Кристаллизация и структурные исследования компонентов бокового "L12-выступа" большой рибосомной субчастицы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Кравченко, Олеся Васильевна

• Кравченко, Олеся Васильевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кравченко, Олеся Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Рибосомные белки бактериального L7/L12-выступа

1.1.1. Белок L7/L

1.1.2. Белок L

1.2. Рибосомные белки эукариотического Р1 /Р2-выступа

1.3. Рибосомные белки архейного LI 2-выступа

1.4. Комплекс L10-L12 и его стехиометрия 26 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы

2.1.1. Химические материалы

2.1.1.1. Реактивы и ферменты

2.1.1.2. Буферы

2.1.1.3. Питательные среды

2.1.2. Биологические материалы

2.1.2.1. Бактериальные штаммы

2.1.2.2. Плазмиды

2.1.3. Принадлежности

2.1.4. Приборы

2.2. Методы 38 2.2.1. Методы генной инженерии

2.2.1.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.2.1.2. Полимеразная цепная реакция

2.2.1.3. Обработка фрагментов ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции

2.2.1.4. Очистка фрагментов ДНК

2.2.1.5. Лигирование фрагментов ДНК

2.2.1.6. Получение компетентных клеток Е. coli

2.2.1.7. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК

2.2.1.8. Анализ клонов методом ПЦР

2.2.1.9. Выделение плазмидной ДНК из небольших объемов культуры

2.2.1.10. Экспрессия рекомбинантного гена белков белков MjaLlONTFl, MjaL10NTF2, MjaLlO, MthLlO, MthL10-L

2.2.1.11. Экспрессия рекомбинантного гена белка MthL

2.2.1.12. Экспрессия гена белка MjaLlONTF 1 для получения белка с заменой метионинов на селенометионины

2.2.2. Биохимические методы при работе с белками

2.2.2.1. Выделение MjaLlONTFl и MjaL10NTF2, MthL12, MjaLlO, MthLlO, MthL10-MthL12, MjaL10-MthL

2.2.2.2. Методы хроматографической очистки белков MjaLlONTFl и MjaL10NTF

2.2.2.2.1. Гидрофобная хроматография на колонке Butyl-Sepharose FF

2.2.2.2.2. Аффинная хроматография на колонке с сорбентом Heparine-Sepharose

2.2.2.2.3. Гель-фильтрация на колонке Superdex G

2.2.2.3. Методы хроматографической очистки MthL

2.2.2.3.1. Гидрофобная хроматография на колонке Butyl-Sepharose FF

2.2.2.3.2. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом Q-Sepharose

2.2.2.3.3. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом CM-Sepharose

2.2.2.3.4. Гель-фильтрация на колонке Superdex G

2.2.2.4. Методы хроматографической очистки MthLlO и MjaLlO

2.2.2.4.1. Гидрофобная хроматография на колонке Butyl-Sepharose FF

2.2.2.4.2. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом Q-Sepharose

2.2.2.4.3. Гель-фильтрация на колонке Superdex G

2.2.2.5. Методы хроматографической очистки MthL10-MthL12, MjaL10-MthL

2.2.2.5.1. Гидрофобная хроматография на колонке Butyl-Sepharose FF

2.2.2.5.2. Аффинная хроматография на колонке с сорбентом Heparine-Sepharose

2.2.2.5.3. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом Q-Sepharose

2.2.2.5.4. Гель-фильтрация на колонке Superdex

2.2.2.6. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях

2.2.2.7. Электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях

2.2.2.8. Формирование комплекса L10-L12 из изолированных белков 48'

2.2.2.9. Аналитическое ультрацентрифугирование

2.2.3. Биохимические методы при работе с РНК

2.2.3.1. Получение РНК-белковых комплексов

2.2.3.2. Электрофорез РНК, РНК-белковых и белок-белковых комплексов в ПААГ в неденатурирующих условиях

2.2.4. Кристаллизация белков

2.2.5. Кристаллографичекие методы. 49 2.2.5.1. Съемка и обработка дифракционных данных

2.2.5.2. Анализ содержания ячейки

2.2.5.3. Решение проблемы фаз

2.2.5.4. Уточнение структуры

2.2.5.5. Проверка стереохимии 56 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Кристаллизация и структурные исследования N-концевого фрагмента рибосомного белка MjaLl

3.1.1. Получение стабильного фрагмента белка L10 из М. jannaschii

3.1.2. Определение аминокислотной последовательности MjaLl0NTF

3.1.3. Создание генетических конструкций генов белков MjaLlONTFl и MjaL10NTF

3.1.4. Выделение белков MjaLlONTFl и MjaLl0NTF

3.1.5. Хроматографическая очистка белка Mj aL 1ONTF

3.1.6. Хроматографическая очистка белка MjaL 10NTF

3.1.7. Кристаллизация белков Mja LIO NTF 1 и Mja LIO NTF

3.1.8. Выделение и кристаллизация селенометионинового производного белка MjaL 1 ONTF

3.1.9. Пространственная структура MjaLlONTF

3.1.10. Сравнение структуры первого домена MjaLlONTF со структурами РНК-связывающих доменов в TmaLl 0 и HmaL

3.1.11. Сравнение структуры MjaLlONTF со структурой Р0 из Р. horikoshii в комплексе N-концевыми доменами белка L

3.1.12. Встраивание структуры MjaLlONTF в модели архейной и бактериальной рибосомы

3.2. Исследование стехиометрии комплекса L10-L

3.2.1. Архейный комплекс L10-L

3.2.2. Бактериальный комплекс L10-L12 88 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 91 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 92 БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. - аминокислотные остатки

БСА - бычий сывороточный альбумин

БФС - бромфеноловый синий

ГТФ - гуанозин-5'-трифосфат дАТФ - дезоксиаденозин-5'-трифосфат дГТФ — дезоксигуанозин-5'-трифосфат

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ДТТ — дитиотрейтол дТТФ - дезокситимидин-5'-трифосфат дЦТФ - дезоксицитидин-5'-трифосфат

ИПТГ — изопропил-р-Б-тиогалактозид мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота нт - нуклеотид

ПААГ — полиакриламидный гель

ПСА - персульфат аммония рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ТХУ - трихлоруксусная кислота

Ас - ацетат

СТАВ - цетилтриметиламмоний бромид CTD - С-концевой домен NTD - N-концевой домен NTF - N-концевой фрагмент

Pipes - пиперазин-1Ч,№-бис-(2-этансульфоновая кислота) PMSF - фенилметилсульфонилфторид SA - сульфат аммония

Se-Met Mja LIO NTF 1 - селенометиониновые производные белка MjaLlONTFl

SRL - сарцин-рициновая петля

ТЕМЕД - ^Н№,№-тетраметилэтилендиамин

Mja - M.jannaschii

Mth - M. thermolithotrophicus

MjaLlONTF — N-концевой фрагмент рибосомного белка LIO из M. jannaschii

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кристаллизация и структурные исследования компонентов бокового "L12-выступа" большой рибосомной субчастицы»

Во всех исследованных организмах большая рибосомная субчастица содержит функционально важный боковой выступ, называемый в бактериях Ь7/Ы2-выступ, в археях - Ы2-выступ и в эукариотах - Р1/Р2-выступ. Этот боковой выступ вовлечен в образование. ГТФазного центра рибосомы и играет важную роль во взаимодействии рибосомы с факторами трансляции и в контроле точности трансляции (Diaconu et al., 2005). Изолированные рибосомные белки L10 и LI2, входящие в состав бактериального выступа, образуют в растворе стабильный комплекс, который через белок L10 связывается с большой рибосомной РНК в районе спирали 42 (нумерация по 23 S рРНК Escherichia coli). Белки LIO и LI2, входящие в состав L12-BbicTyna архейной рибосомы, похожи на эукариотические белки Р0 и Р1/Р2 и существенно отличаются от своих бактериальных аналогов. Так, архейный L10 и эукариотический Р0 существенно длиннее бактериального белка L10. Замечательно, что архейный комплекс L10-L12 и даже эукариотический комплекс Р0-Р1/Р2 могут in vitro замещать комплекс L10-L7/L12 в 50S субчастице рибосомы Е. coli, причем, получившиеся гибридные рибосомы способны связывать архейные и эукариотические факторы элонгации, но теряют способность связывать бактериальные факторы (Nomura et al., 2006). Пространственная структура данного бокового выступа представляет большой интерес, но до сих пор определение её наталкивается на большие трудности. Структура рибосомной 50S субчастицы, из археи Haloarcula marismortui была определена около десяти лет тому назад с разрешением 2.4 Á (Ban et al., 2000), но L12-BbicTyn в этой модели отсутствовал полностью. Позднее только структура N-концевого домена белка L10 была локализована в, этой модели 50S субчастицы на уровне низкого разрешения (Kavran & Steitz, 2007). Совсем недавно этот РНК-связывающий домен белка L10 был визуализован на карте электронной плотности бактериальной 70S рибосомы, сокристаллизованной с фактором элонгации EF-G (Gao et al., 2009). Поэтому в настоящее время большой интерес представляет собой определение пространственных структур изолированных компонентов L12-BbicTyna.

Кроме того, остается до сих пор невыясненным вопрос о стехиометрии комплекса белков рибосомного L12-BbiCTyna. Ранее комплекс L10-L12 описывался как пентамерный, состоящий из одной копии белка L10 и двух димеров белка LI2. Однако несколько лет назад была определена пространственная структура белка L10 из термофильной бактерии Thermotoga maritima в комплексе с тримя димерами N-концевых доменов белка LI2 (L12NTD) (Diaconu et al., 2005). Было выдвинуто предположение, что число молекул белка L12 в комплексе определяется длиной С-концевой a-спирали белка L10. В С-концевой части рибосомного белка L10 из термофильных бактерий' (но не из мезофильных) присутствует дополнительная аминокислотная последовательность, с которой, как предполагается, взаимодействует третий димер белка LI 2. Подобная последовательность была найдена также в аналоге белка L10 (рибосомный белок РО) из архей. Методом масс-спектрометрии! было показано наличие третьего димера белка L12 в L12-BbiCTyne рибосом двух термофильных бактерий (Ilag et al., 2005) и третьего димера белка РО в PI-выступе рибосом гипертермофильной археи Pyrococcus horikoshii (Maki et al., 2007). В 2009 году японской группой была определена пространственная структура комплекса белка Р0 из Р. horikoshii с N-концевыми доменами белка PI (Naganuma et al., 2010). Этот комплекс оказался гептамерным. В то же время, по данным масс-спектрометрии в эукариотических рибосомах комплекс Р0-Р1/Р2 всегда является пентамерным.

Цель данной диссертационной работы - кристаллизация и исследование структуры РНК-связывающего N-концевого фрагмента белка L10 из Methanococcus jannaschii, а также исследование стехиометрии комплекса L10-L12 из бактерий и архей. Наша работа является весьма актуальной и вносит весомый вклад в исследования функционально-важного выступа рибосомы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Обзор литературы посвящен рибосомным белкам, формирующим боковойг L12-BbiCTyn рибосомы бактерий, архей и эукариот. В рамках данной диссертационной работы впервые получены кристаллы длинного РНК-связывающего N-концевого фрагмента белка ЫО из археи М. jannaschii, и определена его пространственная структура. Оказалось, что исследуемый фрагмент рибосомного белка L10 состоит из двух глобулярных доменов; причем, второй домен является вставкой в первый домен и является* специфическим для архей и эукариот. Пространственная структура второго домена определена впервые. Встраивание определенной нами структуры в модель большой субчастицы архейной рибосомы позволяет прояснить структуру основания L12-BbicTyna архейной и эукариотической рибосомы. Кроме того, показано каким образом специфический домен архейного гомолога белка L10 может мешать взаимодействию бактериальных факторов элонгации с архейными и эукариотическими рибосомами. Исследования стехиометрии комплексов, образуемых в растворе изолированными рибосомными белками L10 и L12 из гипертермофильных архей рода Methanococcus и термофильной бактерии Bacillus stearothermophiliis, показали, что эти белки образуют стабильный пентамерный комплекс. Таким образом, полученные нами результаты создают базу для понимания структурных основ функционирования L12-BbicTyna в архейных и эукариотических рибосомах.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Кравченко, Олеся Васильевна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Клонирован и экспрессирован фрагмент гена белка MjaLlO, соответствующий РНК-связывающему N-концевому фрагменту MjaLlO. Разработана методика получения MjaLlONTF в препаративном количестве с чистотой, пригодной для кристаллизации.

2. Получены кристаллы немодицированного N-концевого фрагмента белка MjaLlO и его селенометионинового производного.

3. Определена пространственная структура MjaLlONTF с разрешением 1.6 À. Исследуемый фрагмент рибосомного белка L10 состоит из двух глобулярных доменов, причем, второй домен, структура которого была определена впервые, является вставкой в первый. Показано, что второй домен полностью соответствует специфическому участку аминокислотной последовательности, который отсутствует в бактериальном белке, но характерен для архейных и эукариотических белков LIO(PO).

4. Полученная модель N-концевого фрагмента белка LIO(PO) встроена в модель большой субчастицы архейной рибосомы, что позволило прояснить структуру основания Р1 -выступа архейной и эукариотической рибосом.

5. Показано, каким образом специфический второй домен архейного белка LIO(PO) может мешать взаимодействию бактериальных факторов элонгации с архейными и эукариотическими рибосомами.

6. Исследована стехиометрия комплекса L10-L12 (Р0-Р1) из гипертермофильных архей рода Methanococcus и термофильной бактерии В. stearothermophilus. Показано, что в растворе данные комплексы является пентамерным.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кравченко, Олеся Васильевна, 2011 год

1. Бландел Т., Джонсон JI. (1979). Кристаллография белка, Мир, Москва, с.620.

2. Спирин А.С. (1986). Молекулярная биология. Структура рибосомы и биосинтез белка. М.: Высшая школа.

3. Сердюк, И.Н., Евсеева, O.Hi (2006). Новые возможности аналитического ультрацентрифугирования для анализа гидродинамических свойств белков. Успехи биологической химии, 46, 349-372.

4. Adams, P. D., Grosse-Kunstleve, R. W., Hung, L. -W., Ioerger, Т. R., McCoy, A. J., Moriarty, N. W. et al. (2002). PHENIX: building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallogr. D58, 1948-1954.

5. Bailey-Serres, J., Vangala, S., Szick, K., Lee, C.K. (1997). Acidic phosphoprotein complex of the 60S ribosomal subunit of Maize Seedling Roots. Plant Physiology, 114,1293-1305.

6. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., Steitz, T.A. (2000). The complete atomicistructure of the large ribosomal subunit at 2.4A resolution. Science, 289, 905-920.

7. Beauclerk, A.A., Cundliffe, E., Dijk, J. (1984). The binding site for ribosomal protein complex L8 within 23 S ribosomal RNA of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry, 259, 6559-6563.

8. Bocharov E., Sobol A., Pavlov K., Korzhnev D., Jaravine V., Gudkov A., Arseniev A. (2004). From structure and dynamics of protein L7/L12 to molecular switching in ribosome. J. Biol. Chem. 279, 17697-17706.

9. Briinger A.T. (1992) The Free R Value: a Novel Statistical Quantity for Assessing the Accuracy of Crystal Structures. Nature, 355, 472-474.

10. Casiano, C., and Traut, R.R. (1991). Protein topography of Sulfolobus solfataricus ribosomes by cross-linking with 2-iminothiolane. The Journal of Biological Chemistry, 266, 21578-21583.

11. Casiano, C.A., and Traut, R.R. (1994). Stoichiometry of Sulfolobus ribosomal protein L12e in 50S subunits determined by quantification of immunoblots. Biochemical and Biophysical Research Communications, 203, 1140-1145.

12. Christensen, T., Johnsen, M., Fiil, N.P., Friesen, J.D. (1984). RNA secondary structure and translation inhibition: Analysis of mutants in the rplJ leader. EMBO Journal, 3, 1609-1612.

13. Collaborative Computational Project, Number 4.(1994). The CCP4 suite: programs for protein crystallography.Acta Crystallogr. D 50, 760-763.

14. Davies, D., and Segal, D. (1971). Protein crystallization: microtechniques involving vapor diffusion. Methods Enzymol., 22, 266-269.

15. Diaconu, M., Kothe, U., Schliinzen, F., Fischer, N., Harms, J.M., Tonevitsky, Stark, IT, Rodnina, M.V., Wahl, M.C. (2005). Structural basis for the function of the ribosomal L7/L12 stalk in factor, binding and GTPase activation. Cell, 121, 991-1004;

16. Dijk, J., Garrett, R.A. and Muller, R. (1979). Studies on the binding of the ribosomal protein complex L7/12-L10 and protein LI 1 to,the 5'-one third of 23S RNA: a functional centre of the 50S subunit. Nucleic Acids Research, 6,21 \1-2129.

17. Drenth J. (1999) Principles of Protein X-ray Crystallography, Springer Verlous Publishing, p. 305.

18. Emsley, P. & Cowtan, K. (2004). Coot: model-building tools for molecular.graphics. Acta Crystallogr. D60, 2126-2132.

19. Francisco-Velilla, R., Remacha, M. (2010). In vivo formation of a stable pentameric (P2a/Plp)-P0-( Pla/P2J3) ribosomal stalk complex in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 27(9), 693-704.

20. Gao, Y., Selmer, M., Dunham, C., Weixlbaumer, A., Kelley, A. & Ramakrishnan, V. (2009). The structure of the ribosome with elongation factor G trapped in posttranslocational state. Science, 326, 694-699.

21. Gordiyenko, Y., Videler, H. Zhou, M., McKay, A.R., Fucini, P., Biegel, E., Muller, V., Robinson, C.V. (2010). Mol Cell Proteomics, 9, 1774-1783.

22. Griaznova, О., Traut, R.R. (2000). Deletion of C-terminal residues of Escherichia coli ribosomal protein L10 causes the loss of binding of one L7/L12 dimer: ribosomes with one L7/L12 dimer are active. Biochemistry, 39,4075-4081.

23. Grela, P., Sawa-Makarska, J., Gordiyenko, Y., Robinson, C.V., Grankowski, N., Tchorzewski, M. (2008). Structural properties of the human acidic ribosomal P proteins forming the P1-P2 heterocomplex. J. Biochem., 143, 169-177.

24. Grela, P., Krokowski, D., Gordienko, Y., Krowarsch, D., Robinson, C, Otlewski, J., Grankowski, N., Tchorzewski, M. (2010). Biophysical properties of the eukaryotic ribosomal stalk. Biochemistry, 49, 924-933.

25. Gudkov, A.T. (1997). The L7/L12 ribosomal domain of the ribosome: structural and functional studies. FEBS Letters, 407, 253-256.

26. Gudkov, A.T., Bubunenko, G.M. (1989). Conformational changes in ribosomes upon interaction with elongation factors. Biochimie, 71, 779-785.

27. Gudkov, A.T., Gongadze, G.M. (1984). The L7/L12 proteins change their conformation upon interaction of EF-G with ribosomes. FEBS Letters, \16, 32-35.

28. Gudkov, A.T., Tumanova, L.G., Venyaminov, S.Y., Khechinashvilli, N.N. (1978). Stoichiometry and properties of the complex between ribosomal proteins L12 and L10 in solution. FEBS Letters, 93,215-218.

29. Hagiya A., et al. (2005). A mode of assembly of P0, Pi, and P2 proteins at the GTPase-associated center in animal ribosome. In vitro analyses with P0 truncation mutants. J. Biol. Chem., 280, 39193-39199.

30. W.A. Hendrickson, J.L. Smith, R.P. Phizackerley, E.A. Merritt (1988). Crystallographic structure analysis of lamprey hemoglobin from anomalous dispersion of synchrotron radiation. Proteins 4, pp. 77-88.

31. Hooft, R. W. W., Vriend, G., Sander, C. & Abola, E. E. (1996). Errors in protein structures. Nature, 381,272.

32. Huang, C., Mandava, C.S., Sanyal, S. (2010). The ribosomal stalk plays a key role in IF2-mediated association of the ribosomal subunits. JMB, 399 (1), 145-153.

33. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96, 23-28.

34. Johnsen, M:, Christensen, T., Dennis, P.P., Fiil, N.P. (1982). Autogenous control: ribosomal protein L10-L12 complex binds to the leader sequence of its mRNA. EMBO Journal, 1, 999-1004.

35. Jose, M.P., Santana-Roman, H., Remacha, M., Ballesta, J.P., Zinker, S. (1995). Eukaryotic acidic phosphoproteins interact with the ribosome through their amino-terminal domain. Biochemistry, 34, 7941-7948.

36. Kabsch, W. (1993). Automatic processing of rotationdiffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800.

37. Kavran, J. & Steitz, T. (2007). Structure of the base ofthe L7/L12 stalk of the Haloarcula marismortui large ribosomal subunit: analysis of LI 1 movements. J. Mol.Biol. 371,1047-1059.

38. Korostelev, A., Trakhanov, S., Laurberg, M. & Noller, H. F. (2006). Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements. Cell, 126, 1065-1077.

39. Kothe, U., Wieden, H.J., Mohr, D., Rodnina, M.V. (2004). Interaction of helix D of elongation factor Tu with helices 4 and 5 of protein L7/L12 on the ribosome. Journal of Molecular Biology, 336, 1011-1021.

40. Laemmli, U. (1970). Cleveage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

41. Laskowski, R. A., MacArthur, M. W., Moss, D. S. & Thornton, J. M. (1993). PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures./. Appl. Crystallogr. 26,283-291.

42. Leijonmarck, M., and Liljas, A. (1987). Structure of the C-terminal domain of the ribosomal protein L7/L12 from Escherichia coli at 1.7 A. Journal of Molecular Biology, 195, 555-580.

43. Liljas A, Gudkov T (1987) The structure and dynamics of ribosomal protein L12. Biochimie. 69, 1043-1047.

44. Liao, D., and Dennis, P.J. (1994). Molecular phylogenies based on ribosomal protein LI 1, LI, L10 and LI 2 sequences. Journal of Molecular Evolution, 38, 405-419.

45. Metthews B.W. (1968) Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol., 33, 491-497.

46. Miyoshi, T., Nomura, T., Uchiumi, T. (2009). Engineering and characterization of the ribosomal L10/L12 stalk complex: a structural element responsible for high turnover of the EF-G-dependent GTPase. The Journal of Biological Chemistry, 284, 85-92.

47. Moller, W., Maassen, J.A. (1986). Structure, Function and Genetics of Ribosomes (Hardesty, B., Kramer, G., eds) Springer-Verlag New York Inc., New York.

48. Murshudov, G. N., Vagin, A. A. & Dodson, E. J. (1997). Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr. D53,240-255.

49. Naganuma, T., Shiogama, K., Uchiumi, T. (2007). The N-terminal regions of eukaryotic acidic phosphoproteins PI and P2 are crucial for heterodimerization and assembly into the ribosomal GTPase-associated center. Genes to Cells, 12, 501-510.

50. Naganuma, T., Nomura, N., Yao, M., Mochizuki, M., Uchiumi, T. & Tanaka, I (2010). Structural basis for translation factors recruitment to the eukaryotic/archaeal ribosomes. J. Biol. Chem. 285,4747-4756.

51. Olson, H.M., Sommer, A., Tewari, D.S., Traut, R.R., and Glitz, D.G. (1986). Localization of two epitopes of protein L7/L12 to both the body and stalk of the large ribosomal subunit. The Journal of Biological Chemistry, 261, 6924-6932.

52. Petersen, C. (1990). Escherichia coli ribosomal protein L10 is rapidly degraded when synthesized in excess of ribosomal protein L7/L12. Journal of Bacteriology, 172,431-436.

53. Pettersson, I. and Liljas, A. (1979). The stoichiometry and reconstitution of a stable protein complex from Escherichia coli ribosomes. FEBS Letters, 98, 139-144.

54. Rich, B.E., and Steitz, J.A. (1987). Human acidic ribosomal phosphoproteins P0, PI and P2: analysis of cDNA clones, in vitro synthesis, and assembly. Molecular and Cellular Biology, 7,4065-4074.

55. Rosendahl, G., Douthwaite, S. (1993). Ribosomal proteins Lll and L10*(L12)4 and the antibiotic thiostrepton interact with overlapping regions of the 23 S r RNA backbone in the ribosomal GTPase centre. Journal of Molecular Biology, 234, 1013-1020.

56. Santos, C., and Ballesta, J.P. (1995). The highly conserved protein P0 carboxyl end is essential for ribosome activity only in the absence of proteins PI and P2. Journal of Biological Chemistry, 270,20608-20614.

57. Santos, C, Rodriguez-Gabriel, MA, Remacha, M & Ballesta, JP (2004). Ribosomal P0 protein domain involved in selectivity of antifungal sordarin derivatives. Antimicrob. Agents Chemother. 48,2930-2936.

58. Shcherbacov, D., Dontsova, M., Tribus, M., Garber, M., and Piendl, W. (2006). Stability of the "LI2 stalk" in ribosomes from mesophilic and (hyper)thermophilic Archaea and Bacteria. Nucleic Acids Research, 34, 5800-5814.

59. Spierer, P., Wang, C.C., Marsh, T.L., Zimmermann, R.A. (1979). Cooperative interactions among protein and RNA components of the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry, 6, 1669-1682.

60. Studier, F., Rosenberg, A., Dunn, J., Dubendorff, J. (1990). Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Jounal Methods in Enzimology, 185, 60-89.

61. Taylor, D., Devkota, B., Huang, A., Topf, M., Narayanan, E., Sali, A., Harvey, S., Frank, J. (2009). Comprehensive molecular structure of the eukaryotic ribosome. Structure, 17 (12), 15911604.

62. Tchorzewski, M., Krokowski, D., Boguszewska, A., Lilijas, A., Grankowski, N. (2003). Structural characterization of yeast acidic ribosomal P proteins forming the P1A-P2B heterocomplex. Biochemistry, 42, 3399-3408.

63. Terhorst, C., Moller, W., Laursen, R., Wittmann-Liebold,. B. (1972). Amino acid sequence of a 50S ribosomal protein involved in both EF-G and EF-Tu dependent GTP-hydrolysis. FEBS Letters, 28, 325-328.

64. Uchiumi, T., Honma, S., Endo, Y., Hachimori, A. (2002). Ribosomal proteins at the stalk region modulate functional rRNA structures in the GTPase center. Journal of Biological Chemistry, 277,41401-41409.

65. Wahl, M.C., and Moller, W. (2002). Structure and function of the acidic ribosomal stalk proteins. Current protein and peptide science, 3, 93-106.

66. Wahl, M.C., Huber, R., Marinkovic, S., Weyher-Stingl, E., Ehlert, S. (2000a). Structural investigations of the highly flexible recombinant ribosomal protein L12 from Thermotoga maritima. Biological Chemistry, 381, 221-229.

67. Wahl, M.C., Bourenkov, G.P., Bartunik, H.D., Huber, R. (2000b). Flexibility, conformational diversity and two dimerization modes in complexes of ribosomal protein LI2. EMBO Journal, 19, 174-186.

68. Wool, I.G, Gluck, A, Endo, Y. (1992). Ribotoxin recognition of ribosomal RNA and a proposal for the mechanism of translocation. Trends in Biochemical Sciences, 17, 266-138.1. БЛАГОДАРНОСТИ

69. Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю Станиславу Владимировичу Никонову за четкое руководство, помощь, поддержку, ценные советы и рекомендации в процессе выполнения и оформления диссертационной работы.

70. Спасибо всем сотрудникам группы структурных исследований рибосомных белков и лаборатории структурных исследовай аппарата трансляции за внимание и помощь в работе, а так же за доброжелательную атмосферу.

71. Спасибо родителям, мужу и доче за понимание и всестороннюю помощь.