Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Чеканова, Татьяна Александровна

• Чеканова, Татьяна Александровна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чеканова, Татьяна Александровна

Введение

1. Обзор литературы.

1.1. Этиология ВИЧ-инфекции.

1.2. Иммунная система при ВИЧ-инфекции. Иммунопатогенез.

1.3. Современное состояние проблемы разработки вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД

1.4. Подходы к разработке вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД. Состав анти-ВИЧ-иммуногенов.

1.5. Методологические подходы для лабораторной оценки кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД.

2. Материалы и методы.

2.1. Кандидатные вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД.

2.1.1. Кандидатная вакцина «ВИЧРЕПОЛ».

2.1.2. Кандидатная вакцина «ТВ1-ВПЧ для инъекций».

2.1.3.Кандидатная вакцина «КомбиВИЧвак».

2.1.4. Кандидатная вакцина «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитории».

2.2. Коммерческие тест-системы.

2.3 .Сыворотки крови человека и стандартные образцы для оценки подлинности кандидатных-вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД.

2.4. Рекомбинантные антигены ВИЧ.

2.5. Лабораторные животные.

2.6. Методы.

2.6.1 Методика проведения непрямого ИФА для подтверждения ВИЧ-специфической антигенной активности (подлинности) кандидатных вакцин по реактивности вакцинных антигенов с сыворотками крови человека.

2.6.2.Методика проведения «сэндвич»-ИФА для подтверждения ВИЧ-специфической антигенной активности (подлинности) кандидатных вакцин «ТВ1-ВПЧ для инъекций» и «КомбиВИЧвак»

2.6.3. Изучение гуморального ответа у мышей после однократной иммунизации на иммуносорбентах с гомологичным вакцинным антигеном.g.

2.6.4. Изучение динамики индукции антител класса G у мышей после двукратной иммунизации кандидат-вакцинами на иммуносорбентах с гомологичным вакцинным антигеном.

2.6.5. Изучение уровня антител класса G у иммунизированных мышей кандидатными вакцинами «ВИЧРЕПОЛ», «КомбиВИЧвак», «ТВ1-ВПЧ для инъекций» к индивидуально иммобилизованным рекомбинантным белкам Env, Gag и на иммуносорбенте (Env+Gag).

2.6.6. Методика изучения иммунореактивности антител в сыворотках крови иммунизированных мышей с рекомбинантными белками (пептидами) иммуносорбентов коммерческих ИФА-тест-систем.

2.6.7. Методика изучения спектра антител в сыворотках крови иммунизированных и интактных мышей в иммунном блоттинге.

2.6.8. Методика изучения антиген-связывающей активности сывороток мышей, иммунизированных «ВИЧРЕПОЛ», в конкурентном ИФА в коммерческих тест-системах, выявляющих антиген р24 ВИЧ

2.6.9. Реакция вирусной нейтрализации.

2.6.10. Изучение ВИЧ-специфической индукции цитотокин-продуцирующих клеток у ммунизированных мышей методом ELISPOT

2.6.11. Определение ВИЧ-специфических йзотипов IgGl и IgG2a в сыворотках крови иммунизированных мышей.

2.6.12. Статисическая обработка результотов.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Доклиническое изучение кандидат-вакцины «ВИЧРЕПОЛ».

3.1.1. Определение ВИЧ-специфической антигенной активности вакцины «ВИЧРЕПОЛ» методом непрямого ИФА.

3.1.2. Оценка гуморального ответа у иммунизированных однократно «ВИЧРЕПОЛ» мышей на гомологичный антиген.

3.1.3. Определение антител класса G в сыворотках крови мышей, ммунизированных двукратно «ВИЧРЕПОЛ», на гомологичный вакцинный антиген. 3.1.4. Изучение иммунореактивности антител в сыворотках крови иммунизированных «ВИЧРЕПОЛ» мышей с рекомбинантными белками/пептидами на иммуносорбентах коммерческих тест-систем, выявляющих антитела к ВИЧ.

3.1.5. Изучение спектра антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных двукратно «ВИЧРЕПОЛ», методом иммунного блоттинга.

3.1.6. Исследование специфической антиген-связывающей активности сывороток крови мышей, иммунизированных «ВИЧРЕПОЛ», в конкурентном ИФА в тест-системах, выявляющих антиген р

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД»

Актуальность работы

По оценке ВОЗ и ООН по СПИДу (UNAIDS) ежедневно в мире регистрируется около 16000 новых случаев инфицирования ВИЧ. Общее количество ВИЧ-инфицированных насчитывает более 70 млн человек, из них умерло более 22 млн человек [160]. СПИД - терминальная фаза ВИЧ-инфекции - явился основной причиной смертности населения ряда стран Центральной и Южной Африки [30, 31, 61]. В начале 90-х годов прошлого века эксперты ВОЗ пришли к официальному заключению, что ВИЧ-инфекция, захватив практически все страны мира, приняла характер пандемии. В России в последние годы отмечается высокий уровень .распространения ВИЧ-инфекции [14]. По данным Роспотребнадзора, на 15 ноября 2005 года в России зарегистрировано 335 тысяч 795 случаев ВИЧ-инфекции, из них 1 тысяча 727 детей в возрасте до 14 лет. 80% ВИЧ-инфицированных - молодые люди в возрасте от 15 до 30 лет (www. rian.ru).

Постоянный рост инфицированности ВИЧ делает проблему разработки и испытания анти-ВИЧ/СПИД-вакцин одной из важнейших в здравоохранении. Безопасные и эффективные вакцины (профилактические и терапевтические) считаются наиболее перспективным средством контроля пандемии ВИЧ-инфекции/СПИД [167]. К разработке и испытаниям кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД привлечены ведущие научные центры, общественные организации, международные и национальные фонды. Общая координация деятельности осуществляется ВОЗ и ООН. Важность интеграции усилий мирового научного сообщества по созданию анти-ВИЧ/СПИД-вакцин подчеркнута на самом высоком международном уровне. На совещании лидеров государств-участников Большой восьмерки 8-10 июня 2004 года в США одобрена глобальная инициатива («AIDS Vaccine Enterprise»), направленная на ускорение разработки вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД [71].

Для успешной работы в области разработки вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД необходима единая комплексная система создания, контроля и испытаний иммуногенов и вакцин, которая обеспечивала бы безопасность проведения всех этапов тестирования в соответствии со стандартами GLP и GCP [4, 5, 6]. ВОЗ и UNAIDS - ведущие координаторы исследований в области разработки кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции - считают одним из важнейших направлений создание комплексна единых и стандартизованных методов для адекватного анализа результатов, полученных различными научными центрами в ходе доклинических и клинических испытаний. В рамках глобальной инициативы «AIDS Vaccine Enterprise» предусмотрена поддержка работ по стандартизации лабораторных тест-систем для сравнения результатов испытаний, проводимых в различных странах, и создание единой системы клинических испытаний.

Создание единой системы доклинических испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД является важным звеном в подготовке к клиническим исследованиям. Формирование системы контроля на лабораторном уровне вакцин против ВИЧ/СПИД в России начато в рамках Межведомственной научно-технической программы «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» одновременно с доклиническими исследованиями препаратов.

Программа доклинического изучения - комплекс исследований, включающий идентификацию антигенов, адъювантов и векторов, определение безвредности и иммуногенности вакцины на модели лабораторных животных, создание пилотного производства и выпуск образцов кандидатной вакцины в соответствии с правилами GMP, стандартизацию методов контроля подлинности и специфической активности. О стандартизации исследования свидетельствует воспроизводимость методов и полученных результатов при аттестации разных экспериментальных серий вакцины (как минимум трех). Наиболее информативные методы контроля должны быть подробно описаны и внесены в соответствующую нормативную документацию - ФСП, которая окончательно должна утверждаться после успешного проведения всех этапов клинических испытаний [11]. Кроме того, они позволят не только адекватно сравнивать различные варианты вакцинирующих препаратов, оценивать влияние иммуногенов на активацию гуморального и/или клеточного звена иммунного ответа, отработать схемы иммунизации, но уже на этапе доклинического изучения судить о перспективности тестируемых препаратов.

В России разработаны несколько вариантов вакцин-кандидатов против ВИЧ/СПИД, которые были представлены на аттестацию в ГИСК им.Л.А.Тарасевича. Особенности конструкций состава иммуногенов, средств доставки и адъювантов позволяют классифицировать изучаемые вакцины следующим образом: конъюгированная полимер-белковая кандидатная вакцина «ВИЧРЕПОЛ» (ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»),

- кандидатная вакцина на основе рекомбинантного вектора (векторная вакцина) - «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитории» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора),

- синтетическая полипептидная кандидатная вакцина с использованием технологии ВПЧ - «ТВ1-ВПЧ для инъекций» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора),

- комбинированная кандидат-вакцина «КомбиВИЧвак», представляющая собой синергизм ДНК-вакцины и синтетической полипептидной вакцины с использованием технологии ВПЧ (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора).

Вакцины-кандидаты находятся на различных стадиях исследований. В 2004 году начались клинические испытания I фазы кандидат-вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД «ВИЧРЕПОЛ» в соответствии с Протоколом, прошедшим экспертизу в ГИСК им.Л.А.Тарасевича, Комитета по МИБП и Комитета по этике при Федеральном органе контроля качества лекарственных средств. Получено разрешение Федеральной службы в сфере здравоохранения и социального развития Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации на проведение I фазы клинических испытаний [4, 5, 19, 20]. Это первый опыт подобных испытаний в нашей стране. Кандидатные вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД, разработанные в ФГУН ГНЦ ВБ

Вектор» находятся на стадии подготовки к проведению клинических испытаний.

Цель исследования - разработка комплекса информативных методов лабораторной оценки и стандартизации экспериментальных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. модифицировать и стандартизовать условия проведения ИФА и иммунного блоттинга применительно к лабораторной оценке подлинности и специфической активности кандидатных вакцин,

2. изучить специфичность взаимодействия эпитопов вакцинного антигена гес(24-41) «ВИЧРЕПОЛ» и белка-иммуногена TBI в составе кандидатных вакцин «КомбиВИЧвак» и «ТВ1-ВПЧ для инъекций» с антителами в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных лиц с помощью различных вариантов ИФА,

3. изучить динамику индукции ВИЧ-специфических антител класса G у мышей различных линий, иммунизированных кандидатными вакцинами «ВИЧРЕПОЛ», «ТВ1-ВПЧ для инъекций», «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитории», «КомбиВИЧвак» однократно и двукратно,

4. изучить особенности формирования вирус-нейтрализующих антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных экспериментальными вакцинами, на модели острой инфекции с штаммом ВИЧ-1 на культуре линии чувствительных перевиваемых клеток МТ4 in vitro,

5. исследовать методом ELISPOT ВИЧ-специфическую индукцию цитокинов у иммунизированных анти-ВИЧ/СПИД-вакцинами мышей,

6. провести анализ синтеза ВИЧ-специфических изотипов IgGl и IgG2a в сыворотках крови иммунизированных кандидат-вакцинами мышей.

Научная новизна работы

Впервые проведено сравнительное изучение на доклиническом уровне экспериментальных вариантов ' отечественных вакцин против ВИЧинфекции/СПИД, полученных по различным технологиям.

Впервые разработаны и стандартизованы методы оценки специфической кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД с помощью различных модификаций ИФА и иммунного блоттинга.

Впервые изучено влияние различных схем и способов иммунизации мышей анти-ВИЧ/СПИД-вакцинами на активацию ВИЧ-специфического гуморального и клеточного иммунного ответа.

Научно-практическое значение работы

На основании полученных результатов разработаны и стандартизованы методы оценки подлинности и специфической активности кандидатной вакцины «ВИЧРЕПОЛ», что явилось основой алгоритма оценки активности экспериментальной вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД «ВИЧРЕПОЛ» и обоснованием решения вопроса о проведении клинических испытаний I фазы.

Разработанные методы лабораторной оценки специфической активности экспериментальных вакцин («ВИЧРЕПОЛ», «КомбиВИЧвак», «ТВ1-ВПЧ для инъекций» и «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитории»), введены в проекты нормативной документации на эти препараты.

В исследованиях вирус-нейтрализующей активности сывороток крови иммунизированных мышей, индукции цитокин-продуцирующих клеток методом ELISPOT и определения ВИЧ-специфических IgGl и IgG2a в сыворотках крови иммунизированных мышей в ИФА показана различная степень активации гуморального и клеточного иммунного ответа при иммунизации мышей в зависимости от типа экспериментальной вакцины и способа введения.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Чеканова, Татьяна Александровна

выводы

1. Модифицированы и стандартизованы условия проведения ИФА и иммунного блоттинга применительно к лабораторной оценке подлинности и специфической активности кандидатных вакцин ВИЧ-инфекции/СПИД, полученных по различным технологиям («ВИЧРЕПОЛ», «КомбиВИЧвак», «ТВ1-ВПЧ для инъекций», «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитррии»).

2. Оптимальным для подтверждения подлинности кандидатной вакцины «ВИЧРЕПОЛ» является непрямой ИФА, кандидатных вакцин «КомбиВИЧвак» и «ТВ1-ВПЧ для инъекций» - «сэндвич»-ИФА.

3. Разработана оптимальная схема иммунизации мышей для изучения специфической активности экспериментальных вакцин против ВИЧ/СПИД. Наиболее выраженный гуморальный ответ у мышей достигался при двукратной иммунизации исследуемыми экспериментальными вакцинами с интервалом в 28 дней (с последующим забором крови на 7 сутки со дня последней иммунизации).

4. Разработана стандартная методика оценки подлинности и специфической t активности кандидат-вакцин против ВИЧ/СПИД, которая включает иммунизацию мышей и последующую аттестацию иммунных сывороток в коммерческих тест-системах соответствующего назначения, адаптированных к доклиническим исследованиям.

5. Внутрибрюшинное и подкожное введение вакцин «ВИЧРЕПОЛ», «КомбиВИЧвак», «ТВ1-ВПЧ для инъекций» позволяет подтверждать антигенную композицию иммуногенов методом иммунного блоттинга.

6. Выявлена различная степень индукции нейтрализующих антител к ВИЧ в зависимости от способа иммунизации мышей (внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно). Наиболее эффективная вируС-нейтрализация отмечена после иммунизации экспериментальными вакцинами «ВИЧРЕПОЛ», «КомбиВИЧвак»,

ТВ1-ВПЧ для инъекций» внутрибрюшинно.

7. При изучении стимуляции цитокин-продуцирующих клеток методом ELISPOT выявлена преимущественная активация клеточного звена иммунного ответа при иммунизации мышей ДНК-содержащими вакцинами и гуморального звена иммунного ответа при иммунизации кандидатными вакцинами, содержащими рекомбинантные белковые/полипептидные антигены («ВИЧРЕПОЛ» и «ТВ1-ВПЧ для инъекций»),

8. Оценка биосинтеза изотипов IgG2a и IgGl в ИФА является информативным методом для выбора эффективного способа введения кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Важность решения проблемы разработки эффективной профилактической вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД, повлекшая за собой создание многочисленных экспериментальных вариантов анти-ВИЧ/СПИД-вакцин, привела к необходимости подбора комплекса стандартизованных методов для адекватной оценки результатов, полученных в ходе доклинических и клинических исследований.

В настоящее время отсутствует анти-ВИЧ/СПИД-вакцина с доказанной эффективностью после проведения всех фаз клинических испытаний, которую можно было бы использовать в качестве референс-препарата при последующей разработке и стандартизации методов контроля специфической активности различных вариантов кандидат-вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД. Для перехода к клиническим исследованиям перспективных вариантов кандидатных вакцин необходимо определить наиболее информативные методы контроля качества препарата и оценки его иммуногенности (специфической активности) [92-94]. На основе опыта специалистов, занятых в области создания и исследования экспериментальных вакцин против ВИЧ/СПИД, ВОЗ предложены рекомендации доклинической оценки качества препаратов, которые могут быть полезными при формировании национальных требований изучения на доклиническом уровне вариантов анти-ВИЧ/СПИД-вакцин [83-87].

В России различными научно-исследовательскими коллективами ведутся актуальные исследования по .разработке вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД. Наиболее перспективные, по мнению авторов, варианты вакцин были представлены в ГИСК им.Л.А.Тарасевича для независимой экспертизы препаратов на доклиническом уровне и решения вопроса о возможности перехода к клиническим испытаниям. Первые отечественные варианты кандидат-вакцин, согласно принятой классификации такого рода препаратов, нельзя отнести к какому-либо определенному типу. К примеру, кандидат-вакцина «ВИЧРЕПОЛ» является представителем сравнительно нового класса субъединичных полимерных вакцин, активное начало которой является генно-инженерный химерный белок гес(24-41), конъюгированный с носителем-иммуномодулятором полиоксидонием. Основной иммуноген TBI вакцины «ТВ1-ВПЧ для инъекций», спроектированный в виде единой полиэпитопной цепи, экспонируется на поверхности ВПЧ. В состав кандидат-вакцины «КомбиВИЧвак» помимо белкового компонента TBI включена плазмида pcDNA-TCI, несущая ген искусственного гибридного белка TCI. Основу вакцины «САЛ-ВИЧ-Д суппозитории» составляет плазмида pcDNA-TCI, введенная в аттенуированный штамм Salmonella enteritidis Е23. Различие в принципе построения кандидат-вакцин, касающиеся состава иммуногенов, адъювантов и векторных систем, является одной из причин сложности решения вопроса разработки методов контроля подлинности (доказательства ВИЧ-специфической антигенной активности иммуногенов) и специфической активности вакцин (определение степени активации гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа при введении вакцины лабораторным животным). Целью исследований являлась разработка комплекса информативных методов лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД. Для решения поставленного задач необходимым условием является проведение доклинического изучения препаратов.

Кандидат-вакцина «ВИЧРЕПОЛ» является первым препаратом в России, который рекомендован для проведения клинических испытаний. Придавая первостепенное значение вопросам качества МИБП, предназначенных для введения человеку, нами совместно с авторским коллективом было проведено комплексное доклиническое изучение препарата. Для этого впервые были модифицированы и стандартизованы условия проведения ИФА и иммунного блоттинга применительно к оценке подлинности и специфической активности кандидат-вакцины, которые легли в основу аттестации других экспериментальных вакцин [25,26].

Методом непрямого ИФА при контроле четырех экспериментальных серий «ВИЧРЕПОЛ» была доказана ВИЧ-специфическая антигенная активность иммуногена гес(24-41) или подлинность препарата по иммунореактивности эпитопов вакцинного антигена с антителами к ВИЧ типа 1 в сыворотках крови

ВИЧ-инфицированных пациентов и при отсутствии ложноположительных реакций с сыворотками крови здоровых доноров. Данный метод позволил стандартизовать препарат по тесту подлинности, не используя иммунизацию животных. ВИЧ-специфическая активность белка-иммуногена TBI в составе кандидат-вакцин «КомбиВИЧвак» и «ТВ1-ВПЧ для инъекций» была доказана в «сэндвич»-ИФА [23].

Изучение в динамике титров антител класса G в сыворотках крови мышей различных линий после однократной и двукратной иммунизации экспериментальными вакцинами на планшетах с гомологичным вакцинным антигеном позволило разработать, оптимальную схему иммунизации мышей для получения в короткие сроки высокотитражных иммунных сыворотки. Наиболее выраженный гуморальный ответ у мышей достигался при двукратной иммунизации экспериментальными вакцинами с интервалом в 28 дней (с последующим забором крови на 7 сутки со дня последней иммунизации).

Учитывая, что оценка гуморального ответа на гомологичный антиген важна для подбора оптимальной схемы иммунизации лабораторных животных, определения титра антител в сыворотках крови иммунных мышей, но не дает полного представления о ВИЧ-специфической активности вакцин, изучались специфические титры антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных кандидат-вакцинами, на иммуносорбентах коммерческих иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВИЧ-1 и -2 типов. Определен уровень содержания антител к ВИЧ в сыворотках крови мышей, иммунизированных внутрибрюшинно кандидат-вакцинами «ВИЧРЕПОЛ», «ТВ1-ВПЧ для инъекций» и «КомбиВИЧвак» в тест-системах, что является важным для стандартизации препаратов по тесту специфической активности. Дополнительно проведено сравнительное изучение уровня антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных «ВИЧРЕПОЛ» подкожно и внутримышечно. Титры антител в таких сыворотках дополнительно были изучены в коммерческих тест-системах «ИФА-анти-ВИЧ-УНИФ» и «УниБест-ВИЧ- 1,2 АТ». Выбор тест-системы «ИФА-анти-ВИЧ-УНИФ» обусловлен высоким уровнем антител, полученным в предыдущем анализе (не менее 1:2560). Тест-система «УниБест-ВИЧ- 1,2 АТ» интересна тем, что содержит в составе иммуносорбента только детерминанты одного рекомбинантного белка gp41. Было выявлено снижение титра антител класса в сыворотках крови мышей, иммунизированных подкожно до 1:40 G в тест-системе «УниБест-ВИЧ- 1,2 АТ». При внутримышечной иммунизации не было отмечено положительной реактивности на иммуносорбенте «УниБест-ВИЧ-1,2 АТ». Однако суммарный уровень антител к белкам Env и Gag, представленных на иммуносорбенте «ИФА-анти-ВИЧ-УНИФ» существенно не изменился. Вероятно, это можно объяснить тем, иммуносорбент тест-системы «ИФА-анти-ВИЧ-УНИФ» представлен спектром иммобилизованных антигенов р15, р17, р24 (Gag) и gp41, gpl20, gp 160 (Env) и снижение индукции уровня антител к gp41 суммарно компенсируется более высоким содежанием антител к группо-специфичным белкам. Таким образом, требовалось дополнительное изучение специфической активности препарата с помощью других методов.

Одним из наиболее информативных методов оценки специфической активности и подлинности кандидат-вакцин является иммунный блоттинг, позволяющий оценить спектр антител к ВИЧ-1 в сыворотках крови иммунизированных мышей. Выявленный спектр антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных внутрибрюшинно и подкожно «ВИЧРЕПОЛ», «ТВ1-ВПЧ для инъекций» и «КомбиВИЧвак» на стрипах коммерческих наборов соответствующего назначения наилучшим образом отражает антигенную композицию белка-иммуногенов гес(24-41) и TBI. Однако при внутримышечной иммунизации данными вакцинами отмечена иммунореактивность только с группо-специфичными белками. Отсутствие результатов клинических испытаний на людях не дает нам возможности утверждать, что внутримышечная иммунизация приведет к снижению активности антителообразования к гликопротеинам, однако это не исключено.

Оригинальный метод определения антиген-связывающей активности в отношении р24 ВИЧ-1 в составе «Antigen HIV-1 Standard» сыворотками крови иммунизированных «ВИЧРЕПОЛ» мышей методом конкурентного ИФА доказал, что кандидат-вакцина является хорошим иммуногеном. Превышение показателя нейтрализации антигена в конкурентном ИФА сыворотками крови мышей, иммунизированных внутримышечно, свидетельствует об увеличении индукции антител к р24 (при одновменном снижении aHTH-gp41).

Полученные результаты требовали дополнительного подтверждения в ИФА на иммуносорбентах с раздельно иммобилизованными антигенами Env и Gag. Уровень антител к гликопротеинам ВИЧ-1 достигает максимальных значений при внутрибрюшинном введении кандидат-вакцин «ВИЧРЕПОЛ», «ТВ1-ВПЧ для инъекций» и «КомбиВИЧвак» и преобладает над суммарным уровнем антител к Gag. Подкожное введение вакцин приводит к незначительному снижению как антител к Env, так и к Gag. При внутримышечной иммунизации отмечали преимущественную индукцию антител к группо-специфичным антигенам и существенное снижение антителообразования к Env ВИЧ типа 1, что объясняет результаты иммунного блоттинга.

Можно предположить, что при внутрибрюшинном способе введения основными антиген-препредставляющими клетками выступают макрофаги, которые фагоцитируют антиген. В макрофагах происходит плановое образование внутри клеток комплексов из продуктов расщепления фагоцитированного вещества с собственными молекулами MHC-II и экспрессия этого комплекса на поверхность клетки с целью представления антигенов для распознавания Т-лимфоцитами. Поскольку комплексы антигенов-пептидов с молекулами MHC-II распознают исключительно СБ4+-Т-лимфоциты, то в защите главную роль играют реакции, обеспечиваемые именно С04+-Т-лимфоцитами или Т-хелперами [28]. При внутримышечном и подкожном введении антигена основными антигенпредставляющими клетками выступают дендритные клетки. Дендритные клетки процессируют антиген, экспрессируют на мембрану комплексы пептидов с МНС и необходимые корецепторные молекулы, с помощью которых они могут вступить в эффективное взаимодействие с Т-лимфоцитами. Вероятно, что образование антител к различным антигенам происходит с неодинаковой скоростью. Возможно, что при подкожной иммунизации представление антигена

Т-лимфоцитам проходит быстрее из-за близости к лимфадренажным протокам. Для выяснения причин, объясняющих снижение уровня антител к гликопротеинам в результате иммунизации кандидат-вакцинами внутримышечно, необходимы дополнительные исследования иммунного ответа, и, прежде всего, взаимодействия иммуногенов и антигенпредставляющих клеток.

Представлял интерес оценить вирус-нейтрализующую способность сывороток крови мышей Balb/c, иммунизированных первыми экспериментальными анти-ВИЧ-вакцинами, в отношении инфекционного культурального ВИЧ. Для получения иммунных сывороток крови мышей мы использовали единую схему иммунизации (двукратное введение с интервалом в 28 дней, забор крови производили через 7 дней со дня последней иммунизации). Ранее нами было достоверно показано, что данная схема иммунизации индуцировала выраженный гуморальный ответ, подтвержденный в ИФА как на иммуносорбенте с вакцинным антигеном, так и в коммерческих тест-системах, выявляющих антитела к ВИЧ 1 и 2 типов. В тесте вирусной нейтрализации 'нами получены данные о вирус-нейтрализующей активности сывороток мышей, иммунизированных вакцинами, в зависимости от способа их введения. Выявлено эффективное подавление накопления вируса в опытных пробах с сыворотками крови мышей, иммунизированных внутрибрюшинно вакцинами «КомбиВИЧвак» и «ТВ1-ВПЧ для инъекций» и «ВИЧРЕПОЛ». Показатели ингибирования р24 сыворотками крови мышей, иммунизированных вакцинами подкожно, были несколько ниже. Такая же тенденция была отмечена при изучении вирус-нейтрализующей активности сывороток крови мышей, иммунизированных внутримышечно [27].

Можно предположить, что снижение нейтрализации вируса сыворотками крови мышей, иммунизированных внутримышечно, по сравнению с подкожным или внутрибрюшинным способом введения, связано с тем, что иммунный ответ развивается, в основном, на Gag-белки, несущими сравнительно небольшое число нейтрализующих эпитопов по сравнению с гликопротеинами Нейтрализация вируса также зависит от количества антител к нейтрализующим эпитопам. Таким образом, более выраженное подавление вируса антисыворотками к

КомбиВИЧвак» и «ТВ1-ВПЧ для инъекций» объясняется высоким содержанием в них антител к нейтрализующим эпитопам.

При введении мышам экспериментальных вакцин, содержащих в качестве основных иммуногенов рекомбинантные белки/полипептиды («ТВ1-ВПЧ для инъекций», «ВИЧРЕПОЛ») отмечена преимущественная активация гуморального звена иммунного ответа, что подтвердено данными ELISPOT и оценки биосинтеза изотипов IgG2a и IgGl. Увеличение синтеза IgG2a наблюдали при анализе сывороток крови мышей, иммунизированных внутримышечно «КомбиВИЧвак» и ректально вакциной «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитории». Следует отметить, что при подкожном и внутрибрюшинном введении мышам кандидат-вакцины «КомбиВИЧвак» наблюдали преимущественную активацию ответа по типу Th2. Вероятно, что комбинированная экспериментальная вакцина против ВИЧ-инфекции/СПИД «КомбиВИЧвак», представляющая собой синергизм ДНК-вакцины (плазмида pcDNA-TCI внутри ВПЧ) и рекомбинантной полипептидной вакцины (содержит белок-иммуноген TBI-recA на поверхности ВПЧ) в зависимости от способа иммунизации способствует индукции либо клеточного звена иммунного ответа (при внутримышечной иммунизации), либо гуморального звена иммунного ответа (при подкожном и внутрибрюшинном ведении). Свойства вакцины индуцировать развитите иммунного ответа по типу Thl или Th2 в зависимости от способа введения требует тщательного изучения. При подтверждении полученных нами результатов кандидатную вакцину «КомбиВИЧвак» можно использовать для достижения протективной защиты, не прибегая к вакцинации по принципу «прайм-буст» с применением различных типов вакцин. Вакцина «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитории», несмотря на низкий уровень активации IgG-ответа (согласно разработанной семе иммунизации), способствует индукции ВИЧ-специфического Т-клеточного ответа.

Полученные данные по изучению особенностей индукции иммунного ответа различными вариантами антй-ВИЧ/СПИД-вакцин могут быть полезными для уточнения и возможной корректировки протоколов вакцинации на различных стадиях клинических испытаний экспериментальных вакцин.

Определенно, что для достижения положительных результатов на пути к созданию эффективной профилактической анти-ВИЧ-вакцины необходимо глубокое изучение иммунобиологии • ВИЧ-инфекции, особенностей взаимодействия антигена и антигенпрезентирующих клеток с целью выбора наиболее рациональных подходов для увеличения иммуногенности препаратов, корректировки протоколов вакцинации на различных стадиях клинических испытаний экспериментальных вакцин.

Таким образом, для адекватной оценки ВИЧ-специфической активности кандидатных вакцин необходимо комплексное изучение индукции иммунного ответа с помощью адаптированных методов ИФА и иммунного блоттинга, используя коммерческие тест-системы соответствующего назначения. Эти методы легко воспроизводимы, что позволило стандартизовать экспериментальные вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД по тестам подлинности и специфической активности.

Дополнительное изучение кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД методом ELISPOT, а также исследования оценки биосинтеза изотопов IgG2a и IgGl в ИФА является важным для определения методов иммунизации, индуцирующих желаемые варианты иммунного ответа.

Не вызывает сомнения, что анализ полученных данных на доклиническом уровне и результатов клинических исследований экспериментальных вакцин будет способствовать повышению эффективности работ по созданию

• профилактической вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД и пониманию ряда ключевых вопросов иммунопатогенеза ВИЧ/СПИД.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чеканова, Татьяна Александровна, 2006 год

1. Бектимиров Т.А. Состояние и перспективы разработки вакцин против ВИЧ-инфекции. Вопросы вирусол., 2002, №3, с.4-6.

2. Гудима Г.О., Богова А.В., Николаева И.А., Сидорович И.Г. Эпидемия ВИЧ-инфекции/СПИД и начало клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцины ВИЧРЕПОЛ в России. Russian J. of Immunol., 2004, v.9, suppl.l, p. 192.

3. Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Николаева И.А., Карамов Э.В., Коробова С.В., Хаитов P.M. Первая отечественная анти-ВИЧ-вакцины на стадии клинических испытаний. Физиология и патология иммунной системы, 2005, Т.9, №7, с. 107-116.

4. Карамов Э.В., Павлова Т.В., Корнилаева Г.В., Сидорович И.Г., Бажан С.И. Кандидатные анти-ВИЧ-вакцины индуцируют сильный нейтрализационный ответ. Аллергия, астма и клин, иммунол., 2003, №9, с. 144-151.

5. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Порываева В.А., Азаев М.Ш., Рябчикова Е.А., Гилева И.П., Ильичев А.А. Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1.Молекул, биология, 2000, №3, с.280-285.

6. Медуницын Н.В. Вакцинология, М., «Триада-Х», 1999, 272 с.

7. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. Методические указания. МУ 4.1/4.2.588-96, М., 1996г.

8. Николаева И.А., Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Шевалье А.Ф., Карамов Э.В., Коробова С.В., Хаитов P.M. Иммунотерапия ВИЧ-инфекции и СПИДа. Физиология и патология иммунной системы, 2005, Т.9, №7, с.80-89.

9. Романович А.Э., Козлов А.П. Методологические подходы для иммуногенности вакцины против ВИЧ-1. Русский журнал "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы", 2001, Т.5, №2, с.87-91.

10. Порядок и методы контроля иммунобиологической безопасности вакцин. Методические принципы, РД 42-28-10-90.М., 1989 г.

11. Построение, содержание и изложение инструкций по применению медицинских иммунобиологических препаратов. Основные изложения. РД 42-28-7-88. М., 1989г.

12. Поствакцинальные осложнения (клиника, диагностика, лечение). Методические рекомендации. JI, 1991 г.

13. Производство и контроль иммунобиологических препаратов для обеспечения их качества. Санитарные правила. СП 3.3.2.015-84. М., 1994г.

14. Сидорович И.Г., Николаева И.А., Шевалье А.Ф., Игнатьева Г.А., Карамов Э.В., Хаитов P.M. Проблемы и перспективы разработки вакцины против ВИЧ/СПИДа. Аллергия, астма и клин, иммунол., 2001, № 5, с.3-5.

15. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. СПИД, М., Народная академия культуры и общечеловеческих ценностей, 1992, 352 с.

16. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология, М., Медицина, 2000,432 с.

17. AIDS Epidemic Update, 2002.

18. Baragona S. US-backed Controversial HIV/AIDS Vaccine Trial Starts on 16,000. Thai Volunteers IAVI Rep., 2004, no.l.

19. Barker E. CD8+ cell-derived anti-human immunodeficiency virus inhibitory factor. J Infect Dis., 1999 May, 179, Suppl 3, S485-8

20. Bass E. Ethics, antiretrovirals and prevention trials. IAVI REPORT, 2004, v.7, no.3.

21. Berzofsky J.A., Ahlers J.D., Janik J., Morris J., Oh S., Terabe M., Belyakov I.M. Progress on new vaccine strategies against chronic viral infections. J. Clin. Invest., 2004, v.l 14, no.4, p.450-462.

22. Betts MR, Yusim K, Koup RA. Optimal Antigens for HIV Vaccines Based on CD8+ T Response, Protein Length, and Sequence Variability. DNA Cell Biol., 2002, Sep, 21 (9), 665-70

23. Bende S, Johnston MI. Immunization. Update: search for an AIDS vaccine. AIDS Read. 2000, Sep 10 (9), 526-32, 534-8.

24. Burgers WA, Williamson C. The challenges of HIV vaccine development and testing. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2005, Apr, 19 (2), 277-291.

25. Burton D. R. A vaccine for HIV type 1: the antibody perspective. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A., 1997, v. 94, p.10018-10023.

26. Burton DR, Williamson RA, Parren PW. Antibody and virus: binding and4neutralization. Virology, 2000, 270, p.1-3.

27. Burton DR, Saphire EO, Parren PW. A model for neutralization of viruses based on antibody coating of the virion surface. Curr Top Microbiol Immunol. 2001, v260, p. 109-43.

28. Clark KR, Sferra TJ, Johnson PR. Recombinant adeno-associated viral vectorsmediate long-term transgene .expression in muscle.Hum Gene Ther 1997, v.8, p.659-669.

29. Cohen J. Public health. AIDS vaccine still alive as booster after second failure in

30. Thailand. Science, 2003, v.302, no.5649, p. 1309-1310.

31. Conley A. J., Kessler J. A., Boots L. J., Tung J. S., Arnold B. A., Keller P. M.,

32. Shaw A. R., Emini E. A. Neutralization of divergent human immunodeficiency virus type 1 variants and primary isolates by IAM-41-2F5, an anti-gp41 human monoclonal antibody. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A, 1994, v.91, p.3348-3352.

33. Connick E„ Marr D.G., Zhang X.Q., Clark S.J., Saag M.S., Sholley R.T. HIVspecific cellular and humoral immune responses in primary HIV infection. AIDS Res Hum Retroviruses, 1996, v.124, p. 1129-1140

34. Cranage MP, Whatmore AM, Sharpe SA, Cook N, Polyanskaya N, Leech S, Smith JD, Rud EW, Dennis MJ, Hall GA. Macaques infected with live attenuated SIVmac are protected against superinfection via the rectal mucosa.Virology,1997, Mar 3;229 (1), 143-54.

35. Draenert R., Goebel F.D. What's new in HIV/AIDS. Protective immunity in HIV infection: where do we stand? Infection, 2004, v.32, no.4, p.250-252.

36. Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, Liu MA. DNA vaccines. Annu Rev Immunol. 1997, v.15, 617-48.

37. Douek DC, Brenchley JM, Betts MR, Ambrozak DR, Hill BJ, Okamoto Y,

38. Casazza JP, Kuruppu J, Kunstman K, Wolinsky S, Grossman Z, Dybul M,

39. Oxenius A, Price DA, Connors M, Koup RA. HIV preferentially infects HIV-specific CD4+ T cells. Nature. 2002, v2; 417 (6884), p.95-8.

40. Dyer WB, Ogg GS, Demoitie MA, Jin X, Geczy AF, Rowland-Jones SL,

41. McMichael AJ, Nixon DF, Sullivan JS. Strong human immunodeficiency virus (HlV)-specific cytotoxic T-lymphocyte activity in Sydney Blood Bank Cohort patients infected with nef-defective HIV type 1. J Virol. 1999, Jan, v.73 (1), p.436-43

42. Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P. et al. Design of four-helical protein as a candidate for HIV vaccine. Protein Engineering, 1995, v.8, p. 167-173.

43. Esparza J., Osmanov S. HIV vaccines: a global perspective. Curr. Mol. Med., 2003, v.3, no.3, p.183-193.

44. Esser M.T., Marchese R.D., Kierstead L.S., Tussey L.G., Wang F., Chirmule N., Washabaugh M.W. Memory T cells and vaccines. Vaccine, 2003, v.21, no.5-6, p.419-430.

45. Evans TG, Keefer MC, Weinhold KJ, Wolff M, Montefiori DM, Gorse GJ,

46. Falk LA, Goldenthal KL, Esparza J, Aguado MT, Osmanov S, Ballou WR, Beddows S, Bhamarapravati N, Biberfeld G, Ferrari G, Hoft D, Honda M,

47. Jackson A, Lu Y, Marchal G, McKinney J, Yamazaki S. Recombinant bacillus Calmette-Guerin as a potential vector for preventive HIV type 1 vaccines.AIDS Res Hum Retroviruses. 2000, v. 16, no. 2, p.91-8.

48. Ferrantelli F., Cafaro A., Ensoli B. Nonstructural HIV proteins as targets for prophylactic or therapeutic vaccines. Curr. Opin. Biotechnol., 2004, v. 15, no.6, p.543-556.

49. Fink S., IAVI Report, 2005, v.9, no.l, p.10-12.

50. Forthal D.N., Landucci G., Keenan. The relonship between antibody dependent cellular cytotoxicity, plasma HIV-1 PHA, and CD4 + lymphocyte count. AIDS Res Hum etroviruses, 2001, v.17, p.553-561.

51. Forthal D.N., Landucci G., Daar E.S. Antibody from patients with acute HIV infection inhibits primary strains of HIV typel in the presence of natural-killer effector cells. J. Virol., 2001, v. 75, p.6953-6961.

52. Frankel A. D. and Pabo С. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell, 1988, v.55, p.l 189-1193.

53. Franchini G., Gurunathan S., Baglyos L., Plotkin S., Tartaglia J. Poxvirus-based vaccine candidates for HIV: two decades of experience with special emphasis on canarypox vectors. Expert. Rev. Vaccines, 2004, v.3, suppl.l, p.75-88.

54. G8 endorses plan to accelerate AIDS vaccine development. IAVI Report, 2004, v.8, no.2, p.19.

55. Garber D.A., Silvestri G., Feinberg M.B. Prospects for an AIDS vaccine: three big questions, no easy answers. Lancet Infect. Dis., 2004, v.4, no.7, p.397-413.

56. Giri M., Ugen K.E., Weiner D.B. DNA vaccines against human immunodeficiency virus type 1 in the past decade. Clin. Microbiol. Rev., 2004, v.17, no.2, p.370-389.

57. Gomez M. В. and Hildreth J. E. Antibody to adhesion molecule LFA-1 enhances plasma neutralization of human immunodeficiency virus type 1. J.Virol., 1995, v. 69, p.4628-4632.

58. Gorny M. K., Moore J. P., Conley A. J., Karwowska S., Sodroski J., Williams C.,

59. Burda S., Boots L. J., Zolla-Pazner S. Human anti-V2 monoclonal antibody that neutralizes primary but not laboratory isolates of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol., 1994, v. 68, p.8312-8320.

60. Goudsmit J, Lange JM, Paul DA and Dawson GJ. Antigenemia and antibody titersto core and envelope antigens in AIDS, AIDS-related complex, and subclinicalhuman immunodeficiency virus infection. J Infect Dis, 1987, v.155, p.558-560.

61. Goudsmit J, Boucher CA, Meloen RH, Epstein LG, Smit L, van der Hoek L, Bakker M. Human antibody response to a strain-specific HIV-1 gpl20 epitope associated with cell fusion inhibition. AIDS , 1988, v.2, p. 157-164.

62. Goulder P.J., Watkins D.I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nat. Rev. Immunol., 2004, v.4, no.8, p.630-640.

63. Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. DNA vaccines: immunology, application, and optimization. Annu. Rev. Immunol., 2000, v.18, p.927-974.

64. Guidelines for assuring the quality of DNA vaccines. WHO Expert Committee on Biological Standardization. Geneva, World Health Organization, 1998.

65. Good manufacturing practices for pharmaceutical products. In: WHO Expert Committeeon Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirty-second report. Geneva, World Health Organization, 1992, Annex 1 (WHO Technical Report Series, No. 823).

66. Good manufacturing practices for biological products. In: WHO Expert Committee on Biological Standardization. Forty-second report. Geneva, World Health Organization, 1992, Annex 1 (WHO Technical Report Series, No. 822

67. Guidelines on nonclinical evaluation of vaccines. In: WHO Expert Committee on

68. Biological Standardization. Geneva, World Health Organization, Annex 1 (WHO Technical Report Series).

69. Guidelines on clinical evaluation of vaccines: regulatory expectations. In: WHO Expert Committee on Biological Standardization. Fifty-second report. Geneva, World Health Organization, 2004, Annex 1 (WHO Technical Report Series, No. 924).

70. Hammond SA, Bollinger RC, Stanhope PE, Quinn TC, Schwartz D, Clements ML,

71. Siliciano RF. Comparative clonal analysis of human immunodeficiency virus type 1 (HlV-l)-specific CD4+ and CD8+ cytolytic T lymphocytes isolated from seronegative humans immunized with carididate HIV-l vaccines. J Exp Med., 1992, v.176, p.1531-1542.

72. Hirsch V. M., Johnson P. R. Pathogenic diversity of simian immunodeficiency viruses.Virus Res., 1994, v.32, no.2, p. 183-203.

73. IAVI Report, List of Ongoing trials of preventive HIV vaccines, updated Feb. 28, 2005

74. IAVI Report, May-August, 2003.94. IAVI Rep., 2005.

75. Janoff E.N., Scamurra R.W., Saneman T.C., Eidman K., Thurn J.R. Human immunodeficiency tipe 1 and mucosal humoral defense. J. Infect. Dis., 1999, v.179, P.S 475-9.

76. Jefferys R., Harrington M. Outstanding questions on HIV vaccine trial. Science, 2004, v.305, no.5681, p.180.

77. Jin X, Bauer DE, Tuttleton SE. Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Exp Med., 1999, v. 189, p.991-998.

78. Johnston R. AIDSVAX results: an answer, or just more questions? AIDS Patient Care STDS, 2003, v. 17, no.2, p.47-51.

79. Johnston MI, Flores J. Progress in HIV vaccine development. Curr. Opin. Pharmac, 2001, v. 1, p.504-510.

80. Karpenko L.I., Lebedev L.R., Ignatyev G.M. et al. Construction of artificial virus-like particles exposing HIV epitopes, and the study of their immunogenic properties. Vaccine, 2003, v. 17, p.386-392.

81. Kaur A., Johnson R.P. HIV pathogenesis and vaccine development. Top HIV Med., 2003, v.l 1, no.3, p.76-85.

82. Khalife J, Guy B, Capron M, Kieny MP, Ameisen JC, Montagnier L, Lecocq JP and Capron A. Isotypic restriction of the antibody-response to human immunodeficiency virus. AIDS Res Hum Retroviruses, 1988, v. 4, p.3-9.

83. Kiyono H., Bienenstock J. Features of inductive and effector sites to consider inmucosal immunization and vaccine development// Reg. Immunol., 1992, v.4, p.54-62

84. Klasse PJ and Blomberg J. Patterns of antibodies to human immunodeficiency virus proteins in different subclasses of IgG. Journal of Infectious Diseases, 1987, v.l56, p. 1026-1030.

85. Klasse PJ, Berntorp E and Hansson BG. An aberrant subclass pattern of HIV-specific immunoglobulin-G in sera from hemophiliacs. AIDS, 1988, v.2, p.311-313.

86. Klausner R.D., Fauci A.S., Corey L., Nabel G.J., Gayle H., Berkley S., Haynes

87. Kokkotou EG, Sankale JL, Mani I, Gueye-Ndiaye A, Schwartz D, Essex ME, Mboup S, Kanki PJ. In vitro correlates of HIV-2 mediated HIV-1 protection. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, v.91, p.6797-6802.

88. Kresina T.F., Mathieson B. Human immunodeficiency virus type 1 infection,mucosal immunity, and extramural research program at the National Institutes of Health. J. Infect. Dis., 1999, v.17, p.392-6.

89. Lanier L. Follow the leader: NK cell receptors for classical and nonclassical MHC class I. Cell, 1998, v.92, p.705-707.

90. Lehner Т., Wang Y., Ping L., Bergmeier L., Mitchell E., Cranage M., Hall G., Dennis M., Cook N., Doyle C., Jones I. The effect of route of immunization on mucosal immunity and protection. J. Infect. Dis., 1999, v. 179, p 489-492.

91. Letvin NL. Progress in the Development of an HIV-1 Vaccine. Science 1998, v.280, p.1875-1880

92. Letvin N, Walker B. HIV versus immune system: another apparent victory for thevirus. Journal of Clinical Investigation, 2001, v. 107, p.273-275

93. Letvin N.L. Progress toward an HIV vaccine. Ann. Rev. Med., 2005, v.56, p.213-223.

94. Levy J, Mackewicz C, Barker E. Controlling HIV pathogenesis: the role of thenoncytotoxic anti-HIV response of CD8 + T cells. Immunol Today, 1996, v. 17, p.217-224

95. Li J, Lord CI, Haseltine W, Letvin NL, Sodroski J. Infection of cynomolgus monkeys with a chimeric HIV-1/SIVmac virus that expresses the HIV-1 envelope glycoproteins. J Acquir Immune Defic Syndr., 1992, v.5, no.7, p. 639-46.

96. Li C. J., Ueda Y., Shi В., Borodyansky L., Huang L., Li Y. Z., Pardee A. B. Tat protein induces self-perpetuating permissivity for productive HIV-1 infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1997, v. 94, p.8116-8120.

97. Lieberman J, Frankel FR. Engineered Listeria monocytogenes as an AIDS4vaccine. Vaccine, 2002, v. 20, no. 15, 2007-10.

98. Lu W., Wu X., Lu Y., Guo W., Andrieu J.M. Therapeutic dendritic-cell vaccine for simian AIDS. Nat. Med., 2003, v.9, no.l, p.27-32.

99. MacDonakd GH, Johnston RE. Role of dendritic cell targeting in Venezuelan equine encephalitis virus pathogenesis. J Virol., 2000, v.74, p.914-922.

100. MacGregor RR, Ginsberg R, Ugen KE, Baine Y, Kang CU, Tu XM, Higgins T, Weiner DB, Boyer JD. T-cell responses induced in normal volunteers immunized with a DNA-based vaccine containing HIV-1 env and rev. AIDS, 2002, v. 16, no.16, p.2137-2143.

101. Mathiesen T, Broliden PA, Rosen J and Wahren B. Mapping of IgG subclass and T-cell epitopes on HIV proteins by synthetic peptides. Immunology, 1989, v. 67, p. 453-459

102. Mazanec M.B., Nedrud J.G., Kaetzel C.S., Lamm M.E. A three-tiered view of role oflgA in mucosal defense. Immunol, today, 1993, v.14, no. 9, p.430-435.

103. Meyer H, Sutter G, Mayr A. Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence. J Gen Virol., 1991, v.72, no. 5, 1031-1038.

104. Mills E., Cooper C., Guyatt G., Gilchrist A., Rachlis В., Sulway C., Wilson K. Barriers to participating in an HIV vaccine trial: a systematic review. AIDS, 2004, v.18, no. 17, p.2235-2342.

105. Moog C., Fleury H.J., Pellegrin I., Kirn A., Aubertin A.M. Autologous and hetrologous neutralizing antibody responses following initial seroconversion in human immunodeficiency virus type 1-infected individuals. J. Virol., 1997, v.71, p.3734-3741.

106. Moore CB, John M, James IR, Christiansen FT, Witt CS, Mallal SA. Evidence of HIV-1 adaptation to HLA-restricted immune responses at a population level. Science, 2002, v. 296. no. 5572, p.1439-1443.

107. Moore J. P. and Ho, D. D. Antibodies to discontinuous or conformationally sensitive epitopes on the gpl20 glycoprotein of human immunodeficiency virustype 1 are highly prevalent in sera of infected humans. J. Virol., 1993, v. 67, p.863-875.

108. Moore JP, Parren PW, Burton DR. Genetic subtypes, humoral immunity, and human immunodeficiency virus type 1 vaccine development J Virol., 2001, v.75, no. 13, p.5721-5729

109. Moss B, Flexner C. Vaccinia virus expression vectors. Ann Rev Immunol., 1987, v. 5, p. 305-324.

110. Murphy CG, Lucas WT, Means RE, Czajak S, Hale CL, Lifson JD, Kaur A, Johnson RP, Knipe DM, Desrosiers RC. Vaccine protection against simian immunodeficiency virus by recombinant strains of herpes simplex virus. J Virol., 2000, v.74, p.7745-7754.

111. Muster Т., Steindl F., Purtscher M., Trkola A., Klima A., Himmler G., Ruker F., Katinger H. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol., 1993, v. 67, p.6642-6647.

112. Muster Т., Guinea R., Trkola A., Purtscher M., Klima A., Steindl F., Palese P., Katinger H. Cross-neutralizing activity against divergent humant immunodeficiency virus type 1 isolates induced by the gp41 sequence

113. ELDKWAS. J. Virol., 1994, v. 68, p.4031-4034.

114. Newman P.A., Duan N., Rudy E.T., Anton P.A. Challenges for HIV vaccine dissemination and clinical trial recruitment: if we build it, will they come? AIDS Patient Care STDS, 2004, v. 18, no.12, p.691-701.

115. Ongoing trials of preventive HIV vaccines (Feb., 2005). IAVI Report, 2005, v.3, no.l.

116. Palese P, Zavala F, Muster T Development of novel influenza virus vaccines and vectors. J Infect Dis., 1997, v. 176, S45-S49.

117. Pancera M., Wyatt R. Selective recognition of oligomeric HIV-l primary isolate envelope glycoproteins by potently neutralizing ligands requires efficient precursor cleavage. Virology, 2005, v.332, no.l, p. 145-156.4

118. Pilcher H. Snapshot of a pandemic. Nature, 2004, v.430, no.6996, p.134-135.

119. Pitisuttithum P. HIV-l prophylactic vaccine trials in Thailand. Curr HIV Res. 2005, v, 3, no.l, p. 17-30.

120. Price DA, Goulder PJ, Klenerman P, Sewell AK, Easterbrook PJ, Troop M, Bangham CR, Phillips RE. Positive selection of HIV-l cytotoxic T-lymphocyteescape variants during primary infection. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, v. 94, no. 5, p. 1890-1895

121. Pope M. Dendritic cells as a conduit to improve HIV vaccines. Curr. Mol. Med., 2003, v.3, no.3, p.229-242.

122. Re M. C., Furlini G., Vignoli M., Ramazzotti E., Roderigo G., De Rosa V., Zauli

123. G., Lolli S., Capitani S., La Placa M. Effect of antibody to HIV-1 Tat protein on viral replication in vitro and progression of HIV-1 disease in vivo. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 1995, v. 10, p.408-416.

124. Richmond J.F.L., Lu S., Santoro J.C., Weng J., Hu S., Montefiori D.C., Robinson

125. H.L. Studies of the neutralizing activity and avidity of anti-human immunodeficiency virus type 1 env antibody elicited by DNA priming and proteinboosting. J. Virol., 1998, vol. 74, no. 13, p.9092-9100.

126. Rizzuto C. D. and Sodroski J. G. Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization. J. Virol., 1997, v. 71, p.4847-4851.

127. Robinson A J., Gazzard B.G. Rising rates of HIV infection. BMJ, 2005, v.330, no. 7487, p.320-321.

128. Sauter S.L., Rahman A., Muralidhar G. Non-replicating viral vector-based AIDS vaccines: interplay between viral vectors and the immune system. Curr HIV Res., 2005, v.3, no.2, p.157-181.

129. Shiver J. A non-replicating adenoviral vector as a potential HIV vaccine. Res. Initiat. Treat. Action, 2003, v.8, no.2, p. 14-16.

130. Shiver JW, Fu TM, Chen L, Casimiro DR, Davies ME, Evans RK1. Replication-incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency-virus immunity. Nature, 2002, v. 415, no. 6869, p.331-335.

131. Silversides A. Canada finally begins long journey to an HIV vaccine. CMAJ, 2004, v.170, no. 12, p.1777.

132. Smith K.A. The HIV vaccine saga. Med. Immunol, 2003, v.2, no.l., p.1-6

133. Srivastava I.K., Ulmer J.B., Barnett S.W. Neutralizing antibody responses to HIV: role in protective immunity and challenges for vaccine design. Expert. Rev. Vaccines, 2004 v.3, suppl.l, p.33-52.

134. Starr S.E. Immune reconstitution in HIV-infected individuals Wath will it take? The Immunologist, 1998, v.6, no. 1, p. 19-22

135. Suni M.A., Picker L.J., Maino V.C. Detection of antigen-specific T-cell cytokine expression in whole blood by flow cyton^try. J. Immunol. Meth., 1998, v.212.-p.89-98.

136. Tavegp T. Cellular and humoral immune responses to a canarypox vaccine containing human immunodeficiency virus type 1 Env, Gag, and Pol in combination with RGP120. J Infect Dis., 2001, v.18, p.563-570.

137. Thali M, Moore JP, Furman C, Charles M, Ho DD, Robinson J, Sodroski J. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gpl20 neutralization epitopes exposed upon gpl20-CD4 binding. J. Virol., 1993, v.61, p.978-988.

138. Townsend A, Bodmer H. Antigen recognition by class 1-restricted T-lymphocytes. Annu. Rev. Immunol., 1989, v.7, p. 601-624.

139. Trkola A., Dragic Т., Arthos J., Binley J.M., Oslon W.C., Allaway G.P., Cheng-Mayer C., Robinson J., Maddon P.J., Moore J.P. CD4-dependent, antibody-sensitive interactions between HIV-1 and its coreceptor CCR-5. Nature, 1996, v.384,p.l84- 187.

140. Understanding AIDS Vaccines, 2004.

141. VaxGen announces results from Thai AIDS VAX trial. IAVI REPORT, 2004, v.7, no.3.

142. Walgate R. AIDS vaccine research riding high. Bull of WHO, 2001, v.79, No5, pp 484-485

143. Wange R, Samelson L. Complex complexes: signaling at the TCR. Immunity, 1996, v.5, p.197-205

144. Weiss A, Littman D. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell, 1994, v.76, p.263-274

145. Westendorp M. O., Frank R., Ochsenbauer C., Strieker K., Dhein J., Walczak H., Debatin К. M., Krammer P. H. Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by HIV-1 Tat and gpl20. Nature, 1995, v. 375, p. 497-500.

146. Whatmore AM, Cook N, Hall GA, Sharpe S, Rud EW, Cranage MP. Repair and evolution of nef in vivo modulates simian immunodeficiency virus virulence. J Virol., 1995, v.69, no. 8, p.5117-5123.

147. S 193. Wierzbicki A, Kiszka I, Kaneko H, Kmieciak D, Wasik TJ, Gzyl J, Kaneko Y,

148. Kozbor D. Immunization strategies to augment oral vaccination with DNA and viral vectors expressing HIV envelope glycoprotein. Vaccine, 2002,v.20 (9-10), p. 1295-1307

149. Xiao Y, Liao M, Lu Y, Dierich MP, Chen YH. Epitope-vaccines: a new strategy to induce high levels of neutralizing antibodies against HIV-1. Immunobiology. 2000, v. 201, no.3-4, p. 323-331.

150. Xu X, Laffert B, Screaton G. Induction of Fas ligand expression by HIV involves the interaction of Nef with the T cell receptor zeta chain. J Exp Med., 1999, v. 189, p.1489-1496.

151. Yang O, Walker B. CD8 + cells in human immunodeficiency virus type I pathogenesis: cytolytic and noncytolytic inhibition of viral replication. Adv Immunol., 1997, v.66, p.273-311.

152. Yokoyama W. Natural killer cell receptors. Curr Opin Immunol., 1998, v. 10, p.298-305.

153. Zagury J. F., Sill A., Blattner W., Lachgar A., Le Buanec H., Richardson M., Rappaport J., Hendel H., Bizzini В., Gringeri A., Carcagno M., Criscuolo M.,

154. Burny A., Gallo R. C., Zagury D. Antibodies to the HIV-1 Tat protein correlatedwith nonprogression to AIDS: a rationale for the use of Tat toxoid as an HIV-1 vaccine. J Hum Virol, 1998, v.282, p.92.

155. Zhang L, Yu W, He T, Yu J, Caffrey RE, Dalmasso EA, Fu S, Pham T, Mei J, Ho JJ, Zhang W, Lopez P, Ho DD. Contribution of human alpha-defensin 1, 2, and 3 to the anti-HIV-l activity of CD8 antiviral factor. Science, 2002, v. 298, no. 5595, p. 995-1000.

156. Zinkernagel RM, Doherty PC. МНС-restricted cytotoxic T cells: Studies of the biological role of polymorphic major transplantation antigens determining T cellrestriction specificity, function, and responsiveness. Adv Immunol., 1979, v.27, p.51-177.

157. Zinkernagel R.M. Immunity, immunopathology and vaccines against HIV? Vaccine, 2002, v.20, no.15, p.1913-1917.

158. Zolla-Pazner S. Identifying epitopes of HIV-1 that induce protective antibodies. Nat. Rev. Immunol., 2004, v.4, no.3, p. 199-210.

159. Zwick MB, Wang M, Poignard P, Stiegler G, Katinger H, Burton DR, Parren PW. Neutralization synergy of human immunodeficiency virus type 1 primary isolates by cocktails of broadly neutralizing antibodies. J Virol., 2001, v. 75, no. 24, p. 12198-208.