Моделирование индивидуальных антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея, анализ их антигенной и иммуногенной активности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Речкина, Елена Александровна

• Речкина, Елена Александровна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Речкина, Елена Александровна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

1 Обзор литературы.

1.1 Молекулярная организация вируса гепатита С.

1.2 Строение и функции вирусных белков.

1.3 Особенности ВГС-инфекции.

1.4 Антигенная структура белков ВГС и методы картирования.

2 Материалы и методы.

2.1 Иммуногистохимическая детекция белков.

2.1.1 Пациенты.

2.1.2 Исход ОГС.

2.1.3 Морфологический анализ.

2.1.4 Выделение МКА из асцитных жидкостей.

2.1.5 Моноклональные антитела.

2.1.6 Определение концентрации белка.

2.1.7 Иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание.

2.2 Картирование антигенных детерминант белков ВГС.

2.2.1 Фаговая библиотека.

2.2.2 Аффинный отбор.

2.2.3 Трансдукция клеток E.coli фагами.

2.2.4 Иммуноскрининг.

2.2.5 Выделение одноцепочечной фаговой ДНК и секвенирование.

2.2.6 Анализ результатов секвенирования.

2.3 Изучение иммуногенности отдельных детерминант.

2.3.1 Иммунизация мышей.

2.3.2 Определение активности антител в сыворотках мышей.

2.3.3 Реакция бласттрансформации спленоцитов.

2.4 Изучение антигенных свойсв отдельных антигенных детерминант.

2.4.1 Реакция иммуно-ДОТа с сыворотками больных ГС.

2.4.2 Приготовление лизата E.coli.

2.4.3 Истощение сывороток больных.

2.4.4 Иммуноферментный анализ. Непрямой ИФА.

2.4.5 Сендвич-ИФА №1.

2.4.6 Сендвич-ИФА №2.

2.4.7 Статистическая обработка результатов.

3 Результаты.

3.1 Выявление натуральных антигенных детерминант в печени больных ОГС

3.2 Картирование антигенных детерминант.

3.3 Изучение иммуногенных свойств отдельных детерминант.

3.4 Изучение антигенных свойств отдельных детерминант.

4 Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моделирование индивидуальных антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея, анализ их антигенной и иммуногенной активности»

Актуальность проблемы

Значительный рост показателей заболеваемости острым гепатитом С, частое поражение лиц молодого возраста, высокий уровень хронизации с возможным исходом в цирроз и первичный рак печени определяют повышенное внимание к этому заболеванию.

Изучение молекулярных механизмов взаимодействий вируса с клеткой-хозяином, в частности изучение нативных вирусных белков, представляет сложную задачу в связи с низким уровнем накопления вируса в организме хозяина и отсутствием клеточной системы для его культивирования. В то же время выяснение структуры и свойств индивидуальных белков необходимо как для решения теоретических проблем (локализация антигенных и иммуногенных детерминант, определение протективных эпитопов), так и для решения задач практической медицины - создания профилактических средств, терапевтических препаратов и диагностических тест-систем.

Серодиагностика, основанная на определении специфических антител к различным вирусным белкам, сегодня является одним из основных методов диагностики ВГС-инфекции. Однако в некоторых случаях антитела к вирусу могут отсутствовать, например, в период «окна», при запаздывании иммунного ответа и при применении иммуносупрессивной терапии. Высокий уровень генетической вариабельности ВГС может обусловливать ложноотрицательные результаты. Возможно также получение ложноположительных результатов за счет перекрестно-реагирующих детерминант. Часто отмечаются несовпадения в результатах тестирования контрольных панелей сывороток с помощью различных тест-систем. В основе перечисленных недостатков - использование в тест-системах рекомбинантных белков и пептидов, которые по строению не всегда точно соответствуют нативным вирусным белкам, а также неполное знание антигенной структуры возбудителя и особенностей его взаимодействия с иммунной системой хозяина.

Цели и задачи исследования

Цели данной работы:

- изучение экспрессии белков ВГС в клетках печени больных острым гепатитом С;

- картирование антигенных детерминант белков ВГС методом фагового дисплея и изучение их иммуногенных и антигенных свойств.

Для достижения целей нами были поставлены следующие задачи:

1. С помощью моноклональных антител (МКА) исследовать выявляемость отдельных антигенных детерминант (АД) нативных вирусных белков в клетках печени больных острым гепатитом С (ОГС).

2. Получить фаговые клоны, имитирующие антигенные детерминанты вирусных белков, и картировать эти антигенные детерминанты.

3. Оценить иммуногенные свойства антигенных детерминант белков ВГС, экспонированных на фаговых частицах.

4. Разработать метод детекции антител к отдельным детерминантам в сыворотках больных гепатитом С, используя в качестве антигенов полученные фаговые клоны.

5. С помощью данного метода изучить спектр антител у больных гепатитом С на разных стадиях заболевания.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Впервые показано, что отдельные антигенные детерминанты белков ВГС выявляются в клетках печени больных ОГС с различной частотой. Наиболее часто выявляются четыре антигенных детеминанты на белках NS4 и NS5, что может быть связано с пространственной доступностью этих детерминант.

2. Установлена структурная организация 6 антигенных детерминант, не описанных ранее, в составе белков core, NS3, NS4B и NS5A ВГС.

3. Показано, что антигенные детерминанты белков ВГС, экспонированные на поверхности фаговых частиц, индуцируют у мышей развитие вирусспецифического гуморального ответа.

4. Разработан лабораторный метод выявления антител у больных ГС к индивидуальным антигенным детерминантам белков ВГС, экспонированным на фаговых частицах.

5. Показано, что на ранних сроках после манифестации инфекции (до 1 месяца) спектр антител к индивидуальным антигенным детерминантам достоверно шире у пациентов с последующей реконвалесценцией, чем у больных с дальнейшей хронизацией инфекции. Данный критерий может иметь прогностическое значение при оценке исхода острого гепатита С.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Установлено, что частота выявления отдельных антигенных детерминант белков ВГС в клетках печени больных ОГС различается. В целом индивидуальные белки core, NS3, NS4 и NS5 выявляются в клетках печени 100% пациентов с острым гепатитом С.

2. Получены фаговые клоны, имитирующие антигенные детерминанты белков ВГС. Определены ключевые аминокислотные остатки 11 антигенных детерминант на белках core, NS3, NS4 и NS5, участвующие в связывании с антителами, установлена конформация 6 детерминант.

3. Показана иммуногенная активность антигенных детерминант белков ВГС в составе фаговых частиц.

4. Разработана схема детекции антител к отдельным антигенным детерминантам белков ВГС в сыворотках крови больных гепатитом С с использованием фагов, несущих пептиды, имитирующие эти детерминанты (т.н. фаговые мимотопы).

5. Установлено, что у больных ОГС частота выявления антител к отдельным антигенным детерминантам достоверно выше по сравнению с ХГС, что может иметь диагностическое значение при разграничении стадий инфицирования.

1 Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Речкина, Елена Александровна

Выводы

1. Показано, что антигенные детерминанты на пяти белках ВГС выявляются в клетках печени больных острым гепатитом С in situ с помощью моноклональных антител с различной эффективностью: от 32% до 95%.

2. Суммарно белки ВГС с помощью моноклональных антител в клетках биоптатов печени выявлены у 100% пациентов с острым гепатитом С, что достоверно выше, чем у больных с хроническим гепатитом С.

3. Установлена прямая зависимость между накоплением белков core, NS3 и NS5A в печени и некрозом ткани печени. Показано, что предполагаемая реконвалесценция ассоциирована с увеличением количества клеток печени, содержащих белки NS4A и NS3, в ранние сроки после манифестации острого гепатита С.

4. При помощи технологии фагового дисплея получены фаговые клоны с пептидными вставками, имитирующими 11 антигенных детерминант белков core, NS3, NS4B и NS5A ВГС. При картировании установлено, что 3 антигенные детерминанты являются линейными, остальные содержат элементы вторичной и третичной структуры белков.

5. Показано, что аминокислотные последовательности, представляющие антигенные детерминанты белков ВГС в составе фагов (мимотопы), способны индуцировать у мышей выработку антител, специфичных к вирусным белкам.

6. Разработан метод выявления антител к индивидуальным антигенным детерминантам белков ВГС, экспонированным на фаговых частицах, в сыворотках больных гепатитом С. Установлено, что частота выявления антител к отдельным антигенным детерминантам различается и достоверно выше у больных ОГС по сравнению с ХГС, что может иметь диагностическое значение при разграничении ОГС и ХГС.

7. Показано, что спектр антител к индивидуальным антигенным детерминантам в срок до месяца после манифестации инфекции достоверно шире у пациентов с последующей реконвалесценцией, чем у больных с дальнейшей хронизацией инфекции, что может иметь прогностическое значение при оценке исхода острого гепатита С.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Речкина, Елена Александровна, 2005 год

1. Абдулмеджидова А.Г., Масалова О.В., Атанадзе С.Н. и др. Характеристика панели моноклональных антител к рекомбинантному белку NS3 вируса гепатита С. // Вопросы вирусологии. 2002. - Т. 47, №1. -С. 21-25.

2. Иванисенко В.А., Ерошкин A.M. Поиск сайтов, содержащих функционально значимые замены в наборах родственных или мутантных белков. // Молекулярная биология. 1997.- Т. 31, №5. - С. 880 - 887.

3. Круглов И.В., Знойко О.О., Огиенко O.JI. и др. Спектр антител к различным антигенам HCV при разных вариантах течения хронической HCV-инфекции. // Вопросы вирусологии. 2002. - Т47, №2. - С. 11 - 16.

4. Круглов И.В., Огиенко O.JL, Знойко О.О. и др. Исследование сероконверсии к различным антигенам вируса гепатита С у больных гепатитом С с различными исходами. // Вопросы вирусологии. — 2003. — Т.48, №2. С. 36 - 40.

5. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Атанадзе С.Н. и др. Характеристика панели моноклональных антител и эпитопное картирование белков вируса гепатита С. // Доклады Академии Наук. -2002. Т. 383, №4. - С. 545-550.

6. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Шкурко Т.В. и др. Анализ белков вируса гепатита С в клетках печени больных хроническим гепатитом С. // Вопросы вирусологии. 2003. - Т.48, №1. - С. 9 - 14.

7. Масалова О.В., Кущ А.А. Моноклональные антитела к белкам вируса гепатита С инструмент для картирования антигенных детерминант,диагностики гепатита С и изучения вирусного патогенеза. // Российский Биотерапевтический журнал. 2003. - №3. - С. 7-23.

8. Пименов В.К. Синтетические пептиды в изучении антителопродукции к белкам вирусов гепатита С и D. // Автореф. канд биол наук. Н.Новгород. 2000.-С. 21.

9. Agnello V., Abel G., Elfahal M. et.al. Hepatitis С virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - V. 96. - P. 12766 - 12771.

10. Andre P., Perlemuter G., Budkowska A. et.al. Hepatitis С virus particles. and lipoprotein metabolism. // Seminars in liver disease. 2005. - V. 25. - N. 1. -P. 93-104.

11. Ballardini G., De Raffele E., Groff P. et al. Timing of reinfection and mechanisms of hepatocellular damage in transplanted hepatitis С virus-reinfected liver. // Liver Transpl. 2002. - V.8. - P. 10-20.

12. Barrera JM, Francis B, Ercilla G et al. Improved detection of anti-HCV in posttransfusion hepatitis by a thirdgeneration ELISA. // Vox Sang. 1995. -V. 68. -P. 15-18.

13. Bartenschlager R., Lohmann V. Replication of hepatitis С virus. // J. Gen. Virol.-2000.-Vol. 81.-P. 1631 1648.

14. Bassett S.E., Thomas D.L., Brasky K.M., Lanford R.E. Viral persistence, antibody to El and E2, and hypervariable region 1 sequence stability in hepatitis С virus-inoculated chimpanzees. // J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 1118 -1126.

15. Bedossa P., Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. // Hepatology. 1996. - V.24. - P.289-293.

16. Bhattacherjee Y., Prescott L.F., Pike I. et.al. Use of NS4 peptides to identify type-specific antibody to hepatitis С virus genotypes 1, 2, 3, 4, 5 and 6. // Journal of General Virology. 1995. -V. 76. - P. 1737-1748.

17. Bocharov G., Ludewig В., Bertoletti A. et al. Underwhelming the immune response: effect of slow virus growth on CD8+ -T-lymphocyte responses. // J. Virol. 2004. V. 78. - P. 2247-2254.

18. Booth J.C., Foster G.R., Levine T. et al. The relationship to genotype in chronic HCV infection.//Liver.-1997.-V. 17. -№3. -P. 144-151.

19. Bowen D.G., Walker C.M. Adaptive immune responses in acute and chronic hepatitis С virus infection. //Nature. 2005. - V. 436. - P. 946-952.

20. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. At least 12 genotypes of hepatitis С virus predicted by sequence analysis of the putative El gene of isolates collected worldwide. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. -V. 90. - P. 8234-8238.

21. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. Sequence analysis of the core gene of 14 hepatitis С virus genotypes. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. - V. 91. - P. 82398243.

22. Buolant S., Becchi M., Penin F., Lavergne J.P. Unusual multiple recoding events leading to alternative forms of hepatitis С virus core protein from genotype lb. //J. Biol. Chem. -2003. V. 278. - P. 45785-45792.

23. Cerino A., Boender P., La Monica N. et.al. A human monoclonal antibody specific for the N terminus of the hepatitis С virus nucleocapsid protein. // J Immunol. 1993. -V. 151, №12. - P. 7005-7015.

24. Cerny A., Chisari. F.V. Immunological aspects of HCV infection. // Intervirology. 1994. - V. 37. - P. 119-125.

25. Chan S.W., Bye J.M., Jackson P., Allain J.P. Human recombinant antibodies specific for hepatitis С virus core and envelope E2 peptides from an immune phage display library. // J Gen Virol. 1996. -V. 77. - P. 2531 - 2539.

26. Chang J.C., Seidel C., Ofenloch B. et.al. Antigenic heterogeneity of the hepatitis С virus NS4 protein as modeled with synthetic peptides. // Virology.1999.-V. 257, N1.-P. 177-190.

27. Chang K.M. Immunopathogenesis of hepatitis С virus infection. // Clin. Liver Dis. 2003. - V.7. - P.89-105.

28. Chang SC, Yen J, Kang H. et.al. Nuclear localization signals in the core protein of hepatitis С virus. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994.- V. 205. - P. 1284-1290.

29. Chen M., Sallberg M., Sonnerborg A. et.al. Limited humoral immunity in hepatitis с virus infection. // Gastroenterology. 1999. - V. 116. - P. 135-143.

30. Chen M., Sallberg M., Sonnerborg A. et.al. Human and murine antibody recognition is focused on the ATPase/Helicase, but not the protease domain of the hepatitis С virus nonstructural 3 protein. // Hepatology. 1998. - V. 28, N1. -P. 219-224.

31. Ching W.M., Wychowski C., Beach M.J. et.al. Interaction of immune sera with synthetic peptides corresponding to the structural protein region of hepatitis С virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. - V. 89, N8. - P. 3190-3194.

32. Cho H.S., Ha N.S., Kang L.W. et.al. Crystal structure of RNA helicase from genotype lb hepatitis С virus. A feasible mechanism of unwinding duplex RNA. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 15045-15052.

33. Choi J., Xu Z., Ou J.H. Triple decoding of hepatitis С virus RNA by programmed translational frameshifting. //Mol. Cell Biol. 2003. - V. 23. - P. 1489-1497.

34. Choo Q., Kuo G., Weiner AJ. et.al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. // Science. 1989. — V. 244. -P. 359-362.

35. Choo Q., Richman K.H., Han J.H. et.al. Genetic organization and diversity ofthe hepatitis С virus. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. -V. 88. - P. 2451-2455.

36. Choo S.H., So H.S., Cho J.M., Ryu W.S. Association of hepatitis С virus particles with immunoglobulin: a mechanism for persistent infection. // J. Gen. Virol. 1995. - V. 76. - P. 2337-2341.

37. Chou P.Y., Fasman G.D. Prediction of the secondary strucrure of proteins from their amino acid sequence. // Adv. Enzymol. 1978. - V. 47. - P. 145-148.

38. Chung R.T., Monto A., Dienstag J.L., Kaplan L.M. Mutations in the NS5A region do not predict interferon-responsiveness in american patients infected with genotype lb hepatitis С virus. // J. Med. Virol. 1999. - V. 58. - P. 353358.

39. Cocquerel L., Duvet S., Meunier J.C. et.al. The transmembrane domain of hepatitis С virus glycoprotein El is a signal for static retention in the endoplasmic reticulum. // J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 2641-2649.

40. Cocquerel L., Meunier J.C., Pillez A. et.al. A retention signal necessary and sufficient for endoplasmic reticulum localization maps to the transmembrane domain of hepatitis С virus glycoprotein E2. // J. Virol. 1998. - V. 72. - P. 2183-2191.

41. Colin C, Lanoir D, Touzet S et.al. Sensitivity and specificity of third-generation hepatitis С virus antibody detection assays: an analysis of the literature. // J. Viral Hepat. 2001. - V. 8. - P. 87-95.

42. Cooper S, Erickson AL, Adams EJ, et al. Analysis of a successful immune response against hepatitis С virus. // Immunity. 1999. - V. 10. - P. 439-449.

43. Cwirla, S.E., Peters, E.A., Barrett, R.W., Dower, W.J. Peptides on phage: a vast library for identifying ligands. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. - V. 87. - P. 6378-6382.

44. Darling J.M., Wright T.L. Immune responses in hepatitis C: is virus or host the problem? // Curr. Opin. Infect. Dis. 2004. - V. 17. - P. 193-198.

45. Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C. et.al. Formation of native hepatitis С virus glycoprotein complexes. // J. Virol. 1997. — V. 71. - P. 697-704.

46. Devlin J.J., Panganiban L.C., Devlin P.E. Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules. // Science. 1990. - V. 249. - P. 404-406.

47. Dou X.-G., Talekar G., Chang J. et.al. Antigenic heterogeneity of the hepatitis С virus NS5A protein. // Journal of Clinical Microbiology. 2002. - V. 40, N1. -P. 61-67.

48. Egger D., Wolk В., Gosert R. et al. Expression of hepatitis С virus proteins induces distinct membrane alteration including a candidate viral replication complex. // J. Virol. 2002. - V.76. - P. 5974-6984.

49. Engelman D.M., Steitz T.A., Goldman A. // Annu. Rev. Biophys. Chem. -1986.-V. 15.-P. 321-353.

50. Enomoto N., Sakuma I., Asahina Y. et.al. Mutations in the nonstructural protein 5a gene and response to interferon in patients with chronic hepatitis с virus lb infection. // N. Engl. J. Med. 1996. - V. 334. - P. 77-81.

51. Enshell-Seijffers D., Denisov D., Groisman B. et.al. The mapping and reconstitution of a conformational discontinuous B-cell epitope of HIV-1. // J. Mol. Biol. 2003. - V. 334. - P. 87-101.

52. Enshell-Seijffers D., Smelyanski L., Gershoni J.M. The rational design of a "type 88" genetically stable peptide display vector in the filamentous bacteriophage fd. // Nucleic Acids Res. 2001. -V. 29, N10. - P. 50-63.

53. Ferreiro M.C., Dios P.D., Scully C. Transmission of hepatitis С virus by saliva? // Oral. Dis. 2005. - V. 11, N4. - P. 230-235.

54. Flegelova Z., Krchnak V., Nemecek V. et.al. Epitope mapping of non-structural (NS3/NS4) region of HCV protein using synthetic peptides. // In "Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis". Mayflower, Kingswinford, UK. -1994.-P. 505-508.

55. Flint M., Maidens C., Loomis-Price L.D. et.al. Characterization of hepatitis С virus E2 glycoprotein interaction with a putative cellular receptor, CD81. // Journal of virology, Aug. 1999. - V. 73, N8. - P. 6235-6244.

56. Gallinari P., Brennan D., Nardi C. et.al. Multiple enzymatic activities associated with recombinant NS3 protein of hepatitis С virus. // J. Virol. 1998. — V. 72. — P. 6758-6769.

57. Garnier J., Osguthorpe D.J., Robson B. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins. //J. Mol. Biol. 1978. -V. 120, N1. - P. 97-120.

58. Gerlach J.T., Diepolder H.M., Jung M.C. et al. Recurrence of hepatitis С virus after loss of vims-specific CD4(+) T-cell response in acute hepatitis C. // Gastroenterology. 1999. - V. 117. - P. 933-941.

59. Geysen H.M., Rodda S.J., Mason T.J. et.al. Strategies for epitope analysis using peptide synthesis. // J. Immunol. Methods. 1987. - V. 102. - P. 259-274.

60. Geysen H.M., Mason T.J., Rodda S.J. Cognitive features of continuous antigenic determinants. // J. Mol. Recognit. 1988. -V. 1. - P. 32-35.

61. Giannelli G., Antonaci S. Immunological and molecular aspects of liver fibrosis in chronic hepatitis С virus infection. // Histol. Histopaphol. 2005. — V. 20. — P. 939-944.

62. Giannini C., Brechot C. Hepatitis С virus biology. // Cell Death and Differentiation. 2003. - V. 10. - P. 27 - 38.

63. Goeser Т., Muller H.M., Pfaff E., Theilmann L. Characterization of antigenic determinants of the hepatitis С virus. // Virology. — 1994. — V. 205. — P. 462469.

64. Grakoui A., Wychowski C., Lin C. et.al. Expression and identification ofhepatitis С virus polyprotein cleavage products. // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 1385-1395.

65. Gretch D.R. Diagnostic tests for hepatitis C. // Hepatology. 1997. - V. 26. -P. 43-47.

66. Grihalde N.D., Jack Chen Y.-C., Golden A. et.al. Epitope mapping of anti-HIV and anti-HCV monoclonal antibodies and characterization of epitope mimics using a filamentous phage peptide library. // Gene. 1995. - V. 166, N2. - P. 187-195.

67. Heller Т., Rehermann B. Acute hepatitis C: a multifaceted disease. // Seminars in liver disease. 2005. - V. 25. - P. 7-17.

68. Hoofnagle J.H. Course and outcome of hepatitis C. // Hepatology. 2002. —V. 36.-P. 21-29.

69. Hope R.G., McLauchlan J. Sequence motifs required for lipid droplet association and protein stability are unique to the hepatitis С virus core protein. //J. Gen. Virol.-2000.-V. 81.-P. 1913-1925.

70. Jolivet-Reynaud C., Adida A., Michel S. et.al. Characterization of mimotopes mimicking an immunodominant conformational epitope on the hepatitis С virus NS3 helicase. // Journal of Medical Virology. 2004. -V. 72. - P. 385-395.

71. Karlus P.A., Schulze G.E. //Naturwissenshaften. 1985. - V. 72. - P. 212-223.

72. Khudyakov Yu.E., Khudyakova N.S., Jue D.L. et.al. Linear B-cell epitopes of the NS3-NS4-NS5 proteins of the hepatitis С virus as modeled with synthetic peptides. // Virology. 1995. - V. 206. - P. 666-672.

73. Kim J.L., Morgenstern K.A., Lin C. et.al. Crystal structure of the hepatitis С virus NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor peptide. // Cell. 1996. - V. 87. - P. 343-355.

74. Kim J.L., Morgenstern K.A., Griffith J.P. et.al. Hepatitis С virus RNA helicase domain with a bound oligonucleotide: the crystal structure provides insights into the mode of unwinding. // Structure. 1998. - V. 6. - P. 89-100.

75. Kittlesen D.J., Chianese-Bullock K.A., Yao Z.Q. et.al. Interaction between complement receptor gClqR and hepatitis С virus core protein inhibits T-lymphocyte proliferation. // J. Clin. Invest. 2000. - V. 106, N10. - P. 1239 -1249.

76. Kuo G., Choo Q.L., Alter H.J. et al. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A, non-B hepatitis. // Science. 1989. — V. 244.-P. 362-364.

77. Kyte I., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. // J. Mol. Biol. 1982. - V. 157. - P. 105-132.

78. Lanford R.E., Notvall L., Chavez D. et.al. Analysis of hepatitis С virus capsid, El, and E2/NS1 proteins expressed in insect cells. // Virology. 1993. - V. 197.-P. 225-235.

79. Large M.K., Kittlesen D.J., Hahn Y.S. Suppression of host immune response by the core protein of hepatitis С virus: Possible implications for hepatitis С virus persistence. //J. Immunol. 1999. -V. 162. - P. 931-938.

80. Lechner F., Wong D.K., Dunbar P.R. et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis С virus. // J. Exp. Med. 2000. - V. 191.-P. 1499-1512.

81. Lerat H., Berby F., Trabaud M.A. et.al. Specific detection of hepatitis С virus minus strand RNA in hematopoietic cells. // J. Clin. Invest. 1996. - V. 97. -P. 845-851.

82. Levy S., Todd S.C., Maecker H.T. CD81 (TAPA-1): a molecule involved in signal transduction and cell adhesion in the immune system. // Annu. Rev. Immunol. 1998.-V. 16.-P. 89-109.

83. Liu Q., Bhat R.A., Prince A.M. et al. The hepatitis С virus NS2 protein generated by NS2-3 autocleavage is required for NS5A phosphorylation. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. -V. 254. - P. 572-577.

84. Liu Q., Tackney C., Bhat R.A. et.al. Regulated processing of hepatitis. С virus core protein is linked to subcellular localization. // J. Virol. 1997. - V. 71, N1. -P. 657-662.

85. Lo S., Masiarz F., Hwang S.B. et.al. Differential subcellular localization of hepatitis С virus core gene products. // Virology. 1995. - V. 213. - P. 455461.

86. Longombardo G., Ferri C., Marchi S. et.al. Immune response to an epitope of the NS4 protein of hepatitis С virus in HCV-related disorders. // Clin. Immunol. Immunopathol. 1998. - V. 87, N2. - P. 124-129.

87. Major M.E., Feinstone S.M. The Molecular Virology of Hepatitis C. // Hepatology. 1997.-V. 25, N6.-P. 1527-1538.

88. Marusawa H., Hijikata M., Chiba Т., Shimotohno K. Hepatitis С virus core protein inhibits Fas- and tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis via NF-kappaB activation. // J. Virol. 1999. - V. 73, N6. - P. 4713^1720.

89. Masalova O.V., Atanadze S.N., Samokhvalov E.I. et.al. Detection of hepatitis С virus core protein circulating within different virus particle populations. // Journal of Medical Virology. 1998. - V. 55. - P. 1-6.

90. Masalova O.V., Lakina E.I., Abdulmedzhidova A.G. et al. Characterization of monoclonal antibodies and epitope mapping of the NS4 protein of hepatitis С virus. // Immunol. Letters. 2002. - V.83. - P. 187-196.

91. McKinney M.M., Parkinson A. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. // J. Immunol. Methods. 1987. - V. 96, N2. - P. 271-278.

92. McLauchlan J. Properties of the hepatitis С virus core protein: a structural protein that modulates cellular processes. // Journal of Viral Hepatitis. -2000. V. 7.-P. 2-14.

93. Menez R., Bossus M., Muller B.H. et.al. Crystal structure of a hydrophobic immunodominant antigenic site on hepatitis С virus core protein complexed to monoclonal antibody 19D9D6. // The Journal of Immunology. -2003.-V. 170.-P. 1917-1924.

94. Meola, A., Delmastro P., Monaci P. et.al. Derivation of vaccines from mimotopes: immunologic properties of HBsAg mimotopes displayed on filamentous phage. // J. Immunol. 1995. - V. 154. - P. 3162-3172.

95. Minenkova O., Gargano N., Tomassi A.D. et.al. ADAM-HCV, a new-concept diagnostic assay for antibodies to hepatitis С virus in serum. // Eur. J. Biochem. 2001. - V. 268. - P. 4758-4768.

96. Mondelli M.U., Cerino A., Boender P. et.al. Significance of the immune response to a major, conformational B-cell epitope on the hepatitis С virus NS3 region defined by a human monoclonal antibody. // J. Virol. 1994. - V. 68, N8.-P. 4829-4836.

97. Moradpour D., Englert C., Wakita Т., Wands JR. Characterization of cell lines allowing tightly regulated expression of hepatitis С virus core protein. //

98. Virology. 1996. -V. 222. - P. 51-63.

99. Moradpour D., Gosert R., Egger D. et.al. Membrane association of hepatitis С vims nonstructural proteins and identification of the membrane alteration that harbors the viral replication complex. // Antiviral research. -2003.-V. 60.-P. 103-109.

100. Moriya K., Fujie H., Shintani Y. et.al. The core protein of hepatitis С virus induces hepatocellular carcinoma in transgenic mice. //Nat. Med. 1998. -V. 4.-P. 1065-1067.

101. Murphy F.A., Fauquet C.M., Bishop D.H.L. et al. Virus taxonomy, sixth report of the international committee on taxonomy of viruses. // Vienna & New York: Springer. 1995. - P. 424-426.

102. Neddermann P., Tomei L., Steinkuhler C. et.al. The nonstructural proteins of the hepatitis С virus: structure and functions. // Biol. Chem. 1997. -V. 378.-P. 469-476.

103. Neumann A.U., Lam N.P., Dahari H. et.al. Hepatitis С viral dynamics in vivo and the antiviral efficacy of interferon-alpha therapy. // Science. 1998. -V. 282.-P. 103-107.

104. Nikolaeva L.I., Blokhina N.P., Tsurikova N.N. et.al. Virus-specific antibody titers in different phases of hepatitis С virus infection. // Journal of Viral Hepatitis. 2002. - V. 9. - P. 429-437.

105. Okuda M., Li K., Beard M.R. et.al. Mitochondrial injury, oxidative stress, and antioxidant gene expression are induced by hepatitis С virus core protein. // Gastroenterology. 2002. -V. 122. - P. 366-375.

106. Olenina L.V., Nikolaeva L.I., Sobolev B.N. et.al. Mapping and characterization of В cell linear epitopes in the conservative regions of hepatitis С virus envelope glycoproteins. // J. Viral. Hepat. 2002. - V. 9, N3. - P. 174182.

107. Park H.J., Byun S.M., Ha Y.J. et.al. Identification of immunodominant epitopes in the Core and nonstructural region of hepatitis С virus by enzymeimmunoassay using synthetic peptides. // J. Immunoassay. 1995. - V. 16. — P. 167-181.

108. Pavio N., Lai M.M. The hepatitis С virus persistence: how to evade the immune system? // J. Biosci. 2003. - V. 28. - P.287-304.

109. Pawlotsky J.M., Germanidis G. The non-structural 5 A protein of hepatitis С virus. // Journal of Viral Hepatitis. 1999. - V. 6. - P. 343-356.

110. Penin F., Combert C., Germanidis G. et.al. Conservation of the conformational and positive charges of hepatitis С virus E2 envelop glycoprotein hypervariable region 1 points to a role in cell attachment. // J. Virol. -2001. -V. 75. P. 5703-5710.

111. Penin F., Dubuisson J., Rey F.A. et.al. Structural biology of hepatitis С virus. // Hepatology. 2004. - V. 39, N1. - P. 5-19.

112. Pereboeva L.A., Pereboev A.V., Wang L.F., Morris G.E. Hepatitis С epitopes from phage-displayed cDNA libraries and improved diagnosis with a chimeric antigen. // Journal of Medical Virology. — 2000. V. 60. — P. 144— 151.

113. Pereboeva L.A., Pereboev A.V., Morris G.E. Identification of antigenic sites on three hepatitis С virus proteins using phage-displayed peptide libraries. // Journal of Medical Virology. 1998. - V. 56. - P. 105-111.

114. Petrenko V.A., Vodyanoy V.J. Phage display for detection of biological threat agents. // Journal of Microbiological Methods. 2003.- V. 53. - P. 253 -262.

115. Pileri P., Uematsu Y., Campagnoli S. et.al. Binding of hepatitis С virus to CD81. // Science. 1998. - V. 282. - P. 938-941.

116. Prezzi C., Nuzzo M., Meola A. et.al. Selection of antigenic and immunogenic mimics of hepatitis С virus using sera from patients. // The Journal of Immunology. 1996. -V. 156. - P. 4504 - 4513.

117. Ray R., Khanna A., Lagging L.M. et.al. Peptide immunogen mimicry of putative El glycoprotein-specific epitopes in hepatitis С virus. // J. Virol. —1994. V. 68, N7. - P. 4420-4426.

118. Ray R.B., Lagging L.M., Meyer K. et.al. Transcriptional regulation of cellular and viral promoters by the hepatitis С virus core protein. // Virus Res. —1995.-V. 37.-P. 209-220.

119. Ray R.B., Ray R. Hepatitis С virus core protein: intriguing properties and functional relevance. // FEMS Microbiology Letters. 2001. - V. 202. - P. 149-156.

120. Realdon S., Gerotto M., Dal Pero F. et al. Proapoptotic effect of hepatitis С virus core protein in transiently transfected cells is enhanced by nuclear localization and is dependent on PKR activation. // J. Hepatol. — 2004. — V. 40. -P.77-85.

121. Reed K.E., Gorbalenya A.E., Rice C.M. The NS5A/NS5 proteins of viruses from three genera of the family flaviviridae are phosphorylated by associated serine/threonine kinases. // J. Virol. 1998. — V. 72. - P. 6199-6206.

122. Rice C.M. Flaviviridae: The viruses and their replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, et al. // Fields Virology, 3rd edition. Philadelphia: Lippincott-Raven. 1996. - P. 931-959.

123. Rollier C., Depla E., Drexhage J. et al. Control of heterologous hepatitis С virus infection in chimpanzees is associated with the quality of vaccine-induced periferal T-helper immune response. // J. Virol. — 2004. — V. 78. — P.187-196.

124. Rosa C., Osborne S., Garetto F. et.al. Epitope mapping of the NS4 and NS5 gene products of hepatitis С virus and the use of a chimeric NS4-NS5 synthetic peptide for serodiagnosis. // Journal of Virological Methods. 1995. -V. 55.-P. 219-232.

125. Sagnelli E., Coppola N., Marrocco C. et.al. Diagnosis of hepatitis С virus related acute hepatitis by serial determination of IgM anti-HCV titres. // Journal of Hepatology. -2005. V. 42. - P. 646-651.

126. Saito I., Miyamura Т., Ohbayashi A. et.al. Hepatitis С virus infection is associated with the development of hepatocellular carcinoma. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. - V. 87. - P. 6547-6549.

127. Sansonno D., Iacobelli A.R., Cornacchiulo V. et.al. Immunohistochemical detection of hepatitis С virus-related proteins in liver tissue. // Clin. Exp. Rheumatol. 1995. - V. 13. - P. 29-32.

128. Santolini E., Migliaccio G., La Monica N. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis С virus core protein. // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 3631-3641.

129. Scheuer P.J., Ashrafzadeh P., Sherlock S. et al. The pathology of hepatitis C. // Hepatology. 1992. - V. 15. - P. 567-571.

130. Scognamiglio P., Accapezzato D., Casciaro M.A. et al. Presence of effector CD8+ T cells in hepatitis С virus-exposed healthy seronegative donors. // J. Immunol. 1999. - V. 162. - P. 6681-6689.

131. Scott J.K., Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. // Science. 1990. - V. 249. - P. 386-390.

132. Seeff L.B., Buskell-Bales Z., Wright E.C. et al. Long-term mortality after transfusion-associated non-A, non-B hepatitis. // N. Engl. J. Med. 1992. — V. 327.-P. 1906-1911.

133. Sela M. Antigenicity: some molecular aspects. // Science. — 1969. V. 166.-P. 1365-1374.

134. Shimizu Y.K., Igarashi H. Kiyohara T. et al. A hyperimmune serumagainst a synthetic peptide corresponding to the hypervariable region 1 of hepatitis С virus can prevent viral infection in cell cultures. // Virology. 1996. -V. 223.-P. 409^412.

135. Siemoneit K., Cardoso M.S., Wolp A. et.al. Isolation and epitope characterization of human monoclonal antibodies to hepatitis С virus core antigen. // Hybridoma. 1994. - V. 13, N1. - P. 9-13.

136. Simmonds P.E., Holmes C., Cha T.-A. et.al. Classification of hepatitis С virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS5 region. //J. Gen. Virol. 1993. -V. 74. - P. 2391-2399.

137. Smith G.P., Petrenko V.A. Phage display. // Chem. Rev. 1997. - V. 97. -P. 391-410.

138. Smothers J.F., Henikoff S., Carter P. Affinity selection from biological libraries. // Science. 2002. - V. 298. - P. 621-622.

139. Sung V.M-H, Shimodaira S., Doughty A.L. et.al. Establishment of B-cell lymphoma cell lines persistently infected with hepatitis С virus in vivo and in vitro\ The apoptotic effects of virus infection. // J. Virol. 2003. - V. 77. — P. 2134-2146.

140. Takamizawa A., Mori C., Fuke I. et.al. Structure and organization of the hepatitis С virus genome isolated from human carriers. // J. Virol. 1991. - V. 65.-P. 1105-1113.

141. Taylor D.R., Shi S.T., Romano P.R. et.al. Inhibition of the interferon-inducible protein kinase PKR by HCV E2 protein. // Science. 1999. - V. 285. -P. 107-110.

142. Tellinghuisen T.L., Marcotrigiano J., Gorbalenya A.E., Rice C.M. The

143. NS5A protein of hepatitis С virus is a zinc metalloprotein. // The Journal of Biological Chemistry. 2004. - V. 279, N 47. - P. 48576-48587.

144. Tellinghuisen T.L., Rice C.M. Interaction between hepatitis С virus proteins and host cell factors. // Curr. Opin. Microbiol. 2002. - V. 5. - P. 419427.

145. Teo M., Hayes P. Management of hepatitis C. // British Medical Bulletin. -2004.- V. 70.-P. 51-69.

146. Thimme R., Bukh J., Spangenberg H.C. et al. Viral and immunological determinants of hepatitis С virus clearance, persistence, and disease. // PNAS. -2002.-V. 99.-P. 15661-15668.

147. Thimme R., Oldach D., Chang K.-M. et al. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis С virus infection. // J. Exp. Med.-2001.-V. 194.-P. 1395-1406.

148. Tomei L., Failla C., Santolini E. et.al. NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis С virus polyprotein. // J. Virol. — 1993. V. 67. — P. 4017-4026.

149. Ueno Т., Misawa S., Ohba Y. et.al. Isolation and characterization of monoclonal antibodies that inhibit hepatitis С virus NS3 protease. // J'. Virol. — 2000. V. 74, N14. - P. 6300-6308.

150. Urbanelli L., Fortugno P., Bartoli F. et.al. 'Affinity maturation' of ligands for HCV-specific serum antibodies. // J. Immunol. Methods. 2000. — V. 236.-P. 167-176.

151. Wang L.-F., Yu M. Epitope identification and discovery using phage display libraries: application in vaccine development and diagnostics. // Current Drug Targets. 2004. - V. 5. - P. 1-15.

152. Welling G.W., Weijer W.J., van der Zee R., Welling-Wester S. Prediction of sequential antigenic regions in proteins. // FEBS Lett. 1985. - V. 188, N2.-P. 215-218.

153. Wienhues U., Ihlenfeldt H.-G., Seide C. et.al. Characterization of a linearepitope in the nonstructural region 4 of hepatitis С virus with reactivity to seroconversion antibodies. // Virology. 1998. - V. 245. - P. 281-288.

154. Wright P.E., Dyson H.J. Inrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm. // J. Mol. Biol. 1999. - V. 293. - P. 321-331.

155. Xu Z., Choi J., Yen T.S. et.al. Synthesis of a novel hepatitis С virus protein by ribosomal frameshift. // EMBO J. 2001. - V. 20. - P. 3840-3848.

156. Yagnik A.T., Lahm A., Meola A. et.al. A model for the hepatitis С virus envelop glycoprotein E2. // Proteins. 2000. - V. 40. - P. 355-366.

157. Yamanaka Т., Kodama Т., Doi T. Subcellular localization of HCV core protein regulates its ability for p53 activation and p21 suppression. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2002. - V. 294. — P. 528-534.

158. Yamanaka Т., Uchida M., Doi T. Innate form of HCV core protein plays an important role in the localization and the function of HCV core protein. // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2002. — V. 294. — P. 521-527.

159. Yasui K., Wakita Т., Kohara K.-T. et.al. The native form and maturation process of hepatitis С virus core protein. // J. Virol. 1998. - V. 72. - P. 60486055.

160. Yip Y.L., Smith G., Ward R.L. Comparison of phage pill, pVIII and GST as carrier proteins for peptide immunisation in Balb/c mice. // Immunology Letters. 2001. - V. 79. - P. 197-202.

161. Zhang Z.-X., Chen M., Sonnerborg A. et.al. Distinguishing acute from symptomatic chronic hepatitis С virus infection by site-directed of the HCV structural proteins. // J. of Infectious Deseases. — 1995. — V. 171. — P. 13561359.

162. Zhu Z.Y., Minenkova O., Bellintani F. et.al. In vitro evolution of ligands for HCV-specific serum antibodies. // Biol. Chem. 2000. - V. 381. - P. 245254.

163. Zibert A., Kraas W., Meisel H. et.al. Epitope Mapping of antibodies directed against hypervariable region 1 in acute self-limiting and chronic infections due to hepatitis С virus. // Journal of Virology. 1997. - V. 71, N 5. -P. 4123-4127.

164. Zibert A., Kraas W., Ross R.S. et.al. Immunodominant B-cell domains of hepatitis С virus envelope proteins El and E2 identified during early and late time points of infection. // J. Hepatol. 1999. - V. 30, N 2. - P. 177-184.

165. Zibert A., Meisel H., Kraas W. et al. Early antibody response against hypervariable region 1 is associated with acute self-limiting infections of hepatitis С virus. // Hepatology. 1997. -V. 25. - P. 1245-1249.