Мобильные генетические элементы Drosophila melanogaster: особенности локализации и транспозиции, коррелирующие с изменением фенотипа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Беляева, Елена Спартаковна

• Беляева, Елена Спартаковна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Беляева, Елена Спартаковна

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ0Б30Р.

1. Мобильные диспергированные гены или сор/а подобные элементы.

1) Локализация мдг в хромосомах. II

2) Молекулярно-генетическая организация мдг

2. Семейство FB (fold-back , или "шпилечных" последовательностей).

3. Вставки в рибосомные гены.

4. Семейство"беспорядочно собранных" ( scrambled) последовательностей.

5. Мобильные генетические элементы и нестабильность генных локусов

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Глаза I. Закономерности распределения мдг-I и мдг-3 в политенных хромосомах разных линий

1) Распределение мдг-I в хромосомах линий.

2) Распределение мдг-3 в хромосомах линий.

Глава 2. Анализ распределения мдг в родственных линиях НА, НА+ и ВА, полученных после длительной селекции и инбридинга и различающихся по уровню конкурентоспособности

Глава 3. Обнаружение транспозиций мдг, коррелиру

-3Стр, ющих с увеличением индекса конкурентоспособности

Глава 4. Стабильность локализации мдг и их транспозиции, наблюдаемые в скрещиваниях

ОБСУЖДЕНИЕ . ИЗ

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Мобильные генетические элементы Drosophila melanogaster: особенности локализации и транспозиции, коррелирующие с изменением фенотипа»

Актуальность проблемы. В последние годы в результате изучения генома эукариот с помощью методов генной инженерии были выделены и охарактеризованы мобильные генетические элементы* К настоящему времени исследования мобильных элементов самых разных представителей эукариот (дрожжи, дрозофила, млекопитающие, растения и т.д.) развились в целое направление современной молекулярной биологии и генетики. Мобильные генетические элементы составляют значительную часть генома дрозофилы и других эукариотических организмов, поэтому изучение их свойств, а также их возможной роли в функционировании генома является актуальной проблемой современной биологии. Исследуется их роль в процессе мутагенеза и регуляции экспрессии генов. Открытие мобильных генетических элементов позволяет также рассматривать с новых позиций, воцросы эволюции.

Цель и задачи исследования. В лаборатории Г.П.Георгие-ва, в Институте молекулярной биологии АН СССР, в 1977 году были открыты активно транскрибируемые повторяющиеся генетические элементы V. rnetanogaster . Гибридизация s'l£ll и дальнейший молекулярно-биологический анализ позюлили заключить, что выделенные фрагменты представляют собой мобильные элементы генома 2). me&fnogcrster , названные мобильными диспергированными генами, или мдг. С помощью метода гибридизации и? sitie было показано, прежде всего на примере мдг-Х, что число сайтов гибридизации с политенными хромосомами и особенно характер распределения по хромосомам существенно различается в разных линиях 2). meioLnogcrs'ter' /24/. Исследование особенностей распределения мдг по длине хромосом, по-видимому, является необходимым этапом на пути выяснения возможной етруктурно-функ-циональной роли мдг. Поэтому первая задача работы состояла в изучении характера распределения мдг-1 и мдг-3 у целого ряда лабораторных линий £>. т&ИапОдалЬег.

Вопрос о функциях мдг в геноме дрозофилы в настоящее время продолжает дискутироваться« Один из возможных подходов к исследованию функций мдг может состоять в изучении закономерностей транспозиций мдг и исследовании их влияния на фено-типические характеристики особей. Таким образом, вторую и основную часть настоящей работы составляло изучение транспозиций мдг, коррелирующих с резким увеличением жизнеспособности особей.

Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе, на примере большого числа лабораторных линий, была выявлена неслучайность распределения мдг-1 и мдг-3 по хромосомам. Удалось выделить участки предпочтительной локализации мдг. Существенная часть таких районов, в особенности в хромосоме 2, перекрываются с районами интеркалярного гетерохроматина.

Впервые были обнаружены транспозиции мдг, происходящие в лабораторной линии £Х гтЕгтодеи'Ыг' в процессе эксперимента. Показано, что эти транспозиции носят неслучайный (направленный) характер. Выявлены корреляции между транспозициями мдг и увеличением жизнеспособности и приспособленности особей. Полученные результаты позволяют предполагать, что транспозиции мдг играют определенную роль в определении ряда количественных признаков и приспособленности особей.

Апробация работы» Основные результаты настоящего исследования докладывались на 1У съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им, Н.И.Вавилова, Кишинев (1981), на симпозиуме в Колд Спринг Харбор (США, 1980), на международном симпозиуме "Организация и экспрессия тканеспецифических генов1*, Новосибирск (1982), на У Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва (1983).

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Мобильные генетические элементы дрозофилы Введение

Впервые нестабильные генетические элементы у эукариот были открыты с помощью генетического анализа на кукурузе /86,87/. Мак Клинток, исследуя возникновение пигментных пятен на кукурузе, пришла к выводу о существовании "контролирующих элементов", ответственных за наблюдаемые изменения генетической экспрессии. Оказалось, что контролирующие элементы способны к перемещению в геноме, вызывая структурные изменения хромосом и индуцируя мутантный фенотип»

Аналогичное явление было обнаружено позже у дрозофилы /58/ в случае мутации . Эта мутация с высокой частотой ревертировала к нормальному фенотипу и вызывала хромосомные абберации. Грин предположил, что мутация возникла в результате встраивания чужеродных последовательностей ДОК в ген white- а Таким образом, существование в геноме эукариотичес-ких организмов генетических элементов, способных к изменению своего местоположения в хромосомах, предполагалось уже давно. Однако, вццелить их и изучить их свойства стало возможно только благодаря развитию методов генной инженерии.

Впервые мобильные генетические элементы были выделены из генома Й тe£oJiogat>ter- в составе рекомбинантных клонов в Лаборатории Хогнесса в США /76/ и Георгиева в СССР /11,53/ по их способности связывать значительную часть клеточной РНК. Оказалось, что эти элементы обладают свойствами, отличающими их от всех ранее известных генов. Во-первых, они представлены большим количеством копий на геном и при гибридизации LH Sitte дают до нескольких десятков сайтов гибридизации, то есть являются множественными рассеянными по хромосомам генами. Во-вторых, Е.В.Ананьев показал, что члены одного семейства генетических элементов в разных лабораторных линиях располагаются в различных местах хромосом. Это была первая работа, указывающая на существование в геноме Û. mefxinOßout&r множественных генетических элементов с варьирующей локализацией /24,53/. Отсюда возникло предположение, что вьщеленные генетические элементы являются мобильными. В дальнейшем они получили название мобильных диспергированных генов (мдг), или copia подобных элементов. Данные по гибридизации in Sutic. затем были подтверждены результатами рестрикционного анализа, с помощью которого было показано, что мдг могут находиться в соседстве с различными последовательностями хромосомной ДНК /45,62/.

В настоящее время у £). meianogastêf выявлен целый ряд мобильных элементов разных типов /21,109/. Часто они обнаруживаются при детальном молекулярно-биологическом анализе выбранных фрагментов генома. Признак, на основании которого делают заключение о том, что данный фрагмент ДНК представляет собой мобильный элемент, это наличие коротких прямых повторов по его краям, которые образовались в процессе инсерции мобильного элемента и представляет собой дупликацию последовательности ДНК-мишени. Такая дупликация, например, возникает при внедрении бактериального транспозона /30/. Кроме того, как уже отмечалось, варьирующая локализация в хромосомах разных линий £). melanogoute*' также указывает на мобильность того или иного семейства последовательностей.

На основании ряда структурных особенностей мобильных генетических элементов можно разделить их на следующие типы; I) мдг - характеризуются наличием длинных прямых концевых повторов ; 2) га - наличием длинных обращенных повторов с характерной структурой; 3) вставки в рибоеомные гены - не содержат вышеперечисленных элементов ; 4) последовательности типа

- содержат обращенные повторы небольшого размера; Ъ) „зессипОех^ * - кластеры повторов, содержащие мобильные элементы; 6) Р-элемент - заслуживающий специального рассмотрения в связи с особыми функциональными свойствами этого элемента (табл. I). Теперь рассмотрим более подробно, что известно о каждом классе мобильных генетических элементов.

I. Мобильные диспергированные гены, или сор¿а подобные элементы

Мобильные диспергированные гены можно отнести к наиболее изученному классу мобильных генетических элементов. Сейчас уже вьщелен целый ряд различных семейств мдг, по-видимому, составляющих существенную часть среднеповторяющихся последовательностей в геноме гу)е£аподса£ы. Следует отметить, что все копии одного семейства достаточно сходны по размеру и по первичной нуклеотидной последовательности. С самого начала исследования мдг проводились в основном в двух направлениях: I) анализ локализации в хромосомах $ 2) изучение молекулярно-генетической организации.

Таблица I.

Молекулярная характеристика разных типов мобильных генетических элементов. размер тыс.н.п. прямой концевой повтор н.п. инвертированный повтор н.п. дупликация в сайте мишени н.п. число копий в геноме мдг /6, 10б/ 5-7. от 266'по 500 от 3 до 18 4-5 . от 5 до 150

РВ /99/ варьирует за счет центрального района - от 190 до 1600 9 " 30 вставки в 28 ¿> РНК гены /130/ 5, 1.0, 0.5 - ? от 7 до 15 100 zetta 7 - ' 10 13 50

Р элемент /28/ . 3, от 0.5 до 1.6 - 31 8 30-50

-II

Локализация мдг в хромосомах

В этом разделе будут приведены только некоторые основные данные, касающиеся цитогенетической характеристики мдг. Вопросы, связанные с особенностями локализации мдг в хромосомах £). утпеЬоипо^алЬг*' будут рассмотрены в разделе "обсуждение". Как уже говорилось, с помощью метода гибридизации Ъп ¿¿¿и. , было обнаружено, что мобильные диспергированные гены могут располагаться в различных местах хромосом /53,62,45/. Число сайтов локализации каждого семейства мдг приблизительно соответствует числу его копий на геном (определяемых с помощью метода гибридизации по Саузерну /119/. Таким образом, в одном сайте находится, вероятнее всего, одна копия мдг. Данные по гибридизации 1м ¿¡£си говорят также против модели тандемной организации, так как уникальные фрагменты ДНК, окружающие мдг, гибридизуют-ся с той же эффективностью с данным районом политенных хромосом, что и сам мдг /3/.

Высокая степень различий между разными линиями дрозофилы, требовала выяснения вопроса о том, в какой степени локализация мдг стабильна в клетках одного и того же организма. Анализ сайтов гибридизации в клетках одной слюнной железы показал, что между ними нет различий ни по числу» ни по местоположению мдг /24/. Число сайтов локализации и их местоположение в хромосомах разных тканей также оказалось идентичным /25/. На основании этих наблюдений Е.В.Ананьев предположил, что в процессе онтогенеза местоположение мдг в хромосомах не изменяется.

Мобильные диспергированные гены характеризуются высокой видоспецифичностью. Так, мдг, вьщеленные из 2).юе&игю&ш!^^

-iaне удается обнаружить в геноме î). viritis , В. fajuSris и Ь. WULoroutlb /3, 10/. С другой стороны, мдг, выделенные из ДНК 3. vLriÜJb не имеют сайтов гибридизации в хромосомах ^.mdXLhO^cutü^ /41/. В противоположность этому, ДНК, соответствующая уникальным генам Ä meiano^cuie^, гибриди-зуется с хромосомами Ä vifilu? . Таким образом, уникальные гены более консервативны в эволюции, чем мдг /128/. Многие мобильные диспергированные гены (copia, мдг-I и другие) показывают гибридизацию с политенными хромосомами близкородственного вида siynutaJbi, /3,37,137/. Однако число копий мдг в геноме £). ¿>1ми1мл£ уменьшено примерно в три раза. Эта особенность локализации мдг выявлена более чем для десятка различных семейств мдг.

Молекулярно-генетическая организация мдг

Основные свойства нескольких наиболее хорошо изученных семейств мобильных диспергированных генов отражены в таблице 2. Мдг представлены большим числом копий на геном от 5 у мдг-4 и до 120 у семейства BI04 /112/. Интересно, что количество копий на гаплоидный геном резко возрастает в культуре клеток, в результате их транспозиций в новые районы хромосом /98/. Мдг представляют собой длинные (по 5-7 тыс. п.н.) последовательности ДНК. Характерной чертой строения мдг является присутствие на их концах прямых повторяющихся последовательностей длиной от 266 до 500 пар оснований (табл. 2) /19,26,45,74,134/. Важно отметить, что в отличие от элементов у дрожжей /31/, длинные концевые повторы не обнаруживаются отдельно от центрального района, или "тела" мдг. Прямые концевые повторы содержат в своем составе два (copia, Ът 412, мдг-I) или один (мдг-3) не

Таблица 2.

Молекулярная характеристика.разных семейств мобильных диспергированных генов. элемент число копий в геноме прямой концевой повтор н.п. инвертированный повтор н.п. дупликация в сайте мишени н.п. размер тыс.н.п. copia /45/ 20-60 276 7 5 5

412,или мдг-2 /98/ 40 481 10 4 7 мдг-4,или gypsy /89/ 5-10 500 7 5 7,3

297 /98/ 30 412 3 4 6,5

W 20-30 442 16 4 7,2

Ж/3 15 269 18 5 5,5

BI04 /И2/ 120 429 3 5 8,5

H.M.S. Beagle /118/ 50 266 7 4 7,3 i i—i со I совершенных инвертированных повтора. Почти все исследованные мдг начинаются с последовательности ТСТ и оканчиваются последовательностью ТС А.

Данных относительно того, что представляет собой "тело" мдг, пока практически нет. Можно назвать только одну работу, в которой был проведен анализ последовательностей небольшого района в составе элемента cop¿a (примерно в средней части "тела"). Был выявлен район со сложной структурой, представляющий собой повтор из трех родственных, но отличающихся по последовательности субфрагментов. Размер каждого субфрагмента приблизительно равен 35-37 нуклеотидам. Субфрагменты повторены три раза и расположены в следующем порядке: АБСА В С А В С. функция таких последовательностей неясна. Предполагается, что они содержат сигналы полиаденилирования, а также сигнальные последовательности для процессинга и терминации транскрипции /51/.

Большинство данных, полученных к настоящему моменту, свидетельствуют о том, что варьирующая локализация мдг в геноме дрозофилы возникла в результате их транспозиции. Как уже говорилось, признак на основании которого делают заключение о том, что данный фрагмент представляет собой мобильный элемент - наличие коротких прямых повторов по его краям, которые образовались в процессе инсерции мобильного элемента и представляют собой дупликацию последовательности ДНК-мишени. Оказалось, что у всех изученных мдг к обеим сторонам несовершенных инвертированных повторов примыкают по два коротких прямых повтора. Размер дуплицированного участка может варьировать в зависимости от семейства мдг (см, таблицу 2). В случае copia и 412 происхождение коротких концевых повторов за счет дупликации хозяйской последовательности строго доказано /38,77/.

Механизм транспозиции мдг пока остается неясным. Очевидно, что решающая роль принадлежит областям гомологии, расположенным на концах мдг. В клетках ¿>. meianogcwte*' обнаружены кольцевые ДШ, гомологичные элементу cop¿a. Это дает основание предполагать, что одним из возможных способов перемещения мдг может быть образование кольцевых экстрахромосомных копий мдг /49,50/. Способ образования таких кольцевых молекул неизвестен. Возможно, образование кольцевых молекул может осуществляться с помощью обратной транскрипции: FHK транскрибируется с цдг по аналогии ретровирусов. В пользу такой возможности говорит тот факт, что в составе ццг (как и в составе ретровирусов) есть последовательности, комплементарные участкам генома tFHK /13,19/.

Известно, что тРНК служит затравкой при обратной транскрипции ретровирусной РНК. Однако, не исключено, что образование колец происходит за счет вырезания ДНК из хромосомы или за счет локальной экстрарепликации. Образование кольцевых молекул, содержащих мдг, по-видимому, является редким событием. В клетках, культивируемых ui vitho , обнаруживается в среднем одна кольцевая молекула, содержащая сор/а, на 50 клеток /49/, С целью изучения функций мдг важно было исследовать их транскрипцию и трансляцию. Установлено, что мобильные диспергированные гены транскрибируются полностью, включая концевые повторы. Таким образом, каждый элемент представляет собой одну единицу транскрипции. Последовательность Хогнесса-Гольд-берга (TATA последовательность) находится в зоне первого концевого повтора, заканчивается транскрипция в зоне второго прямого концевого повтора, в котором находится сайт терминации /45,14,22/.

Оказалось, что РНК считывается с обеих цепей ДНК мдг (симметричная транскрипция). Однако, одна нить транскрибируется примерно в 20 раз менее эффективно, чем вторая /22,54/. За счет симметричного характера транскрипции в выделенных препаратах поли (А)+ РНК, выявляются двуспиральные молекулы. Поэтому, в лаборатории Г.П.Георгиева было предложено использовать гибридизацию клонированных фрагментов с дс РНК (дву-спиральной РНК) как диагностический тест для выявления мдг.

Главным продуктом синтеза является полный транскрипт мдг. Наряду с этим транскриптом в цитоплазме обнаружена минорная фракция поли (А)+РНК. В случае мдг-1 и мдг-3 /13,14/ такая ИК содержит длинные 3» и короткие 5* концевые части первичного транскрипта. Таким образом, РНК, транскрибируясь с мдг-1 и мдг-3, по-видимому, подвергается сплайсингу с вырезанием центрального участка этой РНК. Длинные и короткие транскрипты были обнаружены также для сор/а /32,113,137/, Ът412 /45,137/ и ВЮ4 /112/. Например, в случае сор ¿а обнаружены 4 РНК разных размеров, гомологичные различным участкам сор^а. В данном случае разные транскрипты возникли, вероятно, в результате процессинга.

По-видимому, транскрипция мдг происходит на поздних стадиях эмбриогенеза. Так, РНК, гомологичная сор/а элементу, наиболее полно экстрагируется на стадии развития личинки /43,106/. Хотя транскрипты с мдг-1 могут составлять до 10% от цитоплазматической поли (А+) РНК, в полисомах обнаруживается лишь незначительная их фракция, и мдг преимущественно локализованы во фракции свободных РНП частиц неизвестной природы /12,42,45,63,137/. Более того, оказалось, что значительная

часть РНК (около 10%), гомологичная D.mAlZ и copia находится в ядре и не переходит в цитоплазму /43,137/. До сих пор оста ется неизвестным, происходит ли трансляция мдг Ш vlvo Пока трансляция РНК in vitro показана только для элемента copia /42,48/, Были обнаружены три новообразованных пептида размером от 5000 до 18000 аминокислот. В этом случае активно транслируется малая РНК длиной 2 тыс.п.н.

Суммируя данные, полученные в результате детального изучения биохимической структуры и цитологической локализации мдг в хромосомах T>.Yr)d£uno^aiia^ % можно заключить, что для мобильных диспергированных генов характерны следующие основные свойства: I) мдг представлены сравнительно большим числом копий на геном (от 5 до 100) ; 2) они могут быть локализованы в различных местах хромосом. В каждом районе, по-видимому, находится одна копия мдг ; 3) расположение мдг отличается в различных линиях Ù- m&1оло<дал"ter и в меньшей степени у особей из одной линии ; 4) мдг активно транскрибируются и каждое семейство связывает от 0,3 до 3$ клеточной поли (А+)РНК; 5) мдг амплифицируются в культуре клеток ; 6) для мдг характерна симметричная транскрипция ; 7) одно из важных свойств мдг, отличающее их от других мобильных генетических элементов, состоит в том, что члены одного семейства мдг практически идентичны ; 8) мобильные диспергированные гены характеризуются общей структурой: они состоят из центрального района (длиной от 5 до 7 тыс.п.н.), который ограничен прямыми повторами от 300 до 500 п.н. По краям длинных прямых повторов расположены короткие несовершенные инвертированные повторы. Вся структура окружена в геноме прямыми повторами от 4 до 5 н.п., которые возникают за счет дупликации хозяйской ДНК в процессе встраивания мдг.

В последнее время многие исследователи склонны предполагать, что мдг подобны ретровирусам, интегрированным в геном дрозофилы /47/. На это указывает большое сходство, -которое имеется между мдг-элементами и эндогенными проретровирусами мыши /6/. Приведу основные черты сходства этих генетических элементов: I) большое число копий на геном; 2) активная транскрипция ; 3) множественная локализация ; 4) вариабельность локализации в различных линиях ; 5) симметричная транскрипция ; 6) существование двух типов FHK (процессинг) ; 7) прямые длинные и короткие инвертированные повторы необходимые для интеграции; 8) транскрипция FHK начинается и оканчивается в концевых прямых повторах и охватывает весь интегрированный геном. Усиливают это предположение данные о том, что в составе вирусоподобных частиц в клетках дрозофилы были обнаружены последовательности, гомологичные элементу copia /114/.

Теперь коротко будут рассмотрены другие мобильные генетические элементы, обнаруженные в геноме D. meÍQJiogazter.

Семейство FB ( или "шпилечных") последо вательностей

Ко второму классу мобильных генетических элементов генома D. me£xino^oLít£f можно отнести так называемые FB-последо-вательности. Поттером с соавторами /99/ была выделена фракция палиндромных последовательностей ДИК, которую они использовали для обнаружения клонов, несущих комплементарные им последовательности да. Этим способом из библиотеки рекомбинантных клонов был отобран один (р Dm Fbl ), у которого при исследовании под электронным микроскопом были обнаружены палиндромные последовательности ДНК. С помощью FBI было выделено еще 9 членов этого семейства. Методом гибридизации in Situ. было показано, что местоположение FB последовательностей отличается у разных линий D. melanogcuter.

Для каждого из 9 клонов были построены подробные реет-риктные карты. Оказалось, что концы вьщеленных фрагментов ДНК ограничены инвертированными повторами длиной до 1,6 тыс. п.н.

Следует отметить, что в отличие от мдг, члены одного FB-семейства имеют гомологичные инвертированные повторы, но разные по длине и нуклеотидной последовательности центральные районы или "петли" /99,129/. Структура концевых последовательностей оказалась достаточно сложной. В начале инвертированного повтора (показано для FB4) находятся несовершенные прямые повторы длиной в 10 н.п., которые разделены между собой другими последовательностями ДНК нерегулярной структуры. Начиная с 220 нуклеотида, следует участок, состоящий из повторяющихся последовательностей в 20 н.п., которые перемежаются с более короткими АТ-богатыми последовательностями ДНК. В состав повтора в 20 н.п. входит предыдущий повтор в 10 н.п. С пятисотого нуклеотида продолжаются прямые тандемные 31-нуклеотидные повторы, они включают в себя повторяющиеся последовательности длиной в 20 нуклеотидных пар. Найдено 5 типов 31 нуклеотидных последовательностей, которые периодически повторяясь, образуют единицу в 155 нуклеотидов, выделяемую при рестрикции Tagl. Таким образом, инвертированный повтор в составе FB элемента представляет собой сложную структуру (повтор внутри повтора). Его наличие в составе FB элементов авторы этой работы связывают с особенностями транспозиции этих элементов.

Как и в случае бактериальных транспозонов, а также мдг элементов, при встраивании РВ последовательностей появляется дупликация в сайте-мишени, длиной в 9 н.п. /100/. Возможно, что механизм переноса FB элемента сходен с бактериальным.

По-видимому, FB элементы могут транскрибироваться (хотя прямых данных, свидетельствующих о транскрипции РВ элементов, получено не было), так как в их составе обнаружены "последовательности Хогнесса" и сигналы полиаденилирования /49/.

Вставки в рибосомные гены

Образование дупликаций в сайте-мишени является одним из признаков перемещающихся последовательностей ДНК. Именно благодаря этому свойству, инсерционные последовательности, обнаруженные в рибосомных генах D. те&ьподouter » можно отнести к классу мобильных генетических элементов /55,133/. Эти элементы представляют собой родственные последовательности ДНК, дивергировавшие в процессе эволюции, так как копии, принадле-жещие к одному семейству, различаются как по размеру, так и последовательности оснований.

Различают два типа инсерционных последовательностей или вставок /35,135/. Вставки первого типа найдены у 60% 2BSШК генов в Х-хромосоме и не обнаружены в рибосомных генах У-хромосомы /96,126,130/. Они могут быть различной длины: 5 тыс.н.п., 1,0 тыс.п.н., 0,5 тыс. п.н. /131/. Вставки второго типа обнаруживаются у 15% рДНК как в Х-, так и в У-эфомо сомах, и могут варьировать в размерах от 2,5 до 4 тыс. п.н. /18,103, 130/. По краям вставок первого типа найдены прямые короткие повторы длиной от 7 до 15 п.н., которые, как уже говорилось, возникли в результате дупликации хозяйской ДНК. В местах локализации инсерционных последовательностей второго типа дупликации хозяйской ДНК не происходит и, напротив, вставки такого размера могут вызывать делецию хозяйской ДНК длиной в 9 нукле-отидов /104/. Таким образом, возможно, что вставки, по крайней мере первого типа, появились в рибосомных генах в результате их транспозиций. Это предположение усиливают данные о том, что в хромоцентре и в одном районе 4-й хромосомы существуют последовательности, представленные большим числом копий на геном (100 копий/геном), гомологичные вставкам первого типа.

Вставки первого типа, по-видимому, препятствуют транскрипции рДНК. Это предположение согласуется с данными о том, что уровень транскрипции рДНК, содержащих вставки первого типа, очень низкий /80,66/. Вероятно рДНК, содержащие вставки второго типа, транскрибируются также с очень низкой эффективностью /81/.

Следует отметить, что последовательности в хромоцентре и в одном из районов хромосомы 4, подобные вставкам 1-ого типа, могут встречаться в виде тандемных повторов по 5 тыс.н.п., а также перемежаться с другими среднеповторяющимися последовательностями ДНК, которые были названы фланкирующими, или прерывающими последовательностями. При гибридизации 1*о ¿¡Ъи. прерывающие последовательности дают от нескольких до 50 сайтов гибридизации, причем их распределение в различных линиях ¿2 отличается. Таким образом, данные последовательности также можно отнести к мобильным генетическим элементам генома & ме1ш>одал'Ье+' л О способности этих элементов к транспозиции говорит также тот факт, что на их концах обнаружены повторы длиной 13 н.п., образованные в результате дупликации хозяйской ДНК /101/. Было выделено несколько таких семейств ДОК, из которых наиболее подробно изучено семейство, получившее название , Размер последовательностей, входящих в это семейство, равен 7,4 тыс.п.н. На концах элемента 2&ЬЬси расположены короткие инвертированные последовательности длиной до 10 н.п. /36,69/. Оказалось, что два ¿>со(И фрагмента, составляющих 2.еЬЬои , могут распределяться в геноме независимо друг от друга как в составе ин-серционных последовательностей, подобных вставкам 1-ого типа, так и в ином окружении. Основное отличие последовательностей типа %Мо- состоит в том, что они составляют семейства, члены каждого из которых дивергировали по последовательности оснований, транскрибируются с низкой эффективностью с образованием поли(А") РНК и не содержат длинных концевых повторов.

Семейство "беспорядочно собранных" (лсьшпВ^еД. ) последо вательностей

Беспорядочно собранные" последовательности по своим свойствам резко отличаются от других уже описанных типов мобильных генетических элементов. Эти последовательности представляют собой довольно крупные кластеры умеренных повторов от 300 до 1000 н.п. Каждый кластер длиной в несколько тыс.н.п. содержит различные семейства таких умеренных повторов. Последовательности часто повторяются внутри одного кластера, причем иногда в обратной ориентации. Повторы из одного кластера встречаются примерно в тысячи хромосомных районов как в гетерохроматине, так и в хромосомных плечах. В связи с этими особенностями их локализации было выдвинуто предположение, что повторы такого типа могут перемещаться в геноме за счет рекомбинации по гомологичным последовательностям. При подробном изучении четырех кластеров в их составе было обнаружено 17 различных семейств повторяющихся последовательностей. Таким образом, по приблизительной оценке, четверть умеренно повторяющихся последовательностей может быть организована в подобные кластеры /132/. Последовательности, обнаруженные Венсинком, по-видимому, могут входить в состав других мобильных генетических элементов. Например, обнаружена гомология между одним из кластеров повторов и copia подобным элементом Dm 412.

Р-элементы

К мобильным генетическим элементам генома D. gcwbef можно отнести Р-элемент, интерес к которому в последнее время очень возрос, В этом разделе будут кратко рассмотрены некоторые его свойства. Р-элемент был выделен Рубиным с соавторами /108/ в составе локуса white . Р-элемент может быть различной длины. Основным элементом является последовательность длиной в 3 тыс.н.п., из которой в результате простой делеции центрального участка могут возникать малые Р-элементы от 0,5 до 1,6 тыс. н.п. В то же время, концы всех элементов гомологичны - это инвертированные повторы, содержащие 31 ну-клеотид /92/. Предполагается, что инвертированные повторы являются сайтами узнавания транепозаз. Как и для других типов мобильных элементов, для Р-элемента характерна множественная варьирующая локализация. Биологическая роль Р-элементов будет рассмотрена позднее.

Подробный сравнительный анализ структуры различных семейств мобильных генетических элементов у D. rneùmofycutejк настоящему времени проводить еще преждевременно. Если структура мдг изучена достаточно подробно, то данные по структуре других семейств мобильных генетических элементов являются далеко не полными. Тем не менее, определенное сходство в структуре различных типов мобильных элементов можно выявить (табл. I). Почти для всех мобильных генетических элементов характерно наличие центрального района, окруженного с обеих сторон повторяющимися последовательностями различной длины, которые, вероятно, непосредственно вовлечены в процесс транспозиции.

Для сор¿а подобных элементов показана интенсивная транскрипция. В случае РВ и Р-элементов обнаружены "открытые рамки считывания". Поэтому можно говорить об экспрессии генов, заключенных внутри ряда мобильных элементов. Предполагается, что они могут кодировать транспозазы. Вероятно, разные мобильные элементы, различающиеся по строению концевых повторов и центрального района, характеризуются разными механизмами транспозиции. Отметим также, что для каждого семейства мобильных эле-, ментов характерна разная степень полиморфизма по молекулярной структуре: высокая - для РВ и Р-элементов и сравнительно небольшая для мдг подобных элементов. Хотя сейчас уже много известно о молекулярной структуре мобильных элементов, вопрос об их функциональной роли остается еще далеко невыясненным. Отметим, что основная часть среднеповторяющейся фракции ДВК эука-риот, по-видимому, представлена мобильными генетическими элементами /4,83/. Существует большая литература, в которой уже много лет дискутируется вопрос о функциональной роли средних повторов. Теперь к исследованию этих вопросов можно будет вернуться с новых позиций. Сопоставление количества среднеповторяющейся ДОК в геноме ОююрЪ^ те1стода*Ь>г< /75/ с частотой выявления мобильных генетических элементов в составе клонированных сегментов ДНК /136/ позволяет заключить, что и в случае /), подавляющая часть умеренных повторов может быть представлена мобильными элементами.

Мобильные генетические элементы и нестабильность генных локусов

Накопленные к настоящему времени данные дают основание считать, что мобильные элементы могут принимать непосредственное участие в мутационном процессе и отвечать за нестабильность структурных генов. У дрозофилы, так же как и у других организмов, описаны мутации по некоторым генам у, W, с£-/59,60,102/, которые проявляют высокую нестабильность: как частота их возникновения, так и реверсия к норме может значительно превышать в 10-100 раз частоту спонтанного мутирования. Например, в случае гена J>n частота возникновения мутаций может достигать 20-50% от числа всех особей /8/.

По аналогии с данными, ранее полученными в отношении транспозонов бактерий /30/, была выдвинута гипотеза, согласно которой нестабильные аллели разных ло кусов Z). meÙLnogaz возникают в результате внедрения перемещающихся элементов /57/.

Первые, достаточно косвенные, данные относительно роли мобильных элементов в генетической нестабильности, были получены для локуса wkiit. . Было показано /27/, что клонированные фрагменты ДНК, содержащие элемент сор/а, гибридизуются в политенных хромосомах с районом локуса whïte~ , если в нем находится аллель W^ , но не дикий аллель. В нашей совместной работе с Рассмусоном /102/ было обнаружено, что приобретение локусом white. нестабильности может коррелировать с интеграцией мобильного элемента мдг-I в район этого локуса.

В последнее время все больше стало появляться работ, в которых уже с помощью прямых молекулярно-биологических методов показано встраивание мобильных генетических элементов в гены дрозофилы. Благодаря этим исследованиямк настоящему времени уже известно, что многие мутации в локусах W, ot, sti, btthorb*, % , sc. , / и т.д. /89,108,138/ вызваны встраиванием мобильных генетических элементов типа мдг, FB и Р-элементов.

Зачар и Бингхам /138/ с помощью рестрикционного анализа провели исследование 19 мутантных аллелей white- локуса D.m&tanoqoibie*' . Оказалось, что из 13 спонтанных мутаций в локусе white 7 вызваны инсерциями фрагментов чужеродной ДЖ. Природа этих инсерций подробно не была изучена. Однако, авторы предполагают, что большинство, если не все инсерции, являются перемещающимися генетическими элементами. Встроенные фрагменты ДНК у 6 мутантов авторы предположительно относят к классу copta подобных элементов. Мутации в локусе whi и . вызванные инсерциями этого типа, оказались относительно стабильными, так как реверсия к нормальному цвету глаз происходила с низкой частотой. Все 6 инсерций, судя по фенотипу, подавляют экспрессию гена white. . Следует отметить, что встраивание copta-подобных элементов происходило во всех случаях в левую, по-видимому, кодирующую область локуса white. Седьмая мутация wDzL (dominant zute. -Like.J подверглась наиболее тщательному изучению. Было установлено, что мутация вызвана встраиванием фрагмента ДНК длиной 13-14 тыс.н.п.

-27в пограничный район локуса wkiti. в правой его части. Этот аллель был обнаружен как спонтанная мутация в линии Oregon (Ld /77/. Мутация частично репрессирует функцию локуса как в цис-, так и в транс-положении. Предполагается, что фрагмент ДНК встроен в регуляторную зону локуса v/hlbt. . Было установлено, что реверсия к дикому типу глаз происходит за счет неточного вырезания инсерции. Оставшийся фрагмент продолжает во многих случаях вызывать с высокой частотой дальнейшие мутации в локусе wkdtz. . Центральный район инсерции вероятно не влияет на нестабильность аллеля white , так как ре-вертанты, в которых этот район полностью делетирован, продолжают оставаться нестабильными.

Мутация w crimson* (малиновый цвет глаз) была первой, генетические свойства которой позволили предположить встраивание перемещающегося элемента /57/. Мутация wCJ~urisc>n' была выделена как частичный фенотипический ревертант WL ( W LVOry , глаза цвета слоновой кости) аллеля /68/. Было показано, что цутация wL возникла в результате дупликации фрагмента ДНК. Мутация Wc обусловлена встраиванием ДНК длиной 10 тыс.н.п. в район дупликации. Мутация [Vе , так же как и W DzL оказалась нестабильной и ревертировала с частотой и с той же частотой вызывала перестройки прилежащих последовательностей /57,27/. Отличие этих двух мутаций в локусе whitz- состоит в том, что в случае \л/с происходит точное вырезание инсерции /33/, а в случае W°2L неточное вырезание /78/. Была выяснена природа инсерционных последовательностей. Оказалось, что обе мутации возникли в результате встраивания FB-последовательностей. В случае W0, про

PZL изошло встраивание одного FB-элемента, а в случае VV двух FB-элементов. Центральный район между двумя FB-последовательностями оказался уникальным, так как в дикой линии О. те-Иал одлбпредставлен одной копией на геном.

По предположению Левиса с соавторами /79/ точная эксцизия уус происходит за счет рекомбинации коротких дупликаций в сайте-мишени, как это было показано ранее для бактериальных транепозонов Ти 10 и Тп 5 , также несущих на концах инвертированные повторы. В этом случае, за счет гомологичного спаривания концевых последовательностей, облегчается рекомбинация между короткими дупликациями. В случае неточное вырезание может происходить за счет рекомбинации между инвертированными повторами из разных ЕВ-элементов.

Итак, в результате рестрикционного анализа спонтанных мутаций в локусе было обнаружено, что примерно половина из них возникла в результате встраивания чужеродных последовательностей ДНК. Встраивание мобильных генетических элементов может происходить в функционально различающиеся районы локуса и^бй, . Инсерции чужеродных последовательностей ДНК в большинстве исследованных случаев привели к подавлению экспрессии гена . Только в случае IVй (малиновые глаза), судя по фенотипу, стимулируется (по сравнению с состоянием И/6 ) транскрипционная активность локуса . Вопросы, связанные с изменением экспрессии генов в результате встраивания мобильных элементов, будут подробнее рассмотрены в разделе "обсуждение".

Получены интересные данные, указывающие на роль клонированных Р-элементов в нестабильности генома. Группа исследователей во главе с Рубиным показала /108/, что этот элемент может вызывать синдром гибридного дисгенеза. Гибридный дис-генез - название, данное синдрому, коррелирующему с генетическими последствиями, которые происходят в потомстве, полученном в результате скрещивания между определенными линиями дрозофилы. Эти последствия включают стерильность, высокую частоту рекомбинации у самцов, высокую мутабильность, хромосомные аб-берации и т.д. /70,71/. У Л УпеЛаподси'Ы*' различают по крайней мере 2 системы взаимодействия линий Т- Я и Р - И /72/. Р-М система гибридного дисгенеза проявляется, когда самцы линии Р скрещиваются с самками линии М, но не при реципрок-ном скрещивании. Энгельс выдвинул предположение о том, что причиной гибридного дисгенеза является семейство перемещающихся элементов - Р-факторов /39,40/. Согласно его гипотезе множественные копии Р-фактора разбросаны по геному Р-линии и отсутствуют в М линии. Перемещение Р-факторов подавляется в Р-цитоти-пе и не запрещается в М цитотипе, где материнская линия определяет природу цитотипа. В том случае, когда хромосомы Р-линии попадают в окружение М цитотипа происходит дерепрессия Р-факторов, в результате чего они приобретают способность к транспозициям в различные районы хромосом и тем самым вызывают мутации и другие аномалии, присущие синдрому гибридного дисгенеза /71,124,125/.

Результаты, полученные Рубины с соавторами /108/, могут служить подтверждением гипотезы, предложенной Энгельсом. На первом этапе своей работы исследователи провели анализ мутаций в локусе » которые возникли в результате дисгенетических скрещиваний между Р и М линиями. С помощью рестрикци-онного анализа было установлено, что все мутации возникли в результате встраивания фрагментов ДНК различной длины. Пять из них вызваны встраиванием членов из одного семейства элементов, которые авторами этой работы были названы Р-элементами. Эти элементы оказались гомологичными между собой по последовательности нуклеотидов, но гетерогенными по размерам, варьируя по длине от 0,5 до 1,4 тыс. н.п. По-видимому, встраивание Р-эле-мента в район локуса является сайт специфичным, так как места расположения Р-элементов у трех независимых мутантов или совпадают (согласно рестриктной карте), или находятся в очень близком соседстве.

Оказалось, что мутации в и/^й. локусе, вызванные встраиванием Р-элемента, являются нестабильными, и с частотой о

4-6x10 могут появляться ревертанты с диким типом глаз. Во всех изученных случаях реверсия к норме сопровождалась эксци-зией Р-элемента из района локуса \MkitjL • В пределах точности рестрикционного анализа авторы показали, что вырезание Р-элемента происходит по его границам. Выяснилось также, что нестабильность мутаций, вызванных внедрением Р-элемента, строго зависит от цитоплазматического окружения. Реверсия к норме происходила у особей с цитотипом М, и те же самые мутации оказались стабильными в окружении Р цитотипа.

Две инеерции в локусе и/А^й^. , возникшие в результате дисгенетических скрещиваний Р и М линий, при гибридизации по Саузерну показали гомологию с элементом сорга. Мутации, вызванные сор/я, были стабильными как в окружении Р, так и М цитотипа. Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе дисгенетических скрещиваний резко возрастает скорость транспозиций Р-элемента, а также индуцируется перемещение и других мобильных элементов генома.

На основании этой работы авторы предположили, что Р-элементы являются теми факторами, которые, согласно гипотезе Энгельса, могут вызывать синдром гибридного дисгенеза. Усиливают это предположение и другие данные, полученные этой же группой исследователей /28/. Во-первых, в соответствии с гипотезой Р-фактора, Р-элементы оказались локализованы примерно в 30 районах в различных Р линиях и отсутствовали в М линиях. Во-вторых, было показано, что Р-элементы с высокой частотой перемещаются в Р-М дисгенетических гибридах. По приблизительной оценке транспозиции Р-элементов происходят с частотой 4 копии за одну генерацию. Кроме того, Х-хромосомы, которые приобрели Р-элементы, способны индуцировать стерильность в М цитотипе /73/. Интересно, что способность индуцировать стерильность зависит от количества приобретенных копий Р элемента. Наконец, оказалось, что хромосомы из Р-линии (но не из М линии) с большой частотой в дисгенетических скрещиваниях подвергаются перестройке, причем точки разрыва являются сайтами локализации Р-элементов. Таким образом, на основании этих работ, был сделан вывод о том, что все аномалии гибридного дисгенеза могут быть объяснены поведением Р-элементов в дисгенетических скрещиваниях.

Способность Р-элементов к самостоятельной транспозиции была блестяще продемонстрирована Рубиным и Спрадлингом /107/. Исследователи вводили с помощью микроинъекции в линию М (она была маркирована рецессивным геном Яп ^ ) в составе плазмиды рВИ 322 фрагмент ДНК, который включал в себя Р-элемент длиной 3 тыс.п.н. Оказалось, что в потомстве от скрещивания такой линии с самцами М линии или с самками со сцепленными XX хромосомами с высокой частотой (до 48$) могут появляться особи с фенотипом 2п и , Дальнейшие эксперименты показали, что эти изменения в мутабильности вызваны встраиванием Р-элемента в.район локуса . Таким образом, впервые для эукариотических организмов, продемонстрирована способность к перемещению ДНК из плазмид в хромосому хозяина /107/.

-32В другой серии экспериментов авторы показали (на примере гена rosy. ) /121/, что Р-элемент может служить в качестве вектора для включения структурных генов в хромосомную ДНК. Следует отметить, что для успешной трансформации оказалось необходимым присутствие интактного Р-элемента длиной 3 тыс.п.н. Эти данные указывают на то, что Р-элементы могут служить переносчиками различных последовательностей ДНК в геноме

D. melonодсиЪе*'.

Результаты, полученные в этих модельных экспериментах, свидетельствуют в пользу того, что Р-элемент длиной 3 тыс.п.н. способен к самостоятельной транспозиции, и, вероятно, кодирует собственную транспозазу, которая обеспечивает перемещение как этого Р-элемента, так и Р-элементов меньших размеров. Возможно, что инвертированные повторы, обнаруженные на концах Р-элемента, являются сайтами связывания транспозазы /84/. Поскольку транспозиции Р-элементов в линии Р не происходит, то 3 тыс. п.н. Р-элемент, по-видимому, кодирует также образование белка-репрессора, функция которого подавлять действие транспозазы в линии Р.

Герасимова с соавторами исследовала целое семейство нестабильных мутаций в локусе c,ut , которые были получены в условиях гибридного дисгенеза /7/. Исходная мутация о характеризовалась высокой частотой реверсий (I0~Q), с выщеп-лением cut мутаций с новым фенотипом, в том числе деталей и сверхнестабильных d мутаций, а также появлением новых мутаций по другим локусам Х-хромосомы. С помощью гибридизации ih situ. было показано, что мутации произошли в результате внедрения в район расположения локуса cu~t мдг-4. Реверсии дикого типа сопровождались эксцизией мдг-4. Таким образом, в этой работе еще раз продемонстрировано, что Р-элементы могут быть факторами, индуцирующими транспозиции других семейств мобильных генетических элементов, например, за счет синтеза ферментов транспозиции. При этом положение мдг при встраивании в районы структурных генов может быть стабильным (это показано для элемента сор ¿а) или нестабильным (как в случае мдг-4).

Возможно, что перемещения мобильных элементов, которые индуцируются в дисгенетических скрещиваниях, являются направленными. В пользу этого свидетельствует, например, тот факт, что встраивание Р-элемента в район локуса white. является сайт специфичным, а также и некоторые другие данные, которые будут рассмотрены в разделе "обсуждение". Возможно, что перемещения мобильных элементов в определенные районы хромосом могут контролироваться с помощью генных факторов, регулирующих их транспозиции. Об этом свидетельствуют, например, опыты, проведенные Мезельсоном с соавторами /89/. Авторы исследовали мутации у дрозофилы, супрессируемые супрессором Sil (И w) и обнаружили, что они возникли в результате инсерции мобильного элемента, который получил название gifxsy. {gLfzsy аналогичен мдг-4, Ильин, личное сообщение). Была выявлена связь gipsif с 19 супрессируемыми аллелями в 10 различных локусах. Наиболее интересным оказался тот факт, что последовательности не встречаются ни в одном из этих локусов, если мутации в них не супрессируются. Поэтому супрессор S и (И можно рассматривать как регулятор транспозиций в районы этих генетических локусов.

К настоящему моменту у дрозофилы вьщелено много нестабильных мутаций, затрагивающих различные локусы. Степень нестабильности локусов может быть различной. Например, в локусе у cito w - уровень реверсий всего в несколько раз превышает уровень спонтанных мутаций /59/, а в случае реверсии к норме обнаруживаются у значительной доли особей. Хотя молекулярная природа упомянутых локусов неизвестна, предполагается, что мутации в них вызваны встраиванием перемещающихся элементов /8/. Возможно, уровень нестабильности возникающих мутаций зависит от типа инсерционного элемента. Например, большинство данных говорит за то /138/, что мутации, возникшие в результате инсерции сор/а подобных элементов, являются стабильными и частота их реверсий приближена к уровню спонтанных мутаций. Реверсии к нормальному фенотипу в результате эксцизии Р~ и

РВ-элементов из районов структурных генов происходят со знао чительно большей частотой (до Ю"ч?). Таким образом, мобильные генетические элементы играют большую роль в нестабильности генетических локусов у , причем вклад каждого семейства перемещающихся последовательностей в определение уровня нестабильности может быть различным.

В ряде случаев показано, что сами нестабильные локусы могут перемещаться в различные места генома, захватывая с собой смежные гены /64,65,102/. Обнаружено совместное перемещение сор/а элемента и нестабильного гена /52/. РВ-элементы вьщелены на концах большого транспозона /46,56/. Таким образом, мобильные генетические элементы могут выполнять функцию переносчиков структурных генов в новые районы хромосом.

Существуют также данные о том, что транспозиции мобильных генетических элементов могут приводить к сайт специфическим делециям и инверсиям у дрозофилы /102,115/. Таким образом, у дрозофилы, также как и у других организмов, мобильные элементы могут резко усиливать мутационные процессы и контролировать работу генов. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этих процессов, предстоит еще выяснить.

Обсуждая роль мобильных элементов в дестабилизации генома и мутагенезе, мы не касались рассмотрения многих других гипотез, предполагающих их роль в эволюции и функционировании хромосом. Высказывалось предположение, что мобильные генетические элементы могут относиться к так называемой "эгоистической" ДНК, у которой нет определенных функций и она существует в хозяйской ДНК как паразит /93/. По мнению других авторов, единственной функцией мобильных генетических элементов является кодирование ферментов, обеспечивающих поддержание этих элементов в геноме и их перемещение /123/. "Эгоистическая" ДНК, согласно этим представлениям, участвует тем не менее в эволюционных преобразованиях генома.

Ананьев считает, что одной из функций мобильных элементов может быть создание структурной гетерозиготноети гомологичных хромосом. Это может вести к поддержанию оптимального уровня рекомбинации, что особенно важно в районах повторяющихся генов /3/.

Дэвидсон и Бриттен высказали гипотезу, согласно которой умеренно повторяющиеся последовательности ДНК, несмотря на эффективную транскрипцию, не кодируют белки. Транскрипты с мобильных генетических элементов могут контролировать образование РНК, взаимодействуя с гетерогенной ядерной РНК и формируя тем самым гибридные РНК-РНК комплексы /34/.

В последнее время высказывается мнение, что Р элемент играет большую роль в изоляции популяций и видообразовании /29/, так как в результате дисгенетических скрещиваний появляется стерильное потомство. Вопрос о возможной биологической роли мобильных элементов у дрозофилы будет также рассмотрен в разделе "обсуждение".

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение цитологических препаратов для гибридизации ио S>itlL

Личинок выращивали до поздней третьей стадии развития или до стадии предкуколки при I6-I8°G на стандартном корме. Слюнные железы извлекали из личинок препаровальными иглами непосредственно в капле 50$ уксусной кислоты, накрывали сили-конизированным стеклом и раздавливали. Стекла замораживали в камере с жидким азотом, покровные стекла удаляли с помощью бритвы. Препараты фиксировали в нескольких сменах 96° спирта, высушивали и хранили до использования. В работе использовали препараты политенных хромосом, которые имели четкую диско-идальную структуру, видимую в фазовоконтрастный микроскоп, и были хорошо расправлены.

Гибридизация иг situ.

Для гибридизации иг sitie клонированных последовательностей ДНК в основном была использована методика Пардью /94,95/.

При гибридизации препараты прогревали при 70°С в течение 30 минут в растворе , промывали в двух сменах 70° и в двух сменах 96° спирта, высушивали. После этого препараты обрабатывали раствором РНК-азы в £ S»St в течение 30 минут при 37°С, снова споласкивали в трех сменах £ J>S£ , в двух сменах 70° и 96° спирта и высушивали. Далее препараты политенных хромосом обрабатывали 0,07Н Аб ОН в течение одной минуты, споласкивали в 70° и 96° спирте и высушивали.

При гибридизации с политенными хромосомами препаратов Д1К меченой тритием или на предметные стекла наносили

1-2 мкл раствора меченой ДНК (100000-300000 имп/мин) в 4 С , накрывали покровными стеклами и помещали во влажную камеру на 12 часов при температуре 65°. Препараты отмывали от метки в четырех сменах при 60°С (по 10 минут в каждой), споласкивали в двух сменах 70° и 96° спирта и высушивали.

Препараты покрывали авторадиографической эмульсией типа М для ядерных исследований. Сроки экспозиции радиоавтографов варьировали в широких пределах: от нескольких дней до месяца, в зависимости от количества наносимой метки и эффективности гибридизации.

Препараты проявляли амидоловым проявителем 2 минуты при 18°С. Окрашивали с помощью красителя азур-эозина, высушивали и анализировали под световым микроскопом.

Статистическая обработка

Случайное распределение мдг-1 и мдг-3 по участкам поли-тенных хромосом строили на основании формулы для вычисления теоретических частот распределения Пуассона:

И*" ~ ТуГТ • я л

У)т - теоретически ожидаемое число участков с т сайтами;

Пт - наблюдаемое в эксперименте число участков с гп сайтами ;

X - среднее число сайтов на участок. Для сравнения теоретически ожидаемого и наблюдаемого распределений сайтов мдг применяли критерий : otz Г (nm~hJZ

S If tn-o rim

При расчетах использовали допущение о том, что техника гибридизации in situ, позволяет выделить в политенных хромосомах 400 участков локализации мдг. Выявляя одинаковые (общие для нескольких линий) сайты локализации мдг, учитывали, что в проведенных опытах локализовать мдг, как правило, можно только с точностью до подсекции.

Сравнение частоты встречаемости сайтов мдг-I и мдг-3 в группе лабораторных линий и в группе линий, полученных из НА, проводилось на основе it критерия с использованием ~f преобразо вания: и^ /•/ (Р/о) - l(R,7.)tVFT

Нулевая гипотеза о случайности наблюдаемого распределения сайтов в группе линий, полученных из НА, отвергалась на 1%-ом. уровне значимости.

Достоверность отличий наблюдаемого распределения числа сайтов мдг-I и мдг-3 между хромосомами от ожидаемого при равномерном распределении оценивали по критерию Стьюдента: и S х где X - среднее количество сайтов, обнаруживаемое в данной хромосоме; J4 - ожидаемое среднее количество сайтов в данной хромосоме при условии равномерного распределения числа сайтов между хромосомами ; S / - квадратичная ошибка X .

Для сравнения расположения мдг и районов интеркалярно-го гетерохроматина вычисляли коэффициент корреляции Юла Га. : w си-cL - & -г где a. - число сайтов гибридизации, совпадающих с районами интеркалярного гетерохроматина; ё - число сайтов локализации, не совпадающих с районами интеркалярного гетерохроматина; С - число районов интеркалярного гетерохроматина, с которым мдг не гибридизуютея ; cL - сайты эухроматической части генома, с которыми мдг не гибридизуютея.

Локализацию мдг-I и мдг-3 определяли в следующих лабораторных линиях

1) C(I)RM, у w/y ас w YS Yb yf; Dp(I;3)wvco/+

2) у ас w, Dp(I;3) wvco/+

3) In(I) wm4, wm4/Df(Y) ЪЪ

4) HA,

6 2

5) sc ec cv ct v g f

6) sc z ec ct^

7) Oregon RC

8) gt wa

9) gt13z

6 2

10) sc ec cv ct v g

11) sc ec cv ptg/C(I)RM, у v f car

12) wm4/YSu Var/C(I), у w ЪЪ

13) Ъг we ее гЪ t4/M1, y31dsc8 wa lzs В

14) T007/Cy

-4015) GB-39

16) OK1

17) ru h th st sr e ca

18) ru h st pp ss es

19) yZ; C(2L)RM, dp; C(2R)RM, px; C(3L)RM, h; C(3R)RM

20) Swedish-b

При постановке генетических скрещиваний использовали

31 d 8 2 2 2'

ЛИНИЮ А С генотипом: ЕМ4» у SC dm В/+; SM1, al Су en sp /

In(2LR)Pm, dp bj Pm; Sb/In(3LR) Ubx130, Ubx130 es

Обозначения генетических маркеров хромосом, использованных в работе см. в каталоге (Liiidsley, Grell, Carnegie Inst. Wash.

Publ., 627, 1968.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Заключение диссертации по теме «Генетика», Беляева, Елена Спартаковна

-126-ВЫВОДЫ

1. Методом гибридизации In situ. проведена локализация мдг-1 и мдг-3 в политенных хромосомах лабораторных линий Ъ. mtlcLtoogcLsttr (мдг-1 - в 20 линиях, мдг-3 - в 15 линиях), Обнаружено, что последовательности мдг-1 и мдг-3 распределяются неслучайно. В геноме 2).ftiztanogaster существуют районы предпочтительной локализации мдг-1 и мдг-3, значительная часть которых (около 50%) совпадает с районами интерка-лярного гетерохроматина.

2. Было обнаружено, что мдг-1 и мдг-3 распределяются неравномерно не только по длине хромосом, но и между хромосомами. Так, при исследовании 20 линий в Х-хромосоме, составляющей около 20% длины политенных хромосом, было зарегистрировано менее 9% от всех обнаруженных сайтов мдг-1. Распределение числа сайтов локализации ццг-3 в расчете на Х-хромосому и плечо аутосомы отличается от распределения мдг-1. Наименьшее количество копий мдг-1 было выявлено в ZL и ЗЬ хромосомах.

3. Проведен анализ локализации мдг-1 и мдг-3 в инбред-ной линии НА с низкой приспособленностью. Установлено, что по местоположению мдг-1 (исследовано более 100 особей) и мдг-3 (исследовано 20 особей) особи из линии НА практически не различаются. В результате длительной селекции из линии НА были получены линии мух с высокой приспособленностью, у которых обнаружены значительные изменения в локализации мдг-1 и мдг-3.

4. При исследовании местоположения сайтов мдг-1 и мдг-3 в потомстве от одной пары особей с известным и характерным для линии НА распределением мдг было установлено, что наблюдаемые изменения локализации мдг, коррелирующие с резким возрастанием приспособленности, являются результатом транспозиций, которые происходили по ходу выполнения эксперимента.

При анализе динамики изменения сайтов локализации мдг в течение нескольких поколений было обнаружено, что транспозиции мдг могут происходить одномоментно (в течение одного-двух поколений). В последующих поколениях существенных качественных изменений в распределении сайтов мдг-1 и мдг-3 не отмечалось.

5. Перемещения мдг-1 и мдг-3 в определенной степени происходят направленно, то есть в независимых опытах в линиях с высокой приспособленностью, полученных из линии НА с низкой приспособленностью, обнаруживается воспроизводимое появление сайтов мдг в одних и тех же районах хромосом.

6. Показано, что с мдг-1 можно манипулировать как с обычными генами и в результате скрещивания получать хромосомы с ожидаемым порядком и числом сайтов. Отклонения от ожидаемого распределения в результате транспозиций мдг были обнаружены только в скрещиваниях с участием линии НА. Изменения в локализации мдг-1 затрагивали только хромосому 2, полученную от линии НА, и выражались в появлении новых сайтов в прицентромер-ных районах. Эти же сайты были отмечены у большинства линий с восстановленной жизнеспособностью, полученных из линии НА.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Беляева, Елена Спартаковна, 1984 год

1. Ананьев Е.В., Ильин Ю.В., Чуриков-H.A. Сообщение 3. Определение сайтов локализации фрагментов Dml18A и Dml18B. Генетика, 16, №8, 1360-1369,-1979.

2. Ананьев Е.В, диссертация, 1983. Молекулярная цитогенетика мобильных генетических элементов Drosophila melanogaster.

3. Газарян К.Г., Тарантул В.З. Геном эукариот. Изд. МГУ, 1983.

4. Гвоздев В.А. О природе и функциях интеркалярного гетерохроматина у D.melanogaster. Молекулярные основы генетических процессов. Изд. Наука, 389-403, 1981.

5. Георгиев Г.П., Ильин Ю.В., Рысков А.П., Крамеров Д.А. Мобильные диспергированные генетические элементы эукариот и их возможное отношение к канцерогенезу. Генетика, 17, №2, 222-232, 1981.

6. Голубовский М.Д., Ерохина И.Д. Мутационный процесс в линиях с супермутабильным аллелей локуса sn D.melanogaster. Генетика, 13, №7, I2I0-I2I9, 1977.

7. Грант В. Эволюция организмов. Изд. Мир, Москва, 1980.

8. Евгеньев М.Б., Ениколопов Г.Н., Пеунова Н.И. Транспозициямобильных диспергированных генетических элементов у дрозофилы. Докл. АН СССР, 264, №6, 1495-1496, 1982.

9. Ильин Ю.В., Чуриков H.A., Солонин A.C., Полукарова Л.Г.,-ч

10. Георгиев Г.П. Селекция и некоторые свойства рекомбинантных клонов фага 2. /содержащих гены D.melanogaster. Мол.биол., П, №3 , 637-645, 1977.

11. Ильин Ю.В., Хмеляускайте В.Г., Ананьев Е.В., Любомирская Н.В., Кульгускин В.В., Баев A.A. мл. Сообщение 6. Структурная организация мобильных диспергированных генов I и 3. Генетика, 17, №2, 199-210, 1981.

12. Ильин Ю.В., Хмеляускайте В.Г., Кульгускин В.В. Множественные рассеянные ПО хромосомам гены Drosophila melanogaster с варьирующей локализацией. Сообщение УП. Транскрипция мобильных диспергированных генов I и 3. Генетика, 17, №2, 2II-22I, 1981.

13. Кайданов Л.З. Анализ генетических последствий отбора и инбридинга у Drosophila melanogaster. Ж.общ.биол., 40, №6,134 834-850, 1979.

14. Кайданов Л.З. Об адаптивном значении скорости мутационного процесса. Исследования по генетике, №9, изд. ЛГУ, 1981.

15. Кирпичникова Е.В., Кайданов Л.З. Концентрация хромосом с летальными и полулетальными мутациями в высокоинбредных селектируемых ЛИНИЯХ "НА" и "ВА" Drosophila melanogaster. Генетика, 9, №2V 163-164, 1973.

16. Колчинский А.М., Вашидзе РЛ1., Евгеньев М.Б., Мирзабеков

17. А.Д. Клонирование и изучение вставочных последовательностей в гене 28S рибосомной РНК D.melanogaster. Мол.биол., 16, №3, 302-314, 1982.

18. Кульгускин В.В., Ильин Ю.В., Георгиев Г.П. Множественные рассеянные по хромосомам гены Drosophila melanogaster с варьирующей локализацией. Сообщение УШ. Первичная структура длинных концевых повторов в едг-I. Генетика, 8, №6, 869-879, 1982.

19. Рокицкий П.Р., Савченко В.К., Добина А.И. Генетическая структура популяций и ее изменения при отборе. Наука и техника, Минск, 1977.

20. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. Изд. Наука, М., 1983.

21. Хугуто Н., Глотов Н.В., Кайданов Л.З. Отбор на увеличение **исла брюшных щетинок в высокоинбредных линиях НА и ВА Drosophila melanogaster. Генетика, 16, №7, 1228-1233, 1980.

22. Ananiev E.V., Gvozdev V.A., Ilyin Y.V., Tchurikov N.A#f Georgiev G.P. Reiterated genes with varying locations in intercalary heterochromatin regions of Drosophila melanogaster polytene chromosomes. Chromosoma, 70, N1,1-12, 1978

23. Ananiev E.V., Ilyin Yu.V. A comparative study of the location of mobile dispersed genes in salivary gland and nidgut polytene chromosomes of Drosophila melanogaster. Chronoso-ma, 82, N3, 429-435, 1981.

24. Bayev A.A., Krayev A.S., Lubomirskaya N.V., Ilyin Y.V,,

25. Skryabin K.G., Georgiev G.P. The transposable element mdg-3in Drosophila melanogaster is flanked with the perfect direct and mismatched inverted repeats. Nucl.Acids Res., 8, N14, 3263-3272, 1980.

26. Bingham P.M., Levis R., Rubin G.M. Cloning of DNA sequences from the white locus of D.melanogaster by a novel and general method. Cell, 2^, N3, 693-704, 1981,

27. Bingham P.M., Kidwell M.G., Rubin G.M. The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis,: the role of the P element, a P-strain-specific transposon family. Cell, 29, N5, 995-1004, 1982.

28. Bregliano J.C., Kidwell M.G. Hybrid dysgenesis determinants in mobile genetic elements. Shapiro J.A., ed., Acad.Press, New York, 363-410, 1983.

29. Calos M.P., Miller J.M. Transposable elements. Cell, 20.N3, 579-595, 1980.

30. Cameron J.R., Loh E.V., Davis R.W. Evidence for transposition of dispersed repetitive DNA families in yeast. Cell, N4, 739-752, 1979.

31. Carlson M., Brutlag D.L. A gene adjacent to satellite DNA in Drosophila melanogaster. Cell, N4, 733-742, 1978.

32. Collins M., Rubin G.M. High-frequency precise excision of the Drosophila fold-back transposable element. Nature, 303. N5914, 259-260, 1982.

33. Davidson E.H., Britten R.J. Regulation of gene expression: possible role of repetitive sequences. Science, 204. N4397» 1052-1059, 1979.

34. Dawid I.B., Wellauer P.K., Long E.O. Ribosomal DNA in Drosophila melanogaster. I. Isolation and characterization of cloned fragments. J.Mol.Biol., 126. N4, 749-768, 1978.

35. Dawid I.B., Long E.O., Di Nocera P.P., Pardue M.L. Riboso-143mal insertion-like elements in Drosophila melanogaster are interspersed with mobile sequences. Cell, N2,399-408,1981.

36. Dowsett A.P., Yotuag M.W. Differing levels of dispersed repetitive DNA among closely related species of Drosophila. Proo.Natl.Acad.Sci., N15, 4570-4574, 1982.

37. Dunsmuir P., Brorein Y/.J., Simon M.A., Rubin G.M. Insertion of the Drosophila transposable element copia generates a 5 base pair duplication. Cell, 21., N2, 575-579, .1980.

38. Engels W.R. Extra chromosomal control of mutability in Drosophila melanogaster. Proc.Natl.Acad.Sci., 76,4011-4015.1979.

39. Engels W.R. Hybrid dysgenesis in Drosophila and the stochastic loss hypothesis. Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol., 561-565, 1981.

40. Evgeniev M.B., Yenikolopov G.N., Peunova N.I., Ilyin Y.V. Transposition of mobile genetic elements in interspecific hybrids of Drosophila. Chromosoma, 8£,N3, 375-386, 1982.

41. Falkenthal S., Lengyel J.A. Structure, translation and metabolism of cytoplasmatic copia ribonucleic acid of D.melanogaster. Biochemistry, .19, N25, 5820-5842, 1980.

42. Palkenthal S., Graham M.L., Korn E.L., Lengyel J.A. Transcription, processing, and turnover of RNA from the Drosophila mobile genetic element copia. Develop.Biol,, U2, 294-305, 1982.

43. Parabaugh P.J., Pink G.R. Insertion of the eukaryotic transposable element Ty1 creates a 5 base pair duplication. Nature, 286, N5770, 352-356, 1980.

44. Pinnegan D.J,, Rubin G.M., Young M.W., Hogness D.S. Repeated gene families in Drosophila. Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol., 42, 1053-1063, 1978.

45. Pinnegan D.J. The fold-back elements of Drosophila. Nature,-144297, N5863, 181-182, 1982.

46. Finnegan D.J. Retroviruses and transposable elements -which came first? Nature, J302, N5904, 105-106, 1983.

47. Flavell A.J., Ruby S.W., Toole J.J., Roberts B.E., Rubin G.M. Translation and developmental regulation of RNA encoded by the eukaryotic transposable element copia. Proc. Natl.Acad.Sci., 21» N12, 7107-7111, 1980.

48. Plavell A.J., Ish-Horowicz D. Extrachromosomal circular copies of the eukaryotic transposable element copia in culture Drosophila cells. Nature, 292,N5824, 591-596, 1981.

49. Plavell A.J., Ish-Horowicz D. The origin of extrachromosomal circular copia elements. Cell, 34, N3, 415-419, 1983.

50. Pouts D.L., Manning J.E., Pox G.M., Schmid C.W. A complex repeated DNA sequence within the Drosophila transposable element copia. Nucl.Acids Res., N24, 7053-7064, 1981.

51. Gehring W., Paro R. Isolation of hybrid plasmid with homologous sequences to a transposing element of Drosophila melanogaster. Cell, 19, N4, 897-904, 1980.

52. Georgiev G.P., Ilyin Yu.V., Ryskov A.P., Tchuricov N.A., Yenikolopov G.N., Gvozdev V.A., Ananiev E.V. Isolation of eukaryotic DNA fragments containing structural genes and the adjacent sequences. Science, 195, N4276, 394-397, 1977.

53. Glover D.M., Hogness D.S. A novel arrangement of the 18S and 28S sequences in a repeating unit of Drosophila mela-145nogas.ter rDNA. Cell, .10, N11,167-176, 1977.

54. Goldberg M.L., Paro R., Gehring 7/. J. Molecular cloning of the white locus region of Drosophila melanogaster using a large transposable element. The EMBO J., 1, N1, 93-98,' 1982.

55. Green M.M. The genetics of a mutable gene at the white locus of Drosophila melanogaster. Genetics, ¿6, N3,467-482,1967.

56. Green M.M. Controlling element mediated transposition of the white gene in Drosophila melanogaster. Genetics, 6l, N3, 429-441, 1969. \

57. Green M.M. Genetic instability in Drosophila melanogaster presumptive insertion mutations of the yellow locus. Mut. Res., N2, 291-293, 1979.

58. Green M.M. Transposable elements in Drosophila and other diptera. Ann.Rev.Genet.N1, 109-120, 1980.

59. Hannah H. Localization and function of heterochromatin' in D.melanogaster. Adv.Genet., 4, N1,"87-125, 1951.

60. Ilyin Y.V., Chmeliauskaite V.G., Ananiev E.V., Georgiev G.P. Isolation and characterization of new family of mobile dispersed genetic elements mdg-3, in Drosophila melanogaster. Chromosoma, 81^, N1, 27-53, 1980.

61. Jolly D.J., Thomas C.A. Nuclear RNA transcripts from Drosophila melanogaster ribosomal RNA genea containing in-trons. Nucl.Acids Res., 8, N1, 67-84, 1980.

62. Jungen H., Hartl D.L. Average fitness of populations of Drosophila melanogaster as estimated using compound autosome strains. Evolution, N2»' 359-370, 1979.

63. Karess R., Rubin G.M. A small tandem duplication is resivoryponsible for the unstable white mutation in Drosophila. Cell, N1, 63-69, 1982.

64. Kidd S.J., Glover D.M. A DNA segment from D.melanogaster which contains five tandemly repeating units homologous to the major rDNA insertion. Cell, 1J9, N1, ~103-r119, 1980.

65. Kidwell M.G., Kidwell J.P. Selection for male recombination in Drosophila melanogaster. Genetics, 84,N2, 333-341,1976.

66. Kidwell M.G., Kidwell J.F., Sved J.A. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. A syndrome of aberrant trai/ts including mutation, sterility and male recombination. Genetics, 86, N5, 813-833, 1977.

67. Kidwell M.G. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. The relationship between the P-M and I-R interaction systems. Genet.Res., ¿2* N2,' 205-2f7, 1979.

68. Kidwell M.G. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster: factors affecting chromosomal contamination in the P-M system. Genetics, 104. N2. 317-341, 1983.

69. Kulguskin V.V., Ilyin Y.V., Georgiev G.P. Mobile dispersed genetic element mdg-1 of Drosophila melanogaster: nucleotide sequence of long terminal repeat. Nucl.Acids Res., 9.,-1471. N44, 3451-3460, 1981.

70. Laird C.D. DNA of Drosophila chromosomes. Ann.Rev.Genet., 7, N1,.177-204, 1973.

71. Levis R., Dunsmuir P., Rubin G.M. Insertion of the Drosophila transposable element copia generates a 5 base pair duplication. Cell, 21., N2, 581-588, 1980.

72. Levis R., Bingham B., Rubin G.M. Physical map of the white locus of Drosophila melanogaster. Proc.Natl.Acad.Sei., 79. N2, 564-568, 1982.1. D7T

73. Levis R., Rubin G.M. The unstable w mutation of Droso-• phila is caused by a 13 kilobase insertion that is imprecisely excised in phenotypic revertants. Cell, j30, N2, . 543-550,1982.

74. Levis R., Collins M., Rubin G.M. FB elements are the common basis for the instability of the w02*1 and wc Drosophila mutations. Cell, 30, K"2, 551-565, 1982.

75. Long E.O., Dawid I.B. Expression of ribosomal DNA insertions in Drosophila melanogaster. Cell, 18, N5, 1185-1196, 1979.

76. Long E.O., Refobert M.L., Dawid I.B. Structure and expression of ribosomal RNA genes of Drosophila melanogaster interrupted by type-2 insertions. Cold Spring Harbor Symp. QuantjBiol., 4j>, 667-672, 1981.

77. Low K.B. Escherichia coli K-12 F-prime factors, old and new. Bacteriol.Rev., ¿6, N3, 587-607, 1972.

78. Manning J.E., Schmid C.W., Davidson N. Interspersion of repetitive and nonrepetitive DNA sequences in the D.melanogaster genome. Cell, 4,N1, 141-155, 1975.

79. Marx J.L. Gene transfer into the Drosophila germ line. Science, 218. N4570, 364-365, 1982.

80. Mather K. The genetical activity of heterochromatin. Proc.

81. Royal Soc., ser.B, 132, 308-332, 1944.

82. McClintock B. Chromosome •organization and gene expression. Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol., JhS, 13-47, 1951.

83. McClintock B. Controlling elements and the gene. Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol., 21, 197-216, 1957.

84. McGinnis W., Shermoen A.W., Beckendorf S.K. A transposable element inserted just 5f to a Drosophila glue protein gene alters gene expression and chromatin structure. Cell, 34. N1, 75-84, 1983.

85. Modolell J., Bender W., Meselson M. Drosophila melanogaster mutations suppressible by the suppressor of hairy-wing are insertions of a 7.7 kilobase-mobile element. Proc. Natl.Acad.Sci., 80, N6, 1678-1682, 1983.

86. Montgomery E.A., Langley C.H. Transposable element in men-delian populations. II.Distribution of three copia-like. elements in a natural population of Drosophila melanogaster. Genetics, J0£, N3, 473-483, 1983.

87. Mukai T., Cockerham C.C. Spontaneous mutation rates at enzyme loci in D.melanogaster. Proc.Natl.Acad.Sci., 74» N6f 2514-2517, 1977.

88. O'Hare K., Rubin G.M. Structures of P transposable elements and their sites of insertion and excision in the Drosophila melanogaster genome. Cell, N2, 25-35, 1983.

89. Orgel L.E., Crick P.H.C. Selfish DNA: the ultimate parasite. Nature, 284, N5723, 604-607, 1980.

90. Pardue M.L., Garbi S.A., Eckhardt R.A., Gall J.G. Cytolo-gical localization of DNA complementary to ribosomal RNA in polytene chromosomes of Diptera. Chromosoma, 29,, N2,268.290, 1970.

91. Pardue M.L., Kedes L.H., Weinberg E.S., Birnsteil M.L.1.calization of sequence coding for histone messenger UNA in the chromosomes of D.melanogaster. Chromosoma, 63., N1, 135-151, 1977.

92. Peacock W.J., Appels R., Endow S., Golver D.M. Chromosomal distribution of the major insert in D.melanogaster 28S ri-bosomal RNA genes. Genet.Res., J37, N2, 209-214, 1981.

93. Pierce D., Lucchesi J.C. Analysis of a dispersed repetitive DMA sequence in isogenic lines of Drosophila. Chromosoma, 82, N4, 471-492, 1981.

94. Potter S., Brorein W., Dunsmuir P., Rubin G. Transposition of elements of the 412, copia and 297 dispersed repeated gene families in Drosophila. Cell, 12, N2, 415-427, 1979.

95. Potter S., Truett M., Phillip M., Maher A. Eukaryotic transposable genetic elements with inverted terminal repeats. Cell, 20, N3, 639-647, 1980.

96. Potter S.S. DNA sequence of a foldback transposable element in Drosophila. Nature, 297. N5863, 201-204, 1982.

97. Rae P.M., Kohorn B.D., Wade R.P. The 10 kb Drosophila vi-rilis 2SS DNA intervening sequence :'/is flanked by a direct repeat of 14 base pairs of coding sequence. Nucl.Acids Res., 8, N15, 3491-3504, 1980.

98. Rasmuson B., Westerberg B.H., Rasmuson A., Gvozdev V.A., Belyaeva E.Sp., Ilyin Y.V. Transpositions, mutable genes, and the dispersed gene family Dm225 in Drosophila melanogaster. Cold Spring Harbor Quant.Biol., 545-551, 1981.

99. Roiha H., Glover D.M. Characterization of complete type II insertions in cloned segments of ribosomal DNA from Drosophila melanogaster. J.Mol.Biol., 140« H2, 341-355, 1980.

100. Roiha H., Miller J.R., Woods L.C., Glover D.M. Arrangements and rearrangements of the sequences flanking the two typesof rDNA insertions in D.melanogaster. Nature, 290, N5809, 749-753, 1981.

101. Rubin G.M., Finnegan D.J., Hogness D.S. The chromosomal arrangement of coding sequences in a family of repeated genes. Progress of nucleic acid research and molecular biology, 79, 221-226, 1976,

102. Rubin G.M., Kidwell M.G., Bingham P.M. The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the nature of induced mutations. Cell, 22, N3, 987-994, 1982.

103. Rubin G.M. Dispersed repetitive DNAs in Drosophila. Mobile Genetic Elements. (J.A.Shapiro, ed.), Acad.Press, 1983.

104. Rubin G.M., Spradling A.C. Vectors for P element-mediated gene transfer in Drosophila. Nucl.Acids Res., JJ, N18, 6341-6351, 1983.

105. Saigo K., Millstein L., Thomas C.A. The organization of Drosophila melanogaster histone genes. Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol., £5, 815-827, 1981.

106. Scherer G., Tshudi C., Perra J., Delius H., Perrota V. B104, a new dispersed repeated gene family in Drosophila melanogaster and its analogies with retroviruses. J.Mol. Biol., 157. N3, 435-451, 1982.

107. Simmons M.J., Johnson N.A., Fahey T.M., Nellet S.H., Raymond J.D. High mutability in male hybrids of Drosophila melanogaster. Genetics, 96, N2, 479-490, 1980.

108. Simmons M.J., Lim J.K. Site specificity of mutations arising in dysgenic hybrids of Drosophila melanogaster. Proc.Natl.Acad.Sci.,-71, N10, 6042-6046, 1980.

109. Slatko B., Hiraizumi Y. Genetic elements causing male crossing over in Drosophila melanogaster. Genetics, 81. N2, 313-324, 1975.

110. Snyder M.P., Kimbrell D., Hunkapiller M., Hill R., Fristrom J., Davidson N. A transposable element that splits the promoter region inactivates a Drosophila cuticle protein gene. Proc.Natl.Acad.Sci., 79.N23»7430-7434. 1982.

111. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragment separated by gel electrophoresis. J.Mol.Biol., 98, N3, 503-509, 1975.

112. Spradling A.C., Rubin G.M. Drosophila genome organization: conserved and dynamic aspects, review. Ann.Rev.Genet., 15, N2, 219-264, 1981.

113. Spradling A.C., Rubin G.M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science, 218. N4570, 341-347, 1982.

114. Spradling A.G., Rubin G.M. The effect of chromosomal position on the expression of the Drosophila xanthine dehydrogenase gene. Cell, J34, N1, 47-57, 1983.

115. Strobel E., Dunsmuir P., Rubin G.M. Polymorphism in thechromosomal locations of elements 412, copia and 297 dispersed repeated gene families in Drosophila. Cell, 17, N2, 429-439, 1979.

116. Sved J.A. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster: a possible explanation in terms of spatial organization of chromosomes. J.Biol.Sci., 29, N2, 375-388, 1976.

117. Sved J.A. The "hybrid dysgenesis" syndrome in Drosophila melanogaster. Bioscience, N3, 659-664, 1979.

118. Tartof K.D., Dawid I.B. Similarities and differences in the structure of X and Y chromosome rRNA genes in Drosophila. Nature, 26^, N5620, 27-30, 1976.

119. Tchurikov N., Zelentsova E.S., Georgiev G.P. Cluster containing different mobile dispersed genes in the genomeof Drosophila melanogaster. Nucl.Acids Res., 8, N6, 1243-1258, 1980.

120. Truett M.A., Jones R.S., Potter S.S. Unusual structure of the PB family of transposable elements in Drosophila. Cell, 24, N3, 753-763, 1981.

121. Wellauer P.K., Dawid I.B., Tartof K.D. X and Y chromosomal ribosomal DNA of Drosophila: comparison of spacers and insertions. Cell, 14, N2, 269-278, 1978.

122. White R.L., Hogness D.S. R-loop mapping of the 18S and 28S sequences in the long and short repeating units of Drosophila melanogaster rDNA. Cell, 10, N1, 177-192,1977.

123. Will B.M., Bayeb A.A., Pinnegan D.J. Nucleotide sequence of terminal repeats of 412 transposable elements of D.melanogaster. J.Mol.Biol., IjLb N4, 897-916, 1981.,

124. Wright S. Evolution and the genetics of populations. v.3. Experimental results and evolutionary deductions. (The Univ. of Chicago Press, Chicago a.London), 374, 1977.

125. Young M.W. Middle repetitive DNA: a fluid component of the Drosophila genome. Proc.Natl.Acad.Sci., 76, N12, 6274-6278, 1979.

126. Young M.W., Schwartz H.E. Nomadic gene families in Drosophila. Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol., 629640, 1981.

127. Zachar Z., Bingham P.M. Regulation of white locus expression: the structure of mutant alleles at the white locus of D.melanogaster. Cell, £0, N2, 529-541, 1982.

128. Zhimulev I.P., Semeshin V., Kulichkov V.A., Belyaeva E.S. Intercalary heterochromatin in Drosophila. I.Localization and general characteristics. Chromosoma, 87, N1, 197-205, 1982.