Механизмы взаимодействия гипохлорита и гипохлорит-образующих систем с органическими гидропероксидами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Чеканов, Андрей Васильевич

• Чеканов, Андрей Васильевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чеканов, Андрей Васильевич

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Пути появления гипохлорита в организме

1.2. Физико-химические свойства хлорноватистой кислоты и гипохлорита

1.3. Свободнорадикальные реакции гипохлорита

1.4. Гипохлорит - индуцированное ПОЛ

1.5. Пути образования гидропероксидов в организме

1.5.1. Перекисное окисление липидов

1.5.2. Синглетный кислород

1.5.3. Озонолиз

1.5.4. Катализ липоксигеназой

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Используемые реагенты

2.2. Объекты исследования

• Приготовление эмульсии жирной кислоты

• Получение гидропероксида линолевой кислоты

• Изолирование липопротеинов низкой плотности из крови человека

• Изолирование нейтрофилов из крови человека

2.3. Методы исследования

2.3.1. Хемилюминесценция

• Изучение реакции гипохлорита с /яре/и-бутилгидропероксидом

• Исследование реакции гипохлорита с линолевой кислотой

• Измерение спектров хемилюминесценции

2.3.2. ЭПР спиновых ловушек

• Исследование реакции гипохлорита с треяг-бутилгидропероксидом

• Изучение реакции гипохлорита с линолевой кислотой и ее гидропероксидом

• Образование свободных радикалов при миелопероксидазном катализе

• Образование свободных радикалов активированными нейтрофилами

2.3.3. Спектрофотометрическое определение концентрации диеновых конъюгатов

2.3.4. Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение реакции гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом

• Исследование методом хемилюминесценции

• Исследование методом спиновых ловушек

3.2. Исследование реакции гипохлорита с гидропероксидом линолевой кислоты

3.3. Образование свободнорадикальных интермедиатов при миелопероксидазном катализе в присутствии ирет-бутилгидропероксида

3.4. Образование свободных радикалов активированными нейтрофилами в присутствии трет-бутилгидропероксида

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы взаимодействия гипохлорита и гипохлорит-образующих систем с органическими гидропероксидами»

При активации нейтрофилов и моноцитов во внеклеточную среду секретируется фермент - миелопероксидаза (МПО; донор: НгОг-оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.7), который, используя в качестве субстрата пероксид водорода, катализирует двухэлектронное окисление хлорида до хлорноватистой кислоты (НОС1, ионизированная форма - гипохлорит, ОСГ) по реакции:

Н2О2 + н+ + С1 -> Н20 + НОС1

Именно НОС1/ОСГ принадлежит основная антимикробная, бактерицидная и детоксицирующая функция, которые выполняют нейтрофилы в организме [75]. НОС1/ОСГ - сильный окислитель и хлорирующий агент, вступает в реакцию со многими биологически активными соединениями: нуклеиновыми кислотами [166], углеводами [164], аминокислотами [7], белками [32]. Ранее были исследованы также его реакции с липидами. Оказалось, что НОС1/ОСГ реагирует с ненасыщенными липидами по двум основным механизмам. Первый - молекулярный. По этому механизму в результате присоединения НОС1 по двойной связи в качестве основных продуктов образуются изомеры хлоргидринов, а также их кислород- и хлорсодержащие метаболиты [24,38,165,170,193]. Помимо этого было обнаружено образование лизофосфолипидов [24,38]. Второй механизм - свободнорадикальный, характеризуется аккумуляцией известных продуктов перокисидации липидов: гидропероксидов, диеновых конъюгатов, карбонилов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой, а также флюоресцирующих продуктов, являющихся результатом реакции окисленных липидов с белком [10,14-24,127,129-137,170]. Последнее обстоятельство заслуживает особого внимания, поскольку известно, что свободнорадикальные реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) играют важную роль в развитии целого ряда патологических процессов, таких как воспаления, артриты, лучевая болезнь, атеросклероз и др. [3,75].

Как любая свободнорадикальная цепная реакция гипохлорит-индуцированное ПОЛ имеет стадию инициирования. Согласно одной из гипотез [127,131-136], на роль стадии инициирования в этом случае может претендовать реакция НОС1/ОСГ с органическими гидропероксидами, которые всегда присутствуют in vivo в некотором количестве в составе ненасыщенного липида [147]. В пользу этого предположения указывает ряд имеющихся в настоящее время экспериментальных фактов: • гипохлорит реагирует с гидропероксидной группой, но не с диалкил-, алкил-ацилпероксидами или эпоксидами, причем стехиометрическое соотношение реакции превышает 1 [132];

• в указанной реакции не образуется синглетный кислород [17,132], как это установлено для реакции гипохлорита с пероксидом водорода [101]:

НОС1 + Н2О2 -> 'Ог + СГ + Н+ + Н20;

• реакция гипохлорита с гидропероксидом сопровождается хемилюминесценцией [133], что свойственно свободнорадикальным реакциям [3];

• присутствие гидропероксидов приводит к дополнительной аккумуляции продуктов ПОЛ в фосфолипидных липосомах, инкубируемых с гипохлоритом или в системе МПО+Н2О2+СГ, катализирующей образование гипохлорита [127,133];

• аккумуляция продуктов ПОЛ при действии гипохлорита на фосфолипидные липосомы, содержащие гидропероксиды, подавляется известными перехватчиками свободных радикалов [127,133];

• основным молекулярным продуктом реакции гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом является ди-тярет-бутилпероксид, образование которого можно объяснить лишь исходя из предположения о возникновении свободных радикалов в ходе указанной реакции [132,17].

Все эти данные хоть косвенно, но свидетельствуют в пользу того, что реакция гипохлорита с гидропероксидной группой протекает с образованием свободнорадикальных интермедиатов, наиболее вероятными из которых следует признать алкоксильный или пероксильный радикалы.

Однако до начала данной работы в литературе отсутствовали сведения о регистрации прямыми методами свободных радикалов, образующихся в реакции гипохлорита с гидропероксидами. Между тем, можно полагать, что знание механизма указанной реакции, с одной стороны, позволит пролить свет на развитие ранних стадий многих заболеваний, сопровождающихся активацией фагоцитов, а с другой - даст возможность оптимизировать применение гипохлорита в клинической практике в качестве детоксицирующего средства.

Цели работы: изучить механизм реакции гипохлорита и гипохлорит-образующих систем (миелопероксидаза, активированные нейтрофилы) с органическими гидропероксидами; попытаться зарегистрировать и идентифицировать свободнорадикальные интермедиаты, образующиеся в ходе указанных реакций.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Используя методы хемилюминесценции n ЭПР спиновых ловушек попытаться зарегистрировать и идентифицировать свободные радикалы, образующиеся при взаимодействии гипохлорита с юретя-бутилгидропероксидом.

2. Методами хемилюминесценции и ЭПР спиновых ловушек изучить закономерности реакции гипохлорита с гидропероксидом линолевой кислоты.

3. Методом ЭПР спиновых ловушек исследовать свободнорадикальные интермедиаты, образующиеся в ходе инкубации гидропероксида в присутствии систем, продуцирующих гипохлорит: МПО+Н2О2+СГ и активированные нейтрофилы крови человека.

4. Путем ингибиторного анализа с использованием ловушек гипохлорита, перехватчиков свободных радикалов и ингибиторов МПО выяснить роль МПО и гипохлорита, образующегося в результате МПО-катализа, в разрушении гидропероксидной группы в присутствии изолированной МПО или активированных нейтрофилов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Чеканов, Андрей Васильевич

5. ВЫВОДЫ

1. Методом хемилюминесценции показано, что реакция гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом сопровождается интенсивным свечением в области 410550 нм аналогично тому, как это происходит в случае известной реакции Се4+ с гидропероксидом, в ходе которой образуются пероксильные радикалы.

2. Используя спиновые ловушки ФБН и 4-ПОБН в реакции гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом зарегистрированы два спиновых аддукта, один из которых обусловлен прямым взаимодействием гипохлорита со спиновыми ловушками, а второй - радикалом, образующимся в ходе реакции гипохлорита с ятретя-бутилгидропероксидом.

3. Проведено сравнение спектральных параметров спинового аддукта радикала, образующегося в реакции гипохлорита с /яретя-бутилгидропероксидом, с параметрами спиновых аддуктов /ярт-бутоксильного и трет-бутилпероксильного радикалов, которые образуются в известных реакциях тре/я-бутилгидропероксида с Fe2+ и Се4+ соответственно. Установлено, что в реакции гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом образуется радикал пероксильной природы.

4. Методом хемилюминесценции и ЭПР спиновых ловушек показано, что в реакции гипохлорита с гидропероксидом линолевой кислоты возникают свободнорадикальные интермедиаты. Анализ спектров ЭПР спиновых аддуктов, образующихся в присутствии ловушки 4-ПОБН, показал, что, по крайней мере, один из радикалов является О-центрированным.

5. Миелопероксидаза в присутствии своих субстратов (Н2О2 и СГ), спиновой ловушки 4-ПОБН и дгре/я-бутилгидропероксида образует аддукты 2-х О-центрированных радикалов: пероксильного и алкоксильного с константами сверхтонкого расщепления арн=0,230 мТ; aN=l,500 мТ, ДНрр=0,042 мТ и арН=0,289 мТ; aN=l,640 мТ, ДНрр=0,068 мТ соответственно. Образование обоих радикалов обусловлено функционированием МПО и наблюдается только в присутствии гидропероксида.

6. Активированные зимозаном нейтрофилы крови человека в присутствии трет-бутилгидропероксида продуцируют аддукты 2-х радикалов, с константами сверхтонкого расщепления: арН=0,234 мТ; aN= 1,493 мТ, AHPP=0,067 мТ и арН=0,286 мТ; aN=l,628 мТ, ДНрр=0,092 мТ. Первый идентифицирован как трет-бутоксильный ((СНз)зСО*), второй - юрети-бутилпероксильный ((СНз)3СОО*).

7. Ингибиторный анализ, проведенный с использованием ловушек гипохлорита (таурин и метионин), перехватчиков свободных радикалов (ВНТ и маннитол) и ингибиторов МПО (гидразин 4-аминобензойной кислоты и салицилгидроксамовая кислота) показал, что разрушение гидропероксидной группы в присутствии изолированной МПО или активированных нейтрофилов, происходящее с образованием пероксильных и алкоксильных радикалов, обусловлено непосредственно работой фермента МПО. Однако лишь часть радикальных интермедиатов возникает в результате функционирования цикла хлорирования МПО, то есть через образование гипохлорита. Другая же часть образуется независимо от гипохлорита, во всей видимости с участием пероксидазного цикла МПО.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что ПОЛ играет важную роль в развитии целого ряда патологических процессов: воспаления, артриты, лучевая болезнь, атеросклероз и др. [3,4,12,39,75]. Важной причиной активации свободнорадикальных реакций in vivo являются так называемые активные формы кислорода, которые образуются при активации фагоцитов, сопровождающейся «кислородным взрывом». В ходе этих биохимических процессов нейтрофилы (в меньшей степени моноциты) секретируют во внеклеточную среду фермент - миелопероксидазу, который, используя в качестве субстрата пероксид водорода, способен катализировать двухэлектронное окисление хлорида до хлорноватистой кислоты (НОС1, ионизированная форма - гипохлорит, ОСГ) по реакции (1) [67,76,108,191].

В результате многочисленных исследований, в том числе проведенных и в нашей лаборатории, различными методами было показано, что гипохлорит индуцирует в ненасыщенном липиде свободнорадикальные реакции ПОЛ с образованием традиционных продуктов, регистрируемых в липидном материале при всех других способах инициирования ПОЛ [14,17-25,128-134,137]. Как осуществляется гипохлорит-индуцированное ПОЛ?

Многие исследователи неоднократно демонстрировали, что гипохлорит реагирует с ненасыщенными связями свободных жирных кислот, равно как и с жирнокислотными цепями в составе липидов. Основными продуктами были изомеры хлоргидринов, образующиеся в результате электрофильного присоединения молекулы хлорноватистой кислоты по двойной связи согласно уравнению (19). Однако в ходе этой реакции не образуются соединения или интермедиаты, которые могли бы инициировать свободнорадикальные реакции. Каким образом осуществляется стадия инициирования гипохлорит-индуцированного ПОЛ?

В ранее проведенных экспериментах было показано, что гипохлорит реагирует с гидропероксидной группой (но не с другими пероксидами), которая всегда присутствует в виде примеси в ненасыщенном липиде в результате его автоокисления. Примечательно, что стехиометрическое соотношение реакции превышает 1 [20,131]. В указанной реакции не образуется синглетный кислород [17,132], как это установлено для реакции (17) гипохлорита с пероксидом водорода [101]. Реакция гипохлорита с гидропероксидом сопровождается хемилюминесценцией [131-133], что свойственно свободнорадикальным реакциям [3]. Присутствие гидропероксидов приводит к дополнительной аккумуляции продуктов ПОЛ в фосфолипидных липосомах, инкубируемых с гипохлоритом или в системе МПО+Н2О2+СГ, катализирующей образование гипохлорита [17,127,131,133]. Аккумуляция продуктов ПОЛ при действии гипохлорита на фосфолипидные липосомы, содержащие гидропероксиды, подавляется известными перехватчиками свободных радикалов [17,127,133]. Наконец, основным молекулярным продуктом реакции гипохлорита с /яре/я-бутилгидропероксидом ((СНз)зСООН) является ди-п?/?е/и-бутилпероксид ((СНз)зСООС(СНз)з), образование которого можно объяснить лишь исходя из предположения о возникновении свободных радикалов в ходе указанной реакции [17,131,132]. Все эти результаты весьма убедительно свидетельствуют в пользу того, что в реакции гипохлорита с гидропероксидом может образовываться инициатор ПОЛ.

С целью выяснения данного вопроса мы использовали два независимых метода: хемилюминесценцию и метод ЭПР спиновых ловушек, позволяющие изучать закономерности радикальных реакций и идентифицировать свободнорадикальные интермедиаты, образующиеся в ходе этих реакций.

В исследовании использовали 4 модельные системы возрастающей сложности и приближающиеся к условиям in vivo:

1. Образование свободных радикалов в реакции гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом. Это самая простая физико-химическая система. Реакция протекает в гомогенной среде (в растворе). В качестве модели органического гидропероксида использован тре/я-бутилгидропероксид.

2. Образование свободных радикалов в реакции гипохлорита с гидропероксидом линолевой кислоты в гетерогенной системе. В этой системе использован гидропероксид жирнокислотной цепи, реально встречающийся in vivo.

3. Образование свободных радикалов при разрушении гидропероксидной группы в системе МПО+Н2О2+СГ, продуцирующей гипохлорит. Здесь мы использовали не гипохлорит, как реагент, а фермент - миелопероксидазу вместе с ее субстратами. Именно этот фермент, содержащийся в нейтрофилах и моноцитах, катализирует образование гипохлорита in vivo.

4. Образование свободных радикалов при разрушении гидропероксидной группы в присутствии активированных нейтрофилов, секретирующих во внеклеточную среду МПО. Эта система максимально приближена к естественным условиям. Нейтрофилы при активации продуцируют пероксид водорода и секретируют во внеклеточную среду, содержащую хлорид, МПО. Создаются все условия для образования гипохлорита, который может реагировать с гидроперокеидной группой, разрушая ее с образованием свободных радикалов.

Используя первую, самую простую модельную систему, мы методом хемилюминесценции изучали природу радикалов, образующихся при действии НОС1/ОСГ на тре/я-бутилгидропероксид, (СНз)зСООН. Было показано, что добавление НОС1/ОСГ в раствор (СНз)зСООН сопровождается вспышкой хемилюминесценции, интенсивность которой возрастает с увеличением концентрации НОС1/ОСГ при постоянной концентрации (СНз)зСООН, равно как и с ростом концентрации (СНз)зСООН при постоянной концентрации НОС1/ОСГ. Добавление в реакционную среду ловушек свободных радикалов приводило к тушению хемилюминесценции, свидетельствуя об образовании свободнорадикальных интермедиатов в ходе изучаемой реакции. Все закономерности, обнаруженные при исследовании методом хемилюминесценции реакции гипохлорита с (СНз)зСООН, включая и зарегистрированный с помощью граничных светофильтров спектр хемилюминесценции, качественно совпадали с таковыми для известной реакции (СНз)зСООН с Се4+, в ходе которой образуется пероксильный радикал (СНз)зСОО* (см. реакцию 23). В противоположность этому, реакция (СНз)зСООН с Fe , в которой образуется алкоксильный радикал (СНз)зСО* (см. реакцию 22), во всем исследованном диапазоне концентраций реагентов сопровождалась едва заметной хемилюминесценцией. Эти результаты позволяют полагать, что в реакции гипохлорита с /ирею-бутилгидропероксидом образуются свободные радикалы пероксильной природы.

Для того чтобы идентифицировать радикалы, образующиеся в исследованной реакции гипохлорита с (СНз)зСООН, мы применили прямой метод регистрации свободных радикалов - метод ЭПР спиновых ловушек, в качестве которых были использованы N-тргт-бутил-а-фенилнитрон (ФБН) и а-(4-пиридил-1 -OKcnn)-N-трет-бутилнитрон (4-ПОБН). При добавлении гипохлорита к (СНз)зСООН в присутствии ловушки мы регистрировали спектр ЭПР, представляющий собой суперпозицию двух сигналов. Один из сигналов принадлежит спиновому аддукту, образующемуся в результате прямого взаимодействия гипохлорита с ловушкой (константы сверхтонкого расщепления: аРн=0,148 мТл; аы=1,537 мТл; ДНрр=0,042 мТл и аРн=0,190 мТл; aN=l,558 мТл; ДНрр=0,074 мТл в случае 4-ПОБН и ФБН соответственно). Другой аддукт образуется в результате взаимодействия гипохлорита с (СНз)зСООН (константы сверхтонкого расщепления: арц=0,233 мТл; аы=1,484 мТл; АНрр=0,063 мТл и аРн=0,360 мТл; aN=l,547 мТл; ДНрр=0,063 мТл в случае 4-ПОБН и ФБН соответственно). При сравнении спектральных параметров этого спинового аддукта с таковыми для аддуктов wpem-бутоксильного или т/?еди-бутилпероксильного радикалов, образующихся в известных реакциях (СНз)зСООН с Fe2+ и Се4+ соответственно, было установлено, что в реакции гипохлорита с (СНз)зСООН образуется радикал (СНз)зСОО*.

Таким образом, совместное использование методов хемилюминесценции и ЭПР спиновых ловушек позволило нам установить, что при взаимодействии гипохлорита с /ирет-бутилгидропероксидом в качестве короткоживущего радикала образуется радикал пероксильной природы, а именно шре/л-бутилпероксильный радикал, (СНз)зСОО*.

Далее мы усложнили систему и одновременно приблизили ее к естественным условиям, используя в качестве органического пероксида гидропероксид линолевой кислоты. Гипохлорит добавляли в суспензию линолевой кислоты в присутствии фермента липоксигеназы и регистрировали вспышку хемилюминесценции. В качестве активатора хемилюминесценции использовали кумарин С-525. Известно, что этот активатор увеличивает вспышку хемилюминесценции процессов, протекающих в гидрофобной фазе с участием пероксильных радикалов [156-158,185]. Проведенные нами контрольные эксперименты, во-первых, подтвердили тот факт, что для интенсивной активации хемилюминесценции кумарином С-525 необходимо присутствие гидрофобной фазы, во-вторых, позволили заключить, что интенсивность вспышки хемилюминесценции возрастает с увеличением концентрации гидропероксидных групп в гетерогенной системе.

Нами было показано, что введение гипохлорита в смесь линолевой кислоты с липоксигеназой, в которой происходит наработка гидропероксида, сопровождается вспышкой хемилюминесценции. Причем, интенсивность этой вспышки линейно коррелировала с содержанием гидропероксидов в системе (коэффициент корреляции R2=0,88). Тот факт, что вспышка хемилюминесценции сильно увеличивалась в присутствии кумарина С-525, свидетельствует об образовании в исследованной смеси радикалов пероксильной природы.

Исследования, проведенные методом спиновых ловушек подтвердили, что при взаимодействии гипохлорита с гидропероксидом линолевой кислоты образуются свободнорадикальные интермедиаты. Анализ спектров ЭПР спиновых аддуктов, образующихся в присутствии ловушки 4-ПОБН, показал, что, по крайней мере, один из радикалов является О-центрированным.

В дальнейших экспериментах мы гипохлорит заменили на системы, продуцирующие его в естественных условиях. Прежде всего, это фермент МПО с его субстратами: Н2О2 и СГ. При добавлении к этой системе трет-бутилгидропероксида в присутствии спиновой ловушки 4-ПОБН мы зафиксировали образование двух спиновых аддуктов. Сигнал первого аддукта характеризовался следующими спектральными параметрами: арН= 0,230 мТ; aN= 1,500 мТ, ДНрр= 0,042 мТ, которые близки к спектральным параметрам аддуктов, полученных нами при взаимодействии гипохлорита или церия с (СНз)зСООН (см. табл. 6), и идентифицированные как аддукты /ирет-бутилпероксильного радикала ((СНз)зСОО'). Вторая компонента имела следующие константы сверхтонкого расщепления: арН= 0,289 мТ; aN= 1,640 мТ, ДНрр= 0,068 мТ, которые близки к параметрам спиновых аддуктов, полученных нами при взаимодействии Fe с (СНз)зСООН (см. табл. 6). Вероятнее всего, это аддукт трет-бутоксильного радикала ((СНз)зСО').

Важным является тот факт, что в отсутствие МПО или пероксида водорода спиновые аддукты не регистрировались. Это значит, что образование свободных радикалов обоих типов обусловлено функционированием МПО. В отсутствие хлорида был зарегистрирован слабый сигнал ЭПР. Данный факт позволяет предположить, что часть свободных радикалов образуется через пероксидазный цикл, то есть в результате одноэлектронного окисления гидропероксида соединением I (см. схему на рис. 2). Эти результаты хорошо согласуются с данными авторов работы [69], которые продемонстировали, что органические гидропероксиды могут быть окислены до пероксильных радикалов соединением I по пероксидазному циклу. Однако в цитируемой работе отсутствовали какие-либо сведения о возможном образовании свободных радикалов при участии цикла хлорирования, то есть при действии образующегося гипохлорита на гидропероксидную группу.

Проведенный нами ингибиторый анализ показал:

1. Важная роль в распаде гидропероксидной группы под действием МПО принадлежит свободным радикалам, поскольку перехватчики радикалов - ВНТ и маннитол полностью предотвращали образование спиновых аддуктов.

2. Образование радикалов обусловлено функционированием МПО, поскольку в ее отсутствие или в присутствии ее ингибиторов (салицилгидроксамовая кислота или гидразид 4-аминобензойной кислоты) сигнал ЭПР спиновых аддуктов не регистрировался вовсе.

3. Наконец, таурин и метионин — перехватчики гипохлорита - в значительной мере препятствовали образованию спиновых аддуктов, однозначно свидетельствуя об участии гипохлорита, а значит и цикла хлорирования в образовании свободнорадикальных интермедиатов при добавлении гидропероксида к системе МП0+Н202+СГ.

Наконец, последняя серия экспериментов была проведена на суспензии нейтрофилов, изолированных из крови человека. Было показано, что при введении /яргтя-бутилгидропероксида в систему: 4-ПОБН + нейтрофилы + зимозан образуются аддукты 2-х О-центрированных радикалов, а именно: пероксильного с константами сверхтонкого расщепления: арН=0,234 мТ; aN=l,493 мТ, ДНрр=0,067 мТ и алкоксильного с параметрами: арН=0,286 мТ; aN=l,628 мТ, ДНрр=0,092 мТ. Присутствие зимозана в значительной мере увеличивает выход спиновых аддуктов, свидетельствуя о том, что активированные нейтрофилы интенсивнее разрушают гидропероксиды с образованием свободных радикалов.

Ловушка свободных радикалов (ВНТ), перехватчики гипохлорита (таурин и метионин), ингибиторы МПО (гидразин 4-аминобензойной кислоты и салицилгидроксамовую кислоту) значительно снижают интенсивность сигнала ЭПР спиновых аддуктов. Это значит, что разрушение гидропероксидной группы в присутствии нейтрофилов, происходящее с образованием пероксильных и алкоксильных радикалов, обусловлено непосредственно работой фермента МПО. Однако лишь часть радикальных интермедиатов возникает в результате функционирования цикла хлорирования МПО, то есть через образование гипохлорита. Другая же часть образуется независимо от гипохлорита, во всей видимости с участием пероксидазного цикла МПО.

Принимая во внимание результаты данной работы, участие гипохлорита в свободнорадикальной модификации природных белок-липидных комплексов можно представить при помощи схемы, изображенной на рис. 57. Стимуляция фагоцитов сопровождается активацией мембраносвязанного фермента - NADPH-оксидазы, который катализирует образование супероксидного анион-радикала (*02'). Последний спонтанно или же под действием другого фермента - супероксиддисмутазы дисмутирует до пероксида водорода (Н202). При активации фагоцитов во внеклеточную среду секретируется еще один фермент - миелопероксидаза, который, используя в качестве субстрата Н2О2 и СГ, катализирует образование гипохлорита. Каждая из упомянутых активных форм кислорода (Н2О2, *02\ НОС1) может в результате реакции (1), а также реакций [25-27]

HOCI + 'О/ -»*ОН + 02 + СГ;

НОС1 + Fe2+ -> 'ОН + Fe3+ + СГ явиться источником чрезвычайно реакционного гидроксильного радикала (*ОН). Этот радикал, отрывая атом водорода от ненасыщенного липида (L) , образует алкильный радикал (L*). Последний может являться инициатором свободнорадикальных реакций ПОЛ, а может и прореагировать с молекулой кислорода, образовав пероксильный радикал (LOO*), из которого в свою очередь и возникает гидропероксид (LOOH). Гидропероксид может быть восстановлен ионами Fe2+ до алкоксильного радикала (LO*), а может быть окислен гипохлоритом до пероксильного радикала. Оба радикала дают начало цепному свободнорадикальному перекисному окислению липидов. Таким образом, гипохлорит, превращая молекулу гидропероксида в свободный радикал (в данном случае пероксильный), подобно двухвалентному железу способен играть важную роль в интенсификации реакций перекисного окисления липидов на стадии разветвления цепей согласно схеме:

L*

LOO*

LH -> I LOOH + HOCI -» LOO* + H20 + СГ

L*

02-»i

LOO*

LH 1 -> LOOH + HOCI -> LOO* + н2о + СГ

L*

Ог-»^

LOO* I и т.д.

Здесь следует отметить, что гидропероксиды могут образовываться в организме не только в результате активации процессов ПОЛ. Известны и другие их источники: фотоиндуцированное окисление с участием синглетного кислорода, озонолиз, каталитическое окисление ненасыщенных жирнокислотных цепей различными липоксигеназами, например, окисление арахидоновой кислоты в лейкотриены.

Приведенная выше схема реакций, протекающих в живом организме, может иметь важные патофизиологические последствия. Оказалось что, гипохлорит способен проникать через клеточные мембраны [75,187], а также в липидную фазу липопротеинов крови [10]. Это приводит к деградации липидорастворимых антиоксидантов [134,136]; снижает резистентность липидной фазы к пероксидации [136]; увеличивает содержание первичных, вторичных и конечных продуктов окисления липидов [10,14,127,129-131,137,169]; нарушает проницаемость мембран для Са2+ [75]; уменьшает подвижность и увеличивает полярность ацильных цепей липидной фазы [135]; увеличивает микровязкость клеточных мембран [25,75]; модифицирует мембраносвязанные белки и ферменты [75,118], нарушает межклеточные взаимодействия [127].

В случае липопротеинов такая окислительная модификация нарушает их холестерин-транспортную функцию. Они лучше захватываются макрофагальными клетками, что приводит к аккумуляции холестерина в клетках и превращению их в так называемые пенистые клетки, дающие начало развитию атеросклеротического поражения сосудов [78,128,129,134].

Тем не менее, живой организм ищет возможности борьбы с последствиями окислительного повреждения мембранных липидов гипохлоритом. Так, в работе [133] было показано, что окисление гипохлоритом фосфатидилхолина в составе модельных мембран, сопровождающееся накоплением продуктов липопероксидации, вызывало активацию одного из ключевых ферментов синтеза фосфатидилхолина. Авторы полагают, что нарушение организации липидного бислоя под действием оксидантов, в том числе гипохлорита, служит сигналом для запуска механизма обновления липидного матрикса мембран и потенциирует репаративные функции клетки.

Какой из механизмов, молекулярный или радикальный, преобладает in vivo и играет решающую роль в повреждении мембранных липидов гипохлоритом? Если судить по количеству образующихся продуктов и задействованных функциональных групп липидов, то можно полагать, что это молекулярный механизм, поскольку концентрация образующихся хлоргидринов (особенно в экспериментах in vitro [132,170,193]) значительно превышает концентрацию регистрируемых продуктов ПОЛ [10,23,14,129,130,137,163]. Действительно, в реакции ПОЛ, каким бы образом они не инициировались (Ре2++аскорбат [21], ксантин+ксантиноксидаза [195], автоокисление [128], радиация [3], гипохлорит [10,23,131,137], МП0+Н202+СГ [127,130], клетки [128] и др.), как правило, вовлекается лишь незначительная доля ненасыщенных липидов, а уровень регистрируемых продуктов на несколько порядков ниже концентрации двойных связей - субстрата ПОЛ [14,147]. Тем не менее, как известно [75], реакции ПОЛ приводят к существенным изменениям физико-химических свойств липидной фазы мембран и других белок-липидных комплексов. Поэтому, если исходить из предположения, что ПОЛ как таковое существует in vivo и играет важную роль в развитии многих патологических процессов [3,75,128,129], то вряд ли следует пренебрегать возможностью инициирования гипохлогитом в очагах воспаления свободнорадикальных реакций в липидной фазе. Это становится очевидным, если учесть, что МПО, секретируемая во внеклеточную среду при активации фагоцитов, способна ассоциировать с белок-липидными комплексами, в частности с липопротеинами крови [75], что, по всей вероятности, позволяет этому ферменту локально способствовать осуществлению окислительных процессов в непосредственной близости от липидной фазы липопротеинов.

Рис. 57. Схема участия гипохлорита, продуцируемого активированными фагоцитами, в инициировании свободнорадикального перекисного окисления липидов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чеканов, Андрей Васильевич, 2004 год

1. Ахметов Н.С. Неорганическая химия. Москва: Высшая школа, 1975, 304-311.

2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. Москва: Наука, 1972.

3. Владимиров Ю. А., Азизова О. А., Деев А. И., Козлов А. В., Осипов А. Н., Рощупкин Д. И. Свободные радикалы в живых системах. Итоги науки и Техники, Биофизика, Москва. ВИНИТИ, 1992,29: 3-250.

4. Владимиров Ю. А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран. Биофизика. 1987,38(3): 390-396.

5. Владимиров Ю.А., Литвин Ф.Ф. Исследование сверхслабых свечений в биологических системах. Биофизика. 1959,4(5): 601-605.

6. Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н. Влияние низкомолекулярных соединений на хемилюминесценцию люминола, обусловленную действием продуктов миелопероксидазного катализа и экзогенного гипохлорита. Биохимия, 1988,53:2025-2032.

7. Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н. Окислительное повреждение эритроцитов миелопероксидазой. Защитное действие сывороточных белков. Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1989,107:428-430.

8. Горбатенкова Е.А., Науменко К.В., Сергиенко В.И. Свойства производных каталазы и пероксидазы, образованных при непрямом электрохимическом окислении. В кн.: Электрохимические методы в медицине. Москва: НИИ ФХМ МЗ РСФСР, 1991, 5-6.

9. Евгина С.А., Панасенко О.М., Сергиенко В.И., Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липопротеинов крови человека, индуцированное гипохлорит-анионом. Биол.мембраны, 1992,9: 946-953.

10. Осипов А.Н. (1983) Изучение свободных радикалов, образующихся при перекисном окислении, методом ЭПР. Дисс. канд. биол. наук, Изд-во МГУ, Москва.

11. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофше и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1985.

12. Несмеянов А.Н., Несмеянов Н.А. Начала органической химии. Москва: Химия. 1974, 1,249.

13. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Сергиенко В.И., Арнольд К., Владимиров Ю.А. Стехиометрия взаимодействия гипохлорита с ненасыщенными связями фосфатидилхолина и свободных жирных кислот в составе липосом. Биол.мембраны, 1996,13: 271-281.

14. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Арнольд К., Владимиров Ю.А., Сергиенко В.И. Взаимодействие гипохлорита с гидропероксидами и другими продуктами окисления фосфатидилхолиновых липосом. Биохимия, 1995, 60: 1419-1429.

15. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Сергиенко В.И. Влияние рН на перекисное окисление фосфолипидных липосом, индуцированное гипохлоритом. Биофизика, 1998,43:463-469.

16. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Шиллер Ю. Гипохлорит взаимодействует с органическим гидропероксидом с образованием свободных радикалов, но не синглетного кислорода, инициируя перекисное окисление липидов. Биохимия, 1997, 62: 1111-1121.

17. Панасенко О.М., Арнхольд Ю. Механизм гипохлорит-индуцированного перекисного окисления липидов фосфолипидных липосом. Биол. мембраны, 1996, 13: 89-99.

18. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Арнольд К., Владимиров Ю.А., Сергиенко В.И. Взаимодействие гипохлорита с гидропероксидами и другими продуктами окисления фосфатидилхолиновых липосом. Биохимия, 1995, 60: 1419-1429.

19. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Арнольд К., Владимиров Ю.А., Сергиенко В.И. Сравнительное исследование кинетики пероксидации фосфолипидных липосом, индуцированной гипохлоритом и в системе Fe2+ + аскорбат. Биофизика, 1996,41: 334-341.

20. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Арнольд К., Владимиров Ю.А., Сергиенко В.И. Применение метода хемилюминисценции в исследовании кинетики взаимодействия гипохлорита с фосфатидилхолиновыми липосомами. Биофизика, 1995,40: 1234-1242.

21. Панасенко О.М., Евгина С.А., Дремина Е.С., Шаров B.C., Владимиров Ю.А., Сергиенко В,И. Роль Fe2+ в перекисном окислении липидов липосомальных мембран, инициированном гипохлоритом натрия. Биол. мембраны, 1995,12: 191196.

22. Панасенко О.М., Осипов А.Н., Шиллер Ю., Арнхольд Ю. Взаимодействие экзогенного гипохлорита, продуцируемого в системе миелопероксидаза + Н202 + С1-, с ненасыщенными фосфадилхолинами. Биохимия, 2002, 67: 1071-1084.

23. Черный В.В., Стожкова И.Н., Мирский В.М., Ястребова Т.Н., Соколов B.C. Изменение свойств липидного бислоя под действием гипохлорита натрия. II. Исследование действия гипохлорита натрия на модельные липидные системы. Биол. мембраны, 1992,9: 66-73.

24. Шафран М.Г. Миелопероксидаза нейтрофильных гранулоцитов. Успехи соврем, биол., 1981,92(6): 365-379.

25. Шаронов Б.П., Чурилова И.В. Окисление супероксиддисмутазы гипохлоритом. Появление изомеров, обладающих каталитической активностью. Докл. АН СССР, 1990,314: 1500-1502.

26. Якутова Э.Ш., Осипов А.Н., Костенко О.В., Арнхольд Ю., Арнольд К., Владимиров Ю.А. Взаимодействие гипохлорита с оксигемоглобином приводит к освобождению железа в каталитически активной форме. Биофизика, 1992,37: 1021-1028.

27. Якутова Э.Ш., Дремина Е.С., Евгина С.А., Осипов А.Н., Шаров B.C., Панасенко О.М., Владимиров Ю.А. Образование свободных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа (И). Биофизика, 1994,39: 275-279.

28. Anbar М., Taube Н. The exchange of hypochlorite and of hypobromite ions with water. J.Am.Chem.Soc., 1958,80: 1073-1077.

29. Akanmu D., Cecchini R., Aruoma O.I., Halliwell B. The antioxidant action of eTgothione'me.Arch.Biochem.Biophys., 1991,288: 10-16.

30. Aruoma O.I., Halliwell B. Action of hypochlorous acid on the antioxidant protective enzymes superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase. Biochem.J., 1987, 248: 973-976.

31. Arnhold J., Mueller S., Arnold K., Sonntag K. Mechanisms of inhibition of chemiluminescence in the oxidation of luminol by sodium hypochlorite. J.BioIumin.Chemilumin., 1993,6: 307-313.

32. Aruoma O.I., Laughton M.J., Halliwell B. Carnosine, homocarnosine and anserine: could they act as antioxidants in vivo? Biochem.J., 1989,264: 863-869.

33. Albrich J.M., McCarthy С.A., Hurst J. Biological reactivity of hypochlorous acid: Implications for microbicidal mechanisms of leucocyte myeloperoxidase. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1981,78: 210-214.

34. Arnhold J., Hammerschmidt S., Wagner M., Mueller S., Arnold K., Grimm E. On the action of hypochlorite on human serum albumin. Biomed.Biochim.Acta, 1990,49: 991997.

35. Arnhold J., Mueller S., Arnold K., Grimm E. Chemiluminescence intensities and spectra of luminol oxidation by sodium hypochlorite in the presence of hydrogen peroxide.

36. J. Biolumin. Chemilumin., 1991,6: 189-192.

37. Arnhold J., Osipov A.N., Spalteholz H., Panasenko O.M., Schiller J. Effects of hypochlorous acid on unsaturated phosphatidylcholines. Free Radic. Biol. Med. 2001,31: 1111-1119.

38. Babior B.M. Oxygen dependent microbial killing by phagocytes. N. Engl. J. Med. 1978, 298: 659-668.

39. Bekkenist R.J., De Boer J.E.G., Plat H., Wever R. The halide complexes of myeloperoxidase and the mechanism of halogenation reactions. Biochim.Biophys.Acta, 1980,613:337-348.

40. Bernofsky C., O'Dea S.W. Nucleotide modification, a radical mechanism of oxidative toxicity. Free Radic.Res.Commun., 1986,2: 129-136.

41. Boyum A. Separation of white blood cells. Nature. 1964,204: 793-794.

42. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combiningbcentrifugation and sedimentation at 1 g. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968,21: 74-89.

43. Candeias L.P., Stratford M.R., Wardman P. Formation of hydroxyl radicals on reaction of hypochlorous acid with ferrocyanide, a model iron(II) complex. Free Radic.Res., 1994, 20: 241-249.

44. Candeias L.P., Patel K.B., Stratford M.R., Wardman P. Free hydroxyl radicals are formed on reaction between the meutrophil-derived species superoxide anion and hypochlorous acid .FEBSLett., 1993,333: 151-153.

45. Carr A.C., van den Berg J.J., Winterbourn C.C. Chlorination of cholesterol in cell membranes by hypochlorous acid. Arch.Biochem.Biophys., 1996,332: 63-69.

46. Carr A.C., Winterbourn C.C., Blunt J.W., Phillips A.J., Abell A.D. Nuclear magnetic resonance characterization of 6-alpha-chloro-5-beta-cholestane-3-beta,5-diol formed from the reaction of hypochlorous acid with cholesterol. Lipids, 1997,32: 363-367.

47. Chamulitrat W, Mason RP. Alkyl free radicals from the beta-scission of fatty acid alkoxyl radicals asdetected by spin trapping in a lipoxygenase system. Arch Biochem Biophys. 1990,282(1): 65-69.

48. Chamulirat W., Conet M.S., Mason R.P. Free radical formation from organic hydroperoxides in isolated human polymorphohuclear neutrophils. Free Radic. Biol. Medicin. 1991,11: 439-445.

49. Chatham W.W., Blackburn W.D.,Jr. Fixation of C3 to IgG attenuates neutrophil HOC1 generation and collagenase activation. J.Immunol., 1993,151: 949-958.

50. Clark R.A., Pearson D.W. Inactivation of transferrin iron binding capacity by the neutrophil myeloperoxidase system. J.Biol.Chem., 1989,264: 9420-9427.

51. Clark R.A., Szot S. Chemotactic factor inactivation by stimulated human neutriphils mediated by myeloperoxidase-catalyzed methionine oxidation. J.Immunol., 1981, 128: 1507-1513.

52. Cuperus R.A., Muijsers A.O., Wever R. The superoxide dismutase activity of myeloperoxidase; formation of compound III. Biochim. Biophys. Acta, 1986,871: 78-84.

53. Dai J., Meij J.T.A., Padua R., Panagia V. Depression of cardiac sarcolemmal phospholipase-D activity by oxidant-induced thiol modification. Circ.Res., 1992,71: 970-977.

54. Darley Usmar V.M., Lelchuk R., O'Leary V.J., Knowles M., Rogers M.V., Severn A. Oxidation of low-density lipoprotein and macrophage derived foam cells. Biochem. Soc. Trans., 1990,18: 1064-1066.

55. Davies M.J. Protein and peptide alkoxyl radicals can give rise to C-terminal decarboxylation and backbone cleavage. Arch. Biochem. Biophys. 1996, 336: 163-172.

56. Davies, M. J., Fu, S., and Dean, R. T. Protein hydroperoxides can give rise to reactive free radicals. Biochem. J. 1995,305: 643-649.

57. Davies J.M., Horwitz D.A., Davies K.J. Potential roles of hypochlorous acid and N-chloroamines in collagen breakdown by phagocytic cells in synovitis. Free Radic.Biol.Med., 1993,15: 637-643.

58. Di Mascio P, Wefers H, Do-Thi HP, Lafleur MV, Sies H. Singlet molecular oxygen causes loss of biological activity in plasmid andbacteriophage DNA and induces single-strand breaks. Biochim Biophys Acta., 1989, 1007(2): 151-157.

59. Dikalov SI, Mason RP. Spin trapping of polyunsaturated fatty acid-derived peroxyl radicals:reassignment to alkoxyl radical adducts. Free Radio Biol Med. 2001,30(2): 187197.

60. Drozdz R., Naskalski J. W. & Sznajd J. Oxidation of amino acids and peptides in reaction with myeloperoxidase, chloride and hydrogen peroxide. Arch Biochem. Biophys., 1988, 957:47-52.

61. Duling, D.R. Simulation of multiple isotropic spin-trap EPR spectra. J. Magn. Reson.,1994. В 104: 105-110.

62. Edwards S.W. Biochemistry and physiology of the neutrophil. Cambridge:Cambridge University press, 1994.

63. Fliss H., Menard M. Hypochlorous acid-induced mobilization of zinc from metalloproteins. Arch. Biochem. Biophys., 1991,287: 175-179.

64. Floris R., Wever R. Reaction of myeloperoxidase with its product HOCI. Eur. J. Biochem.,1992,207: 697-702.

65. Foote C.S., Goyne, Т.Е.; Lehrer R.I. Assessment of chlorination by human neutrophils. Nature. 1983, 301: 715-726.

66. Freeman B. A., Sharman M. C., and Mudd L. Reaction of ozone with phospholipid vesicles and human erythrocyte ghosts. Arch Biochem Biophys. 1979, 197: 264-272.

67. Furtmuller PG, Burner U, Jantschko W, Regelsberger G, Obinger C. Two-electron reduction and one-electron oxidation of organic hydroperoxides by human myeloperoxidase. FEBSLett. 2000, 484(2): 139-43.

68. Girotti A.W. Lipid hydroperoxide generation, turnover, and effector action in biological systems. J. Lipid Res. 1998, 39: 1529-1542., Review.

69. Girotti AW. Photodynamic lipid peroxidation in biological systems., Photochem. and Photobiol. 1990,51: 497-509., Review.

70. Granger D.L., Taintor R.R., Boockvar K.S., Hibbs J.B. Measurement of nitrate and nitrite in biological samples using nitrate reductase and Griss reaction. Methods Enzymol., 1996, 268: 142-151.

71. Grisham M.B., Jefferson M.M., Thomas E.L. Role of monochloramine in the oxidation of erythrocyte hemoglobin by stimulated neutrophils. J.Biol.Chem., 1984., 259: 6757-6765.

72. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free radicals in Biology and Medicine. Oxford. University Press. 2000.

73. Harrison J.E., Schultz J. Studies on the chlorinating activity of myeloperoxidase. J.Biol.Chem., 1976,251: 1371-1374.

74. Harrison J.E. The functional mechanism of myeloperoxidase. In: Cancer Enzymology. Eds. Schultz J., Cameron B.F. New York: Academic Press, 1976,305-317.

75. Hazell L.J., Stocker R. Oxidation of low-density lipoprotein with hypochlorite causes transformation of the lipoprotein into a high-uptake form for macrophages. Biochem.J., 1993,290: 165-172.

76. Hawkins C. L. and Davies M. J. Hypochlorite-induced damage to proteins: formation of nitrogen-centred radicals from lysine residues and their role in protein fragmentation. Biochem.J. 1998,332:617-625.

77. Hawkins C.L., Davies M.J. Degradation of hyaluronic acid, poly- and monosaccharides, and model compounds by hypochlorite: evidence for radical intermediates and fragmentation. Free Radic. Biol. Med. 1998,24: 1396-1410.

78. Hawkins C.L., Davies M.J. Hypochlorite-induced damage to proteins: formation of nitrogen-centred radicals from lysine residues and their role in protein fragmentation. BiochemJ. 1998,332:617-625.

79. Headlam HA, Davies MJ. Cell-mediated reduction of protein and peptide hydroperoxides to reactive free radicals. Free Radic Biol Med. 2003,34(l):44-55.

80. Heinecke J.W., Li W., Daehnke H.L., Goldstein J.A. Dityrosine, a specific marker of oxidation, is synthesized by the myeloperoxidase-hydrogen peroxide system of human neutrophils and macrophages. J.Biol.Chem., 1993,268:4069-4077.

81. Heinecke J.W., Li W., Mueller D.M., Bohrer A., Turk J. Cholesterol chlorohydrin synthesis by the myeloperoxidase-hydrogen peroxide-chloride system: potential markers for lipoproteins oxidatively damaged by phagocytes. Biochemistry, 1994,33: 1012710136.

82. Heinecke J.W., Li W., Daehnke H.L., Goldstein J.A. Dityrosine, a specific marker of oxidation, is synthesized by the myeloperoxidase-hydrogen peroxide system of human neutrophils and macrophages. J.Biol.Chem., 1993, 268:4069-4077.

83. Heller A., Koch Т., Schmeck J., van Ackern K. Lipid mediators in inflammatory disorder. Drugs. 1998, 55:487-496.

84. Hoogland H., Dekker H.L., Riel C., Kuilenburg A., Muijsers A.O., Wever R. A steady-state study on the formation of II and III of myeloperoxidase. Biochim.Biophys.Acta, 1988, 955: 337-345.

85. Howard J.A., Ingold K.U. The self-reaction of sec-butylperoxy radicals. Conformation of the Russell mechanism. J.A.Chem.Soc., 1968,90: 1056-1058.

86. Hu M.L., Louie S., Cross C.E., Motchnik P., Halliwell B. Antioxidant protection against hypochlorous acid in human plasma. J.Lab.Clin.Med., 1993, 121: 257-262.

87. Hurst J.K. Myeloperoxidase active site structure and catalytic machanism. In: Everse K.; Grisham M.B., eds., Peroxidases in chemistry and biology 1 st ed Boca Ration: CRC Press; 1991,37-62.

88. Iwahashi H. Some polyphenols inhibit the formation of pentyl radical and octanoic acid radical in the reaction mixture of linoleic acid hydroperoxide with ferrousions. Biochem. J. 2000,346: 265-73.

89. Iwahashi H. High-performance liquid chromatographic determination of linoleic acid peroxide-derived radicals using electrochemical detection. J Chromatogr A. 2000, 904(2): 197-202.

90. Iwamoto H., Kobayashi Т., Hasegawa E., Morita Y. Reaction of human myeloperoxidase with hydrogen peroxide and its true catalase activity. J.Biochem., 1987,101: 1407-1412.

91. Iwase H, Sakurada К, Hatanaka К, Kobayashi M, Takatori Т. Effect of cytochrome с on the linoleic acid-degrading activity of porcine leukocyte 12-lipoxygenase. Free Radio. Biol. Med. 2000, 28(6): 912-918.

92. Iwase H, Takatori T, Sakurada K, Nagao M, Niijima H, Matsuda Y, Kobayashi M. Calcium is required for quasi-lipoxygenase activity of hemoproteins. Free Radio. Biol. Med. 1998,25(8): 943-52.

93. Jasin H.E. Oxidative modification of inflammatory synovial fluid immunoglobulin G. Inflammation, 1993,17: 167-181.

94. Johnson D.W., Margerum D.W. Non-metal redox kinetics: a reexamination of the mechanism of the reaction between hypochlorite and nitrite ions. Inorg.Chem., 1991,30: 4845-4851.

95. Kalyanaraman В., Sohnle P.G. Generation of free radical intermediates from foreign compounds by neutrophil-derived oxidants .J.Clin. Invest., 1985, 75: 1618-1622.

96. Kanofsky J.R. Singlet oxygen production by biological systems. Chem.-Biol. Interact.,1989, 70: 1-28.

97. Kettle A. J., Winterbourn C.C. Assays for the chlorination activity of myeloperoxidase.

98. Methods Enzymol., 1994,233: 502-512.

99. Kettle A.J., Winterbourn C.C. Mechanism of inhibition of myeloperoxidase by antiinflammatory drugs. Biochem.Pharmacol., 1991,41: 1485-1492.

100. Kettle A. J., Winterbourn C.C. Superoxide modulates the activity of myeloperoxidase andoptimizes the production of hypochlorous acid. Biochem. J., 1988, 252: 529-536.

101. Kettle A.J., Winterbourn C.C. Oxidation of hydroquinone by myeloperoxidase.

102. Mechanism of stimulation by benzoquinone. J.Biol.Chem., 1992,267: 8319-8324.

103. Kettle A. J., Winterbourn C.C. Myeloperoxidase: A key regulator of neutrophil of oxidantproduction. Redox. Rep. 1997,3: 3-15.

104. Khan A.U., Kasha M. Chemiluminescence arising from simultaneous transitions in pairs of singlet oxygen molecules. J.Am.Chem.Soc., 1970,92: 3293-3300.

105. Klebanoff S.J., Clark R.A. The neutrophil: Function and clinical disorders. Amsterdam:

106. Elsevier-North Holland, 1978.

107. Kukreja R.C., Weaver A.B., Hess M.L. Stimulated human neutrophils damage cardiacsarcoplasmic reticulum function by generation of oxidants. Biochim.Biophys.Acta, 1989, 990: 198-205.

108. Kukreja R.C., Weaver A.B., Hess M.L. Sarcolemmal Na+-K+-ATPase: inactivation byneutrophil-derived free radicals and oxidants. Am.J.Physiol., 1990, 259: H1330-H1336.

109. LapennaD., DeGioia S., Ciofani G., Mezzetti A., Consoli A., Di Ilio C., Cuccurullo F.

110. Hypochlorous acid-induced zinc release from thiolate bonds: a potential protective mechanism towards biomolecules oxidant damage during inflammation. Free Radic.Res., 1994,20: 165-170.

111. Lindgren F.T. Preparative ultracetrifugal laboratory procedures and suggest ions forlipoprotein analysis. In: Analisis of Lipids and Lipoproteins., Ed. Perkins E.G. Champaign (III), Amer. Oil. Chemists. Soc. 1975,204-224.

112. Long C.A., Bielski B.H.J. Rate of reaction of superoxide radical with chloride-containingspecies. J.Phys. Chem., 1980,84: 555-557.

113. Malle E., et al., Int. J. Lipoxygenase and hydroperoxy/hydroxy-eicosatetraenoic acidformation. Biochem. 1987,19: 1013.

114. Marietta M.A., Yoon P.S., Iyenger R., Leaf C.D., Wishok J.S. Macrophage oxidation of Larginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an intermediate. Biochemistry, 1988,27: 8706-8711.

115. Mashino Т., Fridovich I. Reactions of hypochlorite with catalase. Biochim.Biophys.Acta,1988, 956: 63-69.

116. Matheson N.R., Travis J. Differential effects of oxidizing agents on human plasma aiproteinase inhibitor and human neutrophil myeloperoxidase. Biochemistry, 1985,24: 1941-1945.

117. Matsuoka Т., Kato M., Kako K.J. Effect of oxidants on Na+,K+-ATPase and its reversal.

118. Basic.Res.Cardiol., 1990,85: 330-341.

119. Metzger J.O. Herstellung (Erzeugung) von Radikalen durch homolytische SpaltungvonC,H-Bindungen mit Radikalen. In: Houben-Weyl. Methoden der Organischen Chemie. 4. Auflage, Bd. El9a, C-Radikale, Georg-Thieme Verlag, Stuttgart-New York,1989, 60-145.

120. Michaelis J., Vissers M.C., Winterbourn C.C. Different effects of hypochlorous acid onhuman neutrophil metalloproteinases: activation of collagenase and inactivation of collagenase and gelatinase. Arch.Biochem.Biophys., 1992,292: 555-562.

121. McGiff J. C. Cytochrome P-450 metabolism of arachidonic acid. Annu. Rev. Farmacol.1. Toxicol 1991,31:339-369.

122. Monboisse J.C., Borel J.P. Oxidative damage to collagen. EXS., 1992,62: 323-327.

123. Morris J.C. The acid ionization constant of HOCl from 5 to 35°C. J.Phys.Chem., 1966, 70:3798-3805.

124. Nakamori К., Koyama I., Nakamura Т., Yoshida Т., Umeda M., Inoue K. Effectiveness oftaurine in protecting biomembrane against oxidant. Chem.Pharm.Bull.Tokyo., 1990,38: 3116-3119.

125. Nauseef W.M.; Malech H.L. Analysis of the peptide subunits of human neutrophilmyeloperoxidase. Blood., 1986,67: 1504-1507.

126. Noguchi N, Nakada A, Itoh Y, Watanabe A, Niki E. Formation of active oxygen speciesand lipid peroxidation induced by hypochlorite. Arch. Biochem. Biophys. 2002,397(2): 440-7.

127. Panasenko O.M., Arnhold J. Linoleic acid hydroperoxide favours hypochlorite- andmyeloperoxidase-induced lipid peroxidation. Free Radic Res. 1999,30(6):479-87.

128. Panasenko O.M., Vol'nova T.V., Osipov A.N., Azizova O.A., Vladimirov Yu.A. Freeradical generation by monocytes and neutrophils: a possible cause of plasma lipoprotein modification. Biomed.Sci., 1991,2: 581-589.

129. Panasenko O.M., Arnhold J., Vladimirov Yu.A., Arnold K., Sergienko V.I. Peroxidationof egg yolk phosphatidylcholine liposomes by hypochlorous acid. Biochim. Biophys. Acta., 1994,1215:259-266.

130. Panasenko O.M., Evgina S.A., Andyraliev R.P., Sergienko V.I., Vladimirov Yu.A.

131. Peroxidation of blood lipoproteins induced by exogenous hypochlorite generated in the system of myeloperoxidase + H202 + СГ. Free Radic.Biol.Med., 1994,16: 143-148.

132. Panasenko O.M. The mechanism of the hypochlorite-induced lipid peroxidation.

133. BioFactors. 1997,6: 181-190.

134. Panasenko O.M., Arnhold J., Vladimirov Yu.A., Arnold K., Sergienko V.I Reaction ofhypochlorous acid with hydrogen peroxide and tert-butyl hydroperoxide. 'H NMR spectroscopy and chemiluminescence analysis. Z. Naturforsch., 1996,51: 386-394.

135. Panasenko O.M., Arnhold J., Vladimirov Yu.A., Arnold K., Sergienko V.I. Hypochloriteinduced peroxidation of phosphatidylcholine is mediated by hydroperoxides. Free Radic. Res., 1997,27: 1-12.

136. Panasenko O.M., Briviba K., Klotz L.-O., Sies H. Oxidative modification and nitration of human low-density lipoproteins by the reaction of hypochlorous acid with nitrite. Arch.Biochem.andBiophys., 1997,343: 254-259.

137. Panasenko O.M., Sergienko V.I. Hypochlorite, oxidative modification of plasmalipoproteins, and atherosclerosis. Bull. Exp. Biol. Med. 2001,31(5): 407-15. Review.

138. Panasenko O.M., Panasenko O.O., Briviba K., Sies H. Hypochlorite destroys carotenoidsin low density lipoproteins thus decreasing their resistance to peroxidative modification. Biochemistry. 1997, 62(10): 1140-5.

139. Panasenko O.M., Evgina S.A., Driomina E.S., Sharov V.S., Sergienko V.I., Vladimirov

140. Yu.A. Hypochlorite induces lipid peroxidation in blood lipoproteins and phospholipid liposomes. Free Radic.Biol.Med., 1995,19: 133-140.

141. Piazza. G.J. Lipoxygenase catalyzed hydroperoxide formation in microemulsionscontaining nonionic surfactant. Biotechnol. Lett. 1992,14: 1153.

142. Penner M.H., Osuga D.T., Meares C.F., Feeney R.E. The interaction of anions with nativeand phenylglyoxal-modified human serum transferrin. Arch.Biochem.Biophys., 1987., 252: 7-14.

143. Peppin G.J., Weiss S.J. Activation of the endogenous metalloproteinase, gelatinase, bytriggered human neutrophils. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1986,83:4322-4326.

144. Podrez E.A., Abu-Soud H.M., Hazen S.L. Myeloperoxidase-generated oxidation andatherosclerosis. Free Radic. Biol. & Med. 2000, 28(12): 1717-1725.

145. Pryor W.A. The formation of free radicals and the consequences of their reactions in vivo.

146. Photochem. and Photobiol. 1978,28:787-801.

147. Pryor W.A. Mechanisms of radical formation from reactions of ozone with target moleculsin the lung. Free Radical Biol.Med. 1994,17: 451-465.

148. Qian SY, Guo Q, Mason RP. Identification of spin trapped carbon-centered radicals insoybean lipoxygenase-dependent peroxidations of omega-3 polyunsaturated fatty acids by LC/ESR, LC/MS, and tandem MS. Free Radic Biol Med. 2003, 35(l):33-44.

149. Rao S. I., Wilks A., Hamberg M., Ortis de Montellano P. R. The lipoxygenase activity ofmyoglobin. J. Biol. Chem. 1994,269: 7210-7216.

150. Rice-Evans C., Leake D., Bruckdorfer K.R., Diplock A.T. Practical approaches to lowdensity lipoprotein oxidation: whys, wherefores and pitfalls. Free Radic.Res., 1996,25: 285-311.

151. Russell G.A. Deuterium-isotope effects in the autoxidation of aralkyl hydrocarbons.

152. Mechanism of the interaction of peroxy radicals. J. Am. Chem. Soc. 1957, 79: 3871-3877.

153. Saari H., Sorsa Т., Lindy О., Suomalainen К., Halinen S., Konttinen Y.T. Reactive oxygen species as regulators of human neutrophil and fibroblast interstitial collagenases. Int.J.Tissue React., 1992,14: 113-120.

154. Sayuri Miyamoto, Glaucia R. Martinez, Marisa H. G. Medeiros, and Paolo Di Mascio.

155. Singlet Molecular Oxygen Generated from Lipid Hydroperoxides by the Russell1 Я

156. Mechanism: Studies Using O-Labeled Linoleic Acid Hydroperoxide and Monomol Light Emission Measurements. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125(20): 6172 6179.

157. Sepe S.M., Clark R.A. Oxidant membrane injury by the neutrophil myeloperoxidasesystem. 1. Characterization of a liposome model and injury by myeloperoxidase, hydrogen peroxide, and halides. J.Immunol., 1985,134: 1888-1895.

158. Sepe S.M., Clark R.A. Oxidant membrane injury by the neutrophil myeloperoxidase system. 2. Injury by stimulated neutrophils and protection by lipid-soluble antioxidants. J. Immunol., 1985,134: 1896-1901.

159. Sies H., Stahl W., Sundquist A.R. Antioxidant functions of vitamins. Vitamins E and C, beta-carotene, and other carotenoids. Ann.N.Y.Acad.Sci., 1992,669: 7-20.

160. Shanlin F., Wang H., Davies M. & Dean R. Reactions of hypochlorous acid with tyrosineand peptidyl-tyrosyl residues give dichlorinated and aldehydic products in additions to 3-chlorotyrosine. J.Biol.Chem., 2000, 275: 10858-10858.

161. Sharov V.S., Briviba K., Sies H. Assessment of the C-525 laser dye as a chemiluminescence sensitizer for lipid peroxidation in biological membranes: a comparison with chlorophyll-a. Free Radic Biol Med. 1996,21(6): 833-43.

162. Sharov V.S., Dremina E.S., Vladimirov Iu.A. Activation of Fe2+-inducedchemiluminescence in human blood low density lipoproteins by the fluorescent dye C-525. Biofizika., 1995,40(2): 428-33.

163. Sharov V.S., Vladimirov Iu.A. Chemiluminescence of liposomes activated with rare earth ions. Biofizika. 1982,27(2): 327-9.

164. Sharonov B.P., Churilova I.V. Inactivation and oxidative modification of Cu,Znsuperoxide dismutase by stimulated neutrophils: the appearance of new catalytically active structures. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1992, 189: 1129-1135.

165. Sharonov B.P., Govorova N.I., Lyzlova S.N. A comparative study of serum proteinsability to scavenge active oxygen species: "O2*. and ОСГ. Biochem.Int., 1988,17: 783790.

166. Sharonov B.P., Govorova N.I., Lyzlova S.N. Serum protein degradation by hypochlorite. Biochem.Int., 1989,19: 27-35.

167. Sharonov BP, Govorova NIu. Oxidation of ceruloplasmin by hypochlorite. The loss of blue color and preservation of oxidase activity. Biokhimiia. 1990,55(6): 1145-1148.

168. Schaur J.R., Jerlich A.,Stelmaszynska T. Hypochlorous acid as reactive oxygen species.

169. Current Topics in Biophysics. 1998,22: 176-185.

170. Schiller J., Arnhold J., Grunder W., Arnold K. The action of hypochlorous acid on polymeric components of cartilage. Biol.Chem.Hoppe Seyler, 1994,375: 167-172.

171. Schiller J., Arnhold J., Arnold K. Action of hypochlorous acid on polymeric componentsof cartilage. Use of 13C-NMR spectroscopy. ZNaturforsch., 1995,50: 721-728.

172. Schraufstatter I., Hyslop P.A., Jackson J.H., Cochrane C.G. Oxidant-induced DNA damage of target cells. J.Clin.Invest., 1988, 82: 1040-1050.

173. Schraufstatter I.U., Browne K., Harris A., Hyslop P.A., Jackson J.H., Quehenberger O.,

174. Cochrane C.G. Mechanisms of hypochlorite injury of target cells. J.Clin.Invest., 1990, 85: 554-562.

175. Schultz Y., Kaminver K. Myeloperoxidase of the leukocyte of normal human blood.

176. Content and localization. Arch.Biochem., 1962,96: 465-467.

177. Soriani M., Mazzuca S., Quaresima V., Minetti M. Oxidation of desferoxamine tonitroxide free radical by activated human neutrophils. Free Radic.Biol.Med., 1993,14: 589-599.

178. Spickett C.M., Jerlich A., Panasenko O.M., Arnhold J., Pitt A.R., Stelmaszynska Т.,

179. Schaur R.J. The reactions of hypochlorous acid, the reactive oxygen species produced by myeloperoxidase, with lipids. Acta Biochim. Polonica. 2000,47: 889-899.

180. Stark J.A., Henderson A.R. In vitro effect of elastase and cathepsin G from humanneutrophils on creatine kinase and lactate dehydrogenase isoenzymes. Clin.Chem1993, 39: 986-992.

181. Steven P. Stratton and Daniel C. Liebler. Determination of Singlet Oxygen-Specific versus

182. Radical-Mediated Lipid Peroxidation in Photosensitized Oxidation of Lipid Bilayers: Effect of p-Carotene and cc-Tocopherol. Biochemistry 1997,36(42): 12911 12920.

183. Stocker R., Peterhans E. Antioxidant properties of conjugated bilirubin and biliverdin: biologically relevant scavenging of hypochlorous acid. Free Radic. Res.Commun., 1989, 6: 57-66.

184. Soriani M., Mazzuca S., Quaresima V., Minetti M. Oxidation of desferoxamine tonitroxide free radical by activated human neutrophils. Free Radic.Biol.Med., 1993,14: 589-599.

185. Suzuki S., Kaneko M., Chapman D.C., Dhalla N.S. Alterations in cardiac contractile proteins due to oxygen free radicals. Biochim.Biophys.Acta, 1991,1074: 95-100.

186. Terada L.S., Beehler C.J., Banerjee A., Brown J.M., Grosso M.A., Harken A.H., McCord

187. J.M., Repine J.E. Hyperoxia and self- or neutrophil-generated O2 metabolites inactivate xanthine oxidase. J.Appl.Physiol., 1988., 65: 2349-2353.

188. Uppu R. M., Cueto R., Squadrito G. L., Pryor W. A. What does ozone react at the air/lunginterface? Model studies using human red blood cell membranes. Arch Biochem Biophys. 1995,319: 257-266.

189. Van Rensburg C.E., Van Staden A.M., Anderson R., Van Rensburg E.J. Hypochlorousacid potentiates hydrogen peroxide-mediated DNA-strand breaks in human mononuclear leucocytes. Mutat.Res., 1992,265: 255-261.

190. Van Rensburg C.E., Van Staden A.M., Anderson R. Inactivation of poly (ADP-ribose)polymerase by hypochlorous acid. Free Radic.Biol.Med., 1991,11: 285-291.

191. Van Zyl J.M., Basson K., Kriegler A., Van der Walt B.J. Activation of chlorpromazine bythe myeloperoxidase system of the human neutrophil. Biochem. Pharmacol., 1990, 40: 947-954.

192. Vissers M.C., Winterbourn C.C. Myeloperoxidase-dependent oxidative inactivation ofneutrophil neutral proteinases and microbicidal enzymes. Biochem. J., 1987,245: 277280.

193. Vissers M.C., Fantone J.C. Inhibition of hypochlorous acid-mediated reactions bydesferoxamine. Implications for the mechanism of cellular injury by neutrophils. Free Radic.Biol.Med., 1990,8: 331-337.

194. Vissers M.C., Winterbourn C.C. Oxidative damage to fibronectin. I. The effects of theneutrophil myeloperoxidase system and HOCI. Arch.Biochem.Biophys., 1991., 285: 5359.

195. Vladimirov Yu.A., Olenev V.I., Suslova T.B., Cheremisina Z.P. Lipid peroxidation in mitochondrial membrane. Adv. Lipid Res., 1980,17: 173-249.

196. Vladimirov Y.A, Sharov V.S., Driomina E.S., Reznitchenko AV, Gashev SB. Coumarinderivatives enhance the chemiluminescence accompanying lipid peroxidation. Free Radic Biol Med. 1995,18(4):739-745.

197. Weiss S.J. Neutrophil-mediated methemoglobin formation in the erythrocyte. The role ofsuperoxide and hydrogen peroxide. J.Biol.Chem., 1982,257: 2947-2953.

198. Weiss S.J., Peppin G., Ortiz X., Ragsdale C., Test S.T. Oxidative autoactivation of latent collagenase by human neutrophils. Science, 1985,227: 747-749.

199. Wefers H, Di Mascio P, Do-Thi HP, Schulte-Frohlinde D, Sies H. Effects of singletoxygen on the biological activity of DNA and its involvement in single strand-break formation. Basic Life Sci. 1988,49: 473-477.

200. Wefers H, Melnik ВС, Flur M, Bluhm C, Lehmann P, Plewig G. Influence of UVirradiation on the composition of human stratum corneum lipids. J Invest Dermatol. 1991,96(6): 959-962.

201. Wiess S.J.; Klein R.; Slivka A.; Wei. M. Chlorination of taurine by human neutrophils.

202. Evidence for hypochlorous acid generation. J. Clin. Invest. 1982, 70: 598-607.

203. Wiberg N. Lehrbuch der Anorganische Chemie. Berlin-New York: Walter de Gruyter.1985,422-425.

204. Winterbourn C.C., van den Berg J.J., Roitman E., Kuypers F.A. Chlorohydrin formationfrom unsaturated fatty acids reacted with hypochlorous acid. Arch.Biochem.Biophys., 1992,296: 547-555.

205. Winterbourn C.C., Carr A.C. Myeloperoxidase-dependent loss of malondialdehyde: alimitation for detecting neutrophil-mediated lipid peroxidation. Arch.Biochem.Biophys., 1993,302:461-467.

206. Winterbourn C.C., Monteiro H.P., Galilee C.F. Ferritin-dependent lipid peroxidation bystimulated neutrophils: inhibition by myeloperoxidase-derived hypochlorous acid but not by endogenous lactoferrin. Biochim.Biophys.Acta, 1990,1055: 179-185.

207. Winterbourn C.C., Molloy A.L. Susceptibilities of lactoferrin and transferrin to myeloperoxidase-dependent loss of iron-binding capacity. Biochem.J., 1988,250: 613616.

208. Winterbourn C.C. Comparative reactivities of various biological compounds with myeloperoxidase-hydrogen peroxide-chloride, and similarity of the oxidant to hypochlorite. Biochim.Biophys.Acta, 1985,840: 204-210.

209. Winterbourn C.C., Garcia R.C., Segal A.W. Production of the superoxide adduct of myeloperoxidase (compound III) by stimulated human neutrophils and its reactivity with hydrogen peroxide and chloride. Biochem.J., 1985,228: 583-592.

210. Wright A, Bubb WA, Hawkins CL, Davies MJ. Singlet oxygen-mediated protein oxidation: evidence for the formation of reactive side chain peroxides on tyrosine residues. Photochem Photobiol. 2002, 76: 35-46.

211. Wright A, Hawkins CL, Davies MJ. Photo-oxidation of cells generates long-lived intracellular protein peroxides. Free Radic Biol Med. 2003, 34(6): 637-647.

212. Yamashita H., Nakamura A., Noguchi N., Niki E., Ktihn H. Oxidation of low densitylipoprotein and plasma by 15-lipoxygenase and free radicals., FEBS Letters. 1999, 445: 287-290.

213. Zibon V. A., Miller С. C., Cho Y. H. Metabolism of polyunsaturated fatty acids by skinepidermal enzymes: generation of anti-inflammatory and antiproliferative metabolites. Amer. J. Clin. Nutr. 2000, 71: 361 366.

214. Zgliczynsky J.M., Stelmaszynska Т., Domanski J., Ostrowski W. Chloramines asintermediates of oxidation reaction of amino acids by myeloperoxidase. Biochim.Biophys.Acta, 1971,235: 419-424.