Модифицированные производные нуклеиновых кислот, содержащие 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Синтез и свойства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Хомякова, Елена Алексеевна

  • Хомякова, Елена Алексеевна
  • кандидат химических науккандидат химических наук
  • 2012, МоскваМосква
  • Специальность ВАК РФ02.00.10
  • Количество страниц 129
Хомякова, Елена Алексеевна. Модифицированные производные нуклеиновых кислот, содержащие 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Синтез и свойства: дис. кандидат химических наук: 02.00.10 - Биоорганическая химия. Москва. 2012. 129 с.

Оглавление диссертации кандидат химических наук Хомякова, Елена Алексеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

3.1. Химические методы исследования структуры комплексов биомолекул

3.1.1. Фотоактивируемые производные нуклеиновых кислот

3.1.1.1. Арилазидные производные нуклеиновых кислот

3.1.1.2. Галоген- и тиосодержащие производные нуклеиновых кислот

3.1.2. Образование ковалентной связи между молекулами белка и нуклеиновой кислоты с использованием формальдегида

3.1.3. Олигонуклеотиды, содержащие апуриновые/апиримидиновые сайты

3.2. Физические методы структурной биологии

3.2.1. Рентгеноструктурный анализ

3.2.2. Ядерный магнитный резонанс

3.2.3. Сравнение методов ЯМР-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа для исследования НК-белковых комплексов

3.3. Исследование структурных особенностей рибонуклеазы Р

3.3.1. РНК-субъединица бактериальной рибонуклеазы Р

3.3.2. Белок бактериальной рибонуклеазы Р

3.3.3. РНК-белковые взаимодействия в бактериальной рибонуклеазе Р

3.4. Заключение

4. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, СОДЕРЖАЩИЕ 1,2-ДИОЛЬНЫЕ, АЛЬДЕГИДНЫЕ И ГИДРАЗИДНЫЕ ГРУППИРОВКИ. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)

4.1. Синтез модифицированных фрагментов ДНК и РНК, содержащих в 2'-положении

1,2-диольные группировки

4.2. Синтез модифицированных фрагментов ДНК и РНК, содержащих в 2'-положении альдегидные группировки

4.3. Синтез модифицированных фрагментов ДНК и РНК, содержащих в 2'-положении гидразидную группировку

4.4. Физико-химические свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина

4.5. Влияние модифицированных звеньев, содержащих 1,2-диольную группу,

на структуру двойной спирали ДНК с использованием ферментов системы рестрикции-модификации ЗбоП

4.5.1. Гидролиз ДНК-дуплексов, содержащих остатки 2'-<9-[2-(2,3-дигидроксипропил)-амино-2-оксоэтил]уридина и 2'-6>-(2,3-дигидроксипропил)уридина, эндонуклеазой рестрикции БзоП

4.5.2. Метилирование ДНК-дуплексов, содержащих остатки 2'-0-[2-(2,3-дигидрокси-пропил)амино-2-оксоэтил]уридинаи 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)уридина, метилтрансферазой ЗбоН

4.6. Взаимодействие модифицированных олигонуклеотидов с метилтрансферазой 8зо11 и белком бактериальной рибонуклеазы Р

4.6.1. Взаимодействие метилтрансферазы ЭзоП с ДНК-дуплексами, содержащими 2'-диольную и 2'-альдегидную группировки

4.6.2. Изучение ингибирования реакции 2'-альдегидных фрагментов ДНК с метилтрансферазой БзоН в присутствии ДНК-конкурентов

4.6.3. Ковалентное связывание 2'-альдегидных олигонуклеотидов с белком бактериальной рибонуклеазы Р

4.7. Получение конъюгатов 2'-гидразидных олигонуклеотидов с карбонильными соединениями

4.8. Заключение

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

8. ПРИЛОЖЕНИЕ

1. УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

В работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (IUPАС) и Международного Союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения:

АП-сайт - апуриновый/апиримидиновый сайт

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДМСО - диметилсульфоксид

ДСН - додецил сульфат натрия

ДТТ - дитиотреит (трео-\,4-димеркапто-2,3-бутандиол)

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

КД - круговой дихроизм

криоЭМ - криоэлектронная микроскопия

мРНК -матричная РНК

НК - нуклеиновые кислоты

ПААГ - полиакриламидный гель

рРНК - рибосомная РЖ

РСА - рентгеноструктурный анализ

ТГФ - тетрагидрофуран

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

тРНК - транспортная РНК

ТСХ - тонкослойная хроматография

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс Ас - ацетил

AdoMet - S-аденозил-Ь-метионин

AMA - смесь концентрированного водного аммиака и 40% водного метиламина (1:1, v/v) BER - эксцизионная репарация ДНК путем удаления поврежденных азотистых оснований ВТРР - /и/?ет-бутилимино-три(пирролидино)фосфоран Bz - бензоил

COSY - корреляционная ЯМР-спектроскопия

CPG - стекло с определенным размером пор 2,5-DHBA - 2,5-дигидроксибензойная кислота DMAP - 4,4-диметиламинопиридин DMTr - 4,4'-диметокситритил Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил

HEPES - 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфокислота

HMQC - ЯМР-спектроскопия с использованием гетероядерной многоквантовой корреляции HSQC - ЯМР-спектроскопия с использованием гетероядерной одноквантовой корреляции MALDI-TOF - матричная лазерная десорбционная ионизационая времяпролетная масс-спектрометрия

NER - экзиционная репарация ДНК путем удаления нуклеотидов Ni-NTA - никелевая соль нитрилотриуксусной кислоты NOE - ядерный эффект Оверхаузера

NOESY - ЯМР-спектроскопия с использованием ядерного эффекта Оверхаузера Рот - пивалоилоксиметил

SAXS - малоугловое рассеяние рентгеновских лучей TBAHS - гидросульфат тетрабутиламмония 2,4,6-ТНАР - 2,4,6-тригидроксиацетофенон Ud - 2'-0-(2,3-Дигидроксипропил)уридин

Ijdao - 2'-0-[2-(2,3-Дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридин Ijdap - 2'-0-(2,5-диоксо-3-азапентил)уридин

Uh -2'-0-(2-((2-(2-(4-гидразинил-4-оксобутаноил)гидразинил)этил)амино)-2-

оксоэтокси)уридин

U0 - 2'-0-(2-оксоэтил)уридин

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биоорганическая химия», 02.00.10 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модифицированные производные нуклеиновых кислот, содержащие 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Синтез и свойства»

2. ВВЕДЕНИЕ

Модифицированные производные нуклеиновых кислот (НК) широко используются в молекулярной биологии и медицинских исследованиях, так как обладают уникальными свойствами, в том числе способностью регулировать экспрессию генов, избирательно связываясь с белками и комплементарными последовательностями ДНК и РНК.

Одним из направлений исследований в химии нуклеиновых кислот является разработка методов синтеза и изучение свойств 2'-модифицированных олигонуклеотидов, содержащих в своем составе химически активные группировки. Использование таких производных для получения конъюгатов с различными молекулами представляется перспективным подходом для направленного изменения свойств НК-фрагментов. Ранее в лаборатории химии нуклеиновых кислот химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова была разработана стратегия синтеза реакционноспособных производных ДНК, в рамках которой предложены эффективные методы синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих амино-, карбоксильную, 1,2-диольную и альдегидную группы.

Успешное использование данного синтетического подхода позволяет продолжить создание способов получения новых химически активных производных ДНК, что является актуальной задачей химии нуклеиновых кислот. Кроме того, важным представляется разработка методов синтеза новых реакционноспособных аналогов РНК, так как число работ, посвященных синтезу таких соединений, ограничено.

Целью настоящего исследования является разработка методов синтеза модифицированных производных ДНК и РНК, содержащих в 2'-положении 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Отдельной частью работы было изучение физико-химических свойств олигонуклеотидов и характера их взаимодействия с различными низкомолекулярными соединениями и биомолекулами.

Основными этапами работы были: а) синтез олигодезокси- и олигорибонуклеотидов, содержащих диольные, альдегидные и гидразидные группировки; б) исследование физико-химических свойств 2'-диольных олигодезокси- и олигорибонуклеотидов; в) изучение закономерностей ковалентного связывания 2'-альдегидных олигонуклеотидов с ДНК- и РНК-узнающими белками, на примере ДНК-метилтрансферазы БэоП и белка бактериальной рибонуклеазы Р, и оценка перспективности их использования для аффинной модификации; г) разработка методики конъюгации олигонуклеотидов, содержащих гидразидные группировки,

с карбонильными соединениями для дальнейшего получения новых НК-производных с заранее заданными свойствами.

С использованием З'-амидофосфита 2'-0-[2-(2,3-диацетоксипропил)амино-2-оксоэтил] -5'-0-(4,4 '-диметокситритил)-Л8-пивалоилоксиметилуридина впервые синтезированы модифицированные олигорибонуклеотиды, содержащие в 2'-положении углеводного фрагмента 1,2-диольные и альдегидные группировки. Показано, что встраивание в олигонуклеотидную цепь модифицированных остатков уридина, содержащих 1,2-диольные группировки, существенно не влияет на термическую стабильность ДНК-, РНК- и гибридных дуплексов.

Впервые изучено взаимодействие 2'-диоксоазапентильных ДНК- и РНК-производных с метилтрансферазой ЗэоП и белком бактериальной РНКазы Р, соответственно. Проведено сравнительное исследование свойств альдегидных олигонуклеотидов нового типа и 2'-оксоэтильных производных, описанных ранее. Показано, что оксоэтильные производные обладают более высокой реакционной способностью в условиях ковалентного связывания с НК-узнающими белками. Продемонстрирован неизбирательный характер взаимодействия 2'-оксоэтильных и 2'-диоксоазапентильных производных с метилтрансферазой БвоП, что свидетельствует о снижении специфичности узнавания на фоне параллельного протекания химической реакции или о возможном наличии двухстадийного механизма узнавания белком ДНК-лиганда. Следует отметить, что различие в строении модифицированных звеньев не сказывается на специфичности взаимодействия ДНК-дуплексов с М.ЗбоП.

В представленной работе предложен новый эффективный метод получения 2'-гидразидных производных ДНК и РНК. Показано, что 2'-гидразидные олигонуклеотиды могут быть успешно применены для конъюгации с различными ароматическими и алифатическими альдегидами.

Полученные результаты могут быть использованы для создания новых типов биологически активных производных нуклеиновых кислот. Разработка методов синтеза и изучение свойств 2'-модифицированных альдегидных и гидразидных олигонуклеотидов способствует дальнейшему развитию методов конъюгации биомолекул с различными соединениями. Кроме того, альдегидные производные РНК могут применяться для присоединения пептидов и белков, что может использоваться для эффективной и адресной доставки малых интерферирующих РНК в клетки и ткани.

Работа включает обзор литературы, посвященный современным методам исследования структуры белково-нуклеиновых комплексов.

3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Взаимодействия нуклеиновых кислот с белками играют важную роль в процессах хранения и передачи генетической информации, поэтому исследование структуры белково-нуклеиновых комплексов является одной из основных задач молекулярной биологии. Детальное понимание строения таких комплексов необходимо для изучения механизмов функционирования различных НК-узнающих белков. На сегодняшний день существуют различные подходы, позволяющие изучать структуру комплексов биомолекул. В качестве основных можно указать:

1. рентгеноструктурный анализ (РСА);

2. ядерный магнитный резонанс (ЯМР);

3. криоэлектронная микроскопия (криоЭМ);

4. малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (8АХ8);

5. аффинная модификация.

Методы исследования НК-белковых взаимодействий, широко применявшиеся ранее, такие как ковалентное связывание между компонентами изучаемого комплекса с последующим анализом образовавшегося конъюгата и изучение свойств белков, полученных с использованием сайт-направленного мутагенеза, в последнее время используются реже, так как не дают полной информации о структуре комплекса. К настоящему моменту на первый план вышли физические методы структурной биологии (РСА, ЯМР, криоЭМ и ЗАХБ). Эти подходы дают возможность охарактеризовать структуры полноразмерных комплексов с разным пространственным разрешением: от низкого, сравнимого с размерами биомолекул, до высокого, сопоставимого с расстояниями между атомами. На сегодняшний день основной объем информации о структуре биомолекул с хорошим разрешением получен с помощью

рентгеновской кристаллографии с использованием синхротронных источников и ядерного магнитного резонанса.

Настоящий обзор содержит три основных раздела. В первых двух обсуждаются химические и физические методы исследования структуры комплексов белков с нуклеиновыми кислотами. Последний посвящен изучению пространственного строения рибонуклеазы Р с использованием современных подходов структурной биологии.

Применение метода ковалентного связывания нуклеиновых кислот с белками подробно обсуждается в обзоре [1]. В связи с этим первая глава включает анализ литературы, опубликованной после 2003 г. Во второй части обзора, посвященной физическим методам исследования, мы остановились на методах рентгеновской кристаллографии и ядерного магнитного резонанса. Данные по изучению комплексов методом РСА обобщены в обзоре 2005 г. [2], поэтому мы рассматривали только работы, вышедшие за последние 6 лет. Кроме того, во второй главе также кратко охарактеризованы криоэлектронная микроскопия и малоугловое рассеяние, которые активно используются, несмотря на то, что обладают более низким разрешением по сравнению с ЯМР и РСА. Анализ структур белков и их комплексов с использованием малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и нейтронов подробно обсуждается в обзорах 2010 г. [3, 4]. Мы не рассматривали метод, основанный на получении белков с помощью сайт-направленного мутагенеза и анализе их свойств, так как в последнее время он практически не используется для изучения структуры НК-белковых комплексов.

Все эти ограничения круга рассматриваемых вопросов позволили нам сосредоточить внимание прежде всего на обсуждении различных подходов к исследованию строения комплексов биомолекул и проанализировать возможности, проблемы и перспективы развития структурной биологии (табл. 3.1).

Таблица 3.1. Сравнительная характеристика основных подходов структурной биологии.

Метод Основные преимущества метода Основные проблемы метода

Ядерный магнитный резонанс Возможность анализа структуры в растворе или изучения динамической структуры комплекса с высоким разрешением (~2 А) Не подходит для анализа структуры больших комплексов (>100-120 кДа).

Рентгеноструктурный анализ Возможность изучения достаточно больших комплексов с высоким разрешением (~2 А) Невозможно использовать для анализа слишком подвижных или не полностью структурированных комплексов, так как необходимым эпатом метода является кристаллизация образца. По этой же причине невозможно анализировать динамические изменения в комплексе.

Криоэлектронная микроскопия и малоугловое рассеяние рентгеновских лучей Исследование сложных мульти-субъединичных структур в растворе Разрешение этих методов ниже, чем в случае РСА и ЯМР, и составляет 5-20 А.

Химические методы анализа структуры Простота подготовки препаратов НК и белков, входящих в состав комплекса. В последнее время широко используется для изучения и выделения молекулярных партнеров различных биомолекул или для исследования доменов белка, взаимодействующих с НК, в случае крупных мульти-субъединичных комплексов [5-7]. Метод позволяет определить отдельные контакты в сближенных участках НК и белка и не дает представления о структуре в целом.

3.1. Химические методы исследования структуры комплексов биомолекул

Метод ковалентного связывания был первым предложен для характеристики структур НК-белковых комплексов и активно использовался для изучения различных объектов молекулярной биологии с начала 60-х гг. В последние 10-20 лет химические методы не являются основными в структурных исследованиях, однако некоторые задачи по изучению строения биомолекул успешно решаются с помощью кросс-линкинга.

Основные варианты аффинной модификации белков НК-фрагментами изложены в обзоре [1]. За последнее время не было разработано принципиально новых подходов к кросс-линкингу нуклеиновых кислот с белками, поэтому в этой части обзора мы рассматриваем только работы, в которых с помощью методов ковалентного связывания решались задачи структурной биологии, и не обсуждаем особенности строения модифицированных НК-производных и методы их получения.

Основные подходы, которые в последние годы использовались для исследования белково-нуклеиновых комплексов, можно условно разделить на две группы. Первый основан на использовании УФ-света для образования ковалентных "сшивок" между биополимерами в составе специфического комплекса. Второй метод не предполагает использования излучения. В этом случае присоединение белка к НК происходит за счет взаимодействия активных группировок в составе биомолекул. Кроме того, возможно ковалентное связывание с помощью неспецифических реакционноспособных агентов, например, формальдегида.

3.1.1. Фотоактивируемые производные нуклеиновых кислот

В настоящее время для изучения НК-белковых взаимодействий методом кросс-линкинга наиболее широко используется подход, когда ковалентная связь между биомолекулами образуется под действием УФ-света. Немодифицированные нуклеиновые кислоты и белки поглощают свет с длиной волны 250-280 нм и могут быть ковалентно связаны между собой при облучении в таком интервале длин волн без существенных изменений конформации комплекса. Недостатками этого метода являются низкий выход продуктов реакции и возможная деградация белка и нуклеиновой кислоты в процессе облучения. В настоящее время для осуществления УФ-кросс-линкинга используют фотоактивируемые аналоги НК, которые генерируют радикалы или бирадикалы при облучении УФ-светом с длиной волны > 300 нм, что позволяет снизить степень деструкции

биополимеров и получить ДНК-белковый конъюгат с более высоким выходом. За последние 5 лет к о валентное связывание ^модифицированных б ко моле кул под действием облучения использовалось только в работе [8] для изучения комплекса фактора терминации транскрипции вируса коровьей оспы с РНК-субстратом. Авторы показали, что транскрипционный фактор вируса взаимодействует с мотивом U9 мРНК в составе тройного комплекса с субъединицей Rap94 вирусной полимеразы.

В некоторых случаях для определения области ПК, в которую следует вводить модифицированное звено, проводят первичный анализ контактов в комплексе методом футприншига [9].

Основные этапы исследования строения нуклеин обо-белковых комплексов с использованием, фотоактивируемых производных нуклеиновых кислот представлены на схеме 3.1.

Схема 3.1

Белок

ЛПЙПШЕ

ДНК

УФ-излучение Протеолиз

V

11ептидный фрагмент

лйшшг

и = УФ-активируемая

^ ~ группировка Анализ методом

масе-спектром етр и и MALDI-TOF 3.1.1.1. Арилазндные производные нуклеиновых кислот

СО

Белок

РНК

Пептидный фрагмент

Cj

и

U

Среди фотоактивирумьтх аналогов ПК наибольшее распространение получили аналоги, содержащие арилазидные звенья, что обусловлено их высокой реакционной

способностью, а также тем, что такие модифицированные производные можно ввести в состав НК с использованием как ферментативной, так и химической реакции. Основные данные по анализу литературы, посвященной ковалентному связыванию с использованием арилазидов, обобщены в табл. 3.2. Следует отметить, что такие производные могут быть введены в состав ДНК и РНК с использованием линкеров различной длины и природы.

Таблица 3.2. Ковалентное связывание белов с артазидными производными нуклеиновых кислот.

УФ-активируемая группировка

Исследованный НК-белковый комплекс или молекулярно-биологический процесс, полученные результаты

Литература

4-азидо-2-гидроксифенил

Изучен комплекс ДНК с АТФ-зависимым ремоделирующим белком БМ^/ЗЫР в составе нуклеосомы у дрожжей. Было показано, что каталитическая субъединица Swi2/Snf2 сближена с нуклеосомой на расстоянии двух витков двойной спирали от оси второго порядка нуклеосомы, а субъединица Б^б сближена с транскрипционным фактором, взаимодействующим с 8\У1/8КР.

[9]

4-азидофенил

Проанализированы контакты каталитической субъединицы белка ISW2 с

экстрануклеосомной и нуклеосомной ДНК в составе комплекса с нуклеосомой. С-конец субъединицы Isw2, включающий домены SLIDE и HAND, взаимодействует в основном с экстрануклеосомными фрагментами ДНК.

[10]

4-ази до-2,5 -дифторо-3 -хлоропиридин-6-ил V

Приведена сравнительная характеристика комплексов белков системы эксцизионной репарации нуклеотидов (КЕЯ) ХРС-НЯ23В, ИРА и ХРА с поврежденной ДНК. Продемонстрировано, что ИРА образует с ДНК более прочный комплекс, чем ХРА, кроме того, ХРА образует больше контактов с поврежденной цепью, а ЫРА - с неповрежденной. Показано, что ЯРА связывается с одноцепочечной ДНК или ДНК-дуплексом, содержащим неспаренное основание, более эффективно, чем с двуцепочечной ДНК. В случае ХРА подобной избирательности связывания не наблюдается.

[11-13]

4-азидо-2,3,5,6-тетра-фторофенил

Р

Показано, что поли(АДФ-рибоза)полимераза 1 и ее апоптотический фрагмент (24 кДа), которые являются компонентами системы ВЕЯ, оказывают влияние на репарацию ДНК длинными последовательностями.

[14]

4-азид о-2,5 -ди фторо-3 -хлоропиридин-6-ил £

Проанализирован комплекс белка ХРС-Яаё23В, который является основным компонентом системы репарации ЫЕЯ, с фрагментом ДНК, поврежденной цисплатином. Показано, что белок ХРС-ЫасШВ имеет контакты как с поврежденной, так и с неповрежденной ДНК, причем, место связывания субъединицы Яаё23В

локализовано в 3'-нижележащей области относительно места повреждения.

[15]

6 4-азидофенил Связывание бактериальной РНК-полимеразы с промоторной областью ДНК осуществляется за счет контактов о54-субъединицы с областью +1 - -31. Такие контакты сохраняются также в комплексе полимеразы с белком-активатором, который меняет конформацию холофермента. [16-19]

7 4-азидофенил В элонгационном комплексе архейной РНК-полимеразы с промоторной областью ДНК происходит существенное изменение структуры белка, которое приводит к сближению Н-субъединицы и транскрибируемой ДНК. [20]

8 4-азидофенил Изучена активация инициации транскрипции белком Spx Bacillus subtilis, взаимодействующим с РНК-полимеразой. При этом возникает контакт между аА-субъединицей полимеразы и -10 промоторной областью irxA и trxB, а также контакт ßß'-субъединиц с промоторной последовательностью ДНК. [21]

9 4-азидофенил Продемонстрирована роль транскрипционного фактора TFE в стабилизации элонгационного комплекса транскрипции в археях. [22, 23]

10 4-азидофенил Определены контакты гетеротримерного белка SNAP в Drosophila melanogaster, необходимого для транскрипции генов малых ядерных РНК U1-U6, с PSEA-областью ДНК, расположенной на 40-60 нуклеотидных звеньев с 5'-стороны от точки инициации транскрипции. [24]

11

4-азидофенил

При исследовании механизма транскрипции в дрожжах показано, что С53-субъединица полимеразы III расположена близко к 3'-концу РНК, в то время как транскрибируемая ДНК локализована вблизи каталитического центра элонгационного комплекса полимеразы III.

[25]

12

4-азидофенил

Изучен открытый комплекс митохондриальной РНК-полимеразы $асскаготусе.ч сегеу1^!ае и механизм расплетания промотора

транскрипционным фактором МгЛ. Показано, что 1УМ1 взаимодействует с промотором ДНК и способствует формированию открытого комплекса, связываясь с расплетенной нематричной цепью ДНК.

[26]

13

Рибосомный комплекс человека

13.1

13.2

13.3

4-азидо-2,3,5,6-тетрафторофенил

F

Определены пептидные фрагменты фактора терминации трансляции eRFl, сближенные со стоп-кодоном.

Показано, что рибосомный белок 83 сближен с мРНК при элонгации и терминации трансляции.

Установлено, что С-концевой фрагмент рибосомного белка S15 расположен в декодирующем центре рибосомы.

[27, 28]

[29, 30]

[31]

Следует отметить, что в некоторых работах параллельно используются различные фотоактивируемые группировки, а полученные результаты анализируются и сравниваются. Например, в работе [9] использовали арилазидную и диазиридиновую группировки. С использованием последней было получено большее количество ковалентно связанных комплексов, так как она является более реакционноспособной и менее селективной. Авторы [11] исследовали кросс-линкинг белков репарации с молекулами ДНК, содержащими

тиогруппу и арилазидную группировку. Было показано, что результаты аффинной модификации одинаковы для разных типов модифицированных производных.

3.1.1.2. Галоген- и тиосодержащие производные нуклеиновых кислот

Другим широко используемым типом фотоактивируемых производных являются НК, содержащие 5-галогенпиримидиновые нуклеозиды: 5-бромоуридин, 5-иодоуридин, 5-иодо-2'-дезоксиуридин или 5-иодо-2'-дезоксицитидин. При УФ-облучении таких соединений образуется устойчивый радикал, который способен взаимодействовать с электронодонорными остатками аминокислот в составе белка. Преимуществом использования таких производных является высокие выходы конъюгатов в реакции ковалентного связывания. Кроме того, использование 5-галогенпроизводных практически не вносит изменение в структуру нуклеиновых кислот, так как размеры атомов иода (2.15 А) и брома (1.95 А) примерно соответствуют размерам метальной группы (2.0 А), тем самым искажение структуры НК-белкового комплекса снижается до минимума. Такие фотоактивируемые аналоги образуют ковалентно связанные комплексы с определенными аминокислотными остатками (Туг, His, Phe, Met, Тгр) при УФ-облучении светом с длиной волны 310-320 нм [32]. Кроме того, для УФ-кросс-линкинга с молекулами белка широко используются тиопроизводные, в которых кетогруппа гетероциклического основания заменена на тиогруппу, такие как 4-тиотимидин, 4-тиоуридин, 4-тио-2'-дезоксиуридин, 6-тиогуанозин и 6-тио-2'-дезоксигуанозин. Замена атома кислорода на атом серы приводит к минимальным структурным изменениям биомолекулы, что в сочетании с высокой реакционной способностью делает такие соединения весьма перспективными. Следует отметить, что в настоящее время для изучения комплексов РНК с белками методом УФ-кросс-линкинга используют в основном тиопроизводные. Основные данные по анализу литературы, посвященной ковалентному связыванию белков с использованием галоген- и тиопроизводных НК, обобщены в табл. 3.3.

Таблица 3.3. Ковалентное связывание белов с галоген- и тиопроизводными нуклеиновых кислот.

УФ-активируемая группировка Исследованный НК-белковый комплекс или молекулярно-биологический процесс, полученные результаты Литература

1 5-бромо-2'-дезоксиуридин Исследован тройной комплекс обратной транскриптазы ВИЧ-1 с праймером и матричной цепью РНК. Показано, что обратная транскриптаза взаимодействует с первым неспаренным нуклеотидом матричной цепи. [33]

2 4-тио-2 '-дезоксиуридин Приведена сравнительная характеристика комплексов белков системы эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) XPC-HR23B, RPA и ХРА с поврежденной ДНК. Продемонстрировано, что RPA образует с ДНК более прочный комплекс, чем ХРА, кроме того, ХРА образует больше контактов с поврежденной цепью, a RPA - с неповрежденной. [П]

3 4-тиоуридин N-Домен белка NusA из Escherichia coli, регулирующего элонгацию транскрипции, взаимодействует с РНК-полимеразой в области канала выхода молекулы РНК, а также с синтезирующимся РНК-продуктом. [34]

4 4-тиоуридин При протекании сплайсинга в дрожжах хеликаза Ргр22 взаимодействует с мРНК в нижележащей области по отношению к участку соединения экзонов. [35]

5 4-тиоуридин Исследованы контакты пре-мРНК в комплексе с малым ядерным рибонуклеопротеидным компонентом U11-48К пре-сплайсосомы человека. Продемонстрировано, что U11-48K взаимодействует с 5'-сайтом сплайсинга интрона типа U12. [36]

6 б-тио-2 '-дезоксигуанозин, 4-тиотимидин Изучен комплекс промоторного участка ДНК с РНК-полимеразой Escherichia coli. Фрагмент ДНК, нижележащий по отношению к области -10 нематричной цепи ДНК, взаимодействует с аминокислотными остатками 99-107 cl .2-субъединицы, в то время как другой элемент нематричной цепи гексамер "14ТАТАА~9Т, расположенный в вышележащей области по отношению к точке инициации транскрипции, сближен с о2-субъединицой. [37, 38]

7 4-тиоуридин При изучении положения мРНК относительно 408-субъединицы рибосомы в составе эукариотического комплекса инициации трансляции установили, что мРНК попадает в мРНК-связывающий канал так же, как и в случае прокариотического комплекса. [39]

8 4-тиоуридин Белок S1 Escherichia coli, входящий в состав 308-субъединицы рибосомы, взаимодействует с некодирующей РНК DsrA, которая участвует в регуляции трансляции. [40]

9 4-тиоуридин Определены сайты связывания в микроРНК-компонентах рибонуклеопротеиновых комплексов, включающих белки PUM2, QKI, IGF2BP1-3, AGO/EIF2C1-4 и TNRC6A-C. [41]

10 4-тиоуридин Продемонстрировано взаимодействие участка IGR-IRES дицистровирусов с различными белками 408-субъединицы рибосомы и удаленность этого участка от 18S рРНК. По данным кросс-линкинга наибольшее количество контактов участок IGR-IRES образует с рибосомальным белком S25. [42]

В последнее время подход, подразумевающий образование ковалентной связи между белком и НК с использованием фотоактивируемых производных, чаще применяется не для определения точечных контактов в комплексах, а для изучения и выделения партнеров биомолекул в различных системах. Это связано с тем, что после облучения активная группа может реагировать с различными аминокислотными остатками даже в составе одного комплекса. Кроме того, метод аффинной модификации дает очень ограниченную информацию о структуре нуклеиново-белкового комплекса. В этой связи ковалентное связывание используется для исследования белковых молекул, а также отдельных субъединиц или доменов белка, взаимодействующих с НК, в случае крупных мультисубъединичных комплексов [5-7].

3.1.2. Образование ковалентной связи между молекулами белка и нуклеиновой кислоты с использованием формальдегида

Формальдегид используют для формирования ковалентных нуклеиново-белковых и белок-белковых комплексов между близко расположенными молекулами. Образование конъюгатов может происходить двумя способами: в первом случае нуклеофильная группа белка атакует карбонильную группу формальдегида, а затем происходит взаимодействие с НК; либо на первом этапе нуклеофильная группа НК взаимодействует с формальдегидом, а

потом происходит ковалентное связывание с аминокислотными остатками белка {схема 3.2), С применением методов ЯМР и масс-снектрометрии было показано, что использование

формальдегида для кросс-лиыкинга белков и нуклеиновых кислот приводит к образованию ко валентных связей между остатками Lys, Gys, His, Тгр и dG, dA, dC [43]. Следует отмстить, что наибольшие выходы продуктов реакции наблюдаются при взаимодействии формальдегида с dG и Lys, а также е dG и Cys. В остальных случаях выходы коньгогатов были в 10 и более раз ниже.

Схема 3.2

^СИ, -

о

X, Y - нуклсофильные группировки

X', Y' - остатки нуклеофильных группировок

В настоящее время этот модифицирующий агент не применяется для изучения структуры комплексов биойолекул, однако в работах [44-50] образование ковалентной связи с использованием формальдегида применяли для поиска и выделения биологических партнеров НК в клетках или клеточных экстрактах. В некоторых случаях определяли также, в какой субьедиыице или домене локализована область белка, взаимодействующая с фрагментом нуклеиновой кислоты. В настоящее время формальдегид как сшивающий агент наиболее часто используют при иммунопреципитации хроматина (ChIP). Этот метод активно используется для идентификации разнообразных белков, взаимодействующих с определенными участками генома in vivo и, наоборот, для выявления областей генома, с которыми связан определенный белок. Данный подход позволяет изучать механизмы таких процессов, как репликация, репарация ДНК, транскрипция, а также организацию и механизмы структурных перестроек хроматина [51, 52].

-X

Y

о

3.1.3. Олигонуклсотиды, содержащие апуриновые/агшрнмидиновые сайты

Для изучения ряда ферментов репараций можно использовать подход, основанный на формирований in vitro основания Шиффа между аминогруппой боковой цепи лизина в составе фермента и апуриновым/апиримидиновым участком (All-сайт) в составе олигонуклеотидного субстрата. На первом этапе исследования в составе НК-субстрата генерируют А1 [-сайт с использованием урацил-ДНК-гликозилазы. Образующийся реакдионноспособный фрагмент НК инкубируют с ферментом репарации. Затем полученные конъюгаты стабилизируют с использованием реакции восстановления основания Шиффа до вторичного амина боргидридом натрия (схема 3.3) [53, 54].

Схема 3.3

В настоящее время этот подход, который ранее активно использовался для изучения комплексов репарации из-за относительной простоты проведения эксперимента, чаще

применяется не для структурно-биологических исследований, а с целью поиска и выделения молекулярных партнеров [55]. Однако в ряде работ образование ковалентной связи между белком и фрагментом ДНК, содержащим АП-сайт, было успешно использовано для изучения структуры комплексов системы репарации. Так. авторами [56] было показано, что за проявление дезоксирибо-5'-фосфатлиазной (ЙКР-лиазноЙ) активности ответственен 24-кДа домен в С-концевой области полимеразы 0. В работе [57] использовали конъюгацию с ЗпуриновЫМ участком для изучения структуры белка Кн. который связывается с фрагментами ДНК, содержащими двуцепочечный разрыв. Аналогичным образом исследовали активный центр поли(АДФ-рибоза)-полимеразы 1. участвующей в репарации повреждений ДНК [58]. а также структуру белков и ¡\iFIL2, которые и клетках млекопитающих являются

гомологами бактериальной эндонуклеазы VIII и обладают с1КР-лиазной активностью [59].

Таким образом, химические методы, особенно метод образования ковалентной связи между биомолекулами под действием УФ-света, до настоящего времени используются для структурных исследований в молекулярной биологии. Однако использование этого подхода для изучения структуры НК-белковых комплексов не является оптимальным, так как интерпретация результатов может быть затруднена вследствие возможной неспецифичности реакции, образования множественных продуктов, а также частичной деструкции биомолекул в условиях реакции. Кроме того, аффинная модификация позволяет идентифицировать отдельные аминокислотные остатки, взаимодействующие с определенным участком НК, и не дает полной информации о структуре комплекса в целом.

Тем не менее, метод ко валентно го связывания успешно используется для решения ряда задач. Прежде всего, он позволяет идентифицировать субъсдиницу или домен белка, взаимодействующие с заданным НК-фрагмснтом в комплексе. При изучении мул ьтибел ковы х комплексов, образующихся, например, при репликации, репарации, трансляции и т.п.. кросс-линкинг дает возможность определить, какой белковый компонент взаимодействует с определенным участком НК [5-7]. Кроме того, в ряде работ ковалентное связывание с использованием реакционноспособных производных нуклеиновых кислот используется как этап, предшествующий кристаллизации НК-белкового комплекса и изучению его структуры методом РСА. Работы, в которых успешно использовалась стратегия кристаллизации ковалентно связанных структур, подробно рассматриваются в обзоре В, Вердина и Д. Норманна 2003 г, [60].

3.2. Физические методы структурной биологии 3.2.1. Рентге неструктурный анализ

В последние 30 лет РСА и методики кристаллизации белков и их комплексов с различными лигандами активно развивались. В этой связи появляется все больше работ, в которых рентгеновскую кристаллографию применяют для исследования активного центра Н К-связывающих белков. На сегодняшний день методами РСА охарактеризовано уже более 1500 кристаллов белков, связанных с нуклеиновыми кислотами, то есть большая часть структур комплексов высокого разрешения получена с использованием рентгеновской кристаллографии [61-63], В настоящем обзоре мы рассматриваем только некоторые характерные примеры исследования 11 К-белковых комплексов методом РСА.

Основные этапы изучения структуры биомодекул с использованием рентгеновской кристаллографии представлены на рис. 3.1.

с

А

Рис. 3.1. Основные этапы изучения структуры биомолекулы методом РСА на примере анализа аденовирусной протеазы [64]. А. Кристаллы белка протеазы аденовируса. Ь. Дифракционная картина кристаллов белка протеазы аденовируса. В. Карта электронной плотности, рассчитанная из дифракционной картины. Г. Интерпретация карт электронной плотности с использованием аминокислотной последовательности.

В некоторых работах Метод РСА используют вместе с ковалентной фиксацией компонентов комплексов. В этом случае для изучения структуры па первом этапе часто осуществляют ковалей гное связывание ПК-лиганда с белком, что значительно упрощает получение кристаллов, особенно в случае не очень прочных комплексов [65]. Для этих целей наиболее часто применяют реакцию образования дисульфидной связи. При этом используют ПК-фрагмент, содержащий меркапто- или д и сульфидную группу, а в активный центр бежа методом мутагенеза вводят остаток цистсина (схема 3.4) [66].

Схема 3.4

Cys Cys

,J SJ

Некоторые примеры исследования UK-бол коны x комплексов методом РС'Л представлены в табл. 3.4, примеры полученных структур приведены на рис. 3.2.

Таблица 3.4. НК-белковые комплексы, исследованные методом рентгеиоструктуриого анализа.

Метод исследования Исследованный НК-белковыи комплекс пли молекулярно-биоло! инескнн процесс Литература

1 РСА ковален'гно связанного комплекса* Механизм сканирования неповрежденной ДНК репарирующим ферментом 8-оксагуанин-ДНК-гл и к о зил аз ой 1 человека [67]

2 РСА ковалентно связанного комплекса* с активацией ферментативной реакиии в кристалле Комплекс фермента оксигеназы AikB системы репарации Escherichia coli с поврежденной метилированной ДНК [68]

3 РСА ковалентно связанного комплекса* Комплексы ферментов оксигеназы Alkß и АВН2 систем репарации Escherichia coli и человека с поврежденной и неповрежденной ДЩ (рис. 3.2 А) [69]

4 РСА ко валентно связанного комплекса* Комплекс гетрамера транскрипционного фактора р53 человека с ДНК-лигандом (рис. 3.2 В) [70]

5 РСА Комплекс ТАТ-участка вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1 с циклин-зависимой кипазой Cdk9 и циклипом'П человека [71]

6 РСА фрагментов РНК-полимеразы в сочетании с методами молекулярного моделирования и криоэлектронной микроскопии для изучения полноразмерного комплекса Элонгационный комплекс РНК-полимеразы Escherichia coli [72]

7 РСА Комплексы белка LexA SOS-системы репарации из Escherichia coli с ДНК-субстратами разной длины и последовательности (рис. 3.2 В) [73]

8 РСА, электронная микроскопия, малоугловое рассеяние рентгеновских лучей Обобщены сведения об исследовании различных комплексов системы репарации двуцепочечных разрывов по пути негомологичного соединения концов (NHFJ) у человека. [74]

*Белок и нуклеиновая кислота соединены между собой дисульфидиой связью.

Рис. 3.2. Примеры НК-белковых комплексов, изученных методом PC'А. А. Комплекс фермента оксигеназы AlkB системы репарации Е. coli с неповрежденной ДНК [69]. Б. Комплекс тетрамера транскрипционного факгора р53 человека с ДНК-лигандом ¡"70]. В. Комплекс белка Lex А SOS-системы репарации Е. coli е Д1 П<-субстратом. Субъедшшцы белка окрашены синим и розовым цветами; основания, составляющие консснсусную последователи ость, - голубым [73].

Поскольку с помощью РСА можно охарактеризовать только кристалл белка или НК-белкового комплекса, этот метод пе подходит для изучения динамики конформационных изменений структуры, например, при узнавании НК-лигапда белком. Несмотря на это с использованием РСА можно проводить сравнение и анализ двух различных структур - белок в комплексе со специфическим и песпецифическим дигандами. Такой подход позволяет Получить представление о структуре переходных состоянии и конформационных изменениях, происходящих в процессе HK-белкового узнавания. Например, он был успешно использован для изучения структуры комплекса эндонуклеазы рестрикции EcoRV с ДНК (рис. 3.3) [75].

Рис. 3.3. Структура эндонуклеазы рестрикции EcoRV в ано-форме (А), в комплексе с Неспецифическим Д11К-лигандом (Б) и в комплексе с Д1 IK-субстратом (В).

В 2010 г. была опубликована работа [68], авторам которой удалось зафиксировать переходное состояние фермента репарации, осуществляющего де метилирование поврежденной ДНК. и проанализировать его методом PC А. Для изучения механизма устранения поврежденного нуклеотидного звена оксигеназой Е. coli были получены и закристаллизованы ко валентно связанные комплексы AI kB с метилированным и немегилированным ДНК-субстратам и. Фермент осуществляет репарацию путем окислительного де метилирован и я и поэтому неактивен в отсутствие кислорода. Рост кристаллов осуществляли в анаэробных условиях. После этого инициировали репарацию ферментом AlkB при взаимодействии с кислородом воздуха и изучали переходные состояния in erys¡alio методом PCA.

В заключение необходимо отметить, что основной прогресс рентгеновской кристаллографии обеспечен развитием синхротронных источников, применяемых для РСА. а также методов кристаллизации НК-белковых комплексов [65, 76],

3.2.2. Ядерный магнитный резонанс

Для решения некоторых задач молекулярной биологии необходимо исследовать строение комплексов в растворе, что исключает использование рентгеновской кристаллографии. В этом случае для получения структуры с высоким разрешением применяют ЯМР-спектроскопинэ [77]. Следует отметить, что в последние 5 лет произошло существенное развитие методов ядерного магнитного резонанса, и в настоящее время по своей разрешающей способности (~2 А) ЯМР не уступает рентгеновской кристаллографии.

В отличие от метода РСА, который характеризует структуру комплекса, tío не дает представления о различных этапах ДНК-белкового узнавания и связывания, ядерный магнитный резонанс позволяет изучать НК-белковые взаимодействия в растворе и динамику образования комплекса. Основные этапы изучения структуры биомолекулы методом ЯМР представлены на рис. 3.4.

А

В

2D NOE Spectrum

ICH3 ОН3

*': \/

6С'Н ; О

• .I.* II

_ I/ 1

^н : н

— Chemical Shift (ppm)

Рис, 3.4. Основные этапы изучения структуры бйомолекульт методом ЯМР па примере анализа бычьей панкреатической рибонуклеазы А [78]. А. Схематическое представление фрагмента 2D NOESY ЯМР-спектра белка. Б. Корреляция между атомами водорода в пептидном остатке. В. Структура бычьей панкреатической рибонуклеазы А. Суперпозиция структур, полученных в результате 20 измерений. Усредненная структура имеет наибольшую достоверность. Полипептидная цепь выделена голубым цветом, боковые группы, находящиеся внутри структуры белка, выделены зеленым цветом, боковые группы, взаимодействующие с молекулами воды, выделены красным цветом.

Сйёдует отметить, что различные ме тоды ЯМР-спектроекопии часто используются для сравнительного исследования структурных особенностей специфических и неспецифических комплексов, как, например, в работе [79]. В некоторых случаях ЯМР, так же как и рС1 птеиоструктурный анализ, используют в сочетании е кросс-липкингом [80].

В последнее время широкое распространение получила методика, основанная на явлении парамагнитного усиления релаксации в ЯМ Р - с п е кт р о с к оп и и. Этот эффект наблюдается при включении в состав биомолекулы парамагнитного соединения. В качестве такой молекулы могут выступать ионы металлов, например, марганца или лаптанидов, которые хелатируются остатком ЭДТА, ковалентно присоединенным к биомолекуле [81-83]. Кроме того, в некоторых работах [84-86] для наблюдения эффекта усиления, релаксации в состав молекулы белка включается Ы-оксильный радикал ((1-оксил-2,2,5,5-тетраметил-3-] 1 ирро л и н -3 - м ети л)м стан ти осул ьф о н ат) (схема 3.5). Такой подход часто применяется для исследования переходных состояний НК-белковых комплексов.

Схема 3.5

О* О*

В настоящее время, несмотря на активное использование подходов ЯМР для структурно-биологических исследований, основным ограничением этого метода является размер комплекса, масса которого не может составлять более 100-120 кДа ("87].

Некоторые примеры исследования ПК-белковых комплексов методом ядерною магнитного резонанса представлены в табл. 3.5, на рис. 3.5.

Таблица 3,5, НК-белковые комплексы, исследованные методом ядерного магнитного резонанса.

Метод исследования Исследованный НК-белковый комплекс или молекулярно-биологический процесс Литература

1 !Н-1Н Ю ШЕ5У, 1Н-13С-'^ ЗЭ ШЕЗУ-НБСЗС Стадии образования комплексов ¿«с-репрессора с различными ДНК-фрагментами, содержащими операторную последовательность. Комплексы ¿ас-реп рессора со специфическим и нее п с пифическим ДНК-фрагментами (рис. 3.5 А) [77]

2 т нз<}с Комплексы эндонуклеазы рестрикции РтаП со специфическими и неспецифическими ДНК-лига нда ми [79]

3 2Э НЭрС ковалентно Связанного комплекса Комплекс убиквитин-подобного белка 8иМО-1 с ДНК-лигандом (рис. 3.5 Б) [80]

4 'н-'-'ы 20 нйдс Комплекс гомеодомена транскрип- [88]

ционного фактора НохЭ9 с Д11К-

лигандами (рис. 3.5 В)

5 !Н-'^20НМ0С 'н-'нго тмоезу Комплекс гистонного белка Н1 с ДНК-лигандом [87]

А

В

.. < и ъеъ

гс] * М 1 ; 4

Неспецифичеекий комплекс

1

): 1 ^ ^ V

1ЯЯ О/'-

Специфический комплекс

Рис. 3.5. Примеры НК-белковых комплексов, изученных методом ЯМР. А. Фрагмент структуры комплекса ¿дс-репрессора с неспецифическим Д11К-фрагментоМ [77]. К. II структуре убиквитин-подобиого белка 8иМО-1 цветом отмечены аминокислотные остатки, взаимодействующие с ДНК-лигандом. Аминокислотные остатки были определены сравнительной характеристикой ЯМР-снектров белка и комплекса белка с ДИК [80], В. Комплекс гомеодомена транскрипционного фактора НохЛ9 со специфическим и неспецифическим ДНК-лигаидамв. Розовым цветом выделены аминокислотные остатки, взаимодействующие с Д11К [88].

3.2.3. Сравнение методов ЯМР-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа для исследования НК-белковых комплексов

Некоторые работы включают сравнение анализа Д1 П<-белковых комплексов методами ЯМР-спектроскопии и рентгепострукгурпого анализа. Например, авторы [89] исследоВ&ли структуру гомеодомена фактора транскрипции белка Antemiapcdia из Drosophilct mclanogaster в комплексе с участком ДНК. Данные РСА в целом согласуются с данными NOE-спсктроскопии. Часть отличий в результатах экспериментов объясняются подвижностью N-концевого домена, а некоторые невозможно объяснить в рамках предложенной авторами структурной модели. В статье [90] с помощью методов рептгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии исследовали структуру комплекса поли(С)-связывающего белка-2 с ДНК- и РНК-лигандами, однако сравнения результатов, полученных этими методами не проводили.

В настоящее время ЯМР-спекгроско11ия является единственным методом для изучения структуры макромолекул на атомном уровне в растворе [91]. Использование Я MP позволяет анализировать движение доменов макромолекул относительно друг друга или рассматривать разные стадии образования комплекса. Наличие большого количества различных методов ядерного магнитного резонанса и возможность их одновременного использования для исследования комплекса часто позволяет получить более полную и точную информацию о структуре. Например. NOESY позволяет оценить сближенность различных ядер в пространстве, a COSY - взаимодействия между атомами через одну - четыре химические связи [91]. Основным недостатком метода является сложность анализа спектров больших молекул. ! !а сегодняшний день большинство проанализированных структур ДНК-белковых комплексов и белков имеют вес < 100 кДа. Опубликовано лишь несколько работ, в которых были охарактеризованы более крупные белки, ДНК-белковые и белок-белковые комплексы [87, 92,93].

В отличие от ЯМР-спектроскопии рентгеноструктурный анализ позволяет анализировать комплексы большого размера с высоким разрешением (-2 А). Основным недостатком этого метода является необходимость этапа кристаллизации, которая часто бывает трудоемкой, кроме того, получить кристаллы некоторых белков или НК-белковых комплексов не удается.

При обсуждении современных структурно-биологических методов анализа необходимо упомянуть о криоэдектрониой микроскопии и SAXS. Следует отметить, что

структуру больших или слишком подвижных для использования методов ЯМР и РСА биомолекул и их комплексов часто анализируют с помощью криоэлектронной микроскопии. В этом случае можно получить изображение комплекса в природном окружении, кроме того, не требуется больших количеств образца. Однако разрешающая способность этого метода ниже и составляет 5-15 А. С помощью электронной микроскопии были исследованы сложные комплексы макромолекул, такие как, например, рибосома из Escherichia coll или капе ид вируса гепатита В [94].

Для исследования и особенно для предварительного анализа комплексов биомолекул в растворе широко применяется метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, который позволяет характеризовать структуры различных размеров В растворе с разрешением -1-2 нм. Однако это ограничение в некоторой степени компенсируется возможностью быстрого анализа образца и обработки данных. Таким образом, метод SAXS является удобным для быстрого исследования набора образцов в различных условиях, что может быть полезным, например, при оптимизации условий кристаллизации [3. 95]. В последнее время для решения задач структурной биологии используется также метод малоуглового рассеяния нейтронов. В этом случае изменить рассеивающие свойства частицы по отношению к рассеивающим свойствам растворителя значительно проще. Например, в одном из вариантов, который получил широкое распространение в силу своей простоты, для исследования образца предлагается использовать смесь легкой и тяжелой воды, плотности амплитуд рассеяния которых отличаются не только по величине, но и по знаку. Одним из первых интересных открытий, сделанных с использованием этого метода, было доказательство существования гидрофобного ядра в глобулярных белках, исследования распределения РНК и белка в сферических и палочкообразных вирусах, демонстрация наличия в нуклеосомах белкового ядра [96].

Наиболее перспективным для исследования биомолекул и их комплексов представляется одновременное использование сразу нескольких методов изучения структуры [97]. Одним из наиболее ярких примеров успешного использования этой стратегии для изучения сложных биологических систем является характеристика структуры вирусов с помощью электронной микроскопии и рентгеноструктурноiч> анализа (рис. 3.6) [98].

Рис. 3.6. Структура комплекса вируса Коксаки ВЗ с рецепторами Коксаки-аденовируса (САК) [98]. Вирус выделен серым цветом; внеклеточная часть рецепторов — красным, а трансмсмбранная и цито плазматическая части - зеленым цветом.

Таким образом, очевидно, что дальнейшее усовершенствование методов исследования структуры биомолекул и возможность их совместного использования позволяет преодолевать недостатки каждого отдельного метода и решать все более сложные задачи структурной биологии.

3.3. Исследование структурных особенностей рибонуклеазы Р

Детальная информация о структуре и функции рибопуклеазы Р (РНКаза Р) обобщены в литературе [99-103]. Тем не менее в рамках настоящего обзора рассмотрено пространственное строение РНК-компоненты и белка бактериальной РНКазы Р. а также их взаимодействие в составе холофермента, поскольку в данной работе для изучения химических свойств альдегидных олигорибонуклеотидов в качестве модельного объекта использовалась бактериальная рибонуклеаза Р.

Функцией рибопуклеазы Р является каталитическое отщепление 5'-ко1щевой последовательности предшественника тРНК (ире-тРНК) с образованием РНК-фрагментов, один из которых содержит З'-гидроксильпую, а другой - 5'-фосфатную группы (рис. 3.7) [104. 105]. Такой характер гидролиза отличается от реакций с участием рибозимов или РНКазы А, которые гидролязуют РНК с образованием продуктов, содержащих 2',3'-циклофосфат и 5'-гидроксильную группу. Механизм расщепления рибонуклеазой Р является схожим с механизмом гидролиза РНК нитронами I и [I групп [106]. Следует отметить, что

субстратами для РНКазы Р также могут быть предшественники 4.5S РНК [107-109], транспортно-матричноЙ РНК [110], мРНК из п ол и цистрон аого и лактозного опер о нов [111, 112], а также некоторые переходные структуры и §| и боп ерек л ючате л ях [113, II4J и другие [ЮЗ].

РНКлза Р

5'

ССА-3'

пре-тРНК

5'-

©

гССА-3'

Рис. 3.7. Гидролиз пре-тРНК рибонуклеазой Р с образованием молекулы тРНК, содержащей на 5'-конце фосфатную группу, и 5'-концевой последовательности с гидроксильной группой на 3'-конце [115].

Рибоиуклеаза Р обнаружена в трех надцарствах: у бактерий, архей и зукариот (рис. 3.8). Почти все РНКазы Р содержат в своем составе РНК- и белковые субъединицы. Исключение составляют РНКазы Р из митохондрий [116-118] и хлоропластов некоторых растений, которые не содержат РНК [119, 120].

Рибоиуклеаза Р является металлоферментом. Присутствие ионов двухвалентного металла, например, , необходимо для протекания каталитической реакции [121]. Кроме того, такие ионы необходимы для правильного формирования РНК-компоненты бактериальной РНКазы Р [122, 123] и стабилизации конформационных изменений структуры фермент-субстратного комплекса, которые происходят до катализа [124].

Бактерии

Ар\си

Jy кар йоты

Рис. Схематическое изображение бактериальной, архейной и эукариотической РНКазы Р. РНК-субъединица обозначена темно-синим цветом, бактериальный белок - зеленым. Гомологичные белки архей и эукариот изображены розовым цветом, голубым цветом выделены белки, которые принадлежат только эукариотической РНКазе Р. Дополнительный белок у архей или эукариот показан серым цветом.

Бактериальная рибонуклеаза F состоит из РНК-компоненты (-400 и.о.; -130 кДа) и одной субъединицы белка (-120 а.о.; -13-14 кДа), кодируемых генами гпрВ и гпрА, соответственно [125. 126]. РНК РНКазы Р каталитически активна in vitro в условиях высокой ионной силы [127], однако для проявления се активности т vivo необходим белок [128].

РНКазы Р архей и эукариот имеют более сложную структуру, чем бактериальная рибонуклеаза Р. Кроме Р! IK-компоненты Р11Каза Р архей содержит 4 белковых субъединицы Рор4, Pop5, Rppl и Rpr2, гомологичные белковым компонентам эукариотической РНКазы Р [129, 130]. Однако недавно было показано, что некоторые архейные РНКазы Р могут содержать дополнительный пятый белковый компонент: рибосомный белок L7Ac, который увеличивает скорость гидролиза пре-тРНК и термическую устойчивость фермента [131, 132]. Вероятно, белок L7Ae меняет конформацию РНК и тем самым способствует эффективному связыванию остальных белковых субъединиц РНКазы Р с РНК [133].

Зукариотическая рибонуклеаза Р содержит девять [134] или десять [135] взаимодействующих белков, роль которых до конца неясна. Возможно, мультисубъедштчный белковый комплекс необходим для увеличения специфичности связывания и процессинга субстрата, а также стабилизации третичной структуры PIIK-субъединицы [135-137].

РНК-компоненты рибоиуклеаз Р трех над царств каталитически активны in vitro [127, ¡37-140]. Однако в сравнении с РНК РНКазы Р бактерий скорость гидролиза субстрата РНК-комнонентой рибонуШтеазы Р человека в отсутствие белков снижается на 5-6 порядков [137]. Падение каталитической активности, вероятно, связано с отсутствием третичных взаимодействий, стабилизирующих структуру РНК, которые были найдены у бактерий и архей, но не у эукариот.

3.3.1. РНК-субъсдиннца бактериальной рибонуклсазы Р

По вторичной структуре РНК бактериальной РНКазы Р можно разделить па два основных типа: наиболее общий тип А (анцестральный), обычно представленный РНКазой Р из Escherichia coli (рис. 3.9 А), и тип В (Bacillus, найденный в грамположительных бактериях с низким содержанием G*C пар в РНК-субъедииице), обычно представленный РНКазой Р из Bacillus sub tilis (рис, 3.9В) [141].

Структурные различия между А- и B-типами РНК главным образом заключаются в разном количестве спиральных участков и их распределении (рис. 3.9) [141, 142]. Однако в целом пространственные структуры РНК похожи [143, 144] и взаимозаменяемы ш vitro [127] и ш viva [145, 146].

РНК-компонента РНКазы Р состоит из двух доменов: специфический домен (S-домен), который вовлечен в узнавание и связывание субстрата, образуя контакты с псевдоуридиловой и дигидроуридиловой петлями пре-тРНК [147-149], и каталитический домен (С-домен), который содержит активный центр фермента и взаимодействует с 5"-концом и З'-ССА последовательностью тРНК [149, 150] (рис. 3.9). Кроме того, С-домен образует специфический комплекс с белковой компонентой РНКазы Р [151]. Методом футриитипга авторами работ [152, 153] было показано, что оба домена формируются независимо друг от Друга.

А

Б

Р12.;:

8-домен

Л1/12в

„Л 2/11 \ П 1

У 131

Ш211.-1

Р9 > тМт> / Р7 рЛ

ОД * ------

С-домен

Р1?

Р8<

" 1 СААС!«СС ^«ан:' & Р1

-'.¡и// * I I I I »111 1НН1

? РЩ Р15 '*Щ

I I I

.-с1: и

*7-

А-;: Ц МЛСС II I I »•* I -

1

Р6

НИМ111М1И1.М \ А

.. со-; су. «С у^С у «««с \, ?

РЗ Ь \ р2

д-и

р 1

слсв*^

Р4 5

ВДЗСССЛ

12 ш

т !

Похожие диссертационные работы по специальности «Биоорганическая химия», 02.00.10 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Хомякова, Елена Алексеевна

6. выводы

1. С использованием З'-амидофосфита 2'-0-[2-(2,3-диацетоксипропил)амино-2-оксоэтил]-5'-0-(4,4'-диметокситритил)-#3-пивалоилоксиметилуридина впервые синтезированы модифицированные олигорибонуклеотиды, содержащие в 2'-положении углеводного фрагмента 1,2-диольные и альдегидные группировки.

2. Показано, что встраивание в олигонуклеотидную цепь модифицированных остатков уридина, содержащих 1,2-диольные группировки, существенно не влияет на термическую стабильность ДНК-, РНК- и гибридных дуплексов.

3. Данные, полученные при проведении кросс-линкинга в присутствии ДНК-конкурентов, показывают, что реакция 2'-оксоэтильных и 2'-диоксоазапентильных дуплексов с метилтрансферазой ЗэоН носит неизбирательный характер, что свидетельствует о снижении специфичности узнавания на фоне параллельного протекания реакции между е-аминогруппой остатка лизина белка и альдегидной группировкой или о возможном наличии двухстадийного механизма узнавания белком ДНК-лиганда.

4. Ковалентное связывание 2'-диоксоазапентильных олигорибонуклеотидов с белком РНКазы Р носит неизбирательный характер, так как, по-видимому, быстрое протекание химической реакции препятствует специфическому взаимодействию белка с лигандом.

5. Предложен новый эффективный метод получения 2'-гидразидных производных ДНК и РНК. Показано, что 2'-гидразидные олигонуклеотиды могут быть успешно применены для конъюгации с различными ароматическими и алифатическими альдегидами.

4.8. Заключение

В настоящей работе продемонстрирована возможность использования альдегидных и гидразидных производных нуклеиновых кислот для получения конъюгатов с различными низкомолекулярными соединениями и белками. В рамках исследования свойств альдегидных производных РНК была предложена оригинальная методика для встраивания коротких олигорибонуклеотидов в протяженную молекулу РНК, что позволяет вводить в состав нуклеиновой кислоты разнообразные функциональные группировки. Такие протяженные

РНК, содержащие химически активные или репортерные группы, могут быть применены для решения различных задач молекулярной биологии и химии нуклеиновых кислот.

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы: 5-этилтио-Ш-тетразол (Glen Research, США); дигидразид янтарной кислоты (Lancaster, Великобритания); S-аденозил-Ь-метионин (AdoMet), предварительно прокрашенные маркеры молекулярных масс белков 20-120 кДа (SM0441) и 10-170 кДа (SM0671), маркер молекулярной массы белков 10-200 кДа (SM0661), буфер для Т4 ДНК-лигазы, дитиотреит (ДТТ), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Литва); poly(dl-dC) (Midland Certified Reagent Company, США); хлорометилпивалат (PomCl), гидросульфат тетрабутиламмония (TBAHS), бензилбромоацетат, 4,4-диметиламинопиридин (DMAP), тригидрофторид триэтиламина (Aldrich, США); этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) (Amresco, США); хлорид магния, ß-меркаптоэтанол, ацетат натрия, ацетат аммония, перхлорат лития, периодат натрия, цианборгидрид натрия, формамид, метиламин, 3-амино-1,2-пропандиол, 1,3-дихлор-1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан, wpem-бутилимино-отрмс(пирролидино)фосфоран (ВТРР), бмс(МА^-диизопропиламино)-2-цианэтоксифосфин, 4,4'-диметокситритил хлорид (DMTrCl), триэтиламин, (Fluka, Швейцария); 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфокислота (HEPES), спермин, спермидин, хлорид натрия, додецилсульфат натрия (ДСН), Tween 20 (Sigma, США); глицерин (Serva, Германия); красители-маркеры бромфеноловый синий, ксиленцианол (Reanal, Венгрия); [у-32Р]-АТФ (Изотоп, Россия).

2-Гидрокси-1 -нафтальдегид, антрацен-9-карбальдегид, 4-диметиламинокоричный альдегид, 3-(4-трет-бутилфенил)пропаналь, 4-гидрокси-З-метоксибензальдегид были любезно предоставлены научным сотрудником Химического факультета МГУ Волковым Е.М. Перилен-3-карбальдегид и пирен-1-карбальдегид были любезно предоставлены научными сотрудниками Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Коршуном В.А. и Прохоренко И.А.

Ферменты и белки. Рекомбинантные формы ДНК-метилтрансферазы SsoII и эндонуклеазы рестрикции SsoII, содержащие 6 остатков гистидина на N-конце белковой молекулы, выделены из культуры клеток Е. coli методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе. Концентрация белка в препаратах составляла 8 пмоль/мкл (R.SsoII) и 40 пмоль/мкл (M.SsoII).

Рекомбинантный белок В. subtilis рибонуклеазы Р, содержащий 6 остатков гистидина на iV-конце белковой молекулы, выделен из культуры клеток Е. coli JM109. Экспрессию, выделение и очистку белка проводили по стандартным методикам с использованием Ni-NTA-агарозы [245, 246]. Концентрация его составила 105 пмоль/мкл.

Полинуклеотидкиназа фага Т4, ингибитор РНКаз RiboLock™ RNase Inhibitor, Т4 ДНК-лигаза - коммерческие препараты производства Fermentas.

Буферные растворы:

Al: 5% ацетонитрил, 48 мМ калий-фосфатный буфер, содержащий 2 мМ дигидрофосфат тетрабутиламмония, рН 7.0;

Б1: 40% ацетонитрил, 48 мМ калий-фосфатный буфер, содержащий 2 мМ дигидрофосфат тетрабутиламмония, рН 7.0;

А2: 0.1 М ацетат аммония, рН 7.0;

Б2: 0.1 М ацетат аммония, 50% ацетонитрил, рН 7.0;

В: 0.4 М ацетат натрия, рН 4.0-4.5;

Г: 50 мМ Трис-НС1, 150 мМ NaCl, рН 7.5;

Д: 10 мМ Трис-НС1, 10 мМ MgCl2, 0.05% глицерин, 0.01% Tween 20, 1/10000 (v/v) флуоресцентного красителя SYBR Green I;

Е: 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ MgCl2, 5 мМ ДТТ, рН 7.6;

Ж: 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 50 мМ ДТТ, рН 7.6;

3: 50 мМ Трис-НС1, 150 мМ NaCl, 5 мМ Р-меркаптоэтанол, рН 7.6;

И: 50 мМ Трис-НС1, 150 мМ NaCl, 5 мМ Р-меркаптоэтанол, 0.5 мкг poly(dl'dC), рН 7.5;

К: 50 мМ Трис, 50 мМ Н3В03, 1 мМ ЭДТА, рН 8.3;

JI: 50 мМ Трис-НС1, 2% глицерин, 1% ДСН, 0.05%> Р-меркаптоэтанол, 0.1% бромфеноловый синий, рН 6.8;

М: 20 мМ HEPES-KOH, 150 мМ NH4OAc, 2 мМ спермидин, 0.05 мМ спермин, 4.5 мМ MgCl2, 4 мМ Р-меркаптоэтанол, рН 7.4;

Н: 50 мМ HEPES-KOH, 150 мМ NH4OAc, 4.5 мМ MgCl2, 4 мМ p-меркаптоэтанол, рН 7.4; О: 25 мМ Трис-НС1, 6% глицерин, 1% ДСН, 1% р-меркаптоэтанол, 0.01% бромфеноловый синий, рН 6.8.

Растворы:

Р1: концентрированный водный аммиак и этанол, 3:1 (v/v);

Р2: концентрированный водный аммиак и 40% водный метиламин, 1:1 (v/v);

РЗ: 66% формамид, 2.6 M мочевина, 2Х буфер К, 0.02% бромфеноловый синий и ксиленцианол.

Спектры ЯМР !Н, 13С и 31Р регистрировали на приборах Bruker DRX-500, АМ-300, WM-250 (500.13, 300.13 МГц для !Н; 75.47, 62.90 МГц для 13С; 121.50 МГц для 31Р) в CDC13, используя примесь СНС13 как внутренний стандарт. При расшифровке 2D спектров использовали COSY- и HSQC-методики, адаптированные для данного прибора. Химические

1 1 'Я сдвиги (м.д., погрешность 0.01 м.д.) приведены относительно (CHa^Si (H, С) и 85%-ного

5 1 водного раствора Н3РО4 ( Р). Указаны константы спин-спинового взаимодействия (./, Гц, погрешность 0.5 Гц). Масс-спектры MALDI-TOF регистрировали на приборах Voyager DE Biospectrometry Workstation (PerSeptive Biosystems) и Bruker Microflex (Bruker Daltonics). Для олигонуклеотидов в качестве матрицы использовали смесь 3-гидроксипиколиновой кислоты и двухосновного цитрата аммония. Перед нанесением образцы обрабатывали катионно-обменной смолой в аммониевой форме для удаления примесей щелочных и щелочноземельных металлов. Для низкомолекулярных веществ в качестве матрицы применяли растворы 2,5-дигидроксибензойной кислоты (2,5-DHBA) (10 мг-мл"1 в метаноле) или 2,4,6-тригидроксиацетофенона (2,4,6-ТНАР) (10 мг-мл"1 в 50%-ном водном ацетонитриле). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) осуществляли на алюминиевых пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck). Вещества, поглощающие в УФ-области, обнаруживали при облучении УФ-светом с длиной волны 254 нм в виде темных пятен на флуоресцирующем поле. Соединения, содержащие диметокситритильную группу, идентифицировали при обработке хроматографической пластинки парами трифторуксусной кислоты. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле 60 (BDH).

Синтез 3-1111валоилоксн1иетил-2,-0-[2-(2,3-диацетокси11ронил)амино-2-оксоэтил]-3'-0-(Л^У-д11и:т11ро1П1лам1шо-2-цна11этокс11фосф|!1Шл)-5'-0-(4,4'-диметокснтри'1и:|)ур11Д11на

Уридин 5.1 {4.88 г. 20 ммоль) высушивали переупариванием в вакууме с абсолютным пиридином (ЗхЗО мл), растворяли в 100 мл абсолютного пиридина и добавляли при перемешивании и охлаждении на ледяной бане 1,3-дихлор-1 J ,3,3-тетраизопропилдисилоксан (6.72 мл, 21 ммоль}. Реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 12-18 часов. Полноту прохождения реакции контролировали методом ТСХ (СНС'Ь/ЕЮН 95:5, v/v). После полного исчезновения исходного вещества в реакционную смесь добавляли 3 мл метанола. Реакционную смесь упаривали до масла, растворяли в 150 мл этилацетата и промывали 5%-пым раствором NaHCO^ (2х 150 мл). Объединенные органические вытяжки высушивали над безводным Na^SO^. Осушитель отфильтровывали, реакционную смесь концентрировали до масла в вакууме. Остаток переупаривали с толуолом (3Х30 мл), хлороформом (3Х30 мл) и хроматографировалн па колонке с силикагелем. Элюировали градиентом EtOAc в Ci 1С13

0—10^40%, v/v). Выход 5.2 в виде белой пены 9.05 г (93%). Rr 0.45 (CHCb/EtOH 95:5, v/v). !Т-ЯМР (CDCb, S, м.д): 163.24 (C4); 150.03 (C2); 139.98 (C6); 101.95 (C5); 90.99 (СГ); 81.98 (C41); 75.17 (C2'); 69.07 (C3'); 60.38 (C5'); 17.44-16.83 (CH(CH3)2); 13.41. 13.12, 12.96, 12.56

4.1b) 1182]

3',5'-0-(Тсграизопропилд1!склоксаН"1,3-диил)уридин (5.2)

CM(CH02).

3-Т1ивалоилоксиметил-3,,5,-0-('гсграи:1011ропилдиси:ткса11-1,3-дипл)урилии (5.3)

О О О

Соединение 5.2 (9.05 г, 18.6 ммоль) растворяли в смеси хлористого метилена (150 мл) и 0.2 М раствора карбоната натрия (300 мл), затем при сильном перемешивании добавляли хлормегиловый эфир пивали новой кислоты (26.8 мл, 186 ммоль) и гидросульфат тетрабутиламмония (1.26 г, 3.72 ммоль). Реакционную смесь оставляли при сильном перемешивании на 48 часов при комнатной температуре (ТСХ в СНСЬ/ЕЮИ 98:2. у;/у). после чего отделяли органическую фазу и промывали ее 5%-ным раствором К'аНСО* (2*150 мл). Объединенные органические вытяжки высушивали над безводным N33804. Осушитель отфильтровывали, реакционную смесь концентрировали в вакууме, переупаривали с бензолом (Зх50 мл) и хроматографировали на колонке с силикагелем. Элюировали градиентом ЕЮАс в бензоле (0—>2—>4~-»6—^>8—>10%, vlv). Выход соединения 5.3 в виде белой немы 8.41 г (70%). Щ 0.34 (СНС13/ЕЮН 96:4, уН). Спектр ЯМР 'н (С1)С1>, 5, м.д. .//Гц): 7.82 (д, 1 Н, Н6,Л6 = 8.0); 5.95 (с, 2 Н, СЬЬОСОВп1); 5.82 (д, 1 Н, Н5); 5.75 (каж. т, 1 Н, НГ); 4.33 (уш. с, 2 Н, Н2\ ИЗ'); 4.15 (м, 1 Н, Н4'); 3.98 (д, 1 Н, На5',.7?Х5Ъ= 12.0); 3.82 (д, 1 И, Нй|'); 1.20 (с, 9 Н, Ви'); [.10-0.80 (м, 28 Н, Рг1). Спектр ЯМР ВС (ШС13, 6, м.д.): 178.00 (С1ЬОСОВи1); 161.75 (С4); 151.50 (С2); 140.02 (Об); 101.85 <С5); 92.58 (С'Г); 85.33 (С4'); 74.97 (СТ); 70.20 (СЗ'); 64.58 (СН2ОСОВн1); 61.65 (С5'| 38.92 (С(СН3)3); 27.01 (С(СН3)3); 17.09 (СН(СН3)2); 13.39-12.85 (СЫ(С113)2). Масс-спектр (МЛЫМ-ТОР, 2,5-ОЫВА), т/г: найдено 624.05, вычислено для [М+]^а]+ 623.84; найдено 641.77, вычислено для [М+К)+ 639.95.

3-Пнвало11локснметнл-2,-0-(2-бе1анлокси-2-оксоэтил)-3,,5,-С>-(тетраизо11ро1]и;1-дисилоксан-1,3-диил)уридин (5.4)

Соединение 5.3 (8.41 г. 14 ммоль) высушили упариванием с абсолютным ацетон итрилом (3*50 мл), растворили в 300 мл смеси абсолютных ТГФ и ацетонитрила (1:1, v/v) и добавили бензилбромацетат (5.54 мл. 35 ммоль) и ВТРР (11.98 мл, 39.20 ммоль). Полноту прохождения реакции контролировали по ТСХ (CHCl3/EtOH 97:3, v/v). Реакционную смесь оставили на ночь, после чего концентрировали в вакууме, остаток (масло) упарили с бензолом (3х50 мл) и выделили целевой продукт колоночной хроматографией (градиент EtOAc в бензоле 0-^2—>4—>6%, v/v). Выход соединения 5.4 в виде бесцветной пены 9.54 г (91%). Äf 0.31 (СНСЦ/ЕЮН 97:3, v/v). Спектр ЯМР *Н (CDCl3, Ö, м.д., .//Гц): 7.90 (д, 1 Н, Мб, J5,в = 8.0); 7.407.30 (уш. с, 5 Н, Ph); 5.97 (д, I Н, СНаНьОСОВи\ ./н,,1ш. = 9.5); 5.91 (д, 1 Н, CI IajJbOCOBul); 5.81 (уш. с, 1 Н, III'); 5.71 (д, 1 Н, Н5); 5.21 (д, 1 Н, OCHaHbPh, /ца,1!Ь - 12.5); 5.18 (д, I Н, ОСЬЩьРЬ); 4.61 (д, 1 Н, ОСНцНьСО, /Иа,нь = 16.5); 4.48 (д, 1 Ы, ОСНдНьСО, /На,нь = 16.5); 4.25 (д, 1 В, 1 la5% .h aSb = 13.3); 4.22 (уш. с, 2 И. Н3\ Н4'); 4.Ü5 (с, 1 Н. Н2')> 3.98 (д, 1 Н, Нь5'); 1.20 (с, 9 Н, Ви1); 1.10-0.80 (м, 28 Н, Рг1). Спектр ЯМР l3C (CDC1-,. 5, м.д.): 177.36 (С1-ЬОСОВис); 169.66 (ОСН3СО); 161.61 (С4); 149.97 (С2); 138.36 (С6); 135.42 (и-Ph); 128.53, 128.35 (Ph); 101.10 (С5); 89.13 (СГ); 82.46 (02^; 81.60 {С4'); 68.42 (С3|; 67.53 (ОСП,СО); 66.56 (OCH2Ph): 64.48 (CI-bOCOBi/); 59.36 (С5'); 38.82 (С(СН3)3); 27.01 (С(СН3)3); 17.42-16.76 (СН(СН3)2); 13.46-12.37 (СН(С1 ЬЫ- Масс-спектр (MALDI-TOF, 2,4,6-ТНАР), т/г. найдено 750.17, вычислено для [М+Н]1 750.02; найдено 772.50. вычислено для [M-v-Na]+ 772.00; найдено 788.63, вычислено для [М+К]+ 788.1 Г.

3-П11вал«11локсиметил-2,'-С'-|2-(2,3-Д11ацетоксинропил)аминг>-2-оксоэтил)-3',5'-6>-{тетраизт1р(шилднснлоксан-1,3-диил)уридин (5.6) О

0 0 0 0 rví Anftv- АСг° ^ i mrfrf о о

О N'

А -—Ул ■—1 DMAP, пиридин

V6 ó X ö 'О \ Y¿ , %

4 О ^Y \ VNH ОН I %j-ö 0

5.4 О' ^Ph I / 5.5 О' W Г У ~ Рт

Х-0Н 1 / 5.6 о

-О Ас

К соединению 5.4 (1.3 г, 1.74 ммоль) добавляли расгвор 3 -ам и но-1,2-п pon ai i д иола (1.58 г, 17.3 ммоль) в абсолютном этаноле (25 мл). Реакционную смесь оставляли при перемешивании tía ночь при комнатной температуре, после чего упаривали до масла. Остаток (масло) растворяли в ЕЮ Ас (50 мл) и промывали водой (50 мл) и 20%-ным раствором NaCl (2x50 мл). Объединенные органические вытяжки высушивали над безводным "Na^SOj. Осушитель отфильтровывали, реакционную смесь концентрировали в вакууме. Остаток переупаривали с абсолютным пиридином (Зх20 мл) и растворяли в смеси абсолютных ТГФ (15 мл) и пиридина (0.7 мл, 8.65 ммоль). Затем добавляли уксусный ангидрид {0.82 мл, 8,65 ммоль) и каталитические количества DMA Р. Реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 5 часов, затем добавляли I мл метанола. Через 10 мин реакционную смесь упаривали до масла, растворяли в 50 мл этил ацетата и промывали водой (50 мл), 5%-ным раствором NaHCO^ (50 мл) и 20%-ным раствором NaCl (2*50 мл). Органическую фазу высушивали над безводным NaiSO^ Осушитель отфильтровывали, реакционную смесь концентрировали до масла в вакууме. Остаток переунаривали с бензолом (3x25 мл) и х ро м ато гр аф и р о в ал и на колонке с силикагелем. Элюировали градиентом СНСЬ в бензоле (0^5^10-»20->30^40^50^60^75->100%, v/v). Выход соединения 5.6 в в;иде белой пены 1.24 г (87.4%). Rr 0.64 (СПС13/ЕЮН 98:2, v/v). Спектр ЯМР (CDCh, 8, м.д., .//Гц): 7.82 (дд, I К, Н6, Jy6 = 8.2); 7.22 (дд, 1 Н, Wm = 13.0, 6.5, CONHCH2); 5.96 (д, Í Н, СН,НьОСОВиг, Ун*,нь = 8.8); 5.90 (д, 1 Н, СЩЙСОВи, = 8-8); 5.79 (уш. с, 1 II, ИГ); 5.72 (д, 1 И, Н5.Лл = 8.2); 5.18 (м. 1 П, СН(ОАс)СН2(ОАс)); 4.35 (д, 1 Н, ОСЩ-1ьСО ./,,а.ш = 16.5); 4.30 (д, 1Н, ОСаИьСО./Иа.нь= 16.5); 4.28 (м. 2 Н, На5\ CH(OAc)CH:(OAc)); 4.22 (дд, 1 Н. ИЗ\Jr.y = 3.5,JyA =8.5); 4.15 (м, 2 И, Н4\ СН(ОАс)СН2(ОАс)); 3.98 (д, 1 Н, Нь5\ JHd.m = 13.0, JrSh = 2.3); 3.86 (каж. г, 1 Н. i 12'); 3.63 (м, 1 И, CONIICIb); 3.50 (м. I И, CONHOT); 2.10, 2.07 (оба с, по 3 Н, СН3СО); 1.20 (с. 9 Н, Bu'); 1.10-0.80 (м. 28 И, Рт1). Спектр ЯМР |3С

СПСЬ. м.д-У- 177.24 (СРЬОСОВи1); 170.61, 169.72 (СН5С=0); 161.41 (С4); 150.28 (С2); 137.57 (С6): 101.44 (С5); 89.43 (СГ); 83.09 (С2'); 81.64 (С4'); 70.52 (С11(ОАс)СН2(ОАс)); 70.32 (ОСН2СО); 68.91 (СЗ'); 64.33 (СН2ОСОВиг); 63.03 (СН(ОАс)СН2(ОАс)); 59.12 (С5'| 39.38 (С(СП.Оз); 38.91 (СОМИСРЬ); 26.99 (С(СН3)3; 20.94, 20.72 (СН3СО); 17.44, 17.37, 17.00. 16.86 (С:Н(£Нг)г); 13.38. 13.02, 12.89, 12,71 (СН(С1 Ш- Масс-спектр (МАЬГХ-ТОР, 2.4.6-ТНАР), т!1\ найдено 816,64. вычислено для [М+Н] 817.06; найдено 838.38, вычислено для [М+Ма]* 839.04; найдено 854.53, вычислено для [М+К]+ 855.15.

3-Пивалоилоксимегил-21-0-[2-(2,3-Диацетоксипропил)амиио-2-оксоэтил1уридин (5.7)

О О о о

Соединение 5.6 (1.21 г, 1.48 ммоль) растворяли в абсолютном тетрагидрофуране (5 мл) и добавили при перемешивании 0.48 мл (2.96 ммоль) три гидрофторида триэтиламина. Реакцию ВШИ 1.5 ч при комнатной температуре. Полноту прохождения реакции контролировали по ТСХ (CHCIj/ElOII 97:3, v/v), после чего смесь разбавили EtOAc (50 мл) и промыли последовательно 5%-ным раствором МаНС03 (2x50 мл), водой (50 мл). 5%-ным раствором лимонной кислоты (2*50 мл) и 20%-ным раствором NaCl (50 мл). Органическую фазу высушили безводным Na2SC)4, осушитель отфильтровали, растворитель упарили, остаток (масло) упарили с СНСЦ (3x25 мл) и выделили целевой продукт колоночной хроматографией (градиент ЕЮН в СНС13 0->1-^2-^3-^4%, v/v). Выход соединения 5.7 0.81 г (95.3%). Rf 0.26 (CHCb/EtOH 92:8. v/v). Спектр ЯМР 'Н (CDC13, 6, м.д.,//Ец): 8.05 (дд,; 1 И, Н6, J5,6 = 8.3); 7.40 (уш. с. 1 I I, CONHCH2). 5.96 (д, 1 Н, CJJ,I IbOCOKu\ /ца.Иь = 9.5); 5.90 (д, 1 Н, СНаПьОСОВи', •/н,.нь = 9.5); 5.85 (каж. т, 1 Н. НГ. J = 2.8); 5.80 (д. 1 Н. П5, J5fi = 8.0), 5.10 (м. 1 II, СН(ОАс)С1 Ь(ОАс)); 4.38 (д. 1 И. ОСНаНьСО. ,/ilaHb = |б.6); 4.32 (м, 1 Н, ИЗ'); 4.30 (Д, I Н. ОСНаНьСО. УНа,нь = 16.6); 4.25 (м, I Н, Н41); 4.20 (м, I 11, CH(OAc)CLb (ОАс)); 4.10 (м, 1 Н, СН(ОАс)СЬЬ (ОАс)); 4.04 (д, 1 Н. Па5", УНа.нь = 12.0): 4.02 (м, 1 Н, Н2'); 3.90 (д, I Н. Пъ5\

Л^.нъ= 12.0); 3.6 (м, 1 НГСШНСЩ;ШШ (м, 5 Щ^ШШСЩ); 3,25 (уш. с, I Н, ОН); 2.10 (уш. с, 1 1, ОН); 2.05 (м, 6 П, СНзСО): 1.20 (с. 9 Н. Ви1). Спектр ЯМР ПС (СОС13. 5. м.д.): 177.58 (СНтОСОВи1); 171.13, 171.03 (СН3С=0); 169.99 (ОСН2СО); 161.66 (С4); 150.47 (С2); 139.29 (С6); 101.62 (С5); 89.39 (СГ); 84.26, 83.84 (С2\ С4'); 70.45 (СИ(ОЛс)СН2(ОЛе)): 69.91 (ОСН2СО); 6Й.35 (СЭО; 64.48 (СН2ОСОВи'); 62.94 (СН(ОАс)СН2(ОАс)); 60.53 (С5*); 39.31 (СОЫНСН2): 38.87 (С(Ш3)3); 27.00 (С(СН,)з); 20.99, 20.75 (СН3СО). Масс-спектр (МЛШ1-ТОГ, 2,4,6-ТНАР), МШ найдено 574.75, вычислено для [М+Н]+ 574.55; найдено 591.44, вычислено для 596.54; найдено 612.28. ЦтчйсЖно для [М+К]~ 612.64.

3-Пива.'10илоксимет11л-21-0-[2-(2,3-диацетокс1111ронил)амино-2-01геотгил|-5'-0-(4,4'-диметокситритил)уридин (5.8)

О О

-чX нсгЛэу РМТГС1 ^ рттг^Жу \I пиридин \/ но 'о—ч на о

-|\1Н ОАс О Ас т М о

5.7 "°АС 5.8 0Ас

Соединение 5.7 (0.77 г, 1,34 ммоль) высушили упариванием с абсолютным пиридином (Зх25 мл), растворили в абсолютном пиридине (25 мл) и добавили при охлаждении на ледяной бане и перемешивании БМТгС1 (0.73 г, 2.14 ммоль). Полноту прохождения реакции контролировали по ТСХ (СПСЬ/ПЮН 95:5, у/у), после чего добавляли I мл ЕЮН. По истечении 10 мин реакционную смесь концентрировали в вакууме, остаток растворили в 50 мл СНСЬ и промыли 5%-ным раствором МаНСОз (2х50 мл) и 20%-ным раствором №С| (50 мл). Орган и ческу ¡о фазу высушили безводным МарШ^ осушитель отфильтровали, растворитель упарили, остаток (масло) переупарили с толуолом (3x25 мл) и хроматограф и ро вал и на колонке с силикагелем (градиент СИСЬ в толуоле (О—>20—>25—>30—->50—" 100%) + 1% пиридина (у/у/у), потом 1% ЕЮН в СНС1*+ 1% пиридина, у/у/у). Выход соединения 5.8 0.99 г (84.3%). К,- 0.25 (СИСЦ/ЕЮН 98:2. у/у). Спектр ЯМР 'н (С1Х1з. 5, м.д.,.//Гц): 8.05 (дд, % II, П6. = 8.0): 7.40 (д, 2 11, о-РЬ,./ 7.8); 7.30 (д, 2 Ы, о-Лп, ./ 8.5): 7.25 (м, 4 11, м,п-Щ СОМНС!12); 6.80 (д, 2 Н, ,и-Ап, .1 = 8.5); 5.90 (м, 2 И, СНЮСОВи'); 5.Я5 (перекрывание, I Н. НГ); 5.30 (д, I Н, Н5, = 8.0); 5.10 (м, 1 II,

CH(OAc)Cl lz(OAc)); 4.50 (каж. к, 1 Н, Щ\ J= 6.5); 4.42 (д. 1 ЕI, ОСНаПьСО, */№.нь = 15.8); 4.36 (д. 1 Н, ОСВДьСО, J,ia,Mb * 15.8); 4.25 (м, 1 Н, СН(ОЛс)СШОАс)); 4.15 (м, 1 Н. CI 1(0Ас)С1 Ь(ОАс)): 4.10 (каж. к, 1 Н, Н4\./= 6.5); 3.90 (дд, 1 Н, Н2\ ./,= 4.5. JY,y = 13.0); 3.80 (с. 3 Н, ОСЩ; 3.70 (м, 1 Н. З'-ОН): 3.65 (м, 1 Н, CONHCPb); 3.55 (м, 2 Н, Н5'); 3.40 (м, 1 Н, CONHCH2);2.10 (с, 6 Н, СНзСО); 1.20 (с, 9 Н, Bu1). Спектр ЯМР ,3С (CDClj, 5, м.д.): 177.80 (СН2ОСОВи'); 171.10, 171.00 (С1-Г:,С=0); 169.50 (ОСН2СО); 161.45 (С4); 158.82 (й-Ап); 150.20 (С2); 144.50 (w-Ph| 138.48 (С6); 135.31, 135.11 (м-Лп); 130.16 (о-Ап); 128.17, 128.09 (,u,f?-Ph); 127.26 (и-Ph); 113.40 (л/-Ап); 101.65 (С5); 88.70 (С Г); 87.10 (С(Аг)3); 84.16 (С2'); 82.80 (С4); 70.59 (СН(ОАс)СН2(0Ас)); 69.96 (ОСН2СО); 68.60 (Со'); 64.00 (СН(ОАс)СЬЬ(ОАс)); 60.00 (С5-); 55.30 (ОСН?); 39.49 (СОМНСЬЬ); 39.40 (С(СН3)э); 27.05 (С(СН3)з); 21.01, 20.77 (СН3СО). Масс-спектр (MALD1-TOF, 2,4.6-ТНАР), т/ж. найдено 899.21, вычислено для [M+Na]+ 898.9; найдено 915.16, вычислено для [M+KJ+915.01.

3-Пивалоилокс11метнл-21-0-[2-(2,3-диацегоксипропил)амипо-2-оксо')тил]-3'-(?-(Л,г^Аг-Д11изопропиламино-2-цианэтокснфосфинил)-5,-0-(4,4'-диметокситритил)уриднн (4.1 Ь)

CN

Соединение 5.8 (0.95 г. 1.09 ммоль) высушили упариванием с абсолютным хлористым метиленом (3x20 мл) и растворили в абсолютном хлористом метилене (10 мл). К раствору добавили тетразолйд диизопропиламмония (0.28 г, 1.63 ммоль) и бг/с(^,Лг-диизопропиламино)-2-ци:иотоксифосфин (0.45 мл, 1.42 ммоль), после чего реакционную смесь оставили при перемешивании на ночь. По окончании реакции (ТСХ в ПЮАс/гексан 2:1 # 1% триэтиламина. v/v/r) реакционную смссь упарили, разбавили 50 мл EtOAc и промыли 5%-ным раствором ШНСОз (100 мл) и 20%-пым раствором NaCl (100 мл). Органическую фазу высушили безводным Na2SO). Осушитель отфильтровали, растворитель упарили, остаток высушили до пенообразного состояния, затем залили гексаном и выдержали 18-24 ч при -20°С. Растворитель декантировали, продукт далее высушили в вакууме. Выход соединения 4.1Ь в виде белой пены 1.09 г (93.1%). Rf 0.27 (CHCl3/Et3N 99:1, v/v). Спектр ЯМР 'Н (CDC13, 5, м.д., //Гц): 8.04, 8.01 (оба д, перекрывание, по 1 Н, Н6); 7.45-7.16 (м, 18 Н, Ph, о-Ап); 6.84 (м, 8 Н, ж-Ап); 5.95 (с, 2 Н, СНгОСОВи1); 5.91 (уш. с, 4 Н, СНгОСОВи1 и 2 HI'); 5.36 (д, 1 Н, Н5, J5,6 = 8.8); 5.28 (д, 1 Н, Н5, J5,б = 8.1); 5.20, 5.12 (оба м, по 1 Н, СН(ОАс)СН2(ОАс)); 4.57 (м, 2 Н, НЗ'); 4.45 (д, 1 Н, OCHaHbCO, JHa,нь =15.8); 4.35 (d, 1 Н, ОСНаИьСО, ./На,нь =15.8); 4.35-4.06 (м, 12 Н, Н4', СН(ОАс)СН2(ОАс), ОСНгСО, NCH(CH3)2); 3.93-3.37 (м, 14 Н, Н2\ Н5\ CONHCH2, OCH2CH2CN); 3.81 (с, 12 Н, ОСЩ; 2.80-2.40 (м, 4 Н, OCH2CH2CN); 2.07 (с, 12 Н, СН3СО); 1.20 (с, 18 Н, Ви'); 1.29, 1.15, 1.03 (три д, 6 Н, 12 Н, 6 Н, соответственно, NCH(CH3)2). Спектр ЯМР 13С (CDCI3, 8, м.д.): 177.32 (СН2ОСОВи'); 170.57, 170.42, 170.28, 169.80, 169.10 (СН3С=0, ОСН2СО); 161.54 (С4); 158.75 (п-An); 150.45 (С2); 144.20, 144.12 (w-Ph); 138.29, 138.21 (С6); 135.16, 135.09, 134.95 (и-Ап); 130.26, 130.22 (о-Ап); 128.27, 127.97 (o^t-Ph); 127.19 (я-Ph); 113.27 (ж-An); 101.73, 101.66 (С5); 89.80, 88.90 (С1'); 87.08 (С(Аг)3); 82.80, 82.20, 81.65, 81.47 (С2', С4'); 71.08, 70.90, 70.34, 70.24, 69.95, 69.80 (СН(ОАс)СН2(ОАс), СН2СО, СЗ'); 64.55 (СН(ОАс)СН2(ОАс)); 62.97, 62.89 (С5'); 58.14, 57.86 (СН(СН3)2); 55.25 (ОСНз); 43.40, 43.20 (OCH2CH2CN); 39.23, 39.08, 38.93, 38.83 (С(СН3)3, CONHCH2); 27.02 (С(СН3)3); 24.67, 24.59 (OCH2CH2CN); 22.92, 20.93, 20.72, 20.49, 20.38, 20.29 (СН(СН3)2, СН3СО). Спектр ЯМР 31Р (CDC13, 5, м.д.): 153.695, 151.351. Масс-спектр (MALDI-TOF, 2,4,6-ТНАР), m/z: найдено 1077.48, вычислено для [М+Н]+ 1077.14.

Синтез модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов и олигорибонуклеотидов осуществляли на автоматическом синтезаторе ABI 394 (Applied Biosystems, США) по стандартному регламенту с использованием коммерческих реагентов и растворителей. В качестве полимерного носителя применяли стекло с определенным размером пор (LCAA-CPG-500, LCAA-CPG-1000). Удельная загрузка полимера первым нуклеозидным звеном составляла 37-60 мкмоль-г"1. З'-Амидофосфиты 2'-дезоксинуклеозидов и 2'-0-(трет-бутилдиметилсилил)рибонуклеозидов использовали в виде 0.1 М растворов в абсолютном ацетонитриле. Концентрация З'-амидофосфита модифицированного нуклеозида в ацетонитриле составляла 0.2-0.5 М. Время конденсации для модифицированных мономеров увеличивали до 30-60 мин. Степень превращения на этой стадии была несколько ниже, чем для З'-амидофосфитов 2'-дезоксинуклеозидов и 2'-рибонуклеозидов, и составила не менее 95-97%.

Деблокирование олигодезоксирибонуклеотидов. После завершения твердофазного синтеза олигонуклеотиды обрабатывали концентрированным водным раствором аммиака в течение 12-18 ч при 55°С. Далее отбирали аммиачный раствор, промывали полимерный носитель водой (2x100 мкл), объединяли вытяжки и упаривали аммиак. Затем проводили высаживание олигонуклетидов 2 М водным раствором перхлората лития (150 мкл) и ацетоном (1 мл) в течение 5 мин при -20°С.

Деблокирование олигорибонуклеотидов. После завершения твердофазного синтеза олигонуклеотиды обрабатывали 400 мкл раствора Р1 в течение 4-17 ч при комнатной температуре (методика «UltraMild») или 1.5 мл раствора Р2 в течение 40 мин при 65°С (методика «UltraFast»). После отбирали раствор и промывали полимер водой (2x100 мкл), объедиенные вытяжки концентрировали в вакууме. Осадок растворяли в 100 мкл ДМСО, добавляли 125 мкл Et3N*3HF и выдерживали в течение 2.5 ч при 65°С. Объем доводили водой до 1 мл и проводили высаживание н-бутанолом (20 мл) в течение 16 ч при -20°С. Анализ и выделение олигонуклеотидов. Реакционные смеси, полученные после олигонуклеотидного синтеза, анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном варианте на хроматографе фирмы «Waters» (США) с шагом элюции 0.5 или 1 нукпеотидное звено в минуту. Использовали колонку 4.6x250 мм с сорбентом Luna С-18(2) Phenomenex (размер частиц 5 мкм). Условия аналитического разделения: температура колонки - 45°С; элюент: буфер Al; буфер Б1; логарифмический градиент концентрации ацетонитрила; расход элюента 1 мл-мин"1.

Выделение целевых продуктов проводили методом электрофореза в 10%- или 20%-ном ПААГ в присутствии 7 М мочевины. Контроль чистоты олигонуклеотидов осуществляли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном варианте. Выделенные олигонуклеотиды обессоливали методом ультрафильтрации с использованием микроконцентраторов Микрокон-3 (Millipore Inc, США).

Олигонуклеотиды, содержащие остатки 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)уридина, были синтезированы научным сотрудником Химического факультета МГУ Зацепиным Т.С. Элюирование олигонуклеотидов из геля. Олигодезоксирибонуклеотиды выделяли из геля 2 М водным раствором перхлората лития в течение 14 ч при комнатной температуре, затем осаждали ацетоном. Осадок центрифугировали, промывали ацетоном, высушивали и растворяли в воде. Олигорибонуклеотиды выделяли из геля 1 М раствором ацетата натрия pH 5.0) в течение 14 ч при 10°С. Олигонуклеотиды осаждали спиртом. Осадок центрифугировали, промывали спиртом, высушивали и растворяли в воде. Синтез 2'-гидразидных олигодезокси- и олигорибонуклеотидов. К олигонуклеотиду (I, IV, V, XIV-XVI, XVIII) (1-3 ОЕ А26о) добавляли 10 мкл воды, 10 мкл буфера В и 10 мкл 0.23 М NaI04. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при 25°С. Затем добавляли 15 мкл 10%-ного этиленгликоля и выдерживали 30 мин при 25°С. Далее олигонуклеотидный материал высаживали 4 М NaOAc (9 мкл) и спиртом (1 мл). К осадку добавляли раствор дигидразида янтарной кислоты (50-100 нмоль) в смеси буфера В и ДМСО (1:1, v/v, 50 мкл). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 ч. Затем добавляли цианборгидрид натрия (~1 мг), инкубировали 30 мин, добавляли 4 М раствор ацетата натрия (20 мкл) и этанол (1.5 мл) и проводили высаживание. Реакционную смесь анализировали с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном варианте и масс-спектрометрии (MALDI-TOF).

Спектры поглощения водных растворов олигонуклеотидов в УФ-области записывали на спектрофотометре Сагу Eclipse (Varían, США). Концентрацию нуклеотидного материала определяли спектрофотометрически по формуле Бугера-Ламберта-Бера: С - А2бо/£2бо'1, где С - концентрация нуклеотидного материала (М), А2бо - оптическая плотность раствора при 260 нм, 8260 - молярный коэффициент экстинкции при 260 им (М"'см1), 1 - длина оптического пути (см). Молярные коэффициенты экстинкции (s26o) олигонуклеотидов рассчитывали с помощью программы OligoAnalyzer 3.1 (SciTools, www.idtdna.com).

Термическую стабильность дуплексов А, В и Е-Н изучали путем регистрации УФ-поглощения образца в зависимости от температуры на спектрофотометре U-2800A Hitachi (Япония) с температурным регулятором SPR-10. Измерения проводили в буфере Г с предварительным отжигом образцов. Использовали термостатируемые кварцевые кюветы Hellma (ФРЕ) с длиной оптического пути 1 см. УФ-поглощение фиксировали при длине волны 260 нм, соблюдая следующий температурный режим: термостатирование при 25°С -15 мин, нагрев от 25°С до 85°С - 120 мин. Концентрация НК-дуплексов составляла 1 мкМ. Еипохромию комплексообразования определяли по уравнению h26o = ((Амакс - Амин)/АмаКс) ' 100%, где Амакс и Амин - оптическая плотность раствора при максимальной и минимальной температурах соответственно (к = 260 нм). Термическую устойчивость дуплексов С и D изучали по изменению интенсивности флуоресценции красителя SYBR Green I в зависимости от температуры. Изменение флуоресценции регистрировали на приборе для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени (Синтол, Россия) при непрерывном повышении температуры со скоростью 0.5°С/мин. Исследования проводили в 40 мкл буфера Д. Концентрация ДНК-дуплексов составляла 1.88 мМ.

Спектры кругового дихроизма двуспиральных НК регистрировали на дихрографе Applied Photophysics Chirascan (Англия), оснащенном термостатированным кюветным отделением и системой сбора данных с использованием программы Graf Work v.l.04.05. Измерения проводили в интервале длин волн 220-330 нм в кварцевых кюветах фирмы Hellma (Германия) с длиной оптического пути 1 см при 23 °С в буфере Г. Результаты КД, которые являются усредненными данными трёх независимых экспериментов, были скорректированы путем вычитания базовой линии, соответствующей спектру буферного раствора, и выражены в виде молярного кругового дихроизма As (в расчете на мононуклеотидное звено): As= sl - sr=Al -Ar /С1, где 8l и sr молярные коэффициенты экстинкции, a AL и Ar - оптическое поглощение лево(Ь)- и право(11)-поляризованного света; С - концентрация-олигонуклеотидов, моль/л (в расчете на мономерное звено); 1 - длина оптического пути, см.

Введение 32Р-метки в олигонуклеотиды. Для получения 5'-[32Р]-меченного производного

32 олигодезокси- или олигорибонуклеотид инкубировали с Т4-полинуклеотидкиназой и [у- Р]-АТФ в 10 мкл буфера Е в течение 30 мин при 37°С. Меченые олигонуклеотиды очищали методом гель-фильтрации на колонках G-25 Illustra MicroSpin™ (GE Healthcare, США). Радиоактивность Р-меченных препаратов определяли методом счёта по Черенкову в импульсах в минуту на счетчике Delta 300 (Tracor, Нидерланды). Ошибка счёта не превышала 2%.

Определение начальной скорости гидролиза ДНК-субстрата эндонуклеазой рестрикции SsoII (R.SsoII). ДНК-дуплексы А, В и I (2.5 нМ), содержащие 32Р-метку в верхней цепи, инкубировали с R.SsoII (1 нМ) в 100 мкл буфера Ж при 37°С. Через определенные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты (10 мкл). Время инкубации варьировали от 0.25 до 12 мин. Реакцию останавливали добавлением 80% формамида. Продукты гидролиза анализировали методом электрофореза в 20%-ном ПААГ, содержащем 7 M мочевину. Визуализацию радиоактивных полос в геле и обсчет данных проводили на приборе Molecular Dynamics Phosphorlmager SI (Molecular Dynamics), используя компьютерную программу Image Qantum, версия 5.0. Степень гидролиза дуплексов R.SsoII определяли как отношение радиоактивности продукта к суммарной радиоактивности продукта и нерасщепленного субстрата, умноженное на 100%. Начальные скорости гидролиза (vo) ДНК-дуплексов А, В, I R.SsoII рассчитывали как угловой коэффициент тангенс угла наклона) начального прямолинейного участка кинетической кривой. Угловой коэффициент прямой определяли графически. Относительные vo определяли как отношение начальных скоростей гидролиза модифицированного ДНК-дуплекса к v0 соответствующего немодифицированного субстрата. Измерения проводили не менее трех раз, в дальнейших расчётах использовали среднее значение. Воспроизводимость результатов измерений характеризует средняя относительная погрешность, не превышающая 20%. Определение эффективности метилирования ДНК-дуплексов метилтрансферазой SsoII. Эффективность метилирования ДНК-дуплекса M.SsoII оценивали по степени «защиты» субстрата от гидролиза R.SsoII. 0.35 мкМ ДНК-дуплексов А, В и I, содержащих 32Р-метку, инкубировали с M.SsoII (89 нМ) в буфере 3, содержащем 0.1 мМ AdoMet, от 0.5 до 20 мин при 37°С. После реакции с метилтрансферазой реакционную смесь выдерживали 10 мин при 65°С для инактивации фермента, затем медленно охлаждали до 25°С. К реакционной смеси добавляли MgCl2 до конечной концентрации 10 мМ и инкубировали с R.SsoII (4.8 мкМ) в течение 1 ч при 37°С. Затем реакционную смесь выдерживали 3 мин при 90°С для инактивации фермента. Продукты реакции анализировали, как описано выше. Комплексообразование M.SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими остатки 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина и 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)уридина методом "торможения" в геле. 5'-32Р-меченные ДНК-дуплексы С, D, J, К или олигонуклеотиды Dl, J1 (50-400 нМ) инкубировали с 2.6-5.2 мкМ M.SsoII в 10 мкл буфера И, содержащего 10% глицерина, в течение 30 мин при 37°С. Реакционные смеси анализировали в неденатурирующем 7%-ном ПААГ в буфере К. Пробы наносили на гель в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10-20% глицерина. Визуализацию радиоактивных полос в геле и обсчет данных проводили на приборе Molecular Dynamics Phosphorlmager SI (Molecular Dynamics), используя компьютерную программу Image Qantum, версия 5.0. Степень связывания M.SsoII с ДНК-дуплексами и олигонуклеотидами рассчитывали как отношение радиоактивности зоны, соответствующей ДНК-белковому комплексу, к сумме радиоактивности зон, соответствующих ДНК-белковому комплексу и несвязавшейся ДНК. Получение ДНК-дуплексов, содержащих остатки 2'-6Ц2,5-диоксо-3-азапентил)уридина и 2 '-0-(2-оксоэтил)уридина. 10 пмоль 5'-32Р-меченного олигонуклеотида, содержащего 1,2-диольную группу, растворяли в 15 мкл буфера В. К раствору добавляли 15 мкл 0.23 М NaI04, реакционную смесь инкубировали 30 мин при 25°С. Затем добавляли 6 мкл 4 М ацетата натрия, олигонуклеотидный материал высаживали 200-кратным избытком спирта и сушили при 37°С. К модифицированному олигонуклеотиду добавляли комплементарную матрицу (10 пмоль) и проводили «отжиг» от 80°С в 20 мкл воды.

Ковалентное связывание ДНК-дуплексов, содержащих 2'-альдегидную группировку, с ДНК-метилтранеферазой БвоП. 5'-32Р-меченные ДНК-дуплексы Ь-О или модифицированные олигонуклеотиды М1, N1 (0.5 пмоль) инкубировали с 50 пмоль М^оН в 10 мкл буфера И в течение 30 мин при 37°С. В некоторых случаях в реакционные смеси добавляли 1 мМ дитиотреит для стабилизации третичной структуры белка. Затем к реакционной смеси добавляли 275 мМ КаВНзСИ до конечной концентрации 50 мМ и выдерживали 1 ч при 37°С. Продукты реакций разделяли электрофорезом по Лэммли [247] в 12%-ном ДСН-ПААГ с 4%-ной концентрирующей полосой. Перед нанесением на гель реакционные смеси выдерживали 5 мин при 95°С в денатурирующем буфере Л для разрушения нековалентных комплексов ДНК-белок. В некоторые реакционные смеси кроме буфера Л добавляли 8 М мочевину для денатурации ДНК-дуплексов и выдерживали 10 мин при 95°С. Положение 5'-32Р-меченных соединений определяли радиоавтографически. Выходы продуктов ковалентного связывания рассчитывали как отношение радиоактивности зоны, соответствующей ДНК-белковому конъюгату, к сумме радиоактивности зон, соответствующих ДНК-белковому конъюгату и несвязавшейся ДНК. Изучение специфичности аффинной модификации М^воП.

32

Конкурентное ингибирование связывания. К 50 пмоль М^эоН и 0.5 пмоль 5'- Р-меченным дуплексам Б и I, содержащим участок узнавания М.БзоП, добавляли конкурирующие ДНК-лиганды С, Р, К, О в 10-, 20-, 40-, 60-, 80-, 100-кратном избытке по отношению к меченому дуплексу. Эксперименты проводили в 10 мкл буфера И в течение 30 мин при 37°С. Продукты реакции анализировали в неденатурирующем 7%-ном ПААГ в буфере К. Конкурентное ингибирование ковалентного связывания. К 50 пмоль М.ЗэоИ и 0.5 пмоль 5'-32Р-меченным дуплексам М и 14, содержащим участок узнавания М.ЗбоН, добавляли конкурирующие ДНК-лиганды С, Р, Ь, О в 5-, 10-, 20-, 40-, 60-, 80-, 100-кратном избытке по отношению к меченому дуплексу. Реакцию проводили в 10 мкл буфера И в течение 30 мин при 37°С. Затем к реакционной смеси добавляли 275 мМ НаВНзСЫ до конечной концентрации 50 мМ и выдерживали 1 ч при 37°С. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 12%-ном ДСН-ПААГ с 4%-ной концентрирующей полосой как описано выше.

Ковалентное связывание модифицированных ДНК-дуплексов с М^оП после образования комплекса. 5'-32Р-меченные 2'-диольные олигонуклеотидные дуплексы (0.5 пмоль) инкубировали с 50 пмоль M.SsoII в 20 мкл буфера И в течение 30 мин при 37°С. После этого к реакционной смеси добавляли 15 мкл 0.23 мМ или 0.023 мМ NaIC>4, реакционную смесь инкубировали 5, 15, 30, 120 мин и 15 ч при 25°С. Затем добавляли 275 мМ NaBH3CN до конечной концентрации 50 мМ и выдерживали 1 ч при 37°С. Продукты реакции анализировали, как описано выше.

Приготовление РНК-транскрипта и пре-тРНК. РНК-транскрипт Bstea-ra/?ß[Al-26] и Т. thermophilus пре-т PHKGly получены с помощью in vitro транскрипции. В качестве матриц для синтеза транскрипта Bstea-m/?ß[Al -26] и Т. thermophilus пре- тРНК01у были использованы плазмидные ДНК pSP64pBstea-rwpß[Al-26] и pSBpt3'hh [248], подвергнутые гидролизу эндонуклеазой рестрикции BamHI.

Синтез полноразмерной РНК Bacillus stearothermophilus с помощью Т4 ДНК-лигазы.

5'-32Р-меченный немодифицированный олигорибонуклеотид или его модифицированный аналог XII (3 мкМ), транскрипт Bstea-rw/?ß[Al -26] (1 мкМ) и ДНК-матрицу (2 мкМ) нагревали (92°С - 1 мин, 25°С - 5 мин [226]) в присутствии или в отсутствие буфера для Т4 ДНК-лигазы, либо не нагревали и инкубировали с Т4 ДНК-лигазой (7.5 ед) в 20 мкл буфера в присутствии 5 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ, ингибитора РНКаз (40 ед) либо БСА (0.1 мг/мл) в течение 4, 6, 8 или 15 ч при 28°С. Продукты лигирования анализировали методом электрофореза в 8%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину.

Формирование структуры РНК РНКазы Р за счет комплементационных

32 взаимодействий. Транскрипт Bstea-rw/>i?[Al-26] (4-5 мкМ) и 5'- Р-меченный модифицированный олигорибонуклеотид (XII, XXVII-XXIX) или его немодифицированный аналог (0.2-0.25 мкМ), взятые в соотношении 20:1, соответственно, выдерживали в отсутствие Т4 ДНК-лигазы в 10 мкл буфера М или Н в течение 5 мин при 55°С, затем 30 мин при 37°С. Полученную структуру РНК РНКазы Р использовали для определения активности холофермента РНКазы Р и изучения закономерностей ковалентного связывания 2'-альдегидных олигорибонуклеотидов с белком РНКазы Р.

Каталитическое отщепление 5'-концевой последовательности пре-тРНК [249]. 250 нМ

РНК В. stearothermophilus (дикий тип, лигированная либо гибридизованная) или 250 нМ транскрипт Bstea-rrcpZ?[Al-26] инкубировали в 20 мкл буфера М [250] 5 мин при 55°С, затем 50 мин при 37°С. После этого добавляли 2.5 пмоль белка В. subtilis. Реакционную смесь объемом 20 мкл выдерживали 5 мин при 37°С. Параллельно инкубировали субстрат - 5'-32Рмеченную пре-тРНК°'у (конечная концентрация в смеси составляла < 1 нМ) - в 5 мкл буфера M 5 мин при 55°С, затем 25 мин при 37°С.

К 16 мкл холофермента добавляли 4 мкл 5'- Р-меченного субстрата и проводили реакцию ферментативного расщепления при 37°С. Через определенное время (1, 2, 5, 10 мин) отбирали аликвоты (4 мкл) и добавляли их к 6 мкл раствора для нанесения на гель РЗ. Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 20%-ном ПААГ, содержащем 7 M мочевину. Визуализацию радиоактивных полос в геле и обсчет данных проводили на приборе Fuji Film (Япония), используя компьютерную программу AIDA, версия 3.45. Расчет константы скорости реакции первого порядка проводили с использованием компьютерной программы Grafit 3.04.

Получение олигорибонуклеотидов, содержащих остаток 2'-{?-(2,5-диоксо-3-азапентил)уридина. 10 пмоль 5'-32Р-меченного олигорибонуклеотида (XIV-XVI), содержащего 1,2-диольную группу, растворяли в 15 мкл буфера В. К раствору добавляли 15 мкл 0.23 M NaIÛ4, реакционные смеси инкубировали 30 мин при 25°С. Затем добавляли 6 мкл 3 M ацетата натрия (рН 5.0), олигонуклеотидный материал высаживали 5-кратным избытком спирта и сушили при 37°С.

Ковалентное связывание РНК-лигандов, содержащих 2'-альдегидную группировку, с белком бактериальной рибонуклеазы Р. 5'- Р-меченные олигонуклеотиды XXVII-XXIX (0.2 мкМ) гибридизовали с Bstea-гирДА1 -26] (4 мкМ) в буфере H в течение 5 мин при 55°С, затем в течение 30 мин при 37°С. Полученную структуру РНК В. stearothermophilus РНКазы Р инкубировали с белком В. subtilis РНКазы Р в течение 10 мин при 37°С. Объем реакционной смеси составлял 10 мкл. Концентрацию белка варьировали в диапазоне 2-20 мкМ. Затем к реакционной смеси добавляли 275 мМ NaBF^CN до конечной концентрации 50 мМ и выдерживали 1.5 ч при 37°С. Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 13%-ном ДСН-ПААГ с 4%-ной концентрирующей полосой (гель-электрофорез по методу Шагера и фон Ягова) [251]. Перед нанесением на гель реакционные смеси выдерживали 5 мин при 95°С в денатурирующем буфере О для разрушения нековалентных комплексов РНК-белок. Визуализацию радиоактивных полос в геле и обсчет данных проводили на приборе Molecular Dynamics Phosphorlmager SI (Molecular Dynamics), используя компьютерную программу Image Qantum, версия 5.0. Выходы продуктов ковалентного связывания Р-белка с РНК рассчитывали как отношение радиоактивности зоны, соответствующей РНК-белковому конъюгату, к сумме радиоактивности зон, соответствующих РНК-белковому конъюгату и несвязавшейся РНК.

Ковалентное связывание ДНК-дуплексов, содержащих 2'-альдегидную группировку, с белком бактериальной рибонуклеазы Р. 5'-32Р-меченные ДНК-дуплексы L, М (1 пмоль) инкубировали с белком В. subtilis РНКазы Р (100 и 200 пмоль) в 10 мкл буфера Н в течение 30 мин при 37°С. Затем к реакционной смеси добавляли 275 мМ NaBH3CN до конечной концентрации 50 мМ и выдерживали 1 ч при 37°С. Продукты реакций разделяли электрофорезом по Леммли в 12%-ном ДСН-ПААГ с 4%-ной концентрирующей полосой. Перед нанесением на гель реакционные смеси выдерживали 5 мин при 95°С в денатурирующем буфере JI для разрушения нековалентных комплексов ДНК-белок. Положение 5'-32Р-меченных соединений определяли радиоавтографически. Реакция 2'-гидразидных олигонуклеотидов с альдегидами. Осадок 2'-гидразидного олигонуклеотида (XIX, XXII) (1-3 ОЕ А260) растворяли в 50 мкл буфера В. Затем добавляли 50 мкл раствора альдегидов 1-5 (1 мг) в ДМСО либо в воде. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 ч при рН 4.0-4.5. Далее, если необходимо, добавляли 40 мкл 275 мМ NaBH3CN, инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После проводили высаживание 4 М раствором ацетата натрия (28 мкл) и этанолом (1.5 мл). Анализ реакционных смесей и выделение целевых продуктов проводили в 20%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину, и методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе фирмы «Agilent 1100» (США) с использованием колонки Nucleosil С18 (5 мкм, 300 А, 4.6x250 мм). Условия аналитического разделения: температура колонки - 45°С; элюент: буфер А2; буфер Б2; линейный градиент концентрации ацетонитрила; расход элюента 0.9 мл-мин"1. Строение конъюгатов подтверждали данными масс-спектрометрии MALDI-TOF (см. Приложение).

Реакция 2'-гидразидных олигонуклеотидов с пирен-1-карбальдегидом или перилен-3-карбальдегидом. К осадку 2'-гидразидного олигонуклеотида (XX, XXI, XXIV, XXV) (1-3 ОЕ А260) добавляли 50 мкл Н20 и раствор альдегида 6 или 7 (1 мг) в 50 мкл ДМСО. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 ч при рН 5.5. Затем, если необходимо, добавляли 40 мкл 275 мМ NaBH3CN и реакционную смесь инкубировали еще 30 мин при комнатной температуре. После проводили высаживание 4 М раствором ацетата натрия (20 мкл) и этанолом (1.5 мл). Продукты реакции анализировали, как описано выше.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Хомякова, Елена Алексеевна, 2012 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Зацепин Т.С., Долинная H.F., Кубарева Е.А., Ивановская М.Г., Метелев В.Г., Орецкая Т.С. Ковалентное связывание модифицированных нуклеиновых кислот с белками как метод изучения специфических белково-нуклеиновых взаимодействий. // Успехи химии. 2005. 74(1): 84-103.

2. Yaffe М.В. X-ray crystallography and structural biology. И Crit. Care. Med. 2005. 33(12 Suppl): S435-440.

3. Mertens H.D., Svergun D.I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. II J. Struct. Biol. 2010. 172(1): 128-141.

4. Svergun D.I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. II Biol. Chem. 2010. 391(7): 737-743.

5. Sato M., Takahashi K., Ochiai Y., Hosaka Т., Ochi K., Nabeta K. Bacterial alarmone, guanosine 5'-diphosphate 3'- diphosphate (ppGpp), predominantly binds the P' subunit of plastid-encoded plastid RNA polymerase in chloroplasts. // Chembiochem. 2009.10(7): 1227-1233.

6. Kirino Y., Mourelatos Z. Site-specific crosslinking of human microRNPs to RNA targets. // RNA. 2008. 14(10): 2254-2259.

7. Петрусева И.О., Тиханович И.С., Мальцева E.A., Сафронов И.В., Лаврик О.И. Фотоактивируемые ДНК-аналоги субстратов белков системы эксцизионной репарации нуклеотидов и их взаимодействие с белками NER-компетентного экстракта клеток HeLa. // Биохимия. 2009. 74(5): 607-619.

8. Christen L.A., Piacente S., Mohamed M.R., Niles E.G. Vaccinia virus early gene transcription termination factors VTF and Rap94 interact with the U9 termination motif in the nascent RNA in a transcription ternary complex. // Virology. 2008. 376(1): 225-235.

9. Dechassa M.L., Zhang В., Horowitz-Scherer R., Persinger J., Woodcock C.L., Peterson C.L., Bartholomew B. Architecture of the SWI/SNF-nucleosome complex. // Mol. Cell. Biol. 2008. 28(19): 6010-6021.

10. Dang W., Bartholomew B. Domain architecture of the catalytic subunit in the ISW2-nucleosome complex. II Mol. Cell. Biol. 2007. 27(23): 8306-8317.

11. Maltseva E.A., Rechkunova N.I., Petruseva I.O., Vermeulen W., Scharer O.D., Lavrik O.I. Crosslinking of nucleotide excision repair proteins with DNA containing photoreactive damages. // Bioorg. Chem. 2008. 36(2): 77-84.

12. Евдокимов А.Н., Петрусева И.О., Пестряков П.Е., Лаврик О.И. Фотоактивируемые ДНК-аналоги субстратов системы эксцизионной репарации нуклеотидов и их взаимодействие с белками NER-компетентного экстракта клеток HeLa. Синтез и применение протяженных моделей ДНК. II Биохимия. 2011. 76(1): 188-200.

13. Maltseva Е.А., Rechkunova N.I., Gillet L.C., Petruseva I.O., Scharer O.D., Lavrik O.I. Crosslinking of the NER damage recognition proteins XPC-HR23B, XPA and RPA to photoreactiveprobes that mimic DNA damages. // Biochim. Biophys. Acta. 2007.1770(5): 781-789.

14. Суханова M.B., Ходырева C.H., Лаврик О.И. Влияние экзогенной поли(АОР-рибозо)-полимеразы-1 и ее апоптотического фрагмента 24 кДа на репарацию ДНК-дуплексов в ядерном экстракте из семенников крупного рогатого скота. // Биохимия. 2006. 71(7): 909-923.

15. Neher Т.М., Rechkunova N.I., Lavrik O.I., Turchi J.J. Photo-cross-linking of XPC-Rad23B to cisplatin-damaged DNA reveals contacts with both strands of the DNA duplex and spans the DNA adduct. II Biochemistry. 2010. 49(4): 669-678.

16. Bose D., Pape Т., Burrows P.C., Rappas M., Wigneshweraraj S.R., Buck M., Zhang X. Organization of an activator-bound RNA polymerase holoenzyme. // Mol. Cell. 2008. 32(3): 337346.

17. Burrows P.C., Wigneshweraraj S., Bose D., Joly N., Schumacher J., Rappas M, Pape Т., Stockley P.G., Zhang X., Buck M. Visualizing the organization and reorganization of transcription complexes for gene expression. // Biochem. Soc. Trans. 2008. 36(Pt 4): 776-779.

18. Burrows P.C., Wigneshweraraj S.R., Buck M. Protein-DNA interactions that govern AAA+ activator-dependent bacterial transcription initiation. II J. Mol. Biol. 2008. 375(1): 43-58.

19. Naryshkin N., Druzhinin S., Revyakin A., Kim Y., Mekler V., Ebright R.H. Static and kinetic site-specific protein-DNA photocrosslinking: analysis of bacterial transcription initiation complexes. II Methods Mol. Biol. 2009. 543: 403-437.

20. Grunberg S., Reich C., Zeller M.E., Bartlett M.S., Thomm M. Rearrangement of the RNA polymerase subunit H and the lower jaw in archaeal elongation complexes. // Nucleic Acids Res. 2010. 38(6): 1950-1963.

21. Reyes D.Y., Zuber P. Activation of transcription initiation by Spx: formation of transcription complex and identification of a cz's-acting element required for transcriptional activation. // Mol. Microbiol. 2008. 69(3): 765-779.

22. Grunberg S., Bartlett M.S., Naji S., Thomm M. Transcription factor E is a part of transcription elongation complexes. II J. Biol. Chem. 2007. 282(49): 35482-35490.

23. Micorescu M., Griinberg S., Franke A., Cramer P., Thomm M., Bartlett M. Archaeal transcription: function of an alternative transcription factor В from Pyrococcus furiosus. II J. Bacteriol. 2008.190(1): 157-167.

24. Kim M.K., Kang Y.S., Lai H.T., Barakat N.H., Magante D., Stumph W.E. Identification of SNAPc subunit domains that interact with specific nucleotide positions in the U1 and U6 gene promoters. // Mol. Cell. Biol 2010. 30(10): 2411-2423.

25. Kassavetis G.A., Prakash P., Shim E. The C53/C37 subcomplex of RNA polymerase III lies near the active site and participates in promoter opening. II J. Biol. Chem. 2010. 285(4): 2695-2706.

26. Paratkar S., Patel S.S. Mitochondrial transcription factor Mtfl traps the unwound non-template strand to facilitate open complex formation. // J. Biol. Chem. 2010. 285(6): 3949-3956.

27. Bulygin K.N., Khairulina Y.S., Kolosov P.M., Ven'yaminova A.G., Graifer D.M., Vorobjev Y.N., Frolova L.Y., Kisselev L.L., Karpova G.G. Three distinct peptides from the N domain of translation termination factor eRFl surround stop codon in the ribosome. // RNA. 2010. 16(10): 1902-1914.

28. Булыгин K.H., Попугаева E.A., Репкова M.H., Мещанинова М.И., Веньяминова А.Г., Грайфер Д.М., Фролова Л.Ю., Карпова Г.Г. С-домен фактора терминации трансляции eRFl сближен со стоп-кодоном в А-участке 80S рибосомы. // Молекуляр. биология. 2007. 41(5): 858867.

29. Хайрулина Ю.С., Молотков М.В., Булыгин К.Н., Грайфер Д.М., Веньяминова А.Г., Фролова Л.Ю., Шталь И., Карпова Г.Г. Фрагменты белка S3, соседствующие с мРНК в рибосоме человека при элонгации и терминации трансляции. // Биоорг. химия. 2008. 34(6): 773-780.

30. Молотков М.В., Грайфер Д.М., Попугаева Е.А., Булыгин К.Н., Мещанинова М.И., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Белок S3 в 80S рибосоме человека соседствует с мРНК с 3'-стороны от ко дона в А-участке. // Биоорг. химия. 2007. 33(4): 431-441.

31. Хайрулина Ю.С., Молотков М.В., Булыгин К.Н., Грайфер Д.М., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. С-концевой фрагмент рибосомного белка S15 расположен в декодирующем центре рибосомы человека. // Молекуляр. биология. 2008. 42(2): 306-313.

32. Meisenheimer К.М., Koch Т.Н. Photocross-linking of nucleic acids to associated proteins. // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol 1997. 32(2): 101-140.

33. Rutvisuttinunt W., Meyer P.R., Scott W.A. Interactions between HIV-1 reverse transcriptase and the downstream template strand in stable complexes with primer-template. // PLoS. One. 2008. 3(10): e3561.

34. Ha K.S., Toulokhonov I., Vassylyev D.G., Landick R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. II J. Mol Biol 2010. 401(5): 708-725.

35. Schwer B. A conformational rearrangement in the spliceosome sets the stage for Prp22-dependent mRNA release. II Mol Cell. 2008. 30(6): 743-754.

36. Turunen J.J., Will C.L., Grote M., Luhrmann R., Frilander M.J. The U11-48K protein contacts the 5' splice site of U12-type introns and the U11-59K protein. // Mol Cell Biol. 2008. 28(10): 3548-3560.

37. Haugen S.P., Berkmen M.B., Ross W., Gaal T., Ward C., Gourse R.L. rRNA promoter regulation by nonoptimal binding of sigma region 1.2: an additional recognition element for RNA polymerase. II Cell. 2006.125(6): 1069-1082.

38. Haugen S.P., Ross W., Manrique M., Gourse R.L. Fine structure of the promoter-sigma region 1.2 interaction. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2008.105(9): 3292-3297.

39. Pisarev A.V., Kolupaeva V.G., Yusupov M.M., Hellen C.U., Pestova T.V. Ribosomal position and contacts of mRNA in eukaryotic translation initiation complexes. // EMBO J. 2008. 27(11): 1609-1621.

40. Koleva R.I., Austin C.A., Kowaleski J.M., Neems D.S., Wang L., Vary C.P., Schlax P.J. Interactions of ribosomal protein SI with DsrA and rpoS mRNA. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. 348(2): 662-668.

41. Hafner M., Landthaler M., Burger L., Khorshid M., Hausser J., Berninger P., Rothballer A., Ascano M. Jr., Jungkamp A.C., Munschauer M., Ulrich A., Wardle G.S., Dewell S., Zavolan M., Tuschl T. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. II Cell 2010.141(1): 129-141.

42. Nishiyama T., Yamamoto H., Uchiumi T., Nakashima N. Eukaryotic ribosomal protein RPS25 interacts with the conserved loop region in a dicistroviral intergenic internal ribosome entry site. // Nucleic Acisd Res. 2007. 35(5): 1514-1521.

43. Lu K., Ye W., Zhou L., Collins L.B., Chen X., Gold A., Ball L.M., Swenberg J.A. Structural characterization of formaldehyde-induced cross-links between amino acids and deoxynucleosides and their oligomers. II J. Am. Chem. Soc. 2010. 132(10): 3388-3399.

44. Qin H., Wang Y. Exploring DNA-binding proteins with in vivo chemical cross-linking and mass spectrometry. II J. Proteome Res. 2009. 8(4): 1983-1991.

45. Guerrero C., Tagwerker C., Kaiser P., Huang L. An integrated mass spectrometry-based proteomic approach: quantitative analysis of tandem affinity-purified in vivo cross-linked protein

complexes (QTAX) to decipher the 26 S proteasome-interacting network. // Mol. Cell. Proteomics. 2006. 5(2): 366-378.

46. Han Y.T., Hsu Y.H., Lo C.W., Meng M. Identification and functional characterization of regions that can be crosslinked to RNA in the helicase-like domain of BaMV replicase. // Virology.

2009. 389(1-2): 34-44.

47. Hinz J.M., Rodriguez Y., Smerdon M.J. Rotational dynamics of DNA on the nucleosome surface markedly impact accessibility to a DNA repair enzyme. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010.107(10): 4646-4651.

48. Kim Y.C., Cheng Kao C. Biochemical analyses of the interactions between viral polymerases and RNAs. II Methods Mol. Biol 2008. 451: 185-200.

49. Vasudevan S., Steitz J.A. AU-rich-element-mediated upregulation of translation by FXR1 and Argonaute 2. // Cell. 2007.128(6): 1105-1118.

50. Bogenhagen D.F., Rousseau D., Burke S. The layered structure of human mitochondrial DNA nucleoids. II J. Biol. Chem. 2008. 283(6): 3665-3675.

51. Jayani R.S., Ramanujam P.L., Galande S. Studying histone modifications and their genomic functions by employing chromatin immunoprecipitation and immunoblotting. // Methods Cell. Biol.

2010. 98: 35-56.

52. Xie Z., Hu S., Qian J., Blackshaw S., Zhu H. Systematic characterization of protein-DNA interactions. II Cell. Mol. Life Sci. 2011. 68(10): 1657-1668.

53. Piersen C.E., McCullough A.K., Lloyd R.S. AP lyases and dRPases: commonality of mechanism. // Mutat. Res. 2000. 459(1): 43-53.

54. Rieger R.A., Zaika E.I., Xie W., Johnson F., Grollman A.P., Iden C.R., Zharkov D.O. Proteomic approach to identification of proteins reactive for abasic sites in DNA. // Mol. Cell. Proteomics. 2006. 5(5):858-867.

55. Ходырева C.H., Лаврик О.И. Аффинная модификация в протеомном исследовании ансамблей репарации ДНК. // Биоорган, химия. 2011. 37(1): 91-107.

56. Prasad R., Longley M.J., Sharief F.S., Hou E.W., Copeland W.C., Wilson S.H. Human DNA polymerase 0 possesses 5'-dRP lyase activity and functions in single-nucleotide base excision repair in vitro. II Nucleic Acids Res. 2009. 37(6): 1868-1877.

57. Ilina E.S., Lavrik O.I., Khodyreva S.N. Ku antigen interacts with abasic sites. // Biochim. Biophys. Acta. 2008.1784(11): 1777-1785.

58. Khodyreva S.N., Prasad R., Ilina E.S., Sukhanova M.V., Kutuzov M.M., Liu Y., Hou E.W., Wilson S.H., Lavrik O.I. Apurinic/apyrimidinic (AP) site recognition by the 5'-dRP/AP lyase in

poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1). // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. 107(51): 2209022095.

59. Grin I.R., Khodyreva S.N., Nevinsky G.A., Zharkov D.O. Deoxyribophosphate lyase activity of mammalian endonuclease VHI-like proteins. IIFEBS Lett. 2006. 580(20): 4916-4922.

60. Verdine G.L., Norman D.P. Covalent trapping of protein-DNA complexes. // Annu. Rev. Biochem. 2003. 72: 337-366.

61. Rohs R., Jin X., West S.M., Joshi R., Honig B., Mann R.S. Origins of specificity in proteinDNA recognition. II Annu. Rev. Biochem. 2010. 79: 233-269.

62. Hrmova M., Fincher G.B. Functional genomics and structural biology in the definition of gene function. II Methods Mol. Biol. 2009. 513: 199-227.

63. Dauter Z. Current state and prospects of macromolecular crystallography. // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2006. 62(Pt 1): 1-11.

64. http://www.bnl.gov/discover/Spring_04/crystallography.asp

65. Hollis T. Crystallization of protein-DNA complexes. // Methods Mol. Biol. 2007. 363: 225237.

66. He C., Verdine G.L. Trapping distinct structural states of a protein/DNA interaction through disulfide crosslinking. // Chem. Biol. 2002. 9(12): 1297-1303.

67. Banerjee A., Yang W., Karplus M., Verdine G.L. Structure of a repair enzyme interrogating undamaged DNA elucidates recognition of damaged DNA. II Nature. 2005. 434(7033): 612-618.

68. Yi C., Jia G., Hou G., Dai Q., Zhang W., Zheng G., Jian X., Yang C.G., Cui Q., He C. Iron-catalysed oxidation intermediates captured in a DNA repair dioxygenase. // Nature. 2010. 468(7321): 330-333.

69. Yang C.G., Yi C., Duguid E.M., Sullivan C.T., Jian X., Rice P.A., He C. Crystal structures of DNA/RNA repair enzymes AlkB and ABH2 bound to dsDNA. II Nature. 2008. 452(7190): 961-965.

70. Malecka K.A., Ho W.C., Marmorstein R. Crystal structure of a p53 core tetramer bound to DNA. // Oncogene. 2009. 28(3): 325-333.

71. Tahirov T.H., Babayeva N.D., Varzavand K., Cooper J.J., Sedore S.C., Price D.H. Crystal structure of HIV-1 Tat complexed with human P-TEFb. II Nature. 2010. 465(7299): 747-751.

72. Opalka N., Brown J., Lane W.J., Twist K.A., Landick R., Asturias F.J., Darst S.A. Complete structural model of Escherichia coli RNA polymerase from a hybrid approach. // PLoS Biol. 2010. 8(9): el000483.

73. Zhang A.P., Pigli Y.Z., Rice P.A. Structure of the LexA-DNA complex and implications for SOS box measurement. II Nature. 2010. 466(7308): 883-886.

74. Ochi T., Sibanda B.L., Wu Q., Chirgadze D.Y., Bolanos-Garcia V.M., Blundell T.L. Structural biology of DNA repair: spatial organisation of the multicomponent complexes of nonhomologous end joining. II J. Nucleic Acids. 2010. 2010: 621695.

75. Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. // Nucleic Acids Res. 2001. 29(18): 3705-3727.

76. Obayashi E., Oubridge C., Pomeranz Krümmel D., Nagai K. Crystallization of RNA-protein complexes. II Methods Mol. Biol. 2007. 363: 259-276.

77. Kalodimos C.G., Biris N., Bonvin A.M., Levandovski M.M., Guennuegues M., Boelens R., Kaptein R. Structure and flexibility adaptation in nonspecific and specific protein-DNA complexes. II Science. 2004. 305(5682): 386-389.

78. http://www.uam.es/otros/germn/images/doc-MR.pdf

79. Dupureur C.M. NMR studies of restriction enzyme-DNA interactions: role of conformation in sequence specificity. // Biochemistry. 2005. 44(13): 5065-5074.

80. Eilebrecht S., Smet-Nocca C., Wieruszeski J.M., Benecke A. SUMO-1 possesses DNA binding activity. // BMC. Res. Notes. 2010. 3(1): 146.

81. Volkov A.N., Ubbink M., van Nuland N.A. Mapping the encounter state of a transient protein complex by PRE NMR spectroscopy. // J. Biomol. NMR. 2010. 48(4): 225-236.

82. Iwahara J., Clore G.M. Detecting transient intermediates in macromolecular binding by paramagnetic NMR. II Nature. 2006. 440(7088): 1227-1230.

83. Iwahara J., Schwieters C.D., Clore G.M. Characterization of nonspecific protein-DNA interactions by 1H paramagnetic relaxation enhancement. // J. Am. Chem. Soc. 2004. 126(40): 12800-12808.

84. Varani G., Chen Y., Leeper T.C. NMR studies of protein-nucleic acid interactions. // Methods Mol. Biol. 2004. 278: 289-312.

85. Ohyama T., Furukawa A., Mashima T., Sugiyama T., Ohgara S., Yamazaki T., Imai T., Okano H., Nagata T., Katahira M. Structural analysis of Musashi-RNA complex on the basis of long-range structural information. // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxj). 2008. (52): 193-194.

86. Volkov A.N., Worrall J. A., Holtzmann E., Ubbink M. Solution structure and dynamics of the complex between cytochrome c and cytochrome c peroxidase determined by paramagnetic NMR. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2006.103(50): 18945-18950.

87. Galius V., Leontiou C., Richmond T., Wider G. Projected ['H, 15N]-HMQC-[ 'H, ^j-NOESY for large molecular systems: application to a 121 kDa protein-DNA complex. // J. Biomol. NMR. 2008. 40(3): 175-181.

88. Iwahara J., Zweckstetter M., Clore G.M. NMR structural and kinetic characterization of a homeodomain diffusing and hopping on nonspecific DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. 103(41): 15062-1507.

89. Fraenkel E., Pabo C.O. Comparison of X-ray and NMR structures for the Antennapedia homeodomain-DNA complex. II Nat. Struct. Biol. 1998. 5(8): 692-697.

90. Du Z., Lee J.K., Fenn S., Tjhen R., Stroud R.M., James T.L. X-ray crystallographic and NMR studies of protein-protein and protein-nucleic acid interactions involving the KH domains from human poly(C)-binding protein-2. H RNA. 2007.13(7): 1043-1051

91. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. Section 4.5. Three-dimensional protein structure can be determined by NMR spectroscopy and X-ray crystallography// Biochemistry. 5th edition. / New York: W. H. Freeman. 2002.

92. Matzapetakis M., Turano P., Theil E.C., Bertini I. 13C-13C NOESY spectra of a 480 kDa protein: solution NMR of ferritin. II J. Biomol. NMR. 2007. 38(3): 237-242.

93. Fiaux J., Bertelsen E.B., Horwich A.L., Wuthrich K. NMR analysis of a 900K GroEL GroES complex. II Nature. 2002. 418(6894): 207-211.

94. Frank J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy -30 years. // Q. Rev. Biophys. 2009. 42(3): 139-158.

95. Rambo R.P., Tainer J.A. Bridging the solution divide: comprehensive structural analyses of dynamic RNA, DNA, and protein assemblies by small-angle X-ray scattering. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2010. 20(1): 128-137.

96. Сердюк И.Н. Физические методы в структурной молекулярной биологии начала XXI века. // Успехи биол. химии. 2002. 42: 3-28.

97. Szymczyna B.R., Taurog R.E., Young M.J., Snyder J.C., Johnson J.E., Williamson J.R. Synergy of NMR, computation, and X-ray crystallography for structural biology. // Structure. 2009. 17(4): 499-507.

98. Tang L., Johnson J.E. Structural biology of viruses by the combination of electron cryomicroscopy and X-ray crystallography. // Biochemistry. 2002. 41(39): 11517-11524.

99. Altman S. A view of RNase P. // Mol. Biosyst. 2007. 3(9): 604-607.

100. Ellis JC, Brown JW. The RNase P family. // RNA Biol. 2009. 6(4): 362-369.

101. Esakova O., Krasilnikov A.S. Of proteins and RNA: the RNase P/MRP family. // RNA. 2010. 16(9): 1725-1747.

102. Jarrous N., Gopalan V. Archaeal/Eukaryal RNase P: subunits, functions and RAN diversification. 11 Nucleic Acids Res. 2010. 38(22): 7885-7894.

103. Altman S. Ribonuclease P. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 2011. 366(1580): 29362941.

104. Robertson H.D., Altman S., Smith J.D. Purification and properties of a specific Escherichia coli ribonuclease which cleaves a tyrosine transfer ribonucleic acid precursor. // J. Biol. Chem. 1972. 247(16): 5243-5251.

105. Altman S., Robertson H.D. RNA precursor molecules and ribonuclease in E. coli. II Mol. Cell. Biochem. 1973.1(1): 83-93.

106. Doudna J.A., Cech T.R. The chemical repertoire of natural ribozymes // Nature. 2002. 418(6894): 222-228.

107. Guerrier-Takada C., Altman S. Catalytic activity of an RNA molecule prepared by transcription in vitro. II Science. 1984. 223(4633): 285-286.

108. Peck-Millert K., Altman S. Kinetics of the processing of the precursor to 4.5 S RNA, a naturally occurring substrate for RNase P from Escherichia coli. II J. Mol. Biol. 1991. 221(1): 1-5.

109. Bothwell A.L., Garber R.L., Altman S. Nucleotide sequence and in vitro processing of a precursor molecule to Escherichia coli 4.5 S RNA. II J. Biol. Chem. 1976. 251(23): 7709-7716.

110. Komine Y., Kitabatake M., Yokogawa T., Nishikawa K., Inokuchi H. A tRNA-like structure is present in lOSa RNA, a small stable RNA from Escherichia coli. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. 91(20): 9223-9227.

111. Li Y., Altman S. A specific endoribonuclease, RNase P, affects gene expression of polycistronic operon mRNAs. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. 100(23): 13213-13218.

112. Li Y., Altman S. Polarity effects in the lactose operon of Escherichia coli. II J. Mol. Biol. 2004. 339(1): 31-39.

113. Altman S., Wesolowski D., Guerrier-Takada C., Li Y. RNase P cleaves transient structures in some riboswitches. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2005. 102(32): 11284-11289.

114. Seif E., Altman S. RNase P cleaves the adenine riboswitch and stabilizes pbuE mRNA in Bacillus subtilis. II RNA. 2008.14(6): 1237-1243.

115. Willkomm D.K., Hartmann R.K. An important piece of the RNase P jigsaw solved. // Trends Biochem. Sei. 2007. 32(6): 247-250.

116. Salavati R., Panigrahi A.K., Stuart K.D. Mitochondrial ribonuclease P activity of Trypanosoma brucei. II Mol. Biochem. Parasitol. 2001.115(1): 109-117.

117. Holzmann J., Frank P., Löffler E., Bennett K.L., Gerner C., Rossmanith W. RNase P without RNA: identification and functional reconstitution of the human mitochondrial tRNA processing enzyme. // Cell. 2008. 135(3): 462-474.

118. Holzmann J., Rossmanith W. tRNA recognition, processing, and disease: hypotheses around an unorthodox type of RNase P in human mitochondria. // Mitochondrion. 2009. 9(4): 284-288.

119. Wang M.J., Gegenheimer P. Novel mechanisms for maturation of chloroplast transfer RNA precursors. HEMBO. J. 1988. 7(6): 1567-1574.

120. Thomas B.C., Li X., Gegenheimer P. Chloroplast ribonuclease P does not utilize the ribozyme-type pre-tRNA cleavage mechanism. II RNA. 2000. 6(4): 545-553.

121. Kirsebom L.A., Trobro S. RNase P RNA-mediated cleavage. // IUBMB Life. 2009. 61(3): 189200.

122. Baird N.J., Fang X.-W., Srividya N., Pan T., Sosnick T.R. Folding of a universal ribozyme: The ribonuclease P RNA. // Q. Rev. Biophys. 2007. 40(2): 113-161.

123. Kazantsev A.V., Krivenko A.A., Pace N.R. Mapping metal-binding sites in the catalytic domain of bacterial RNase P RNA. II RNA . 2009.15(2): 266-276.

124. Hsieh J., Koutmou K.S., Rueda D., Koutmos M., Walter N.G., Fierke C.A. A divalent cation stabilizes the active conformation of the B. subtilis RNase P'pre-tRNA complex: A role for an inner-sphere metal ion in RNase P. II J. Mol. Biol. 2010. 400(1): 38-51.

125. Stark B.C., Kole R., Bowman E.J., Altman S. Ribonuclease P: an enzyme with an essential RNA component. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1978. 75(8): 3717-3721.

126. Brown J.W., Pace N. Ribonuclease P RNA and protein subunits from bacteria. // Nucleic Acids Res. 1992. 20(7): 1451-1456.

127. Guerrier-Takada C., Gardiner K., Marsh T., Pace N., Altman S. The RNA moiety of Ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. // Cell. 1983. 35(3 Pt. 2): 849-857.

128. Kole R., Altman S. Properties of purified ribonuclease P from Escherichia coli. II Biochemistry. 1981. 20(7): 1902-1906.

129. Hall T.A., Brown J.W. Archaeal RNase P has multiple protein subunits homologous to eukaryotic nuclear RNase P proteins. // RNA. 2002. 8(3): 296-306.

130. Hartmann E., Hartmann R.K. The enigma of ribonuclease P evolution. // Trends Genet. 2003. 19(10): 561-569.

131. Terada A., Honda T., Fukuhara H., Hada K., Kimura M. Characterization of the archaeal ribonuclease P proteins from Pyrococcus horikoshii OT3. // J. Biochem. 2006.140(2): 293-298.

132. Fukuhara H., Kifusa M., Watanabe M., Terada A., Honda T., Numata T., Kakuta Y., Kimura M. A fifth protein subunit Phl496p elevates the optimum temperature for the ribonuclease P activity from Pyrococcus horikoshii OT3. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. 343(3): 956-964.

133. Cho I.M., Lai L.B., Susanti D., Mukhopadhyay В., Gopalan V. Ribosomal protein L7Ae is a subunit of archaeal RNase P. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2010. 107(33): 14573-14578.

134. Chamberlain J.R., Lee Y., Lane W.S., Engelke D.R. Purification and characterization of the nuclear RNase P holoenzyme complex reveals extensive subunit overlap with RNase MRP. // Genes Dev. 1998. 12(11): 1678-1690.

135. Jarrous N. Human ribonuclease P: subunits, function, and intranuclear localization. // RNA. 2002. 8(1): 1-7.

136. Marvin M.C., Engelke D.R. Broadening the mission of an RNA enzyme. // J. Cell. Biochem. 2009.108(6): 1244-1251.

137. Kikovska E., Svärd S.G., Kirsebom L.A. Eukaryotic RNase P RNA mediates cleavage in the absence of protein. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007.104(7): 2062-2067.

138. Pannucci J.A., Haas E.S., Hall T.A., Harris K., Brown J.W. RNase P RNAs from some Archaea are catalytically active. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. 96(14): 7803-7808.

139. Thomas B.C., Chamberlain J., Engelke D.R., Gegenheimer P. Evidence for an RNA-base catalytic mechanism in eukaryotic nuclear ribonuclease P. // RNA. 2000. 6(4): 554-562.

140. Li D., Willkomm D.K., Hartmann R.K. Minor changes largely restore catalytic activity of archaeal RNase P RNA from Methanothermobacter thermoautotrophicus. // Nucleic Acids Res. 2009. 37(1): 231-242.

141. Haas E.S., Banta A.B., Harris J.K., Pace N.R., Brown J.W. Structure and evolution of ribonuclease P RNA in Gram-positive bacteria. // Nucleic Acids Res. 1996. 24(23): 4775-4782.

142. Kazantsev A.V., Pace N.R. Bacterial RNase P: a new view of an ancient enzyme. //Nat. Rev. Microbiol. 2006. 4(10): 729-740.

143. Chen J.L., Nolan J.M., Harris M.E., Pace N.R. Comparative photocross-linking analysis of the tertiary structures of Escherichia coli and Bacillus subtilis RNase P RNA. // EMBO. J. 1998. 17(5): 1515-1525.

144. Massire С., Jaeger L., Westhof E. Derivation of the three-dimensional architecture of bacterial ribonuclease P RNAs from comparative sequence analysis. // J. Mol. Biol. 1998. 279(4): 773-793.

145. Waugh D.S., Pace N.R. Complementation of an RNase P RNA (rnpB) gene deletion in Escherichia coli by homologous genes from distantly related eubacteria. // J. Bacteriol. 1990. 172(11): 6316-6322.

146. Wegscheid В., Condon С., Hartmann R.K. Type A and В RNase P RNA are interchangeable in vivo despite substsntial biophysical differences. // EMBO Rep. 2006. 7(4): 411-417.

147. Loria A., Pan T. Recognition of the T stem-loop of a pre-tRNA substrate by the ribozyme from Bacillus subtilis ribonuclease P. // Biochemistry. 1997. 36(21): 6317-6325.

148. Odell L., Huang V., Jakacka M., Pan T. Interaction of structural modules in substrate binding by the ribozyme from Bacillus subtilis RNase P. II Nucleic Acids Res. 1998. 26(16): 3717-3723.

149. Reiter N.J., Osterman A., Torres-Larios A., Swinger K.K., Pan T., Mondragon A. Structure of a bacterial ribonuclease P holoenzyme in complex with tRNA. II Nature. 2010. 468(7325): 784-789.

150. Zahler N.H., Christian E.L., Harris M.E. Recognition of the 5' leader of pre-tRNA substrates by the active site of ribonuclease P. // RNA. 2003. 9(6): 734-745.

151. Loria A., Pan T. Modular construction for function of a ribonucleoprotein enzyme: the catalytic domain of Bacillus subtilis RNase P complexed with B. subtilis RNase P protein. // Nucleic Acids Res. 2001.29(9): 1892-1897.

152. Pan T. Higher order folding and domain analysis of the ribozyme from Bacillus subtilis ribonuclease P. II Biochemistry. 1995. 34(3): 902-909.

153. Loria A., Pan T. Domain structure of the ribozyme from eubacterial ribonuclease P. // RNA. 1996. 2(6): 551-563.

154. Chen J.L., Pace N.R. Identification of the universally conserved core of ribonuclease P RNA. II RNA. 1997. 3(6): 557-560.

155. Reich C., Olsen G.J., Pace B., Pace N.R. Role of the protein moiety of ribonuclease P, a ribonucleoprotein enzyme. // Science. 1988. 239(4836): 178-181.

156. Gossringer M., Far R.K.-K., Hartmann R.K. Analysis of RNase P protein (rnpA) expression in Bacillus subtilis utilizing strains withsuppressible rnpA expression. // J. Bacteriol. 2006. 188(19): 6816-6823.

157. Kurz J.C., Niranjanakumari S., Fierke C.A. Protein component of Bacillus subtilis RNase P specifically enhances the affinity for precursor-tRNAAsp. // Biochemistry. 1998. 37(8): 2393-2400.

158. Sun L., Campbell F.E., Yandek L.E., Harris M.E. Binding of C5 protein to P RNA enhances the rate constant for catalysis for P RNA processing of pre-tRNAs lacking a consensus G+l/C+72 pair. II J. Mol. Biol. 2010. 395(5): 1019-1037.

159. Buck A.H., Dalby A.B., Poole A.W., Kazantsev A.V., Pace N.R. Protein activation of a ribozyme: The role of bacterial RNase P protein. // EMBO. J. 2005. 24(19): 3360-3368.

160. Kim J.J., Kilani A.F., Zhan X., Altman S., Liu F. The protein cofactor allows the sequence of an RNase P ribozyme to diversify by maintaining the catalytically active structure of the enzyme. // RNA. 1997. 3(6): 613-623.

161. Peck-Miller K.A., Altman S. Kinetics of the processing of the precursor to 4.5 S RNA, a naturally occurring substrate for RNase P from Escherichia coli. II J. Mol. Biol. 1991. 221(1): 1-5.

162. Sun L., Campbell F.E., Zahler N.H., Harris M.E. Evidence that substrate-specific effects of C5 protein lead to uniformity in binding and catalysis by RNase P. // EMBO. J. 2006. 25(17): 39984007.

163. Koutmou K.S., Zahler N.H., Kurz J.C., Campbell F.E., Harris M.E., Fierke C.A. Protein-precursor tRNA contact leads to sequence-specific recognition of 5' leaders by bacterial ribonuclease P. II J. Mol. Biol. 2010. 396(1): 195-208.

164. Niranjanakumari S., Stams T., Crary S.M., Christianson D.W., Fierke C.A. Protein component of the ribozyme ribonuclease P alters substrate recognition by directly contacting precursor tRNA. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. 95(26): 15212-15217.

165. Rueda D., Hsieh J., Day-Storms J.J., Fierke C.A.,Walter N.G. The 5' leader of precursor tRNAAsp bound to the Bacillus subtilis RNase P holoenzyme has an extended conformation. // Biochemistry. 2005. 44(49): 16130-16139.

166. Kurz J.C., Fierke C.A. The affinity of magnesium binding sites in the Bacillus subtilis RNase P*pre-tRNA complex is enhanced by the protein subunit. // Biochemistry. 2002. 41(30): 9545-9558.

167. Sun L., Harris M.E. Evidence that binding of C5 protein to P RNA enhances ribozyme catalysis by influencing active site metal ion affinity. II RNA. 2007.13(9): 1505-1515.

168. Kazantsev A.V., Krivenko A.A., Harrington D.J., Carter R.J., Holbrook S.R., Adams P.D., Pace N.R. High-resolution structure of RNase P protein from Thermotoga maritima. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003.100(13): 7497-7502.

169. Stams T., Niranjanakumari S., Fierke C.A., Christianson D.W. Ribonuclease P protein structure: Evolutionary origins in the translational apparatus. // Science. 1998. 280(5364): 752-755.

170. Niranjanakumari S., Day-Storms J.J., Ahmed M., Hsieh J., Zahler N.H., Venters R.A., Fierke C.A. Probing the architecture of the B. subtilis RNase P holoenzyme active site by cross-linking and affinity cleavage. // RNA. 2007.13(4): 521-535.

171. Koutmou K.S., Day-Storms J.J., Fierke C.A. The RNR motif of B. subtilis RNase P protein interacts with both PRNA and pre-tRNA to stabilize an active conformer. // RNA. 2011. 17(7): 1225-1235.

172. Smith J.K., Hsieh J., Fierke C.A. Importance of RNA-protein interactions in bacterial ribonuclease P structure and catalysis. // Biopolymers. 2007. 87(5-6): 329-338.

173. Gopalan V., Kühne H., Biswas R., Li H., Brudvig G.W., Altman S. Mapping RNA-protein interactions in ribonuclease P from Escherichia coli using electron paramagnetic resonance spectroscopy. // Biochemistry. 1999. 38(6): 1705-1714.

174. Biswas R., Ledman D.W., Fox R.O., Altman S., Gopalan V. Mapping RNA-protein interactions in ribonuclease P from Escherichia coli using disulfide-linked EDTA-Fe. // J. Mol. Biol. 2000. 296(1): 19-31.

175. Tsai T.-Y., Masquida B., Biswas R., Westhof E., Gopalan V. Molecular modeling of the three-dimensional structure of the bacterial RNase P holoenzyme. II J. Mol. Biol. 2003. 325(4): 661-675.

176. Buck A.H., Kazantsev A.V., Dalby A.B., Pace N.R. Structural perspectives on the activation of RNase P RNA by protein. II Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. 12(11): 958-964.

177. Christian E.L., Zahler N.H., Kaye N.M., Harris M.E. Analysis of substrate recognition by the ribonucleoprotein nuclease RNase P. // Methods. 2002. 28(3): 307-322.

178. Masquida B., Westhof E. RNase P: at last, the key finds its lock. II RNA. 2011. 17(9): 16151618.

179. Kendrew J.C., Bodo G., Dintzis H.M., Parrish R.G., Wyckoff H., Phillips D.C. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by X-ray analysis. // Nature. 1958. 181(4610): 662-666.

180. Muirhead H., Perutz M. Structure of hemoglobin. A three-dimensional Fourier synthesis of reduced human hemoglobin at 5.5 Ä resolution. II Nature. 1963. 199: 633-638.

181. Kachalova A.V., Zatsepin T.S., Romanova E.A., Stetsenko D.A., Gait M.J., Oretskaya T.S. Synthesis of modified nucleotide building blocks containing electrophilic groups in the 2'-position. II Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids. 2000. 19(10-12): 1693-1707.

182. Zubin E.M., Stetsenko D.A., Zatsepin T.S., Gait M.J., Oretskaya T.S. Oligonucleotides containing 2'-0-[2-(2,3-dihydroxypropyl)amino-2-oxoethyl]uridine as suitable precursors of 2'-aldehyde oligonucleotides for chemoselective ligation. // Bioorg. Med. Chem. 2005. 13(16): 49124920.

183. Zatsepin T.S., Stetsenko D.A., Arzumanov A.A., Romanova E.A., Gait M.J., Oretskaya T.S. Synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates with single and multiple peptides attached to 2'-aldehydes through thiazolidine, oxime, and hydrazine linkages. // Bioconjug. Chem. 2002. 13(4): 822-830.

184. Dolinnaya N.G., Zubin E.M., Kubareva E.A., Zatsepin T.S., Oretskaya T.S. Design and synthesis of 2'-functionalized oligonucleotides. Their application for covalent trapping the proteinDNA complexes. // Curr. Org. Chem. 2009. 13(11): 1029-1049.

185. Казанова Е.В. Производные нуклеиновых кислот, содержащие модифицированные звенья 2'-0-алкильного типа: 2'-аминокислотные и 2'-альдегидные олигонуклеотиды. // Дисс. канд. хим. наук. МГУ. Москва. 2010. 142 с.

186. Качалова А.В., Зубин Е.М., Орецкая Т. С. Методы синтеза олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные электрофильные группировки. // Успехи химии. 2002. 71(12): 1173-1192.

187. Ермолинский Б.С., Михайлов С.Н. Реакция периодатного окисления в химии нуклеиновых кислот. Диальдегидные производные нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов. // Биоорг. химия. 2000. 26(7): 483-504.

188. Baouz S., Woisard A., Sinapah S., Le Caer J.P., Argentini M., Bulygin K., Aguie' G., Hountondji C. The human large subunit ribosomal proteinL36A-like contacts the CCA end of P-site bound tRNA. // Biochimie. 2009. 91(11-12): 1420-1425.

189. Pfander S., Fiammengo R., Kirin S.I., Metzler-Nolte N., Jaschke A. Reversible site-specific tagging of enzymatically synthesized RNAs using aldehyde-hydrazine chemistry and protease-cleavable linkers. // Nucleic Acids Res. 2007. 35(4): e25.

190. Xu Y.-Z., Liu W.-Y. Effects of the active aldehyde group generated by RNA N-glycosidase in the sarcin/ricin domain of rat 28S ribosomal RNA on peptide elongation. // Biol. Chem. 2000. 381(2): 113-119.

191. http://www.glenresearch.com/Technical/TB_RNA_TBDMS_Deprotection.pdf

192. Никольская И.И., Карташова И.М., Лопатина Н.Г. Ферменты новой системы хозяйской специфичности Sso47II. // Молекулярн. генетика. 1983.12(1): 5-10.

193. Воробьева О.В., Васильев С.А., Карягина А.С., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Анализ контактов между ДНК и белком в комплексе метилтрансфераза SsoII-промоторная область генов системы рестрикции-модификации SsoII. // Молекуляр. биология. 2000. 34(6): 10741080.

194. Achilles К., Kiedrowski G.V. Kinetic model studies on the chemical ligation of oligonucleotides viahydrazone formation. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005.15(4): 1229-1233.

195. Raddatz S., Mueller-Ibeler J., Kluge J., Wass L., Burdinski G., Havens J.R., Onofrey T.J., Wang D., Schweitzer M. Hydrazide oligonucleotides: new chemical modification for chip array attachment and conjugation. II Nucleic Acids Res. 2002. 30(21): 4793-4802.

196. Ghosh S.S., Kao P.M., Kwoh D.Y. Synthesis of 5'-oligonucleotide hydrazide derivatives and their use in preparation of enzyme-nucleic acid hybridization probes. // Anal. Biochem. 1989. 178(1): 43-51.

197. Oshevski S.I. Concept of "Binary oligonucleotide reagent". // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 1998.17(9-11): 1969-1975.

198. Zubin E.M., Stetsenko D.A., Gait M.J., Oretskaya T.S. 1,2-Diol and hydrazide phosphoramidites for solid-phase synthesis and chemoselective ligation of 2'-modified oligonucleotides. // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2003. 22(5-8): 1375-1378.

199. Freier S.M., Altmann K.H. The ups and downs of nucleic acid duplex stability: structure-stability studies on chemically-modified DNA:RNA duplexes. // Nucleic Acids Res. 1997. 25(22): 4429-4443.

200. Gyi J.I., Lane A.N., Conn G.L., Brown T. Solution structures of DNA'RNA hybrids with purine-rich and pyrimidine-rich strands: comparison with the homologous DNA and RNA duplexes. //Biochemistry. 1998. 37(1): 73-80.

201. Карягина A.C. Структурно-функциональная характеристика систем рестрикции-модификации ДНК штамма Shigella sonnei 47. // Дисс. докт. биол. наук. ВНИИ РАСХН. Москва. 1997. 331 с.

202. Тедиашвили М.И., Упорова Т.М., Никольская И.И., Дебов С.С. Обнаружение системы хозяйской специфичности у шигелл. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1980. 90(9): 324325.

203. Упорова Т.М., Карташова И.М., Скрипкин Е.А., Лопарева Е., Никольская И.И. Эндонуклеазы рестрикции из Shigella sonnei 47. // Вопросы медицинской химии. 1985. 31(2): 131-136.

204. Kubareva Е.А., Petrauskene O.V., Karyagina A.S., Tashlitsky V.N., Nikolskaya I.I., Gromova E.S. Cleavage of synthetic substrates containing non-nucleotide inserts by restriction endonucleases. Change in the cleavage specificity of endonuclease SsoII. // Nucleic Acids Res. 1992. 20(17): 45334538.

205. Brevnov M.G., Kubareva E.A., Romonova E.A., Volkov E.M., Karyagina A.S., Nikolskaya 1.1., Gromova E.S. Interaction of the Mval and SsoII methyltransferases with DNAs altered at the central base pair of recognition sequence. // Gene. 1995.157(1-2): 149-152.

206. Федотова E.A., Ян Ф., Кубарева Е.А., Романова Е.А., Проценко А.С., Вирясов М.Б., Гианик Т., Орецкая Т.С. Синтез и свойства модифицированных ДНК-фрагментов с включениями тимидингликоля. // Биоорг. химия. 2008. 34(2): 236-244.

207. Громова Е.С., Хорошаев А.В. Прокариотические ДНК-метилтрансферазы: структура и механизм взаимодействия с ДНК. //Молекуляр. биология. 2003. 37(2): 300-314.

208. Воробьева О.В., Карягина А.С., Волков Е.М., Вирясов М.Б., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Анализ контактов метилтранеферазы SsoII с ДНК в фермент-субстратном комплексе. // Биоорг. химия. 2002. 28(5): 402-410.

209. Романенков А.С., Кисиль О.В., Зацепин Т.С., Ямскова О.В., Карягина А.С., Метелев В.Г., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. ДНК-метилтрансфераза SsoII как бифункциональный белок: особенности взаимодействия с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации SsoII. // Биохимия. 2006. 71(12): 1648-1658.

210. Рязанова А.Ю., Молочков Н.В., Абросимова JI.A., Алексеевский А.В., Карягина А.С., Проценко А.С., Friedhoff Р., Орецкая Т.С, Кубарева Е.А. Вторичная структура N-концевой области SsoII-подобных С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, определенная методом спектроскопии кругового дихроизма. // Молекуляр. биология. 2010. 44(5): 911-921.

211. Судьина А.Е., Зацепин Т.С., Пингоуд В., Пингоуд А., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Аффинная модификация эндонуклеазы рестрикции SsoII ДНК-дуплексами, содержащими 2'-альдегидную группу. // Биохимия. 2005. 70(8): 1137-1144.

212. Романенков А.С., Устюгов А.А., Зацепин Т.С., Никулова А.А., Колесников И.В., Метелев В.Г., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Анализ белково-нуклеиновых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК. // Биохимия. 2005. 70(11): 1474-1487.

213. Романенков А.С. ДНК-дуплексы, содержащие реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове, как реагенты для аффиной модификации остатков цистеина и лизина белков. // Дисс. канд. хим. наук. МГУ. Москва. 2006. 156 с.

214. Shilov I., Tashlitsky V., Khodoun M., Vasil'ev S., Alekseev Y., Kuzubov A., Kubareva E., Karyagina A. DNA-methyltransferase SsoII interaction with own promoter region binding site. // Nucleic Acids Res. 1998. 26(11): 2659-2664.

215. Karyagina A., Shilov I., Tashlitskii V., Khodoun M., Vasil'ev S., Lau P.C., Nikolskaya I. Specific binding of SsoII DNA methyltransferase to its promoter region provides the regulation of SsoII restriction-modification gene expression. // Nucleic Acids Res. 1997. 25(11): 2114-2120.

216. Karyagina A.S., Alexeevski A.V., Golovin A.V., Spirin S.A., Vorob'eva O.V., Kubareva E.A. Computer modeling of complex of (C5-cytosine)-DNA methyltransferase SsoII with target and regulatory DNAs. // Biophysics. 2003. 48(Suppl. 1): 45-55.

217. Clamp J.R., Hough L. The periodate oxidation of amino acids with reference to studies on glycoproteins. //Biochem. J. 1965.94: 17-24.

218. Haynes S.R. // RNA-Protein Interaction Protocols. Humana Press. 1999. 481 p.

219. Wang Z, Wang X, Rana TM. Protein orientation in the Tat-TAR complex determined by psoralen photocross-linking. II J. Biol. Chem. 1996.271(29): 16995-16998.

220. Bochkareva E., Korolev S., Lees-Miller S.P., Bochkarev A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA. // EMBO. J. 2002. 21(7): 18551863.

221. Zhao X., Herr W. A regulated two-step mechanism of TBP binding to DNA: A solventexposed surface of TBP inhibits TATA box recognition. // Cell. 2002.108(5): 615-627.

222. Wenz C., Jeltsch A., Pingoud A. Probing the indirect readout of the restriction enzyme EcoKV. II J. Biol. Chem. 1996. 271(10): 5565-5573.

223. Powell L.M., Connolly B.A., Dryden D.T. The DNA binding characteristics of the trimeric EcoKI methyltransferase and its partially assembled dimeric form determined by fluorescence polarisation and DNA footprinting. II J. Mol. Biol. 1998. 283(5): 947-961.

224. Kazantsev A.V., Krivenko A.A., Harrington D.J., Holbrook S.R., Adams P.D., Pace N.R. Crystal structure of a bacterial ribonuclease P RNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. 102(38): 13392-13397.

225. Spitzfaden C., Nicholson N., Jones J.J., Guth S., Lehr R., Prescott C.D., Hegg L.A., Eggleston D.S. The structure of ribonuclease P protein from Staphylococcus aureus reveals a unique binding site for single-stranded RNA. // J. Mol. Biol. 2000. 295(1): 105-115.

226. Moore M.J., Sharp P.A. Site-specific modification of pre-mRNA: the 2'-hydroxyl groups at the splice sites. II Science. 1992. 256(5059): 992-997.

227. Vioque A., Arnez J., Altman S. Protein-RNA interactions in the RNase P holoenzyme from Escherichia coll //J. Mol. Biol. 1988. 202(4): 835-848.

228. Talbot S.J., Altman S. Gel retardation analysis of the interaction between C5 protein and Ml RNA in the formation of the ribonuclease P holoenzyme from Escherichia coli. // Biochemistry. 1994. 33(6): 1399-1405.

229. Jeong J.H., Mok H., Oh Y.K., Park T.G. siRNA conjugate delivery systems. // Bioconjug. Chem. 2009. 20(1): 5-14.

230. Oh Y.K., Park T.G. siRNA delivery systems for cancer treatment. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2009. 61(10): 850-862.

231. Lonnberg H. Solid-phase synthesis of oligonucleotide conjugates useful for delivery and targeting of potential nucleic acid therapeutics. // Bioconjug. Chem. 2009. 20(6): 1065-1094.

232. Hackenberger C.P., Schwarzer D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008. 47(52): 10030-10074.

233. Tiefenbrunn T.K., Dawson P.E. Chemoselective ligation techniques: modern applications of time-honored chemistry. // Biopolymers. 2010. 94(1): 95-106.

234. Moses J.E., Moorhouse A.D. The growing applications of click chemistry. // Chem. Soc. Rev. 2007.36(8): 1249-1262.

235. Hein C.D., Liu X.-M., Wang D. Click chemistry, a powerful tool for pharmaceutical sciences. HPharm. Res. 2008. 25(10): 2216-2230.

236. Hill K.W., Taunton-Rigby J., Carter J.D., Kropp E., Vagle K., Pieken W., McGee D.P.C., Husar G.M., Leuck M., Anziano D.J., Sebesta J.P. Diels-Alder bioconjugation of diene-modified oligonucleotides. II J. Org. Chem. 2001. 66(16): 5352-5358.

237. Kohn M., Breinbauer R. The Staudinger ligation - a gift to chemical biology. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2004. 43(24): 3106-3116.

238. Hermanson G.T. // Bioconjugate Techniques, 2nd ed. Academic Press. San Diego. CA. 2008. P. 121-123.

239. Zatsepin T.S., Stetsenko D.A., Gait M.J., Oretskaya T.S. 2'-Hydrazine oligonucleotides: synthesis and efficient conjugation with aldehydes. // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). 2005. (49): 133-134.

240. Schwartz D.A. Solulink, US patent US 20030013857 (Al). January 2003.

241. Singh Y., Defrancq E., Dumy P. New method to prepare peptide-oligonucleotide conjugates through glyoxylic oxime formation. II J. Org. Chem. 2004. 69(24): 8544-8546.

242. Katajisto J., Virta P., Lonnberg H. Solid-phase synthesis of multiantennary oligonucleotide glycoconjugates utilizing on-support oximation. // Bioconjug. Chem. 2004.15(4): 890-896.

243. Forget D., Boturyn D., Defrancq E., Lhomme J., Dumy P. Highly efficient synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates: chemoselective oxime and thiazolidine formation. // Chem. Eur. J. 2001. 7(18): 3976-3984.

244. Belskaya N.P., Dehaen W., Bakulev V.A. Synthesis and properties of hydrazones bearing amide, thioamide and amidine functions. // ARKIVOC. 2010. 275-332.

245. Rivera-Lion R., Green C.J., Void B.S. High-level expression of soluble recombinant RNase P protein from Escherichia coli. II J. Bacteriol. 1995.177(9): 2564-2566.

246. Wegscheid B., Hartmann R.K. The precursor tRNA 3'-CCA interaction with Escherichia coli RNase P RNA is essential for catalysis by RNase P in vivo. IIRNA. 2006.12(12): 2135-2148.

247. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. II Nature. 1970. 227(5259): 680-685.

248. Busch S., Kirsebom L.A., Notbohm H., Hartmann R.K. Differential role of the intermolecular base-pairs G292-C(75) and G293-C(74) in the reaction catalyzed by Escherichia coli RNase P RNA. II J. Mol. Biol. 2000. 299(4): 941-951.

249. Wegscheid B., Hartmann R.K. In vivo and in vitro investigation of bacterial type B RNase P interaction with tRNA 3'-CCA. II Nucleic Acids Res. 2007. 35(6): 2060-2073.

250. Dinos G., Wilson D.N., Teraoka Y., Szaflarski W., Fucini P., Kalpaxis D., Nierhaus K.H. Dissecting the ribosomal inhibition mechanisms of edeine and pactamycin: the universally conserved residues G693 and C795 regulate P-site RNA binding. II Mol. Cell. 2004. 13(1): 113-124.

251. Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. II Anal. Biochem. 1987. 166(2): 368379.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.