Механизм инфицирования бактериофага Т4: функциональная роль доменов продуктов генов 9 и 11 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Вишневский, Александр Юрьевич

• Вишневский, Александр Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Вишневский, Александр Юрьевич

Список сокращений.

Введение.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи работы.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Обзор литературы.

Бактериофаг Т4.

Продукт гена 9.

Продукт гена 11.

Назальная пластинка бактериофага Т4.

Структурная реорганизация базальной пластинки при инфицировании.

Морфогенез базальной пластинки.

Фолдинг белка.

Две гипотезы механизма сворачивания полипептидной цепи.

Гипотеза нуклеации и роста.

Сворачивание с образованием кинетических интермедиатов.

Фолдинг белка в клетке.

Пост- и ко-трансляционный фолдинг.

Шапероны.

Роль рибосомы в ко-трансляционном фолдинге.

Ферменты, ускоряющие процесс сворачивания.

Изучение фолдинга хвостового шипа бактериофага Р22 Salmonella typhimurium.

Свойства хвостового шипа.

Термолабильные интермедиаты фолдинга и образование телец включения.

Температуро-чувствительные мутации, приводящие к нарушению фолдинга.

Супрессорные мутации.

Изучение рефолдинга белка in vitro.

Побочные интермедиа™ и тельца включения, исследуемые in vitro.

Формирование нативного тримера из телец включения.

Фолдинг БХШ определяет температуру инфицирования фага.

Временные дисульфидные связи в протримере.

Изучение хвостового шипа с помощью моноклональных антител.

Различие между путями фолдинга in vivo и in vitro.

С-домен необходим для тримеризации шипа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Бактериальные штаммы.

Среды для выращивания бактерий и бактериофагов.

Приготовление компетентных клеток.

Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК.

Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli BL21(DE3).

Приготовление экстрактов клеток, содержащих рекомбинантные белки.

Амбер-мутанты фага Т4.

Приготовление дефектных частиц фага Т4.

Комплементация in vitro.

Выделение и очистка рекомбинантных белков.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

Иммуноблоттинг.

Гель-фильтрация.

Векторы для клонирования.

Конструирование плазмидных векторов.

Выделение и очистка плазмидной ДНК.

Полимеразная цепная реакция.

Очистка фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР.

Клонирование фрагментов гена 11.

Клонирование гена 9* для экспрессии мутанта пг9*РО.

Конструирование векторов для ко-экспрессии пг9 и его делеционных вариантов 58 Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов пг9 с заменами 01п282.

Конструирование плазмидной конструкции для экспрессии мутанта с заменой

ИпПО-» Рго.

Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов пг9 с заменами в области 01и245-01и248.

Конструирование плазмидных конструкций для экспрессии мутантов пг11 с заменами в области Азп203-01п205.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Комплементация дефектных частиц фага продуктами генов 9 и 11.

Изучение продукта гена 9 бактериофага Т4.

Мутагенез Ы-концевого сегмента пг9.

Мутант пг9*РО.

Ко-экспрессия пг9 и его делеционного варианта МД20.

Ко-экспрессия пг9 и его делеционных вариантов ЫА54, ЫА167 и СД113.

С-концевые делеционные мутанты пг9.

Мутагенез в1п282 в молекуле пг9.

Супрессорный мутант пг9.

Изучение продукта гена 11 бактериофага Т4.

Получение делеционных фрагментов пг11.

Тримеризация делеционных фрагментов пг11.

Биологическая активность делеционных фрагментов пг11.

Образование комплексов пгЮ с делеционными фрагментами пг11.

Локализация участка взаимодействия с пг11в молекуле пгЮ.

Мутагенез предполагаемых участков взаимодействия пг9 и пг11 с хвостовыми фибриллами.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Функциональная роль >1-домена пг9.

Роль С-домена пг9.

Свойства пг11.