Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, доктор биологических наук Телесманич, Наталья Робертовна

• Телесманич, Наталья Робертовна
• доктор биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации доктор биологических наук Телесманич, Наталья Робертовна

f СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ХОЛЕРНЫХ

ВИБРИОНОВ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Гемолитическая активность в эволюции возбудителя холеры.

1.2. Проблемы очистки и характеристики препаратов гемолизинов.

1.2.1. Методы очистки гемолизинов холерных вибрионов.

1.2.2. Механизм действия гемолизинов холерных вибрионов как токсинов i каналоформеров.

1.2.3. Организация и экспрессия генов, детерминирующих синтез гемолизина холерных вибрионов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТЫ В ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ.

2.1. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей структурных генов, составляющих hly область генома холерных вибрионов и их продуктов.

2.1.1. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена hlyA.

2.1.2. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена 1ес.

2.1.3. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена hlyB.

2.1.4. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена hlyC.'.

2.2. Детекция ферментативных активностей в препаратах гемолизинов,

Л полученных с помощью многоэтапных схем очистки.

2.3. Двухэтапная схема очистки гемолизина холерных вибрионов, детекция ферментативных активностей фракций препарата.

ГЛАВА 3. РОЛЬ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛЛИПАЗЫ И ЛЕЦИТИНАЗЫ В ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ.

3.1. Разработка питательной среды для выявления триацилглицероллипазной активности холерных вибрионов.

3.2. Конструирование антилипазного полимерного иммуноглобулинового диагностикума на основе коммерческого препарата липазы Pseudomonas sp. фирмы «Sigma» для изучения липазной активности холерных вибрионов.

3.3. Роль лецитиназы в гемолитической активности холерных вибрионов.

ГЛАВА 4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ ГЕНА HLY А,

ДЕТЕРМИНИРУЮЩЕГО ПРОДУКЦИЮ ЛЕКТИНА.

4.1. Общие сведения о лектинах.

4.2. Углеводная специфичность лектина (Н1у А), выявленная в реакции торможения гемолиза.

4.3. Участие галактозоспецифичного лектина в агглютинации эритроцитов токсигенными и атоксигенными штаммами холерных вибрионов.

4.4. Метод осмотической протекции в изучении механизма действия гемолизинов.

4.5. Углеводная специфичность некоторых лектиновых рецепторов холерных вибрионов в процессе адгезии (на модели эритроцитов).:.

ГЛАВА 5. ДЕЙСТВИЕ ГЕМОЛИЗИНА НА КЛЕТКИ

МИКРООРГАНИЗМОВ.

5.1. Изучение влияния препаратов гемолизина на рост клеток грам грам" бактерий.

5.2. Ультраструктурные изменения холерных вибрионов при действии гемолизина из штамма V. cholerae не 01 Р 11702.

ГЛАВА 6. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ ^ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ

ВИБРИОНОВ.

6.1. Гемолитическая активность холерных вибрионов эльтор.

6.2. Гемолитическая активность классических холерных вибрионов.

6.3. Гемолиз и биологические мембраны.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов»

Актуальность проблемы.

Данные многолетник наблюдений позволяют высказать предположение, что индикатором эволюционной смены возбудителя холеры и одним из критериев оценки появления вирулентных форм явилась гемолитическая активность холерных вибрионов. Гемолитическая активность вибрионов эльтор до возникновения 7-й пандемии отличала их от классических холерных вибрионов. Начало 7-й пандемии охарактеризовалось появлением фенотипически негемоли-тичного варианта этого биовара, и в результате гемолитическая активность как тест, дифференцирующий биовары, утратил своё значение (Gotshlich F., 1905, Kraus R., 1903, Doorenbos W., 1932, Roy C., 1962, Greig E., 1914, Вейде A.A., 1975; Святой В.И., 1978; Адамов A.K., 1979 и др.).

Существует два экологических варианта холерных вибрионов, которые различаются по способности лизировать эритроциты барана в пробе Грейга. Вариант, не разрушающий эритроциты барана, с учетом его других свойств, является эпидзначимым, продуцирующим холероген, и гемолитический вариант, который принято считать авирулентным или слабовирулентным. В настоящее, время описаны два типа гемолитической активности: I тип, лизирующий эритроциты барана и других видов животных в пробе Грейга, II тип, не лизирующий эритроциты барана, но активный по отношению к эритроцитам кролика, морской свинки и других видов животных (Семиотрочев В.Л., 1987). В свою очередь каждый из них подразделяют на два варианта: а (лизис через 24 часа) и Р (лизис через 2 часа) (Семиотрочев В.Л., 1990). Однако продолжает оставаться открытым вопрос: чем отличаются типы гемолитической активности холерных вибрионов - интенсивностью экспрессии гена hly (количественно) или разным механизмом действия?

Гемолитичность холерных вибрионов, обусловленную экспрессией комплекса hly генов (Fiore Е., 1997), расположенного на малой хромосоме, принято рассматривать как альтернативу холерогенности и, соответственно, эпидемической опасности. Все биовары холерных вибрионов, обладают консервативным ф лецитиназа - гемолизин - липазным (lec - hly А - hly В - hly С) локусом (Fiore

Е., 1997). Отдельные штаммы холерных вибрионов эльтор могут продуцировать гемолизин, лизирующей эритроциты барана, в отдельных случаях сочетая в себе свойства гемолитичности и холерогенности (Осауленко О.В., 1994), что может затруднять дифференциацию холерогенных штаммов от нехолерогенных по гемолитической активности в общепринятом тесте Грейга.

Сравнительно недавно был показан механизм действия гемолизина как порообразующего токсина (Цитцер А.О., 1992; 2001; Chattopadhyay К., 2003). В настоящее время интенсивно изучаются конформационные изменения молекулы HlyA при взаимодействии с эритроцитами кролика и липидными везикулами (Saha N., 1997; Harris J., 2002; Olson R., 2003; Chattopadhyay K., 2003). Однако в этих исследованиях отражена больше структурная сторона процесса, чем функциональная. При этом не раскрывается реализация гемолитической активности живыми клетками холерных вибрионов, а также различие механизмов лизиса эритроцитов кролика и эритроцитов барана. Проведено патоморфологи-ческое исследование тонкого кишечника мышей - сосунков при воздействии гемолизина (цитолизина) (McCardell., 1985;Ray А., 2003). Сделан вывод, что гемолитическая активность может служить причиной диареи. ^ Отечественными специалистами установлено, что в пределах биовара способность к гемолизу эритроцитов барана может быть использована как один из критериев дифференциации эпидемических штаммов от неэпидемических, наряду с определением гена холерного токсина в ПЦР и биологической моделью, определяющей холерогенность (Никишина Г.П., 1974; Вейде А.А., 1979; Святой В.И., 1978; Кюрегян А.А., 1988; Уралева B.C., 1988; Подосинникова JT.C., 1989).

Зарубежные исследователи, уделяя много внимания изучению гемоли-4 зина холерных вибрионов, рассматривают его лишь как возможный фактор вирулентности, но не как фактор дифференциации эпидемически значимых штаммов. Поэтому зарубежные методы нацелены, в основном, на определение токсина реакциями латексной агглютинации и Elisa, а тест лизиса эритроцитов барана за рубежом продолжает оставаться тестом, дифференцирующим классический биовар от биовара эльтор.

В системе эпиднадзора за холерой в России гемолитическая активность в пробе по Грейгу является дополнительным критерием оценки эпидемической значимости штаммов, обеспечивая большое подспорье практическим лабораториям, которым недоступны биологические in vivo и молекулярно-биологические методы. С другой стороны, ограниченность подхода к дифференциации токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов по гемолитической активности, который на протяжении 100 лет не претерпел существенных изменений, заставляет нас задуматься о том, что представляет собой гемолитическая активность холерных вибрионов и каким образом можно расширить спектр методических подходов, основанных на гемолитической активности.

Следует признать, что термин «гемолизин» (цитолизин, гемоцитолизин) (McCardell., 1985) отражает лишь результат воздействия биологически активного вещества на эритроциты и это условное название не говорит ни о его структуре и функциях, ни о конкретном механизме действия. Несмотря на то, что проблеме выделения и очистки гемолизина посвящено значительное количество зарубежных и отечественных работ, механизмы гемолитической активности холерных вибрионов и роль ферментов в реализации этого процесса живыми бактериальными клетками до настоящего времени оставались неизученными.

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось выяснение биологической характеристики, функциональной организации и механизмов гемолитической активности холерных вибрионов.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей полипептидов, продуктов генов, составляющих hly область, с помощью методов компьютерной геномики, что необходимо для прогнозирования основных биологических характеристик гемолитической активности.

2. Выяснить биологическую функцию гена hlyA, как гена, детерминирующего продукцию лектина, участвующего в гемолитической активности штаммов холерных вибрионов различных биоваров и серологических групп.

3.Изучить роль лектина в гемагглютинирующей и адгезивной активности холерных вибрионов in vitro на штаммах различных биоваров и серологических групп.

4. Осуществить детекцию ферментов в препаратах гемолизинов, выделенных из разных штаммов холерных вибрионов.

5. Разработать методы изучения липазной активности холерных вибрионов и апробировать их на большом количестве штаммов холерных вибрионов.

6. На штаммах холерных вибрионов установить взаимосвязь лецитиназной, липазной и гемолитической активности холерных вибрионов.

7. Изучить эффекты влияния гемолизинов холерных вибрионов на клетки прокариот.

Научная новизна.

Впервые лектиновая природа продукта гена hlyA выявлена путем инги-бирования гемолиза эритроцитов барана галактозой у штаммов холерных вибрионов (приоритет № 2004121534). Впервые сформулирована концепция о гемолитической активности как сложном, полифункциональном процессе, включающем взаимодействие лектина с галактозой на поверхности мембран эритроцитов барана, участие нейраминидазы в десиализации мембран и ферментов, действующих на липиды и фосфолипиды.

Впервые выполнен компьютерный анализ нуклеотидных (НК) последовательностей генов hly области и соответствующих аминокислотных (АК) последовательностей холерных вибрионов, на основании, которого составлено представление о функциональной организации и возможных механизмах гемолитической активности.

Впервые обнаружено и на штаммах холерных вибрионов различных биоваров и серологических групп показано фенотипическое проявление гена hlyA, детерминирующего продукцию лектина, определена его углеводная специфичность к галактозе и установлена роль в гемолитической активности холерных вибрионов (приоритет № 2004121534). На наборе токсигенных и аток-сигенных штаммов установлено, что галактозоспецифичный рецептор не принимает участие в лизисе эритроцитов кролика.

Впервые на штаммах холерных вибрионов различных серологических групп и биоваров показано участие галактозоспецифического лектина в гемагг-лютинации и адгезии in vitro.

Впервые определены углеводные рецепторы на мембране эритроцитов барана и кролика, участвующие в гемолизе, гемагглютинации, адгезии холерных вибрионов. Предложена модельная система in vitro для изучения влияния углеводов на процесс адгезии (приоритет №2005109733/13).

Впервые описана триацилглицероллипазная активность холерных вибрионов; установлена взаимосвязь липазной и гемолитической активности холерных вибрионов.

Впервые предложены методы изучения липазной активности холерных вибрионов. Разработана питательная среда (№ приоритет 2003135696/13) и ди-агностикум антилипазный иммуноглобулиновый полимерный сухой для ее детекции (приоритет №2004108603/15).

Впервые для получения диагностикума, выявляющего липазу холерных вибрионов, предложено использовать иммуноглобулин к гомологичному по структуре, но чужеродному для холерного вибриона антигену коммерческой липазы Pseudomonas sp., что апробировано на большом количестве штаммов холерных вибрионов эльтор.

Впервые выявлен различный диапазон вибриоциногенной активности препаратов гемолизинов по отношению к индикаторным культурам.

Теоретическая значимость.

Данные, полученные с помощью методов компьютерной геномики, несут высокую степень информативности и перспективны для выяснения новых неизвестных свойств и функций гемолизина холерных вибрионов. Установлена лектиновая природа продукта гена hlyA, которая объясняет способность последнего к комлексообразованию с различными гидролитическими ферментами. С помощью компьютерного анализа предсказаны продукты каждого из генов hly области и установлена степень гомологии с другими белками, что может быть использовано для дальнейших научных исследований, а в результате привести к совершенствованию подходов в дифференциальной диагностике холерных вибрионов.

Полученные сведения о лектине (Hly А) могут быть использованы для дальнейшего углубленного изучения роли лектинов в патогенезе холеры и острых диарей. Лектиновые свойства препаратов гемолизина и их специфичность к галактозидам могут быть использованы в разработке новых методов биотехнологии.

Взаимодействие лектинов с мембранными рецепторами метаболически полноценных клеток эукариот и прокариот, последующая их реакция являются удобной моделью для исследования регуляторных механизмов и углеводных рецепторов клеточной мембраны. Знание углеводной специфичности лектина Hly А позволяет применить его даже в виде «грубого» препарата, в качестве детектора определенных углеводных групп на поверхности цитомембран и выяснения участия последних в различных физиологических и патофизиологических процессах. Изучение ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов in vitro дает возможность определить наличие или отсутствие углеводсвязывающих лектиновых рецепторов, участвующих в адгезии, что перспективно для изучения патогенеза холеры. Выявление у холерных вибрионов триацилглицероллипазной активности расширило наши представления о биологии возбудителя холеры. Полученная информация об использовании иммуноглобулинов к липазе Pseudomonas sp. (Sigma) для выявления липазы холерных вибрионов перспективна в плане использования чужеродных, но гомологичных по структуре коммерческих антигенов, с целью конструирования препаратов для изучения фенотипа других микроорганизмов.

Практическая значимость.

Разработана питательная среда для выявления липазной активности холерных вибрионов. Данные по липазной активности холерных вибрионов позволили предложить новый способ дифференциации токсигенных (негемоли-тичных) от атоксигенных (гемолитичных) штаммов в дополнение к тесту Грей-га на основе определения триацилглицероллипазной активности. Принцип реакции (способность гемолитичных вибрионов к гидролизу жиров) может быть использован для разработки других методов биохимической идентификации и дифференциации V. cholerae. Сконструирован антилипазный полимерный им-муноглобулиновый диагностикум на основе липазы Pseudomonas sp. (Sigma), который в реакции объемной агломерации выявляет гемолитичные атоксиген-ные штаммы по продукции липазы. Препарат перспективен в плане изучения закономерностей проявления липазной активности у холерных вибрионов в РАО. Получены сведения о возможности использования чужеродных, но гомологичных антигенов для серологических реакций.

Получены положительные решения на выдачу патентов по заявкам: «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (№ 2004108603/15 (009067); «Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных» (№ 2003135696/13 (038310); «Способ выявления лектиновых рецепторов микроорганизмов и их токсинов» (№ 2004121534/(023081); «Способ определения ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов» (№ 2005109733/13).

Одобрены Ученым советом и утверждены директором РостНИПЧИ методические рекомендации «Новый дифференциальный тест для выявления гемолитичных холерных вибрионов» (протокол №3 от 23.05.02); «Инструкция по изготовлению и контролю антилипазного полимерного иммуноглобулинового диагностикума» (протокол №1 от 13.01.05). Положения, выносимые на защиту:

1. Гемолитическая активность холерных вибрионов является сложным полифункциональным процессом, включающим взаимодействие лектина с галактозой на поверхности мембран эритроцитов барана, участие нейраминидазы в десиализации мембран и ферментов, действующих на липиды и фосфолипиды.

2. Лектиновый рецептор, детерминируемый геном hlyA, принимает участие в лизисе эритроцитов барана, но не кролика, взаимодействует с углеводами II группы - 3,4 - ОН транс Д форма (Д - галактоза), избирателен к аномерам р ф галактоза) (по классификации О. Мёкела).

3. Галактозоспецифичный лектиновый рецептор принимает участие в процессах взаимодействия токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов с клеточными мембранами: гемагглютинации эритроцитов кролика и барана, адгезии к эритроцитам барана и человека.

4. Холерные вибрионы эльтор обладают триацилглицероллипазной активностью, коррелирующей с гемолитической активностью этих микроорганизмов, что перспективно для разработки методов дифференциальной диагностики V. cholerae.

5. Иммуноглобулины к чужеродному, но гомологичному антигену липазы Pseudomonas sp., могут быть использованы для разработки методов выявления липазной активности холерных вибрионов.

Апробация работы.

Результаты исследований были представлены на научных конференциях: «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». Международная конференция, посвященная 75-летию института им. Пастера. С.-Петербург, 1998 г.

Юбилейная научная конференция, посвященная 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. Киров, 1998 г.

Российская научно-практическая конференция по проблеме «Холера». Ростов-на-Дону, 1995 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 1999 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2000 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2001 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2002 г.

VIII съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 2002 г.

VIII Российская научно-практическая конференция по проблеме "Холера». Ростов-на-Дону, 2003 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2004 г.

Всероссийская научно-практическая конференция «Медицинская микробиология - XXI век». Саратов, 2004 г.

Проблемная комиссия «Разработка и стандартизация медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики инфекционных болезней». Москва, 2004 г.

Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2005 г.

Публикации результатов исследований.

По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, 9 - в центральной печати, из них четыре обзорных. Представлено пятнадцать докладов на конференциях и проблемных комиссиях. Получены положительные решения на выдачу патентов по заявкам: «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (№ 2004108603/15 (009067); «Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных» (№ 2003135696/13 (038310); «Способ выявления лектиновых рецепторов микроорганизмов и их токсинов» (№ 2004121534/(023081); «Способ определения ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов» (№2005109733/13).

План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора (протокол № 3 от 14 мая 2003 г.)

Структура работы.

Диссертация написана в виде монографии, изложена на 256 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, каждая из которых включает описание материалов и методов, результаты собственных исследований, их обсуждение, за которым следуют заключение и выводы. Диссертация иллюстрирована 32 таблицами и 41 рисунком. Библиографический указатель содержит 291 информационный источник, в том числе 128 работ отечественных и 163 - зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Телесманич, Наталья Робертовна

ВЫВОДЫ

1. На штаммах холерных вибрионов различных серологических групп показано, что лектиновый рецептор, детерминируемый геном hlyA, принимает участие в лизисе эритроцитов барана, но не кролика, взаимодействует с углеводами II группы - 3,4 - ОН транс Д форма (Д - галактоза), избирателен к аномерам р (р галактоза) (по классификации О. Мёкела). Лектиновая природа HlyA может обусловливать способность последнего к комплексообразованию с различными гидролитическими ферментами.

2. Сформулирована концепция о гемолитической активности холерных вибрионов как сложном полифункциональном процессе, включающем взаимодействие лектина с галактозой на поверхности мембран эритроцитов барана, участие нейраминидазы в десиализации мембран и ферментов, действующих на липиды и фосфолипиды.

3. Показано участие галактозоспецифичного лектинового рецептора в процессах взаимодействия токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов с клеточными мембранами: гемагглютинации эритроцитов кролика и барана, адгезии к эритроцитам барана и человека.

4. Разработана питательная среда для выявления триацилглицероллипаз-ной активности холерных вибрионов с использованием в качестве субстрата куриного жира.

5. Выявлено и на большом количестве штаммов показано, что гемоли-тичные холерные вибрионы эльтор обладают триацилглицероллипаз-ной активностью, а негемолитичные - не обладают, что перспективно для разработки методов дифференциальной диагностики V. cholerae.

6. Показана возможность использования иммуноглобулинов, полученных к чужеродному, но гомологичному антигену липазы Pseudomonas sp. (Sigma), с целью конструирования диагностикума для выявления липазы холерных вибрионов.

7. Сконструирован иммуноглобулиновый антилипазный диагностикум, позволяющий выявлять в РАО гемолитические штаммы, обладающие липазной активностью.

8. Выявлен различный диапазон вибриоциногенной активности препаратов гемолизинов по отношению к индикаторным культурам холерных вибрионов и некоторых энтеробактерий.

227

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гемолитическая активность холерных вибрионов в пробе Грейга на протяжении многих лет является одним из эффективных способов оценки эпидемической значимости штаммов, наряду с выявлением гена токсинооб-разования с помощью ПЦР, ДНК-зондирования и определением чувствительности к фагам эльтор ctx+ и ctx". С одной стороны, гемолитическая активность, тестируемая в пробе по Грейгу, является дополнительным критерием оценки эпидемической значимости штаммов, обеспечивая большое подспорье практическим лабораториям, которым недоступны биологические in vivo и молекулярно-биологические методы. С другой стороны, ограниченность подхода к дифференциации токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов по гемолитической активности, который на протяжении 100 лет не претерпел существенных изменений и дополнений, заставляет нас задуматься о том, что представляет собой гемолитическая активность холерных вибрионов. Исходя из сделанных обобщений, мы акцентировали внимание на выяснении особенностей феномена гемолиза. Конкретной задачей .явилась детекция ферментов, что, по нашему мнению, и согласно проведенному компьютерному прогнозированию, имеет немаловажное значение в осуществлении биологической роли гемолитической активности.

Для прогнозирования и объяснения свойств гемолизина холерных вибрионов нами был проведен компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов hly-области V. cholerae, который позволил сделать следующие обобщения:

1. ген hlyA кодирует полипептид, который относится к классу лектинов -поверхностно-активных веществ;

2. гемолитическая активность холерных вибрионов не опосредована активностью одного гена (hlyA); по всей видимости, феномен гемолиза -это сложный полифункциональный процесс, являющийся результатом взаимодействия продуктов нескольких генов;

3. определенная роль в гемолитической активности должна принадлежать фосфолипазе С и триацилглицероллипазе, так как гены, которые принято считать основными генами гемолитической активности hlyA и hlyB, окружают гены lec (лецитиназы) и hlyC (липазы). Проведенный нами анализ литературы и компьютерный анализ всех генов hly области холерных вибрионов позволил обосновать и объяснить свойства препаратов гемолизина, которые были описаны ранее другими авторами, такие как лизис эритроцитов различных животных (Семиотрочев В.Л., 1987; Адамов А.К., 1979; Подосинникова Л.С., 1989); цитотоксическая активность по отношению к клеточным культурам разного происхождения (Цитцер А.О., 1992, 2002); энтеротоксичность (McCardell, 1985), способность к пороформированию и каналоформированию (Цитцер А.О., 1992, 1997, 2002, 2003; Chattopadhyay К., 2002, 2003).

Одной из задач нашего исследования явилась детекция ферментов и других составляющих гемолитической активности холерных вибрионов в препаратах гемолизинов, полученных из разных штаммов холерных вибрионов с помощью многоэтапных схем очистки, предложенных другими авторами (Мишанькин М.Б., 1981; Романова Л.В., 1983; Уралева B.C., 1985; Оленичева Л.С., 1989), и отдельных фракций препарата, полученного нами с помощью двухэтапной схемы очистки. Ферментативные активности в препаратах гемолизинов определяли с помощью общепринятых клинико-диагностических экспресс-методов.

Изучив проявление гемолитичного фенотипа препаратов из штаммов V. cholerae не 01 Р-11702 (I тип а), любезно предоставленного Б.Н. Мишань-киным; V. cholerae eltor 9949 (I тип а), любезно предоставленного B.C. Ура-левой; мутанта V. cholera cholerae 461/67-34 (О") (I тип |3), любезно предоставленного О.П. Фецайловой (авт. свидетельство №4109359/2813); V. cholerae cholerae 569 В, любезно предоставленного Л.С. Оленичевой; (II тип а); V. cholerae eltor 14965 (I тип Р), очищенного нами. Установлено, что «активные» препараты гемолизинов холерных вибрионов эльтор, лизирующие эритроциты барана, содержат как минимум трех фермента - лецитиназу, липазу, нейраминидазу. Препарат гемолизина из штамма V. cholerae cholerae 569 В, лизирующий только эритроциты кролика, проявлял лецитиназную и нейраминидазную активности, не обладая липазной. В связи с этим возник вопрос насколько закономерно существование обнаруженных ферментов в препаратах, и как они связаны с гемолитической активностью. На основании полученных данных нами было выдвинуто предположение, что липазная активность при определенных условиях может являться маркером гемолитич-ности эритроцитов барана атоксигенных штаммов, это согласуется с мнением зарубежных исследователей о возможном участии липидов и липазы в ориентации гемолизина на поверхности раздела фаз липид-вода (Chattopadhyay К, 2002,2003; Olson R., 2003).

Несмотря на то, что ген нейраминидазы не является структурным геном hly области, нейраминидаза, по всей видимости, играет важную роль в биологическом действии гемолизина, подготавливая клетки-мишени к контакту и поражению. Данный факт подтверждается рядом работ (Козырева JT.A., 1978; Езепчук Н.В., 1983; Zhang D., 1999), в которых освещается роль нейраминидазы в реализации функции бактериальных токсинов. Нами установлено, что все препараты гемолизинов, очищенные разными авторами и способами содержали нейраминидазу. Этот факт согласуется с работами зарубежных исследователей последних лет (Zhang D., 1999; Chattopadhyay К., 2002, 2003) о взаимодействии гемолизина с сиалоглкопротеином гликофори-на. Известно также, что сиаловые кислоты экранируют Р-галактозу гликоли-пидов и гликопротеинов, поэтому для взаимодействия лектинов с галактозой необходима десиализация мембран (Луцик М.Д., 1980)

Проявления как нейраминидазной, так и лецитиназной активности штаммами холерных вибрионов довольно хорошо изучены. Установлено, что ни одна из этих активностей не является сугубо специфичной для гемоли-тичных атоксигенных холерных вибрионов (Донская Т.Н., 1978; Бугоркова Т.В., 1983; Колесникова Л.И., 1984; Евлахова С.П., Мишанькин Б.Н., 1998).

Одной из причин неизученности триацилглицероллипазной (липазной) активности у холерных вибрионов являлось отсутствие методов ее анализа, потому что последняя реализуется на поверхности раздела фаз липид-вода. Поэтому очередной задачей нашего исследования стала отработка методик изучения липазной активности холерных вибрионов. Нами была сконструирована питательная среда для выявления липазной активности холерных вибрионов, и показана корреляция липазной и гемолитической активности на большом количестве штаммов холерных вибрионов эльтор (приоритет №2003135696).

Установленная нами и другими авторами (Casanova Т.А., 1995; Ogier-man М.А., 1997) гомология липазы холерного вибриона с липазой Pseudomonas sp. позволила открыть новое направление в получении диагностических препаратов - возможность использования чужеродных, но гомологичных по структуре антигенов для серологических реакций. Мы использовали коммерческий препарат липазы Pseudomonas sp. («Sigma») для конструирования ан-тилипазного полимерного иммуноглобулинового диагностикума для изучения закономерностей проявления липазной активности у холерных вибрионов в РАО. Разработанный нами антилипазный диагностикум позволяет выявлять липазную активность у гемолитичных штаммов холерных вибрионов, выделенных из окружающей среды (приоритет № 2004108603). На наш взгляд, предложенные нами методы изучения липазной активности холерных вибрионов позволили затронуть лишь некоторые аспекты характеристики последней у холерных вибрионов. С помощью предложенных нами методов возможно изучение закономерностей проявления липазной активности у других биоваров и сероваров холерных вибрионов, выделенных из разных объектов, и установления взаимосвязи липазной активности с другими факторами патогенности при других условиях культивирования, что на сегодняшний день остается актуальным.

Таким образом, мы установили, что в «гемолитическом» фенотипе холерных вибрионов могут принимать участие ферменты липидного обмена

- лецитиназа и липаза, последняя коррелирует с гемолитической активностью атоксигенных штаммов. Тем не менее, предстояло ответить на один из главных вопросов: «Какое же вещество, принятое называть «гемолизином», детерминирует собственно структурный ген hlyA?». Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов и их продуктов, составляющих hly область холерных вибрионов, позволил обратить внимание на то, что доменная организация полипептида HlyA (HlyB) очень сходна с доменной организацией лектинов. Анализ показал наличие 1) домена сигнального пептида, который участвует в активации гемолизина-предшественника путем протеолиза. По данным (Hall R.H., 1990) полипептид гемолизина-предшественника (м.м 83200 кДа), кодируемый геном hly, подвергается протеолизу с образованием 3 белков с м.м. - 79,4; 68,6; 65,3 кДа. Мотив сигнального пептида располагается на N-конце полипептида HlyA, состоит из 40 аминокислотных остатков. Наличие сигнального пептида характерно для лектинов. Обычно он располагается на N-конце и включает до 15-40 аминокислот, его функция - активация незрелого лектина (пролектина) путем протеолиза (Лахтин В.М., 1994);

2) трансмембранный домен обеспечивает транспорт лектина из клетки микроорганизма. Ген hlyB кодирует синтез белка-порина, необходимого для секреции гемолизина, связанного с внешней мембраной холерного вибриона, отвечает за функции бактериальной хемотаксической чувствительности, обеспечивающей процесс передачи сигнала внутрь клеток, везикулярного транспорта и рецепторного слияния мембран;

3) домен, образующий ионные каналы, необходим для реализации токсического действия бактериальных лектинов (Лахтин В.М., 1994). При помощи компьютерного анализа мотив под кодовой характеристикой «haemolysin роге» был обнаружен ближе к N-концу полипептида HlyA в положении 288-481. Фенотипическое проявление этого домена HlyA-хорошо известно, оно заключается в формировании пор, каналов и, в результате, ци-тотоксической активности гемолизина (Zitzer А., 1997; Jkigai Н., 1996);

4) углеводсвязывающий домен (лектиновый) является ключевым признаком принадлежности белка к лектинам. Именно этот домен бактериальных лектинов обусловливает агглютинацию, преципитацию, адгезию микроорганизмов, способность лектинов к образованию фимбрий, пилей, а также к образованию всевозможных комплексов, в частности с ферментами. Наличие углеводсвязывающих доменов обусловливает полифункциональность лектинов (Лахтин В.М., 1989, 1994; Луцик М.Д., 1984). В положении 484-600 (116 ак) полипептида HlyA нами был обнаружен мотив лектинового домена В-цепи рицина. Результаты проведенного нами компьютерного анализа позволили с высокой степенью вероятности предположить, что продуктом гена HlyA является лектин. В последующем аналогичный компьютерный анализ был проведен R. Olson (2003), который также предположил наличие рицино-подобного лектина, отсутствующего у других родственных микроорганизмов. Способность связываться с углеводами у авторов вызывала сомнения по причине низкой гомологии лектиновых доменов растений и холерных вибрионов. Поэтому очередной задачей нашей работы была идентификация свойств гемолизина (hlyA) холерных вибрионов как лектина, изучение участия лектина (HlyA) в гемолитической активности на большом количестве штаммов разных сероваров холерных вибрионов, учитывая наличие двух типов гемолизинов - лизирующего эритроциты барана (атоксигенные штаммы) и лизирующие эритроциты кролика (токсигенные и атоксигенные штаммы).

На препаратах гемолизинов и штаммах холерных вибрионов, лизи-рующих эритроциты барана и кролика, с помощью реакции торможения гемолиза углеводами, основываясь на данных компьютерного анализа установлено, что лектиновый рецептор HlyA взаимодействует с углеводами III группы - 3,4-ОНтрансДформа, избирателен к аномерам р по классификации О. Мёкела, принимает участие в лизисе эритроцитов барана, но не эритроцитов кролика. Некоторые зарубежные авторы (Chattopadhyay К., 2002) сообщают об ингибиции гемолиза эритроцитов кролика гликопротеинами с Р-галактозиловыми молекулами. Однако сами же авторы свидетельствуют, что чувствительность кроличьих эритроцитов к hlyA не коррелирует с поверхностной плотностью галактозы. В связи с чем наши результаты при использовании чистой галактозы (D- р) при ингибиции гемолиза эритроцитов кролика на большом количестве штаммов адекватно отразили отсутствие ингибиции. Углеводным рецептором для гемолизина на поверхности мембраны эритроцитов барана является галактоза. Моделью для изучения галактозоспецифич-ного лектина и других лектиновых рецепторов холерных вибрионов для нас явилась не только модель гемолиза, но и гемагглютинации и адгезии к эритроцитам. В гемолизе эритроцитов кролика принимает участие N-конец pro HlyA - домен каналоформирования, вызывающий неспецифический гемолиз, который способен ингибироваться различными осмопротекторами, масса которых соответствует размерам пор в эритроцитах кролика.

Общепризнано, что адгезия является начальным и необходимым элементом патогенеза, а структуры (лектины), обусловливающие адгезивность возбудителя к клеткам хозяина, признаны определяющими факторами пато-генности (Yangulu N.K., 1996; Alouf J.E., 1982; Франц X., 1983; Луцик М.Д., 1981; Лахтин В.М., 1994). Показано, что лектины взаимодействуют с глико-каликсом щеточной каймы энтероцитов и вызывают его повреждение. Это приводит к нарушению функции всасывания слизистой кишечника, повышает ее проницаемость для бактериальных токсинов. Они же усиливают катаболизм белков в тканях и приводят к нарушению азотистого баланса. Лектины устойчивы к протеолизу в желудочно-кишечном тракте (Brady Р., 1978; Liener I., 1976). Однако микроорганизмы, обладая лектинами (агглютининами, адгезинами), при помощи последних участвуют в различных межклеточных взаимодействиях (Луцик М.Д., 1981; Лахтин В.М., 1994; Chivelli D.A., 2001; Flemming Н.С., 1998; Ипполитов И.Г., 2003; Chattopadhyay К., 2003).

Относительно лектиновых рецепторов (адгезинов) холерных вибрионов и их участия в различных межклеточных взаимодействиях в литературе до настоящего времени имелись отрывочные сведения. В нашей работе мы обобщили имеющиеся в литературе данные, дополнив их полученными нами новыми сведениями. В результате чего сформировали новое направление исследований, которое нуждается в дальнейшем развитии, так как изучение молекулярных основ взаимодействия холерных вибрионов с клетками человека и животных, идентификация лектиновых гаптенов холерных вибрионов и их углеводных рецепторов, несомненно, будет способствовать расшифровке структурно-клеточных механизмов действия токсинов холерного вибриона и углублению наших представлений о начальных этапах патогенеза холеры, а также позволит совершенствовать методические подходы профилактики и лечения холеры. Кроме обнаруженных ранее маннозочувствительного лектина (Chivelli D.A., 2001), лектина, узнающего N-ацетилглюкозамин на поверхности эритроцитов цыплят (Sasmal D., 2002), нами обнаружен галактозоспе-цифичный лектин, принимающий участие в лизисе эритроцитов барана (приоритет № 2004121534), гемагглютинации холерными вибрионами эритроцитов барана и кролика, участвующий в адгезии холерных вибрионов. Нами выявлены также лектиновые рецепторы, узнающие на поверхности эритроцитов N-ацетилД-галактозамин и глюкозу. Оба эти рецептора участвуют в адгезии штаммов холерных вибрионов 01 на модели эритроцитов, предложенной Брилисом В.И. (1986). Нами установлено, что рецептор, узнающий глюкозу, является специфическим при агглютинации эритроцитов кролика холерными вибрионами эльтор ctx+ (глюкоза не ингибирует агглютинацию эритроцитов кролика у других представителей холерных вибрионов). Данный принцип может быть использован при идентификации и дифференциации токсигенных вибрионов эльтор. Действие, ингибирующее адгезию холерных вибрионов, нами выявлено у глюкосолана - препарата, применяемого для ре-гидратационной терапии.

Результатом проведенной нами работы явилось установление у препаратов гемолизина антагонистических свойств по отношению к клеткам холерных вибрионов, некоторых шигелл и сальмонелл. О специфичности действия гемолизинов свидетельствовал разный спектр их ингибирующей активности по отношению к индикаторным культурам для изучения вибриоциногенности, соответствующий типу гемолизина. Препараты гемолизинов I тип а, лизирующие эритроциты барана через 24 часа, обладали узким спектром бактерицидной активности, препарат I тип Р, лизирующий эритроциты барана через 2 часа, ингибировал рост большого количества индикаторных культур. Сыворотка к гемолизину холерного вибриона не 01 группы нейтрализовала как гемолитическую, так и бактерицидную активность препаратов.

При помощи электронной микроскопии методом ультратонких срезов нами установлено, что при действии препарата гемолизина на клетки холерных вибрионов наблюдается значительное увеличение числа клеток с деградацией нуклеоида и рибосомного комплекса, что позволяет назвать их лизи-рованными. У некоторых клеток холерных вибрионов поврежден пептидог-ликан клеточной стенки. Установленный феномен не противоречит данным литературы о том, что у некоторых бактерий гемолитическая и бактерицидная активность тесно связаны: бактериоцин и гемолизин Streptococcus zymo-genes (Петровская В.Г., 1967); Bacillus megaterium (Jzaki M., 1966); Enterococ-cus faecalis (Gepson M., 1999); Yersinia pestis (Булгакова Е.Г., Кутырев B.B., 2002).

По нашим данным препараты гемолизинов холерных вибрионов ин-гибировали рост холерных вибрионов, некоторых шигелл и сальмонелл, в слабой степени штаммов некоторых лактобацилл. В связи с вышесказанным можно выдвинуть предположение, что в явлениях бактериоциногении важную роль могут играть лектиновые и углеводные рецепторы. Таким образом, понимание молекулярной основы адгезии микроорганизмов, которая имеет место в любых межклеточных взаимодействиях и явлениях, требует знаний о поверхностных компонентах патогенов, в частности холерных вибрионов.

Несмотря на полученные нами новые результаты о природе гемолитической активности холерных вибрионов, проведенные исследования, по всей видимости, ответили лишь на некоторые вопросы, касающиеся этого феномена. Установление многокомпонентности процесса гемолиза у холерных вибрионов послужило предпосылками для разработки новых методических приемов, направленных на совершенствование дифференциальной диагностики V. cholerae, и наметить ряд важных направлений, дальнейшее развитие которых позволит внести новый вклад в представления о биологии возбудителя холеры.

225

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Телесманич, Наталья Робертовна, 2005 год

1. Адамов А.К., Быстрый Н.Ф., Шмеркевич Д.Л., Середин В.Г. Методика дифференцирования патогенных и апатогенных вибрионов Эль Тор // Пробл. особо опас. инф. Саратов. -1971, Вып. 1. - С. 116-123.

2. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов, 1984. - 328 с.

3. Андрусенко И.Т. Исследование факторов, влияющих на вирулентность холерных вибрионов и разработка новых методов ее определения: Автореф. дис. д-ра мед. наук. Саратов, 1991 - 43 с.

4. Андрусенко И.Т., Адамов А.К., Яговкин Э.А., Шепелев А.П. Изучение биологического действия холерного энтеротоксина холерного вибриона // Сб. научных трудов. Вып. 1,- Новороссийск, 1994. - С. 173-175.

5. Андрусенко И.Т., Пастернак Н.А., Ведьмина Е.А. и др. Действие энтеротоксина Vibrio cholerae на микроорганизмы // Журн. микробиол., эпидемиол., и иммунобиол. 1984.- № 10.- С. 52-55.

6. Андрусенко И.Т., Фрунзе О.В., Шепелев А.П., Адамов А.К., Щуркина И.И. Использование реакции гемагглютинации с целью изучения адгезивно-сти вибрионов. Лаб. дело. 1987. № 3.

7. Биохимия человека / Р. Мари, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл. М.:1. Мир, 1993.-Т. 1.-384 с.

8. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцер Х.П., Ленцер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лаб. дело. 1986. №4. - С. 210212.

9. Брокерхоф X., Дженсен Р. Липолитические ферменты. М.: Мир, 1978. -396 с.

10. Бугоркова Т.В., Майоров Н.В., Казакова Е.С., Адамов А.К. Некоторые биохимические особенности двух штаммов V. cholerae 0139 серовара // Эко-лого эпидемиол. надзор за природно - очаг. инф. в Северном Прикаспии: Сб. науч. тр. - Астрахань, 1996.- С. 96-97.

11. Бугоркова Т.В., Шмеркевич Д.Л., Наумшина М.С. Характеристика штаммов холерных вибрионов биовара эльтор по протеолитической и лецитиназной активности // Биохимия, патофизиол. и микробиол. особо опас. инф. -Саратов, 1978. С. 76-82.

12. Булгакова Е.Г., Кутырев В.В. Генетическая детерминированность гемолизина чумного микроба // Матер. VIII съезда Всерос. об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол. М., 2002. - Т. 1. - С. 142.

13. Бырдаров С.В. Экспериментальная микробиология. София: Медицина и физкультура, 1965. - 372 с.

14. Вейде А.А., Марамович А.С., Ганин B.C. и др. Характеристика холерных вибрионов, выделенных в Астраханской области в 1970 г. // Пробл. особо -опас. инф.- Саратов, 1975. Вып. 2. С. 81-85.

15. Вертиев Ю.В. Токсин-опосредованная обусловленность инфекционных заболеваний // Мол. структура бактериальных токсинов и генетич. контроль их биосинтеза: Тез. 1-й Всесоюз. конф. М., 1985. - С. 28-30.

16. Вертиев Ю.В., Езепчук Ю.В. Бактериальные нейраминидазы: некоторые физико-химические и биологические свойства и связь их с патогенностью микробов // Веста. АМН СССР. 1973. - № 12. - С. 56-61.

17. Власов В.П., Монахова Е.В., Подосинникова JI.C. и др. Использование Тох-зонда для изучения холерных вибрионов // Пробл. мед. и сан. микро-биол. города: Тез. обл. конф. Ростов-на-Дону, 1987. - С. 14-16.

18. Власов В.П., Монахова Е.В., Ушакова И.Е. и др. Гемолизин Vibrio cholerae el tor: клонирование и экспрессия генов в Escherichia coli // Мол. генетика, микробиол. и вирусология. 1992 - № 7-8. - С. 14-20.

19. Водопьянов С.О., Мишанькин М.Б., Олейников И.П. и др. Разработка способа выявления гена tcpA холерного вибриона биотипа эльтор и серова-рианта 0139 Бенгал с помощью полимеразной цепной реакции // Биотехнология.-1999.-№ 6. С. 19-23.

20. Гинцбург A.JL, Грижебовский Г.М., Токарская О.Н. и др. Изучение полиморфизма штаммов холерного вибриона разного происхождения методом геномной дактилоскопии // Генетика.- 1989.- T.XXV, № 7.- С. 1320-1324.

21. Гинцбург A.JL, Янишевский Н.В., Мотин B.JI. и др. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV 79// Мол. генет., микробиол. и вирусол.- 1984,- № 9.- С. 12-18.

22. Громов Б.В. Строение бактерий. Л.: Изд-во ЛГУ, 1985. - 190 с.

23. Далин М.В., Фиш Н.Г. Белковые токсины микробов. М., 1980. - 224 с.

24. Джапаридзе М.Н., Наумов А.В., Никитина Г.П. и др. Оральная химическая вакцина из гипертоксигенных штаммов КМ-76 Инаба и КМ-68 Огава возбудителя холеры // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1991. -№ 4.-С. 31-33.

25. Домарадский И.В. Зачем микробам токсины? (о роли токсинов в экологии бактерий) // Мол. генет., микробиол. и вирусол.- 1990.- № 9.- С. 3-10.

26. Домарадский И.В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий к окружающей среде // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. -№ 4.-С. 31-35.

27. Домарадский И.В. Роль токсинов в экологии бактерий // Журн, микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993. - № 1. - С. 103-106.

28. Донская Т.Н. Ферметативная активность холерных вибрионов // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 1978. - Вып. 3. - С. 59-63.

29. Дуванова О.В., Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Способность расщеплять твин 20 как дифференциальный тест для вибрионов 0139 серовара различного происхождения // Клин. лаб. диагн. 2000, № 5. - С. 48-49.

30. Евлахова С.П., Мишанькин Б.Н. Протеолитическая и лецитиназная активность холерных вибрионов 0139 серовара // Пробл. сан. эпид. охраны территории стран Содр. Независ. Гос-в: Тез. докл. Междунар. науч. - практ. конф.- Саратов, 1998.- С. 154-155.

31. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М.: Медицина, 1985.-240 с.

32. Езепчук Ю.В., Вертиев Ю.В., Денисов JI.A. Роль нейраминидазы в функции бактериальных токсинов // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1983. -№ 1.-С. 21-24.

33. Зыкин Л.Ф. Современное состояние вопроса о лабораторной диагностике холеры // Микробиол. и иммунол. особо опас. инфекций. Саратов, 1968. - С. 391-395.

34. Иммунология: в 3-х т. / Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1989. Т. 3. - С. 49-50.

35. Ипполитов К.Т., Сироткин А.С., Панкратова С.А., Кюн М. Закономерности развития биопленки и особенности образования внеклеточных полимерных веществ штаммом Sphingomonas sp. // Биотехнология. 2003. - № 3. - С. 3-11.

36. Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы. -М., 1976. 164 с.

37. Колесникова Л.И., Гулида М.М., Фецайлова О.П., Кутырева И.В. Значение лецитиназы (фосфолипазы С) в вирулентности возбудителя холеры // Обл. науч. практ. конф. по пробл. «Холера»: Тез. докл.- Ростов-на-Дону, 1984.- С. 90-91.

38. Король В.В. Современное состояние и перспективы развития проблемы адгезии патогенных микроорганизмов // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. 1994. - № 4. - С. 45-48.

39. Король В.В., Алексеева Л.П., Гофман Е.Л. Метод изучения адгезивных свойств холерных вибрионов, меченных радиоактивным углеродом // Профилакт. природноочаговых инф.: Тез. докл. Всесоюз. науч. практ. конф. -Ставрополь, 1983. - С. 300-301.

40. Костромитина Е.А. Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона с различной эпидемической значимостью: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 2004. - 22 с.

41. Крю Ж. Биохимия. Медицинские и биологические аспекты. М.: Медицина, 1979.-С. 195.

42. Кузьмиченко И.А., Грачев И.В., Плотников О.П. Деструктивная активность и рост холерного вибриона в присутствии твинов // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 2001.-Вып. 1.-С. 101-105.

43. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М.: Медицина, 1983. - 272 е.

44. Лабораторная диагностика холеры. МУ 4.21097-02. Москва, 2002. - 95с.

45. Лахтин В.М. Молекулярная организация лектинов // Мол. биология. -1994.- Т. 28, №2.-С. 245-273.

46. Лахтин В.М., Биотехнология лектинов // Биотехнология. 1989. - Т. 5, № 6.-С. 616-691.

47. Ленцнер А.А., Брилис В.И., Брилене Т.А. // Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология. М., 1982, - С. 93.

48. Ломов Ю.М., Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С. Характеристика современного этапа в развитии 7 пандемии холеры // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - № 6. - С. 39-42.

49. Ломов Ю.М. Пандемии холеры и эволюция возбудителя // Холера: Матер. 8 Росс. науч. практ. конф. - Ростов-на-Дону, 2003. - С. 13-23.

50. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Антонюк В.А. и др. Методы поиска лектинов (фитогемагглютининов) и определение их иммунохимической специфичности: Метод, рекомендации.- Львов, 1980.- 20 с.

51. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. Лектины. Львов, 1981. - 156 с.

52. Манувахова М.Ш., Богданова М.В., Несмеянова М.А. Изучение роли оболочки Е. coli в секреции гемолизина // Биологические мембраны. 1990. - Т. 7, № 4. - С. 390-398.

53. Меньшикова Е.А., Подосинникова Л.С., Миронова А.В., Сальникова О.И. Гемолитическая активность и токсигенность V. cholerae различных серог-рупп // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - № 5. - С. 7-11.

54. Меньшикова Е.А. Гемолитическая активность токсигенных и нетокси-генных штаммов холерных вибрионов различных серогрупп: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов-на-Дону, 2002. -18 с.

55. Меньшикова Е.А., Подосинникова Л.С., Соколенко А.В. и др. Гемолитическая активность токсигенных и атоксигенных штаммов V. cholerae и V. cholerae 0139 серогрупп // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2004.-№5.-С. 106-108.

56. Методические рекомендации по выявлению вибриоцинов холерных вибрионов 01 и не 01 сероваров / Сост.: Л.В. Иванова, Л.Г. Воронежская, А.Г. Сомова., Н.С. Гончарова. Ростов н/Д, 1987. - 11 с.

57. Методические рекомендации по определению вирулентности холерныхвибрионов на модели кроликов-сосунков / Сост.: А.К. Адамов, Л.Ф. Зыкин, И.В. Исупов и др. Ростов н/Д, 1979 - 6с.

58. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов. МУК 4.1/4.2.588-96. МЗ России. М., 1996. - 128 с.

59. Мишанькин Б.Н., Родионова А.В., Рачицкая В.А., Романова Л.В. Способ получения гемолизина / А. с. 982347 (СССР). Заявл. 01.04.81, № 3275956/28. Опубл. в Б.И., 1984, № 46, 15.12.84. МКИ С 12 № 1/00.

60. Мишанькин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Рябухина О.Ю. и др. Молекулярное клонирование генов нейраминидазы V. cholerae El Tor: Перспективы использования // Вестн. Всесоюз. микробиол. общества. Ростов, отд. Ростов н/Д, 1989.- Вып. I.-C. 149-156.

61. Мишанькин М.Б., Телесманич Н.Р. Компьютерный анализ нуклеотид-ной и аминокислотной последовательностей гена HLY А гемолизина Vibrio cholerae // Пробл. комис. «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов н/Д, 2001.-Вып. 14.-С.56-57.

62. Молекулярная биология клетки / Б. Альберте, Д. Брей, Дж. Льюис и др. -М.: Мир, 1986. Т. 2. - С. 197-200.

63. Монахова Е.В., Власов В.П., Подосинникова Л.С. и др. Использование молекулярной гибридизации ДНК для определения потенциальной способности холерных вибрионов к синтезу холерного токсина//Бактериальные токсины: Сб. науч. тр. М., 1987. - С. 92-97.

64. Недзевецкий Э.Ф. К микрографии холеры,- 1872. // Оттиск из Московской медицинской газеты.

65. Нефедов К.С., Осин А.В., Ливанова Л.Ф., Смирнова Н.И. Фенотипическая и генотипическая характеристика штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор // Пробл. комис. «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов н/Д, 2005.-Вып. 18.-С. 81-82.

66. Никитина Г.П., Урюпина Н.В. Методические особенности применения гемолитического теста для дифференциации биотипов холерных вибрионов //

67. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Мазрухо Б.Л. и др. Характеристика культур холерных вибрионов 01, изолированных из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в 2002 г. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004. - № 2. - С. 3-8.

68. Определитель бактерий Берджи: В 2-х томах. М.: Мир, 1997. - Т. 1.

69. Осауленко О.В., Марамович А.С., Вейде А.А. Изучение стабильности гемолитического теста у штаммов Vibrio cholerae eltor различной вирулентности // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983.- № П.- С. 100101.

70. Осауленко О.В., Пинигин А.Ф., Погорелов В.И. Изучение гемолизинов холерных вибрионов // Актуал. пробл. профилак. особо опас. и природно -очаг, инфекций: Тез. докл. науч. конф., посвящ. 60-лет. Иркутского ПЧИ.-Иркутск, 1994.-С. 122-123.

71. Осин А.В. Фенотипический и генетический анализ вирулентных и авиру-лентных штаммов Vibrio cholerae 0139: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -Саратов, 2002. 22 с.

72. Пастернак Н.А., Ведьмина Е.А., Андрусенко И.Т. и др. Титрование энте-ротоксина холерных вибрионов на модели УФ-2 мутанта Staph, aureus 209р. // Лаб. дело. 1983. -№9. - С. 52-53.

73. Петровская В.Г. Проблема вирулентности бактерий. М: Медицина, 1967. - 263 с.

74. Подосинникова JI.C. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Саратов, 1993.-44 с.

75. Подосинникова JI.C., Власов В.П., Монахова Е.В., Глянько Е.В. Оценка эпидемической значимости холерных вибрионов. Формула эпидзначимости штаммов Vibrio cholerae 01 // Пробл.-темат. комисс. по пробл. «Холера»: Информация.- Ростов н/Д, 1989,- С. 9.

76. Покровский В.И., Малеев В.В. Холера. М.: Медицина, 1978,- 232с.

77. Покровский В.И., Малеев В.В., Адамов А.К. Клиника, патогенез и лечение холеры.- Саратов, 1988.- 272 с.

78. Прозоровский С.В., Кац JI.H., Каган Г.Я. L-формы бактерий (механизм образования, структура, роль в патологии). М.: Медицина, 1981. - 240 с.

79. Резников Ю.Б., Стукова Н.Ю., Донская Т.Н.; под ред. Ледванова М.Ю., Неумова А.В. Клиническая микробиология холеры. Академическая серия «Международные стандарты». М., 1997. 26 с.

80. Рис Э., СтернбергМ. От клеток к атомам. М.: Мир, 1988. - 144 с.

81. Романова Л.В., Родионова А.В. Очистка и некоторые свойства гемолизина из клеток Vibrio NAG Р-11702 // Профилактика природно-очаговых инфекций: Тез.докл. Всесоюз. науч.-практ. конф Ставрополь, 1983. - С. 40-41.

82. Рубан Е.Л. Микробные липиды и липазы. -М.: Наука, 1977.-218 с.

83. Савельев В.Н., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф. и др. Этиология холеры эльтор. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1998.- №1.- С. 21-24.

84. Сальникова О.И., Помухина О.И., Подосинникова JI.C. Определение нейтрализующей активности иммунных сывороток к токсинам холерных вибрионов на модели культуры клеток // Иммунол. и спец. профил. ООИ.: Матер. Рос. науч. конф. Саратов, 1993. - С. 255.

85. Саямов С.Р., Телесманич Н.Р. Ультраструктурные изменения холерных вибрионов при действии гемоцитолизина из штамма V. cholerae Не 01 Р-11702 // Биотехнология, 2003. - № 1. - С. 33-38.

86. Саямов С.Р., Дунаев Г.С., Зыкин Л.Ф., Курилов В.Я. Автолитические процессы как возможный компонент механизма L-трансформации чумного микроба // Дезинфекция и стерилизация. Перспективы развития: Матер. Всес. науч. конф. Волгоград, 1983. - С. 118-119.

87. Саямов С.Р., Заренков М.И., Мишанькин Б.Н. Индукция пестицином изменений ультраструктуры чумного микроба, коррелирующих с продукцией экстрабактериальной каталазы II Биотехнология. 2000. - № 4. - С. 22-27.

88. Святой В.И. Изучение вирулентности гемолитически активных вибрионов Эль Тор в тесте Грейга // Пробл. особо опас. инф.- Саратов, 1978.-Вып. 3. - С. 42-44.

89. Семиотрочев В.Л. Изучение гемолитической активности холерных вибрионов эльтор // XII Межреспубл. науч. практ. конф. противочумн. уч-режд. Средней Азии и Казахстана по проф. чумы: Тез. докл.- Алма-Ата, 1985.-С. 281-283.

90. Семиотрочев В.Л., Бабицин С.Н., Цитцер А.О. Селекция клеток холерного вибриона 01, лишенных гемолитических свойств // Матер. Обл. науч.-практ. конф. Гурьевской ПЧС по профилактике ООИ. Гурьев, 1989. - С. 192-194.

91. Семиотрочев В.Л. Группы V. cholerae, имеющие различную эпидемическую значимость // Журн. микробиол., эпидемиол. и иимунобиол. 1990. -№4.-С. 61-67.

92. Скулачев В. П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. М.: Высш. шк., 1989.-271 с.

93. Смирнова Н.И., Ильина Т.С., Гончарова Н.С., Смирнов Г.Б. Мутанты Vibrio eltor с измененной продукцией гемолизина: получение и характеристика//Генетика.- 1982.-Т. 18, № 10.- С. 1730-1732.

94. Соловьев В.Д., Кобринский Г.Д., Гальцева Г.В., Саямов P.M. О роли нейраминидазы холерных вибрионов в патогенезе экспериментальной холеры // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1975,- № 5. - С. 94-99.

95. Справочник биохимика / Р. Досон, У. Элиот, К. Джонс К. М.: Мир, 1991.-С. 240.

96. Суханова Г.А. Патохимия клетки. Томск: изд-во Томского мед. инта, 1990.- 150 с.

97. Тихомирова Е.И., Заднова С.П., Волох О.А. и др. Лектин вакцинного штамма Yersinia pestis EV и изучение его иммунобиологических свойств // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2003. - № 1. - С. 51-55.

98. Уралева B.C., Гулида М.М. Характеристика протеазной активности штаммов и мутантов Vibrio cholerae с различными биологическими свойствами //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1988.- № 9.- С. 7-10.

99. Уралева B.C., Кутырева И.В., Черепахина И.Я., Трубникова В.А. Адгезивные свойства штаммов и мутантов холерных вибрионов с различной биологической характеристикой // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983. №7.-С. 51-55.

100. Уралева B.C., Фецфйлова О.П. Штамм вибриона V. cholerae cholera -продуцент гмолизина / Авторское свидетельство № 4109359/2813 (123125) от 11.08.86.

101. Уралева B.C., Гулида М.М. Протеазы возбудителя холеры // Пробл. мед. и сан. микробиологии города: Тез. обл. конф. Ростов-на-Дону, 1987. -С. 16-17.

102. Ушакова И.Е. Гемолитическая активность холерных вибрионов: Авто-реф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1993. - 22 с.

103. Фецайлова О.П., Уралева B.C. Иммуногенность гемолизина холерных вибрионов //1 съезд иммунологов России: Тез. докл. Новосибирск, 1992. -С. 495-496.

104. Фецайлова О.П., Уралева B.C., Цыгулева Н.Н. Особенности получения антигемолитических сывороток и их характеристика //1 съезд иммунологов России: Тез. докл. Новосибирск, 1992. - С. 496.

105. Фецайлова О.П., Уралева B.C., Помухина О.И. Сравнительная характеристика вирулентности холерных вибрионов // Генетика и микробиологияприродноочаговых инфекций. Саратов, 1984. - С. 56-60.

106. Франц X., Пфюллер К. Применение токсических растительных лектинов в изготовлении иммунотоксинов (аффинотоксинов) // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983. - № 5. - С. 18-25.

107. Чистович Г.Н. Стафилококковая лецитиназа // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1950. - 10. - С. 54-57.

108. Шиманюк Н.Я., Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н. Нейраминидаза холерных вибрионов 0139 серовара «Бенгал» // Матер, науч. практ. конф., по-свящ. 100-лет. образов, противочум. службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. -С. 151-152.

109. Цитцер А.О.Красильникова О.В., Муратхаджаев Д.Н., Семиотрочев B.JL Характеристика свойств цитолизина холерного вибриона Холера. Матер. Российской науч. конф. (Вопр. эпидем., микробиол. и лаб. диагностики). Ростов-на-Дону, 18-19 ноября 1992. С. 78.

110. Aim R.A., Manning P. A. Caractreization of the hly В gene and its role in the production of Eltor hemolysin of V. cholerae 01 // Mol. Microbiol. 1990. - №4 (3).-P. 413-425.

111. Aim R.A., Mayrhofer G., Kotlarski I., Manning P.A. Amino-terminal domain of the El Tor haemolysin of Vibrio cholerae 01 is expressed in classical strains and is cytotoxic // Vaccine. 1991. - Vol. 9, № 8. - P. 588-594

112. Alouf J.E. Bacterial toxin: an outlook // Toxicon. 1982, Vol. 20, № 1. - P. 211-216.

113. Barua D., Cvjetanovic В. Холера в период 1961-1970 гг. // Принципы ипрактика борьбы с холерой.-Женева, ВОЗ, 1971.- С. 15-21.

114. Baxter A., Beeley J., Changes in surface carbohydrate of human erythrocytes aged in vivo//Biochem. Soc. Trans. 1975. - Vol. 3, № 1. - P. 134-136.

115. Benz R., Schmid A., Wagner W., Goebel W. Pore formation by E. coli hemolysin: evidence for an association dissociation equilibrium of the pore-forming aggregates // Infect. Immun. - 1989. - Vol. 67, № 2. - P. 887-895.

116. Bernard P., Guillerm J., Gallut J. L hemolyse par le vibrion El Tor et par son hemolysine // Compt Rend. Soc. Biol.- 1939.- Vol. 130,- P. 147-148.

117. Bhattacharya M.K., Bhattacharya S.K., Yarg S. et al. Outbreak of Vibrio chol-erae non 01 in India and Bangladesh // Lancet.- 1993.- Vol. 341, № 8856.- P. 13461347.

118. Bhattacharya S.K., Bhattacharya M.K., Nair G.B. et al. Clinical profile of acute diarrhoea cases infected with the new epidemic strain of Vibrio cholerae 0139: designation of the disease as cholera//J. Infect.- 1993.-Vol. 27, № l.-P. 11-15.

119. Bishagratnas K. An English translation of the Sushruta Samhita Chowk-hamba Sanscrit Series Office. Varanasi, India, 1963.- P. 352-356.

120. Booth I.W., Harries J.T. Oral rehydration therapy: An issue of growing controversy // J. Trop. Pediatr. 1982. - Vol. 28. - P. 116-123.

121. Boyd W. Lectins // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1970. - Vol. 169. - P. 168-190.

122. Boyd W., Everhart D., Mc Master M. The anti- N lectin of Bauhinia purpurea//J. Immunol. 1958. - Vol. 81. - P. 414-418.

123. Brady P., Vannier A., Banwell J. Identification of the dietary lectin, wheat germ agglutinin, in human intestinal contents // Gastroenterology. 1978. - V. 75, № 2. - P. 236-239.

124. Broveli A., Balduini C.L. Membrane glycoprotein structure during erythro-% cyte life-span // Ital. J. Biochem. 1978. - Vol. 27, № 4. - P. 274-275.

125. Casanova T.B., Peterson K.M. The Vibrio cholerae hlyC gene encodes a proteinthat is related to lipases of pseudomonas species // DNA Seq. 1995. Vol. 5, №3. P. 181-184.

126. Chattopadhyay K., Bhattacharyya D., Baneijee K.K. Vibrio cholerae hemolysin. Implication of amphiphilicity and lipid-induced conformational change for its pore-forming activity // Eur J Biochem. 2002. - Vol. 269, № 17. - P. 4351 -4358.

127. Chattopadhyay K., Banerjee K.K. Unfolding of Vibrio cholerae hemolysin induces oligomerization of the toxin monomer // J Biol Chem. 2003. - Vol. 278, № 40. - P. 38470-38475. Epub 2003 Jul 23.

128. Cholera in 1983 // WER. 1984. - Vol. 59, № 33. - P. 353.

129. Cholera in 1988 // WER. 1989. - Vol. 64, № 19. - P. 141-148.

130. Chongsa-nguan M., Chalcumpa W., Moolasart P. et al. Vibrio cholerae 0139 Bengal in Bangkok//Lancet.- 1993.- Vol. 342, № 8868.- P. 430-431.

131. Cieplak W., Eidels L. Membrane-mediated cytotoxicity / Bonavida D., Collier R.J. Eds.-N.Y.: AlanR. Liss, 1987.-P. 19-26.

132. Coelho A., Andrade J.R., Vicente A.C., Dirita V.J. Cytotoxic cell vacuolating activity from Vibrio cholerae hemolysin // Infect Immun. 2000. - Vol. 68, № 3. - P. 1700-1705.

133. Col well R.R. Vibrios in the aquatic environment: an ecological paradigm. // Perspect. Microbiol. Ecol.: Proc. 4 л Intern. Symp. Ljubljana, 1987,- P. 426-434.

134. De Moor C.E. A non haemolytic El Tor Vibrio as the cause of an outbreak of paracholera in West New Guinea. The El Tor problem and pandemic paracholera in the West Pacific. // Trap. Geograph. Med.- 1963.- V. 15, № 2.- P. 97-107.

135. De Moor C.E. Paracholera (El Tor). Enteritis choleriformis El Tor Van Loghem.

136. Bull. Wld. Helth. Org. Geneva, 1949.- Vol. 2, № 1.- P. 5-17.

137. De Moor C.E. Un vibrion du type El Tor responsable, dans la partie sud de 1' ile ^ de Celebes (Indes Neerlandaises), d'une epidemie presentant les apparances completesdu cholera//Bull. Off. Int. Hyg. Publ.- 1938.- Vol. 30, № 7.- P. 1510-1519.

138. De S.N., Bhattacharyya K., Roychaudhury P.K. The haemolytic activities of Vibrio cholerae and related vibrios // J. Pathol. Bacteriol. 1954. - Vol. 67.- P. 117.

139. Doorenbos W. Etude sur la symbiose du vibrion cholerique avec le bacteriophage. Reproduction experimentale de caracteres biologiques des vibrions choleriques // Ann. Inst. Pasteur. 1932. - T. 48. - P. 457-469.

140. Dubert J.M., Stiewiez P., Rebeyrotte P. nouvelle methode de separations des proteins seriques par methanol application aux serum de lapin et de cheval // Ann. Inst. Pasteur. 1953. - Vol. 84. - P. 370-381.

141. Eshdat Y., Ofek I., Yashow-Gan Y. et al. Isolation of a mannose-specific lectin from E. coli and its role in the adherence of the bacteria to epithelial cells. // Biochem. Biophis. Res. Comm. 1978. - Vol. 85, № 4. - P. 1151-1559.

142. Farkas-Himsley H. Bacteriocins as growth inhibitors of neoplasma and tu-morigenic cells //IRCS Med. Sci.- 1976.- Vol. 4,- P. 291.

143. Faruque S.M., Comstock L., Kaper J.B., Albert J. Distribution of zonula occludens toxin (zot) gene among clinical isolates of Vibrio cholerae 01 from Bangladesh and Africa //J. Diar. Dis. Res. 1994. - Vol. 12, № 3. - P.222-224.

144. Feeley J.C., Pittman M. Studies on the haemolytic activity of El Tor vibrios // Bull. WHO. 1963. - Vol. 28. - P 347-356.

145. Felsenfeld O., Jatanasen S., Buspavanich B. et al. El Tor vibrios of the Ogava serotype occurring in an epidemic of diarrhoea with vomiting in Ubol, Thailand // J.

146. Trap. Med. Hyg. -1961. Vol. 64. - P. 207-210.

147. Figueroa-Arredondo P., Hueser J.E., Akopyants N.S. et al. Cell vacuolation caused by Vibrio cholerae haemolysin // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, № 3.-P. 1613-1624.

148. Finkelstein R., Hanne L. Purification and characterization of the soluble hemagglutinin (cholera lectin) produced by Vibrio cholerae // Infect. Immun. -1982. Vol. 36, № 3. - P. 1199-1208.

149. Fiore E., Michalski J., Russel R. et al. Cloning, characterization, and chromosomal mapping of a phospholipase (lecithinase) produced by Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1997. - Vol. - 65, № 8. - P. 3112-3117.

150. Flemming H.C. Bakterien auf Oberflaechen. Skript zur Vorlezung: Universi-taet Stuttgart. Stuttgart, 1998. - S. 81.

151. Franz H., Ziska P. Lectins: Biology, biochemistry and clinical biochemistry / Eds. T.C Bog-Hansen.- Berlin; New York: Walter de Gruyter, 1981.- Vol. 1.- P. 179-184.

152. Fredericq P. Action antibiotique chez les Enterobacteriaceae // Rev. Beige Path. Med. Experimental. 1948. - Suppl. № 4. - P. 1.

153. Gallut J., Qniniou J. Взаимодействие вибрионов классической холеры биотипа Эль Тор и вибрионов НАГ // Бюлл. ВОЗ 1971. - Т. 42. № 3. - С. 480-482.

154. Gancik J., Schaner R. Sialic acid a determinant of the life-time of rabbit erythrocytes // Hoppe - Seylers's Zschr. Physiol. Chem. - 1974. - Vol. 355, № 4. -P. 395-400.

155. Ganguly N.K., Kaur T. Mechanism of action of cholera toxins and other toxins // Indian J. Med. Res.- 1996.- Vol. 104.- P. 28-37.

156. Gilboa-Garber N. Pseudomonas aeruginosa lectins as a model for lectin production, properties, applications and functions // Zbl. Bakt. Hyg. 1988. - Vol. 270,№ 1-2.-P. 3-15.

157. Goldberg S.L., Murphy J.R. Cloning and characterization of the hemolysin determinants from Vibrio cholerae RV 79 (Hly +), RV 79 (Hly "), and 5'69B //1.

158. Ф Bacteriol. 1985. - Vol. 162, № 1.-P. 35-41.

159. Goldberg S.L., Murphy J.R. Molecular cloning of the hemolysin determinant from Vibrio cholerae El Tor // J. Bacteriol.- 1984,- Vol. 160, № 1. P. 239-244.

160. Gotschlich F. Uber cholera und choleraahnliche Vibrionen unter den aus Mekka zuriickkehrenden Pilgern // Zschr. Hyg. Infektkr.- 1906. - Bd. 53, H 2.-S. 281-304.

161. Gotschlich F. Vibrions chol6riques isoles au campement de Tor. Retour du pelerinage de l'annee 1905. Rapport adresse au president du

162. Conseil quarantenaire d'Egypte, Alexandrie // Bull. Inst. Pasteur. -1905.- Vol. 3.- P. 726.

163. Green B.A., Newland J.W., Holmes R.K. Mapping of chromosomal genes that determine the El Tor biotype in Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1983.- Vol. 42, № 3. - P. 924-929.

164. Greig E. The haemolytic action of indian strains of cholera and cholera-like vibrios // Indian. J. Med. Res.-1914.- Vol. 2.- P. 623-629.

165. Gruber M., Durham H.E. Eine neue Methode zur raschen Erkennung des Choleravibrio und des Typhusbacillus // Munch, med. Wschr.- 1896.- Bd. 43.- S. 285.

166. Gyobu Т., Kodama H., Sato S. Studies on the enteropathogenic mechanism of non 01 Vibrio cholerae. III. Production of enteroreactive toxins // Kansen-shogaku Zasshi. -1991. V. 65. -№ 7. - P. 781-787.

167. Hall R.H., Drasar B.S. Vibrio cholerae HlyA hemolysin is processed by proteolysis // Infect. Immun. 1990.- Vol. 58, № 10.- P. 3375-3379.

168. Hanson P.I., Heuser J.E., Jahn R. Neurotransmitter release-four years of SNARE complexes // Curr. Opin. Neurobiol. 1997 - Vol. 7, № 3. - P. 310-315.

169. Harris J.R., Bhakdi S., Meisner U. et al. Interactin of the Vibrio cholerae cytolysin (VCC) with cholesterol, some cholesterol esters, and cholesterol derivatives: а ТЕМ study // J. Struct. Biol. 2002. Vol 139, №2. - P. 122-135.

170. Hazelbauer G.L. The bacterial chemosensory system. // Can. J. Microbiol. -1988. Vol. 34, № 4. - P. 466-474.

171. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DHA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae // Nature. 2000. - Vol. 406, № 6795.-P. 477-483.

172. Hellin H. Der giftige Eiweisskorper Abrin und sein Wirkung auf Blut. -Dorpat, 1891.

173. Holmgren J.A., Svennerholm A.M. Enzyme-linked immunosorbent assays for cholera serology // Infect. Immun. 1973. - Vol. 7, № 5. - P. 759-763.

174. Honda Т., Finkelstein R.A. Purification and characterization of a haemo-lysin produced by Vibrio cholerae biotype El Tor: another toxic substance produced by cholera vibrios // Infect. Immun. 1979. - Vol. 26, № 3. - P. 1020-1027.

175. Hutchison M.L., Poxton I.R., Govan J.R.W. Burkholderia cepacia produces a hemolysin that is capable of inducing apoptosis and degranulation of mammalian phagocytes // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66, № 5. - P. 2033-2039.

176. Ichinose Y., Yamamoto K., Nakasone N. et al. Enteroxicity of El Tor -like hemolysin of non-Ol Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55, № 5.-P. 1090-1093.

177. Ikigai H., Nakae T. The rate assay of alpha toxin assembly in membrane // FEMS Microbiol. Lett. 1987. - Vol. 24, N 2-3. - P. 319-322.

178. Ikigai H., Ono T, Nakae T. et al. Two forms of Vibrio cholerae 01 El Tor hemolysin derived from identical precursor protein // Bioch. Bioph. Acta. 1999. - Vol. 1415, № 5. - P. 297-305.

179. Izumi N., Kondo H. Studies on Clostridium oedematiens toxins with special reference to differentiation of the lethal oedematous hemolytic and lecitinase activities // Jap. J. Med. Sci. Biol. 1978. - Vol. 31, №2. - P. 219-220.

180. Jesudason M.V., Cherian A.M., John T.J. Blood stream invasion by Vibrio cholerae 0139 //Lancet.- 1993,- Vol. 342, № 8868.- P. 431.

181. Kamata Y., Kozaki S., Sakaguchi G. et al. Evidence for direct binding of Clostridium botulinum type E derivative toxin and its fragments to gangliosides and free fatty acids // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. - Vol. 140, № 3. -P. 1015-1019.

182. Kammerer H. Bakterien und Blutabstoss // Arch. Exper. Path. Pharmac.-1920.- Bd. 88.- S. 247.

183. Kaper J.B, Bradford H.B., Roberts N.C., Falkow S. et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae in the United States Gulf Coast // J. Clin. Microbiol.- 1982.-Vol. 16, №1.- P. 129-134.

184. Kaper J.B. Molecular approaches to the study of infectious diseases // Mar. Technol. Soc. J.-1981.- Vol. 15, № 2.- P. 41-44.

185. Karaolis D.K.R., Johnson J.A., Bailey C.C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.- Vol. 95, № 6,- P. 3134-3139.

186. Karaolis D.K.R., Lan R., Reeves P.R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-Ol Vibrio cholerae//J. Bacteriol.- 1995.-Vol. 177, № 11,- P. 3191-3198.

187. Karaolis D.K.R., Somara S., Maneval D.R. et al. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria // Nature." 1999.- Vol. 399, № 6734.- P. 375-379.

188. Kemper M., Doyle R.J. Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol. 87th Annu. Meet., At lanta, Ga, 1-6 March, 1987. - Washington, D.C., 1987. - P. 220.

189. Kemper M., Weissman С., Askanazi J. et al. Metabolic and respiratory changes during weaning from mechanical ventilation //Chest. 1987. - Vol. 92, N1. V* 6.-P. 979-983.

190. Kessel M., Klink F. Archaebacterial elongation factor is ADP-ribosylated by diphteria toxin // Nature. 1980. - Vol. 287, № 5779. - P. 250-251.

191. Keusch G.T. Donohue-Rolfe A., Jacewicz M. Microbial lectins and agglutinins / Ed. D. Mirelman N.Y.: J. Wiley, 1986. P. 271-296.

192. Kimura M., Sumizawa Т., Funatsu G. // Biosci. Biotechnol. Biochem. -1993. Vol. 57. № l.P. 166-169.

193. Kimura M., Sumizawa Т., Funatsu G. The complete amino acid sequences of the B-chains of abrin-a and abrin-b, toxic proteins from the seeds of Abrus preca-torius // Biosci Biotechnol Biochem. 1993. - Vol. 57, N1. - P. - 166-169.

194. Koch R. In: Conferenz zur Erorterung der Cholerafrage // Dtsch. med. Wschr.- 1884.- Bd. 10,- S. 499, 519.

195. Krasilnikov O.V., Muratkhodjaev J.N., Zitzer A.O. The mode of action of Vibrio cholerae cytolysin. The influences on both erythrocytes and planar lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta - 1992. - Vol. 1111, № 1. - P. 7-16.

196. Kraus R. Zur Differenzierung des Choleravibrio von artverwandten if Vibrionen // Wien. klin. Wschr. 1903. - Bd. 16. - S. 1382.

197. Kraus R., Pribram E. Uber Choleravibrionen und andere pathogenen Vibrionen. 1. Uber die Beziehungen der Vibrionen El Tor zu dem Choleravibrio // Zbl. Bakt., Abt. 1. Orig. - 1906. - Bd. 41, № 15. - S. 155.

198. Kriipe M. Blutgruppespezifische pflanzliche Eiweiskorper (Phytoagglutini-ne).- V. Enke, Stuttgart, 1956. 131 S.

199. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4 // Nature (London). 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

200. Lakhtin V.M. Lectins: Biology, Biochemistry, and Clinical Biochemistry V.7 / Eds. J. Kocourek, D. Freed. St. Luis: Sigma Cem. Co. (USA). - 1990. - P. 417-426.

201. Lee J.H., Ahn S.H., Kim S.H. et al. Characterization of Vibrio mimicus phospholipase A (PhlA) and cytotoxicity on fish cell // Biochem Biophys Res Commun. 2002. - Vol. 298, №2. - P. 269-276.

202. Levine M.M., Kaper J.B., Herrington D. et al. Volunteer studies of deletion mutants of Vibrio cholerae 01 prepared by recombinant techniques // Infect. Immun. -1988. -Vol. 56, №1.- P. 161-167.

203. Loghem J.J. Van Un vibrion ElTor pathogene isole aux Indes Neerlandaises. // Bull. Off. Int. Hyg. Publ.- 1938.- T. 30, № 8.- P. 1520-1523.ft

204. Loghem J.J. van Unterschied zwischen Hamolyse und Hamodigestion auf der Blutagarplatte. Ill Mitteilung zur El Tor Frage // Zbl. Bak. I Abt. Orig.-1913.-Bd. 70.-S. 70-74.

205. Loghem J.J. van. Der El Tor Vibrio // Z. Hyg. Infekt. Kr.- 1932.- Bd. 114.-S. 20.

206. Loghem J.J. van. Uber den Unterschied zwischen El Tor und Cholera -Vibrionen // Zbl. Bak. I Abt. Orig.-1911,- Bd. 57- S. 289.

207. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement Ц with the folin phenol reagent//J. Biol. Chem.-1951.-Vol. 193,№ 1.-P265-275.

208. Makela O. Studies in hemagglutinins of leguminose seeds // Ann. Med. Exp. Biol. Fenniae. 1957. - Vol. 35, Suppl. 11. - 53 p.

209. Manning P.A., Brown M.H., Heusenroeder M.W. Cloning of the structural gene (hly) for the hemolysin of Vibrio cholerae El Tor strain 07 // Gene.- 1984.-Vol. 31, № 1-3.-P. 225-231.

210. Marxen M., Maienschein V., Volknandt W. et al. Immunocytochemical lo-^ calization of synaptic proteins at vesicular organelles in PC 12 cells // Neurochem.

211. Res. 1997. Vol. - 22, № 8. - P. 941-950.

212. McCardell B.A., Kothary M.H., Madden J.M. Two-step purification and partial characterization of a variant of the Vibrio cholerae non 01 hemolysin // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol. 180. № 2. - P. 177-182.

213. McCardell B.A., Madden I.M., Shah D.B. Isolation and characterization of a cytolysin produced by Vibrio cholerae serogroup non 01 // Canad. J. Microbiol. -1985.-Vol. 31, № 8. P. 711-720.

214. Mechow S., Vaidya A.B., Bramucci M.G. Mapping of a gene that regulates hemolysin production in Vibrio cholerae // J. Bacterid.- 1985.- Vol. 163, № 2.- P. 799-802.

215. Mekalanos J.J., Swartz D.J., Pearson Y.D. et al. Cholera toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development // Nature.-1983,- Vol. 306, № 5943. P. 551-557.

216. Mekalanos J.J., Waldor M.K., Rubin E.Y. Cholera: Molecular basis for emergence and pathogenesis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997. -Vol. 18, №4.-P. 241-248.

217. Mercurio A., Manning P.A. Cellular localization and export of soluble hemolysin of Vibrio cholerae eltor // Mol. Gen. Genet. 1985. - V. 200, № 3. - P. 472-475.

218. Montal M.S., Blewit R., Tomich J.M., Montal M. Identification of an ion channtl-forming motif in the primary structure of tetanus and botulinum neurotoxin //FEBS Lett. 1992.-Vol. 313, № l.-P. 12-18.

219. Moschioni M., Tombola F., de Bernard M., Coelho A., Zitzer A., Zoratti M., Montecucco C. The Vibrio cholerae haemolysin anion channel is required for cell vacuolation and death // Cell Microbiol. 2002. Vol. 4№ 7. - P. 397-409.

220. Mukerjee S. Characterization of the cholera typing phages. II. Thermal death points // Ann. Biochem. Exp. Med. 1961. - Vol. 21, № 9. - P. 265-266.

221. Ogierman M.A., Fallarino A., Riess T. et al. Characterization of the Vibrio cholerae eltor lipase operon lip AB and a protease gene down-stream of the hly region // J. Bacterid. 1997. - Vol. 179, № 22. - P. 7072-7080.

222. Olsnes S., Sandvig K. Receptor Mediated binding and internalization of toxins and hormones. - New York, 1981. - P. 81-94.

223. Olson R., Gouaux E. Vibrio cholerae cytolysin is composed of an alpha-hemolysin-like core // Protein Sci. 2003. - Vol. 12, № 2. - P. 379-383.

224. Ozaki M., Higashi Y., Saito H. et al. Identity of megacine A with phospoli-pase A. // Biken Journal. 1966. - Vol. 9, № 3. - P. 201-213.

225. Pal S., Datta A., Mallick R. et al. Electrophoretic mobility and immune response of outer membrane proteins of Vibrio cholerae 0139 // FEMS Immunol. Med. Microbiol.- 1996.-Vol. 15, №2-3.-P. 143-148.

226. Politzer R. Cholerae. Monograph Series, N43. - WHO, Geneva, 1959.

227. Ponniah S., Endres R.O., Hasty D.L., Abraham S.N. Fragmentation of Escherichia coli type 1 fimbriae exposes cryptic D-mannose-binding sites // J. Bacterid. -1991. Vol. 173, № 13. - P. 4195-4202.

228. Prabhakar H., Lai M., Kaur H. Outbreak of gastroenteritis due to a new strain of поп О group-1 Vibrio cholerae, in Ludhiana in May August 1993. // Indian. J. Med. Res.- 1994.- Vol. 99, № 3.- P. 107-108.

229. Ramamurthy Т., Garg S., Sharma R. et al. Emergence of novel strains of Vibrio cholerae with epidemic potential in Southern and Eastern India // Lancet.- 1993.- Vol. 341, № 8846.- P. 703-704.

230. Rice M.S. Dahlquist F.W. Sites of deamidation and methylation in Tsr, a bacterial chemotaxis sensory transducer // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 226, N15. -P. 9746-9753.

231. Ray A., Chattopadhyay K., Banerjee K.K., Biswas T. Macrophage distinguishes Vibrio cholerae hemolysin from its protease insensitive oligomer by time dependent and selective expression of CD80-CD86 // Immunol Lett. 2003. - Vol. 89, №2-3.-P. 143-147.

232. Richardson К., Michalski J., Kaper J. Hemolysin production and cloning of two hemolysin determinants from classical Vibrio cholerae // Infect. Immun.-1986.- Vol. 54, № 2. P. 415-420.

233. Roy C., Mukerjee S., Tanamal S. Haemolytic and nonhaemolytic El Tor vibrios // Ann. Biochem. Exp. Med. 1963. - Vol. 23, № 12. - P. 553-558.

234. Samadi A.R., Hyq M.I., Shahid N. et al. Classical Vibrio cholerae biotype displaces El tor in Bangladesh // Lancet. 1983. - Vol. 341, № 8328. - P. 805-807.

235. Sasmal D., Guhathakurta В., Bhattacharya S.K. et al. N-acetyl-D-glucosamine specific hemagglutinin receptor of Vibrio cholerae 01 in chicken erythrocyte membranes // FEMS Immunol. Med. Microbiol.-2002-Vol. 32,№3.-P. 187-189.

236. Sen R., Shrivastava D.L. A note on designating strains as Vibrio cholerae biotype El Tor // Indian. J. Med Rec.-1970.- Vol. 58, № 2. P. 174-178.

237. Saha N., Baneijee K.K. Carbohydrate-mediated regulation of interaction of Vibrio colerae hemolysin with erithrocyte and phospholipid vesicle // J. Biol. Chem. -1997.-Vol. 272, №1.-P. 162-167.

238. Shahid N.S., Samadi A.R., Khan M.U. et al. Classical Vibrio eltor : a prospective family study of a concurrent cholera outbreak // J. Diarrh. Dis. Res.- 1984,- Vol. 2.- P. 73-78.

239. Sharon N., Ofek I. // Microbiol Lectins and Agglutinins / Ed. D. Mirelman -N.Y.: J. Wiley, 1986. P. 55-81.

240. Shimada Т., Nair G.B., Deb B.C. et al. Outbreak of Vibrio cholerae non 01 in India and Bangladesh //Lancet. 1993. - Vol. 341, № 8856.- P. 1346-1347.

241. Shottmiiller H. Zur Aetiologie der akuten Gastroenteritis // Munch, med. Wochr.- 1904.- Bd. 51.- S. 294.

242. Simpson D., Thorne D., Loh H. Lectins: endogenous carbohydrate-binding proteins from vertebrates tissues. Functional role in recongnition processes // Life Sci. 1978. - Vol. 22, № 9. p. 727-748.

243. Singh D.V., Matte M.H., Matte G.R., et al. Molecular analysis of Vibrio cholerae 01, 0139, non 01 and non 0139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates // Appl. Environ. Microbiol.- 2001.1. Vol. 67, №2.-P. 910-921.

244. Smith H.W., Halls S. The transmissible nature of the genetic factor in Escherichia coli that controls enterotoxin production // J. Gen. Microbiol. -1968.-Vol. 52, №3.-P. 319-334.

245. Smith S., Martin F. The El Tor and Celebes vibrios. Vibrio comma and asiatic cholera // Zinsser's Textbook of Bacteriol. 1948. - P. 504-505.

246. Snapper I. De ontleding van bloed en bloedkleurstof door cholera El Tor -* vibrionen // Ned. T. Geneesk. -1918.- Bd 62.- S. 848.

247. Stevenson G., Leavesley D.I., Lagnado C.A. et al. Purification of the 25 kDa Vibrio cholerae major outer membrane protein and the molecular cloning of its gene: omp V // Eur. J. Biochem.- 1985.- Vol. 148.- P. 385-390.

248. Stewart R.C., Dahlquist F.W. Molecular components of bacterial chemotaxis // Chem. Rev. 1987. - Vol. 87. - P. 997-1025.

249. Stilmark H. Ricin, ein qiftiges Ferment aus dem Samen von Ricinus communis und einiqen anderen Euphceaen. Inaug. Dissertation. Dorpat, 1888.

250. Tacket C.O., Losonsky G., Natar J.P. et al. Initial clinical studies of CVD 112 Vibrio cholerae 0139 live oral vaccine: safety and efficacy against experimental challenge // J. Infect. Dis. 1995. Vol. 172, №3-P. 883-886.

251. Towbin H., Stachelin Т., Gordon J. electroforetic transfer of proteins frompoliacrilamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications // Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76, № 9. - P. 4350-4354.

252. Townsend R.R. The Pharmacology and Toxicology of Proteins / Eds. J.S. Holcenberg, J.L. Winkelhake. N. Y.: Alan R. Liss, 1987. - P. 41-57.

253. Valeva A., Walev J., Weis S. et al. Cellular metlloprotein activates Vibrio cholerae procytolysin // J. Biochem. 2004. - Vol. 279, №24. - P. 251143-25148.

254. Wake A., Yamamoto M. Hemolysin destructive factor of Vibrio cholerae (Vibrio comma) // J. Bacteriol. - 1966. - Vol. 91, № 1. - P. 461-462.

255. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage en coding cholera toxin// Science.- 1996.- Vol. 272, № 5270.- P. 1910-1914.

256. Waldor M.K., Mekalanos J.J., Kimsey H. Regulation, replication and integration functions of the Vibrio cholerae CTX phi are encoded by region RS 2 // Mol. Microbiol.- 1997.- Vol. 24, № 5,- P. 917-926.

257. Ward H.M., Manning P.A. Mapping of chromosomal loci associated with lipopolysaccharide synthesis and serotype specificity in Vibrio cholerae 01 by transposon mutagenesis using Tn 5 and Tn 2680 // Mol. Gen. Genet. 1989.- Vol. 218,№2.-P. 367-370.

258. Watanabe Y., Seaman G.R Purification and properties of the hemolysin from El Tor Vibrio // Arch. Bioch. Bioh. -1962. Vol. 97, № 2 - P. 393-398.

259. Watanabe Y., Verwey W.F. The biological characterization of the ha'emolysin from the El Tor variety of Vibrio cholerae // J. Inf. Dis.-1966. Vol. 116, № 3. -P. 363371.

260. Williams S.G., Attridge S.R., Manning P.A. The transcriptional activator HlyU of Vibrio cholerae: nucleotide sequence and role in virulence gene expression // Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 9, № 4. - P. 751-760.

261. Williams S.G., Manning P.A. Transcription of the Vibrio cholerae haemoly-sin gene, hlyA, and cloning of a positive regulatory locus, hlyU // Mol. Microbial-1991.- Vol. 5, № 8.- P. 2031 -2038.

262. Yamamoto K., Honda T. Activation and processing of Vibrio cholerae cytolysin //Jap. J. Bacteriol. 1989. - Vol. 44, № 1. -P 199.

263. Yamamoto К., Ichinose Y., Nakasone N. et al. Identity of hemolysins produced by Vibrio cholerae non 01 and V. cholerae 01 biotype El Tor // Infect. Immun. -1986. -Vol. 51, №3.- P. 927-931.

264. Zhang D., Takahashi J., Seno T. et al. Analysis of receptor for Vibrio chol-erae Eltor hemolysin with a monoclonal antibody that recognizes glycophorin В of human erythrocyte membrane // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, № 10.-P. 5332-5337.

265. Zimmerman E. Weitere Beobachtungen uber die Haemolysine der Vibrionen // Z. Immunnitatsforsch. 1934. - Bd. 82. - S. 495-505.

266. Zitzer A., Palmer M., Weller U. et al. Mode of primary binding to target membranes and pore formation induced by Vibrio cholerae cytolysin (hemolysin) // Eur.J. Biochem. 1997. - Vol. 247, № 1. - P. 209-216.

267. Zitzer A., Wassenaar T.M., Walev I., Bhakdi S. Potent membrane per-meabilizing and cytocidal action of Vibrio cholerae cytolysin on human intestinal cells. // Infect. Immun. - 1997. - Vol. 65, № 4. - P. 1293-1298.

268. Zitzer A., Zitzer O., Bhakdi S., Palmer M. Oligomerization of Vibrio Ь cholerae cytolysin yields a pentameric pore and has a dual specificity for cholesterol and sphingolipids in the target membrane //J. Biol. Chem. 1999. - Vol.274, №3,-P. 1375-1380.