Методологические аспекты исследования мутационного статуса генов, участвующих в патогенезе колоректального рака тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат наук Телышева, Екатерина Николаевна

• Телышева, Екатерина Николаевна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Телышева, Екатерина Николаевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Колоректальный рак. Современное состояние проблемы

1.1.1. Этиология и факторы риска колоректального рака

1.1.2. Молекулярный патогенез при колоректальном раке

1.2. Свободно-циркулирующие нуклеиновые кислоты

1.2.1. Биологические свойства свободно-циркулирующих нуклеиновых кислот

1.2.2. Диагностическая значимость определения концентрации сцДНК в плазме крови

1.2.3. Свободно-циркулирующая опухолевая ДНК

1.2.4. Методы детекции генетических изменений в сцДНК плазмы крови

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая характеристика обследованной группы

2.2. Объект исследования

2.3. Методы исследования

2.3.1. Выделение ДНК

2.3.2. Методы анализа мутационного статуса генов

2.3.2.1. Метод мутационно-специфической ПЦР в режиме "реального времени"

2.3.2.2. Метод усиленной аллель-специфическая ПЦР в режиме "реального времени"

2.3.2.3. Метод секвенирования нового поколения (NGS)

2.3.2.4. Метод прямого секвенирования по Сэнгеру

2.3.3. Статистический анализ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-

ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Молекулярно-генетический профиль тканей опухоли

3.2. Анализ частоты и спектра мутаций в генах, участвующих в патогенезе

колоректального рака, проведенный методом N08 в образцах опухолевой ткани

2

3.2.1. Комбинация мутаций в опухолевой ткани больных КРР

3.3. Молекулярно-генетический анализ свободно-циркулирующей опухолевой ДНК

3.3.1. Анализ сцДНК методом усиленной аллель-специфической ПЦР в режиме "реального времени"

3.3.2. Анализ сцДНК методом NGS

3.4. Возможности и ограничения использования сцДНК плазмы крови

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

КРР - колоректальный рак

мКРР - метастатический колоректальный рак

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

сцНК - свободно-циркулирующие нуклеиновые кислоты

сцДНК - свободно-циркулирующая дезоксирибонуклеиновая кислота

цоДНК - циркулирующая опухолевая дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

NGS - next generation sequencing (секвенирование "нового" поколения) COSMIC - catalogue of somatic mutations in cancer - база данных по соматическим мутациям в онкологии

dbSNP - the single nucleotide polymorphism database - база данных однонуклеотидных полиморфизмов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Методологические аспекты исследования мутационного статуса генов, участвующих в патогенезе колоректального рака»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы и степень ее разработанности

Онкологические заболевания являются одной из наиболее распространенных причин смертности людей по всему миру, в том числе и в России. За последнее десятилетие, несмотря на значительные успехи клинической онкологии, смертность от онкологических заболеваний увеличивается [6]. По данным 2012 года, во всем мире от злокачественных новообразований умерло более 8 миллионов человек, что составляет 13% от всего количества смертей [5]. Современная статистика злокачественных новообразований в России показывает, что ежегодно в России от рака умирает около 300 тысяч человек [6].

К настоящему времени достигнуты значительные успехи в профилактике, диагностике и лечении многих видов онкологических заболеваний. Важной составляющей повседневного лечения онкологических больных становятся молекулярно-генетические исследования. Прогресс в области молекулярной биологии привел к пониманию основных механизмов канцерогенеза и опухолевой прогрессии. Наиболее примечательным результатом исследований последних лет в области клинической онкологии стало открытие мутаций, повышающих чувствительность к противоопухолевым препаратам. Были идентифицированы молекулярные мишени, воздействие на которые может остановить процесс пролиферации и, следовательно, прогрессию опухолевого роста. Появилась реальная возможность влиять на эти процессы с помощью новых селективных противоопухолевых препаратов (таргетная терапия).

Чтобы назначить препарат, направленный на клеточную мишень, важно иметь информацию о состоянии этой мишени, т.е. оценить необходимость назначения лекарственной терапии. Это делает актуальным разработку новых чувствительных молекулярно-биологических маркеров, которые будут учитывать индивидуальные особенности организма больного и опухоли.

В настоящее время существует множество молекулярно-биологических маркеров, позволяющих эффективно индивидуализировать не только

лекарственное, но и лучевое лечение злокачественных опухолей. Возможность и эффективность персонифицированного подхода в лечении злокачественных опухолей на основании молекулярно-генетических маркеров была неоднократно продемонстрирована как в ходе небольших пилотных проектов [115], так и при проведении масштабных ретроспективных исследований [53, 112, 120, 133].

Молекулярно-биологические маркеры, используемые для индивидуализированного лечения, могут быть представлены определенными генами, белками или ферментами, идентифицировать которые можно различными методами, позволяющими оценивать их состояние в норме и при патологических процессах в клетке [9].

В повседневной практике молекулярно-генетические исследования для определения чувствительности опухоли к таргетным препаратам, как правило, проводятся на ДНК, выделенной из опухолевых клеток операционного или биопсийного материала. Однако в случае нерезектабельных опухолей или при необходимости назначения неоадъювантной терапии проведение подобных исследований становится проблематичным. В связи с этим возникает необходимость разработки простых неинвазивных методов, позволяющих идентифицировать мутации в генах-маркерах, приоритетных для индивидуализации лекарственной терапии.

Свободно-циркулирующие нуклеиновые кислоты (сцНК) известны уже более 40 лет, однако за последнее десятилетие интерес к ним значительно возрос. Появилось много работ, посвященных теме анализа сцДНК плазмы крови у онкологических больных [29, 65, 155]. Разнообразные молекулярно-генетические нарушения, возникающие в процессе канцерогенеза в ткани опухоли, могут быть выявлены не только в самой опухолевой ткани, но и в плазме или сыворотке крови при анализе сцНК, которые выполняют в данном случае роль онкомаркеров [24, 28, 46, 60]. При этом так называемая "жидкостная биопсия", основанная на исследовании выделенной из плазмы крови сцДНК для обнаружения генетических маркеров, может стать ценным инструментом исследования для диагностики, мониторинга и прогноза онкологических заболеваний [46, 60, 94].

Учитывая вышеизложенное, мы предположили, что продолжение исследований, направленных на изучение молекулярно-генетических нарушений, которые необходимы для поиска и разработки новых опухолевых онкомаркеров, а также методов их детекции, являются актуальными и перспективными.

Цель исследования

Изучить возможности использования ДНК опухоли и свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови для идентификации мутаций в генах, участвующих в патогенезе колоректального рака.

Задачи исследования

1. Провести молекулярно-генетическое исследование генов ЯЛ8-каскада, приоритетных для индивидуализации лекарственной терапии, в ткани опухоли при колоректальном раке;

2. Изучить частоту и спектр мутаций в генах, участвующих в патогенезе колоректального рака, в ткани опухоли с использованием метода высокопроизводительного секвенирования (N08);

3. Изучить возможности метода усиленной аллель-специфической ПЦР для анализа мутаций в генах ЯЛ8-каскада в образцах свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови у больных колоректальным раком.

4. Изучить частоту и спектр мутаций в генах, участвующих в патогенезе колоректального рака, в свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови с использованием метода высокопроизводительного секвенирования (N08);

5. Оценить возможности и ограничения применения свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови для идентификации мутаций у больных колоректальным раком.

Научная новизна

На достаточно большом клиническом материале (355 больных) показано, что частота мутаций в генах ЯЛ8-каскада у больных КРР составляет 48,6%, при этом чаще всего выявляются мутации в гене КЯЛ8, частота которых составила 40,6%. Самые распространенные мутации в гене КЯЛБ - 012Б (39,7%), 013Б (22,6%) и 012У (17%), которая характерна для наиболее агрессивных опухолей.

Впервые в России методом NGS проанализировано 46 образцов опухолевой ткани и выявлены основные молекулярно-генетические нарушения, характерные для патогенеза КРР. Определена диагностическая и прогностическая значимость анализа мутационного статуса генов, участвующих в патогенезе КРР.

Впервые проведен сравнительный анализ сцДНК плазмы крови методом NGS и методом усиленной аллель-специфической ПЦР в реальном времени, разработанным специально для анализа биологических образцов, содержащих небольшое количество мутантной ДНК. Показано, что по чувствительности и информативности метод аллель-специфической ПЦР уступает методу NGS, но является более доступным для применения в клинической лабораторной практике.

Показано, что онкоспецифические изменения в циркулирующей крови до и после проводимого лечения коррелируют со степенью агрессивности опухоли и свидетельствуют о возможном метастазировании, а также позволяют оценивать эффективность терапии и вносить необходимые коррективы в случае развития резистентности к проводимому лечению.

Теоретическая и практическая значимость работы

Исследование мутационного статуса генов, участвующих в патогенезе КРР позволило выявить основные генетические изменения, которые могут быть использованы для разработки онкоспецифических маркеров, позволяющих индивидуализировать лечение злокачественного новообразования.

Анализ мутационного статуса генов RAS-каскада позволяет определять не только показания к таргетной терапии для пациентов с метастатическим КРР, но и индивидуализировать лечебную тактику у пациентов с выявленными мутациями на ранней стадии заболевания.

Исследование сцДНК плазмы крови методами NGS и аллель-специфической ПЦР в реальном времени продемонстрировало реальные перспективы применения «жидкостной биопсии» для диагностики и прогноза онкологических заболеваний.

Полученные данные позволяют рекомендовать для практического применения анализ сцДНК плазмы крови в качестве прогностического теста при индивидуальном мониторинге заболевания, а также в качестве дополнительного метода диагностики онкологических заболеваний в тех случаях, когда процедура биопсии по какой-либо причине трудновыполнима или может вызвать осложнения.

Положения, выносимые на защиту

1. Исследование мутационного статуса генов, участвующих в патогенезе колоректального рака, позволяет проводить отбор, анализ и интерпретацию опухолевых маркеров, позволяющих индивидуализировать лечение злокачественного новообразования.

2. Анализ сцДНК плазмы крови является перспективным прогностическим методом, позволяющим проводить индивидуальный мониторинг заболевания.

Методы и методология научного исследования Работа проводилась на образцах опухолевой ткани, хранящейся в формалин-фиксированных парафиновых блоках (FFPE), и на образцах плазмы крови, взятой до операции и на 5-й день после хирургического лечения. Молекулярно-генетическое исследование мутационного статуса генов анализировали с использованием нескольких методов: метод мутационно-специфической ПЦР в режиме "реального времени", метод усиленной аллель-специфической ПЦР в режиме "реального времени", метод секвенирования нового покления (NGS), метод прямого секвенирования по Сенгеру. Статистическую обработку данных проводили с использованием программных пакетов Statistica 8 (StatSoft, США) и Microsoft Excel 2013. Сравнение вариационных рядов при анализе сцДНК плазмы крови проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни.

Апробация результатов диссертации

Материалы диссертационной работы представлены на Всероссийской

конференции молодых ученых-онкологов "Актуальные вопросы

9

экспериментальной и клинической онкологии", посвященной памяти академика РАМН Н.В. Васильева, Томск, апрель 2014 г.; на конкурсе молодых онкологов на VIII съезде онкологов и радиологов стран СНГ и Евразии, Казань, сентябрь 2014 г.; на II Всероссийской конференции по молекулярной онкологии, Москва, декабрь 2016 г., на конференции "Геномное секвенирование и редактирование", Москва, май 2018 г.

Апробация работы состоялась на совместном заседании научно-практической конференции и совета по апробациям кандидатских диссертаций ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России 13 ноября 2017 года.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Колоректальный рак. Современное состояние проблемы 1.1.1. Этиология и факторы риска колоректального рака

Колоректальный рак (КРР) считается исключительно частой патологией, занимая, по данным ВОЗ, третье место в структуре онкологических заболеваний у мужчин (746 000 случаев или 10% от общего количества) и второе место у женщин (614 000 случаев или 9,2% от общего числа). КРР является также и одной из наиболее частых причин смерти от онкологических заболеваний. Каждый год около 694 000 человек в мире умирают от данного заболевания [32, 144]. В последние десятилетия наблюдается рост заболеваемости КРР. Так, если в 2004 году в России распространенность КРР составляла 147,7 случаев на 100000 населения, то в 2014 году данный показатель увеличился почти в 2 раза и составил 236 случаев на 100000 населения [5, 6].

Несмотря на имеющиеся на сегодняшний день современные диагностические методы, такие как эндоскопические, рентгенологические, лабораторные (анализ кала на скрытую кровь), широко используемые в повседневной практике, а также и высокотехнологичные (КТ, МРТ, ПЭТ,), выявляемость КРР на ранних стадиях (I и II) остается очень низкой на фоне высокой летальности в течение первого года после постановки диагноза. Так, в 2014 году, данные показатели составили 49,0% и 28,4% для прямой кишки и для 43,1% и 24,9% ободочной. По данным российского канцер-регистра в 2014 году было выявлено 61874 случаев КРР, при этом 25% случаев - на IV стадии [6].

Пожилой возраст является одним из основных факторов риска развития КРР. Индивидуальный риск развития данного заболевания может достигать 5-6% в возрасте 50-55 лет и старше, причем он в равной степени касается как мужчин, так и женщин, и удваивается с каждым прожитым десятилетием, становясь особенно заметным после 70-75 лет. При этом средний возраст, при котором диагностируют КРР, составляет 61-63 года [11, 21, 42, 144].

В ряде исследований было показано, что заболеваемость КРР выше в экономически развитых странах, что не противоречит имеющимся данным: КРР отмечается исключительно часто в США, Канаде, Японии, Западной Европе, в то время как его встречаемость, например, в Индии, Китае, Вьетнаме, Африке примерно в 10-20 раз ниже [32]. Как отмечается, причина подобных различий связана, в первую очередь, с характером питания, а именно с преимущественным потреблением мясных продуктов и жиров животного происхождения, а также жареных и копчёных продуктов в экономически развитых странах. В менее богатых странах преобладающую часть рациона, как правило, составляет растительная пища, в частности фрукты и овощи. Предполагают, что чрезмерное питание и недостаточная физическая активность, а также курение могут быть факторами риска развития КРР. Взаимосвязь между избыточной массой тела и вероятностью возникновения заболевания показана во многих исследованиях. Однако при этом хорошо известно, что причиной ожирения может быть не только нарушение баланса между количеством потребляемых продуктов и физической нагрузкой, но и особенности метаболизма [18, 21, 144].

В то время как вклад внешних факторов в формировании риска развития КРР является предметом обсуждения, роль наследственного фактора в патогенезе колоректальных опухолей не вызывает сомнения.

Около 10%-15% всех случаев рака толстой кишки являются семейными и

развиваются из доброкачественных полипозных разрастаний эпителия толстой

кишки. Наряду со спорадическим КРР различают две наследственные формы -

семейный аденоматозный полипоз и наследственный неполипозный

колоректальный рак, в основе которых лежат генетические изменения. Семейный

аденоматозный полипоз - аутосомно-доминантный наследственный синдром,

который характеризуется наличием мутации в гене АРС, кодирующем белок

опухолевой супрессии. Клетки с подобной мутацией приобретают преимущество

в росте, поскольку они пролиферируют быстрее соседних клеток, и возникают

полипы, состоящие из клеток, несущих в своем геноме мутацию гена АРС. Этот

синдром характеризуется развитием большого количества полипов (аденом) на

12

слизистой оболочке толстой кишки с прогрессивным ростом и обязательной малигнизацией при отсутствии своевременного лечения. Полипы появляются в раннем возрасте (как правило, до 40 лет) и локализуются в области перехода толстого кишечника в прямую кишку. Риск развития злокачественных опухолей у этих больных в 18 раз выше, чем в общей популяции. Если больных не подвергнуть лечению, то злокачественная трансформация аденом неизбежна.

Наследственный неполипозный колоректальный рак (ННКРР) или синдром Линча I и II типа является наиболее распространенной формой наследственного КРР, на долю которого приходится около 5-10% всех форм колоректального рака. Предполагают, что причиной возникновения ННКРР являются мутации в ряде генов, локализованных во 2 и 3 хромосомах, однако 95% этих мутаций сосредоточенно в основном в 2-х генах - MLH1 и MSH2. Согласно базе данных Международного Общества по Гастроинтестинальным Наследственным Опухолям (http: //www.insight- group .org) известно более 450 видов различных патогенных мутаций в этих генах, обнаруженных в разных популяциях мира. При этом риск развития КРР при наследственной мутации в любом из этих двух генов составляет 80-85%. Эти гены отвечают за репарацию ДНК («mismatch repair» genes, MMR-гены), а их инактивация проявляется в форме «микросателлитной нестабильности» [4, 110].

У больных с генетическими синдромами предрасположенности к КРР злокачественное поражение толстой кишки возникает уже в молодом возрасте, поэтому они находятся под особым контролем, направленным на раннюю диагностику онкологического заболевания.

1.1.2. Молекулярный патогенез при колоректальном раке

Масштабные фундаментальные исследования последних десятилетий привели к существенному прогрессу в области понимания биологии КРР. Были идентифицированы молекулярные механизмы, которые приводят к трансформации и прогрессированию КРР.

Существует несколько принципиально различных вариантов молекулярного патогенеза КРР, включающих как генетические, так и эпигенетические механизмы. Считается, что первоначальные генетические изменения начинаются еще в ткани аденомы и накапливаются в ней по мере ее превращения в карциному [15]. При этом возникает нестабильность генома, которая инициирует канцерогенез и способствует прогрессии опухолевого процесса.

Общепризнаны три различных пути развития геномной нестабильности при КРР: хромосомная нестабильность (chromosomal instability, CIN), микросателлитная нестабильность (m^resateH^ instability, MSI) и гиперметилирование CpG-островков (метиляторный фенотип, CpG island methylator phenotype, CIMP) [15, 119].

Полагают, хромосомная нестабильность является общей чертой большинства опухолей человека, таких как раки молочной железы, яичника, предстательной железы, желудка, а также более чем для 85% случаев КРР. На молекулярном уровне хромосомная нестабильность характеризуется аллельным дисбалансом и проявляется в виде множественных делеций, амплификаций и перестроек больших участков хромосом [61]. Однако механизмы возникновения хромосомной нестабильности пока изучены недостаточно. Она наблюдается в аденомах еще до перехода в откровенно злокачественную форму новообразования и, по-видимому, является распространенным явлением даже в очень небольших опухолях, возникая уже на ранних этапах колоректального канцерогенеза [15]. Остается также открытым вопрос, является ли хромосомная нестабильность движущей силой злокачественной трансформации аденомы в карциному или же она возникает во время этого процесса и является его следствием.

Помимо хромосомной нестабильности, патогенез КРР характеризуется наличием микросателлитной нестабильности.

"Микросателлиты" - это короткие тандемно повторяющиеся последовательности (длина повтора от одного до шести нуклеотидов), которые разбросаны по всему геному. Микросателлитная изменчивость проявляется либо за счет уменьшения, либо за счет увеличения количества повторов [12].

14

Некоторые опухоли имеют повышенный уровень мутирования микросателлитов в результате нарушения процесса репарации ДНК, вызванного изменениями в системе MMR ("мисс-мэтч репарация"), ферменты которой действуют как дополнительная система для сохранения геномной целостности [15]. Данное явление получило название микросателлитной нестабильности (microsatelHte instability, MSI). Инактивация ферментов системы MMR может происходить либо путем аберрантного метилирования промоторных CpG-островов гена MLH1, либо за счет точечных мутаций в любом члене семейства MMR. О высокой микросателлитной нестабильности говорят в случае нестабильности 30% и более маркеров [110].

Биологическая функция микросателлитов до сих пор не до конца ясна, но они часто используются в качестве генетических маркеров в различных областях биологии и медицины [46].

Микросателлитная нестабильность является отличительной чертой синдрома Линча и наблюдается более чем у 95% этих пациентов, в отличие от 1520% случаев ее при спорадическом КРР [55]. Опухоли с микросателлитной нестабильностью обычно характеризуются отсутствием хромосомной нестабильности, нормальный кариотип в них как правило сохранен [161].

Еще один путь развития геномной нестабильности и, следовательно, третий тип патогенеза КРР, который стали выделять в последнее время, - избыточное метилирование CpG-островков (эпигенетическая нестабильность). При эпигенетической нестабильности регуляция экспрессии ДНК происходит без изменения нуклеотидной последовательности. Обозначение CpG означает цитозин (C), за которым следует гуанин (G), с промежуточной фосфодиэфирной (р) связью между ними. В данной паре цитозин демонстрирует более высокую чувствительность к метилированию. Большим количеством CpG пар характеризуются промоторные (регуляторные) области генов. Аберрантное метилирование промоторных областей генов является столь же существенным фактором, как и инактивация генов-супрессоров посредством мутаций в ДНК [15, 79].

В нормальных клетках CpG-островки обычно находятся в неметилированном состоянии. В отсутствие метилирования ген экспрессируется нормально. При метилировании промоторной области транскрипция гена подавляется (т.е. отключается). "Молчание" гена-супрессора опухоли может быть результатом гиперметилирования промотора, включающего как копии гена-супрессора опухоли, так и комбинацию потери одного аллеля посредством делеции или мутации в сочетании с молчанием другого аллеля посредством гиперметилирования промотора [15]. Положительный метиляторный фенотип часто связан с микросателлитной нестабильностью, так как нарушение метилирования зачастую приводит к инактивации гена системы MMR - MLH1. Как показали многочисленные исследования, аберрантное метилирование гена MLH1 встречается в 80% случаев спорадических КРР с микросателлитной нестабильностью [79, 137, 164]. Наличие значимого статуса гиперметилирования обычно определяют, если присутствует метилирование не менее трех локусов для панели, включающей пять генетических локусов: hMLH1, P16, MINT1, MINT2 и MINT31 ген-ассоциированных CpG-островков [19]. Эпигенетическая нестабильность также может проявляться в тотальном гиперметилировании экзонных и интронных участков генов.

Важным фактором в патогенезе КРР является накопление широкого спектра мутаций (точечные мутации, делеции, инсерции, амплификации) в специфических генах - онкогенах и генах-супрессорах. Данные изменения влияют на регуляцию сигнальных путей, контролирующих ключевые клеточные процессы, приводя к канцерогенезу. Наиболее изученными сигнальными путями, которые участвуют в процессе малигнизации тканей при КРР, являются WNT (APC/Wnt/ß-catenin), EGFR (EGFR/RAS/RAF/MAPK), PI3K (PI3K/AKT/mTOR) и TGF-ß пути [160]. Эти сигнальные пути представляют собой разветвленные цепочки передачи активирующих стимулов, начинающихся с распознавания факторов роста соответствующими рецепторами и заканчивающиеся запуском экспрессии комплекса генов, отвечающих за такие важные процессы, как клеточная

пролиферация, дифференцировка, апоптоз, ангиогенз и инвазия. Патогенез КРР включает как активацию онкогенов, так и инактивацию супрессорных генов.

Сигнальный путь Wnt (APC/Wnt/p-catenin) является одним из важнейших сигнальных путей в клетке и играет огромную роль в развитие как наследственного, так и спорадического КРР. Мутации в этом каскаде связаны с развитием, в первую очередь, рака толстой кишки, а также гепатокарцином и лейкемий. Особый интерес представляет роль данного сигнального пути в поддержании опухоль-инициирующих клеток и метастазировании.

Важную роль в канцерогенезе КРР играет ген APC, являющийся одним из компонентов сигнального пути Wnt. Ген-супрессор опухоли APC обычно блокирует переход клеточного цикла от фазы G1 к S и участвует в процессах клеточной адгезии. Путь передачи сигналов Wnt поддерживает нативные стволовые клетки в их недифференцированном состоянии в основании кишечных криптов, что способствует не только выживанию нормальных стволовых клеток, но также и выживанию раковых стволовых клеток. Ген-супрессор APC мутирует примерно в 30-70% случаев спорадических аденом и аденокарцином, при этом мутации в этом гене часто ассоциированы с семейным аденоматозным полипозом. Большинство (98%) мутаций APC представляют собой либо сдвиг рамки считывания, либо нонсенс-мутации, приводящие к синтезу укороченного белка [15, 23, 36].

в-Катенин является основным звеном в сигнальном пути Wnt. Немутантный ген APC вызывает протеосомную деградацию Р-катенина и, следовательно, функционирует как отрицательный регулятор сигнального пути Wnt. Устойчивые уровни внутриклеточного Р-катенина, локализованного в ядре клетки, приводят к длительной активации пути Wnt в клетках рака прямой кишки с мутантным геном APC [15, 103]. Ген fi-катенина также часто мутирует в клетках КРР. В случаях спорадического КРР с геном APC дикого типа было описано, что гиперметилирование промотора гена APC или точечная мутация в структуре гена Р-катенина объясняют устойчивую активацию сигнального пути Wnt [103].

В нормальной слизистой оболочке толстой кишки стволовые клетки мигрируют из эпителиальных крипт после того, как они дифференцируются, и впоследствии отслаиваются через 3-7 дней после апоптоза. Р-катенин контролирует такое миграционное поведение. У здоровых людей некоторые клетки приобретают различные мутации во время репликации и дифференцировки. Но, так как они обычно отслаиваются менее чем через неделю, у них нет возможности индуцировать процесс канцерогенеза. Накопление Р-катенина в предшественниках энтероцитов из-за инактивации гена APC приводит к сохранению фенотипа стволовых клеток, что предотвращает их миграцию на поверхность для того, чтобы впоследствии отслоиться. Накопление недифференцированных клеток в толстой кишке в конечном итоге приводит к образованию полипа. Накопление последующих дополнительных мутаций с участием таких генов, как KRAS и TP53, может в конечном итоге привести к карциноме [15].

Помимо мутаций в компонентах самого каскада, сигнальный путь Wnt активируется через другие сигнальные пути - MAPK, PI3K, TGF-P и инактивацию белка р53.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Телышева, Екатерина Николаевна, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Васильева И.Н. Роль внеклеточной ДНК в возникновении и развитии злокачественных опухолей и возможности ее использования в диагностике и лечении онкологических заболеваний. / Васильева И.Н., Беспалов В.Г. // Вопросы онкологии. 2013. Т. 59. № 6. С. 673-681.

2. Захаренко А.А. Возможности жидкой биопсии при раке желудка. / Захаренко А.А., Зайцев Д.А., Беляев М.А. и др. // Вопросы онкологии. 2016. Т. 62. №4. С. 379-385.

3. Зборовская И.Б. Современные стратегии исследования маркеров опухолевого роста в клинической практике. / Зборовская И.Б. // Успехи молекулярной онкологии. 2014. Т. 2. С. 4-15.

4. Имянитов Е. Н. Клинико-молекулярные аспекты колоректального рака: этиопатогенез, профилактика, индивидуализация лечения. / Е. Н. Имянитов // Практическая онкология 2005.Т.6, № 2. С. 65-70.

5. Каприн А.Д. Состояние онкологической помощи населению России в 2014 г. / Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. // Москва: МНИОИ им. А.П. Герцена - филиал ФГБЦ "НМИРЦ" Минздрава России, 2014.

6. Каприн А.Д. Злокачественные новообразования в России в 2015 году (заболеваемость и смертность). / Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. // Москва: МНИОИ им. П.А. Герцена филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2017. 978-5-85502-227-8.

7. Кит О. И. Молекулярная биология колоректального рака в клинической практике. / О. И. Кит, Д. И. Водолажский // Молекулярная биология. 2015. Т. 49. №4. С. 531-540.

8. Немцова М.В. Молекулярно-генетический анализ клональной внутриопухолевой гетерогенности в колоректальных карциномах. / Немцова М.В., Пальцева Е.М., Бабаян А.Ю. и др. // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 6. С. 1040-1047.

9. Снеговой А. В. Значение Биомаркеров для определения тактики лечения и прогноза злокачественных опухолей. / Снеговой А. В., Манзюк Л.В. // Практическая онкология. 2011. Т. 12. №. 4. С. 166-170.

10. Тамкович С. Н. Циркулирующие ДНК крови и их использование в медицинской диагностике. / С. Н. Тамкович, В. В. Власов, П. П. Лактионов // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. №1. С. 12-23.

11. Чисов В.И. Руководство по онкологии. / Чисов В.И., Дарьялова С.Л // Москва: Медицинское информационное агенство. 2008. 978-5-8949-1676-0.

12. Abeloff M. D. Clinical Oncology. / Abeloff M. D. // Sutton, UK, Churchill Livingstone, 1995.

13. Agostini M. Circulating cell-free DNA: a promising marker of pathologic tumor response in rectal cancer patients receiving preoperative chemoradiotherapy. / M. Agostini, S. Pucciarelli, M.V. Enzo, et al. // Ann. Surg. Oncol. 2011. V. 18. N. 9. P. 2461-2468.

14. Alix-Panabieres C. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. / Alix-Panabieres C., Pantel K. // Cancer Discov. 2016. V. 6. N. 5. P. 479-91. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-1483. Epub 2016 Mar 11.

15. Armaghany T. Genetic Alterations in Colorectal Cancer / T. Armaghany, J. D. Wilson, Q. Chu, G. Mills // Gastrointest Cancer Res. 2012. V. 5: P. 19-27.

16. Arrington A.K. Prognostic and predictive roles of KRAS mutations in colorectal cancer. / Arrington A.K., Heinrich E.L., Lee W. et al. // Int. J. Mol. Sci. 2012. V.13. P. 12153-12168. doi:10.3390/ijms131012153.

17. Azeem S. Diet and Colorectal Cancer Risk in Asia - a Systematic Review. / Azeem S., Gillani S.W., Siddiqui A. et al. // Asian Pacific journal of cancer prevention. 2015. 16, 13, P. 5389-96.

18. Bai J. Genetic mutations in human rectal cancers detected by targeted sequencing. / Bai J., Gao J., Mao Z. et al. // J Hum Genet. 2015. V. 60. P. 589-96. doi: 10.1038/jhg.2015.71

19. Barault L. Hypermethylator phenotype in sporadic colon cancer: study on a population based series of 582 cases. / Barault L., Charon-Barra C., Jooste V. et al. // Cancer Res. 2008. V. 68. P. 8541-8546.

20. Bidard F.C. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma. / Bidard F.C., Madic J., Mariani P. et al. // Int J Cancer. 2014. V. 134. N. 5. P. 1207-13. doi: 10.1002/ijc.28436. Epub 2013 Sep 3.

21. Boyle P. Epidemiology of colorectal cancer. / P. Boyle, M.E. Leon // Brit. Med. Bull. 2002. V. 64. P. 1-25.

22. Brock G. Liquid biopsy for cancer screening, patient stratification and monitoring. / Brock G., Castellanos-Rizaldos E., Hu L. et al. // Transl Cancer Res. 2015. V. 4. N. 3. P. 280-290.

23. Cai Z.X. APC, FBXW7, KRAS, PIK3CA, and TP53 Gene Mutations in Human Colorectal Cancer Tumors Frequently Detected by Next-Generation DNA Sequencing. / Cai Z.X., Tang X.D., Gao.H.L. et al. // Molecular and Genetic Medicine. 2014. 8:4. DOI: 10.4172/1747-0862.1000145.

24. Chae Y. K.. Concordance between genomic alterations assessed by next-generation sequencing in tumor tissue or circulating cell-free DNA. / Y. K. Chae, A. A. Davis, B. A. Carneiro et al. // Oncotarget. 2016. V. 7. N. 40. P. 65364-65373. doi: 10.18632/oncotarget.11692.

25. Chan K.C. Cancer genome scanning in plasma: detection of tumor-associated copy number aberrations, single-nucleotide variants, and tumoral heterogeneity by massively parallel sequencing. / K.C. Chan, P. Jiang, Y.W. Zheng et al. // Clin. Chem. 2013. V. 59. N. 1. P. 211-24.

26. Chang-Hao T. S. Monitoring response to therapy in melanoma by quantifying circulating tumour DNA with droplet digital PCR for BRAF and NRAS mutations. / Chang-Hao T. S., Weiss J, Hudson C, et al. // Sci Rep. 2015. V. 22. N. 5. 11198. doi: 10.1038/srep11198.

27. Chelobanov B.P. Isolation of nucleic acid binding proteins: an approach for isolation of cell surface, nucleic acid binding proteins. / B.P. Chelobanov, P.P. Laktionov, M.V. Kharkova et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. 1022: 239-243.

28. Chen X. Q. Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. / X. Q. Chen, M. Stroun, J. L. Magnenat et al. // Nat. Med. 1996. V. 2. N. 9. P. 1033-1035.

29. Cheng F. Circulating tumor DNA: a promising baiomarker in the liquid biopsy of cancer. / Cheng F., Su L., Qian C. // Oncotarget. 2016. V. 7. N. 30. P. 4883248841. doi: 10.18632/oncotarget.9453.

30. Choi J. J. The role of macrophages in the in vitro generation of extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells. / J.J. Choi, C.F. Reich, D.S. Pisetsky // Immunology. 2005. V. 115. N. 1. P. 55-62.

31. Choi M. ATM Mutations in Cancer: Therapeutic Implications. / M. Choi, T. Kipps, R. Kurzrock // Mol. Cancer Ther. 2016. V. 15. N. 8. P. 1781-1791.

32. Colorectal Cancer. Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. IARC WHO, 2012 r. globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx.

33. Conlin A. The prognostic significance of K-ras, p53, and APC mutations in colorectal carcinoma. / Conlin A., Smith G., Carey F.A. et al. // Colorectal Cancer. 2005. V. 54. P. 1283-1286. doi: 10.1136/gut.2005.066514.

34. Danielsen S.A. Novel mutations of the suppressor gene PTEN in colorectal carcinomas stratified by microsatellite instability and TP53 mutation status. / Danielsen S.A., Lind G.E., Bjornslett M. et al. // Hum. Mutat. 2008. V. 29. P. 252-262.

35. Dawson S.J. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. / S.J. Dawson, D.W. Tsui, M. Murtaza et al. // N. Engl. J. Med. 2013. V. 368. N. 13. P. 1199-1209.

36. De Filippo C. Mutations of the APC gene in human sporadic colorectal cancers. / C. De Filippo, C. Luceri, G. Caderni, et al // Scand J Gastroenterol. 2002. V. 37. N. 9. P. 1048-53.

37. Delgado P.O. Characterization of cell-free circulating DNA in plasma in patients with prostate cancer. / Delgado P.O., Alves B.C., Gehrke Fde S. et al. // Tumour Biol. 2013. V. 34. N. 2. P. 983-6.

38. Dianxu F. A prospective study of detection of pancreatic carcinoma by combined plasma KRAS mutations and serum CA19-9 analysis. / F. Dianxu, Z. Shengdao, H. Tianquan et al. // Pancreas. 2002. V. 25. N. 4. P. 336-341.

39. Diaz L.A. Jr The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. / L.A. Diaz Jr, R.T. Williams, J. Wu et al. // Nature. 2012. V. 486. N. 7404. P. 537-540.

40. Elshimali Y.I. The clinical utilization of circulating cell free DNA (CCFDNA) in blood of cancer patients. / Elshimali Y.I., Khaddour H., Sarkissyan M. et al. // Int J Mol Sci. 2013. V. 14. N. 9. P. 18925-58. doi: 10.3390/ijms140918925.

41. Esposito A. Liquid biopsies for solid tumors: Understanding tumor heterogeneity and real time monitoring of early resistance to targeted therapies. / Esposito A., Criscitiello C., Locatelli M. et al. // Pharmacol Ther. 2016. V. 157. P. 1204. doi: 10.1016/j.pharmthera.2015.11.007. Epub 2015 Nov 23.

42. Faivre J. Bonithon_Kopp C. Epidemiology and screening of colorectal cancer. / Faivre J., Bouvier A.M. // Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2002. V.16. P. 187199.

43. Fearnhead N.S. Genetics of colorectal cancer: hereditary aspects and overview of colorectal. / Fearnhead N.S., Wilding J.L., Bodmer W.F. // Brit. Med. Bull. 2002. V.64. P. 27-43.

44. Fearon E. R. The deleted in colorectal cancer (DCC) gene: a candidate tumour suppressor gene encoding a cell surface protein with similarity to neural cell adhesion molecules. / Fearon E. R., Pierceall W. E. // Cancer Surv.1995. V. 24. P. 3-17.

45. Fearon E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. / E. R. Fearon // Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 2011. V. 6. P. 479-507.

46. Fleischhacker M. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer - a survey. / M. Fleischhacker, B. Schmidt // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1775. N. 1. P. 181232.

47. Fleming I. N. SMAD2, SMAD3 and SMAD4 Mutations in Colorectal Cancer. / I. N. Fleming, N. R. Jorissen, D. Mouradov et al., // Cancer Res. 2013. V. 75. N . 2. P. 725-35.

48. Forshew T. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. / T. Forshew, M. Murtaza, C. Parkinson et al. // Sci. Transl. Med. 2012. V. 4. N. 136. 136ra68.

49. Frattini M. Quantitative and qualitative characterization of plasma DNA identifies primary and recurrent colorectal cancer. / M. Frattini, G. Gallino, S. Signoroni et al. // Cancer Lett. 2008. V. 263. N. 2. P. 170-181.

50. Gahan P.B. Metabolic DNA as the origin of spontaneously released DNA? / P. B. Gahan, P. Anker, M. Stroun // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2008. 1137:7-17. doi: 10.1196/annals. 1448.046.

51. Gahan P.B. Biology of circulating nucleic acids and possible roles in diagnosis and treatment in diabetes and cancer. / Gahan P.B. // Infect Disord Drug Targets. 2012. V. 12. N. 5. P. 360-370.

52. García-Olmo D.C. Quantitation of cell-free DNA and RNA in plasma during tumor progression in rats. / D.C. García-Olmo, M.G. Picazo, I. Toboso et al. // Mol Cancer. 2013. 12:8. doi: 10.1186/1476-4598-12-8.

53. Garde Noguera J. Role of RAS mutation status as a prognostic factor for patients with advanced colorectal cancer treated with first-line chemotherapy based on fluoropyrimidines and oxaliplatin, with or without bevavizumab: A retrospective analysis. / Garde Noguera J., Jantus-Lewintre E., Gil-Raga M. et al. // Mol Clin Oncol. 2017. V. 6. N. 3. P. 403-408. doi: 10.3892/mco.2017.1149. Epub 2017 Feb 3.

54. Gautschi O. Circulating deoxyribonucleic acid as prognostic marker in nonsmall-cell lung cancer patients undergoing chemotherapy. / O. Gautschi, C. Bigosch, B. Huegli et al. // J. Clin. Oncol. 2004. V. 22. N. 20. P. 4157-4164.

55. Geiersbach K.B. Microsatellite instability and colorectal cancer. / Geiersbach K.B., Samowitz W.S. // Arch Pathol Lab Med. 2011. V. 135. N. 10 P. 1269-1277.

56. Gerlinger M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. / M. Gerlinger, A.J. Rowan, S. Horswell et al. // N. Engl. J. Med. 2012. V. 366. N. 10. P. 883- 892.

57. Gingras I. Liquid biopsy: will it be the 'magic tool' for monitoring response of solid tumors to anticancer therapies? / Gingras I., Salgado R., Ignatiadis M. // Curr Opin Oncol. 2015. V. 27. N. 6. P. 560-567.

58. Gold B. Do circulating tumor cells, exosomes, and circulating tumor nucleic acids have clinical utility? A report of the association for molecular pathology. / B. Gold, M. Cankovic, L.V. Furtado et al. // J. Mol. Diagn. 2015. V. 17. N. 3. P. 209-24.

59. Gonsalves W.I. Alliance for Clinical Trials in Oncology. Patient and tumor characteristics and BRAF and KRAS mutations in colon cancer. / Gonsalves W.I., Mahoney M.R., Sargent D.J. et al. // NCCTG/Alliance N0147. J Natl Cancer Inst. 2014. V.106. N. 7. pii: dju106. doi: 10.1093/jnci/dju106. Print 2014 Jul.

60. González-Masiá J. A. Circulating nucleic acids in plasma and serum (CNAPS): applications in oncology. / J. A. González-Masiá, D. García-Olmo, D. C. García-Olmo // Oncotargets and therapy. 2013. 6:819-32. doi: 10.2147/OTT.S44668.

61. Grady W.M. Genomic and epigenetic instability in colorectal cancer pathogenesis. / Grady W.M., Carethers J.M. // Gastroenterology. 2008. V. 135. P. 10791099.

62. Grady W.M. Genetic and epigenetic alterations in colon cancer. / Grady W.M., Markowitz S.D. // Ann. Rev. Genomics. Hum. Genet. 2002. V. 3. P. 101-128.

63. Hamamoto T. Compound disruption of SMAD2 accelerates malignant progression of intestinal tumors in APC knockout mice. / T. Hamamoto, H. Beppu, H. Okada et al. // Cancer Res. 2002. V. 62. N. 20. P. 5955-61.

64. Hashad D. Free circulating tumor DNA as a diagnostic marker for breast cancer. / D. Hashad, A. Sorour, A. Ghazal et al. // J. Clin. Lab. Anal. 2012. V. 26. N. 6.P. 467-472.

65. Heitzer E. Tumor-associated copy number changes in the circulation of patients with prostate cancer identified through whole-genome sequencing. / E. Heitzer, P. Ulz, J. Belic et al. // Genome Med. 2013. V. 5. N. 4. :30. doi: 10.1186/gm434.

66. Hicks J. K. Cell-free circulating tumor DNA supplementing tissue biopsies for identification of targetable mutations: Implications for precision medicine and considerations for reconciling results. / Hicks J. K., Saller J., Wang E. et al. // Lung Cancer. 2017 Sep;111:135-138. doi: 10.1016/j.lungcan.2017.06.015. Epub 2017 Jun 23.

67. Hindson B.J. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. / Hindson B.J., Ness K.D., Masquelier D.A. et al. // Anal Chem. 2011. V. 83. N. 22. P. 8604-10. doi: 10.1021/ac202028g. Epub 2011 Oct 28.

68. Holdhoff M. Analysis of circulating tumor DNA to confirm somatic KRAS mutations. / M. Holdhoff, K. Schmidt, R. Donehower et al. // J. Natl. Cancer Inst. 2009. V. 101. N. 18. P. 1284-1285.

69. Houlston R.S. What we could do now: molecular pathology of colorectal cancer. / Houlston R.S. // Mol. Pathol. 2001. V. 54. P. 206-214.

70. Iacopetta B. BRAF mutation and gene methylation frequencies of colorectal tumours with microsatellite instability increase markedly with patient age. / Iacopetta B., Li W.Q., Grieu F. et al. // Gut. 2006. V. 55. N. 8. P. 1213-1214.

71. Ilyas M. b-Catenin mutations in cell lines established from human colorectal cancers. / M. Ilyas, I. P. M. Tomlinson, A. Rowan et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1997. V. 94. N. 19. P. 10330-10334.

72. Jacobs E.L. Clinical use of tumor markers in oncology. / E.L. Jacobs, C.M. Haskell // Curr. Probl. Cancer. 1991. V. 15. N. 6. P. 299-360.

73. Juckett D. A. Actions of cis-diamminedichloroplatinum on cell surface nucleic acids in cancer cells as determined by cell electrophoresis techniques. / D.A. Juckett, B. Rosenberg // Cancer Res. 1982. V. 42. N. 9 P. 3565-3573.

74. Jung K. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker - a critical appraisal of the literature. / K. Jung, M. Fleischhacker, A. Rabien // Clin. Chim. Acta. 2010. V. 411. N. 21-22. P. 1611-1624.

75. Kaisaki P.J. Targeted next-generation sequencing of plasma DNA from cancer patients: factors influencing consistency with tumour dna and prospective investigation of its utility for diagnosis. / Kaisaki P.J., Cutts A., Popitsch N. et al. //

129

PLoS One. 2016. V. 11. N. 9. e0162809. doi: 10.1371/journal.pone.0162809. eCollection 2016.

76. Kaler P. Activating Mutations in b-Catenin in Colon Cancer Cells Alter Their Interaction with Macrophages; the Role of Snail. / P. Kaler, L. Augenlicht, L. Klampfer // PLoS ONE. 2012. V. 7. N. 9. dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0045462.

77. Kim K. Circulating cell-free DNA as a promising biomarker in patients with gastric cancer: diagnostic validity and significant reduction of cfDNA after surgical resection. / Kim K., Shin D.G., Park M.K. et al. // Ann Surg Treat Res. 2014. V. 86. N. 3. P. 136-142.

78. Kohler C. Cell-free DNA in the circulation as a potential cancer biomarker. / Kohler C., Barekati Z., Radpour R. et al. // Anticancer Res. 2011. V. 31. N. 8. P. 26238.

79. Kondo Y. Epigenetic changes in colorectal cancer. / Kondo Y., Issa J.P. // Cancer Metastasis Rev. 2004. V. 23. P. 29-39.

80. Kopreski M.S. Somatic mutation screening: identification of individuals harboring KRAS mutations with the use of plasma DNA. / M.S. Kopreski, F.A. Benko, D.J. Borys et al. // J. Natl. Cancer Inst. 2002 V. 92. N. 11. P. 918-923.

81. LaFramboise T. Single nucleotide polymorphism arrays: a decade of biological, computational and technological advances. / T. LaFramboise // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. N. 13. P. 4181-93.

82. Laktionov P.P. Cell-surface-bound nucleic acids: free and cell-surface-bound nucleic acids in blood of healthy donors and breast cancer patients. / P.P. Laktionov, S.N. Tamkovich, E.Y. Rykova et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. 1022: 221-227.

83. Laktionov P. P. Extracellular circulating nucleic acids in human plasma in health and disease. / P. P. Laktionov, S. N. Tamkovich, E. Y. Rykova et al. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. V. 23. N. 6-7. P. 879-883.

84. Lane D. P. p53: oncogene or antioncogene? / Lane D. P., Benchimol S. // Genes Dev. 1990. V. 4. N. 1. P. 1- 8.

85. Langlois M.J. The PTEN phosphatase controls intestinal epithelial cell polarity and barrier function: role in colorectal cancer progression. / Langlois M.J.,

130

Bergeron S., Bernatchez G. et al. // PLoS ONE. 2010. V. 5. N. 12. e15742. doi: 10.1371/journal.pone.0015742.

86. Leary R.J. Detection of chromosomal alterations in the circulation of cancer patients with whole-genome sequencing. / R.J. Leary, M. Sausen, I. Kinde et al. // Sci. Transl. Med. 2012. V. 4. N. 162: 162ra154.

87. Leon S.A. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. / S.A. Leon, B. Shapiro, D.M. Sklaroff et al. // Cancer Res. 1977. V. 37. N. 3. P. 646650.

88. Li X. L. p53 mutations in colorectal cancer- molecular pathogenesis and pharmacological reactivation. / X. L. Li, J. Zhou, Z. R. Chen et al. // World J. Gastroenterol. 2015. V. 21. N. 1. P. 84-93.

89. Lièvre A. KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. / Lièvre A., Bachet J. B., Boige V. et al. //J Clin Oncol. 2008. V. 26. N. 3. P. 374-379.

90. Luis A., Diaz L. A. Jr, Bardelli A. Liquid Biopsies: Genotyping Circulating Tumor DNA. // J. Clin. Oncol. 2014. V. 32. N. 6. P. 579-586.

91. Lupini L. Prediction of response to anti-EGFR antibodybased therapies by multigene sequencing in colorectal cancer patients. / L. Lupini, P. Vychytilova-Faltejskova, O. Slaby et al. // BMC Cancer. 2015. 15:808. doi: 10.1186/s12885-015-1752-5.

92. Mäbert K. Cancer biomarker discovery: current status and future perspectives. / K. Mäbert, M. Cojoc, C. Peitzsch, et al. // Int. Radiat. Biol. 2014. V. 90. N. 8. P. 65977.

93. Maebo A. Plasma DNA level as a tumor marker in primary lung cancer. / A. Maebo // Nihon Kyobu Shikkan Gakkai Zasshi. 1990. V. 28. N. 8. P. 1085-1091.

94. Ma M. "Liquid biopsy" - ctDNA detection with great potential and challenges. / M. Ma, H. Zhu, C. Zhang, et al. // Ann. Transl. Med. 2015. V. 3. N. 16: 235.

95. Malapelle U. Less frequently mutated genes in colorectal cancer: evidences from next-generation sequencing of 653 routine cases. / Malapelle U., Pisapia P.,

131

Sgariglia R. et al. // Journal of Clinical Pathology. 2016. V. 69. N. 9. P. 767-771. doi: 10.1136/jclinpath-2015-203403.

96. Manne U, Jadhav T, Putcha BK. Molecular Biomarkers of Colorectal Cancer and Cancer Disparities: Current Status and Perspective. Curr Colorectal Cancer Rep. 2016. V. 12. N. 6. P. 332-344.doi: 10.1007/s11888-016-0338-1.

97. Markowitz S. Inactivation of the type II TGF-beta receptor in colon cancer cells with microsatellite instability. / Markowitz S., Wang J., Myeroff L. et al. // Science. 1995. V. 268. N. 5215. P. 1336-1338.

98. Marzese D.M. Diagnostic and prognostic value of circulating tumor-related DNA in cancer patients. / Marzese D.M., Hirose H., Hoon D.S. // Expert Rev Mol Diagn. 2013. V. 13. N. 8. P. 827-44. doi: 10.1586/14737159.2013.845088. Epub 2013 Oct 16.

99. Mehlen P. Role of the dependence receptor DCC in colorectal cancer pathogenesis. / Mehlen P., Fearon E. R. // J. Clin. Oncol. 2004. V. 22. N. 16. P. 3420-8.

100. Meyer L. A. Endometrial cancer and Lynch syndrome: clinical and pathologic. / L. A. Meyer, R. R. Broaddus, K. H. Lu // Cancer Control. 2009. V. 16. N. 1. P. 14-22.

101. De Miranda N. F. Transforming Growth Factor ß Signaling in Colorectal Cancer Cells With Microsatellite Instability Despite Biallelic Mutations in TGFBR2. / de Miranda N. F., van Dinther M., van den Akker B. E. et al. // Gastroenterology. 2015. V. 148. N. 7. P. 1427-37.

102. Misale S. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. / S. Misale, R. Yaeger, S. Hobor et al. // Nature. 2012. V. 486. N. 7404. P. 532-536.

103. Morin P. J. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. / P. J. Morin, A. B. Sparks, V. Korinek et al. // Science. 1997. V. 275. N. 5307. P. 1787-1790.

104. Moran A. Differential colorectal carcinogenesis: Molecular basis and clinical relevance. / A. Moran, P. Ortega, C. Juan et al., // World J Gastrointest Oncol. 2010. V. 2. N. 3. P. 151-158.

105. Mouliere F. High Fragmentation Characterizes Tumour-Derived Circulating DNA. / Mouliere F., Robert B., Peyrotte E. A. et al. / PLoS One. 2011. V. 6. N. 9. e23418.

106. Murtaza M. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. / M. Murtaza, S.J. Dawson, D.W. Tsui et al. // Nature. 2013. V. 497. N. 7447. P. 108-112.

107. Nawroz-Danish H. Microsatellite analysis of serum DNA in patients with head and neck cancer. / H. Nawroz-Danish, C.F. Eisenberger, G.H. Yoo et al. // Int. J. Cancer. 2004 V. 111. N. 1. P. 96-100.

108. NCCN Guidelines Version 2.2017. Colon Cancer. Clinical Practice Guidelines in Oncology.

109. Di Nicolantonio F. Wild type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer. / Di Nicolantonio F., Martini M., Molinari F. et al. // J. Clin. Oncol. 2008.V. 26. P. 5705-5712.

110. Ogino S. Molecular correlates with MGMT promoter methylation and silencing support CpG island methylator phenotype-low (CIMP-low) in colorectal cancer. / Ogino S, Kawasaki T, Kirkner GJ, et al // Gut. 2007 V. 56. N. 11. P. 1564-71. Epub 2007 Mar 5.

111. Ogino S. PIK3CA mutation is associated with poor prognosis among patients with curatively resected colon cancer. / Ogino S., Nosho K., Kirkner G.J. et al. // J Clin Oncol. 2009. V. 27. N. 9. P. 1477-1484.

112. Oliner K. Analysis of KRAS/NRAS and BRAF mutations in the phase III PRIME study of panitumumab (pmab) plus FOLFOX versus FOLFOX as first-line treatment (tx) for metastatic colorectal cancer (mCRC). / Oliner K, Douillard JY, Siena S et al. // ASCO. 2013. (poster discussion): 3511.

113. Overman M.J. Use of research biopsies in clinical trials: Are risks and benefits adequately discussed? / M.J. Overman, J. Modak, S. Kopetz et al. // J. Clin. Oncol. 2013. V. 31. N. 1. P. 17-22.

114. Paci M, Circulating plasma DNA as diagnostic biomarker in non-small cell lung cancer. / M. Paci, S. Maramotti, E. Bellesia et al. // Lung Cancer. 2009. V. 64. N. 1. P. 92-97.

115. Paez J.G. EGFR Mutations in Lung Cancer: Correlation with Clinical Response to Gefitinib Therapy. / Paez J.G., Pasi A.J., Jeffrey C.L. et al. // Science. 2004. V. 304. N. 5676. P. 1497-500.

116. Park J.L. Quantitave analisys of cell-free DNA in the plasma of gastric cancer patients. / Park J.L., Kim H.J., Choi B.Y. et al. // Oncol Lett. 2012. V. 3. N. 4. P. 921-6. doi:10.3892/ol.2012.952.

117. Parsons D.W. Colorectal cancer: mutations in a signalling pathway. / Parsons D.W., Wang T.L., Samuels Y. et al. // Nature. 2005. V. 436. P. 792.

118. Patel K.M. The translational potential of circulating tumour DNA in oncology. / K.M. Patel, D.W. Tsui // Clin. Biochem. 2015. V. 48. N. 15. P. 957-961.

119. Pino S. M. The chromosomal instability pathway in colon cancer. / S. M. Pino, C. D. Chung // Gastroenterology. 2010. V. 138. N. 6. P. 2059-2072.

120. Peeters M. Mutant (MT) KRAS codon 12 and 13 alleles in patients (pts) with metastatic colorectal cancer (mCRC): assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab (pmab). / Peeters M., Douillard J.Y., Van Cutsem E. et al. // Program and abstracts of the 2012 Gastrointestinal Cancers Symposium. 2012. San Francisco, California. Abstract 383.

121. Pekin D. Quantitative and sensitive detection of rare mutations using droplet-based microfluidics. / Pekin D., Skhiri Y., Baretr J.C. et al. // Lab Chip. 2011. V. 11. N. 13. P. 2156-66. doi: 10.1039/c1lc20128j. Epub 2011 May 19.

122. Popat S. A systematic review and meta-analysis of the relationship between chromosome 18q genotype, DCC status and colorectal cancer prognosis. / S. Popat, R. S. Houlston // Eur. J. Cancer. 2005. V. 41. N. 14. P. 2060-2070.

123. Qin Z. Cell-free circulating tumor DNA in cancer. / Qin Z, Ljubimov VA, Zhou C et al. // Chin J Cancer. 2016 V. 7. 35:36. doi: 10.1186/s40880-016-0092-4.

124. Rachiglio A. M. Limits and potential of targeted sequencing analysis of liquid biopsy in patients with lung and colon carcinoma. / A. M. Rachiglio, R. E. Abate, A. Sacco // Oncotarget. 2016. V. 7. N. 41. P. 66595-66605.

125. Razis E. Potential value of PTEN in predicting cetuximab response in colorectal cancer: an exploratory study. / Razis E., Briasoulis E., Vrettou E. et al. // BMC Cancer. 2008. V. 8. P. 234.

126. Riedinger J.M. CA-125 half-life and CA-125 nadir during induction chemotherapy are independent predictors of epithelial ovarian cancer outcome: Results of a French multicentric study. / J.M. Riedinger, J. Wafflart, G. Ricolleau et al. // Ann. Oncol. 2006 V. 17. N. 8. P. 1234-1238.

127. De Roock W. KRAS, BRAF, PIK3CA, and PTEN mutations: implications for targeted therapies in metastatic colorectal cancer. / De Roock W., De Vriendt V., Normanno N. et al. // Lancet Oncol. 2011. V. 12. P. 594-603.

128. Rosty C. PIK3CA activating mutation in colorectal carcinoma: Associations with molecular features and survival. / C. Rosty, J. P. Young, M. D. Walsh et al. // PLoS ONE. 2013. V. 8. N. 6. e65479. doi: 10.1371/journal.pone.0065479.

129. Samuels Y. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. / Samuels Y., Wang Z., Bardelli A. et al: // Science. 2004. V. 304. N. 5670. P. 5527-554.

130. Salvianti F. Multiparametric analisys of cell-free DNA in melanoma patients. / Salvinati F., Pinzani P., Verderio P. et al. // PLoS One. 2012. V. 7. N. 11. e49843. doi: 10.1371/journal.pone.0049843. Epub 2012 Nov 27.

131. Sarshekeh A. M. Association of SMAD4 mutation with patient demographics, tumor characteristics, and clinical outcomes in colorectal cancer. / A. M. Sarshekeh, S. Advani, J. M. Overman et al. // PLoS ONE. 2017. V. 12. N. 3. :e0173345. doi: 10.1371/journal.pone.0173345. eCollection.

132. Schutz E. Bov-tA short interspersed nucleotide element sequences in circulating nucleic acids from sera of cattle with bovine spongiform encephalopathy (BSE) and sera of cattle exposed to BSE. / E. Schutz, H.B. Urnovitz, L. Iakoubov et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2012. V. 12. N. 7. P. 814-820.

133. Schwartzberg L.S. PEAK (study 20070509): A randomized phase II study of mFOLFOX6 with either panitumumab (pmab) or bevacizumab (bev) as ferst-line treatment (tx) in patients (pts) with unresectable wild type (WT) KRAS metastatic colorectal cancer (mCRC). Schwartzberg L.S., Rivera F., Karthaus M. et al. // Clin Oncol. 2013. 30 (Suppl 34) P. 446.

134. Schwarzenbach H. Detection and characterization of circulating microsatellite-DNA in blood of patients with breast cancer. / Schwarzenbach H., Müller V., Stahmann N. et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. 1022: 25-32.

135. Schwarzenbach H. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. / H. Schwarzenbach, D.S. Hoon, K. Pantel // Nat. Rev. Cancer. 2011. V. 11. N. 6. P. 426437.

136. Schell M.J. A multigene mutation classification of 468 colorectal cancers reveals a prognostic role for APC. / Schell M.J., Yang M., Teer J.K. et al. // Nature Communications. 2016. 7:11743. doi: 10.1038/ncomms11743.

137. Shen L. Integrated genetic and epigenetic analysis identifies three different subclasses of colon cancer. / Shen L., Toyota M., Kondo Y. et al. // Proc Natl Acad Sci. 2007. V. 104. N. 47. P. 18654-18659.

138. Shu X.O. Novel genetic markers of breast cancer survival identified by a genome-wide association study. / X.O. Shu, J. Long, W. Lu et al. // Cancer Res. 2012. V. 72. N. 5. P. 1182-9.

139. Sinicrope F.A. Association of DNA Mismatch Repair and Mutations in BRAF and KRAS With Survival After Recurrence in Stage III Colon Cancers : A Secondary Analysis of 2 Randomized Clinical Trials. / Sinicrope F.A., Shi Q., Allegra C.J. et al. // JAMA Oncol. 2017. V. 3. N. 4. P. 472-480. doi: 10.1001/jamaoncol.2016.5469.

140. Siravegna G. Clonal evolution and resistance to EGFR blockade in the blood of colorectal cancer patients. / Siravegna G., Mussolin B., Buscarino M. et al. // Nat. Med. 2015. V. 21. N. 7. 827. doi: 10.1038/nm0715-827b.

141. Slattery L. M. TCF7L2 polymorphism and colon cancer. / L. M. Slattery, R. A. Folsom, R.Wolff // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008. V. 17. N. 4. P. 978982.

142. Soussi T. TP53: an oncogene in disguise. / T. Soussi, K. G. Wiman // Cell Death Differ. 2015. V. 22. N. 8. P. 1239-1249.

143. Stec R. Mutation of the PIK3CA gene as a prognostic factor in patients with colorectal cancer. / R. Stec, A. Semeniuk-wojtas, R. Charkiewicz et al. // Oncology Letters. 2015. V. 10. N. 3. P. 1423-1429.

144. Stewart B.W. World cancer report. / Stewart, B.W., Wild C.P. // Lyon : IARC, 2014. 978-92-832-0432-9.

145. Stroun M. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients. / M. Stroun, P. Anker, P. Maurice et al. // Oncology. 1989. V. 46. N. 5. P. 318-322.

146. Stroun M. About the possible origin and mechanism of circulating DNA apoptosis and active DNA release. / M. Stroun, J. Lyautey, C. Lederrey et al. // Clin. Chim. Acta. 2001. V. 313. N. 1-2. P. 139-142.

147. Sunami E. Multimarker circulating DNA assay for assessing blood of prostate cancer patients. / E. Sunami, M. Shinozaki, C.S. Higano et al. // Clin. Chem. 2009. V. 55. N. 3. P. 559-567.

148. Szpechcinski A. Quantitative analysis of free-circulating DNA in plasma of patients with resectable NSCLC. / A. Szpechcinski, J. Chorostowska-Wynimko, W. Kupis et al. // Expert Opin. Biol. Ther. 2012. 12 Suppl 1:S3-9. doi: 10.1517/14712598.2012.668519.

149. Tamkovich S. N. Circulating nucleic acids in blood of healthy male and female donors. / S. N. Tamkovich, O. E. Bryzgunova, E.Y. Rykova et al. // Clin. Chem. 2005. V. 51. N. 7. P. 1317-1319.

150. Tejpar S. Influence of KRAS G13D mutations on outcome in patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) treated with first-line chemotherapy with or without cetuximab. / Tejpar S., Bokemeyer C., Celik I., et al. // Clin Oncol. 2012. 30 29: P. 3570-7.

151. Therkildsen C. The predictive value of KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA and PTEN for anti-EGFR treatment in metastatic colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis. / C. Therkildsen, T. K. Bergmann, T. Henrichsen-Schnack et al.// Acta Oncol. 2014. V. 53. N. 7. P. 852-864.

152. Thiery JP: Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nat Rev Cancer. 2002. V. 2. N. 6. P. 442-454.

153. Thomsen M. Health-related quality of life in patients with metastatic colorectal cancer, association with systemic inflammatory response and RAS and BRAF mutation status. /Thomsen M, Guren MG, Skovlund E et al. // Eur J Cancer. 2017 V. 81. P. 26-35. doi: 10.1016/j.ejca.2017.04.026. Epub 2017 Jun 6.

154. Tomioka N. Array comparative genomic hybridization analysis revealed four genomic prognostic biomarkers for primary gastric cancers. / N. Tomioka, K. Morita, N. Kobayashi et al. // Cancer Genet. Cytogenet. 2010. V. 201. N. 1. P. 6-14.

155. Tu M. Liquid biopsy for etection of actionable oncogenic mutations in human cancers and electric field induced release and measurement liquid biopsy (eLB). / M. Tu, D. Chia, F. Wei et al. // Analyst. 2016. V. 141. N. 2. P. 393-402.

156. Varghese M. A. BRAF mutation as a biomarker in colorectal cancer. / M. A. Varghese, B. L. Saltz // Advances in Genomics and Genetics. 2015. P. 347-353.

157. Vasioukhin V. Point mutations of the NRAS gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia. / V. Vasioukhin, P. Anker, P. Maurice et al. // Br. J. Haematol. 1994. V. 86. N. 4. P. 774779.

158. Vogelstein B. Cancer genome landscapes. / B. Vogelstein, N. Papadopoulos, V.E. Velculescu et al. // Science. 2013. V. 339. N. 6127. P. 1546-1558.

159. Vogelstein B. Genetic alterations during colorectal_tumor development. / Vogelstein B., Fearon E.R., Hamilton S.R. et al. // New Engl. J. Med. 1988. V. 319. P. 525-532.

160. Walther A. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. / Walther A., Johnstone E., Swanton C. et al. // Nat. Rev. Cancer. 2009. V. 9. P. 489-499.

161. Wang Y. Rapamycin inhibits FBXW7 loss-induced epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell-like characteristics in colorectal cancer cells. / Wang Y., Liu Y., Lu J. et al. // Biochem Biophys Res Commun. 2013. V. 434. P. 356-6.

162. Wang Y. Dystrophin Is a Tumor Suppressor in Human Cancers with Myogenic Programs. / Wang Y., Marino-Enriquez A., R. R. Bennett et al. // Nat Genet. 2014. V. 46. N. 6. P. 601-606.

163. Weber A. M. ATM and ATR as therapeutic targets in cancer. / A. M. Weber, A. J. Ryan // Pharmacol. Ther. 2015. V. 149. P. 124-38. doi: 10.1016/j.pharmthera.2014.12.001.

164. Weisenberger D.J. CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer. / Weisenberger D.J., Siegmund K.D., Campan M., et al. // Nat Genet. 2006. V. 38. N. 7. P.787-793.

165. Winther-Larsen A. Correlation between circulating mutant DNA and metabolic tumour burden in advanced non-small cell lung cancer patients. / Winther-Larsen A., Demuth C., Fledelius J. et al. // Br J Cancer. 2017 Aug 22;117(5):704-709. doi: 10.1038/bjc.2017.215. Epub 2017 Jul 6.

166. Yao Y. Detection of circulating tumor DNA in patients with advanced non-small cell lung cancer. / Yao Y., Liu J., Li L. et al. // Oncotarget. 2017 Jan 10;8(2):2130-2140. doi: 10.18632/oncotarget.12883.

167. Yin Y. PTEN: a new guardian of the genome. / Yin Y, Shen W.H. // Oncogene. 2008. V. 27. N. 41. P. 5443-5453.

168. Yokobori T. FBXW7 mediates chemotherapeutic sensitivity and prognosis in NSCLCs. / Yokobori T., Yokoyama Y., Mogi A. et al. // Mol Cancer Res. 2014. V 12. P. 32-7. doi: 10.1158/1541 -7786.MCR-13-0341.

169. Yu S.C. High-resolution profiling of fetal DNA clearance from maternal plasma by massively parallel sequencing. / Yu S.C., Lee S.W., Jiang P. et al. // Clin Chem. 2013. V. 59. N. 8. P. 1228-37. doi: 10.1373/clinchem.2013.203679. Epub 2013 Apr 19.

170. Zhai R. Genome-wide DNA methylation profiling of cell-free serum DNA in esophageal adenocarcinoma and Barrett esophagus. / Zhai R., Zhao Y., Su l. et al. // Neoplasia. 2012. V. 14. N. 1. P. 29-33.