Механизм действия эмфорина – нового белкового ингибитора металлопротеаз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Бердышев Игорь Михайлович

• Бердышев Игорь Михайлович
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Бердышев Игорь Михайлович

2.6 Ингибирование, не связанное с координированием каталитического цинка

2.7 Ингибирование боковыми группами

2.8 Ингибирование пропептидами

2.9 Необратимое ингибирование по механизму «молекулярной ловушки»

2.10 Необратимое ингибирование с образованием дисульфидных связей

2.11 Необратимое ингибирование по механизму конформационного автолиза

2.12 Заключение

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Реактивы и материалы

3.2 Микробные штаммы и плазмиды

3.3 Питательные среды

3.4 Общие методы

3.4.1 Манипуляции с нуклеиновыми кислотами

3.4.2 Создание плазмидных экспрессионных конструкций

3.4.3 Манипуляции с белками

3.4.4 Работа с бактериальными клетками

3.5 Получение рекомбинантных белков в E. coli

3.5.1 Получение протеализина

3.5.2 Получение эмфорина M4in/S

3.5.3 Получение эмфорина M4in-His6/S и его мутантных вариантов

3.6 Анализ ингибирующей активности

3.7 Анализ последовательностей

3.8 Молекулярный докинг

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Разработка количественного метода определения активности ингибиторов протеализинподобных протеаз

4.2 Изучение влияния эмфорина на кинетику реакции гидролиза, катализируемого протеализином

4.3 Анализ последовательностей эмфориноподобных ингибиторов и пространственной структуры эмфорина, построение модели комплекса эмфорина с протеализином

4.4 Получение мутантных вариантов эмфорина в E. coli

4.5 Изучение влияния модификаций эмфорина на способность ингибировать протеализин

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6 ВЫВОДЫ

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

9 БЛАГОДАРНОСТИ

10 ПРИЛОЖЕНИЯ

1 ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизм действия эмфорина – нового белкового ингибитора металлопротеаз»

Актуальность темы исследования

Протеолиз является одной из основных систем регуляции в живых организмах и играет важную роль в обеспечении жизнедеятельности клеток и тканей. Он задействован во многих фундаментальных процессах, среди которых иммунный ответ, пролиферация и дифференцировка клеток, регулируемая клеточная гибель, активация ферментов и гормонов [4]. Учитывая универсальность и многообразие этих процессов, неудивительно, что в геномах различных организмов гены, кодирующие протеолитические ферменты, в большинстве случаев составляют от 1 до 2,5 % [5]. Строгая регуляция активности протеаз критически важна для поддержания гомеостаза.

Активность протеолитических ферментов контролируется на различных уровнях, что обеспечивает точную пространственно-временную регуляцию их действия. К основным механизмам относятся транскрипционная, посттранскрипционная и трансляционная регуляция, посттрансляционные модификации, активация зимогенов, регуляция субклеточной локализации, деградация, а также воздействие внешних сигналов и межклеточных взаимодействий [4]. Одной из важнейших систем регуляции протеолиза являются белковые ингибиторы протеаз (БИП). Их биологическая роль чрезвычайно многообразна, они участвуют как в физиологических, так и в патологических процессах. В частности, БИП принимают активное участие в регуляции свёртывания крови, клеточного цикла, иммунного ответа и воспаления. Кроме того, они вовлечены в патогенез сердечно-сосудистых, онкологических, нейродегенеративных, аутоиммунных и инфекционных заболеваний [6].

Несмотря на то, что на сегодняшний день известно значительное число БИП, их природные мишени, механизмы действия и биологические функции зачастую остаются недостаточно изученными. При этом более полно охарактеризованы белковые ингибиторы сериновых и цистеиновых протеаз, что объясняется как распространённостью и биологической значимостью этих групп ферментов, так и долгой историей их исследования. В то же время объём информации о белковых

ингибиторах металлопротеаз (БИМ) остается существенно более ограниченным [7]. Согласно базе данных MEROPS (https://ebi.ac.uk/merops), на данный момент идентифицировано 73 семейства металлопротеаз, но лишь для 9 из них описаны белковые ингибиторы [8]. Среди 84 известных семейств БИП, только 25 содержат представителей, способных ингибировать металлопротеазы. При этом механизмы действия остаются неустановленными для 7 из этих 25 семейств, что подчёркивает явный дефицит знаний о механизмах действия БИМ [6]. Возможно, такая ситуация связана с тем, что металлопротеазы, представляющие собой крупный, функционально разнообразный класс ферментов [9], в течение длительного времени оставались сравнительно малоизученными. Однако в настоящее время металлопротеазы интенсивно исследуются, поскольку они играют ключевую роль в ремоделировании внеклеточного матрикса, регуляции воспаления, ангиогенезе, активации цитокинов, а также участвуют в патогенезе различных заболеваний [10, 11]. Как следствие, возрастает интерес и к БИМ. Следует отметить также, что большая часть имеющихся данных относится к БИП эукариот, а о бактериальных ингибиторах известно очень мало. В частности, практически нет сведений о механизмах действия, природных мишенях и биологических функциях бактериальных БИМ [12-18].

Изучение механизмов действия БИП (и, в том числе, БИМ) имеет большие перспективы, поскольку может не только пролить свет на фундаментальные аспекты взаимодействия белковых молекул, но и способствовать созданию новых подходов к терапии социально-значимых заболеваний. Современные методы терапии с использованием ингибиторов протеаз в основном базируются на применении низкомолекулярных синтетических соединений. Однако ввиду их небольшого размера и ограниченного числа взаимодействий с мишенью, такие ингибиторы часто обладают низкой селективностью и вызывают многочисленные побочные эффекты [19]. В отличие от них, белковые ингибиторы высоко специфичны, что делает их потенциальными кандидатами для создания новых, более безопасных лекарственных средств.

С учётом развивающейся антибиотикорезистентности чрезвычайно важным направлением использования БИП может стать противобактериальная терапия, поскольку бактериальные протеазы представляют собой одну из перспективных терапевтических мишеней. В частности, бактериальные металлопротеазы семейства M4 [20], к которым относятся, например, псевдолизин из Pseudomonas aeruginosa и ауреолизин из Staphylococcus aureus [11, 21], являются известными секретируемыми факторами вирулентности. Эти ферменты разрушают компоненты внеклеточного матрикса (включая коллаген, эластин и фибронектин), инактивируют антимикробные пептиды и элементы системы комплемента, а также расщепляют молекулы клеточной адгезии, тем самым нарушая барьерные функции тканей, подавляя врождённый иммунный ответ и облегчая инвазию патогенов вглубь организма [22-24]. В этом контексте изучение БИМ, мишенями которых являются бактериальные протеазы, позволит не только расширить представления о принципах регуляции протеолиза у прокариот, но и может стать основой для разработки инновационных подходов к лечению бактериальных инфекций.

Степень разработанности темы исследования

В лаборатории функциональной энзимологии НИЦ «Курчатовский институт» ранее была охарактеризована цинковая металлопротеаза из бактерии Serratia proteamaculans, получившая название протеализин (Pln) [25-28], а также выделен её эндогенный белковый ингибитор - эмфорин (M4in). Скрининг бактериальных геномов продемонстрировал, что гомологи Pln и M4in широко распространены у бактерий. Анализ первичных структур ферментов показал, что протеализинподобные протеазы (ППП) представляют собой новую группу протеаз, входящую в семейство пептидаз М4 [25]. На основании сравнения аминокислотных последовательностей гомологов эмфорина с известными белковыми ингибиторами эмфориноподобные ингибиторы (ЭПИ) были выделены в новое семейство БИП, которому был присвоен идентификатор I104 по классификации MEROPS. Биоинформатический анализ выявил, что в бактериальных геномах гены ППП и ЭПИ колокализованы. Детальное рассмотрение соответствующих геномных локусов позволило установить, что эти гены во многих случаях формируют

бицистронный оперон, что указывает на их координированную экспрессию и вероятную функциональную связь.

Многие микроорганизмы, продуцирующие ППП, являются симбионтами или патогенами растений и животных. Хотя функции ППП в настоящее время изучены недостаточно, имеющиеся данные указывают на то, что эти ферменты вовлечены во взаимодействие бактерий с другими бактериями, высшими организмами (растениями и животными) и, вероятно, в патогенез [29-32]. Ассоциация ЭПИ с ППП позволяет предположить, что биологическая роль этих ингибиторов связана с регуляцией активности ППП и, как следствие, с регуляцией взаимодействия бактерий с другими организмами. Таким образом, исследование системы ППП-ЭПИ может дать новую информацию о механизмах взаимодействия бактерий с высшими организмами и, потенциально, о механизмах бактериального патогенеза.

Для понимания того, как функционирует система ППП-ЭПИ у бактерий, необходимо знать особенности функционирования как ферментов, так и ингибиторов. ППП изучаются достаточно давно, в частности, были определены каталитические характеристики Pln и установлена его пространственная структура (идентификатор в базе данных Protein Data Bank (PDB): 2VQX) [26]. Исследования ЭПИ начались относительно недавно и в основном проводятся на модели M4in. В рамках этих исследований была разработана схема получения M4in в Escherichia coli, а также методом спектроскопии ЯМР установлена его пространственная структура (PDB: 6ZYG) и получены данные малоуглового рентгеновского рассеяния для комплекса Pln-M4in, однако механизм действия M4in не был установлен.

Таким образом, исследование механизма действия эмфорина - прототипа нового семейства белковых ингибиторов протеаз - является актуальной задачей, имеющей значение как для понимания регуляции протеолиза у бактерий, так и для создания новых подходов к антибактериальной терапии.

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы является изучение механизма действия эмфорина - нового белкового ингибитора металлопротеаз.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Разработать количественный метод определения активности ингибиторов протеализинподобных металлопротеаз.

2. Исследовать влияние эмфорина на кинетику гидролиза, катализируемого протеализином.

3. Провести сравнительный анализ аминокислотных последовательностей и пространственных структур эмфориноподобных ингибиторов и на его основе сформулировать гипотезу о молекулярном механизме их действия.

4. Проверить гипотезу с помощью сайт-направленного мутагенеза.

Научная новизна

Разработан метод количественного анализа активности ингибиторов протеализинподобных протеаз, который позволяет оценивать эффективность действия широкого спектра соединений.

Изучено взаимодействие протеализина и эмфорина. Показано, что эмфорин является сильным конкурентным медленно-связывающимся ингибитором протеализина. Установлены кинетические и равновесные параметры ингибирования.

Установлен молекулярный механизм действия эмфорина - прототипа нового семейства белковых ингибиторов протеаз. Продемонстрировано, что эмфорин является первым охарактеризованным ингибитором протеаз семейства M4, работающим по неканоническому механизму.

Теоретическая и практическая значимость работы

На модели эмфорина получены новые данные о функционировании белковых ингибиторов протеаз. Эти данные расширяют имеющиеся теоретические представления о способах межмолекулярных взаимодействий протеаз и их белковых ингибиторов, а также о механизмах регуляции активности протеаз

белковыми ингибиторами. Полученные данные являются фундаментом для изучения молекулярных основ, определяющих специфичность, селективность и кинетику взаимодействия ингибиторов нового семейства 1104 с мишенями. Полученная информация важна для дальнейших исследований, направленных на выяснение биологических функций ингибиторов семейства эмфорина.

Механизм действия М4т является уникальным для ингибиторов пептидаз М4, что открывает перспективы практического использования эмфориноподобных ингибиторов в качестве новой платформы для разработки антибактериальных средств. В условиях увеличивающейся антибиотикорезистентности бактерий ингибиторы на основе ЭПИ могут стать перспективной альтернативой низкомолекулярным ингибиторам, имеющим низкую селективность.

Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием широкого спектра современных методов молекулярной биологии, энзимологии и биоинформатики: клонирование генов, создание экспрессионных конструкций, трансформация и культивирование бактерий, электрофоретический анализ ДНК и белков, спектрофотометрические методы анализа, флуоресцентная спектроскопия, спектроскопия кругового дихроизма, хроматографические методы разделения белков, методы исследования ферментативной кинетики, методы анализа первичных и пространственных структур белков, а также молекулярный докинг.

Положения, выносимые на защиту

1. Метод количественного анализа активности ингибиторов протеализинподобных протеаз позволяет получать данные о кинетике ингибирования и специфичности взаимодействия ингибиторов с ферментами.

2. Эмфорин является сильным конкурентным медленно-связывающимся ингибитором протеализина (К = 52±14 пМ).

3. Для взаимодействия М4т-Р1п решающее значение имеют две сближенные в пространстве петлевые области в молекуле ингибитора. В первой -ключевым элементом является остаток аспарагиновой кислоты (Asp70), который через боковую карбоксильную группу координирует каталитический ион цинка в

активном центре фермента. Во второй - гидрофобные остатки (Phe21, Ala22, Phe23), соответствующие субстратной специфичности металлопротеазы и взаимодействующие с S' сайтами. Механизм действия эмфорина относится к неканоническим, но при этом уникален.

Степень достоверности и апробация результатов Достоверность полученных результатов обеспечивается использованием современных физико-химических методов исследования, современного научно-исследовательского оборудования, применением методов статистического анализа и воспроизводимостью значений измеряемых параметров в нескольких повторах экспериментов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая 3 статьи в рецензируемых научных журналах, индексируемых в международных базах данных Scopus и Web of Science, и 8 тезисов докладов, представленных на всероссийских и международных научных конференциях.

Личный вклад автора Автор принимал активное участие в планировании экспериментов и самостоятельно выполнил основную часть экспериментальной работы. Автором была выполнена обработка и оценка полученных результатов, подготовлен иллюстративный материал, проведен анализ литературных данных по теме работы и подготовлены материалы к публикации.

Структура и объём диссертации Диссертация изложена на 155 страницах, включает в себя 11 таблиц, 22 рисунка и 295 источников литературы. Работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список сокращений и условных обозначений, список литературы, благодарности и приложения.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗ

2.1 Введение

Протеолитические ферменты (протеазы) представляют собой обширный класс гидролаз, катализирующих расщепление пептидных связей [9]. Они участвуют в широком спектре физиологических и патофизиологических процессов, выполняя множество важных функций. Эффективное поддержание гомеостаза в организме требует строгой регуляции протеолитической активности, которая может осуществляться на различных уровнях: от транскрипционного до посттрансляционного. Одним из ключевых механизмов регуляции является взаимодействие протеаз с их белковыми ингибиторами (БИП) [8].

В широком смысле к белковым ингибиторам протеаз относят любые белковые молекулы, снижающие каталитическую активность протеазы при непосредственном взаимодействии с ней. При этом в данном обзоре мы не относим к БИП протеолитические ферменты, способные расщеплять протеазы и, таким образом, подавлять их активность. Однако рассматриваем как БИП белки, индуцирующие конформационные изменения, приводящие к автолизу протеазы или её расщеплению другими протеолитическими ферментами. Кроме того, мы обсуждаем собственные пропептиды протеаз как особую группу БИП, действующих внутримолекулярно.

В общем случае механизмы действия БИП тем или иным образом связаны с ограничением доступа субстрата к активному центру протеазы и созданием стерических или конформационных затруднений для связывания субстрата. Многообразие БИП позволяет классифицировать их по различным структурным и функциональным признакам [33].

По строению активного центра протеазы разделяют на семь каталитических типов: сериновые, металлопротеазы, цистеиновые, аспартатные, треониновые, аспарагиновые и глутаматные. Как следствие, БИП могут быть разделены в соответствии с каталитическими типами ингибируемых протеаз. К настоящему

моменту обнаружено большое число БИП для сериновых, цистеиновых и металлопротеаз, гораздо меньше известно для аспартатных протеаз, а для треониновых, аспарагиновых и глутаматных протеаз БИП до сих пор не описаны

[19].

По специфичности БИП делят на специфичные, которые взаимодействуют только с определённым каталитическим типом протеаз, и универсальные, которые действуют на протеазы с различным строением активного центра [34].

По характеру взаимодействия БИП с протеазой они подразделяются на субстратоподобные - взаимодействующие в активном центре протеазы по типу субстрата, аллостерические - взаимодействующие с внешним (аллостерическим) сайтом связывания вне активного центра протеазы, и смешанные - сочетающие оба типа взаимодействия.

По обратимости связывания БИП подразделяются на обратимые, образующие комплекс за счёт нековалентных взаимодействий, и необратимые, как правило, формирующие ковалентные связи. Большинство БИП являются обратимыми, необратимые встречаются гораздо реже.

По количеству реактивных центров БИП подразделяются на «одноголовые» (монофункциональные), взаимодействующие только с одной молекулой фермента, и «многоголовые» (многофункциональные), имеющие два и более реактивных центра и способные одновременно связывать несколько молекул протеаз одного или разного каталитического типа [35, 36].

Изучение многообразия механизмов действия долгое время было ограничено небольшим количеством изученных БИП. При этом число охарактеризованных белковых ингибиторов сериновых протеаз (БИС) значительно превышало число описанных БИП для других каталитических типов. Вероятно, это было связано с высокой распространённостью этих ингибиторов в природе и доступностью сериновых протеаз для исследования. В 1980 году Ласковский и Като проанализировали известные механизмы действия БИП и предложили первую их классификацию, выделив два основных: «стандартный» механизм и механизм

«молекулярной ловушки» [34]. Эта классификация стала классической и долгое время механизмы действия большинства известных БИП ей соответствовали.

В настоящее время количество охарактеризованных БИП существенно выросло. При этом белковые ингибиторы сериновых и цистеиновых протеаз являются самыми обширными группами, а их механизмы действия наиболее изученными. Большинство этих БИП функционируют по стандартному механизму, но кроме того за прошедшие годы для них были открыты новые механизмы, не описанные Ласковским и Като [33]. Гораздо меньше информации о белковых ингибиторах металлопротеаз (БИМ) и их механизмах действия. В то же время за последние два десятилетия интерес к БИМ существенно вырос, что связано с их ролью в патогенезе различных заболеваний [37]. По мере накопления данных о БИМ становится очевидно, что существующая классификация механизмов действия не отражает функционального разнообразия БИМ. В настоящем обзоре обобщены и систематизированы современные данные о БИМ и предложена актуальная классификация их механизмов действия.

2.2 Разнообразие белковых ингибиторов металлопротеаз

Создание классификации механизмов действия БИМ требует системного анализа существующих данных. На сегодняшний день ключевым ресурсом, содержащим информацию о протеазах и их ингибиторах, является база данных МЕККОРБ (https://ebi.ac.uk/merops) [8]. МЕККОРБ использует иерархическую систему классификации, где семейства пептидаз и БИП формируются на основе гомологии аминокислотных последовательностей, а кланы объединяют эволюционно родственные семейства со схожей третичной структурой. По состоянию на январь 2026 года в МЕККОРБ зарегистрировано 84 семейства БИП, из которых 24 семейства содержат БИМ (таблица 2.1). Большинству семейств БИМ соответствует свой отдельный клан. Исключение составляют семейства II и 18, которые объединены в клан 1А, а также семейства 125 и 147, входящие в клан 1Н. Ингибиторы из 18 семейств действуют исключительно на металлопротеазы, тогда как ингибиторы 7 семейств также подавляют активность протеаз других

каталитических типов. Большинство семейств БИМ включают ингибиторы только эндопептидаз. Ингибиторы экзопептидаз относятся к 8 семействам, при этом 7 из них (12, 137, 144, 146, 147, 168, 192) содержат ингибиторы металлокарбоксипептидаз семейства M14, а одно (II) - ингибитор металлоаминопептидазы из семейства M1. Представители семейств II и \2 способны ингибировать как эндо-, так и экзопептидазы.

Таблица 2.1 — Семейства белковых ингибиторов металлопротеаз

№ Клана Семейство Семейства протеаз, представители которых ингибируются6

1 П М1, М10А, М12В, S1A, S1D, S8A, S9A

2 т пв М10А, М14А, S1A, S7

3 к М4, S1

4 ¡У !16 М4, М7, S1A, S8A, S8B

5 щ !25 I25Bг М12А, С1А, С2А, С13, S8B

I25Cг М12А, М12В

6 IX В1 М10А, А1А, С1А,

7 1Т В5 М10А, М12В,

8 ш В6 М4

9 ш В7 М14А

10 ж В8 М10В

11 гь В9 М4, М10А, М10В, М12А, М12В, А1А,

А2А, С1А, С2А, С11, S1A, S1B, S8A

12 лм I43 М12В

13 л I44 М14А

14 к М6 М14А, М14В

15 щ I47 М14А

16 - I62 М50В

17 лв I63 М43В, S1A

18 лк I68 М14А

19 * I75 М41

20 * I87 М41

21 * I92 М14А

22 * I93 М12А

23 * П00 М43В

24 * !104 М4

аЗнак «*» в столбце «Клан» обозначает, что семейство белков в настоящее время не отнесено ни к одному из кланов. Знак «-» обозначает, что семейство было удалено из MEROPS. бПервая буква в обозначении семейства M, S, С, A отражает каталитический тип входящих в него протеаз: металлопротеаза, сериновая, цистеиновая, аспартатная, соответственно. вБольшинство семейств БИМ включают ингибиторы, содержащие только одну ингибиторную единицу. Ингибиторная единица - минимальная часть структуры ингибитора, проявляющая активность. Семейства (И, 12, К, П5, В1) включают также составные ингибиторы, содержащие несколько ингибиторных единиц, обозначение которых начинается с буквы L. Среди них только в семействе 12 найден единственный составной БИМ (Ы02-003), который ингибирует протеазы семейства M10A. гI25B, I25C - подсемейства в составе Т25.

БИМ обнаружены только для 9 из 73 известных семейств металлопротеаз. Среди них семь (М1, М4, М7, М10, М12, М41, М43) относятся к клану МА, одно (М14) к клану МС и одно (М50) к клану ММ. Это свидетельствует о том, что, несмотря на накопленные за последние десятилетия данные, для подавляющего большинства семейств металлопротеаз всё ещё неизвестно ни одного ингибитора.

Хотя в целом количество данных о БИМ в МЕЯОРБ постоянно растёт, конкретно данные о механизмах действия БИМ в МЕЯОРБ представлены очень ограниченно и отсутствуют для многих изученных случаев. Поскольку данные сильно разрознены, систематизация накопленных знаний о механизмах действия известных БИМ становится ключевой задачей. Список проанализированных представителей семейств БИМ, ингибируемых ими протеаз, а также ссылки на известные пространственные структуры собраны в Приложении 1.

Для классификации механизмов действия БИМ мы анализировали всю совокупность разнообразных структурных и функциональных данных. В первую очередь мы принимали во внимание экспериментальные данные о пространственных структурах как самих БИМ, так и их комплексов с металлопротеазами. В случае их отсутствия ориентировались на модели структур комплексов, которые часто позволяют предсказать механизмы взаимодействия ингибитора и металлопротеазы с высокой вероятностью. Кроме структурных данных мы рассматривали соответствующие данные биохимических экспериментов и направленного мутагенеза, позволяющие экспериментально доказать предполагаемые механизмы действия. Однако для ~30% семейств БИМ механизмы остаются изученными не до конца или совсем неизвестны. Проведенный нами анализ позволил выявить несколько общих стратегий ингибирования в рамках разных семейств БИМ, которые будут описаны в следующих разделах.

2.3 Ингибирование по квазиканоническому механизму

Исторически первым исследованным механизмом действия БИП стал «стандартный механизм», описанный Ласковским и Като [34], более известный

сегодня как «канонический» или «механизм Ласковского». Канонический механизм предполагает, что ингибитор специфично и обратимо связывается в активном центре протеазы, имитирует взаимодействие субстрата, но не подвергается полному гидролизу. Полноценный канонический механизм продемонстрирован в настоящее время только для белковых ингибиторов сериновых протеаз [38]. Для протеаз других каталитических типов не описаны белковые ингибиторы, проявляющие полноценный канонический механизм, но для многих БИП характерно «субстратоподобное» связывание [39]. Область, отвечающая за ингибирование протеазы, называемая реакционной петлёй, всегда развёрнута и экспонирована в растворитель [40]. Хотя конформации реакционных петель отдельных ингибиторов сильно различаются, общая геометрия взаимодействия (расстояния между Ca каталитического серина и Ca остатков P3-P3') очень схожи (RMSD ~ 1А) [41]. Петля содержит пептидную связь P1-P1' реактивного центра, который взаимодействует с активным центром соответствующей протеазы. В многоголовых ингибиторах таких петель с реактивными центрами может быть несколько. Для описания сайтов взаимодействия пептидного субстрата (в нашем случае канонического ингибитора) с протеазами используется номенклатура Шехтера и Бергера (P1, P2 и P1', P2' обозначают остатки ингибитора, находящиеся на амино- и карбоксильном конце разрезаемой пептидной связи соответственно; S1, S2 и S1', S2' обозначают соответствующие сайты протеазы) [42].

Рассмотрим канонический механизм ингибирования с кинетической точки зрения на примере взаимодействия трипсина с его бычьим панкреатическим ингибитором (bovine pancreatic trypsin inhibitor, BPTI) при гидролизе казеина. В таблице 2.2 приведены приблизительные значения соответствующих констант взаимодействия [43-45]. Взаимодействие протеазы и канонического ингибитора может быть представлено в упрощенной схеме (1) как реакция гидролиза/ресинтеза пептидной связи реактивного центра P1-P1' [38]. В более общей схеме взаимодействия также включаются различные нестабильные промежуточные формы комплекса фермент-ингибитор [34]. Упрощённая схема (1) подразумевает,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бердышев Игорь Михайлович, 2026 год

Источник

pPln-His6 Конструкция, обеспечивающая экспрессию в бактериях рекомбинантного предшественника протеализина с шестью His на C-конце (His6) [27]

pET23c Вектор, обеспечивающий экспрессию в бактериях целевого гена под управлением промотора фага T7 Novagen

pM4in/S Конструкция, обеспечивающая экспрессию гена эмфорина c заменой Cys68^Ser (m4in/S) [191]

pM4in-His6/S Конструкция, обеспечивающая экспрессию гена m4in/S с шестью His на C-конце (His6) [191]

Конструкции на основе pM4in-His6/S, несущие варианты гена m4in/S, кодирующие белок с _различными аминокислотными заменами_

pD70A

pD70S

pD70N

pD70E

pF21S

pA22S

pF23S

pF21S-A22S pA22S-F23S pF21S-F23S pF21S-A22S-F23S pD70A-F21S-A22S-F23 S

D70-A D70-S D70-N D70-E F21-S A22-S F23-S F21-S и A22-A22-S и F23-F21-S и F23-F21-S, A22-D70-A, F21-

S S S

S и F23--S, A22-

S

►S иF23-

Данная работа Данная работа Данная работа Данная работа Данная работа Данная работа Данная работа Данная работа Данная работа Данная работа Данная работа Данная работа

Питательные среды (ЬЛ, ЬВ, ВВ без глюкозы и лактозы) стерилизовали автоклавированием в течение 45 мин при 121°С и 2,25 атм. Растворы глюкозы и лактозы (12,5 и 50 г/л, соответственно) для среды ВВ стерилизовали отдельно фильтрацией через фильтр (0,2 мкм) и добавляли в среду непосредственно перед использованием.

3.4 Общие методы

3.4.1 Манипуляции с нуклеиновыми кислотами

Выделение плазмидной ДНК из бактериальной биомассы проводили с помощью коммерческого набора Plasmid Miniprep (Евроген, Россия) согласно протоколу производителя. Полученные препараты инкубировали 10 мин при 65 °С, после чего хранили при -20 °С. Концентрацию выделенных плазмид определяли

спектрофотометрически по оптической плотности при 260 нм, используя коэффициент экстинкции s260 = 0,020 (мкг/мл)-1 ■ см-1.

Электрофорез ДНК проводили в 1 % горизонтальном агарозном геле, используя 89 мМ трис-боратный буфер, содержащий 2 мМ ЭДТА (TBE), pH 7,6, при напряженности электрического поля 5-10 В/см. В качестве стандарта использовали 1 kb DNA Ladder (СибЭнзим, Россия), состоящий из 13 фрагментов ДНК в диапазоне 250 - 10000 п.н. Перед нанесением на гель исследуемые образцы смешивали с буфером для образцов: 40% глицерин в TBE с 0,05% бромфенолового синего. Для окрашивания ДНК агарозный гель инкубировали в течение 1 мин в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл). Визуализацию ДНК в геле проводили с помощью системы Gel Doc EZ System (Bio-Rad, США).

3.4.2 Создание плазмидных экспрессионных конструкций

Для создания конструкций pD70A, pD70S, pD70N и pD70E фрагменты гена M4in амплифицировали, используя в качестве матрицы pM4in-His6/S и пары праймеров D70A-mf/R-1, D70S-mf/R-1, D70N-mf/R-1 или D70E-mf/R-1, соответственно (таблица 3.1). В случае pD70A полученный фрагмент очищали, обрабатывали ферментами XmaI (СибЭнзим, Россия) и XhoI (New England Biolabs, USA), после чего лигировали в вектор pM4in-His6/S, предварительно обработанный теми же ферментами. В случае pD70N, pD70S, pD70E фрагменты очищали, обрабатывали ферментом XhoI и лигировали в вектор pM4in-His6/S, предварительно обработанный SmaI (СибЭнзим, Россия) и XhoI.

Для создания конструкции pF21S было получено два фрагмента ДНК методом ПЦР. На первом этапе фрагмент гена M4in амплифицировали, используя матрицу pM4in-His6/S и пару праймеров F21 S-mf/R-1. На втором этапе полученный ПЦР-продукт использовали в качестве матрицы для амплификации полноразмерного гена с праймерами F21S-f/R-1. Полученный фрагмент очищали, обрабатывали FauNDI (NdeI изошизомер, СибЭнзим, Россия) и XhoI и клонировали в pM4in-His6/S, обработанный теми же ферментами.

Для создания конструкций pA22S, pF23S, pF21S-F23S, pF21S-A22S, pA22S-F23S, pF21S-A22S-F23S, и pD70A-F21S-A22S-F23S был использован метод ПЦР с достройкой перекрывания (overlap extension PCR). Во всех случаях, кроме pD70A-F21S-A22S-F23S, в качестве матрицы для амплификации и вектора для клонирования использовали pM4in-His6/S. В случае pD70A-F21S-A22S-F23S и вектором служила pF21S-A22S-F23S. На первом этапе два перекрывающихся модифицированных фрагмента гена M4in были амплифицированы с использованием пар праймеров A22S-mf/R-2 и F-1/A22S-mr, F23S-mf/R-2 и F-2/F23S-mr, F21S-F23S-mf/R-2 и F-2/F21S-F23S-mr, F21S-A22S-mf/R-3 и F-2/F21S-A22S-mr, A22S/F23S-mf/R-3 и F-2/A22S-F23S-mr, F21S-A22S-F23S-mf/R-3 и F-2/F21S-A22S-F23 S-mr, D70A-F21S-A22S-F23S-mf/R-2 и F-1/D70A-F21S-Ala22-F23S-mr, соответственно. На втором этапе полученные фрагменты использовали в качестве праймеров и матриц для «достройки перекрывания», а затем амплифицировали полноразмерные последовательности, используя пары праймеров F-1/R-2, F-2/R-2, и F-2/R-3, соответственно. Полученные продукты очищали, обрабатывали FauNDI и XhoI и клонировали в pM4in-His6/S или pF21S-A22S-F23S, обработанные теми же ферментами. Структура генов в составе всех полученных конструкций была подтверждена секвенированием.

3.4.3 Манипуляции с белками

Электрофорез белков проводили в вертикальном 15%-ном полиакриламидном геле, содержащем 0,1% додецилсульфата натрия, по Лэммли [2]. Перед нанесением на гель 20 мкл образца смешивали с 20 мкл буфера для образцов (125 мМ Tris-HCl, 2% додецилсульфата натрия, 0,05% бромфенолового синего, 5% глицерина, 5 мМ ЭДТА, 5% ß-меркаптоэтанола) и прогревали при 95°C в течение 5 мин. Зоны белков окрашивали Кумасси бриллиантовым синим R-250 (Reanal, Венгрия). В качестве стандарта использовали маркеры молекулярных масс Unstained Protein MW Marker 14,4-116 кДа и PageRuler Low Range Unstained Protein Ladder 3,4-100 кДа (ThermoFisher, США).

Концентрацию очищенных белков в растворе определяли по поглощению при 280 нм, используя коэффициенты экстинкции, рассчитанные с помощью сервера ProtParam (https://web.expasy.org/protparam): S280 = 52 370 M-1 ■ см-1 - для протеализина (Pln), s280 = 58 200 M-1 ■ см-1 - для термолизина (Tln), s280 = 10 810 M-1 ■ см-1 - для M4in и его мутантных вариантов.

Концентрацию Abz-RSVIK(Dnp) определяли по поглощению 2,4-динитрофенила при 365 нм, используя коэффициент экстинкции s365 = 17 300 М-1 ■ см-1 [192]. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Agilent 8453 UV-Vis (Agilent Technologies, США).

Концентрацию белков во фракциях после хроматографии определяли по модифицированному методу Бредфорда с использованием иммуноглобулина G в качестве стандарта [193]. Оптическую плотность измеряли при 595 нм в 96-луночном планшете на фотометре iMark Microplate Reader (Bio-Rad, США).

Спектры кругового дихроизма (КД) регистрировали на спектрофотометре Chirascan VX (Applied Photophysics, Великобритания) при комнатной температуре в кювете с длиной оптического пути 0,05 см. Белки разбавляли до 0,16 мг/мл в 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4 и центрифугировали (9000 g, 4 °С, 5 мин) перед всеми измерениями. Спектры анализировали с помощью программного обеспечения DichroWeb (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk) с использованием метода CDSSTR и эталонного набора данных 4 [194]. Для предсказания спектров КД и расчёта долей вторичных структур по пространственным структурам использовали сервер PDBMD2CD [195].

3.4.4 Работа с бактериальными клетками

Культивироване бактерий осуществляли при 37°С в питательной среде LB при интенсивном перемешивании или на твердой среде LA. Для селекции в среду добавляли 0,1 мг/мл ампициллина.

Введение ДНК в клетки Escherichia coli выполняли методом кальциевой трансформации [196]. Селекцию и дальнейшее культивирование клонов

трансформированных клеток проводили на твердой среде LA, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина.

3.5 Получение рекомбинантных белков в E. coli

3.5.1 Получение протеализина

Культивирование клеток E. coli BL-21 (pPln-His6) проводили на автоиндукционной среде BB. С чашки Петри переносили клоны в 250 мл свежей среды BB, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина. Культивирование проводили при интенсивном перемешивании (220 об/мин) при 37°C в течение 24 ч до оптической плотности ОП600 = 6- 8. Культуральную суспензию центрифугировали (2000 g, 15 мин, 4°C), осадок промывали 25 мл буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0) и повторно центрифугировали (2000 g, 15 мин, 4°C). Биомассу хранили при -20°C. Очистку Pln осуществляли по ранее отработанной схеме в две стадии с помощью металл-хелатной и гельпроникающей хроматографии, полученные целевые фракции диализовали против 100 объёмов 50 мМ бикарбоната аммония и лиофильно высушивали [27].

3.5.2 Получение эмфорина M4in/S

Клетки E. coli BL-21 (DE3), трансформированные плазмидой pM4in/S, выращивали в 250 мл автоиндукционной среды BB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, при интенсивном перемешивании (220 об/мин) при 37°C в течение 2 ч, а затем при 16°C в течение 96 ч до достижения оптической плотности ОП600 = 10-12. Клеточную суспензию центрифугировали (4000 g, 15 мин, 4°C), осадок замораживали и хранили при -20°C. Очистку M4in/S проводили по ранее разработанной схеме в три стадии: высаливание сульфатом аммония, анионнообменная и гельпроникающая хроматография [191]. Замороженную биомассу (2 г) ресуспендировали в 50 мл буфера L-His (50 мМ L-гистидин-HQ, pH 6,0). Клеточную суспензию разделяли на две порции по 25 мл и каждую импульсно обрабатывали ультразвуком (Omni Sonic Ruptor 4000, США) при 4°C, мощности 30% и импульсном режиме 30% в течение 10 мин по два раза. Клеточный

лизат центрифугировали (8600 g, 15 мин, 4°C), отбирали супернатант и добавляли к нему сульфат аммония до конечной концентрации 50% насыщения (0,3 г/мл) и оставляли на 16 ч при 4°C. Полученный осадок отделяли центрифугированием (8600 g, 10 мин). Осадок растворяли в 16 мл буфера L-His, разделяли на две части по 8 мл, центрифугировали (8600 g, 10 мин, 4°C), отбирали супернатант. Супернатант диализовали против 1,6 л буфера L-His в диализном мешке SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO (Thermo Fisher, США) в течение 6 ч при 4°C. После замены буфера диализ продолжали в течение ночи при 4°C. Диализованный раствор центрифугировали (8600 g, 15 мин, 4°C) и отбирали супернатант для дальнейшей очистки.

Вторую стадию очистки M4in/S проводили методом анионнообменной хроматографии на колонке (1,5x7 см) с сорбентом UNOsphere Q Anion Exchange Resin (BioRad, США). Хроматографию проводили с объёмной скоростью 1,8 мл/мин. Колонку уравновешивали 24 мл L-His, наносили супернатант после диализа и промывали 12 мл L-His. Элюцию проводили линейным градиентом от 0 до 0,3 М NaCl в 72 мл L-His, собирая фракции по 2 мл. Полученные препараты анализировали методом гель-электрофореза. Фракции с наибольшим содержанием M4in/S (по данным электрофореза) объединяли и концентрировали методом ультрафильтрации на центрифужных фильтрах Amicon Ultra-15 (Milipore, США).

Третью стадию очистки M4in/S проводили методом гельпроникающей хроматографии на колонке Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare, Швеция). Голубой декстран (2000 кДа), бычий сывороточный альбумин (66,6 кДа), карбоангидраза (29 кДа), цитохром С (12,4 кДа) и апротинин (6,5 кДа) (Merck, Германия) были использованы как стандарты молекулярных масс. Аликвоту сконцентрированного образца после анионнообменной хроматографии объёмом 200 мкл наносили на колонку, уравновешенную 50 мМ Tris-HCl, содержащим 0,15 М NaCl, pH 7,4. Элюирование проводили тем же буфером со скоростью потока 0,5 мл/мин, собирая фракции по 200 мкл. Фракции, содержащие целевой белок M4in/S (по данным электрофореза), объединяли. Объединённые фракции диализовали против 100 объёмов 50 мМ бикарбоната аммония в диализном мешке

SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO (Thermo Fisher, США) в течение 6 ч при 4°C. После замены буфера диализ продолжали в течение ночи при 4°C. Диализованный раствор центрифугировали (8600 g, 15 мин), супернатант высушивали лиофильно. Лиофильную сушку проводили при -52°C в течение 18 ч.

3.5.3 Получение эмфорина M4in-His6/S и его мутантных

вариантов

Клетки E. coli BL-21 (DE3) трансформировали pM4in-His6/S, pD70A, pD70S, pD70N, pD70E, pF21S, pA22S, pF23S, pF21S-A22S, pA22S-F23S, pF21S-F23S, pF21S-A22S-F23S или pD70A-F21S-A22S-F23S и выращивали в 250 мл аутоиндукционной среды BB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, при 37°С и интенсивном перемешивании (220 об/мин) в течение 2 ч, а затем при 16°С в течение 96 ч до оптической плотности ОП600 = 10-12. Клеточную суспензию центрифугировали (4000 g, 15 мин, 4°C), осадок замораживали и хранили при -20°С. Замороженную биомассу (1,5 г) ресуспендировали в 15 мл 50 мМ Tris-HCl, рН 8,0. Полученную суспензию обрабатывали ультразвуком (Omni Sonic Ruptor 4000, США) при 4°C, мощности 30% и импульсном режиме 30% в течение 12 мин. После центрифугирования (9000g, 4°C, 15 мин) супернатант наносили на колонку 1,5x1 см с сорбентом Ni-NTA XPure (UBPBio, США), уравновешенную тем же буфером. Колонку промывали 6 мл того же буфера и затем ступенчатым градиентом 10, 100 и 250 мМ имидазола в 30 мл того же буфера со скоростью потока 0,5 мл/мин. Целевые белки элюировались 100 мМ имидазола. Фракции с наибольшим содержанием целевого белка (по данным электрофореза) объединяли и концентрировали до объема 2 мл ультрафильтрацией с помощью Amicon Ultra-15 (Millipore, США). Аликвоту полученного образца объемом 0,5 мл наносили на колонку Superdex 75 Enhance 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенную 50 мМ Tris-HCl, содержащим 0,15 М NaCl, pH 7,4, и элюировали тем же буфером со скоростью потока 0,5 мл/мин. Фракции, содержащие целевой белок (по данным электрофореза), объединяли и концентрировали до объема 2 мл ультрафильтрацией на Amicon Ultra-15. Для обессоливания концентрат наносили

на колонку PD-10 (GE Healthcare), уравновешенную 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, и элюировали тем же буфером. Полученный образец целевого белка центрифугировали (9000g, 4°С, 5 мин) и сразу использовали для анализа активности и регистрации спектров КД.

3.6 Анализ ингибирующей активности

Анализ ингибирующей активности проводили с использованием пептидного субстрата с внутренним гашением флуоресценции, 2-аминобензоил^-аргинил-Ь-серил^-валил-Ь-изолейцил-Ь-(8-2,4-динитрофенил)лизина (Abz-RSVIK(Dnp)) [192]. Концентрация Pln в реакционной смеси составляла 50 пМ, а концентрация Abz-RSVIK(Dnp) - 30 или 90 мкМ. Концентрации вариантов M4in варьировали в зависимости от их активности в диапазоне от 50 пМ до 10 мкМ. Реакции проводили в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,4. Для каждой пары концентраций субстрата и ингибитора было проведено три независимых измерения. Для регистрации флуоресценции во времени (длина волны возбуждения - 320 нм; длина волны испускания - 420 нм) использовали прибор CLARIOstar Plus (BMG, Германия).

При медленном связывании ингибитора с ферментом для каждой кинетической кривой проводили нелинейную регрессию по уравнению (1) для медленно-связывающихся ингибиторов. Полученные параметры ka, v0 и vs для одинаковых условий усредняли и анализировали их зависимость от концентрации ингибитора при концентрациях субстрата 30 и 90 мкМ.

[P]t = Vs + + с, (!)

ка

где [P]t - концентрация продукта реакции в момент времени t, M;

ka - кажущаяся константа скорости первого порядка для описания равновесного состояния между свободным ферментом, ингибитором и комплексом EI при конкретных концентрациях субстрата и ингибитора, с-1; vs - стационарная скорость, M • с-1; v0 - начальная скорость, M • с-1;

C - константа, необходимая для исправления отклонений базовой линии, M.

Данные о зависимости ka от концентрации субстрата аппроксимировали уравнением (2) с помощью линейной регрессии. Для каждой концентрации субстрата константы скоростей k+3 и k-3 определяли как угловой коэффициент и точку пересечения с осью ординат, соответственно:

ka = k-3 + (1+k[S^/KM)' (2)

где k+3 - прямая константа (второго порядка) скорости образования комплекса

фермент-ингибитор, M-1 • с-1;

k-3 - обратная константа (первого порядка) скорости образования комплекса

фермент-ингибитор, с-1;

[S] - начальная концентрация субстрата, M;

[I] - начальная концентрация ингибитора, М; - константа Михаэлиса-Ментен, М.

Значения констант k+3 и k-3, определённые для разных концентраций

субстрата, усредняли и по уравнению (3) рассчитывали константу ингибирования (Ki), M.

k-3 (3)

k+3

При быстром связывании ингибитора с ферментом (классическое ингибирование) кинетические кривые аппроксимировали линейным уравнением и константы ингибирования были получены методом Диксона [197, 198].

Для Pln в расчётах использовали константу Михаэлиса-Ментен KM = 35 мкМ, полученную ранее [192]. Анализ данных проводили при помощи программы GraphPad Prism версии 9.0 (www.graphpad.com GraphPad Software, США).

3.7 Анализ последовательностей

Для анализа последовательностей эмфориноподобных ингибиторов был использован ранее описанный набор из 908 последовательностей [191]. Последовательности были выровнены с использованием программы Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa/clustalo) [199]. Пятнадцать

последовательностей с неполными N- или C-концевыми областями были исключены из выравнивания. В оставшемся выравнивании были удалены области, отсутствующие в M4in (GenBank ARS03586). Полученный набор выровненных

последовательностей был использован для генерации LOGO с помощью WebLogo версии 3.7.4 (https://weblogo.threeplusone.com) [200].

3.8 Молекулярный докинг

Молекулярный докинг проводился на онлайн-сервере Rosetta (ROSIE) с помощью локального протокола белок-белкового докинга (https://rosie.rosettacommons.org/docking2) [201]. Для докинга использовали каждую из 20 моделей M4in (PDB ID: 6ZYG), а также модель пространственной структуры зрелого Pln, основанную на кристаллической структуре предшественника Pln (PDB ID: 2VQX). Модель зрелого Pln была получена путём удаления из структуры предшественника области пропептида и включала остатки с 51 по 341 (нумерация соответствует последовательности предшественника). Начальные взаиморасположения структурных моделей для докинга были получены путем позиционирования M4in относительно зрелого Pln таким образом, чтобы боковая цепь Asp70 M4in находилась вблизи иона Zn2+ каталитического центра Pln, а боковая цепь Phe21 M4in была ориентирована в сторону участка связывания субстрата S1'-S2' Pln [26]. Структура зрелого Pln и стартовые позиции партнеров были созданы с использованием системы молекулярной графики PyMOL версии 2.4 (Schrodinger).

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Разработка количественного метода определения активности ингибиторов протеализинподобных протеаз

Для исследования механизма действия эмфорина (М4т) нами был разработан метод количественного определения активности ингибиторов протеализинподобных протеаз (ППП). На первый взгляд определение ингибирующей активности представляется простой задачей, заключающейся в добавлении раствора ингибитора к раствору фермента и регистрации изменения скорости реакции гидролиза субстрата. Однако на практике реализация такого подхода сталкивается с рядом методических ограничений, особенно при работе с ингибиторами высокой аффинности, такими как эмфорин.

Разработанный нами метод основан на описанном ранее способе анализа активности протеализина (Р1п) по гидролизу пептидного субстрата с внутренним тушением флуоресценции 2-аминобензоил-Лг§-8ег-Уа1-11е-Ьув(2,4-

динитрофенила) - Л^-ЯБУЖфпр), структура которого базируется на последовательности сайта автокаталитического процессинга предшественника Р1п (рисунок 4.1) [192]. Изначально данный субстрат применяли для определения активности ППП и при проведении реакции использовали достаточно высокую концентрацию Р1п - 2,5 нМ.

ABZ - 2-аминобензоил (флуорофор); DNP - 2,4-динитрофенил (тушитель флуоресценции); ABZ-RSVIK(DNP) - пептидный субстрат с внутренним тушением флуоресценции для определения активности протеализинподобных протеаз.

Рисунок 4.1 — Схема метода анализа активности ингибиторов протеализинподобных протеаз

При первых попытках измерить ингибирующую активность M4in добавляли различные концентрации ингибитора, но даже при снижении концентрации до 2,5 нм фермент полностью инактивировался. Это указывало на то, что M4in обладает высокой аффинностью и, следовательно, низким значением константы ингибирования (по крайней мере К;<10-8). В такой постановке реакции концентрация фермента была выше константы ингибирования ([Е]»^), поэтому весь фермент быстро связывался с ингибитором и полностью инактивировался. В этой ситуации определить зависимость скорости реакции от концентрации ингибитора и, следовательно, эффективность ингибирования невозможно. Стало понятно, что необходимо снижать концентрацию фермента до значений, которые были бы ниже, чем ожидаемая К или, в крайнем случае, сравнимы с ней ([Е] < К^. Уменьшение концентрации фермента вело к снижению регистрируемого флуоресцентного сигнала, что требовало повышения чувствительности измерений.

Это можно сделать различными способами: подобрать более чувствительный субстрат, оптимизировать настройки прибора, увеличить соотношение сигнал/шум и время реакции. Флуорогенные субстраты (как ЛЬ7-КЗУ1К(Впр)) в принципе в настоящее время обеспечивают наиболее высокую чувствительность и значительно превосходят использовавшиеся ранее хромогенные субстраты (например, БЛОЬЛ - К-[3-(2-фурил)акрилоил]-глицил-Ь-лейцинамид для протеализинподобных протеаз). Важными параметрами при конструировании флуорогенного субстрата являются выбор пары флуорофор-тушитель (с учётом их химических и фотофизических свойств), правильное расстояние между флуорофором и тушителем не превышающее 5-10 нм (внутреннее тушение флуоресценции происходит только на коротких дистанциях), и совместимость с оборудованием (длины волн возбуждения/эмиссии). Для наилучшей чувствительности метода спектр испускания флуорофора должен хорошо перекрываться со спектром поглощения тушителя, что обеспечит низкой фон субстрата до гидролиза и резкий рост сигнала после. Используемый нами субстрат ЛЬ7-Я8У1К(Впр) обладает достаточно высокой чувствительностью и содержит классическую пару флуорофор (2-аминобензоил, ЛЬ7)-тушитель

(2,4-динитрофенил, Бпр). Малый размер молекул ЛЬ7 и Бпр обеспечивает хорошую растворимость субстрата. Существуют субстраты с более эффективными парами молекул флуорофор-тушитель (например, ЕВЛКБ/ВЛБСУЬ, ЕЛМЮЛБСУЬ), но зачастую они обладают низкой растворимостью, что не позволило бы работать при высоких концентрациях, соизмеримых с Км. Кроме того, их флуоресценция сильнее зависит от рН и они были бы существенно дороже. В нашем случае выигрыш от замены пары флуорофор-тушитель был бы небольшой (< 10 раз), а с учётом других недостатков замена субстрата в этой ситуации была не целесообразной. Задачу повышения чувствительности метода было решено реализовать за счёт оптимизации других параметров.

Другим способом повысить чувствительность метода является изменение настроек параметров флуориметра. Важной составляющей флуориметра является фотоэлектронный умножитель (фотоумножитель) - это детектор, который преобразует слабый световой сигнал (флуоресценцию) в электрический сигнал и усиливает его. Увеличение усиления фотоумножителя позволяет регистрировать более слабые флуоресцентные сигналы. Однако настройка усиления фотоумножителя требует соблюдения осторожного баланса, так как при слишком высоком усилении может ухудшаться стабильность измерений (появляются артефакты и нелинейности). Обычно оптимальное значение усиления выбирают так, чтобы максимизировать отношение сигнал/шум и избежать насыщения детектора. Нами было выбрано такое усиление, чтобы фоновый шум субстрата составлял не более 20% от верхнего предела измерения. Это дало возможность детектировать активность фермента при концентрации на два порядка ниже исходной (2,5 нМ), вплоть до 25 пМ. Однако при минимальной концентрации, несмотря на то, сигнал чётко детектировался, соотношение сигнал/шум было низким. Поэтому на основании серии тестов в качестве рабочей была выбрана концентрация фермента 50 пМ, что позволяет работать с ингибиторами с К! в субнаномолярном диапазоне (рисунок 4.2).

Были также оптимизированы другие условия ферментативной реакции. Важным аспектом постановки реакции является порядок добавления компонентов.

Концентрации протеализина 0, 25, 50, 100, 250, 500 и 2500 пМ; концентрация ЛЬ2-К8УГК(Бпр) 30 мкМ. Реакции проводили при температуре 37°С. ЛЬ2-Я8 (2-аминобензоил-Ь-аргинил-Ь-серин) является продуктом гидролиза субстрата. Пересчет относительных единиц флуоресценции в концентрацию продукта производился с использованием калибровочных кривых.

Рисунок 4.2 — Кинетика гидролиза ЛЬ2-К8УГК(Впр) протеализином при различных

концентрациях

Запуск реакции может осуществляться двумя основными способами: добавление фермента к смеси субстрата с ингибитором и добавление субстрата к смеси фермента с ингибитором. Запуск реакции ферментом позволяет регистрировать полную кинетическую кривую, определять, как начальную, так и стационарную скорость гидролиза, что особенно важно для изучения медленно-связывающихся ингибиторов. При запуске реакции субстратом, осуществляется предварительная инкубация фермента с ингибитором, что позволяет измерить только стационарную скорость гидролиза. Этот способ предпочтителен, если ингибитор связывается слишком медленно (часы) и обязателен, если ингибирование необратимое. Уже на начальных этапах исследования ингибирующего действия эмфорина стало ясно, что кривые имеют вид, характерный для медленно-связывающихся ингибиторов. Поэтому в нашем случае использовался запуск реакции ферментом, что позволило детально изучить кинетику связывания эмфорина. Поскольку для расчётов кинетических параметров необходимо определение как начальной, так и стационарной скорости реакции, мы

регистрировали кинетику реакций достаточно продолжительное время, в течение 15 мин.

Последним ключевым аспектом увеличения чувствительности, а также воспроизводимости метода является увеличение соотношения сигнал/шум. Источником шума может являться как прибор, так и сама система реакции. Так, на скорость реакции, флуоресценцию и стабильность белков влияет температура. Чтобы уменьшить колебания температуры мы предынкубировали растворы белков до внесения в реакцию, заранее прогревали прибор и термостатировали планшет при выбранной температуре реакции.

Оптический шум может быть вызван образованием пузырей и взвесей в растворе, недостаточно чистыми поверхностями, пылью, всё это приводит к рассеянию света и изменению сигнала. Для устранения оптического шума мы использовали одноразовую посуду и удаляли нерастворимые примеси из используемых растворов с помощью предварительного центрифугирования или фильтрации.

Фоновая флуоресценция может быть вызвана автофлуоресценцией компонентов буфера, белков и добавок. Избежать этого помогает выбор спектрально чистых компонентов, уменьшение концентраций других флуоресцирующих компонентов или подбор флуорофора со спектром возбуждения, смещённым в красную область. Используемый нами в реакции буфер 50 мМ ТпБ-НС1, рН 7,4 обладал пренебрежительно малой автофлуоресценцией по сравнению с сигналом флуорофора.

Приборный шум может быть результатом нестабильности источника света, детектора или фотоумножителя. Предварительный запуск прибора, оптимальное усиление фотоумножителя, отсутствие перегрузки детектора и усреднение сигнала по времени позволяют нивелировать шум от прибора.

Временные колебания сигнала в начальной фазе реакции могут быть вызваны разными причинами. Так, неоднородность реакционной смеси из-за погрешностей смешивания приводит к локальным вариациям концентраций, что искажает начальную кинетику реакции. Задержка запуска измерений, когда между началом

реакции и первым измерением проходит слишком много времени, ведёт к потере важных начальных данных. Контроль времени задержки позволяет зафиксировать интервал между запуском реакции и началом измерений. Температурные флуктуации и артефакты оборудования также могут вносить дополнительный шум. Эти причины эффективно устраняются стандартизацией процедуры запуска реакции. В частности, для обеспечения гомогенизации реакционной смеси мы осуществляли быстрое однократное перемешивание после добавления всех реагентов.

Адсорбция белков на стенках микроцентрифужных пробирок при хранении является серьёзной проблемой, особенно при работе с низкими концентрациями. Это приводит к снижению реальной концентрации белков в растворе и низкой воспроизводимости данных. Минимизировать сорбцию можно различными способами: выбором материала пробирок (использование низкосорбирующих пробирок, полипропилен, например, предпочтительнее, чем полистирол), добавлением «белка-носителя» (например, 0,1% бычьего сывороточного альбумина), использованием поверхностно-активных веществ (Tween-20, Тгйоп Х-100), изменением состава буфера (например, добавление 100-150 мМ №С1 для увеличение ионной силы, 10% глицерина), приготовлением свежих растворов реагентов непосредственно перед каждым измерением. В нашем случае мы не модифицировали состав буфера, но готовили свежие растворы белков перед каждым измерением, что положительно влияло на воспроизводимость.

Помимо учёта источников шума в каждый эксперимент были включены контрольные реакции. Контроль фона субстрата (субстрат, буфер, без добавления фермента) для оценки неспецифического гидролиза субстрата и его концентрации в реакции. Контроль активности фермента (субстрат, фермент, без добавления ингибитора) для установки референсного значения 100% активности и оценки стабильности фермента. Для подтверждения достоверности и воспроизводимости данных все измерения проводились в нескольких технических повторах с последующей статистической обработкой данных.

Итак, разработка методики определения активности ингибиторов требует тщательной оптимизации. В рамках данной работы была стандартизирована процедура постановки реакции и осуществлялся контроль возможных источников шума, что позволило обеспечить высокую воспроизводимость метода и снизить вариабельность данных до 5%. Предложенный метод определения ингибиторной активности был успешно валидирован на системе Pln-M4in (рисунок 4.3), а затем с его помощью были определены ингибирующие активности всех мутантных вариантов M4in (см. раздел 4.5).

Таким образом, нами разработан метод определения активности ингибиторов ППП. Этот метод может быть использован для изучения высокоаффинного ингибирования (Ki < 1010 M) и кинетики медленного связывания, позволяя проводить как качественную, так и количественную оценку ингибирующей способности.

4.2 Изучение влияния эмфорина на кинетику реакции гидролиза,

катализируемого протеализином

Для изучения ингибирующей активности эмфорина рекомбинантные белки Pln и M4in/S (M4in c заменой Cys68^Ser, препятствующей образованию неактивных ковалентных димеров) были получены в E. coli по ранее разработанной схеме [191]. Влияние M4in/S на кинетику гидролиза Abz-RSVIK(Dnp) протеализином исследовали при шести концентрациях M4in/S (от 0,5 до 3,5 нМ) и двух концентрациях субстрата (30 и 90 мкМ). Зарегистрированные кинетические кривые гидролиза демонстрировали медленное снижение скорости реакции во времени (рисунок 4.3а), что характерно для медленно-связывающихся ингибиторов и не соответствует классическому (быстрому) типу ингибирования, при котором скорость реакции остаётся постоянной в отсутствие истощения субстрата (при [S]>>KM). Все полученные кинетические кривые с использованием метода нелинейной регрессии были аппроксимированы интегральным уравнением скорости для медленно-связывающихся ингибиторов (уравнение 1 в п. 3.6 раздела «Материалы и методы»). Высокая степень соответствия экспериментальных

данных полученным кривым (Я2 > 0,98) подтвердила вывод о том, что М4т взаимодействует с Р1п по механизму медленного связывания.

Регрессионный анализ позволил получить значения параметров интегрального уравнения скорости (у0, vs и ка). Для определения кинетических и равновесных констант взаимодействия М4т с Р1п были построены графики зависимости начальной скорости ^0), стационарной скорости и кажущейся константы скорости первого порядка (ка) от концентрации ингибитора при концентрациях субстрата 30 и 90 мкМ (рисунок 4.3б). Анализ таких зависимостей позволяет различить одноступенчатый и двухступенчатый механизмы медленного-связывания (рисунок 4.4) [3].

Двухступенчатый механизм более общий и предполагает быстрое образование комплекса Е1, который затем медленно изомеризуется в комплекс ЕТ, то есть значения к+3[1] и к-3, заметно выше в сравнении с к+4 и к-4. В случае одностадийного механизма образование комплекса Е1 происходит в одну медленную стадию, а величины к+3[1] и к-3 невелики относительно к+г[Б], к-г и к+2, то есть образование комплекса фермент-субстрат (Е8) происходит значительно быстрее, чем образование и диссоциация комплекса Е1. При ингибировании М4т характер полученных зависимостей не зависит от концентрации ингибитора, vs зависит гиперболически, а ка зависит линейно, рисунок 4.3б) указывает на одностадийное образование комплекса фермент-ингибитор (Е1), которое описывается константами скорости прямой к+3 и обратной к-3 реакций (рисунок 4.4) [3]. Кроме того, кривые, отражающие зависимость ка от концентрации ингибитора при различных концентрациях субстрата, пересекаются на оси ординат, что указывает на конкурентный характер ингибирования. Константы к+3 и к-3 были рассчитаны для каждой концентрации субстрата для чего зависимость ка аппроксимировали уравнением (2) (в п. 3.6 раздела «Материалы и методы»), а затем усреднены. Константу ингибирования (К^) рассчитывали по уравнению (3) (в п. 3.6 раздела «Материалы и методы») (таблица 4.2). Таким образом, М4т/8 является сильным (К± = (5,2±1,4)10-11 М) конкурентным медленно-связывающимся ингибитором Р1п.

А. Репрезентативные кинетические кривые ингибирования Pln эмфорином ^4^^). Б. Зависимость значений у0, vs и ка от концентрации M4in/S. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка для трёх независимых экспериментов. Концентрации субстрата составляли 30 и 90 мкМ; концентрации М4т^ [М4т^] составляли 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 и 3,5 нМ; концентрация Р1п составляла 50 мкМ. Abz-RS является продуктом гидролиза субстрата.

Рисунок 4.3 — Влияние эмфорина на гидролиз Abz-RSVIK(Dnp), катализируемого

протеализином ^1п)

Красной рамкой выделен одноступенчатый механизм реакции характерный для действия эмфорина на протеализин. E - фермент, I - ингибитор, S -субстрат, P - продукт, k - константы скоростей прямых (Ъ, k2, kз, k4) и обратных (^1, k-з, k-4) реакций.

Рисунок 4.4 — Обобщенная схема механизмов конкурентного ингибирования с медленным

связыванием [3]

С функциональной точки зрения идеальной комбинацией для ингибитора является быстрая ассоциация и медленная диссоциация, что обеспечивает высокую прочность связывания (аффинность). Такой ингибитор мгновенно находит мишень и надолго с ней связывается. Однако в природе сверхпрочное связывание очень часто достигается через медленную ассоциацию. Медленное связывание является индикатором сложного и высокооптимизированного механизма, который обеспечивает высокую эффективность и специфичность ингибирования.

Медленное связывание ингибитора с ферментом может быть обусловлено несколькими факторами [202]. Во-первых, вероятным объяснением является необходимость структурной перестройки фермента и/или ингибитора для образования стабильного комплекса. Белковые ингибиторы, в отличие от низкомолекулярных, часто взаимодействуют с ферментами через обширные интерфейсы (поверхности взаимодействия), включающие гибкие петли, элементы вторичной структуры (такие как а-спирали и Р-листы), и образуют сеть специфических водородных и ионных связей, а также ван-дер-ваальсовых и гидрофобных взаимодействий. Формирование таких взаимодействий может требовать времени, особенно если они сопровождается конформационными перестройками, например, когда ингибитору или активному центру фермента необходимо принять определённую пространственную структуру для эффективного связывания (механизм конформационного отбора). Во-вторых, кинетическая задержка может быть следствием двухступенчатого взаимодействия, включающего первичное быстрое, но слабое связывание, за которым следует медленная стабилизация комплекса (механизм индуцированного соответствия). Поскольку в случае эмфорина данные указывают на одностадийную модель, то структурная перестройка является более вероятной причиной медленного связывания.

Высокая аффинность ингибитора обеспечивает эффективное ингибирование при низких концентрациях ингибитора [203]. Это критически важно в физиологических условиях, например, в клетке, где ингибитор и фермент экспрессируются в ограниченных количествах, поскольку позволяет эффективно

контролировать активность фермента. В фармакологии сильное связывание ингибитора увеличивает продолжительность действия препарата, что позволяет снизить частоту его приёма. Даже после падения концентрации свободного ингибитора, комплекс фермент-ингибитор остаётся стабильным, продлевая терапевтический эффект. В контексте бактериальной инфекции эмфорин может обеспечивать пролонгированное подавление активности металлопротеаз, участвующих, например, в инвазии, разрушении клеточных барьеров или модуляции иммунного ответа [204].

Однако для клетки выгоден не просто эффективный, но и обратимый ингибитор. Обратимость позволяет гибко регулировать активность фермента, чтобы адаптироваться к изменяющимся условиям. Если бы связывание было необратимым, клетка не смогла бы быстро восстановить активность фермента и пришлось бы тратить энергию и время на синтез новых молекул. При обратимом связывании переключение активности фермента происходит за счёт удаления ингибитора от уже существующих молекул фермента, что экономит время и энергию. Удаление может происходить за счёт: разбавления (например, при делении клетки), протеолитической деградации ингибитора другими протеазами, снижения экспрессии гена ингибитора, изменений условий среды (рН, ионная сила, окислительный стресс), ослабляющих связывание. Таким образом, эмфорин как обратимый ингибитор способен обеспечивать высокую степень контроля активности протеаз в клетке с возможностью оперативного «переключения» ферментативной активности [205, 206].

4.3 Анализ последовательностей эмфориноподобных ингибиторов и пространственной структуры эмфорина, построение модели комплекса эмфорина с протеализином

Эмфориноподобные ингибиторы (ЭПИ) по своей первичной и пространственной структуре не демонстрируют значимого сходства с другими известными БИП, что позволяет рассматривать их как новое семейство белковых ингибиторов. Механизм действия представителей ЭПИ в настоящее время остаётся

неизученным, поэтому его определение является актуальной научной задачей. Вероятно, ЭПИ принимают участие в регуляции активности их природных мишеней - протеализинподобных протеаз (111111). Биологические функции ППП не установлены, однако опубликованные данные позволяют предполагать, что эти ферменты вовлечены во взаимодействие бактерий с высшими организмами и, вероятно, в патогенез [29-32]. Таким образом, выяснение механизма ингибирования не только расширит наши знания о механизмах действия БИМ, но может дать новую информацию об их биологической роли и механизмах регуляции активности ППП in vivo.

Для раскрытия молекулярного механизма действия БИП необходимы данные о взаимодействии ингибитора с ферментом. Такие данные могут быть получены непосредственно с помощью методов структурной биологии, однако это далеко не рутинная задача. В частности, в нашей лаборатории ранее предпринимались попытки кристаллизации комплекса Pln-M4in, которые оказались безуспешными. Вместе с тем, в разное время были получены методом рентгеновской кристаллографии структура предшественника протеализина (Pln) и методом спектроскопии ЯМР структура эмфорина (M4in). Эти структуры могут стать основой для построения модели взаимодействия. Полученные ранее данные малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) и другие биохимические данные демонстрируют, что в растворе Pln и M4in находятся в мономерной форме и взаимодействуют в соотношении 1:1 [191], что упрощает и делает более определённой задачу молекулярного моделирования. Также в случае Pln экспериментально показано, что M4in взаимодействует с активным центром фермента [191]. Однако о том, какой регион ингибитора участвует в связывании c Pln ничего не известно. Данные МУРР для комплекса Pln-M4in не позволили установить эту область.

Основываясь на предположении, что регион взаимодействия должен быть консервативен для всех белков семейства ЭПИ, мы проанализировали 908 аминокислотных последовательностей представителей ЭПИ, что позволило выявить потенциально функционально значимые аминокислотные остатки (а.о.).

Было выявлено 14 консервативных а.о. (рисунок 4.5а). Девять из них оказались погруженными в белковую глобулу (рисунок 4.5б). Из них 5 а.о. (Ile13, Phe74, Val76, Leu105, Trp106, нумерация по последовательности M4in) гидрофобные и, вероятно, участвуют в формировании гидрофобного кора белка. Остатки Arg17 и Glu95 (примерно у половины ЭПИ в 95 положении находится Asp) образуют внутримолекулярную ионную связь между у-карбоксильной группой Glu95 и гуанидиновой группой Arg17; c карбоксильной группой Glu95 взаимодействует и гуанидиновая группа Arg72. В обоих случаях минимальное расстояние между атомами кислорода и азота от 2.7 А по данным ЯМР. Расстояния рассчитаны на основе данных ЯМР для 20 моделей структур эмфорина, наилучшим образом соответствующих целевой функции (PDB ID: 6ZYG). Алифатическая же часть бокового радикала Arg72, по-видимому, участвует в формировании гидрофобного кора молекулы, также как остаток Phe, находящийся в этой позиции у большинства ЭПИ. Таким образом, а.о. 13, 17, 72, 74, 76, 95, 105 и 106, очевидно, выполняют структурообразующую функцию и, скорее всего, не участвуют во взаимодействии ЭПИ с протеазами. Консервативные позиции в ЭПИ включают Met11 (Thr в M4in). Однако это объясняется тем, что N-концевой участок у 2/3 ЭПИ на десять а.о. короче, чем у M4in; следовательно, позиция 11 соответствует первому а.о. полипептидной цепи. Таким образом, данный а.о., который в M4in тоже находится внутри белковой глобулы и образует внутримолекулярную водородную связь, не может рассматриваться как потенциальный элемент белок-белкового взаимодействия.

Остальные 5 консервативных а.о. (Gly19, Gly20, Phe21, Ala22 и Asp70) формируют компактный кластер, расположены на поверхности молекулы M4in и соответствуют одному из регионов, которые могут взаимодействовать с активным центром Pln по данным МУРР [191]. Боковые цепи Phe21, Ala22 и Asp70 в большинстве рассчитанных на основе ЯМР данных моделей структуры белка экспонированы в растворитель, то есть эти остатки могут быть вовлечены в белок-белковые взаимодействия. Следует отметить также, что по результатам ЯМР исследований регионы 18-29 и 61-70, являются самыми подвижными участками

молекулы [1]. Принципиально, что гидрофобные а.о. Phe и Ala соответствуют субстратной специфичности Pln [26, 207], а Asp способен формировать координационные связи с ионами металлов. Таким образом, можно предположить, что Phe21 и Ala22 взаимодействуют c S1' и S2' субстрат-связывающими сайтами фермента (номенклатура по Шехтеру и Бергеру [42]), а Р-карбоксильная группа Asp70 координирует ион цинка активного центра, вытесняя каталитическую воду, что и приводит к потере активности ферментом.

А. LOGO представление консенсусной последовательности эмфориноподобных ингибиторов. Цветные пятиугольники обозначают консервативные остатки, обсуждаемые в тексте; цвета как на панели Б, нумерация по последовательности эмфорина. Б. Локализация наиболее консервативных остатков, отмеченных на панели A, в молекуле эмфорина. Остатки, погруженные в белковую глобулу маркированы зелёным, остатки, расположенные на поверхности и, предположительно, формирующие активный центр ингибитора, маркированы розовым. Thr 11, соответствующий стартовому метионину в 2/3 последовательностей ЭПИ, отмечен серо-голубым. Атомы кислорода и азота отмечены красным и синим, соответственно. Рисунок, воспроизведен из статьи [1], в которой опубликованы результаты диссертационного исследования.

Рисунок 4.5 — Консервативные остатки эмфориноподобных ингибиторов

Основываясь на предположении о взаимодействии в-карбоксильной группы Asp70 с цинком активного центра Р1п и боковых цепей Phe21 и А1а22 с S1' и S2' сайтами фермента, мы провели моделирование комплекса Р1п-М4т с использованием молекулярного докинга. Докинг был проведен для всех 20 моделей пространственной ЯМР-структуры М4т находящихся в РБЬ (67УО). Поскольку положение петель, в которых расположены а.о. 70 и 21, и положение боковых цепей этих а.о. отличается от модели к модели, результаты докинга были неидентичными для разных моделей. Однако общая геометрия содержащего Asp70 и Phe21 региона пространственной структуры М4т соответствовала геометрии активного центра Р1п во всех случаях. Наилучшие результаты были получены для модели 15 структуры М4т из 6ZYG) (рисунок 4.6).

А. Общий вид комплекса. Б. Увеличенная область активного сайта; пунктирной линией отмечена плоскость сечения панели В. В. Вид на плоскость, указанную пунктирной линией, со стороны стрелки на панели Б. Авр70, РЬе21 и РЬе23 выделены пурпурным цветом; зеленая сфера обозначает Zn2+ активного центра протеализина. Рисунок был создан с использованием системы молекулярной графики PyMOL. Рисунок, воспроизведен из статьи [1], в которой опубликованы результаты диссертационного исследования.

Рисунок 4.6 — Модель взаимодействия эмфорина (синяя модель) и протеализина (бежевая

поверхность)

В этом случае наблюдается как хорошая комплементарность общей геометрии взаимодействующих участков молекул, так и соответствующее высказанному предположению расположение боковых цепей а.о. 70 и 21 у M4in. Кроме того, в полученной модели боковая цепь Phe23 у M4in (а.о. не консервативен у других ЭПИ) занимает гидрофобный карман (рисунок 4.6), который в молекуле предшественника Pln занят Met14 пропептида [26]. Это позволяет предполагать, что Phe23 может вносить существенный вклад во взаимодействие ингибитора и протеазы, по крайней мере, в случае M4in и Pln. Докинговая модель была сопоставлена с полученной ранее ab initio моделью комплекса Pln-M4in на основе данных МУРР (анализ был проведен П.В. Конаревым) и продемонстрировано, что обе модели хорошо соответствуют (%2 = 0,97) [1].

Таким образом, имеющиеся экспериментальные данные о структуре комплекса M4in-Pln не противоречат гипотезе о том, что ключевым элементом активного центра ЭПИ является а.о. Asp70, который координирует каталитический ион цинка в активном центре фермента, а а.о. Phe21, Ala22, Phe23 взаимодействуют с его субстрат-связывающей областью.

4.4 Получение мутантных вариантов эмфорина в E. coli

Для проверки гипотезы о молекулярном механизме ингибирования M4in был использован классический подход, заключающийся в сайт-направленной модификации исследуемых а.о. и изучении свойств мутантных вариантов. Мишенями мутагенеза стали все 4 а.о. (Asp70, Phe21, Ala22 и Phe23), потенциально вовлечённые во взаимодействие с Pln. Список полученных мутантных вариантов M4in представлен в таблице 4.1. Во все варианты M4in для упрощения очистки была введена С-концевая последовательность, кодирующую 6 а.о. гистидина. Также все варианты несли замену Cys68-Ser, препятствующую образованию неактивных ковалентных димеров [191]. Варианты M4in были экспрессированы в E. coli и очищены до электрофоретической гомогенности с помощью металл-хелатной аффинной (МХАХ) и гельпроникающей (ГПХ) хроматографий. Ход очистки представлен на рисунке 4.7 и в таблице 4.1.

Таблица 4.1 — Очистка вариантов эмфорина

Вариант эмфорина Стадия очистки3 Общий белок (мг) Количество целевого белка6 (%) Выход (%) Степень очистки

M4inH6 КЛ 108 39 100 1.0

МХАХ 28 87 58 2.2

ГПХ 4 99 9 2.5

D70A КЛ 162 30 100 1.0

МХАХ 28 78 45 2.6

ГПХ 4 99 8 3.3

D70S КЛ 166 38 100 1.0

МХАХ 41 77 50 3.6

ГПХ 4 99 6 4.5

D70N КЛ 311 27 100 1.0

МХАХ 47 83 47 3.1

ГПХ 14 99 17 3.7

D70E КЛ 166 38 100 1.0

МХАХ 41 77 50 2.0

ГПХ 7 99 11 2.6

F21S КЛ 122 34 100 1.0

МХАХ 18 88 38 2.6

ГПХ 3 99 7 2.9

A22S КЛ 168 14 100 1.0

МХАХ 20 67 57 4.8

ГПХ 2 99 8 7.1

F23S КЛ 196 34 100 1.0

МХАХ 43 85 55 2.5

ГПХ 4 99 6 2.9

F21S-F23S КЛ 240 30 100 1.0

МХАХ 46 88 56 2.9

ГПХ 8 99 11 3.3

F21S-A22S КЛ 122 11 100 1.0

МХАХ 12 67 62 6.3

ГПХ 2 99 15 9.3

A22S-F23S КЛ 187 12 100 1.0

МХАХ 11 71 35 6.0

ГПХ 2 99 9 8.4

F21S-A22S-F23S КЛ 214 23 100 1.0

МХАХ 27 75 41 3.3

ГПХ 4 99 8 4.3

D70A-F21S-A22S-F23S КЛ 241 35 100 1.0

МХАХ 46 72 53 2.1

ГПХ 4 99 7 2.8

аКЛ - супернатант клеточного лизата; МХАХ - металл-хелатная аффинная хроматография; ГПХ - гельпроникающая хроматография. ^Количество целевого белка оценивали денситометрически по электрофореграммам, окрашенным кумасси бриллиантовым синим R-250.

Электрофорез проводили в 15% полиакриламидном геле с 0,1% додецилсульфатом натрия по Лэммли [2]. Белки визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым синим Я-250. М -стандарты молекулярной массы; КЛ - супернатант клеточного лизата; МХАХ - образец после металлохелатной аффинной хроматографии; ГПХ - образец после гельпроникающей хроматографии. Обозначения белков соответствуют таблице 4.1.

Рисунок 4.7 — Электрофоретический анализ препаратов рекомбинантных белков - вариантов

М4т в ходе очистки

Следует отметить, что в ходе очистки при фракционировании с помощью ГПХ препаратов, полученных после МХАХ, помимо мономерной формы М4т во

всех случаях обнаруживалось существенное количество агрегатов. Доля агрегатов отличалась для разных вариантов ингибиторов. Для M4in-His6/S и вариантов с заменами F21S, A22S, F23S, F21S-A22S, A22S-F23S, F21S-F23S, F21S-A22S-F23S (обозначения даны в соответствии с таблицей 4.1) она составляла около 20%. В случае всех вариантов с модификацией остатка D70 доля агрегатов была значительно выше и достигала 50%. Отсутствие агрегатов у M4in/S и их наличие у M4in-His6/S указывает на то, что причиной агрегации является добавление шестигистидиновой последовательности на С-конце. Образование агрегатов может быть связано с усилением межмолекулярных взаимодействий между мономерами в результате изменения заряда, гидрофобности и пространственной конфигурации С-концевого участка. Мутации а.о. D70, влияющие на заряд на поверхности M4in, также приводят к дополнительной дестабилизации мономерной формы и увеличению агрегации. При хранении полученных после ГПХ препаратов мономерных белков агрегаты постепенно формировались снова, что не позволяло получать лиофилизированные препараты белков, которые сильно агрегировали на этапе диализа перед высушиванием. Попытки борьбы с агрегацией, заключавшиеся в уменьшении концентрации белков при очистке, добавлении детергентов (Tween-20) или хаотропных агентов (мочевина 0,5 M) не увенчались успехом.

Для минимизации влияния агрегации на исследуемые свойства белков на этапе очистки методом ГПХ собирали фракции, содержащие исключительно мономерные белки. Эти белки с помощью ГПХ на колонках PD-10 переводили в необходимый буфер и немедленно использовали для регистрации спектров кругового дихроизма и определения активности. Для всех мутантных вариантов M4in спектры кругового дихроизма (рисунок 4.8) оказались практически идентичными (относительный вклад альфа-спиралей, бета-листов, поворотов и областей, не формирующих регулярных вторичных структур: 32±3, 23±9, 19±5 и 27±3 %, соответственно) и в основном соответствовали данным предсказанным на основе пространственной структуры M4in (28±2, 30±2, 4±2 и 38±1, соответственно). Совпадение спектров всех вариантов показывает, что введенные мутации не приводят к значимым изменениям пространственной структуры M4in.

Кривые для наглядности смещены вверх на 15103 град-см2-дмоль-1. Обозначения соответствуют таблице 4.1.

Рисунок 4.8 — Сравнение спектров кругового дихроизма в дальней УФ-области

для вариантов М4т

Таким образом, предложенная схема экспрессии и очистки позволяет получать мономерные мутантные формы M4in, пригодные для дальнейшего сравнения их ингибирующей активности.

4.5 Изучение влияния модификаций эмфорина на способность

ингибировать протеализин

Влияние мутантных вариантов M4in на активность Pln было проанализировано по описанному выше методу с использованием Abz-RSVIK(Dnp) в качестве субстрата [208]. Кинетика гидролиза была определена при двух концентрациях субстрата (30 и 90 мкМ) и шести концентрациях каждого из вариантов M4in. Диапазоны концентраций вариантов M4in были выбраны исходя из ингибирующей активности каждого белка (рисунок 4.9). Было продемонстрировано, что константы ингибирования для M4in/S и M4in-His6/S

совпадают. Следовательно, введение шестигистидиновой последовательности не влияет на ингибиторные свойства M4in.

Было установлено, что все модификации Asp70 значительно влияют на ингибирующую активность M4in: рассчитанные константы ингибирования (K¿) меняются на два-три порядка (таблица 4.2). При этом влияние модификаций усиливается в ряду Glu^-Asn^Ser^-Ala, что хорошо согласуется с предположением о формировании координационной связи между боковой цепью Asp70 и Zn2+ активного центра фермента. Так, замена Asp70 на отрицательно заряженную Glu (D70E) имеет наименьший эффект, что, по-видимому, объясняется удлинением боковой цепи при сохранении заряда и способности координировать ион цинка. Замена Asp70 на незаряженный Asn (D70N), влияет на ингибиторные свойства более сильно, что, вероятно, обусловлено подавлением ионного взаимодействия. Замена Asp70 на полярный Ser (D70S), боковая цепь которого слабо способна формировать координационные связи, приводит к еще большему увеличению K При введении в позицию 70 остатка Ala с гидрофобной боковой группой, сродство которой к иону Zn2+ минимально, наблюдается самое сильное снижение ингибиторной активности M4in.

Единичные замены остатков Phe21, Ala22, или Phe23 на Ser (F21S, A22S и F23S) влияют на ингибиторную способность M4in относительно слабо, Ki растет в 1.5-6 раз. Двойные замены (F21S-F23S, A22S-F23S и F21S-A22S) приводят к более существенным изменениям, увеличение Ki достигает 130 раз. При этом в случае F21S-F23S наблюдается синергический эффект. Максимальный эффект, 400-кратный рост Ki, наблюдается при модификации всех трех а.о. одновременно (F21S-A22S-F23S). Таким образом, кластер гидрофобных а.о. 21-23 в молекуле M4in оказывает существенное влияние на активность ингибитора, что свидетельствует в пользу высказанной гипотезы о взаимодействие участка 21 -23 с S' субстрат-связывающей областью протеазы. В то же время однозначно оценить вклад отдельных остатков во взаимодействие достаточно сложно, что, вероятно, объясняется влиянием соседних остатков друг на друга и влиянием на связывание общего снижения гидрофобности участка 21-23 при введении полярного Ser.

Однако на основе сопоставления эффектов одиночных и двойных замен можно предположить, что остаток Ala22 наименее значим для взаимодействия ингибитора с протеазой, а Phe21 и Phe23 вносят соизмеримый вклад в связывание. Здесь следует отметить, что в положении 21 у ЭПИ всегда находится гидрофобный остаток, а наиболее часто встречается именно Phe; в положении 22 наиболее часто обнаруживается Ala, более редкой альтернативой которому являются Gly и Thr. В положении же 23 консерватизм менее выражен, наиболее часто здесь обнаруживается остаток Gly (рисунок 4.5а).

Таким образом, по-видимому, взаимодействие с протеазой а.о., соответствующих 21 и 22 положению в молекуле M4in, реализуется сходным образом практически во всех парах ЭПИ-ППП, а роль а.о. в положении 23, вероятно, является специфической для конкретных случаев. Причем, учитывая то, что в этой позиции часто находится Gly, во многих случаях важным может быть не столько взаимодействие боковой группы этого а.о. с субстрат-связывающей областью протеазы, сколько подвижность или конформация основной цепи.

Следует отметить, что некоторые из введённых модификаций (варианты D70S, D70A, D70N, D70E, F21S-A22S, F21S-F23S и F21S-A22S-F23S) меняют характер ингибирования M4in с медленного связывания на классический (быстрый) тип ингибирования (таблица 4.2, рисунок 4.9). Изменение типа ингибирования в основном коррелирует с увеличением Ki и наблюдается при росте этого параметра более, чем на порядок. Однако в эту тенденцию не вписывается вариант D70A-F21S-A22S-F23S, который является худшим из ингибиторов, демонстрируя при этом медленное связывание (таблица 4.2). Наблюдаемый парадоксальный эффект, при котором комбинация мутаций D70A и F21S-A22S-F23S даёт медленно-связывающийся ингибитор, в то время как каждая из них по отдельности приводит к быстрому связыванию, указывает на синергетическое взаимодействие между этими аминокислотными заменами. Такое взаимодействие, по-видимому, опосредованно влияет на кинетику связывания, однако его структурная основа требует дальнейшего изучения.

Таблица 4.2 — Характеристики вариантов эмфоринаа

Варианты эмфоринаа Положение К / К (M4in-His6/S)б К (ОД k+з (нM-1 с-1) Ь3 (с-1) Тип

21 22 23 70 среднее ± SEв среднее ± SE среднее ± SE ингибирования

M4in/S Б Л Б Б 1 (5,2 ± 1,4) • 10-11 8 (5,0 ± 1,2)10-4 Медленный

M4in-His6/S Б Л Б Б 1 (5,9 ± 1,9) • 10-11 1 (1,1 ± 0,1)10-3 Медленный

D70A Б Л Б A 1119 (6,6 ± 0,9) •10-8 ,н/о н/о Быстрый

D70S Б Л Б S 339 (2,0 ± 0,5) •10-8 ±н/о н/о Быстрый

D70N Б Л Б N 149 (8,8 ± 1,0) •10-9 2±н/о н/о Быстрый

D70E Б Л Б E 63 (3,7 ± 2,5) •10-9 •0н1/0о н/о Быстрый

F21S И Л Б Б 1 (8,7 ± 2,1) •10-11 1 (1,5 ± 3,0)10-3 Медленный

A22S Б S Б Б 4 ( (5,5 ± 1,2)10-3 (1,4 ± 0,2)10-4 Медленный

F23S Б Л S Б 6 (3,6 ± 0,5) •10-10 (4,0 ± 0,5)10-3 (1,4 ± 0,1)10-4 Медленный

F21S-F23S И Л S Б 132 (7,8 ±4,0) •1 0-9 н/о н/о Быстрый

A22S-F23S Б S S Б 29 (1,7 ± 0,4) •10-9 н/о н/о Быстрый

F21S-A22S И S Б Б 4 (2,5 ± 1,1) •10-10 (9,3 ± 1,4)10-3 (2,0 ± 0,4)10-3 Медленный

F21S-A22S-F23S и S S Б 407 (2,4 ± 1,0) •10-8 н/о н/о Быстрый

D70A-F21S-A22S-F23S г S S A 42373 (2,5 ± 0,6) •10-6 ( (2,8 ± 0,1)10-3 Медленный

а Все варианты М4т (кроме М4т/8) несли С-концевую последовательность, кодирующую 6 остатков гистидина для упрощения очистки и замену СуБ68^ег, предотвращающую образование неактивных ковалентных димеров. Для вариантов Б70Л, Б218, Б218-Л228, Л228-Б238 и Б218-Л228-Б238 препараты белков были независимо получены дважды. Для каждого из полученных препаратов было проведено три независимых эксперимента, приведенные значения констант рассчитаны по результатам всех шести экспериментов. В остальных случаях значения констант рассчитаны по результатам трех независимых экспериментов для одного белкового препарата. б Округлено до целых значений. в Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка. н/о, не определено.

Рисунок 4.9 (окончание на следующей странице).

Рисунок 4.9. (окончание).

Время, с Время, с

Рисунок 4.9. (подпись на следующей странице).

Показаны репрезентативные наборы кинетических кривых, полученных для различных концентраций ингибитора и двух концентраций субстрата: 30 мкМ (левый столбец) и 90 мкМ (средний столбец). Расчёт констант ингибирования выполняли методом нелинейной регрессии по уравнению Моррисона для медленно-связывающихся ингибиторов (М4тЩ, Б218, Л228, Б238, A22S-F23S и D70A-Б21S-A22S-F23S) и по методу Диксона для классического типа ингибирования ^70А, D70S, D70N, D70E, Б218-Б238, Б21S-A22S и F21SA22S-F23S) (правый столбец); коэффициент детерминации ^2) во всех случаях был выше 0,98. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка для трёх независимых экспериментов. Обозначения белков соответствуют таблице 4.1.

Рисунок 4.9 — Гидролиз Abz-RSVIK(Dnp) протеализином в присутствии вариантов эмфорина и

определение констант ингибирования

Следовательно, одновременная инактивация обоих этих элементов должна приводить к драматическому падению активности М4т. Действительно, комбинация четырех мутаций Asp70-Ala, РИе21-8ег, Л1а22-8ег и Phe23-Ser (Б70Л-Б218-Л228-Б238) приводит к экстремальному увеличению К; более чем на четыре порядка.

Проведённый анализ влияния модификаций М4т на его ингибирующую активность в отношении Р1п позволяет описать молекулярный механизм действия ингибитора. Два пространственно сближенных гибких петлевых участка имеют решающее значение для взаимодействия ингибитора с протеазой. Первый участок включает остаток аспарагиновой кислоты, образующий координационную связь с 7п2+ активного центра фермента, а второй несет гидрофобные остатки, соответствующие субстратной специфичности протеазы и взаимодействующие с сайтами её 8' области. В целом, можно сделать вывод, что М4т и, вероятно, другие ЭПИ не действуют по «каноническому механизму» (также известному как «стандартный» или «механизм Ласковского») с субстратоподобным взаимодействием между БИП и ферментом [34, 40]. Напротив, структура активного центра М4т, соответствует «неканоническому механизму» действия, типичному для БИМ (см. раздел «Обзор литературы»).

Неканонический механизм действия БИМ реализуется по-разному, но в большинстве случаев (как и в случае с М4т) заключается в координировании каталитического иона цинка активного центра фермента, а также в правильном позиционировании ингибитора, которое обеспечивается дополнительными взаимодействия в 8 и/или Б' субстрат-связывающих областях металлопротеазы.

Координирование иона Zn2+ в активном центре металлопротеаз, может осуществляться через разные типы электронодонорных групп: атомами пептидного остова (карбонильный кислород или амидный азот основной цепи), терминальными группами (N-концевая аминогруппа и C-концевая карбоксильная группа), функциональными группами боковых цепей аминокислот (отрицательно заряженные карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислоты; положительно заряженные s-аминогруппа лизина, 5-гуанидиновая группа аргинина и Р-имидазольная группа гистидина; незаряженные сульфгидрильная группа цистеина, амидные группы аспарагина и глутамина, а также гидроксильные группы серина, треонина и тирозина) (см. раздел «Обзор литературы»). В случае M4in координирование иона цинка осуществляется боковой группой, а именно Р-карбоксильной группой аспарагиновой кислоты. Такой механизм часто встречается у пропептидов металлопротеаз (рисунок 4.10), но показан только для двух ингибирующих металлопротеазы астацинового семейства автономных БИМ: фетуина-Б [104] и белка сиззлед [115]. Механизм действия фетуина-Б был тщательно охарактеризован и подтверждён структурными данными (см. раздел «Обзор литературы»). Этот механизм в некоторых аспектах похож на механизм действия M4in (рисунок 4.10).

У M4in во взаимодействии участвуют две области — это петля GCGDQ, в которой локализован а.о. Asp, координирующий Zn2+, и петля GGFAF, которая взаимодействует с S' субстрат-связывающей областью. У фетуина-Б также основное взаимодействие с активным центром астацина осуществляется двумя петлевыми участками — это петля TCPDCP, которая также содержит а.о. Asp, координирующий Zn2+, но, кроме того, остатки TCP, взаимодействующие с S субстрат-связывающей областью, и петля QWVSGP, взаимодействующая с S' субстрат-связывающей областью. Ввиду очевидного различия в эволюционном происхождении ингибиторов, некоторое сходство механизмов, вероятно, может объясняться конвергентной эволюцией при адаптации к консервативным элементам активных центров металлопротеаз.

Рисунок 4.10 — Схема взаимодействия металлопротеаз с автономными белковыми ингибиторами и пропептидами, содержащими остатки аспарагиновой кислоты, которые

координируют ион цинка в активном центре

Хотя и M4in, и фетуин-Б используют Asp для координирования цинка и а.о. в неструктурированных петлях для взаимодействия с S' субстрат-связывающей областью, их дополнительные взаимодействия с металлопротеазами и структуры в целом значительно отличаются. У M4in остаток Phe21 занимает в активном центре протеализина S1' карман, структура которого в значительной степени определяет субстратную специфичность большинства металлопротеаз. Фетуин-Б взаимодействует по обе стороны активного центра, но при этом у него нет взаимодействий в области S1 и S1' карманов, что не характерно для БИМ. Кроме того, в фетуине-Б присутствует 6 дисульфидных связей, одна из которых стабилизирует петлю TCPDCP, а в природной последовательности M4in есть лишь один остаток цистеина (Cys68) в петле GCGDQ, который очевидно не может образовывать внутримолекулярные дисульфидные связи. В то же время оценить

вклад в ингибирование этого а.о. в настоящее время не представляется возможным, поскольку Cys68 способствовал образованию неактивных ковалентных димеров при очистке M4in в окислительных условиях и был заменён на серин в M4in/S. При этом M4in является внутриклеточным белком, а для бактериальной цитоплазмы характерны восстановительные условия. Следовательно, нативный M4in ковалентные димеры формировать не будет, а свойства его вариантов с Ser или Cys не должны существенно различаться.

Эмфорин и фетуин-Б представляют собой примеры ингибиторов металлопротеаз, у которых основой механизма действия является координирование иона цинка через боковую группу аспарагиновой кислоты. Неканонические механизмы характерны для большинства ингибиторов металлопротеаз. Однако для металлопротеаз семейства M4, к которому относится Pln и другие ППП, наоборот, в основном описаны специфические ингибиторы с механизмом действия близким к каноническому и, кроме того, один неспецифический ингибитор а2-макроглобулин, действующий по особому механизму «молекулярной ловушки».

Таким образом, пример M4in показывает, что для ЭПИ характерен ранее не описанный механизм ингибирования, относящийся к неканоническому типу. Ингибиторы такого типа ранее не были обнаружены для пептидаз семейства M4.

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании впервые проведена комплексная характеристика механизма действия эмфорина — прототипа нового семейства I104 белковых ингибиторов протеаз. Первая часть работы посвящена созданию методологии для количественной оценки активности ингибиторов в отношении металлопротеаз семейства M4. Разработанный и валидированный в ходе работы способ определения ингибирующей активности в перспективе может быть использован для оценки эффективности действия широкого круга соединений, как высокомолекулярных, так и низкомолекулярных, на различные ферменты семейства, в частности, при поиске потенциальных антибактериальных соединений, способных подавлять активность относящихся к семейству M4 пептидаз - факторов бактериального патогенеза.

Во второй части исследования детально изучено влияние эмфорина на кинетику реакций, катализируемых протеализином. Была продемонстрирована высокая эффективность эмфорина как ингибитора протеализина, что делает эмфорин перспективной основой для дизайна высокоаффинных ингибиторов пептидаз семейства М4, подавление активности которых рассматривается как новый альтернативный подход к антибактериальной терапии. Кроме того, было установлено, что ингибирование эмфорином происходит по механизму медленного связывания. В рамках проведенного исследования структурные основы медленного связывания и его значение для реализации биологических функций M4in не изучалась. Однако, на наш взгляд, выяснение этих аспектов может быть существенным для понимания закономерностей взаимодействия белковых молекул in vitro и in vivo.

Третья, ключевая часть исследования, направлена на установление молекулярного механизма действия M4in. Полученные данные демонстрируют, что молекулярный механизм действия эмфорина и, очевидно, других ЭПИ относится к неканоническому типу. Такой тип ингибирования характерен для БИМ, в то же время его реализация в случае эмфорина уникальна. Эмфорин один из немногих ингибиторов, у которых взаимодействие с ионом цинка активного центра протеазы осуществляется через боковую группу аминокислотного остатка,

находящегося в середине полипептидной цепи. При этом, по сравнению с известными БИМ такого рода, эмфорин имеет наименьшую молекулярную массу, а кроме того, между ним и активным центром протеазы реализуется наименьшее количество взаимодействий, при чем взаимодействия с субстрат связывающей областью фермента происходят только в субсайте S'. Таким образом, изменение специфичности ЭПИ должно быть более простой задачей, чем в случае других БИМ с неканоническим механизмом. Это позволяет рассматривать эмфорин и его гомологи в качестве перспективной платформы для конструирования селективных высокоэффективных ингибиторов различных металлоэндопептидаз для применения в медицине. В частности, такие ингибиторы могут стать основой новых антибактериальных лекарственных средств, направленных на подавление активности металлопротеаз различных патогенов, причем не только пептидаз относящихся к семейству M4.

Для создания на базе ЭПИ терапевтических ингибиторов необходимо углублённое изучение структурных детерминант, определяющих специфичность ЭПИ и медленную кинетику их связывания с протеазами. В этом контексте необходимо развивать работы, направленные на определение структуры комплекса ППП-ЭПИ, что позволит выявить детали межмолекулярного взаимодействия. При этом структурные исследования должны быть дополнены традиционными подходами белковой инженерии, основанными на сайт-направленном мутагенезе и анализе влияния мутаций на ингибиторные свойства. Наряду с этим, учитывая широкую распространённость ППП и ЭПИ у бактерий и, в том числе, у патогенов, необходимо развивать исследования биологических функций этих белков и их роли в бактериальном патогенезе. Такие работы целесообразно проводить с использованием животных инфекционных моделей, что позволит дополнить имеющуюся в настоящее время информацию прямыми данными и, в частности, оценить потенциал подавления активности ППП в качестве стратегии антибактериальной терапии. В совокупности такие исследования позволят не только раскрыть молекулярные и биологические механизмы функционирования ЭПИ, но и приблизят возможность их практического применения.

6 ВЫВОДЫ

1. Эмфорин является сильным конкурентным ингибитором протеализина (Ki = 52 ± 14 пМ). Для эмфорина характерно медленное связывание с ферментом по одностадийному механизму.

2. Основными элементами активного центра эмфорина являются остаток Asp70, формирующий координационную связь с ионом цинка активного центра протеазы, а также остатки Phe21, Ala22 и Phe23, взаимодействующие с субстрат-связывающей областью фермента.

3. Механизм действия эмфорина относится к неканоническим, но при этом является уникальным. Ингибирование эмфорином протеализина реализуется за счет координирования иона цинка активного центра протеазы боковой группой неконцевого аминокислотного остатка. При этом, в отличие от известных ингибиторов такого типа, эмфорин взаимодействует только с S' субстрат связывающей областью протеазы.

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

s - коэффициент экстинкции

а.о. - аминокислотный остаток

БИМ - белковые ингибиторы металлопротеаз

БИП - белковые ингибиторы протеаз

БИС - белковые ингибиторы сериновых протеаз

ГПХ - гельпроникающая хроматография

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КД - круговой дихроизм

МКП - металлокарбоксипептидазы

МУРР - малоугловое рентгеновское рассеяние

МХАХ - металл-хелатная аффинная хроматография

ОП - оптическая плотность

ППП - протеализинподобные протеазы

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЭДТА - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

ЭПИ - эмфориноподобные ингибиторы

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

a2Ms - a2-macroglobulins

A2ML1 - a2-macroglobulin-like protein 1

Abz - 2-aminobenzoyl

ACI - Ascaris carboxypeptidase inhibitor

ADAMs - a disintegrin and metalloproteinase proteins

ADAMTSs - a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs proteins

API-2c' - alkaline protease inhibitor 2c'

APR - alkaline proteinase

APRin - alkaline proteinase inhibitor

BsPI - broad-spectrum protease inhibitor

BB - boost broth

BMP-1 - bone morphogenetic protein 1

DAIP - dispase autolysis-inducing protein

Dnp - 2,4-dinitrophenyl

ECI - endogenous metallocarboxypeptidase A inhibitor

hCPA4 - human carboxypeptidase A4

IGFBPs - insulin-like growth factor-binding proteins

IGFs - insulin-like growth factors

IMPI - inducible metallopeptidase inhibitor

InhEc - inhibitor from Erwinia chrysanthemi

InhPl - inhibitor from Photorhabdus luminescens W14

Ki - inhibitory constant

LA - LB-agar

LB - lysogeny broth

LCI - leech carboxypeptidase inhibitor

LIMAC - Limulus a-macroglobulin complement-like protein

M4in - emfourin

MMPs - matrix metalloproteinases

mTLD - mammalian tolloid

MT-MMPs - membrane-type matrix metalloproteinases

mTLL - mammalian tolloid-like

NvCI - Nerita versicolor carboxypeptidase inhibitor

OCX-32 - ovocalyxin-32

PAPP-A - pregnancy-associated plasma protein A

PCI - potato carboxypeptidase inhibitor

PDB - protein data bank

Pln - protealysin

PMT - photomultiplier tube

proMBP - proform of eosinophil major basic protein

PS - plasminostreptin

PZP - pregnancy zone protein

ScNP - Streptomyces caespitosus neutral proteinase

ScNPI - Streptomyces caespitosus neutral proteinase inhibitor

sFRPs - secreted frizzled-related proteins

SGMP - Streptomyces griseus metalloprotease

SmaPI - serralysin protease inhibitor

SmCI - Sabellastarte magnifica carboxypeptidase inhibitor

SMP - serralysin

SMPI - Streptomyces metallopeptidase inhibitor

SSI - Streptomyces subtilisin inhibitor

STC - stanniocalcin

SVMPs - snake venom metalloproteases

TBE - Tris/Borate/EDTA buffer

TCI - tick carboxypeptidase inhibitor

TEPs - thioester-containing proteins

TIMPs - tissue inhibitors of metalloproteinases

Tln - thermolysin

TmCI - tomato carboxypeptidase inhibitor

Tris-HCl - tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bozin T. N., Berdyshev I. M., Chukhontseva K. N., Karaseva M. A., Konarev P. V., Varizhuk A. M., Lesovoy D. M., Arseniev A. S., Kostrov S. V., Bocharov E. V., Demidyuk I. V. NMR structure of emfourin, a novel protein metalloprotease inhibitor: Insights into the mechanism of action // J Biol Chem. - 2023. - T. 299, №2 4. - C. 104585.

2. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - T. 227, № 5259. - C. 680-685.

3. Golicnik M., Stojan J. Slow-binding inhibition: A theoretical and practical course for students // Biochem Mol Biol Educ. - 2004. - T. 32, № 4. - C. 228-235.

4. Lopez-Otin C., Bond J. S. Proteases: multifunctional enzymes in life and disease // J Biol Chem. - 2008. - T. 283, № 45. - C. 30433-30437.

5. Carnevale V., Raugei S., Micheletti C., Carloni P. Convergent dynamics in the protease enzymatic superfamily // J Am Chem Soc. - 2006. - T. 128, № 30. - C. 9766-9772.

6. Rawlings N. D., Barrett A. J., Finn R. Twenty years of the MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors // Nucleic Acids Res. - 2016. - T. 44, № 1. - C. 343-350.

7. Drag M., Salvesen G. S. Emerging principles in protease-based drug discovery // Nat Rev Drug Discov. - 2010. - T. 9, № 9. - C. 690-701.

8. Rawlings N. D., Barrett A. J., Thomas P. D., Huang X., Bateman A., Finn R. D. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database // Nucleic Acids Res. - 2018. -T. 46, № D1. - C. D624-D632.

9. Handbook of Proteolytic Enzymes. / Barrett A. J., Rawlings N. D., Woessner J. F.: Academic Press, 2012.

10. Coussens L. M., Fingleton B., Matrisian L. M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations // Science. - 2002. - T. 295, № 5564. - C. 2387-2392.

11. Miyoshi S., Shinoda S. Microbial metalloproteases and pathogenesis // Microbes Infect. - 2000. - T. 2, № 1. - C. 91 -98.

12. Letoffe S., Delepelaire P., Wandersman C. Characterization of a protein inhibitor of extracellular proteases produced by Erwinia chrysanthemi // Mol Microbiol. - 1989. - T. 3, № 1. - C. 79-86.

13. Feltzer R. E., Gray R. D., Dean W. L., Pierce W. M., Jr. Alkaline proteinase inhibitor of Pseudomonas aeruginosa. Interaction of native and N-terminally truncated inhibitor proteins with Pseudomonas metalloproteinases // J Biol Chem. - 2000. - T. 275, № 28. -C. 21002-21009.

14. Baumann U., Bauer M., Letoffe S., Delepelaire P., Wandersman C. Crystal structure of a complex between Serratia marcescens metallo-protease and an inhibitor from Erwinia chrysanthemi // J Mol Biol. - 1995. - T. 248, № 3. - C. 653-661.

15. Hege T., Feltzer R. E., Gray R. D., Baumann U. Crystal structure of a complex between Pseudomonas aeruginosa alkaline protease and its cognate inhibitor: inhibition by a zinc-NH2 coordinative bond // J Biol Chem. - 2001. - T. 276, № 37. - C. 3508735092.

16. Kim K. S., Kim T. U., Kim I. J., Byun S. M., Shin Y. C. Characterization of a metalloprotease inhibitor protein (SmaPI) of Serratia marcescens // Appl Environ Microbiol. - 1995. - T. 61, № 8. - C. 3035-3041.

17. Bae K. H., Kim I. C., Kim K. S., Shin Y. C., Byun S. M. The Leu-3 residue of Serratia marcescens metalloprotease inhibitor is important in inhibitory activity and binding with Serratia marcescens metalloprotease // Arch Biochem Biophys. - 1998. - T. 352, №2 1. -C. 37-43.

18. Wee K. E., Yonan C. R., Chang F. N. A new broad-spectrum protease inhibitor from the entomopathogenic bacterium Photorhabdus luminescens // Microbiology. - 2000. -T. 146, № 12. - C. 3141-3147.

19. Turk B. Targeting proteases: successes, failures and future prospects // Nat Rev Drug Discov. - 2006. - T. 5, № 9. - C. 785-799.

20. Adekoya O. A., Sylte I. The thermolysin family (M4) of enzymes: therapeutic and biotechnological potential // Chem Biol Drug Des. - 2009. - T. 73, № 1. - C. 7-16.

21. Potempa J., Pike R. N. Corruption of innate immunity by bacterial proteases // J Innate Immun. - 2009. - T. 1, № 2. - C. 70-87.

22. Pietrocola G., Nobile G., Rindi S., Speziale P. Staphylococcus aureus manipulates innate immunity through own and host-expressed proteases // Front Cell Infect Microbiol. - 2017. - T. 7. - C. 166.

23. Beaufort N., Corvazier E., Mlanaoindrou S., de Bentzmann S., Pidard D. Disruption of the endothelial barrier by proteases from the bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa: implication of matrilysis and receptor cleavage // PLoS One. - 2013. - T. 8, № 9. - C. e75708.

24. Laarman A. J., Ruyken M., Malone C. L., van Strijp J. A., Horswill A. R., Rooijakkers S. H. Staphylococcus aureus metalloprotease aureolysin cleaves complement C3 to mediate immune evasion // J Immunol. - 2011. - T. 186, № 11. - C. 6445-6453.

25. Demidyuk I. V., Kalashnikov A. E., Gromova T. Y., Gasanov E. V., Safina D. R., Zabolotskaya M. V., Rudenskaya G. N., Kostrov S. V. Cloning, sequencing, expression, and characterization of protealysin, a novel neutral proteinase from Serratia proteamaculans representing a new group of thermolysin-like proteases with short N-terminal region of precursor // Protein Expr Purif. - 2006. - T. 47, № 2. - C. 551-561.

26. Demidyuk I. V., Gromova T. Y., Polyakov K. M., Melik-Adamyan W. R., Kuranova I. P., Kostrov S. V. Crystal structure of the protealysin precursor: insights into propeptide function // J Biol Chem. - 2010. - T. 285, № 3. - C. 2003-2013.

27. Gromova T. Y., Demidyuk I. V., Kozlovskiy V. I., Kuranova I. P., Kostrov S. V. Processing of protealysin precursor // Biochimie. - 2009. - T. 91, № 5. - C. 639-645.

28. Chukhontseva K. N., Salnikov V. V., Morenkov O. S., Kostrov S. V., Demidyuk I. V. Protealysin is not secreted constitutively // Protein Pept Lett. - 2019. - T. 26, № 3. -C. 221-226.

29. Bozhokina E. S., Tsaplina O. A., Efremova T. N., Kever L. V., Demidyuk I. V., Kostrov S. V., Adam T., Komissarchik Y. Y., Khaitlina S. Y. Bacterial invasion of eukaryotic cells can be mediated by actin-hydrolysing metalloproteases grimelysin and protealysin // Cell Biol Int. - 2011. - T. 35, № 2. - C. 111-118.

30. Held K. G., LaRock C. N., D'Argenio D. A., Berg C. A., Collins C. M. A metalloprotease secreted by the insect pathogen Photorhabdus luminescens induces melanization // Appl Environ Microbiol. - 2007. - T. 73, № 23. - C. 7622-7628.

31. Kyostio S. R., Cramer C. L., Lacy G. H. Erwinia carotovora subsp. carotovora extracellular protease: characterization and nucleotide sequence of the gene // J Bacteriol. - 1991. - T. 173, № 20. - C. 6537-6546.

32. Cabral C. M., Cherqui A., Pereira A., Simoes N. Purification and characterization of two distinct metalloproteases secreted by the entomopathogenic bacterium Photorhabdus sp. strain Az29 // Appl Environ Microbiol. - 2004. - T. 70, № 7. - C. 3831-3838.

33. Farady C. J., Craik C. S. Mechanisms of macromolecular protease inhibitors // Chembiochem. - 2010. - T. 11, № 17. - C. 2341-2346.

34. Laskowski M., Jr., Kato I. Protein inhibitors of proteinases // Annu Rev Biochem. -1980. - T. 49. - C. 593-626.

35. Bao R., Zhou C. Z., Jiang C., Lin S. X., Chi C. W., Chen Y. The ternary structure of the double-headed arrowhead protease inhibitor API-A complexed with two trypsins reveals a novel reactive site conformation // J Biol Chem. - 2009. - T. 284, № 39. - C. 26676-26684.

36. Lenarcic B., Turk V. Thyroglobulin type-1 domains in equistatin inhibit both papain-like cysteine proteinases and cathepsin D // J Biol Chem. - 1999. - T. 274, № 2. - C. 563566.

37. Cerda-Costa N., Gomis-Ruth F. X. Architecture and function of metallopeptidase catalytic domains // Protein Sci. - 2014. - T. 23, № 2. - C. 123-144.

38. Krowarsch D., Cierpicki T., Jelen F., Otlewski J. Canonical protein inhibitors of serine proteases // Cell Mol Life Sci. - 2003. - T. 60, № 11. - C. 2427-2444.

39. Tusar L., Usenik A., Turk B., Turk D. Mechanisms applied by protein inhibitors to inhibit cysteine proteases // International Journal of Molecular Sciences. - 2021. - T. 22, № 3. - C. 997.

40. Bode W., Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases // Eur J Biochem. - 1992. - T. 204, № 2. - C. 433-451.

41. Apostoluk W., Otlewski J. Variability of the canonical loop conformations in serine proteinases inhibitors and other proteins // Proteins. - 1998. - T. 32, № 4. - C. 459-474.

42. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain // Biochem Biophys Res Commun. - 1967. - T. 27, № 2. - C. 157-162.

43. Batt A. R., St Germain C. P., Gokey T., Guliaev A. B., Baird T., Jr. Engineering trypsin for inhibitor resistance // Protein Sci. - 2015. - T. 24, № 9. - C. 1463-1474.

44. Huenerbein A., Schmelzer C. E. H., Neubert R. H. H. Real-time monitoring of peptic and tryptic digestions of bovine P-casein using quartz crystal microbalance // Analytica Chimica Acta. - 2007. - T. 584, № 1. - C. 72-77.

45. Lu W., Starovasnik M. A., Kent S. B. H. Total chemical synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor by native chemical ligation // FEBS Letters. - 1998. - T. 429, № 1. - C. 31-35.

46. Laskowski M., Qasim M. A. What can the structures of enzyme-inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate complexes? // Biochim Biophys Acta. -2000. - T. 1477, № 1-2. - C. 324-337.

47. Burgi H. B., Dunitz J. D., Shefter E. Geometrical reaction coordinates. II. Nucleophilic addition to a carbonyl group // Journal of the American Chemical Society.

- 1973. - T. 95, № 15. - C. 5065-5067.

48. Burgi H. B., Dunitz J. D., Lehn J. M., Wipff G. Stereochemistry of reaction paths at carbonyl centres // Tetrahedron. - 1974. - T. 30, № 12. - C. 1563-1572.

49. Arolas J. L., Botelho T. O., Vilcinskas A., Gomis-Ruth F. X. Structural evidence for standard-mechanism inhibition in metallopeptidases from a complex poised to resynthesize a peptide bond // Angew Chem Int Ed Engl. - 2011. - T. 50, № 44. - C. 10357-10360.

50. Wedde M., Weise C., Kopacek P., Franke P., Vilcinskas A. Purification and characterization of an inducible metalloprotease inhibitor from the hemolymph of greater wax moth larvae, Galleria mellonella // Eur J Biochem. - 1998. - T. 255, № 3. - C. 535543.

51. Clermont A., Wedde M., Seitz V., Podsiadlowski L., Lenze D., Hummel M., Vilcinskas A. Cloning and expression of an inhibitor of microbial metalloproteinases from insects contributing to innate immunity // Biochem J. - 2004. - T. 382, №2 Pt 1. - C. 315-322.

52. Wedde M., Weise C., Nuck R., Altincicek B., Vilcinskas A. The insect metalloproteinase inhibitor gene of the lepidopteran Galleria mellonella encodes two distinct inhibitors // Biol Chem. - 2007. - T. 388, № 1. - C. 119-127.

53. Oda K., Koyama T., Murao S. Purification and properties of a proteinaceous metalloproteinase inhibitor from Streptomyces nigrescens TK-23 // Biochim Biophys Acta. -1979. - T. 571, № 1. - C. 147-156.

54. Seeram S. S., Hiraga K., Oda K. Resynthesis of reactive site peptide bond and temporary inhibition of Streptomyces metalloproteinase inhibitor // J Biochem. - 1997. -T. 122, № 4. - C. 788-794.

55. Ohno A., Tate S., Seeram S. S., Hiraga K., Swindells M. B., Oda K., Kainosho M. NMR structure of the Streptomyces metalloproteinase inhibitor, SMPI, isolated from Streptomyces nigrescens TK-23: another example of an ancestral beta gamma-crystallin precursor structure // J Mol Biol. - 1998. - T. 282, № 2. - C. 421-433.

56. Tate S., Ohno A., Seeram S. S., Hiraga K., Oda K., Kainosho M. Elucidation of the mode of interaction of thermolysin with a proteinaceous metalloproteinase inhibitor, SMPI, based on a model complex structure and a structural dynamics analysis // J Mol Biol. - 1998. - T. 282, № 2. - C. 435-446.

57. Hiraga K., Seeram S. S., Tate S., Tanaka N., Kainosho M., Oda K. Mutational analysis of the reactive site loop of Streptomyces metalloproteinase inhibitor, SMPI // J Biochem.

- 1999. - T. 125, № 1. - C. 202-209.

58. Kajiwara K., Fujita A., Tsuyuki H., Kumazaki T., Ishii S. Interactions of Streptomyces serine-protease inhibitors with Streptomyces griseus metalloendopeptidase II // J Biochem. - 1991. - T. 110, № 3. - C. 350-354.

59. Kumazaki T., Kajiwara K., Kojima S., Miura K., Ishii S. Interaction of Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI) with Streptomyces griseus metallo-endopeptidase II (SGMP II) // J Biochem. - 1993. - T. 114, № 4. - C. 570-575.

60. Kakinuma A., Sugino H., Moriya N., Isono M. Plasminostreptin, a protein proteinase inhibitor produced by Streptomyces antifibrinolyticus. I. Isolation and characterization // J Biol Chem. - 1978. - T. 253, № 5. - C. 1529-1537.

61. Strickler J. E., Berka T. R., Gorniak J., Fornwald J., Keys R., Rowland J. J., Rosenberg M., Taylor D. P. Two novel Streptomyces protein protease inhibitors. Purification, activity, cloning, and expression // J Biol Chem. - 1992. - T. 267, № 5. - C. 3236-3241.

62. Hiraga K., Suzuki T., Oda K. A novel double-headed proteinaceous inhibitor for metalloproteinase and serine proteinase // J Biol Chem. - 2000. - T. 275, № 33. - C. 25173-25179.

63. Trillo-Muyo S., Martínez-Rodríguez S., Arolas J. L., Gomis-Rüth F. X. Mechanism of action of a Janus-faced single-domain proteininhibitor simultaneously targeting two peptidase classes // Chem. Sci. - 2013. - T. 4, № 2. - C. 791-797.

64. Takeuchi Y., Nonaka T., Nakamura K. T., Kojima S., Miura K., Mitsui Y. Crystal structure of an engineered subtilisin inhibitor complexed with bovine trypsin // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1992. - T. 89, № 10. - C. 4407-4411.

65. Takeuchi Y., Satow Y., Nakamura K. T., Mitsui Y. Refined crystal structure of the complex of subtilisin BPN' and Streptomyces subtilisin inhibitor at 1.8 A resolution // J Mol Biol. - 1991. - T. 221, № 1. - C. 309-325.

66. Takeuchi Y., Noguchi S., Satow Y., Kojima S., Kumagai I., Miura K., Nakamura K. T., Mitsui Y. Molecular recognition at the active site of subtilisin BPN': crystallographic studies using genetically engineered proteinaceous inhibitor SSI (Streptomyces subtilisin inhibitor) // Protein Eng. - 1991. - T. 4, № 5. - C. 501-508.

67. Kojima S., Nishiyama Y., Kumagai I., Miura K. Inhibition of subtilisin BPN' by reaction site P1 mutants of Streptomyces subtilisin inhibitor // J Biochem. - 1991. - T. 109, № 3. - C. 377-382.

68. Kojima S., Kumagai I., Miura K. Requirement for a disulfide bridge near the reactive site of protease inhibitor SSI (Streptomyces subtilisin inhibitor) for its inhibitory action // J Mol Biol. - 1993. - T. 230, № 2. - C. 395-399.

69. Murzin A. G. OB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)-fold: common structural and functional solution for non-homologous sequences // Embo j. - 1993. - T. 12, № 3. - C. 861-867.

70. Brew K., Dinakarpandian D., Nagase H. Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function // Biochim Biophys Acta. - 2000. - T. 1477, № 1 -2. -C. 267-283.