Молекулярно-диагностические наборы на основе полианилинсодержащих композитов для одностадийной экстракции нуклеиновых кислот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Зыбин Дмитрий Игоревич

• Зыбин Дмитрий Игоревич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Зыбин Дмитрий Игоревич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Анализ и разделение смесей биополимеров

1.2. Особенности хроматографии белков и нуклеиновых кислот

1.3. Методы выделения и очистки нуклеиновых кислот

1.4. Твердофазная экстракция НК

1.5. Коммерческие наборы для выделения НК

1.6. Методы разделения белков

1.7. Современные инструментальные методы исследования свойств полимерсодержащих сорбентов

1.7.1. Сканирующая зондовая микроскопия

1.7.2. Спектральная корреляционная интерферометрия

1.7.3. Полимеразная цепная реакция - эффективный инструмент молекулярной диагностики

1.7.4. Спектрофотометрия

1.7.5. Электрофорез

1.7.6. Интерферометрия

1.8. Валидация аналитических методик при производстве фармацевтической продукции

1.9. Заключение и постановка задачи исследования

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Синтез фторполимер-полианилинсодержащего композиционного сорбента

2.2. Метод получения полиальгинатных сфер

2.3. Картриджный метод выделения ДНК

2.4. Протокол экстрагирования суммарной ДНК из почв

2.5. Протокол экстрагирования суммарной ДНК из листьев растений

2.6. Протокол экстрагирования суммарной ДНК из зерновых культур

2.7. Протокол экстрагирования суммарной ДНК из мицелия плесневых грибов

2.8. Методика анализа остаточной ДНК ОИЮ в активной фармацевтической субстанции Инфликсимаб

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

48

3.1. Разработка методологии скрининга свойств полимерных модификаторов, демонстрирующих эффект негативной селекции в отношении НК

3.1.1. Исследование морфологии поверхности полимерных модификаторов методом сканирующей зондовой микроскопии

3.1.2. Исследование сорбционных свойств в режиме статической сорбции53

3.1.3. Исследование сорбционных свойств в режиме динамической сорбции

3.3. Разработка протоколов выделения ДНК из образцов зерна и плесневых

грибов

3.4. Разработка протокола выделения суммарной ДНК из образцов почвы

3.5. Разработка набора для экстракции НК с целью определения остаточной ДНК в образцах активной фармацевтической субстанции

3.6. Валидация метода определения остаточной ДНК СНО в активной фармацевтической субстанции Инфликсимаб с использованием разработанного набора для экстракции и амплификации ДНК СНО

3.6.1. Проведение валидационных испытаний

ВЫВОДЫ

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТЬ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Инструкция по применению набора для экстракции суммарной ДНК из образцов зерновых культур

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Инструкция по применению набора для выделения суммарной ДНК из образцов почвы

ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Инструкция по применению набора для экстракции и амплификации ДНК СНО для анализа остаточной ДНК в активных фармацевтических субстанциях

ПРИЛОЖЕНИЕ 4. Паспорт стандартного образца, полученного от ООО «ФАРМАПАРК»

ПРИЛОЖЕНИЕ 5. Акт внедрения в процесс контроля качества субстанции Инфликсимаб ООО «ФАРМАПАРК»

ПРИЛОЖЕНИЕ 6. Описание участка геномной ДНК CHO, использованный для подбора праймеров

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-диагностические наборы на основе полианилинсодержащих композитов для одностадийной экстракции нуклеиновых кислот»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Молекулярно-диагностические методы широко применяются в практике исследовательских и клинических лабораторий, что определяет постоянный рост потребности в очищенных препаратах биополимеров, в первую очередь, нуклеиновых кислот (НК) и белков. По мере совершенствования этих методов и масштабов их применения, к способам выделения и очистки биополимеров предъявляются дополнительные требования. Если ранее к основным требованиям относили степень очистки и количество выделяемого в нативном состоянии биополимера, то сегодня также необходимо сокращать продолжительность процедур выделения за счет уменьшения числа этапов пробоподготовки, обеспечивать возможность их автоматизации и миниатюризации используемых систем. Актуальность такого подхода к разработке систем выделения биополимеров подтверждается свежим примером, а именно, распространением пандемии СОУГО-19 в 2019 - 2021 г.г. Широкомасштабное ПЦР-тестирование населения потребовало разработки новых дешевых экспресс-методик экстракции НК, одновременно являющихся высокоэффективными и полностью воспроизводимыми.

Традиционные методы экстракции НК трудоемки и включают несколько стадий нанесения, сорбции, отмывки и элюции, что неизбежно влечет за собой потери при выделении НК. Эти методы основаны на использовании материалов, демонстрирующих эффект «позитивной селекции» в отношении НК.

Более привлекательной представляется одностадийная схема выделения целевого биополимера, когда выделяемые молекулы после нанесения смеси на специальный сорбент, не удерживаясь, выходят в составе исключенного объема, а примеси удерживаются сорбентом.

В лаборатории «Полимеры для биологии» ИБХ РАН было установлено, что существуют полимерные модификаторы (в частности, фторполимеры и

полианилины), проявляющие эффект «негативной селекции» в отношении НК. Модифицированные такими полимерами материалы не удерживают двухнитевые ДНК (днДНК), относительно слабо удерживают РНК, но при этом обратимо сорбируют белки. Благодаря использованию указанного эффекта удается получать композитные полимерсодержащие материалы (сорбенты), обеспечивающие за счет одностадийного выделения НК значительную экономию времени, затрачиваемого на пробоподготовку, и уменьшение потерь выделяемого компонента биологической смеси с сохранением высокой степени очистки.

Отдельной задачей является правильный выбор полимерного модификатора, обеспечивающего оптимальные условия для выделения целевого биополимера (НК) из конкретного биологического источника (пробы). При этом следует учитывать, что НК различаются по происхождению (вирусные, бактериальные, грибные, растительные, НК животных и человека, искусственно синтезированные), а пробы - по природе источника (бактериальные лизаты, растительная ткань, кровь, мокрота, урогенитальные мазки, пищевые продукты, пробы воздуха, воды, почвы). Поэтому представляется весьма актуальной разработка методологии скрининга сорбционных свойств полимерных модификаторов, проявляющих эффект «негативной селекции» по отношению к НК, выявление зависимости таких свойств от химического состава модификаторов, так как материалы, позволяющие разделять НК и белки в одну стадию, являются наиболее перспективными для создания эффективных инструментов, позволяющих не только значительно сократить время выделения препарата биополимера из биологической смеси (что, несомненно, сказывается на стоимости), но и повысить степень чистоты выделяемого компонента, предназначенного для использования в молекулярной диагностике. Указанная методология предполагает комплексное применение инструментальных методов анализа.

В виду текущего уровня ограничения поставок реагентов и готовых тест-систем в РФ разработка молекулярно-диагностических наборов для выделения и анализа НК, произведенных из полностью отечественных реагентов, представляется исключительно важной задачей, которую необходимо решать в ускоренные сроки. Методология экспресс-скрининга свойств полимерных модификаторов позволит существенно облегчить задачу исследователям, которые работают над созданием таких тест-систем. В настоящем исследовании с помощью предложенной методологии разработан ряд протоколов экстракции суммарной ДНК и молекулярно-диагностические наборы, практическое применение которых может внести полезный вклад в продовольственную и лекарственную безопасность РФ.

Степень научной разработанности проблемы.

Выполненные ранее работы по теме диссертации в значительной мере способствовали разработке методов получения полианилин-модицифированных кремнеземов с заданными свойствами. Были предложены подходы направленного изменения структуры поверхностного слоя полианилинового покрытия для получения требуемых сорбционных свойств. Ранее также был предложен способ получения полимерсодержащих композитов, обеспечивающих негативную селекцию при выделении НК. Однако в ранее выполненных работах отсутствует комплексный подход к решению следующих практических и теоретических задач:

• Разработка методологии скрининга полимерных модификаторов с использованием ряда взаимодополняющих аналитических методик.

• Детальное исследование влияния химической структуры и морфологии поверхностного слоя на эффект негативной селекции по отношению к НК.

• Применение полученных теоретических результатов в практической области, в частности, в разработке молекулярно-диагностических наборов и при внедрении полученных

7

протоколов в процессы контроля качества биотехнологической продукции.

Цель исследования. Разработка методологии скрининга свойств полимерных модификаторов, проявляющих эффект негативной селекции по отношению к НК, на основе комплексного использования инструментальных методов анализа, а также практическое применение полученных результатов при создании молекулярно-диагностических наборов с полным циклом производства на территории Российской Федерации.

Достижение поставленной цели предполагало последовательное решение следующих задач:

1. Выбор полимеров, пригодных в качестве полимерного модификатора в составе композиционного сорбента, проявляющего эффект негативной селекции по отношению к НК.

2. Исследование влияния морфологии поверхности полимерных модификаторов на их сорбционные свойства методом сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ).

3. Сравнительный анализ сорбционных свойств полимерных покрытий, сформированных на поверхности объемно-пористого кремнеземного носителя, методами спектроскопии и электрофореза в режиме статической сорбции.

4. Подбор оптимального полимерного покрытия на основе сравнительного анализа сорбционных свойств, исследованных методом спектральной корреляционный интерферометрии (СКИ) в режиме динамической сорбции.

5. Разработка методологии экспресс-скрининга свойств полимеров, проявляющих эффект негативной селекции в отношении НК.

6. Разработка протоколов выделения ДНК из сложных биологических смесей с использованием полимерсодержащих композиционных сорбентов.

7. Разработка молекулярно-диагностических наборов для экстракции ДНК из сложных биологических смесей с использованием полимерсодержащих композиционных сорбентов. Научная новизна исследования:

• Впервые разработана методология экспресс-скрининга полимерных модификаторов, проявляющих эффект негативной селекции по отношению к НК.

• Предложены новые полиарамидсодержащие полимерные модификаторы, обладающие эффектом негативной селекции в отношении НК; установлены особенностей их взаимодействия с биополимерами с различной молекулярной массой и значением изоэлектрической точки.

• Предложен новый оптимизированный метод синтеза ПАНИ-сорбента для применения в молекулярно-диагностических наборах.

• Разработаны протоколы для экстракции НК из биологических смесей с использованием полимерных модификаторов, отобранных в соответствии с представленной в настоящем исследовании методологией экспресс-скрининга.

• Разработаны молекулярно-диагностические наборы (Набор для выделения суммарной ДНК из образцов почвы, набора для экстракции и амплификации ДНК CHO для анализа остаточной ДНК в активных фармацевтических субстанциях, набора для экстракции суммарной ДНК из образцов зерновых культур); проведена валидация метода определения остаточной ДНК штамма продуцента в процесс контроля качества АФС Инфликсимаб.

Область применения и практическая значимость исследования:

• Практическое внедрение методологии экспресс-скрининга свойств полимерных модификаторов позволит существенно снизить стоимость разработки технологий выделения и очистки

9

биополимеров, необходимых для решения конкретных задач молекулярной диагностики и биоаналитики.

• На основании проведенных исследований разработаны молекулярно-диагностические наборы для проведения экстракции суммарных фракций НК.

• Результаты исследования внедрены в процесс контроля качества моноклонального антитела Инфликсимаб, ООО «ФАРМАПАРК».

Методология и методы исследования:

Методологической основной диссертационного исследования являются теоретические и практические принципы высокоэффективной жидкостной хроматографии, электрофореза в полиакриламидном и агарозном гелях, спектрофотометрии, методов пробоподготовки образцов, различающихся в зависимости от их химической природы, а также валидационных требований, представленных в регламентирующих документах. Методология исследования разрабатывалась с учетом актуальных требований государственной фармакопеи Евразийского экономического союза (ЕАЭС).

Соответствие паспорту научной специальности 1.4.2. «Аналитическая химия».

Исследование соответствует следующим направлениям, описанным в паспорте научной специальности 1.4.2. Аналитическая химия по области исследований (ВАК):

Направления исследований: Пункт 2. Методы химического анализа (химические, физико-химические, атомная и молекулярная спектроскопия, хроматография, рентгеновская спектроскопия, масс-спектрометрия, ядерно-физические методы и др). Пункт 4. Методическое обеспечение химического анализа. Пункт 6. Метрологическое обеспечение химического анализа. Пункт 7. Теория и практика пробоотбора и пробоподготовки в аналитической химии.

Пункт 8. Методы маскирования, разделения и концентрирования.

Пункт 14. Анализ природных веществ.

Пункт 15. Анализ лекарственных препаратов.

Пункт 18. Аналитический контроль технологических процессов.

Положения, выносимые на защиту:

1. 1. Методология экспресс-скрининга свойств полимерных модификаторов, проявляющих эффект негативной селекции в отношении НК.

1.1. Применение результатов исследования морфологии поверхности полимерных модификаторов методом сканирующей зондовой микроскопии в экспресс-скрининге свойств полимерных модификаторов.

1.2. Применение результатов исследования сорбционных свойств модельных сорбентов на основе объемно-пористого кремнезема марки Si-500 в экспресс-скрининге свойств полимерных модификаторов.

1.3. Применение результатов исследования сорбционных свойств модельных полимерных модификаторов методом спектрально корреляционной спектроскопии в экспресс-скрининге свойств полимерных модификаторов.

2. Оптимизация условий проведения синтеза полианилинсодержащего композиционного сорбента.

2.1. Сравнительное исследование сорбционных свойств полианилинсодержащих композиционных сорбентов, полученных в соответствии с классическим и оптимизированным методами синтеза.

3. Протоколы выделения ДНК из сложных биологических смесей.

3.1. Протокол экстрагирования суммарной ДНК из зерновых культур.

3.2. Протокол экстрагирования суммарной ДНК из мицелия плесневых грибов.

3.3. Протокол экстрагирования суммарной ДНК из почв.

3.4. Протокол экстрагирования суммарной ДНК из образцов активных фармацевтических субстанций.

4. Молекулярно-диагностических наборы для экстракции и определения ДНК, в том числе:

4.1. Набора для количественного определения остаточной ДНК штамма продуцента в активной фармацевтической субстанции.

4.2. Набора для экстрагирования суммарной ДНК из почвы.

4.3. Набора для экстрагирования суммарной ДНК из зерновых культур и мицелия плесневых грибов.

5. Валидация аналитической методики количественного определения остаточной ДНК штамма продуцента в активной фармацевтической субстанции Инфликсимаб.

Степень достоверности результатов исследования:

Достоверность полученных результатов подтверждена воспроизводимостью получаемых экспериментальных данных, валидацией аналитических методик, а также результатами статистической обработки данных с использованием программ Microsoft Excel 2016 и STATISTIKA 10.

Личный вклад автора:

Экспериментальные результаты, приведенные в тексте диссертации, получены и обработаны автором. Лично автором было выполнено более 80% экспериментальных и теоретических исследований при разработке методологии экспресс-скрининга полимерных модификаторов, а также протоколов экстракции НК из биологических смесей. Автор самостоятельно проводил обзор и анализ литературы, непосредственно участвовал в написании публикаций по теме диссертации и в практическом внедрении результатов исследования. Работа выполнена в соответствии со Стратегией научно-технологического развития Российской Федерации (Указ Президента РФ от 01.12.2016 № 642 "О Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации").

Публикации:

По теме диссертационной работы опубликовано 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК (Тонкие химические технологии, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, Microchemical Journal, Nanobiotechnology Reports).

Объем и структура диссертации:

Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы (глава I), описание объектов и методов исследования (глава II), обсуждение результатов исследования (глава III), заключение, список используемых сокращений и условных обозначений, список использованной литературы, включающий 93 источников, из них 87 - зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 20 таблиц, 37 рисунков и 13 страниц приложений.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Аналитическая химия - наука о методах и средствах определения химического состава веществ и их смесей.

Задачи аналитической химии:

обнаружение, идентификация и определение составных частей (атомов, ионов, радикалов, молекул, функциональных групп) анализируемого объекта - качественный анализ;

измерение количества (концентрации или массы) составных частей анализируемого объекта или их количественных соотношений -количественный анализ;

Во многих методах аналитической химии используются последние достижения естественных, технических наук. Поэтому вполне закономерно рассматривать аналитическую химию как междисциплинарную науку.

Огромное значение имеет химический анализ для наук биологического цикла. Например, выяснение природы белка - задача, в сущности, аналитическая, поскольку требуется выяснить, какие аминокислоты входят в состав белка и в какой последовательности они связаны. В медицине методы аналитической химии широко применяют при проведении разнообразных биохимических анализов.

Задачи, решаемые аналитической химией весьма разнообразны. В связи с этим она использует множество методов и видов анализа [1].

1.1. Анализ и разделение смесей биополимеров

В настоящее время существует множество подходов к разделению смесей биополимеров и методов анализа, содержащихся в них компонентов [2-4]. Они широко применяются в научных исследованиях, различных областях промышленности, в медицине.

При выборе методов выделения и очистки белков и нуклеиновых кислот (НК) необходимо учитывать специфику биополимеров: высокую молекулярную массу, способность к денатурации и контаминации в

14

неблагоприятных условиях разделения (экстремальные значения рН, высокие концентрации соли, возможность окисления) [5 - 7].

Безусловно, к самым распространенным методам выделения и очистки биополимеров относятся хроматографические методы. Несмотря на то, что в настоящее время широко распространены такие методы как капиллярный электрофорез [8-9], изоэлектрическое фокусирование в геле [10], тонкослойная хроматография [11], вытеснить из применения такой мощный инструмент как жидкостная хроматография ни один из существующих методов не способен.

Важными особенностями хроматографии являются селективность, высокая чувствительность и универсальность.

1.2. Особенности хроматографии белков и нуклеиновых кислот

Применение хроматографических методов для разделения смесей белков и НК оказало огромное влияние на развитие современной биохимии. Поскольку белки и НК обладают важными биологическими функциями (ферментативными, гормональными, регуляторными, иммунохимическими и др.), хроматография с успехом применяется в исследовательских и клинических целях в самых различных областях биологии и медицины [12-13].

Хроматографические методы разделяют на два основных класса: жидкостную (ЖХ) и газовую хроматографию (ГХ) [14-15]. Хроматографическое разделение проводится в жидкой или газовой среде, в присутствии твердого или жидкого сорбента, т.е. протекает в двухфазной системе, в которой подвижная фаза (жидкость или газ) перемещается относительно жидкой или твердой неподвижной фазы. В соответствии с природой подвижной и неподвижной фаз различают следующие типы хроматографии: жидко-жидкостную (ЖЖХ), жидко-твердофазную (ЖТХ), газо-жидкостную (ГЖХ) и газо-твердофазную (ГТХ).

Колоночная хроматография - наиболее распространенный на сегодняшний день вариант проведения хроматографического процесса. Неподвижную фазу, которая представляет собой более или менее

15

тонкоизмельченное твердое вещество, упаковывают в трубку определенного вида. В полученную колонку вводят образец, и подают растворитель. В оптимальных условиях компоненты смеси переносятся подвижной фазой (элюентом) с различной скоростью, которая зависит от их относительного сродства к неподвижной и подвижной фазам [16-17].

Неподвижная фаза в хроматографических экспериментах, как правило, состоит из пористой матрицы, насыщенной элюентом. В хроматографии белков в качестве элюентов, как правило, применяют водные растворы, а в качестве матрицы применяют гидрофильные материалы. Размер частиц неподвижной фазы варьируется от нескольких до сотен микрометров.

Чтобы уменьшить влияние диффузии и тем самым повысить разрешающую способность колонки, используют однородные мелкозернистые сорбенты. Однако, поскольку гидродинамическое сопротивление мелких частиц сорбента потоку жидкости довольно высоко, элюент необходимо подавать на колонку под давлением. Поэтому такой метод известен под названием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [18]. ВЭЖХ на сегодняшний день имеет наибольшее практическое значение среди колоночных методов для выделения белковых фракций из биологических экстрактов.

Нужно учитывать, что при выделении биополимеров традиционные хроматографические методы не всегда применимы, т.к. в процессе разделения возможна полная или частичная денатурации белков и контаминация РНК и ДНК.

Биополимеры отличаются от малых молекул не только размерами, но и лабильностью, которая в первую очередь связана с тем, что биологическая активность многих из них (например, ферментов) обусловлена третичной структурой, в образовании которой решающую роль играют слабые взаимодействия между достаточно удаленными друг от друга участками полипептидной или полинуклеотидной цепи [19].

Термином «денатурация» обычно обозначают утрату макромолекулами

четвертичной, третичной или вторичной структурных организаций. Такая утрата может происходить в ходе самого хроматографического процесса - как в результате воздействия элюента, так и вследствие многоточечной сорбции, когда макромолекулы как бы «распластываются» на поверхности сорбента. При этом слабые связи между участками их цепей разрываются. Денатурация, как правило, приводит к увеличению молекулярного объема и к экспонированию гидрофобных участков. Такие изменения при денатурации влияют на распределение макромолекул между подвижной и неподвижной фазами. Это влияние нередко бывает неблагоприятным, поскольку развернутые полипептидные и полинуклеотидные цепи склонны очень прочно, а иногда и необратимо сорбироваться в неподвижной фазе [20].

Для уменьшения опасности денатурации нередко приходится вести хроматографию макромолекул, в частности, белков при пониженной температуре или вводить в состав элюента глицерин в качестве консерванта, что приводит к увеличению вязкости подвижной фазы, требует повышения рабочего давления и нередко ухудшает разрешение за счет затруднения диффузии. С уменьшением коэффициентов диффузии снижается и допустимая скорость элюции, увеличивается продолжительность хроматографического процесса, а вместе с ней и вероятность денатурации. Большой размер молекул биополимеров обуславливает значительное уменьшение коэффициентов диффузии по сравнению с малыми молекулами. Так, у белков значения коэффициентов диффузии в 10-30 раз меньше, чем, например, у аминокислот, а для очень крупных молекул (РНК и ДНК) эти значения существенно меньше. Следовательно, расширение хроматографических зон и ухудшение разрешения пиков при хроматографии макромолекул обусловлены главным образом трудностью установления равновесия обмена между фазами. Это обстоятельство, в свою очередь, требует уменьшение скорости элюции. В тех случаях, когда (при достаточно малых размерах молекул) скорость элюции за счет повышенного давления удается увеличить, не следует забывать о возможности денатурации

макромолекул в результате их сжатия под высоким давлением [21].

Еще одна особенность хроматографии биополимеров связана с проблемой доступности всего объема неподвижной фазы внутри гранул. Ограничение такой доступности вследствие статистического разброса размеров пор пространственной сетки гранул используется для фракционирования макромолекул по размерам в методе гель-фильтрации [2223], однако, в других вариантах хроматографии ограничение доступности не только уменьшает емкость системы, но и существенно затрудняет установление равновесия в неподвижной фазе. В этом случае обычные микро-и мезопористые сорбенты и носители не пригодны [18].

Таким образом, для выделения белков и НК в нативном состоянии остается актуальным поиск адекватных методов разделения и подбор подходящих сорбентов.

1.3. Методы выделения и очистки нуклеиновых кислот

Эффективность генноинженерных методов в значительной степени зависит от выбора адекватных способов выделения НК (ДНК или РНК) из анализируемого образца. В настоящее время процедура очистки/выделения НК представлена достаточно широким спектром методик, который включает в себя как относительно простые, так и сложные, с большим количеством стадий, схемы. Все они основаны на физико-химических процессах разделения веществ, представленных в таблице 1.

Таблица 1 - Методы выделения/очистки биополимеров

Процесс Наименование методики выделения биополимеров

Избирательное растворение разделяемых компонентов в подходящих растворителях Метод фенол-хлороформной экстракции [24-27]

Процесс Наименование методики выделения биополимеров

Физическое осаждение путем нагревания, охлаждения, концентрирования или разбавлени Центрифугирование в градиенте плотности хлорида цезия [28-30]

Осаждение белков сульфатом аммония, сульфатом декстрана [31].

Переосаждение ДНК в спиртах [32-33].

Концентрирование целевого вещества на границе раздела адсорбент-жидкость. Очистка ДНК на магнитных частицах [34-37].

Очистка НК методами адсорбции на поверхности пористых кремнеземов, стеклянных микросфер и углеродных нанотрубок [38].

Метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различиях в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. Разнообразные варианты хроматографии белков и НК [39-44].

На практике для достижения необходимой чистоты образца или более тонкого разделения смеси биополимеров приходится использовать многостадийные протоколы [45], сочетающие в себе несколько методов. В первую очередь это касается случаев выделения НК при использовании прямых методов анализа. 1.4. Твердофазная экстракция НК

Способность ДНК сорбироваться на стеклянных микросферах в концентрированном растворе соли Nal (рисунок 1) положило начало развитию нового, относительно быстрого метода выделения и очистки НК -твердофазной экстракции НК [46].

Рисунок 1. Сорбция ДНК на поверхности кремнеземного носителя в присутствии Nal.

Поверхность кремнезема характеризуется слабо-кислыми свойствами, и представлена, в основном, Si-OH-группами. При добавлении Nal в высокой концентрации катионы, присутствующие в растворе, образуют стабильный слой противоионов на отрицательно заряженной поверхности кремнезема, и тем самым поверхность носителя приобретает положительный заряд. Тем самым присутствие любой хаотропной соли (гуанидина гидрохлорид, гуанидина изоцианат и др.) в высокой концентрации способствует связыванию молекул ДНК с поверхностью кремнеземного носителя (стеклянные шарики, стеклянное волокно, частицы кремнезема и т. д. с образованием «комплекса», а изменяя ионную силу буферного раствора, возможно десорбировать ДНК с поверхности носителя [47-48].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Зыбин Дмитрий Игоревич, 2023 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ищенко А.А. Аналитическая химия. В 3-х томах. Том 1. Химические методы анализа: учебник. М: Издательский центр «Академия», 2013. 320 с.

2. Liu S., Li Z., Yu B., et al. Recent advances on protein separation and purification methods. // Advances in Colloid and Interface Science. 2020. V. 284. P. 102254. doi:10.1016/j.cis.2020.102254

3. Lee C.-H. A Simple Outline of Methods for Protein Isolation and Purification. // Endocrinology and Metabolism. 2017. V.32. I.1. P. 18-22. doi:10.3803/enm.2017.32.1.18

4. Janson J.C. Protein Purification. Principles, High Resolution Methods, and Applications. 3rd edn. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. 2011. 517 p.

5. Ali N., Rampazzo R. de C. P., Costa A. D. T., et al. Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics. // BioMed Research International. 2017. P.1-13. doi:10.1155/2017/9306564

6. Li P., Li M., Yue D., et al. Solid-phase extraction methods for nucleic acid separation. A review. // Journal of Separation Science. 2021. V.45. I.1. P. 172-184. doi:10.1002/jssc.202100295

7. Preetha J.S., Dairawan M. The Evolution of DNA Extraction Methods. // AJBSR.MS. 2020. V. 8. I.1. P. 39-45.

8. Voeten R. L. C., Ventouri I. K., Haselberg R., et al. Capillary Electrophoresis: Trends and Recent Advances. // Analytical Chemistry. 2018. V.90 I.3. P. 1464-1481. doi:10.1021/acs.analchem.8b00015

9. Shah M., Patel N., Tripathi N., et al. Capillary electrophoresis methods for impurity profiling of drugs: A review of the past decade. // Journal of Pharmaceutical Analysis. 2021. V. 12. I. 1. P. 15-28. doi:10.1016/j.jpha.2021.06.009

10. Radola, B. J. (1973). Isoelectric focusing in layers of granulated gels. // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure. 1973. V. 295. I. 2. P. 412-428. doi:10.1016/0005-2795(73)90037-8

ll.Sherma J., Rabel F. A review of thin layer chromatography methods for determination of authenticity of foods and dietary supplements. // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2018. V. 41. I. 10. P. 645657. doi:10.1080/10826076.2018.1505637

12.Mant C. T., Chen Y., Yan Z., et al. HPLC Analysis and Purification of Peptides. // Methods in Molecular Biology. 2007. V. 386 P. 3-55. doi:10.1007/978-1-59745-430-8_1

13.Nikolin B., Imamovic B., Medanhodzic-Vuk S., et al. High performance liquid chromatography in pharmaceutical analyses. // Bosn J of Basic Med Sci. 2004. V. 4. I. 2. P. 5-9. doi: 10.17305/bjbms.2004.3405

14.Coskun O. Separation Techniques: Chromatography. // North. Clin Istanb. 2016. V. 3. I.2 . P. 156-160. doi:10.14744/nci.2016.32757

15.Eiceman G. A., Gardea-Torresdey J., Overton E., et. al. Gas Chromatography. // Analytical Chemistry. 2002. V. 74. I. 12. P. 2771-2780. doi:10.1021/ac020210p

16.Regenstein J. M. Food Protein Chemistry. Cambridge: Academic press. 1984. 368 p.

17.Palamareva M. D. LIQUID CHROMATOGRAPHY // Encyclopedia of Analytical Science. 2005. P. 106-112. doi:10.1016/b0-12-369397-7/00313-7

18.Meyer V.R. Practical High-Performance Liquid Chromatography - 5th ed. Cornwall: TJ International. 2010. 412 p.

19. Bahbaum E. Fundamentals of Protein Structure and Function. NY: Springer New York. 2007. 367 p.

20. McNay J. L. M., O'Connell J. P., Fernandez E. J. Protein unfolding during reversed-phase chromatography: II. Role of salt type and ionic strength. //

Biotechnology and Bioengineering. 2001. V.76. I. 3. P. 233-240. doi:10.1002/bit. 10016

21.Mitulovic G., Mechtler K. HPLC techniques for proteomics analysis-a short overview of latest developments. // Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 2006. V. 5. I. 4. P. 249-260. doi:10.1093/bfgp/ell034

22.Hong P., Koza S., Bouvier E. S. P. A review size-exclusion chromatography for the analysis of protein biotherapeutics and their aggregates. // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2012. V. 35. I. 20. P. 2923-2950. doi:10.1080/10826076.2012.743724

23.Giridhar G., Manepalli R. K., Apparao G. Size-Exclusion Chromatography. Thermal and Rheological Measurement Techniques for Nanomaterials Characterization. // Micro and Nano Technologies. 2017. P. 51-65. doi:10.1016/b978-0-323-46139-9.00003-7

24.Butler J. M. Advanced Topics in Forensic DNA Typing. MA: Academic Press. 2011. 680 p. doi:10.1016/b978-0-12-374513-2.00002-6

25.Toni L. S., Garcia A. M., Jeffrey D. A., et. al. Optimization of phenolchloroform RNA extraction. MethodsX. 2018. V. 5. P. 599-608. doi:10.1016/j.mex.2018.05.011

26.Chomczynski P. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something year son. // Nat. Protoc. 2006. I. 1. P. 581-585. doi: 10.1038/nprot.2006.83

27.Li Z., Mumford K.A., Smith K.H, et al. Extraction of phenol by toluene in the presence of sodium hydroxide. // Sep Sci Technol. 2014. I. 49. P. 29132920. doi: 10.1080/01496395.2014.952748

28.Nasukawa T., Uchiyama J., Taharaguchi S., et. al. Virus purification by CsCl density gradient using general centrifugation. // Archives of Virology. 2017. V. 162. I. 11. P. 3523-3528. doi:10.1007/s00705-017-3513-z

29.Garger S. J., Griffith O. M., Grill L. K. Rapid purification of plasmid DNA by a single centrifugation in a two-step cesium chloride-ethidium bromide

gradient. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1983. V. 117. I. 3. P. 835-842. doi:10.1016/0006-291x(83)91672-8

30. Tran-Nguyen L.T., Schneider B. Cesium chloride-Bisbenzimide gradients for separation of Phytoplasma and plant DNA BT— Phytoplasma: methods and protocols // Humana Press. 2013. V. 938. P. 381-393

31.Burgess R., Protein Precipitation Techniques // Methods in Enzymology. 2009. V. 463. P. 331-342. doi:10.1016/S0076-6879(09)63020-2

32.Green M. R., Sambrook J. Precipitation of DNA with Ethanol // Cold Spring Harbor Protocols. 2016. V.12. P. 1116-1120. doi:10.1101/pdb.prot093377

33. Tan S.C., Yiap B.C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present // J. Biomed. Biotechnol. 2009. I. 574. P. 378. doi:10.1155/2009/574398

34.Berensmeier S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2006. V. 73. I. 3. P. 495-504. doi:10.1007/s00253-006-0675-0

35.Pearlman S. I., Leelawong M., Richardson K. A. et al. Low Resource Nucleic Acid Extraction Method Enabled by High-Gradient // Magnetic Separation. ACS Applied Materials & Interfaces. 2020. V. 12. I. 11. P. 12457-12467 doi:10.1021/acsami.9b21564

36.Ma C., Li C., Wang F. Magnetic nanoparticles-based extraction and verification of nucleic acids from different sources. // J Biomed Nanotechnol. 2013. V. 9. P. 703-709. doi: 10.1166/jbn.2013.1566

37.Safarik I., Safarikova M. Magnetic nano- and microparticles in biotechnology. // Chem. Pap. 2009. V. 63. P. 497-505. doi: 10.2478/s11696-009-0054-2

38.Masque N., Marce R.M., Borrull F. New polymeric and other types of sorbents for solid-phase extraction of polar organic micropollutants from environmental water. // Trends Anal. Chem. 1998. V. 17. P. 384-394. doi:10.1016/S0165-9936(98)00019-3

39.Louter A.J., Vreuls J.J., Brinkman U.A. On-line combination of aqueous-sample preparation and capillary gas chromatography. // J. Chromatogr. A. 1999. I. 842. P. 391-426. doi:10.1016/S0021-9673(99)00211-3

40. Vidal L., Riekkola M.L., Canals A. Ionic liquid-modified materials for solid-phase extraction and separation: a review. // Anal. Chim. Acta. 2012. I. 715. P. 19 - 41. doi: 10.1016/j.aca.2011.11.050

41. Tian H., Hühmer A.F., Landers J.P. Evaluation of silica resins for direct and efficient extraction of DNA from complex biological matrices in a miniaturized format. // Anal. Biochem. 2000. I. 283. P. 175191. doi:10.1006/abio.2000.4577

42.Seligson D.B., Shrawder E.J. Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples. // Патент US-4935342-A; Опубликовано 30 июня 1990 г.

43. Endres H.N., Johnson J.A., Ross C.A. et. al. Evaluation of an ion exchange membrane for purification of plasmid DNA. // Biotechnol Appl Biochem. 2003. I. 37. P. 259-266.

44.Cummins P. M., Rochfort K. D., O'Connor B. F. Ion-Exchange Chromatography: Basic Principles and Application. // Methods Mol Biol. 2016. V. 1485. P. 209-223. doi:10.1007/978-1-4939-6412-3_11

45. DNA Extraction Protocols. [Электронный ресурс] / URL: https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols.html

46.McCormick R. M. A solid-phase extraction procedure for DNA purification. // Analytical Biochemistry. 1989. V. 181. I. 1. P. 66-74. doi:10.1016/0003-2697(89)90394-1

47.Salek P., Filipova M., Horak D., et. al. Enhanced solid phase extraction of DNA using hydrophilic monodisperse poly(methacrylic acid-co-ethylene dimethacrylate) microparticles. // Molecular Biology Reports. 2019. V. 46. P. 3063-3072 doi:10.1007/s11033-019-04742-6

48.Rother D., Sen T., East D., et. al. Silicon, silica and its surface patterning/activation with alkoxy- and amino-silanes for nanomedical applications. // Nanomedicine. 2011. V. 6. I. 2. P. 281-300.

49.Lyman G.F., Mathus G. Filter for centrifuge tube // Патент US4683058; Опубликовано: 28 июля 1987.

50.QIAamp DNA Blood Midi/Maxi Handbook. [Электронный ресурс] / URL: https://www.qiagen.com/ye/resources/resourcedetail?id=bf32146a-77fd-40c2-8743-c28974f7935b&lang=en

51.Krnajski Z., Geering S., Steadman S. Performance verification of the Maxwell 16 Instrument and DNA IQ Reference Sample Kit for automated DNA extraction of known reference samples. // Forensic Science, Medicine, and Pathology. 2007. V. 3. I. 4. P. 264-269. doi:10.1007/s12024-007-0034-1

52.Barbaro A., Cormaci P., La Marca A. DNA Extraction from soil by EZ1 Advanced XL (Qiagen). // Forensic Science International. 2019. V. 299. P. 161-167. doi :10.1016/j .forsciint.2019.04.004

53.Barkham T. BioRobot EZ1 Workstation Compares Well with Manual Spin Kits for Extraction of Viral RNA from Sera and Saves Substantial Staff Time. // Journal of Clinical Microbiology.2006. V. 44. I. 4. P. 1598-1598. doi:10.1128/jcm.44.4.1598.2006

54.BioSprint 96 DNA Blood Kit. [Электронный ресурс] / URL: https://www.qiagen.com/ca/resources/resourcedetail?id=aef164c4-14c6-4fc2-950a-99bd855cdb90&lang=en

55.Xenophontos S., Christofi V., Iosif G., et. al. Internal validation of the QIAamp DNA Investigator Kit, QIAamp 96 DNA Swab BioRobot Kit and the BioRobot Universal System for DNA extraction from reference and crime scene samples. // Forensic Science International: Genetics. 2015. V. 14. P. 8-10. doi:10.1016/j.fsigen.2014.10.020

56.BioRobot MDx DSP User Manual. [Электронный ресурс] / URL: http://www.qiagen.com/resources/download.aspx?id=b80575ae-5c09-4dfe-89ac-30ee4bdddca7&lang=en

57.Bhattacharya S., Das P., Pandey P. A high yield DNA extraction method for medically important Candida species: A comparison of manual versus QIAcube-based automated system. // Indian Journal of Medical Microbiology. 2016. V. 34. I. 4. P. 533-535. doi:10.4103/0255-0857.195360

58.Kruh0ffer M., Voss T., Beller K., et. al. Evaluation of the QIAsymphony SP Workstation for Magnetic Particle-Based Nucleic Acid Purification From Different Sample Types for Demanding Downstream Applications. // Journal of the Association for Laboratory Automation. 2010. V. 15. I. 1. P. 41-51. doi:10.1016/j.jala.2009.07.006

59.O'Brien D. P., Benedict K. A., Morken N. W., et. al. Automated Purification of DNA from Large Samples: A Study of Effectiveness and Labor Efficiency. // JALA. 2002. V. 7. I. 4. P. 38-42. doi:10.1016/s1535-5535-04-00204-7

60.Marchand D. H., Snyder L. R., Dolan J. W. Characterization and applications of reversed-phase column selectivity based on the hydrophobic-subtraction model. // Journal of Chromatography A. 2008. V. 1191. I. 1. P. 2-20. doi: 10.1016/j .chroma.2007.10.079

61.Anderson D. Chromatofocusing. // Separation Science and Technology. 2005. V. 7. P. 265-296. doi:10.1016/s0149-6395(05)80015-7

62.Grönberg A. Ion Exchange Chromatography. // Biopharmaceutical Processing. 2018. P. 379-399. doi:10.1016/b978-0-08-100623-8.00018-9

63.Walton H. F. Ligand-Exchange Chromatography: A Brief Review. // Ind. Eng. Chem. Res. 1995. V. 34. I. 8. P. 2553-2554. doi:10.1021/ie00047a001

64.Rodriguez E. L., Poddar S., Iftekhar S., et. al. Affinity Chromatography: A Review of Trends and Developments over the Past 50 Years. // Journal of Chromatography B. 2020. V. 1157. doi:10.1016/jjchromb.2020.122332

65.Kapustin D.V., Yagudaeva E.Yu., Zavada L.L., et al. A composite polyaniline-containing silica sorbent for DNA isolation. // Rus. J. of Bioorg. Chem. 2003. I. 29. P.281-285.

66.Льяо Д.-Дж., Зыбин Д.И., Простякова А.И. Статическая и динамическая сорбция нуклеиновых кислот и белков на поверхности сорбентов, модифицированных нанотолщинными слоями полимеров // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2018. Т. 61. В. 1. С. 4-22 doi: 10.6060/tcct.20186101.5694

67.Binnig G., Rohrer H. Scanning tunneling microscopy // Surface Science. 1983. V. 126. P. 236-244. doi:10.1016/0039-6028(83)90716-1

68. [Электронный ресурс] / URL: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1986/press-release/

69. Bian K., Gerber C., Heinrich A.J. et al. Scanning probe microscopy. // Nat Rev Methods Primers 1. 2021. I. 36 doi:10.1038/s43586-021-00033-2

70. Хубатхузин А.А., Абдуллин И.Ш., Христолюбова В.И., Особенности измерения физико-механических свойств нанопокрытий // Вестник Казанского технологического университета. 2014. №. 2. C. 39-42.

71. Nikitin P.I., Valeiko M.V., Gorshkov B.G. New Direct Optical Biosensors for Multi-Analyte Detection // Sensors and Actuators B. 2003. V. 90. P. 4651.

72.Mullis K., Faloona F., Scharf S. Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction. // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 1986. V. 51. P. 263-273. doi:10.1101/sqb. 1986.051.01.032

73.[Электронный ресурс] / URL: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1993/summary/

74.Higuchi R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. // BioTechnology. 1992. V.10. P. 413-417.

75.Deepak S.A., Kottapalli K.R., Rakwal R., et. al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. // Current Genomics. 2007. V. 8. I. 4. P. 234-251. doi:10.2174/138920207781386960

76.Spata M. Image data analysis in qPCR: A method for smart analysis of DNA amplification // Sensing and Biosensing Research. 2015. V. 6. P. 79-84.

77.Salvatore P. PCR Technologies for Point of Care Testing: Progress and Perspectives // ACS Sens. 2017. I. 282. P. 876-891. doi: 10.1021/acssensors.7b00299

78.Germer T. A., Zwinkels J. C., Tsai B. K. Theoretical Concepts in Spectrophotometric Measurements. Spectrophotometry // Experimental Methods in the Physical Sciences. 2014. V. 46. P. 11-66. doi:10.1016/b978-0-12-386022-4.00002-9

79.Holmes D. L., Stellwagen N. C. Electrophoresis of DNA in Oriented Agarose Gels. // Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. 1989. V. 7. I. 2. P. 311-327. doi:10.1080/07391102.1989.10507774

80.Fritsch R. J., Krause I. ELECTROPHORESIS. // Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. 2003. V. 3. P. 2055-2062. doi:10.1016/b0-12-227055-x/01409-7

81.Roth C. M. ELECTROPHORESIS | Nucleic Acids. // Encyclopedia of Analytical Science. 2004. P. 456-460. doi:10.1016/b0-12-369397-7/00130-8

82.Nikitin P.I., Gorshkov B.G., Nikitin E.P., et. al. Picoscope; a new label-free biosensor. // Sensors Actuators B. 2005. V. 111. P. 500-504. doi: 10.1016/j.snb.2005.03.043.

83.Дирюгина Е.Г., Буренин А.Г., Никитин М.П. Детекция в реальном времени аутоантител в сыворотке крови с помощью безметочной биосенсорной системы Пикоскоп. // Труды МФТИ. 2012. Том. 4. №. 3. С. 11-17.

84.Jenkins D., Ramole R., Mohini B., Jain A. A Review: Analytical method development and validation // Sys Rev Pharm. 2021. V. 12. I. 8. P.450-454

85.Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1)

[Электронный ресурс] / URL: https://pharmadvisor.ru/document/tr3569/ 86.ICH guidline Q2(R2) on validation of analytical procedures. [Электронный ресурс] / URL:

https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-guideline-q2r2-validation-analytical-procedures-step-2b_en.pdf

87.Государственная фармакопея РФ XIV изд. Том 1. 0ФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик. [Электронный ресурс] / URL: https://femb.ru/record/pharmacopea14

88.Фармакопея Евразийского экономического союза. Том 1. Часть 1. [Электронный ресурс] / URL:

https://eec.eaeunion.org/upload/medialibrary/bd2/Farmakopeya-2020-t1 1.pdf

89.Дворкин В.И. Метрология и обеспечение качества химического анализа. // М:Химия. 2001. 263 с.

90.Nkongolo K. K., Narendrula-Kotha R. Advances in monitoring soil microbial community dynamic and function. // Journal Appl Genet. 2020. V. 61. I. 2. P. 249-263. doi:10.1007/s13353-020-00549-5

91.Robe P., Nalin R., Capellano C., et. al. Extraction of DNA from soil. // European Journal of Soil Biology. 2003. V. 39. I. 4. P. 183-190. doi:10.1016/s1164-5563(03)00033-5

92.Tsai Y.L., Olson B.H. Rapid method for separation of bacterial DNA from humic substances in sediments for polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. I. 7. P. 2292-2295.

93.Davies G., Ghabbour E.A. Humic substances: structures, properties and uses // Cambridge: The Royal Society of Chemistry. 1998. 133 p.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Инструкция по применению набора для экстракции суммарной ДНК из образцов зерновых культур.

ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ.

Набор поставляется в 2 видах комплектации:

Комплектация 1. Содержит набор реагентов, достаточных для проведения выделения суммарной ДНК из 50 образцов зерна, при условии точного выполнения последовательности действий, представленных в пункте ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

Комплектация 2. Содержит набор реагентов, достаточных для проведения выделения суммарной ДНК из 100 образцов зерна, при условии точного

выполнения последовательности действий, представленных в пункте ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА. СОСТАВ НАБОРА.

Реактив Комплектация 1 Комплектация 2

Количество

Спин-картриджи для выделения суммарной ДНК 50 шт 100 шт

Вода очищенная, не содержащая нуклеаз 50 пробирок по 1,5 мл 100 пробирок по 1,5 мл

Микропробирки объемом 1,5 мл, не содержащие нуклеаз 150 шт 300 шт

Буферный раствор для лизиса 2 пробирки по 5 мл 4 пробирки по 5 мл

Протеиназа К, лиофилизат 1 пробирка 1 пробирка

Буферный раствор для Протеиназа К 1 пробирка 1 пробирка

НАЗНАЧЕНИЕ. Комплект реагентов предназначен для выделения суммарной ДНК из образцов зерна для последующего анализа методом полимеразной цепной реакции.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.

Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. При работе с набором следует соблюдать стандартные меры предосторожности для лабораторий:

- использовать лабораторные перчатки и халаты;

- не принимать пищу, не пить и не курить в лабораторных помещениях;

- после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с мылом.

Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попадании на них компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов набора реагентов следует немедленно обратиться за медицинской помощью.

ОБОРУДОВАНИЕ, НЕОБХОДИМОЕ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ПРОБ.

1. Ламинарный бокс (например, Ламинарный шкаф II класса защиты БМБ-П-«Ламинар-С»-1,2 NEOTERIC (221.120), «Ламинарные системы», Россия) или ПЦР бокс (например, ПЦР-бокс БАВ-ПЦР «Ламинар-C», «Ламинарные системы», Россия).

2. Термостат для пробирок объемом 1,5 мл типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).

3. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например, «Eppendorf 5418», Германия).

4. Вортекс (например, «ELMI», Латвия).

6. Набор механических дозаторов переменного объема (например, «Eppendorf», Германия).

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

1. Образец измельченного зерна массой 100 мг помещают в пластиковые микропробирки объемом 1,5 мл.

2. В пробирку добавляют 200 мкл буферного раствора для лизиса и 25 мкл раствора протеиназы К. Тщательно перемешать на вортексе. При первом использовании набора в пробирку «Протеиназа К, лиофилизат» внести

1 мл буферного раствора для протеиназы К, тщательно перемешать. Полученный раствор использовать при проведении лизиса. Хранить при температуре не выше -20°С.

3. Инкубируют 20 мин при 60°С.

4. В спин-картриджи для выделения суммарной ДНК внести 300 мкл воды очищенной, не содержащей нуклеаз, вставить в микропробирки объемом 1,5 мл, не содержащие нуклеаз и центрифугировать в течение

2 мин при 2000 об/мин. Процедуру повторить 2 раза.

5. Лизат, полученный после инкубирования (пункт 3), центрифугировать в течение 2 мин при 2000 об/мин. 100 мкл полученного лизата внести в спин-картриджи для выделения суммарной ДНК, инкубировать 2 мин при комнатной температуре, а затем центрифугировать при в течение 2 мин при 2000 об/мин.

6. Полученный элюат использовать при проведении ПЦР-анализа.

СРОК ГОДНОСТИ - 2 года. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.

ХРАНЕНИЕ. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ. При температуре от 2 до 8 °С.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Инструкция по применению набора для выделения суммарной ДНК из образцов почвы.

ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ.

Набор поставляется в 2 видах комплектации:

Комплектация 1. Содержит набор реагентов, достаточных для проведения выделения суммарной ДНК из 50 образцов почвы, при условии точного выполнения последовательности действий, представленных в пункте ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

Комплектация 2. Содержит набор реагентов, достаточных для проведения выделения суммарной ДНК из 100 образцов почвы, при условии точного выполнения последовательности действий, представленных в пункте ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

СОСТАВ НАБОРА.

Реактив Комплектация 1 Комплектация 2

Количество

Спин-картриджи для выделения суммарной ДНК 50 шт 100 шт

Вода очищенная, не содержащая нуклеаз 50 пробирок по 1,5 мл 100 пробирок по 1,5 мл

Микропробирки объемом 1,5 мл, не содержащие нуклеаз 150 шт 300 шт

Буферный раствор для лизиса 2 пробирки по 5 мл 4 пробирки по 5 мл

Протеиназа К, лиофилизат 1 пробирка 1 пробирка

Буферный раствор для Протеиназа К 1 пробирка 1 пробирка

НАЗНАЧЕНИЕ. Комплект реагентов предназначен для суммарной ДНК из образцов почв для последующего анализа методом полимеразной цепной реакции.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.

Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. При работе с набором следует соблюдать стандартные меры предосторожности для лабораторий:

- использовать лабораторные перчатки и халаты;

- не принимать пищу, не пить и не курить в лабораторных помещениях;

- после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с мылом.

Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попадании на них компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов набора реагентов следует немедленно обратиться за медицинской помощью.

ОБОРУДОВАНИЕ, НЕОБХОДИМОЕ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ПРОБ.

1. Ламинарный бокс (например, Ламинарный шкаф II класса защиты БМБ-П-«Ламинар-С»-1,2 NEOTERIC (221.120), «Ламинарные системы», Россия) или ПЦР бокс (например, ПЦР-бокс БАВ-ПЦР «Ламинар-C», «Ламинарные системы», Россия).

2. Термостат для пробирок объемом 1,5 мл типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).

3. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например, «Eppendorf 5418», Германия).

4. Вортекс (например, «ELMI», Латвия).

6. Набор механических дозаторов переменного объема (например, «Eppendorf», Германия).

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

1. Образец почвы массой 100 мг, перетертый и очищенный от остатков растений, помещают в пластиковые микропробирки объемом 1,5 мл.

2. В пробирку добавляют 200 мкл буферного раствора для лизиса и 25 мкл раствора протеиназы К. Тщательно перемешать на вортексе. При первом использовании набора в пробирку «Протеиназа К, лиофилизат» внести

1 мл буферного раствора для протеиназы К, тщательно перемешать. Полученный раствор использовать при проведении лизиса. Хранить при температуре не выше -20°С.

3. Инкубируют 20 мин при 60°С.

4. В спин-картриджи для выделения суммарной ДНК вести 300 мкл воды очищенной не содержащей нуклеаз, вставить в микропробирки объемом 1,5 мл, не содержащие нуклеаз и центрифугировать в течение 2 мин при 2000 об/мин. Процедуру повторить 2 раза.

5. Лизат, полученный после инкубирования (пункт 3) центрифугировать при в течение 2 мин при 2000 об/мин. 100 мкл полученного лизата внести в спин-картриджи для выделения суммарной ДНК, инкубировать

2 мин при комнатной температуре, а затем центрифугировать при в течение 2 мин при 2000 об/мин.

6. Полученный элюат использовать при проведении ПЦР-анализа.

СРОК ГОДНОСТИ - 2 года. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.

ХРАНЕНИЕ. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ. При температуре от 2 до 8 °С.

ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Инструкция по применению набора для экстракции и амплификации ДНК CHO для анализа остаточной ДНК в активных фармацевтических субстанциях.

ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ.

Набор поставляется в 2 видах комплектации:

Комплектация 1. Содержит набор реагентов, достаточных для проведения выделения суммарной ДНК из 25 образцов АФС, при условии точного выполнения последовательности действий, представленных в пункте ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

Комплектация 2. Содержит набор реагентов, достаточных для проведения выделения суммарной ДНК из 50 образцов АФС, при условии точного выполнения последовательности действий, представленных в пункте ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

СОСТАВ НАБОРА.

Реактив Комплектация 1 Комплектация 2

Количество

Спин-картриджи для выделения ДНК 75 шт 150 шт

Вода очищенная, не содержащая нуклеаз 50 пробирок по 1,5 мл 100 пробирок по 1,5 мл

Микропробирки объемом 1,5 мл, не содержащие нуклеаз 150 шт 300 шт

Буферный раствор для лизиса 2 пробирки по 5 мл 4 пробирки по 5 мл

Протеиназа К, лиофилизат 1 пробирка 1 пробирка

Буферный раствор для Протеиназа К 1 пробирка 1 пробирка

Готовая смесь для проведения ПЦР в реальном времени 1 пробирка 2 пробирки

НАЗНАЧЕНИЕ. Комплект реагентов предназначен для выделения суммарной ДНК из образцов АФС для последующего анализа методом полимеразной цепной реакции.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.

Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. При работе с набором следует соблюдать стандартные меры предосторожности для лабораторий:

- использовать лабораторные перчатки и халаты;

- не принимать пищу, не пить и не курить в лабораторных помещениях;

- после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с мылом.

Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попадании на них компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов набора реагентов следует немедленно обратиться за медицинской помощью.

ОБОРУДОВАНИЕ, НЕОБХОДИМОЕ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ПРОБ.

1. Ламинарный бокс (например, ламинарный шкаф II класса защиты БМБ-П-«Ламинар-С»-1,2 NEOTERIC (221.120), «Ламинарные системы», Россия) или ПЦР бокс (например, ПЦР-бокс БАВ-ПЦР «Ламинар-C», «Ламинарные системы», Россия)

2. Термостат для пробирок объемом 1,5 мл типа «Эппендорф» от 25 до 100°С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).

3. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс. об/мин (например, «Eppendorf 5418», Германия).

4. Вортекс (например, «ELMI», Латвия).

6. Набор механических дозаторов переменного объема (например, «Eppendorf», Германия).

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

1. В спин-картриджи для выделения суммарной ДНК вести 300 мкл воды.

2. 1,5 мл, не содержащие нуклеаз и центрифугировать в течение 2 мин при 2000 об/мин. Процедуру повторить 2 раза.

3. 50 мкл образца внести в спин-картриджи для выделения суммарной ДНК, инкубировать 2 мин при комнатной температуре, а затем центрифугировать в течение 2 мин при 2000 об/мин.

4. Полученный элюат использовать при проведении ПЦР-анализа.

СРОК ГОДНОСТИ - 2 года. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.

ХРАНЕНИЕ. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ. При температуре от 2 до 8°С.

ПРИЛОЖЕНИЕ 4. Паспорт стандартного образца, полученного от ООО «ФАРМАПАРК».

ПАРМА Eü ПАРК

ООО «ФАРМАПАРК»

117246, Москва, Научный пр-д, д. 8, стр. 1 тел.: [phone], факс: [phone] www.pharm3D3rk.ru г^о©рЬагтарагк ги

Паспорт №010721

Наименование продукции по НД Стандартный образец предприятия ДНК СНО

Объём серии, тип упаковки 5 флакон х 0,5 мл

Номер серии 010721

Дата изготовления 07.2021

Годен до 07.2025

Условия хранения При температуре не менее -40 и не более -18 °С в защищенном от света месте

Условия транспортирования При температуре не менее -40 и не более -18 °С в защищенном от света месте

Испытания проведены в соответствии с В соответствии с рекомендациями QIAamp DNA Mini Kit

Показатель Метод Норма Результаты испытаний

Чистота УФ- спектрофотоме трия 2.0> А260/А280> 1.6 1.9

Содержание УФ- спектрофотоме трия Не менее 100 нг/мкл 173 нг/мкл

Заключение: Стандартный образец предприятия ДНК СНО (СОп ДНК СНО) серия 010721 соответствует заявленным показателям качества.

Директор по науке

Ю.А. Серегин

ПРИЛОЖЕНИЕ 5. Акт внедрения в процесс контроля качества субстанции Инфликсимаб ООО «ФАРМАПАРК».

УТВЕРЖДАЮ

Генеральный директор ООО «ФАРМАПАРК»

Об использовании результатов диссертационной работы аспиранта ФГБОУ ВО «Российский технологический университет - МИРЭА» Зыбина Дмитрия Игоревича на тему «Молекулярно-диагностические наборы на основе полианилинсодержащих композитов для одностадийной экстракции нуклеиновых кислот» по специальности 1.4.2 - аналитическая химия.

Комиссия в составе:

Председатель комиссии - Серёгин Юрий Александрович, к.б.н. -Директор по науке ООО «ФАРМА11АРК»

Члены комиссии:

Сорокина Татьяна Сергеевна - Заместитель директора по науке ООО «ФАРМАПАРК»

Орлова Наталья Владимировна, к.б.н. - Начальник сектора контроля качества департамента экспериментального производства ООО «ФАРМАПАРК» составили настоящий акт о том, что материалы кандидатской диссертации Зыбина Дмитрия Игоревича на тему «Молекулярно-диагностические наборы на основе полианилинсодержащих композитов для одностадийной экстракции нуклеиновых кислот» используются в деятельности ООО «ФАРМАПАРК» при производстве и контроле качества субстанции рекомбинантного моноклонапьного антитела инфликсимаб.

ПРИЛОЖЕНИЕ 6. Описание участка геномной ДНК CHO, использованный для подбора праймеров.

GenBank: J00056.1 FASTA Graphics

Go to: R

LOCUS CRURSA49C 264 bp DNA linear ROD 27-APR-1993

DEFINITION Chinese hamster Alu-equivalent type 2 repeat (clone 49c) DNA. ACCESSION 300056 VERSION 300056.1 KEYWORDS Alu repeat; repeat region. SOURCE Cricetulus griseus (Chinese hamster)

ORGANISM Cricetulus griseus

Eukaryota; Metaroa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Glires; Rodentia; Myomorpha; Muroidea; Cricetidae; Cricetinae; Cricetulus.

1 (bases 12 to 235)

Haynes,S.R., Toomey,T.P., Leinwand,L. and 3elinek,W.R. The Chinese hamster Alu-equivalent sequence: a conserved highly repetitious, interspersed deoxyribonucleic acid sequence in mammals has a structure suggestive of a transposable element Mol. Cell. Biol. 1 (7), 573-583 (1981) 9279371

2 (bases 1 to 264) Haynes,S.R. and 3elinek,W.R.

Low molecular weight RNAs transcribed in vitro by RNA polymerase III from Alu-type dispersed repeats in Chinese hamster DNA are also found in vivo

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78 (10), 6130-6134 (1981)

6796957

Original source text: Hamster (cho cells) clone 49, repeat c. Two short direct repeats flank most alu-type repeats; here they are bp 12-30 and 216-235. Several rna poliii transcripts with a common 5' end are made in vitro and in vivo. See other Chinese hamster alu-equivalent sequences.

Location/Qualifiers 1..264

/organism="Cricetulus griseus" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:10029" Slightly upstream from xhoi site. 1 gagatatgag caaaagaaac ttggaaagga ggctggagag atggctcgag gttaagagca 61 ccaactgctc ttccagaggt cctgagttca attcccagca accacatggt ggctcacaac 121 aatctataat gagatctggt gccctcttct ggtgtgcaga tatatatgga agcagaatgt 181 tgtatacata ataaataaat aaaatcttaa aaaaaaaaag gaaacttgga aaggaaaggg 241 tttattctag cttacaactc tcag

REFERENCE AUTHORS TITLE

JOURNAL PUBMED REFERENCE AUTHORS TITLE

30URNAL PUBMED COMMENT

FEATURES

source

ORIGIN

//