Микробные биокатализаторы для биосенсорных систем анализа токсичных соединений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, доктор биологических наук Игнатов, Олег Владимирович

• Игнатов, Олег Владимирович
• доктор биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации доктор биологических наук Игнатов, Олег Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1 Биосенсорные системы на основе микробных 17 клеток.

ГЛАВА 2 Электрофизические свойства микробных клеток. 44 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3 Материалы и методы

ГЛАВА 4 Респираторная активность микробных клеток 70 при метаболизме акриловой кислоты и её производных а) Респираторная активность микробных клеток, обла- 75 дающих амидазной активностью б) Респираторная активность микробных клеток, обла- 91 дающих нитрилазной активностью в) Респираторная активность микробных клеток, обла- 107 дающих нитрилгидратазной и амидазной активностью г) Респираторная активность микробных клеток в отно- 127 шении акриловой кислоты

ГЛАВА 5 Респираторная активность микробных клеток 147 при метаболизме ароматических соединений а) Респираторная активность микробных клеток, обла- 147 дающих системой подготовительного метаболизма фенола б) Респираторная активность микробных клеток, обла- 156 дающих системой подготовительного метаболизма п-нитрофенола.

ГЛАВА 6 Иммобилизация микробных клеток для биоде- 169 струкции и биосенсорных систем.

ГЛАВА 7 Определение производных акриловой кислоты и 181 ароматических соединений в образцах модельных сточных вод

ГЛАВА 8 Электрооптические свойства микробных суспен- 197 зий при метаболизме токсичных соединений. а) Электрооптические свойства микробных клеток штам- 199 ма Вгеу/ЪасЯеЬит эр. 13ПА при метаболизме акриламида б) Электрооптические свойства микробных клеток штам- 221 ма Аапе&Ьа&ег са1соасеИсит А-122 при метаболизме п-нитрофенола в) Сравнительные исследования специфической респи- 234 раторной активности клеток и электрооптических свойств клеточных суспензий. г) Исследование электрооптических свойств клеточных 249 суспензий при ингибировании ферментативной активности клеток.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Микробные биокатализаторы для биосенсорных систем анализа токсичных соединений»

Актуальность проблемы

Микробные биосенсорные системы впервые появились непосредственно после создания первых ферментных электродов в конце 60-х годов нашего века. Вместо фермента в них используются микробные клетки, обладающие специализированными ферментативными системами метаболизма, субстратами в которых являются определяемые в процессе анализа соединения и физико-химический датчик, регистрирующий тот или иной параметр. Общепринятым является классификация биосенсорных систем по типу применяемого датчика - биосенсоры на основе кислородного электрода, ио-носелективного электрода и т.д. В работе рассматриваются два типа биосенсорных систем - на основе кислородного электрода Кларка, и на основе регистрации электроориентации клеток в переменном электрическом поле, который, с нашей точки зрения, является одним из прототипов биосенсорных систем ближайшего будущего.

Под биокатализатором обычно понимают фермент, обладающий той или иной каталитической активностью [Ленинджер,1985]. Под микробным биокатализатором понимается микробная клетка, обладающая определенной ферментативной активностью [Бест, 1988].

Выбор в качестве объекта исследований микробных клеток, способных использовать ряд токсичных соединений в качестве единственного источника углерода и энергии, обусловлен тем что биосенсорные системы на основе целых клеток микроорганизмов значительно дешевле, чем аналогичные устройства на основе ферментов, и позволяют создавать одноразовые чипы для применения в анализе.

Загрязнение окружающей среды стимулировало развитие биосенсорных методов, направленных на определение токсичных соединений. В связи с этим, в последние десятилетия происходит быстрый рост исследований, посвященных созданию способов определения химических соединений с применением биологических компонентов. Таким новым (в плане биосенсорного анализа) классом соединений являются акриловая кислота и её производные, наиболее известными из которых являются нитрил акриловой кислоты и акриламид. Выбор этой группы соединений для создания микробных биокатализаторов обусловлен, прежде всего, их практическим значением для промышленности и охраны окружающей среды. Они высоко токсичны и при попадании в окружающую среду способны влиять как на водные биоценозы, в случае их попадания в составе сточных вод в водные среды, так и на теплокровных животных, а также на человека, при попадании в пищевые продукты. Другим классом органических соединений являются ароматические вещества, в частности, нитроарома-тические соединения. Они часто используются в качестве пестицидов и являются широко распространенными ксенобиотиками, попадающими в окружающую среду при сельскохозяйственных работах. Несмотря на значительное количество работ, посвященных биосенсорам для определения различных токсичных соединений, исследования, касающиеся определения акриловой кислоты, акриламида и нитрила акриловой кислоты, нитроароматических соединений, до настоящего времени отсутствуют. С нашей точки зрения это объясняется двумя причинами. Во-первых, биосенсоры возникли сравнительно недавно, и в настоящий момент реализована лишь часть потенциальных возможностей данного, направления и, во-вторых, жесткая конкуренция на мировом рынке аналитических приборов ограничивает финансовые ресурсы коммерческих фирм (как правило, мелких и средних), производящих биосенсоры для развития новых систем анализа.

Начиная с 70-х годов нашего века, получила развитие очень интересная и перспективная область исследований -электрофизический анализ микробных клеток. Перспективность данного направления обусловлена с одной стороны потребностями микробиологической промышленности и медицины в быстром и эффективном анализе функционального состояния клеток, с другой стороны преимуществами электрофизического анализа по сравнению с другими методами. Такими преимуществами являются, прежде всего, быстрота проведения анализа целых, не разрушенных клеток, возможность полной автоматизации процессов анализа и т.д. Начиная ещё с 70-х годов, с классических работ Дженнингса [Morris & Jennings, 1977; Jennings & Oakley, 1988 и др.], было принято исследовать весьма ограниченное количество биологических моделей, например, таких как реакция антител или вирусов с микробной клеткой, повреждение клеток под воздействием различных физико-химических факторов (теплового шока, тяжелых металлов, поверхностно-активных веществ, антибиотиков) и т.д. Основное развитие в этой области шло по двум путям - создание нового приборного обеспечения и предложение различных электрофизических моделей клетки. Однако, как неоднократно отмечалось, например, в серии последних обзоров Яна Гимзы [Gimsa, 1999; Eppmann, Pruger & Gimsa, 1999 и др.] в данный момент невозможно предложить удовлетворительную электрофизическую модель поведения клетки в переменном электрическом поле и, поэтому значительное количество фактов можно получить только с помощью эксперимента. Одна из идей нашей работы заключалась в экспериментальном подтверждении предположения, что электрофизические свойства микробных клеток могут меняться не только при повреждении клеток или при их взаимодействии с антителами или другими агентами, но и при ферментативном катализе происходящем в клетках. В качестве модели были использованы клетки, обладающие ферментативной системой подготовительного метаболизма токсичных соединений (акриламида и п-нитрофенола). Практически это может привести к созданию новых методов ферментативной активности целых клеток и нового типа биосенсорных систем.

Целью работы является создание новой методологии анализа низкомолекулярных токсичных соединений на основе микробных биокатализаторов, обладающих специализированными ферментативными системами метаболизма этих соединений и разработка новых методических подходов для определения ферментативной активности микробных клеток. Задачи исследования: 1. Разработать методологические основы и экспериментально обосновать возможность создания микробных биокатализаторов для определения акриловой кислоты и её производных - акриламида и нитрила акриловой кислоты на основе микробных клеток, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма данных соединений.

2. Разработать методические подходы для определения п-нитрофенола и фенола с помощью микробных биокатализаторов на основе микробных клеток, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма ароматических соединений. Разработать методы иммобилизации микробных клеток в полисахаридные гели с сохранением их ферментативной активности.

3. Провести определение токсичных соединений с помощью микробных биокатализаторов в образцах сточных вод. Исследовать влияние отдельных компонентов сточных вод на ферментативную активность микробных биокатализаторов.

4. Исследовать зависимость электрооптических свойств микробных суспензий от процессов клеточного метаболизма низкомолекулярных токсичных соединений. Установить влияние процессов неспецифического взаимодействия субстрата с клетками на электрооптические свойства клеточных суспензий.

5. Экспериментально обосновать способ определения ферментативной активности микробных клеток по изменению их электрофизических характеристик.

6. Исследовать взаимосвязь электрооптических свойств микробных суспензий и специфической респираторной активности клеток при метаболизме токсичных субстратов в условиях ингибирования ферментативной активности клеток.

7. Исследовать возможность определения токсичных соединений с помощью электрофизических свойств микробных клеток, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма.

8. Сформулировать принцип и экспериментально показать возможность создания биосенсорной системы для определения низкомолекулярных соединений на основе регистрации электрофизических свойств микробных биокатализаторов. Научная новизна.

Впервые решена задача биосенсорного определения акриловой кислоты и её производных (акриламида и нитрила акриловой кислоты), имеющих важное народнохозяйственное значение. Установлено, что микробные клетки, обладающие амидазной, нитрилазной, нитрилгидратазной ферментативными системами подготовительного метаболизма акриловой кислоты, акриламида, нитрила акриловой кислоты могут являться биокатализаторами биосенсорной системы на основе кислородного электрода. Показано, что наличие конститутивных и индуцибельных ферментативных систем в микробных клетках позволяет получать микробные биокатализаторы с различной селективностью респираторного ответа, и соответственно селективно определять отдельные субстраты при их совместном присутствии в растворе. Исследованы факторы, влияющие на активность ферментативных систем подготовительного метаболизма микробных клеток. Изучена селективность микробных биокатализаторов при определении акриловой кислоты, акриламида, нитрила акриловой кислоты. Проведен количественный анализ образцов сточных вод с помощью микробных биокатализаторов и кислородного электрода.

С помощью метода электроориентации клеток в переменном электрическом поле впервые установлено, что электрофизические свойства микробных клеток могут изменяться в процессе метаболизма низкомолекулярных субстратов. Показано, что изменение электрофизических свойств микроорганизмов не связано с неспецифическим взаимодействием низкомолекулярного субстрата с клеткой, а является следствием функционирования клеточных систем подготовительного метаболизма данного субстрата. Ингибирование ферментативных систем подготовительного метаболизма токсичных соединений микробных клеток путем лимитирования доступа кислорода, изменения рН и температуры приводит к практически синхронным изменениям значения специфической респираторной активности и электрооптических свойств клеточных суспензий.

Впервые решена задача использования электрооптического анализа микробной суспензии для определения ферментативной активности микробных клеток при метаболизме низкомолекулярных соединений. Установлено, что электрофизические характеристики микробных клеток, обладающих специфической ферментативной системой подготовительного метаболизма токсичных соединений, могут быть использованы для их количественного определения и создания нового типа биосенсорной системы на основе электрооптического анализа или аналогичных видов анализа электрофизических параметров микробных биокатализаторов.

Практическая значимость исследований определяется созданием новой группы методов биосенсорного анализа акриловой кислоты, акриламида и акрилонитрила по респираторной активности микробных клеток, на которые получены патенты Российской Федерации №№ 2083669 и 2112978. Предложены условия селективного определения данных соединений в их смеси. Эти методы создают основу для конструирования приборов по определению акриловой кислоты и её производных в водных средах для решения задач производства и контроля окружающей среды.

Разработан способ количественной оценки п-нитрофенола и фенола по респираторной активности микробных клеток. Разработаны способы иммобилизации микробных клеток, сохраняющих биодеструктивную активность по отношению к токсичным соединениям. Получены авторские свидетельства СССР на изобретения на способ получения иммобилизованных микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики (№ 1705345,1992г.) и на способ получения биокатализатора в по-лисахаридном носителе (№ 1742330,1992г.). Установлена возможность использования полисахаридных носителей для получения иммобилизованных клеток, которые могут использоваться в биосенсорных системах.

На экспериментальной базе Государственного унитарного предприятия «Саратовский НИИ полимеров» осуществляются работы по созданию биосенсорной системы определения ак-риламида и нитрила акриловой кислоты в водных средах и её адаптации к условия производства. Акт о внедрении находится в приложении к диссертации.

Материалы диссертации использовались для научно-практических разработок в в/ч 61469. Акт о внедрении утвержден командиром в/ч 61469 д.т.н., профессором, генерал-майором Н.И.Алимовым.

Создана принципиально новая методология определения ферментативной активности микробных клеток на основе измерения их электрофизических свойств, на который получен патент Российской Федерации № 2103366. Электрооптический анализ микробной суспензии позволяет определить ферментативную активность микробных клеток, применяемых в различных микробиологических процессах. Полученные экспериментальные результаты показывают, что анализ электрофизических свойств микробных клеток является методологической основой для создания принципиально новой микробной биосенсорной системы определения низкомолекулярных соединений.

Материалы, представленные в диссертации, используются при обучении студентов и аспирантов на кафедре микробиологии с вирусологией и иммунологией Саратовского Государственного Медицинского Университета, кафедре биохимии и биофизики Саратовского Государственного Университета, базовой кафедре биофизики Высшего Колледжа Прикладных Наук при Саратовском Государственном Университете, кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Института ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского Государственного Аграрного университета (акты о внедрении находятся в приложении к диссертации).

Исследования по теме диссертационной работы были частично поддержаны грантами Научного Совета «Инженерная энзимология» ГПНП «Новейшие методы биоинженерии» и Министерства науки Российской Федерации в рамках Международных научно-технических проектов «ЕОЭТ».

На защиту выносятся следующие положения:

1.Разработан комплекс методических приемов получения микробных биокатализаторов для определения акриловой кислоты и её производных - акриламида и нитрила акриловой кислоты. Микробные клетки, обладающие амидазной активностью, могут использоваться в качестве микробных биокатализаторов для определения акриламида и акриловой кислоты; микробные клетки обладающие нитрилазной активностью могут быть использованы в качестве микробных биокатализаторов для определения нитрила акриловой кислоты и акриловой кислоты; микроорганизмы, обладающие нитрилгидратазной активностью могут быть использованы в качестве микробных биокатализаторов для определения акриламида, нитрила акриловой кислоты и акриловой кислоты. Для определения акриловой кислоты и её производных с помощью микробных клеток используется кислородный электрод. Биокатализаторы на основе микробных клеток позволяют количественно определять акриловую кислоту, ак-риламид и нитрил акриловой кислоты в сточных водах.

2.Разработаны методические приемы для определения фенола и п-нитрофенола с помощью микробных биокатализаторов в сточных водах. Иммобилизация микробных клеток включением в полисахаридные гели агар-агара и фурцел-ларана и полимеризация гранул с клетками в гидрофобной фазе сохраняет биодеструктивную и респираторную активность клеток.

3.Процессы микробного метаболизма токсичных субстратов (акриламида и п-нитрофенола) влияют на электрооптические свойства клеточных суспензий. Процессы неспецифического взаимодействия субстрата с клетками не оказывают влияния на электрооптические свойства клеточных суспензий.

4.Ингибирование процессов метаболизма путем лимитирования доступа кислорода, изменения рН и температуры приводит к синхронным изменениям значения специфической респираторной активности и электрооптических свойств клеточных суспензий, что непосредственно подтверждает зависимость электрофизических свойств клеток от метаболизма исследуемых субстратов.

5.Принцип использования электрофизических свойств микроорганизмов для определения активности специализированных ферментативных систем микроорганизмов, в том числе ферментативных систем, осуществляющих подготовительный метаболизм токсичных соединений акриламида и п-нитрофенола.

6.Принцип биосенсорной системы для определения низкомолекулярных соединений с помощью электрофизических свойств клеток на основе микроорганизмов, обладающих специализированными ферментативными системами метаболизма определяемых соединений.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на Всероссийских и Международных симпозиумах и конференциях: Всесоюзной конференции «Молодые ученые - биотехнологии» (апрель 1989,Москва), «Новые направления биотехнологии» (октябрь 1990 Пущино), 8th International Biodeterioration & Biodégradation Symposium (August 1990, Windsor, Canada), Научно-практической конференции «Экология и здоровье» (ноябрь 1991, Саратов), Всесоюзной конференции «Химические превращения пищевых полимеров» (апрель 1991 г.,Светлогорск), 6th European Symposium on Carbohydrate Chemistry (September 1991 Edinburg, United Kingdom), V конференция Российской Федерации «Новые направления биотехнологии» (май, 1992 Пущино), XVIth International Carbohydrate Symposium (July 1992, Paris, France), 6th European Congress on Biotechnology (June 1993,Firenze, Italy), International Symposium/Workshop on Environmental Biotechnology (July, 1994 Waterloo, Canada), 3 World Congress on Biosensors (June, 1994, New Orlean,USA), 7th European Congress on Biotechnology (February 1995,Nice, France), III Межреспубликанской научно-техническая конференции «Процессы и оборудование экологических производств» (май, 1995, Волгоград); 3rd International Symposium «Global Environmental Biotechnology Approaching the year 2000» (July, 1996,Boston, USA); Second Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Environmental Analysis (September, Lund, Sweden, 1996); European Conference on Analytical Chemistry «Euroanalysis IX» (September, 1996,Bologna, Italy); 1 Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (октябрь, 1996,Пермь), IV World Congress on Biosensors «Biosensors 96», (May 1996, Bangkok,Thailand,), 8th International Fair and Congress for Sensors, Transducers & Systems (May 1997, Nurenberg, Germany), 8th European Congress on Biotechnology (August, 1997,Budapest, Hungary); 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (August, 1997,San Francisco, California, USA), 2nd International Colloquium on Process Related Environmental Ana

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Игнатов, Олег Владимирович

ВЫВОДЫ

1.Разработаны методологические подходы для использования ферментативной активности микроорганизмов в определении акриловой кислоты и её производных - акриламида и нитрила акриловой кислоты. На примере штамма Brevibacterium sp. 13ПА показано, что существует возможность использовать микробные клетки, обладающие амидазной активностью в качестве микробных биокатализаторов для определения акриламида и акриловой кислоты, на примере штаммов Pseudomonas pseudoalcaligenes КМ-6П установлено, что существует возможность использовать клетки обладающие нит-рилазной активностью в качестве микробных биокатализаторов для определения нитрила акриловой кислоты и акриловой кислоты и на примере клеток штамма Rhodococcus rhodochrous М8 показано, что существует возможность использовать микроорганизмы, обладающие нитрилгидратазной и амидазной активностью в качестве микробных биокатализаторов для определения акриламида, нитрила акриловой кислоты и акриловой кислоты. Установлено, что для определения акриловой кислоты и её производных можно использовать кислородный электрод.

2.При определении акриловой кислоты, акриламида и нитрила акриловой кислоты в сточных водах показано, что биокатализаторы на основе микробных клеток, обладающих специфической ферментативной активностью позволяют количественно определять данные соединения. На примере клеток штамма Brevibacterium sp. 13ПА установлено, что могут быть получены биокатализаторы на основе клеток одного штамма, обладающие различной специфичностью к определяемым субстратам - акриловой кислоте и акриламиду, что позволяет селективно определять акриловую кислоту и акриламид при их совместном присутствии в анализируемом образце.

3.На примере клеток штаммов Pseudomonas putida GFS8 и Acinetobacter calcoaceticum А122 разработаны методические приемы определения фенола и л-нитрофенола с помощью респираторной активности микроорганизмов. Установлено, что биокатализаторы на основе клеток штамма Pseudomonas putida GFS8 позволяют определять фенол в сточных водах производства фенола кумольным способом, а биокатализаторы на основе клеток штамма Acinetobacter calcoaceticum А-122 определять л-нитрофенола в сточной воде производства инсектицида метафоса.

4. На примере клеток штамма Pseudomonas putida GFS8 установлено, что после иммобилизации микробных клеток в гели полисахаридов агар-агара и фурцелларана путем внесения клеток в водный раствор полисахарида и полимеризации гранул с включенными клетками в гидрофобной фазе сохранялась ферментативная активность клеток и они могут быть использованы для биодеструкции и определения фенола.

5.На примере штаммов Brevibacterium sp. 13ПА и Acinetobacter calcoaceticum А-122 с помощью метода электроориентации клеток в переменном электрическом поле показано, что существует зависимость электрооптических свойств микробных суспензий от процессов клеточного метаболизма низкомолекулярных соединений акриламида и п-нитрофенола. Изменения электрооптических свойств клеточных суспензий наиболее выражены в диапазоне частот от 10 до 1000 кГц. В контрольных экспериментах установлено, что процессы неспецифического взаимодействия субстрата с клетками не оказывают влияния на электрооптические свойства клеточных суспензий.

6.На примере штаммов ВгеУ1'Ьа&егшт эр. 13ПА и yAc/пefoЬacíer са1соасеИсит (К\Т1 установлена корреляция между изменениями электрооптических свойств микробных суспензий и специфической респираторной активностью клеток по отношению к метаболизируемому субстрату. Показано, что ингибирование процессов метаболизма путем лимитирования доступа кислорода, изменения рН и температуры приводит к синхронным изменениям значения специфической респираторной активности и электрооптических свойств клеточных суспензий, что подтверждает зависимость электрофизических свойств клеток от метаболизма исследуемых субстратов.

7.Предложен принцип применения электрофизических свойств микроорганизмов для определения активности специализированных ферментативных систем микроорганизмов, в том числе, осуществляющих подготовительный метаболизм токсичных соединений акриламида и л-нитрофенола. Исследованы электрофизические свойства клеточных суспензий в процессе периодического культивирования микроорганизмов. Установлено, что ферментативная активность микробных клеток, определенная по изменению электрооптических характеристик их суспензий, корррелирует с ферментативной активностью клеток, определенной традиционным методом.

8.Предложен принцип определения химических соединений, являющихся субстратами для ферментативных систем микробных биокатализаторов с помощью регистрации электрофизических параметров микробных клеток. Установлено, что существует прямая зависимость между изменениями электрофизических свойств микроорганизмов при метаболизме низкомолекулярных соединений и концентрацией субстрата.

9.Впервые сформулирован принцип построения биосенсорной системы для определения низкомолекулярных соединений с помощью электрофизических свойств клеток. Биокатализаторами в такой системе являются микроорганизмы, обладающие специализированными ферментативными системами для метаболизма определяемых соединений, изменение их электрофизических свойств может регистрироваться с помощью метода ориентации клеточной суспензии в переменном электрическом поле или другими аналогичными методами, позволяющими регистрировать электрофизические свойства клеток. На примере клеток штамма АстеЬЬа&ег са1соасеИсит А-122 показана корреляция между специфической респираторной активностью микробных биокатализаторов по отношению к п-нитрофенолу и изменениями электрооптических свойств клеточной суспензии данного штамма при метаболизме того же субстрата. Показано, что линейные диапазоны зависимостей респираторного ответа клеток и электрооптических свойств клеточной суспензии практически совпадают. Такое сравнение

Заключение

За последние два десятилетия интенсивно развиваются два новых направления научных исследований - биосенсорные системы анализа и изучение электрофизических характеристик клеток. Это связано с несколькими причинами. Во-первых, это существование проблем, для решения которых могут применяться системы, созданные на основе биологии и электроники. Во-вторых, - прогресс в электронике и компьютерной технологии, позволяющий создавать микрочипы и полностью автоматизировать процесс анализа и обработки результатов. В-третьих, - прогресс в молекулярной биологии клетки, позволяющий в случае необходимости создавать ре-комбинантные штаммы микроорганизмов, обладающих заданными свойствами. По своей сути биосенсорные системы и электрофизический анализ клеток это тесно связанные области исследований часто переходящие одна в другую, что наглядно демонстрируется, например, в монографии под редакцией Энтони Тернера и др. [Биосенсоры .,].

Целью работы являлось создание новой методологии анализа низкомолекулярных токсичных соединений на основе микробных биокатализаторов обладающих специализированными ферментативными системами метаболизма этих соединений и создание новых методических подходов для определения ферментативной активности микробных клеток.

Прежде всего, необходимо определить, что понимается под биосенсорной системой и микробным биокатализатором. Общепринятым является классификация биосенсорных систем по типу применяемого датчика - биосенсоры на основе кислородного электрода, ионоселективного электрода и т.д. В нашей работе рассматриваются два типа биосенсорных систем -на основе кислородного электрода Кларка, который на сегодняшний день является в определенной мере классической системой, и на основе регистрации электроориентации клеток в переменном электрическом поле, который, с нашей точки зрения, является одним из прототипов биосенсорных систем ближайшего будущего. Под биокатализатором обычно понимают фермент, обладающий той или иной каталитической активностью [Ленинджер,1985]. Под микробным биокатализатором понимается микробная клетка, обладающая определенной ферментативной активностью [Бест, 1988].

Работа состоит из двух частей. В первой рассматриваются возможности создания микробных биокатализаторов для определения ряда химических соединений, для которых ранее не была показана возможность определения с помощью каких-либо биологических систем анализа (акриловая кислота, её производные - акриламид и акрилонитрил, п-нитрофенол). Кроме того, в этой части исследована возможность определения анализируемых соединений в сточных водах и иммобилизации клеток в полисахаридные носители.

Во второй части диссертации исследуются электрофизические свойства клеток штаммов, обладающие ферментативными системами метаболизма токсичных соединений. Клетки, исследуемые в первой части работы были использованы в качестве модели. Электрофизические свойства клеток изучались с помощью метода электроориентации клеток в переменном электрическом поле.

Прежде всего, по первой части работы необходимо обосновать правильность выбора микробных клеток как биологического элемента для создания микробных биокатализаторов в биосенсорных системах определения акриловой кислоты и её производных. Это обусловлено несколькими обстоятельствами. Во-первых, биосенсорные системы на основе целых клеток микроорганизмов значительно дешевле, чем аналогичные устройства на основе ферментов, и позволяют создавать одноразовых чипы для однократного применения в анализе. Во-вторых, существует перспектива развития микробных биокатализаторов для создания медиаторных биосенсорных систем. В-третьих, одни и те же микробные клетки могут быть использованы как для исследования респираторной активности с кислородным электродом, так и в качестве модели при анализе их электрофизических свойств.

Выбор акриловой кислоты и её производных в качестве анализируемых соединений в биосенсорной системе анализа обусловлен двумя обстоятельствами. Во-первых, это широкая распространенность этих соединений в промышленности. Так, полиакриламид широко используется в качестве флокулянта для очистки питьевой и сточной вод, производства бумаги и целлюлозы, получения вторичных и третичных нефтепродуктов, для добычи и переработки полезных ископаемых. В виде 5% раствора акриламид используется как средство для цементирования [Акриламид, 1989]. По данным на 1990 г. ежегодно в мире производится 200 тыс. тонн акриламида [№да-Ба\л/а & Уатас1а, 1990]. Акрилонитрил входит в состав акриль-ного и акрилонитрильного волокна, из которого изготавливают одежду и предметы домашнего обихода. Бутадиен-акриловый каучук незаменим в производстве деталей автомобилей и других резиновых изделий. Акрилонитрильные полимеры и сополимеры являются компонентами винилпластовых покрытий, целлофана, различных пластиков, бумаги и картона, клея и др. Кроме того, из акрилонитрила синтезируют акриламид и акрилаты [Акрилонитрил., 1987]. Известно, что акрилонитрил является одним из 50 наиболее широко используемых химических соединений в США [Liu et al, 1993]. Акриловая кислота в большом количестве применяется для производства эфиров, например, бутилакрилата, этилакрилата, из которых получают различные полимеры. Кроме того, акриловую кислоту используют для производства полиакрилатных суперабсорбентов и поликарбоксилатных диспергирующих агентов. [Hamilton et al., 1995] Соли полиакриловой кислоты применяют в производстве кож, для шлихтовки искусственных волокон. Кроме того, акриловая кислота и ее соли используются как добавки к печатным краскам и пастам, как компоненты лаков и др. [Краткая химическая энциклопедия, 1962].

V./

Во-вторых, эти соединения токсичны для человека и животных. В многочисленных работах показан канцерогенный, мутагенный и общетоксический эффект этих соединений на человека и животных [Беспамятов и Кротов, 1985; Willhite & Smith, 1981; Venitt et al., 1977; Maltoni et al., 1982; Акрилонитрил, 1987] и др. Основным источником загрязнения природы акриловыми производными являются промышленные сточные воды и аварийные выбросы при транспортировке и хранении данных соединений. По данным на 1987 г. сточные воды различных предприятий, использующих в производственных процессах акрилонитрил, содержали его в концентрации до 0,1 г/л. [Акрилонитрил.,1987]. Кроме того, было рассчитано, что в 1974 в США суммарные выбросы акрилонитрила в окружающую среду из промышленных источников составили около 2,2% от его произведенного количества. Известны случаи локального загрязнения питьевой воды акриламидом при его использовании для цементирования грунта: в одном из колодцев, вблизи которого проводились работы, была зарегистрирована концентрация акриламида 400 мг/л [1д1ви е! а1., 1975]. По оценкам компании "Доу кемикл" выбросы акриламида в окружающую среду в процессе его производства и применения могут достигать 95 т в год [Акриламид., 1989]. С нашей точки зрения, эти обстоятельства являются достаточным обстоятельством для создания биосенсорных систем анализа акриловой кислоты и её производных и соответственно микробных биокатализаторов.

В нашей работе использовались штаммы микроорганизмов, выделенные в Саратовском Филиале ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов для систем локальной микробиологической очистки сточных вод от акриловой кислоты, акрилонитрила, акриламида. Все используемые штаммы обладали специализированной ферментативной системой подготовительного метаболизма этих соединений. В таблице 1 представлены ферментативные реакции, которые лежат в основе предварительного метаболизма определяемых соединений для каждого из исследуемых штаммов. Поскольку в результате этих реакций образуется акриловая кислота, подвергающаяся при дальнейшем метаболизме окислению, было принято решение об использовании для определения субстратов специфической респираторной активности по отношению к субстрату. Респираторная активность определялась с помощью кислородного электрода. Таким образом, прототипом аналитической системы в первой части наших исследований выступали биосенсоры на основе кислородного электрода. Такие системы являлись первыми биоаналитическими приборами, однако, они широко применяются и сегодня, что подтверждает, например, работа профессора Исао Карубе [Карубе,1992]. Процедура измерения респираторной активности клеток являлась традиционной и включала в себя внесение суспензии клеток в ячейку и регистрацию их респираторной активности до и после внесения субстрата.

Схема работы по каждому из штаммов была общей: проводилась оптимизация условий получения биомассы и проведения анализа их респираторной активности. Целью этих процедур являлся выбор условий для получения максимальной респираторной активности клеток к определяемому субстрату. После этого определялись концентрационная зависимость CPA клеток по отношению к субстрату и селективность респираторного ответа клеток по отношению к различным субстратам.

На первом этапе изучались клетки бактериального штамма Brevibacterium sp. 13ПА, обладающие амидазной активностью. Данный штамм был выделен из образца почвы, взятого с производства акриламида, и предложен Моисеевой Т.Н. для использования в локальной очистке промышленных сточных вод от акриламида и акриловой кислоты. Было установлено, что клетки способны утилизировать акриламид в качестве единственного источника углерода и энергии. В процессе деструкции акриламида образовывалась акриловая кислота и ионы аммония, что свидетельствовало о присутствии в клетках фермента амидазы. Был определен индуцибельный характер синтеза амидазы и выявлены индукторы: акриламид, ацетамид, пропионамид [Моисеева с соавт., 1991; Моисеева , 1993].

Известно, что продуктом гидролиза акриламида является акриловая кислота, поэтому оптимизация условий культивирования и измерения респираторной активности клеток проводилась по отношению к двум субстратам - акриламиду и акриловой кислоте. Было установлено, что респираторная активность клеток по отношению к акриламиду и акриловой кислоте проявляется при их предварительном культивировании на среде с акриламидом. В то же время, клетки обладали респираторной активностью по отношению к акриловой кислоте и в случае их выращивания на среде, не содержащей акриламид. Этот феномен может быть использован при получении микробного биокатализатора для селективного определения анализируемых субстратов (акриламида и акриловой кислоты) при их одновременном присутствии в образце. Была определена концентрационная зависимость СРА клеток в отношении акриламида в диапазоне концентраций 0,01-14 мМ. Зависимость имеет линейный характер в интервале 0,14 - 1,0 мМ. Аналогичная концентрационная зависимость была получена для акриловой кислоты. Таким образом, клетки Brevibacterium sp. 13ПА могут быть использованы в качестве микробных биокатализаторов при количественном определении акриламида и акриловой кислоты.

Для разработки микробных биокатализаторов для определения акрилонитрила были использованы клетки штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes КМ-6П, обладающие нитри-лазной активностью, который был получен из образцов почвы, загрязненной продуктами химического производства акрило-нитрила. Было показано, что они обладают конститутивным ферментом нитрилазой, гидролизующим алифатические нитрилы до соответствующих кислот [Моисеева , 1993]. Как и для клеток Brevibacteriium sp. 13ПА метаболизм анализируемого субстрата, в данном случае акрилонитрилила, тесно связан с метаболизмом акриловой кислоты. При оптимизации условий культивирования клеток было установлено, что при высоких концентрациях акрилонитрила в среде респираторная активность клеток полностью ингибируется. Это может быть связано с ингибированием акрилонитрилом активности цитохром с-оксидазы - фермента дыхательной (электрон-транспортной) цепи [Акрилонитрил, 1987]. Причем ингибировалась активность как к акрилонитрилу, так и к акриловой кислоте. После оптимизации условий культивирования клеток и измерения их респираторной активности была определена концентрационная зависимость CPA клеток P. pseudoalcaligenes КМ-6П в отношении акрилонитрила в диапазоне концентраций субстрата 0,005 мМ - 2,0 мМ. Она имела линейный характер в области концентраций 0,01 - 0,1 мМ. Определялась также респираторная активность клеток P. pseudoalcaligenes КМ-6П в отношении акриловой кислоты. Таким образом, была показана возможность создания на основе клеток штамма клеток Р. pseudoalcaligenes КМ-6П микробного биокатализатора для определения акрилонитрила и акриловой кислоты.

Следующим этапом исследования стало изучение клеток, обладающих нитрилгидратазной и амидазной активностями. Нитрилгидролизующая активность микробных клеток может быть обусловлена наличием ферментов нитрилгидратазы и амидазы с помощью которых гидролиз нитрилов до карбоно-вых кислот протекает в две стадии с образованием промежуточного продукта, которым является амид. По литературным данным биосинтез большинства изученных микробных ферментов имеет индуцибельный характер, причем было показано, что происходит коиндукция нитрилгидратазы и амидазы и существует общий механизм регуляции их активности. Клетки Rhodococcus rhodochrous М8, используемые в работе, способны использовать нитрилы и амиды в качестве единственного источника углерода и энергии и обладали нитрилгидратазной и амидазной активностью [Козулин, 1994]. Условия культивирования микробных клеток, признанные оптимальными для проявления клетками высокой респираторной активности в отношении акрилонитрила и акриламида, также являются наилучшими для возникновения респираторного отклика на акриловую кислоту. После оптимизации условий культивирования клеток и измерения из респираторной активности была изучена их специфическая респираторная активность в отношении акрилонитрила в диапазоне концентрации субстрата 0,01-1,0 мМ. Линейный характер зависимость имела в диапазоне концентраций 0,01 - 0,5 мМ. Концентрационная зависимость CPA клеток в отношении акриламида была построена в диапазоне концентраций 0,01 -1,0 мМ с линейным отрезком в интервале 0,01 - 0,1 мМ. и аналогичная зависимость для акриловой кислоты.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что штаммы, обладающие специфическими ферментативными системами, способны изменять респираторную активность по отношению к изученным субстратам. Следовательно, клетки этих штаммов могут быть использованы в качестве микробных биокатализаторов для определения субстратов с помощью биосенсорной системы на основе кислородного электрода. Существует проблема выбора штамма для определения того или иного субстрата. Могут быть различные критерии для такого выбора. Это диапазон линейной зависимости респираторного ответа клеток при метаболизме специфического субстрата, селективность респираторного ответа и т.д. Рассмотрим линейные диапазоны зависимости респираторного ответа у клеток различных штаммов (таблица 2). Как видно из представленных данных наиболее широкий линейный диапазон для определения акриламида и акриловой кислоты имеется у штамма Вгеу\Ьа&епит эр. 13ПА, который составляет 0,14-1,0 мМ для обоих субстратов. Кроме того, поскольку амидаза у клеток данного штамма обладает индуцибельным характером в зависимости от условий предварительного культивирования можно использовать эти клетки для селективного определения - акриловой кислоты и как следствие акриламида. Для определения акрилонитила можно использовать два штамма Р. рэеибоакаНдепез КМ-6П и Я МобосЬюиз М8, которые обладают линейными диапазонами респираторного ответа 0,01-0,1 и 0,01-0,5 мМ соответственно. В данном случае более широким диапазоном обладает второй штамм. Таким образом, эти соединения могут быть определены в смеси если использовать клетки, обладающие различными ферментативными системами. Это было показано при анализе сточных вод, производства акриламида и полиакриамида, содержащих смесь производных акриловой кислоты в различных концентрациях и ионы металлов. Полученные результаты экспериментов близки истинным концентрациям определяемых соединений.

Сравним определение производных акриловой кислоты и традиционные методы анализа. В принципе это может являться темой отдельной работы, но необходимо отметить одно обстоятельство, которое объединяет практически все известные методы анализа данных соединений. Это необходимость достаточно длительных и порой весьма дорогостоящих и трудоемких процедур предварительной подготовки образца. Например, концентрирование образца при ПЖХ анализе [Дмитриев с соавт., 1989; Vairavamurthy & Mopper, 1990], концентрирование и обработка образца затем обработка бромидом пентафторо-бензила на катализаторе при капиллярной газовой хроматографии [Vairavamurthy et al., 1986]. Тонкослойная хроматография акриловой кислоты основана на переведении кислот в сложные эфиры в среде этиленгликоля с последующим образованием гидроксаматов, их хроматографическом разделении на бумаге с последующем проявлением раствором хлорида железа и фотометрическим определением. Необходимо предварительное концентрирование анализируемой пробы, которое проводят упариванием [Ехина, 1977]. Существует значительное количество различных методов анализа акриловой кислоты, акриламида и акрилонитрила, но практически все они имеют те же недостатки - сложная подготовка пробы, необходимость специального дорогостоящего оборудования и квалифицированного персонала.[Обтемперанская и Битар, 1977; Горюнова и Дворников, 1989; Lefevre et al., 1976; [Brown, 1979; Айзенберг с соавт., 1987; Рапапорт и Ледовских, 1972]. Это указывает на то, что микробные клетки могут иметь значительную перспективу как биокатализаторы для анализа акриловой кислоты, акриламида и акрилонитрила.

Одной из важнейших проблем охраны окружающей среды является мониторинг сточных вод с целью определения концентрации фенола и его производных. Хотя фенольные соединения играют важную роль в биохимии живых систем, их накопление в окружающей среде в результате интенсивного развития химической, металлургической и фармацевтической промышленности приводит к возникновению серьезных экологических проблем. Известно, что даже незначительное содержание фенольных соединений в питьевой воде делает её непригодной для употребления.

В настоящий момент для определения фенола наряду с традиционно используемыми хроматографическими и спек-трофотометрическими методами, все большее распространение получают приборы на основе ферментов и клеток [Puig & Вагсе1о,1996]. Сравнение ферментных и клеточных биосенсоров показывает, что в основном, аналитические системы на основе ферментов обладают несколько большей чувствительностью и позволяют проводить определение фенола в большем диапазоне концентраций [Neujahr, 1984]. Однако такие факторы как инактивация ферментов продуктами реакции в случае полифенолоксидазы или потребность во внешнем доноре электронов, как, например, для ФАД-содержащей фе-нолмонооксигеназы, усложняет анализ и увеличивает его стоимость. Поэтому применение микробных сенсоров вместо ферментных в ряде случаев представляется вполне целесообразным. Так в работе [Neujahr, 1982] описано применение клеток дрожжей Trichosporon cutaneum вместо фенолмонооксигеназы. Это позволило авторам избежать длительных и трудоемких стадий получения фермента и благодаря сохранению целостности клеток добавления в среду НАДФН. Описаны калориметрические и амперометрические сенсоры для определения фенола и ряда ароматических соединений [Neujahr, 1984; Campanella et al. 1993] и др.

Из литературных данных известно, что главным промежуточным продуктом микробного окисления фенола является пирокатехин, который в дальнейшем, расщепляясь по орто- и мето- путям превращается в соединения необходимые для обеспечения жизнедеятельности клеток [Карасевич, 1982]. При этом независимо от путей метаболизма фенола ключевые стадии его деградации во всех случаях включают потребление кислорода, что позволяет использовать клетки с подобными метаболитическими путями для создания амперометрического биосенсора для определения концентрации фенола.

Ранее был описан штамм Pseudomonas putida GFS-8, применяемый для деструкции фенола при очистке сточных вод химического производства фенола кумольным способом [Федоров, 1993]. Процедура оптимизации CPA клеток к фенолу была аналогична процедурам рассмотренным нами ранее. Для клеток данного штамма было показано, что линейный диапазон зависимости CPA от концентрации фенола составляет 0,1 - 1,0 мг/л фенола. Для оценки практического применения биосенсора исследовали влияние некоторых соединений наиболее часто встречающихся в сточных водах промышленного производства фенола кумольным способом и производства пластификаторов. Для этого растворы каждого из соединений по отдельности или в сочетании с фенолом вводили в измерительную ячейку и регистрировали потребление кислорода. Концентрации веществ были выбраны в соответствии с их содержанием в реальных сточных водах. Было показано, что данные соединения в исследуемых концентрациях не влияют на CPA клеток P. putida GFS-8 по отношению к фенолу.

На следующем этапе работы нами исследовалась возможность определения /7-нитрофенола. Публикаций, посвященных определению производных ароматических соединений, сравнительно немного и большинство из них направлены на определение галогенопроизводных фенолов. В то же время, большое значение имеют нитроароматические соединения, которые отличаются высокой токсичностью, как для микро-, так и для макроорганизмов. Токсическое воздействие на водные биоценозы наблюдается при концентрации нитроаро-матических соединений всего лишь 0.001 - 0.015 г/л [Груш-ко,1982; Наумова, 1985].

Были использованы клетки Acinetobacter calcoaceticum А-122, обладающие ферментативной системой подготовительного метаболизма /7-нитрофенола. Данный штамм был выделен из проб почвы, взятых с производства «Химпром» (г.Волгоград). Было показано, что клетки способны утилизировать /7-нитрофенол в качестве единственного источника углерода и энергии. В процессе деструкции /7-нитрофенола образовывался 4-нитропирокатехин, оксигидрохинон и происходило накопление нитрит ионов в культуральной среде. Был определен индуцибельный характер синтеза ферментов подготовительного метаболизма /7-нитрофенола [Сингирцев, 1996]. После проведения оптимизации была построена концентрационная зависимость CPA клеток в отношении л-нитрофенола в диапазоне концентраций последнего 0,1-3,0 мМ. Зависимость имеет линейный характер в интервале 0,1 - 1,0 мМ и может быть использована в качестве калибровочной кривой при количественном определении п-нитрофенола. Таким образом, была показана возможность количественного определения п-нитрофенола по CPA клеток A. calcoaceticum А-122. Таким образом, была показана возможность получения биокатализаторов на основе исследованных штаммов для определения фенола ил-нитрофенола водных средах.

На следующем зтапе работы исследовалась возможность определения п-нитрофенола в образцах реальных сточных вод с помощью микробного биокатализатора на основе клеток штамма Acinetobacter calcoaceticum А122. Для этого проводили анализ образца реальных сточных вод производства «Хим-пром» (г. Волгоград). Полученные результаты хорошо коррелировали с данными спектрофотометрического анализа.

Для определения того или иного анализируемого соединения возможно применение свободного (незакрепленного) фермента, клетки или какого-либо другого биологического компонента. Однако практически такие биокомпоненты биосенсорной системы подлежат закреплению (иммобилизации) на поверхности или внутри носителя. Применение иммобили-зованых, а не свободных, клеток в различных биотехнологических процессах в целом имеет ряд неоспоримых преимуществ перед свободными клетками. К ним относится, прежде всего, повышение операционной стабильности клеток в иммобилизованном состоянии [Kloosterman & Lilly, 1985] и возможность его многократного использования [Tramper, 1985].

В работе использовался метод включения клеток в гели природных полисахаридов агар-агара и фурцелларана. Эти способы были разработаны нами первоначально для создания биокатализаторов для биодеструкции токсичных компонентов сточных вод в локальных очистных сооружениях. Было показано, что клетки сохраняют свою биодеструктивную активность после включения в гель. Поэтому данный метод был использован для получения образцов с иммобилизованными клетками для определения фенола с помощью клеток штамма Pseudomonas putida GFS-8. Показано, что клетки сохраняли СРА к фенолу после иммобилизации в полисахаридные гели.

Целью этой части исследований была демонстрация возможности создания препаратов иммобилизованных микробных клеток, которые сохраняют свою ферментативную активность после их иммобилизации путем включения в гель. Это важно для создания реальной биосенсорной системы на основе кислородного электрода, но, в то же время, намного менее значимо, чем работа по получению и изучению свободных, не иммобилизованных микробных биокатализаторов, предложенная ранее. Надо отметить, что на сегодняшний день, в тех реальных условиях, сложившихся в России единственным подходом для создания биосенсорной системы, в условиях полного отсутствия финансирования данных работ, может стать комбинирование выпускаемых кислородных электродов с микробными клетками для однократного использования. В такой комбинированной системе и могут быть использованы иммобилизованные в полисахаридные носители клетки.

Вторая часть диссертации посвящена исследованию электрофизических свойств микробных суспензий при метаболизме токсичных субстратов. Начиная с 70-х годов нашего века, получила развитие очень интересная и перспективная область науки - электрофизический анализ микробных клеток. Перспективность данного направления обусловлена с одной стороны потребностями микробиологической промышленности и медицины в быстром и эффективном анализе функционального состояния клеток, с другой стороны преимуществами электрофизического анализа по сравнению с другими методами. Такими преимуществами являются, прежде всего, быстрота проведения анализа целых, не разрушенных клеток, возможность полной автоматизации процессов анализа и т.д. Начиная ещё с 70-х годов, с классических работ Дженнингса [Morris & Jennings, 1977; Jennings & Oakley,1988 и др.], было принято исследовать весьма ограниченное количество биологических моделей, например, таких как реакцию антител или вирусов с микробной клеткой, повреждение клеток под воздействием различных физико-химических факторов (теплового шока, тяжелых металлов, поверхностно-активных веществ, антибиотиков) и т.д. Основное развитие в этой области шло по двум путям - создание нового приборного обеспечения (были созданы новые модификации методов диэлектрической спектроскопии, электроротации, электроориентации) и предложение различных электрофизических моделей клетки. Однако, как неоднократно отмечалось, например, в серии последних обзоров Яна Гимзы [Gimsa, 1999; Eppmann, Pruger & Gimsa, 1999 и др.] в данный момент невозможно предложить удовлетворительную электрофизическую модель поведения клетки в переменном электрическом поле и, поэтому значительное количество фактов можно получить только с помощью эксперимента. Идея нашей работы заключалась в экспериментальном подтверждении предположения, что электрофизические свойства микробных клеток могут меняться не только при повреждении клеток или при взаимодействии клеток с антителами или другими агентами, но и при ферментативн^о^иса-тализе происходящих в клетках. В качестве модели были использованы клетки, обладающие ферментативной системой подготовительного метаболизма токсичных соединений (акри-ламида и п-нитрофенола). Практически это направление может привести к созданию новых методов оценки ферментативной активности целых клеток и созданию нового типа биосенсорных систем.

Наиболее подробно процессы, происходящие в клеточной | суспензии под влиянием электрического поля, были рассмотрены в монографии [Мирошников с соавт.,1986]. Этот труд ос- ! тается и сегодня уникальным в русскоязычной научной лите- ! ратуре, посвященной этому вопросу, и данные, приведенные : ниже, были написаны, преимущественно, под влиянием этой монографии.

Поскольку все вещества, в том числе и биологические, содержат свободные и связанные заряды, при наложении электрического поля в веществе наблюдается два вида про- ■ цессов. Один из них - перемещение (дрейф) свободных зарядов (электронов и ионов) сквозь толщу вещества от одного электрода до другого представляет собой ток проводимости. Другой процесс состоит в том, что связанные заряды под действием внешнего поля смещаются в некоторых допустимых, но ограниченных пределах, вызывая токи смещения и вызывая в объёме вещества появление наведенного (индуцированного) электрического момента. Это явление электрической поляризации вещества возникает при наложении поля и спадает после его снятия не мгновенно, а за некоторое конечное время называемое временем релаксации. При наложении на клеточную суспензию электрического поля происходит поляризация клеточных структур, в результате которой клетки приобретают индуцированный клеточный дипольный момент. Таким образом, в основе методов, служащих для измерения электрической поляризуемости лежат эффекты силового воздействия электрического поля на клетки, взвешенные в водной среде. В наших исследованиях был использован метод электроориентации клеток под воздействием внешнего электрического поля на дипольный момент клеток. При электроориентации такое воздействие приводит к повороту и выстраиванию клеток вдоль и поперек силовых линий поля. Регистрируя изменение интенсивности рассеянного (или ослабление прямо прошедшего) пучка света, можно количественно охарактеризовать степень пространственной упорядоченности клеток и, в ряде случаев, оценить их электрофизические и ; морфометрические характеристики. Было показано, что ди- ' электрическую проницаемость клеток на низких частотах внешнего электрического поля (ниже 104 Гц) характеризует двойной электрический слой клетки, а на высоких (выше 10 МГц) - состояние цитоплазмы. Для работы был использован электрооптический анализатор созданный в Институте прикладной микробиологии группой исследователей под руководством д.т.н. В.Д.Бунина. Ориентационные спектры представлялись в виде частотной зависимости разности значений оптической плотности суспензий 500, измеренных при распро странении пучка неполяризованного света вдоль и поперек направления ориентирующего поля. Эта разность была нормирована на значение оптической плотности при хаотической ориентации клеток.

Как уже упоминалось, существовало предположение, что в процессе метаболизма электрические свойства клеточных структур могут меняться, что может приводить к изменению вклада в общую поляризацию клеток со стороны отдельных клеточных структур и, следовательно, к изменению электрофизических свойств клетки в целом. Исходя из этого, можно предположить, что эти изменения могут быть зарегистрированы с помощью электрофизических методов, в том числе и метода электроориентации клеток в суспензии.

Ранее были представлены результаты экспериментов по изучению респираторной активности микробных клеток для анализа ряда токсичных соединений, присутствующих в сточных водах. Клетки этих штаммов могут быть использованы как модели для изучения изменений электрофизических свойств микробных клеток в процессе метаболизма токсичных соединений.

На первом этапе работы надо было зарегистрировать сам факт изменения ориентационных спектров клеток при метаболизме низкомолекулярных субстратов. Для этого клетки штаммов Вгеу1Ьас1егшт 8р.13ПА и А. са1соасеИсит А-122 обладающие индуцированной ферментативной системой метаболизма акриламида и /7-нитрофенола инкубировали с соответствующим субстратом, после чего регистрировали ориен-тационный спектр суспензии. Одновременно проводили контрольные эксперименты с клетками тех же штаммов, не обладающими индуцированной системой метаболизма данного субстрата для определения возможных изменений ориентаци-онных спектров, связанных с неспецифическим (не связанным с метаболизмом) действием субстрата на клетку. Было установлено, что изменения ориентационных спектров происходили в основном на первых пяти частотах (от 10 до 1000 кГц), в то время как на последних двух частотах изменения были менее выраженными. Таким образом, сам феномен изменения электрооптических свойств клеточных суспензий при метаболизме низкомолекулярных субстратов был установлен.

Эти эксперименты являются, все же, только косвенными подтверждениями нашего предположения о том, что изменения электрооптических свойств суспензий связано с метаболизмом специфического субстрата. Прямым доказательством этого предположения может служить ингибирование ферментативной активности клеток и электрооптические исследования клеточных суспензий с ингибированной ферментативной системой подготовительного метаболизма. В принципе для этого могут быть применены различные природные и синтетические ингибиторы ферментативной активности клеток, однако, в этом случае, возможно неспецифическое изменение электрофизических свойств клеток, что потребует проведения дополнительных контрольных экспериментов. В связи с этим для ингибировании ферментативной активности клеток были использованы методы, не требующие добавления в суспензионную среду тех или иных соединений. Ферментативная активность клеток изменялась путем лимитирования содержания кислорода в среде, изменением температуры и рН.

Первоначально мы исследовали электрооптическую активность клеток при ингибировании ферментативной активности путем лимитирования содержания кислорода в клеточной суспензии. Идея этих экспериментов заключалась в том, что клетки обладают определенной эндогенной респираторной активностью. При их инкубации без доступа кислорода из окружающей среды кислород, который находился в исходной клеточной суспензии, потребляется клетками и в результате, через определенное время, клетки оказываются в среде лимитированной по кислороду. Поскольку ферментативные системы подготовительного метаболизма часто связаны с процессами окисления субстрата (а ранее это было показано и для обоих используемых штаммов) можно предположить, что отсутствие кислорода в среде будет ингибировать ферментативную активность клеточных систем, и, следовательно, изменение электрооптических свойств суспензии. Клетки штамма A. calcoaceticum А-122 используемые для экспериментов обладали ферментативной системой метаболизма п-нитрофенола. Они инкубировались при 35°С без доступа кислорода из атмосферы в течении нескольких часов в деиони-зованной воде. Концентрацию кислорода в сосудах контролировали с помощью кислородного электрода Кларка. Затем в суспензию клеток добавляли л-нитрофенол - до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали 30 минут при 35°С. Субстрат добавляли таким образом, чтобы доступ кислорода из атмосферы был минимален. После этого проводили определение ориентационных спектров суспензий. Изменения электрооптических свойств микробной суспензии в присутствии субстрата зарегистрировано не было. Одновременно с экспериментом, описанным выше, суспензия клеток насыщалась кислородом путем барбатирования, после чего в неё вносился субстрат в концентрации 1 мМ и определялся ориентационный спектр клеточной суспензии. В данном случае были обнаружены изменения ориентационного спектра аналогичные выявленным ранее. Таким образом, установлено, что изменение электрооптических свойств клеток связано с процессами окисления субстрата клетками и что данный процесс имеет обратимый характер. Аналогичный эксперимент с такими же результатами был проведен для штамма Brevibacterium sp.1 ЗПА.

В принципе сравнение результатов электрооптических экспериментов с определением CPA клеток по отношению к специфическому субстрату дает в руки возможность дополнительно убедится в том, что изменения электрооптических свойств суспензий зависят от метаболизма, происходящего в клетках. Проведя эксперименты при различных рН и температуре и сравнив полученные данные с результатами экспериментов по CPA можно сделать вывод о значительном совпадении полученных результатов для обоих штаммов. Таким образом, были получены доказательства, позволяющие с нашей точки зрения считать доказанным сам факт изменения электрофизических свойств клеток при метаболизме низкомолекулярных субстратов.

Следующим вопросом, является практическое применение полученных данных. Прежде всего, с нашей точки зрения это может быть определение ферментативной активности микробных клеток по их электрофизическим характеристикам. Для экспериментального определения такой возможности были поставлены эксперименты с клетками при периодическом культивировании. Для этого получали клетки, обладающие амидазной активностью, и культивировали их на минеральной среде, содержащей и акриламид в качестве единственного источника углерода. Через определенные промежутки времени отбирали пробы для определения концентрации акриламида, акриловой кислоты и ионов аммония в среде культивирования и определения амидазной активности клеток. Амидазную активность клеток в процессе метаболизма акриламида определяли по изменению электрооптических свойств клеток при частоте ориентирующего поля 502 кГц и традиционным методом - по изменению концентрации субстрата в процессе микробного гидролиза акриламида до акриловой кислоты. При сравнении результатов определения активности клеток в отношении акриламида по изменению электрооптических свойств и традиционным методом, можно увидеть, что обоими способами было зарегистрировано снижение амидазной активности клеток в процессе культивирования. При этом можно отметить, что данные результаты хорошо коррелируют с ранее полученными результатами по исследованию специфической респираторной активности клеток Вrevibacterium sp. 13ПА в отношении акриламида. Аналогичные результаты были получены при культивировании клеток того же штамма на среде, содержащую акриловую кислоту в качестве источника углерода. Аналогичный эксперимент был поставлен с клетками штамма A. calcoaceticum А-122. Было показано, что активность клеток в отношении л-нитрофенола возрастала по мере его деструкции и достигла максимального значения через 6-8 ч после начала эксперимента, когда субстрат в среде культивирования отсутствовал. Это можно объяснить тем, что при культивировании клеток на минеральной среде с единственным источником углерода - л-нитрофенолом - микроорганизмы синтезируют и поддерживают в активном состоянии специальную систему ферментов подготовительного метаболизма данного субстрата. При дальнейшем инкубировании клеток электрооптическая активность в отношении /7-нитрофенола снижалась. Полученные данные хорошо согласуются с представлениями об экономности клеточного метаболизма. Известно, что ферменты, участвующие в утилизации субстрата и включении продуктов его распада в промежуточный обмен, синтезируются лишь в тех случаях, когда данный субстрат имеется в питательной среде. По мере утилизации субстрата происходит накопление промежуточных продуктов, которые в свою очередь осуществляют регуляцию биосинтеза и активности ферментов по принципу катаболитной репрессии.

Другой областью практического применения полученных результатов может стать анализ концентрации субстрата по изменению электрофизических свойств клеток в процессе его метаболизма. Была исследована зависимость изменения электрооптических свойств микробных суспензий штамма А. са1соасеИсит А-122 от концентрации субстрата. Клетки инкубировались с различными концентрациями субстрата (0.1; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0 мМ). Изменения электрооптических характеристик суспензий происходили преимущественно на первых пяти частотах ориентирующего поля от 10 до 1000 кГц. Кроме того, можно отметить, что на частотах 10 - 1000 кГц существует определенная зависимость величины электрооптического эффекта от концентрации субстрата, участвующего в ферментативной реакции. Минимально детектируемая концентрация пнитрофенола составляет 0.1 мМ, диапазон линейной зависимости 80D от концентрации л-нитрофенола - 0.1 - 1.0 мМ. Сравнение полученных данных с результатами определения CPA клеток данного штамма по отношению к п-нитрофенолу показывает корреляцию полученных данных.

Рассмотрим электрофизический анализ клеток с точки зрения биосенсорной технологии. Биосенсоры - это устройства, включающие биологический чувствительный компонент и интегрированный с ним преобразователь, которые предназначены для формирования цифрового электрического сигнала, пропорционального концентрации определенного химического соединения или группы соединений [Тернер, 1992]. Большинство микробных сенсорных систем используют ферментативную активность клеток для получения того или иного эффекта, регистрируемого физико-химическим устройством. По своей сути изменение электрофизических свойств клеток, как следствие перераспределения зарядов в клетке при метаболизме определенных химических соединений, является практически полным аналогом микробной биосенсорной системы, основанной, например, на респираторной активности клеток. В обоих случаях изменения происходят посредством специфической ферментативной системы клетки, осуществляющие метаболизм определенного субстрата. Экспериментальным доказательством данного утверждения служат наши эксперименты, которые продемонстрировали значительную корреляцию между CPA клеток по отношению к определенному субстрату и электрооптической активностью клеточной суспензии при метаболизме данного субстрата. Прибором, для регистрации изменений электрофизических свойств клеток, в наших исследованиях служил электрооптический анализатор, но в принципе, подобным устройством могут являться и другие приборы для измерения электрофизических свойств клеток. Данный метод имеет, с нашей точки зрения, значительное преимущество по сравнению с традиционными микробными сенсорными системами. Изменение электрофизических свойств микроорганизмов может происходить вследствие перераспределения зарядов в клетке и регистрация сигнала не связана с использованием определенного (кислородного, аммонийного, рН и т.д.) электрода.

Таким образом, электрофизические свойства клеток могут являться тем параметром, изменение которого свидетельствует о ферментативных процессах происходящих в клетках и, как следствие этого, о концентрации субстрата, используемого в ферментативной реакции. Безусловно, развитие электрофизического анализа клеток находится на начальном этапе, несмотря на многолетнюю историю этого направления. Это связано, прежде всего, с прогрессом в области микроэлектроники и компьютерной технологии, которая позволяет создавать детекторные ячейки, сравнимые с размерами самих клеток и обрабатывать получаемые данные. Это резко расширяет возможности применения электрофизических методов для изучения различных процессов, происходящих в клетках. Для создания биосенсорных устройств на основе анализа электрофизических свойств клеток уже создана экспериментальная база, которую требуется только адаптировать для решения специфических задач.

Резкое увеличение числа статей в последнее десятилетие, посвященных электрофизическим свойствам клеток и методам их регистрации, свидетельствует о важности и перспективности данного направления для решения ряда прикладных и фундаментальных задач микробиологии и биологии в целом. Мы считаем, что результаты, полученные в данной работе, откроют одно из новых направлений в этой области исследований - электрофизический анализ клеточного метаболизма низкомолекулярных соединений.

Рекомендации по использованию результатов диссертации

По результатам диссертационной работы можно сделать ряд рекомендаций по практическому использованию материалов проведенных исследований.

1. Полученные результаты открывают возможность создания биосенсорных анализаторов на основе микробных клеток, обладающих специализированными системами метаболизма и кислородного электрода для определения акриловой кислоты, акриламида и нитрила акриловой кислоты, фенола и л-нитрофенола. Эти системы могут найти применение для определения данных соединений в химической, фармацевтической, военной и других отраслях промышленности и экологическом контроле в качестве экспресс-анализа.

2. Анализ электрооптических свойств микробных суспензий позволяет быстро определять активность клеточных ферментативных систем. Это может применяться на микробиологических производствах, где используются микроорганизмы, обладающие специализированными ферментативными системами, например, при производстве антибиотиков, лекарственных веществ, химических соединений и т.д.

3. Определено направление для создания нового класса биосенсорных систем, использующих изменение электрофизических свойств микробных клеток при метаболизме низкомолекулярного субстрата для количественного анализа этого соединения.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Игнатов, Олег Владимирович, 1999 год

1. Аболина Т.А. Микроэлектрофорез как метод изучения поверхностной структуры бактериальных клеток// ЖМЭИ -1980, -№4. -С.21-28.

2. Авторское свидетельство СССР № 1096280 Способ определения повреждения микроорганизмов. C12Q 1/02; C12N 13/00, 1/00 А / Фомченков В.М., Чугунов В.А., Ажермачев А.К., Бабаева П.Б. 1984 Бюл. Изобр. №21

3. Авторское свидетельство СССР №1705345 МКИ C12N11/00//11/10 Способ получения иммобилизованных микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики. / Барковский А.Л., Миронов А.Д., Корженевич В.И., Игнатов О.В., Кривопалов Ю.В. 1992 Бюл. Изобр. №2,

4. Авторское свидетельство СССР N1742330 МКИ C12N11/10 / Игнатов О.В., Птичкина Н.М., Сорокин A.B., Корженевич В.И. Способ получения биокатализатора в поли-сахаридном носителе. 1992 Бюл. Изобр. №2.

5. Айзенберг A.B., Горюнова H.H., Дворников А.Н. Определение первичных алифатических амидов // Ж. Анал. Хим. -1987. -Т.42, -Вып. 11. -С. 2071-2075.

6. Акриламид. (Гигиенические критерии состояния окружающей среды, вып. 49.) Женева, Всемирная организация здравоохранения. 1989. -109 с.

7. Акрилонитрил. (Гигиенические критерии состояния окружающей среды, вып. 28.) Женева, Всемирная организация здравоохранения. 1987. -114 с.

8. Астаурова О.Б., Погорелова Т.Е., Фомина O.P., Полякова И.Н., Яненко A.C. Регуляция биосинтеза ферментов биодеградации нитрилов у Rhodococcus rhodochrous МО// Биотехнология. -1991. -N5. -С.10-14.

9. Бакиров Т.С., Чепурнов A.A., Тюнников Г.И., Генералов В.М. Исследование изменений электрических характеристик эритроцитов гуся при адсорбции вируса краснухи// Биотехнология. -1997. -№4. -С.47-54.

10. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Топорков B.C. Измерение поляризации отдельной клетки в неоднородном переменном электрическом поле// Биотехнология. -1998. -№2. -С.73-82

11. Баркер С.А. Иммобилизация биологических компонентов в биосенсорах// В кн. Биосенсорьгосновы и приложения./ Под ред. Э.Тёрнер, И. Карубе, Дж.Уилсона. -М.Мир.-1992. -С.78-88

12. Беспамятов Г.П., Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химическим веществ в окружающей среде. Справочник. -Л.: Химия, 1985. -568 с.

13. Бест Д. Химия и технология// В кн. Биотехнология.Принципы и применение. Под ред. И.Хиггинса, Д.Беста, Д.Джонса -М.Мир. 1988. -С. 187.

14. Биосенсоры: принципы и применение/ Под ред. Э.Тернер, И. Карубе, Дж.Уилсона. -М. Мир. -1992. -614с.

15. Гилбо Ж.Ж. и Нето Г.О. Ферментные электроды// В кн. Иммобилизованые клетки и ферментькметоды/ Под ред.Дж.Вудворта. -М.Мир.-1988. -С.72-95.

16. Горцева Л.В., Тарасова H.A., Шутова Т.В., Холодова А.П. Определение акрилонитрила в полимерных материалах, водных и масляных вытяжках из них газохроматографическим методом // Гигиена и санитария. -1987. -N 4. -С. 61-62.

17. Горюнова H.H., Дворников А.Н. Фотометрическое определение акриловой кислоты и акролеина при совместном присутствии в воде // Гигиена и санитария. -1989. -N 7. -С. 3132.

18. Грушко Я.М. Вредные органические соединения в промышленных сточных водах. Справочник. -Л.: Химия. -1982. -215с.

19. Гузев B.C. и Звягинцев Д.Г. Микроэлектрофорез в микробиологии// В кн.: Микробные метаболиты. -М. Изд-во МГУ, 1979.-С.150-164.

20. Давиденко Т.И. Бондаренко Г.И. Использование иммобилизованных в каррагенан микроорганизмов для получения органических веществ. // Успехи химии. -1990 -Т.59. -Вып.З. -С.509-521

21. Даниельсон Б. и Мосбах К. Теория и практика калориметрических сенсоров// В кн. Биосенсоры: принципы и применение/ Под ред. Э.Тернер, И. Карубе, Дж.Уилсона. -М. Мир. 1992. -С.457-472.

22. Дмитриев М.Т., Казнина Н.И., Пинигина И.А. Санитар-но-химический анализ загрязняющих веществ в окружающей среде; Справ, изд. -М. Химия. 1989. -С. 103.

23. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Салянов В.И., Рыбин В.К., Палумбо М. Принципы создания биодатчиков на основе жидких кристаллов нуклеиновых кислот// Биофизика -1990 -Т.35. -№5. -С.731-738.

24. Ехина Р.С. Раздельное определение акриловой и ме-такриловой кислот в воде с помощью хроматографии на бумаге // Гигиена и санитария. -1977. -N 2. С. 78-80.

25. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. -М. Изд-во МГУ. -1987. -256с.

26. Иванов А.Ю., Дейнега Е.Ю., Мирошников А.И., Сав-лук О.С. Исследование изменений электроориентации клеток E.coli при действии дезинфектантов // Микробиология. -1985. Т.54, № 5. - С.826 - 829.

27. Игнатов O.B. Биодеструкция некоторых ксенобиотиков иммобилизованными клетками микроорганизмов-деструкторов. Дисс. канд.биол.наук. Саратов -1991. -116с.

28. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. -М. Наука -1982. -142с.

29. Карубе И. Сенсоры на основе микроорганизмов// В кн. Биосенсоры: принципы и применение/ Под ред. Э.Тернер, И. Карубе, Дж.Уилсона. -М. Мир. -1992. -С.20-33.

30. Кларк-младший.Л.С. Ферментный электрод// Биосенсоры: принципы и применение/ Под ред. Э.Тернер, И. Карубе, Дж.Уилсона. -М. Мир. -1992. -С.11-19.

31. Козулин C.B. Микробное получение акриламида: Дис. . канд. биол. наук Саратов, 1994. -174 с.

32. Корпан Я.И. и Ельская A.B. Микробные сенсоры: достижения, проблемы, перспективы// Биохимия. -1995. -Т.60. -Вып.12. -С.1988-1997.

33. Краткая химическая энциклопедия. -М: Советская энциклопедия, 1962. -Т.1. -С.88-90.

34. Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов. Вильнюс: Мокслас. - 1981. -200 с.

35. Лебедев B.C. Особенности действия тяжелых металлов на мембрану E.coli // Известия АН СССР. Сер.биол. -1986. №3. - С.370 - 377.

36. Лебедев B.C., Дейнега Е.Ю., Савлук О.С., Федоров Ю.И. Роль трансмембранного потенциала в Си2+-индуцированном нарушении барьерных свойств цитоплаз-матической мембраны E.coli // Биол. мембраны. 1989. - Т.6, №12. - С.1313- 1316.

37. Ленинджер А. Основы биохимии. -М.: Мир, 1985. -1056с.

38. Методическое указание по опредению вредных веществ в воздухе. -М.: Минздрав СССР, 1980. -N 2211-2280.

39. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./ Под ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир. - 1984. - Т.2. - 472 с.

40. Моисеева Т.Н. Микробная деградация акрилонитрила и акриламида: Дис. . канд.биол.наук. Саратов, 1993. -180 с.

41. Моисеева Т.Н., Козулин C.B., Куликова Л.К., Воронин С.П. Скрининг штаммов-деструкторов акриловой кислоты и ее производных // Биотехнология.-1991.-N 6. С.79-83.

42. Наумова Р.П. Микробный метаболизм неприродных соединений. Казань: КГУ. - 1985. - 240 с.

43. Обтемперанская С.И., Битар А. Аренсульфенилгало-гениды как реагенты в функциональном органическом анализе. 7. Фотометрический метод определения ненасыщенных алифатических карбоновых кислот // Журнал Аналит. Хим. -1977. Т.32, -Вып. 9. -С. 1856-1858.

44. Папковский Д.Б., Савицкий А.Н., Ярополов А.Н. Оптические биосенсоры. Прикл.биох.микробиол. -1990. -Т.26. -№2. -С.435-444.

45. Патент РФ № 1285776. Штамм бактерий Pseudomonas putida В-2950, используемый для очистки сточных вод от ал-килфенолэтоксилатов типа ОП./ Турковская О.В., Шендоров Б А, Шуб Г.М. -1994 -4с.

46. Патент РФ № 1731814 , МКИ 5 С12 N 9/78, С12 Р 13/02. Штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous продуцент нитрилгидратазы / Яненко A.C., Полякова И.Н., Астаурова О.Б., Козулин C.B. и др. -1992. - 10 с.

47. Патент РФ № 1752727 РФ, МКИ 5 С02 F 3/34. Штамм бактерий Brevibacterium sp., используемый для очистки сточных вод от акриламида и акриловой кислоты / Моисеева Т.Н., Шендеров Б.А., Куликова Л.К., Полянский А.Б. -1992. -4с.

48. Перегуд Е.А., Гарнет Е.В. Химический анализ воздуха химических предприятий. -Л.: Химия, 1973. 440 с.

49. Рапапорт Л.И., Ледовских Н.Г. Йодхлорометрическое определение микроколичеств акриламида и метилметакрила-та // Гигиена и санитария. 1972. - N 3. - С. 74-77.

50. Решетилов А.Н. Модели биосенсоров на основе по-тенциометрических и амперометрических преобразователей: применение в медицине, биотехнологии и экологическом мониторинге (обзор) // Приклад, биохим. и микробиол. -1996. -Т. 32, N 1. -С. 78-93.

51. Решетилов А.Н., Донова М.В., Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки Glucobacter oxydans как рецепторный элемент сенсора для определения глюкозы// Прикл.биох.микробиол. -1992. -Т.28. -№4. -С.518-524.

52. Сингирцев И.Н. Микробная деструкция нитрофено-лов. Дисс. канд.биол. наук. Саратов, -1996 -23с.

53. Сорочинский В.В., Курганов Б.И. Биосенсоры для определения органических соединений. I. Сенсоры аминокислот, мочевины, спиртов и органических кислот// Прикл.биох.микробиол. -1997. -Т.ЗЗ. -№6. -С.579-596.

54. Сорочинский В.В., Курганов Б.И. Биосенсоры для определения органических соединений. II. Сенсоры углеводов, ароматических, гетероциклических и других органических соединений// Прикл.биох.микробиол. -1998. -Т.34. -№1. -С.22-42.

55. Стародуб Н.Ф. Неэлектродные биосенсоры новое направление в биохимической диагностике// Биополимеры и клетка. -1989. -Т.5. -№1. -С.5-14.

56. Тернер Э.П.Ф., Предисловие к английскому изданию// Биосенсоры: принципы и применение/ Под ред. Э.Тернер, И. Карубе, Дж.Уилсона. -М. Мир. -1992. -С.9-10.

57. Федоров А.Ю. Микробная деструкция компонентов сточных вод производства фенола. Автореф. дис. канд.биол.наук. -Саратов. -20с.

58. Фомченков В.М., Эль-Регистан Г.И., Иванов А.Ю. Электрофизический анализ цистоподобных покоящихся форм бактериальных клеток// Микробиология. -1989. -Т.58. -Вып.5. -С.831-834.

59. Фомченков В.М., Иванов А.Ю., Аржемачев А.К., Чугу-нов В.А., Мирошников А.И. Влияние поверхностно-активных веществ на электрические свойства бактериальных клеток// Микробиология. -1986. -Т.55. -Вып.4. -С.601-606.

60. Хлебцов Н.Г. О теоретической интерпретации электрооптического метода исследования электрического пробоя клеточных мембран// Биологические мембраны. -1993. -Т.1. -№1. -С.88-93.

61. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Мельников А.Г., Сирота А.И. Дихроизм бактериальных суспензий в электрическом поле// Прикладная спектроскопия. -1990. -Т.52. -№6. -С.978-983.

62. Чарыков А.К. Математическая обработка результатов химического анализа. Л.: Химия. - 1984. - 168 с.

63. Шилов В.П. и Еремова Ю.Я. Диффузионные процессы при поляризации осесимметричных биологических клеток и низкочастотный электрооптический эффект в клеточных суспензиях// Коллоидный журнал. -1995. -Т.57. -№2. -С.255-260.

64. Эршлер И.А., Прибуш А.Г., Кузьмин П.И., Абидор И.Г., Яровая М.С. Исследование электрического пробоя клеточных мембран электрооптическим методом// Биологические мембраны. -1991. -Т.8. -№12. -С.1327-1336.

65. Aarato S.E., Bittera E. Determination of acrylonitrile in the air in the presence of dimethylformamide and ammonia // Munkavedelem. -1972. -N 18. -P.50-51.

66. Amine A., Alafandy M., Kauffmann J.M., Pekli M.N. Cyanide Determination Using an Amperometric Biosensor Based on Cytochrome-Oxidase Inhibition// Anal.Chem. -1995. -V.67. -P.2822-2827.

67. Analytical Microbiology. Kavanagh F.,Ed., Academic Press, -New York and London. -1963. 245p.

68. Andreoni V., Bernasconi, Sorlini C., Villa M. Microbial degradation of acrylic acid // Ann. Microbiol. 1990. - Vol. 40. -P.279.

69. Arnaud A., Galzy P., Jallageas J.C. Amidase activity of some bacteria. //Folia Microbiol. 1976- Vol.21, -№ 3. -P. 178184.

70. Asano Y., Yujishiro K., Tani Y., Yamada H. Aliphatic ni-trile hydratase from Arthrobacter sp. J-1. Purification and characterization II Agric. Biol. Chem. -1982. -Vol.46, -N 5. -P.1165-1174.

71. Asano Y., Tachibana M., Tani Y., Yamada H. Purification and characterization of amidase which participates in nitrile degradation //Agric. Biol. Chem. -1982. -Vol.46, N 5. -P.1175-1181.

72. Bandyopadhyay A.K., Nagasawa T., Asano Y. et al Purification and characterization of benzonitrilases from Arthrobacter sp. strain J-1 // Appl. And Environ. Microbiol. -1986. -V.51., -N 2. -P.302-306.

73. Bataillard P. Calorimetric Sensing in Bioanalytical Chemistry Principles, Applications and Trends.// Trac. Trend. Anal. Chem. -1993. -V.12. -P.387-394

74. Benlsrael O., Benlsrael H., Ulitzur S. Identification and quantification of toxic chemicals by use of Escherichia coli carrying lux genes fused to stress promoters// Applied and Environmental Microbiology. -1998. -V.64. -Iss 11. -P. 4346-4352

75. Besombes J.L., Cosnier S., Labbe P., Reverdy G. A Biosensor as Warning Device for the Detection of Cyanide, Chloro-phenols, Atrazine and Carbamate Pesticides// Anal.Chim.Acta. -1995. V. 311. -P.255-263.

76. Billard P. & DuBow M.S. Bioluminescence-based assays for detection and characterization of bacteria and chemicals in clinical laboratories// Clinical Biochemistry. -1998. -V.31. -Iss.1. -P. 1-14

77. Bioluminescence in action. Herring P.J. (Ed.), Academic Press, London, -1978 -347p.

78. Brodelius P. Immobilized microbial cells and plant cells: techniques and application // Biotech'85 (Europe) -1985. -Online Publication, -P.573-585.

79. Brown L. & Rhead M. Liquid chomatographic determination of acrylamide monomer in natural and polluted aqueous environments // Analyst. 1979. -V.104. -P. 391-399.

80. Brown L. High-performance liquid chromatographic determination of acrylic monomer in natural and polluted aqueous environments and polyacrylates//Analyst. -1979. -V. 104, -N1245. -P.1165-1170.

81. Bucke C. Methods in Immobilizing Cells // Process Engineers Aspects of Immobilized Cell System / Ed. Webb C., Black G.M. & Atkinson. Rudby: Institution of Chemical Engineers Publications.-1986.-P.20-34

82. Bull R.J., Robinson M, Laurie R.D., Stoner G.D., Greisinger E., Meier J.R., Stober J. Carcinogenic effects of ac-rylamide in Senear and A/J mice // Cancer. Res. -1984. -V.44. -P.107-111.

83. Bunin V.D. and Voloshin A.G. Determination of cell structures, electrophysical parameters, and cell population heterogeneity // J. Colloid Interface Sei. -1996. V. 180. - P. 122126.

84. Bunin V.D., Voloshin A.G., Bunin Z.F., Shmelev V.A. Electrophysical monitoring of culture process of recombinant Escherichia coli strains// Biotechnol.Bioenginer. -1996. -V.51. -P.720-724.

85. Campanella L., Beone T., Sammartino M.P., Tomassetti M. Determination of Phenol in Wastes and Water Using an Enzyme Sensor//Analyst. -1993. -V.118. -P.979-986.

86. Caras S. & Janata J. Field effect transistor sensitive to penicillin//Anal.Chem.-1980 -V.52 -P.1935-1937

87. Chen C.Y. & Karube I. Biosensors and flow injection analysis// Curr. Opin. Biotechnol. -1992. -V.3. -N1. -P.31-39.

88. Clark L.C.Jr & Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery// Annals of the New York Academy of Sciences. -1962. -V. 102. -P.29-45.

89. Croll BT. & Simkins G.M. The determination of ac-rylamide in water by using electron-capture gas chromatography // Analyst. 1972. -V.97. -P.281 -288.

90. Cserhati T. & Janos B. The effect of nonionic surfactants on the membrane permeability of phytopatogen microorganisms // Proc. 19th

91. Hung.Ann.Meet.Biochem.Orgams.lnt.Particip.25th anniv. Bio-chem.Sect. Hung.Chem.Soc. Budapest. - 1979. -P.85 - 86.

92. Danielsson B., Hedberg U., Rank M., Xie B. Recent Investigations on Calorimetric Biosensors// Sensor.actuator.B.Chem. -1992. A/.6. -P.138-142.

93. Deng L„ Bao L.L., Wei W.Z., Nie L.H., Yao S.Z. Continuous Measurement of Bacterial-Populations on the Surface of a Solid Medium with a Thickness-Shear Mode Acoustic Resonator in Series// Enzyme.Microb.Technol. -1996. -V.19. -P.525-528.

94. Dervakos G.A. & Webb C. Building a database to take a critical look at immobilized cell fermentation technology for improved research strategy development. //Trends Biotechnol -1988. -V.6. -N.2. -P.29-32.

95. Ding T., Bilitewski U., Schmid R.D., Korz D.J. Sanders E.A. Control of Microbial Activity by Flow-Injection Analysis During High Cell-Density Cultivation of Escherichia-Coli// J.Biotechnol. -1993-V.27.-P.143-157.

96. Dixit R., Husain R., Mukhtar H., Seth P.K. Acrylamide induced inhibition of hepatic glutatione-S-transferase activity in rats //Toxicol. Lett., -1981. -Ml. P.207-210.

97. Effenberger F., Graef B.W. Chemo- and enantioselective hydrolysis of nitriles and acid amides, respectively, with resting cells of Rhodococcus sp. C3II and Rhodococcus erythropolis MP50 Journal of Biotechnology. -1998. -V.60. -Iss.3. -P.165-174.

98. Endo H., Kamata A., Hoshi M., Hayashi T., Watanabe E. Microbial Biosensor System for Rapid-Determination of Vitamin-B-6// Journal of Food Science. -1995. -V.60. -P.554-557.

99. Eppmann P., Pruger B., Gimsa J. Particle characterization by AC- electrokinetic phenomena: 2.

100. Dielectrophoresis of Latex particles measured by Dielectrophoretic Phase Analysis Light Scattering (DPALS). Colloids and Surfaces A.-1999.-V.149.-P.443-449

101. Ferrey M.L. & Lovrien R.E. Microbial Calorimetric Analysis (MCA) of Aqueous Organic-Compounds// Talanta. -1993. -V.40. -P.127-134.

102. Fournand D., Bigey F., Arnaud A. Acyl transfer activity of an amidase from Rhodococcus sp. strain R312: Formation of a wide range of hydroxamic acids Applied and Environmental Microbiology. -1998. -V. 64. -№ 8. -P.2844-2852.

103. Fleschin S., Bala C., Bunaciu A.A., Panait A., Aboul Enein H.Y. Enalapril microbial biosensor// Preparative Biochemistry & Biotechnology. -1998. -V. 28. -Iss 3. -P. 261-269.

104. Ghersin Z., Stitzt A., Manea R. Comparative study of ti-trimetric and colorimetric methods for determining acrylonitrile in waste water// Rev. Chim. -1969. -N 20. -P.689-694.

105. Gimsa J., Pruger B., Eppmann P., Donath E. Electrorotation of particles measured by dynamic light scattering -a new dielectric spectroscopy technique// Colloids and Surfaces A:Physocochemical and Engineering Aspects -1995. -V.98. -P.243-249.

106. Gimsa J. Particle characterization by AC-electrokinetic phenomena: 1. A short introduction to dielectrophoresis (DP) andelectrorotation (ER). Colloids and Surfaces A. -1999. -V.149. -P.451-459

107. Galindo E., Lagunas F., Osuna J., Soberon X., Garcia J.L. A microbial biosensor for 6-aminopenicillanic acid// Enzyme and Microbial Technology. -1998. -V. 23. -Iss 5. -P. 331-334.

108. Gaiindo E., Bautista D., Garcia J.L., Quintero R. Microbial sensor for penicillins using a recombinant strain of Escherichia coli// Enzyme Microb.Technol. -1990. -V.12. -N9. -P.642-646.

109. Garcia J.L., Nunez C.J., Gonzalez E.G., Osuna J., Soberon X., Galindo E. Microbial sensor for new-generation cephalosporins based in a protein-engineered beta-lactamase// Applied Biochemistry and Biotechnology. -1998. -V.73. -lss.2-3. -P. 243-256.

110. Gehring A.G., Patterson D.L., Tu S.I. Use of a light-addressable potentiometric sensor for the detection of Escherichia coli 0157:H7//Anal. Biochem. -1998. -V.258. -N2. -P.293-298.

111. Gheorghiu E & Asami K Monitoring cell cycle by impedance spectroscopy: experimental and theoretical aspects// Bioelectrochemistry and Bioenergetics. -1998. -V.45. -Iss.2. -P.139-143.

112. Gilardi G., Denblaauwen T., Canters G.W. Molecular Recognition Design of a Biosensor with Genetically- Engineered Azurin as Redox Mediator// J.Control.Release. -1994. -V.29. -P.231 -238.

113. Goldlust A., Bohak Z. Induction, purification and characterization of the nitrilase of Fuzarium oxysporum f. sp. melanis // Biotech. And Appl. Biochem. -1989. -V.11. -N 6. -P.581 -601.

114. Griffiths D. & Hall G. Biosensors what real progress is being made?// Trends in Biotechnology. -1993. -V.11. -N.4. -P.122- 130.

115. Haggett B.G.D. Mathematical-Model of Toxicity Monitoring Sensors Incorporating Microbial Whole Cells//Analyst. -1994. -V.119. -P. 197-201.

116. Hamilton J.D., Reinert K.H., Mclaughlin J.E. Aquatic risk assessment of acrylates and methacrylates in household consumer products reaching municipal waste-water treatment plants // Environ. Technol. -1995. -V. 16. -P.715-727.

117. Harborn U., Xie B., Venkatesh R., Danielsson B. Evaluation of a miniaturized thermal biosensor for the determination of glucose in whole blood// Clinica Chimica Acta. -1997. -V.267. -Iss.2. -P. 225-237.

118. Harper D.B. Purification and properties of an unusual ni-trilase from Nocardia NCIB 11216 // Biochem. Soc. Trans. -1976. -V.4. -P.502-504.

119. Harper D.B. Fungal degragation of aromatic nitriles. En-zymology of C-N cleavage by Fuzarium solani // Biochem. J. -1977. -V.165. -P.309-319.

120. Harwood G.W., Pouton C.W. Amperometric Enzyme Biosensors for the Analysis of Drugs and Metabolites // Ad-van.Drug.Delivery.Rev. -1996. -V.18. -P.163-191.

121. Hastings J.W., Baldwin T.O., Nicoli M.Z. Bacterial lucifer-ase: Assay, purification and properties// In Methods in enzymol-ogy/ Ed. M.DeLuca -V.57. Academic Press. -New York. -1978. -P.135-152.

122. Helenius A., Simons K. Sulubilization of membranes by detergents // Biochim. and Biophys. Acta. 1975. - V.45. -№ 1. -P.29 -79.

123. Hikuma M., Kubo T., Yasuda T., Karube I., Suzuki S. Amperometric determination of acetic acid with immobilized Tri-chosporon brassicae// Analytica Chimica Acta. -1979. -V.109. -P.33-47.

124. Hikuma M., Obana H., Yasuda T., Karube I., Suzuki S. Amperometric determination of total assimilable sugars in fermentation broths with use of immobilized whole cells// Enzyme Microbial Technology. -1980. -V.2. -P.234.

125. Hobson N.S., Tothill I., Turner A.P.F. Microbial Detection// Biosens.Bioelectron. -1996. -V.11. -P.455-477.

126. Hodgson C.E. & Pethig R. Determination of the viability of Escherichia coli at the single organism level by electrorotation// Clinical Chemistry. -1998. -V.44. -Iss.9. -P.2049-2051

127. Holzel R. Electrorotation of single yeast cells at frequencies between 100 Hz and 1,6 GHz// Biophysical Journal. -1997. -V. 73. -August. -P.1103-1109.

128. Holzel R. Non-invasive determination of bacterial single cell by electrorotation. Biochimica et Biophysica Acta. -1999. -V.1450. -P.53-60.

129. HolzelR. Nystatin-induced changes in yeast monitored by time-resolved automated single cell electrorotation// Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. -1998. -V.1425. -Iss.2. -P.311-318.

130. Hoshi M., Sasamoto Y., Nonaka M., Toyama K., Wata-nabe E. Microbial sensor system for nondestructive evaluation of fish meat quality// Biosens.Bioelectron. -1991. -V.6. -N1. -P.15-20.

131. Ignatov O.V., Rogatcheva S.M., Khorkina N.A., Kozulin S.V. Acrylamide and acrylic acid determination using respiratory activity of microbial cells// Biosensors & Bioelectronics. -1997. -V.12. -N.2. -P.105-111.

132. Jacobs H.W. Syrjala R.J. The use of infrared analyzers for monitoring acrylonitrile // Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 1978. -V. 39. -P. 292-313.

133. Jakoby W., Fredericks J. Reactions catalyzed by amidases// J. Biol.Chem. -1964. -V.239. -P. 1978-1984.

134. Jain R.K., Dreisbach J.H., Spain J.C. Biodégradation of p-nitrophenol via 1,2,4-benzentriol by an Arthrobacter sp. //Appl. Environ. Microbiol. 1994,- V. 60, № 8. - P.3030-3032.

135. Jennings B.R. & Oakley D.M. Electro-optic immunoassay. Phys. Med. Biol. -1988.-V.33. -N3. -P.355-360

136. Morris VJ & Jennings BR The effect of antibiotics on the electrical polarisability of aqueous suspensions of bacteria. Biochim Biophys Acta -1977. -V.29. -P.253-259.

137. Kalab T. & Skladal P. Evaluation of Mediators for Development of Amperometric Microbial Bioelectrodes Electroanal. -1994. -V.6. -P.1004-1008.

138. Karube I. A Novel Microbial Sensor for the Determination of Cyanide. Anal.Chim.Acta. -1995. -V.313. -P.69-74.

139. Katrlik,J.; Svorc.J.; Rosenberg.M.; Miertus.S. Whole-Cell Amperometric Biosensor Based on Aspergillus-Niger for Determination of Glucose with Enhanced Upper Linearity Limit Anal.Chim.Acta. -1996. -V.331. -P.225-232.

140. Kelly J.L., Kornberg H.L. Purification and properties of acyltransferases from Pseudomonas aeruginosa // Biochem.J. -1964. -Vol.93. -P.554-568.

141. Kimura A., Arima K., Murata K. Biofunctional change in jeast cell surface on treatment with Triton X-100 // Agricul. And Biol.Chem. 1981. - V.45, -№ 11. - P. 2627 -2629.

142. King W.H.,Jr. Piezoelectric sorption detector. Analytical Chemistry. -1964. -V.36. -P.1735-1739.

143. Kloosterman J. & Lilly M.D. An airlift loop reactor for the transformation of steroids by immobilized cells // Biotechnol.Lett. -1985. -V.7. -N.1. -P.25-30.

144. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa T., Yamada H. Purification and characterizatin of novel nitrilase of Rhodococcus rhodochrous K22 that acts on alipfatic amides // J. Bacteriol. -1990. -V.172. -N 9. P.4807-4815.

145. Korpan Y.I., Gonchar M.V., Starodub N.F., Sibirnyi A.A., Eiskaya A.V. Methylotrophic Yeast-Cells as Components of Biosensors A Formaldehyde Analyzer Based on a pH-Sensitive Field-Effect Transistor// Biochemistry Engl.Tr. -1994. -V.59. -P.141-143.

146. Lamikanra A., Allwood M.C. Effect of polyethoxyalkii-phenols on the optical density of Staphylococcus aureus //Appl. Bacteriol. 1977. - V.42. - P.387 - 392.

147. Lee J.I. & Karube I. Development of a Biosensor for Gaseous Cyanide in Solution// Biosens.Bioelectron. -1996. -V.11. -P.1147-1154.

148. Lee J.I. & Karube I. Reactor Type Sensor for Cyanide Using an Immobilized Microorganism// Electroanal. -1996. -V.8. -P.1117-1120.

149. Lefevre J.P., Caude M., Rosset R. Analysis of mixtures of maleic, fumaric, acrylic and metacrylic acids by ion exchange chromatography //Analusis. -1976. -V.4. -N 1. -P. 16-24.

150. Liu T.Z., Wang Y., Kounaves S.P., Brush E.J. Determination of organonitriles using enzyme-based selectivity mechanisms. 1. An ammonia gas sensing electrode-based sensor for benzonitrile.// Anal. Chem. -1993. -V.65. -N 21. -P.3134-3136.

151. Maestrassi M., Thiery A., Bui K., Arnaud A., Galzy P. Activity and regulation of an amidase (acylamide amidohydrolase, EC 3.5.1.4.) with a wide spectrum from a Brevibacterium sp. // Arch. Microbiol. -1984. -V.138, N4. P.315-320.

152. Maestrassi M., Thiery A., Arnaud A., Galzy P. A study of the mechanism of the reactions catalyzed by the amidase Brevibacterium sp. R312//Agric. Biol. Chem. -1986. -V.50. -N.9. -P. 2237-2241.

153. Maltoni C., Ciliberti A., Carretti D. Experimental contributions in identifying brain potencial carcinogens in the petrochemical industry//Ann. N. Y. Acad. Sei. 1982. -V. 381. -P.216-249.

154. Marco M-P. & Barcelo D. Environmental applications of analytical biosensors// Measurements Science and Technology. -1996. -V.7. -P.1547-1562.

155. Martens N., Hall E.A.H. Diaminodurene as a Mediator of a Photocurrent Using Intact-Cells of Cyanobacteria// Photo-chem.Photobiol. -1994. -V.59. -P.91-98.

156. McLaughlan A.M., Foster S.J. Molecular characterization of an autolytic amidase of Listeria monocytogenes EGD Microbiology-UK. -1998. A/. 144. -Part 5.-P. 1359-1367.

157. Mosbach K. & Kriz D. Development of a Simple Detector for Microbial-Metabolism, Based on a Polypyrrole DC Resis-tometric Device// Biosensors & Bioelectronics. -1994. -V.9. -P.551 -556.

158. Mozes N., Marchal F., Hermesse M.P., Van Haecht J.L.,Reuliaux L. Immobilization of Microorganisms by Adhesion Interplay of Electrostatic and Nonelectrostatic Interactions // Bio-technol.Bioengineer. -1987. -V.30. -N.3. -P.439-450.

159. Nagasawa T., Yamada H. Application of nitrile converting enzymes for the production of useful compounds // Pure and Appl. Chem.- 1990,- V.62, -N 7,- P.1441-1444.

160. Nagasawa T., Yamada H. Microbial transformations of nitriles.//Trends Biotechnol.- 1989,-V.7.- N 6,- P. 153-158.

161. Nakamura N, Shigematsu A, Matsunaga T Electrochemical detection of viable bacteria in urine and antibiotic selection. Biosens Bioelectron -1991. -V.6. -N.7. -P.575-580.

162. Nakanishi K., Ikebukuro K., Karube I. Determination of cyanide using a microbial sensor// Appl Biochem Biotechnol -1996. -V.60. -N.2. -P.97-106.

163. Neujahr H.Y. Determination of phenol and catechol concentrations with oxygen probes coated with immobilized enzymes or immobilized cells// Applied Biochemistry and Biotechnology. -1982. -V.7. -P.107-111.

164. Okita W.B., Boncham D.B., Gainer J.L. Covalent Coupling of Microorganisms to a Cellular Support. // Biotech-nol.Bioengineer. -1985. -V.27. -N.5. -P.632-637.

165. Pezzlo M.T. Automated methods for detection of bacteriu-ria. Am. J. Med. -1983. -V.28. -P.71-78.

166. Reshetilov A.N., Donova M.V., Khomutov S.M., Eliseeva T.P. Sensors Based on Field-Effect Transistors// J.Anal.Chem Engl.Tr. -1997. -V.52. -P.63-70.

167. Reshetilov A.N., Donova M.V., Dovbnya D.V., Boronin A.M., Leathers T.D., Greene R.V. FET-Microbial Sensor for Xylose Detection Based on Gluconobacter-Oxydans Cells // Biosens.Bioelectron. -1996. -V.11. -P.401-408.

168. Reshetilov A.N., lliasov P.V., Donova M.V., Dovbnya D.V., Boronin A.M., Leathers T.D., Greene R.V. Evaluation of a Gluconobacter-Oxydans Whole-Cell Biosensor for Amperometric Detection of Xylose// Biosens. Bioelectron. -1997. V.12. -P.241-247.

169. Riedel K., Lehmann M., Adler K., Kunze G. Physiological characterization of a microbial sensor containing the yeast Arxula adeninivorans LS3// Antonie Van Leeuwenhoek -1997. -V.71. -N.4. -P.345-351.

170. Robinson W.G., Hook R.H. Ricinin nitrilase. I. Reaction product and substrate specificity // J. Biol. Chem. -1964. -V.239. -N.12. -P.4257-4262.

171. Roederer J.E. & Baastians G.J. Microgravimetric immunoassay with piezoelectric crystals. Analytical Chemistry. -1983. -V.55. -P.2333-2336.

172. Patent USA N 4 138 292. C07G 7/02;C12B 1/00. Immobilized catalytically active substance and method of preparing the same./ I.Chibata, T.Tosa, I.Takata (Japan). 19P.

173. Puig D. & Barcelo D. Determination of Phenolic-Compounds in Water and Waste-Water// Trac.Trend.Anal.Chem. -1996. -V.15. -P.362-375.

174. Pyun JC, Beutel H, Meyer JU, Ruf HH Development of a biosensor for E. coli based on a flexural plate wave (FPW) transducer// Biosens. Bioelectron. -1998. -V.13. -N.7-8. -P.839-845.

175. Schmidt A., Standfuss-Gabisch C., Bilitewski U. Microbial biosensor for free fatty acids using an oxygen electrode based on thick film technology// Biosens.Bioelectron. -1996. -V.11. -N11. -P.1139-1145.

176. Seki A., Kubo I., Sasabe H., Tomioka H. A New Anion-Sensitive Biosensor Using an Ion-Sensitive Field-Effect. Transistor and a Light-Driven Chloride Pump, Halorhodopsin // Appl.Biochem.Biotech. -1994. -V.48. -P.205-211.

177. Sinolitsky M.K., Rogatcheva S.M., Poltavskaya S.V., Sintin A.A., Voronin S.P. Purification and characterization of nitrile hydratase from Rhodoccoccus rhodochrous M8 // Environmental

178. Biotechnology: Principles and Aplication. M. Moo-Young, W.A.Anderson, A.M.Chakrabarty (eds.).-1995. -P.96-104.

179. Smidrod O. & Skjak-Braek G. Alginate as immobilizing matrix for cells // Trends Biotechnol. -1990. -V.8. -N.3. -P.90-95.

180. Somervill H.J., Mason J.R. and Rufell R.N. Benzene degradation by bacterial cells immobilized in polyacrylamide gel // Eur.J.Appl.Microbiol. -1977. -V.4. -N.2. -P.75-85.

181. Spain J.C., Gibson D.T. Oxidation of Substituted Phenols by Pseudomonas putida F1 and Pseudomonas sp. strain JS6 //Appl. and Environ.Microbiol.-1988.-V.54. -№ 6.-P.1399-1404.

182. Spain J.C., Gibson D.T. Pathway for Biodégradation of p-nitrophenol in Moraxella sp. //Appl. and Environ.Microbiol.-1991.-.57, -№3.-P.812-819.

183. Stein K.; Hain J.U. Catalase Biosensor for the Determination of Hydrogen-Peroxide, Fluoride and Cyanide// Mikro-chim.Acta. 1995. -V.118. -P. 93-101.

184. Svitel J., Curilla 0., Tkac J. Microbial cell-based biosensor for sensing glucose, sucrose or lactose// Biotechnology and Applied Biochemistry. -1998. -V.27. -Part 2. -P. 153-158

185. Takayama K., Ikeda T., Nagasawa T. Mediated Am-perometric Biosensor for Nicotinic-Acid Based on Whole Cells of Pseudomonas-Fluorescens Electroanal. -1996. -V.8. -P.765-768.

186. Tan H., Le D„ Li J., Wei W., Yao S. A rapid method for determination of in vitro susceptibility to antibiotics with a bulk acoustic wave bacterial growth biosensor// Letters in Applied Microbiology. -1998. -V.27. -Iss.1. -P. 57-61

187. Tan H.W., Deng L., Nie L.H., Yao S.Z. Detection and Analysis of the Growth-Characteristics of Proteus-Vulgaris with a Bulk Acoustic-Wave Ammonia Sensor// Analyst. -1997. -V.122. -P.179-184.

188. Tatsuma T.t Oyama N. H202-Generating Peroxidase Electrodes as Reagentless Cyanide Sensors//Anal.Chem. -1996. -V.68. -P.1612-1615.

189. Thompson .LA, Knowles C.J., Linton E.A., Wyatt J.M. Microbial biotransformations of nitriles // Chem. in Britain.- September, 1988.- P.900-902.

190. Tramper J. Immobilizing biocatalysis for use in syntheses // Trends Biotechnol. -1985. -V.3. -N.2. -P.45-50.

191. Tsoka S., Gill A., Brookman J.L., Hoare M. Rapid monitoring of virus-like particles using an optical biosensor: A feasibility study//J. Biotechnology. -1998. -V.63. -Iss. 2. -P. 147-153.

192. Updike S.J. & Hicks G.P., The enzyme electrode// Nature. -1967. -V.214. -P.293-298.

193. Vairavamurthy A., Mopper K. Determination of low-molecular-weight carboxylic acids in aqueous samples by gas chromatography and nitrogen-selective detection of 2-nitrophenylhydrazides //Anal. Chim. Acta. -1990. -V.237. -N.1. -P. 215-221.

194. Van Loosdrecht M.C.M. & Novde W. Influence of cell surface characteristics on bacterisl adhesion to solid supports.//

195. Proc.4th Eur.Congr.Biotechnol. Amsterdam, June 14-19 1987. -V.1. -Amsterdam. -1987. -P.227-237.

196. Venitt S., Bushell C.T., Osborne M. Mutagenicity of acry-lonitrile (cyanoethylene) in Escherichia coli // Mutat. Res. -1977. -V. 45. -N.2. P 283-288.

197. Willhite C.C., Smith S.P. The role of cyanide liberation in the acute toxity of aliphatic nitriles // Toxicol, appl. Pharmacol. -1981. V. 59. -P.589-602.

198. Yamada H., Kobayashi M. Nitrile hydratase and its application to industrial production of acrylamide // Biosci. Biotech. Biochem. -1996. -V.69. -N9. -P.1391-1400.

199. Yu J., Wang Y. Determination of air acrylamide by gas chromatography // Zhonghua Laodong Weisheng Zhiyebing Zazhi. -1989. -V. 7. -N.4. -P. 234-235.

200. Zhou C., Pivarnik P., Rand A.G., Letcher S.V. Acoustic standing-wave enhancement of a fiber-optic Salmonella biosensor. Biosens.Bioelectron. -1998. -V.13. -N.5. -P.495-500.

201. Zhou X.F., Burt J.P.H., Pethig R. Automatic cell electrorotation measurements: studies of the biological effects of low-frequency magnetic fields and of heat shock. Physics in Medicine and Biology. -1998. -V.43. -Iss.5. -P.1075-1090

202. Zhou X.F., Markx G.H., Pethig R. Effect of biocide concentration on electrorotation spectra of yeast cells// Biochimica et Biophysica Acta. -1996. -V.1281. -P.60-64.328

203. Zhou X.F., Markx G.H., Pethig R., Eastwood I.M. Différenciation of viable and non-viable bacterial biofilms using electrorotation// Biochimica et Biophysica Acta. -1995. -V.1245. -P.85-93.

204. СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГОСУДАРСТВЕННОМ КОМИТЕТЕ СССР ПО НАУКЕ И ТЕХНИКЕ (Г0СК0МИ30БРЕТЕНИЙ)

205. На основании полномочий, предоставленных Правительством СССР, Госкомизобретений1, выдал настоящее авторское свидетельствона < из^ретениёГ,. * 11Г) .

206. Способ пмученяяВШмобилизованнБос миэдоорганизмов, разрушающих ксан^биотияи" . „ .

207. Автор (авторы-):- - ^ * 1г 4 ,г Игнатов:Олег Владимирович и другие, указанные' в описании ;тотт ттж'ж фйзиояош растений и

208. ЗаявительР№°0?ЗДВМ0В Ж СССР

209. Заявка № 4618803 Приоритет изобретения-.2декабрЯ 1988с,

210. Зарегистрировано в Государственном реестре ' изобретений' ССОР' >- • ■15 сентября 1991г; ;

211. V Действие авторского свидетельства распро-V'1' страняется на всю территор^ябТл^за ССР.1. Председатель Комитета1. Начальник отдела

212. СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГОСУДАРСТВЕННОМ КОМИТЕТЕ СССР ПО НАУКЕ И ТЕХНИКЕ ' (Г0СК0МИ30БРЕТЕНИЙ)л \ ^ Л1. * '-г

213. На ^основании порюмочий,предоставленных > Правительством СССР, 1>аюмизобре:едц^ чна изобретение:полиоахаридном

214. X ''' ^ # I' Т к /|САРАдМШ 'ШИЙ1ВСЕС0ШЙ0Г0 ЕАУШО-ИССЛЩО

215. Заявитель: I Р^п^^ЖЖЖЖ^Р^ Я ОМЩШ ПРО-^МШШШШ^^ОрШШМОВ'И^АРАТОВти НАУЧНО.носителеЦу У Лу // > /V1. Птички на1. ЙУШШСЙЕЕТА¿Г• .адрЕеневи^Врвслав^Иоаевит;/ "Ух £

216. Зарегистрировано;! в/Государственном реестре / / , изобретений Союза ССР22 февраля Ш2т.1. Председатель Комитета1. Начальник отдела1 л