Молекулярно-генетическое исследование комаров комплекса Culex pipiens: Diptera: Culicidae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Храброва, Наталья Валерьевна

• Храброва, Наталья Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Храброва, Наталья Валерьевна

Список условных сокращений и обозначений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Существование двух форм Culex pipiens pipiens.

1.1.1. История открытия двух форм Culex pipiens pipiens.

1.1.2. Основные биологические и экологические признаки

С. р. pipiens и С. р. molestus.

1.1.2.1. Автогенность - неавтогенность.

1.1.2.2. Стеногамность - эвригамность.

1.1.2.3. Гомодинамность - гетеродинамность.

1.1.2.4. Прокормители.

1.1.2.5. Местообитания.

1.1.3. Гибридизация между С. р. pipiens и С. р. molestus.

1.1.4. Таксономический статус С. р. pipiens и С. р. molestus

1.2. Culex torrentium.

1.3. Молекулярные методы популяционной генетики, систематики и филогении. ф 1.3.1. Изоферментный анализ.

1.3.2. Иммунологический анализ.

1.3.3. ДНК - ДНК гибридизация.

1.3.4. RFLP-анализ.

1.3.5. Секвенирование.

1.3.6. RAPD-анализ.

1.4. Объекты молекулярной систематики и филогении.

1.4.1. Митохондриальная ДНК.

1.4.2. Рибосомальная ДНК.

2. Материал и методы.

2.1. Материал.

2.2. Методы.

• 2.2.1. Выделение ДНК.

2.2.2. RAPD-ПЦР.

2.2.3. Поиск специфичных RAPD - фрагментов.

2.2.4. Клонирование и секвенирование специфичных

RAPD - фрагментов.

2.2.5. SCAR-ПЦР.

2.2.6. Рестрикционный анализ участка митохондриального генабъединицы I цитохромоксидазы ф 2.2.7. Амплификация ITS2 регионов рибосомальной ДНК

2.2.8. Амплификация второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2.

2.2.9. Секвенирование участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с и второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2.

2.2.10. RAPD - полиморфизм.

3. Результаты.

3.1. Молекулярно - генетические маркеры для идентификации представителей комплекса Culex pipiens.

Ф 3.1.1. RAPD-маркеры.

3.1.2. SCAR - маркеры.

3.1.3. ITS2 регионы рибосомальной ДНК. 3.1.4. Участок генабъединицы I цитохромоксидазы

3.1.5. Второй интрон гена ацетилхолинэстеразы 2.

3.2. Полиморфизм RAPD - маркеров в природных популяциях

С. p. pipiens, С. p. molestus, С. torrentium.

4. Обсуждение.

4.1. Использование молекулярно - генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens.

4.1.1. RAPD- маркеры.

4.1.2. SCAR - маркеры.

4.1.3. ITS2 регионы рибосомальной ДНК.

4.1.4. Участок генабъединицы I цитохромоксидазы

4.1.5. Второй интрон гена ацетилхолинэстеразы 2.

4.2. Генетическая дифференциация популяций С. p. pipiens,

С. p. molestus и С. torrentium умеренных широт.

4.3. Распространение С. torrentium и С. p. pipiens на территории

Томской области и Республики Казахстан.

Выводы. ф Литература.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота км - километр м - метр i м - кубический метр мкг - микрограмм (10"6 грамм) мкл - микролитр (10"6 литр) мкМ - микромоль (10"6 моль) мМ - миллимоль (10"3 моль) мРНК - матричная РНК мтДНК - митохондриальная ДНК нг- нанограмм (10"9 грамм) п.н. - пар нуклеотидов (bp - base pairs) пмоль - пикомоль (10" " моль)

ПЦР - полимеразная цепная реакция (PCR - Polymerase Chain Reaction) рДНК - рибосомальная ДНК

PK - Республика Казахстан

РНК - рибонуклеиновая кислота рРНК - рибосомальная РНК см - сантиметр см3 - кубический сантиметр т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов (kb - kilobase pairs)

ТО - Томская область тРНК - транспортная РНК

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

АР - случайные праймеры (Arbitrary Primers)

BSA - бычий сывороточный альбумин (Bovine Serum Albumin)

COI - ген субъединицы I цитохромоксидазы с

DAF - фингерпиринтинг амплифицированной ДНК (DNA Amplification Fingerprinting)

DNei- генетическое расстояние по Нею dNTP- дезоксинуклеозидтрифосфат

ETS - внешний транскрибируемый спейсер (External Transcribed Spacer)

F1 - первое поколение гибридных особей F2 - второе поколение гибридных особей IGS - межгенный спейсер (InterGenic nontranscribed Spacer) ITS - внутренний транскрибируемый спейсер (Internal Transcribed Spacer) n - объем выборки

D Nei - среднее генетическое расстояние по Нею

RAPD - случайным образом амплифицированная ДНК (Random Amplified Polymorphic DNA)

RFLP - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphism) s.l. - в широком смысле (sensu lato) s.s. - в узком смысле (sensu stricto)

SCAR - последовательности, характеризующие амплифицированные регионы (Sequence Characterized Amplified Regions) Ssp I - рестриктаза из видов p. Sphaerotilus TAE - трис - ацетат - ЭДТА (буфер)

ТаяДНК — полимераза — ДНК — полимераза из бактерии Termus aquaticus

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическое исследование комаров комплекса Culex pipiens: Diptera: Culicidae»

Актуальность темы

Комары комплекса Culex pipiens (Díptera: Culicidae) представляют большой научный и практический интерес. Они являются активными кровососами людей (особенно на урбанизированных территориях) и известны как переносчики возбудителей ряда опасных заболеваний человека. Высокая экологическая пластичность, сложная таксономическая структура и характер взаимоотношений между членами комплекса привлекают постоянное внимание исследователей. Представление о составе комплекса Culex pipiens и таксономическом ранге его членов на протяжении длительного периода его изучения менялись, до сих пор единого мнения по этому вопросу не достигнуто (Виноградова, 1997).

Culex pipiens L., 1758 - северный обыкновенный комар, включает в себя две формы или экотипа, pipiens и molestus, для которых характерно симпатрическое распространение, небольшие морфологические и значительные биологические отличия (Виноградова, 1961, 1997; Лопатин, 2000). Единственным достоверным морфологическим признаком, позволяющим идентифицировать pipiens и molestus, является величина сифоналыюго индекса личинок. В то же время, различия в биологии настолько очевидны, что некоторые авторы рассматривают автогенную форму в качестве самостоятельного вида С. molesius Forskâl, 1775 (Miles, 1977; Knight, 1978), другие, напротив, считают pipiens и molestus формами одного вида, а отличия между ними - только физиологической изменчивостью (Harbach, Harrison, Gad, 1984; Виноградова, 1997), а третьи -подвидами или полувидами (Bullini, 1982; Лопатин, 2000).

Culex torrentium Martini, 1924 считается видом - двойником Culex pipiens, литературные сведения о нем фрагментарны, не определены и границы ареала (Natvig, 1948; Mattingly, 1951а; Service, 1968; Jupp, 1979; Gillies, Gubbins, 1982; Dahl, 1988). Морфологически С. torrentium и С. p. pipiens близки, распространение симпатричное. В биологическом отношении С. torrentium также похож на С. p. pipiens - неавтогенный, эвригамный и гетеродинамный комар (Dahl, 1988; Виноградова, 1997). По личинкам виды не различимы, определение ведется только по самцам, диагностическое значение имеют особенности строения гипопигия (Виноградова, 1997).

Исследования представителей рода Culex приобрели особое значение в связи с возникновением трех крупных эпидемий западнонильской лихорадки (West Nile virus) в урбанизированных районах на юге Румынии (Tsai, Popovici, Cernescu et al., 1998), в дельте Волги в России (Lvov, Butenko, Gromashevsky et al., 2000; Platonov, Shipulin, Shipulina et al., 2001) и на северо - востоке США (Lanciotti, Roehrig, Deubel et al., 1999) в 1996 - 1999 гг. Основным признаком, объединяющим эти эпидемии, явилось вовлечение Culex pipiens в передачу возбудителя заболевания (Hayes, 2001).

Надежная и быстрая идентификация комаров необходима для дифференцировки форм и лучшего понимания их потенциальной роли в передаче возбудителей заболеваний, а также для разработки эффективных мер контроля. Кроме того, возможность точной идентификации видов или подвидов позволяет изучить другие аспекты биологии, например, особенности личиночной экологии, брачного поведения, устойчивости к инсектицидам (Walton, Sharpe, Pritchard et al., 1999; Kengne, Trung, Baimai et al., 2001; Manguin, Kengne, Sonnier et al., 2002). Важное значение имеет идентификация гибридных особей, т.к. вывод о таксономическом статусе организмов должен базироваться на данных, касающихся природной гибридизации. Морфологические признаки, особенно, если они носят количественный характер, не всегда удобно использовать для этих целей, т.к. часто они подвержены индивидуальной, географической, комбинативной и модификационной изменчивости. Для облегчения идентификации криптических видов комаров широко применяются разнообразные молекулярно - генетические методы в дополнение к традиционным морфологическим (Wilkerson, Parsons, Albright et al., 1993). ДНК - маркеры можно использовать для идентификации организма на любой стадии развития; эти маркеры не подвержены изменчивости, вызванной действием факторов окружающей среды (Ноу, 1994; Walton, Sharpe, Pritchard et al., 1999), что позволяет избежать недостатков, присущих морфометрическим признакам. Кроме того, молекулярные маркеры используются при проведении популяционно - генетических и филогенетических исследований.

Цели и задачи исследования

Цель данной работы заключалась в поиске молекулярно - генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens и оценке внутри - и межвидовой изменчивости Culex torrentium, С. pipiens pipiens, С. p. molestus. Для достижения поставленной цели требовалось выполнить следующие задачи: 1) провести анализ спектров амплифицированных RAPD - фрагментов ДНК для выявления мономорфных специфичных последовательностей ДНК; 2) определить нуклеотидные последовательности специфичных RAPD - фрагментов ДНК для создания SCAR - праймеров; 3) проверить диагностическую ценность молекулярно -генетических маркеров, предложенных другими авторами для идентификации представителей комплекса Culex pipiens; 4) провести секвенирование и сравнение последовательностей второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2 и участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с у особей С. р. pipiens и С. р. molestus с целью выявления различий, пригодных для получения молекулярно - генетических маркеров; 5) оценить внутри - и межвидовую изменчивость и дивергенцию RAPD -маркеров у членов комплекса Culex pipiens.

Научная новизна

Впервые были найдены специфичные RAPD - маркеры для идентификации С. torrentium. Определение нуклеотидной последовательности RAPD - фрагментов позволило создать специфичные SCAR - праймеры. ПЦР с использованием SCAR - праймеров является простым, быстрым и надежным методом идентификации С. torrentium. В ходе работы также была изучена диагностическая ценность маркеров, предложенных другими авторами для идентификации С. p. molestus и С. torrentium (Виноградова, Шайкевич, 2005), С. p. pipiens и С. torrentium (Smith, Fonseca, 2004). Показано, что эти маркеры позволяют идентифицировать особей С. torrentium, в то время как, С. p. pipiens и С. p. molestus идентичны по этим маркерам. Выявлено соответствие результатов при использовании различных типов молекулярно - генетических маркеров. Впервые предложен способ идентификации гибридных особей от скрещивания С. torrentium и С. p. molestus.

Проведен анализ изменчивости RAPD - маркеров в популяциях С. р. pipiens, С. p. molestus и С. torrentium из г. Томска, Томской области и Республики Казахстан. Полученные результаты позволили сделать вывод о генетической дифференциации С. torrentium, С. p. pipiens и С. p. molestus и об отсутствии природной гибридизации между ними в районе проведенных исследований. Кроме того, показано, что в открытых личиночных биотопах (Томская область и Республика Казахстан) доминантным видом является С. torrentium', личинки С. p. pipiens встречаются с небольшой частотой.

Практическая ценность работы

Молекулярно - генетические маркеры, рассмотренные в настоящей работе, можно использовать в любых исследованиях, где необходима надежная идентификация С. torrentium и С. p. pipiens, в частности, при и изучении устойчивости к инсектицидам, путей передачи возбудителей заболеваний, при разработке новых методов контроля за численностью переносчиков, для анализа гибридогенеза, а также, в популяционно -генетических, таксономических, филогенетических и фаунистических исследованиях. Принципы поиска и создания специфичных маркеров (RAPD- и SCAR - маркеры), изложенные в диссертации, можно применять для получения диагностических маркеров практически для любого организма.

Апробация результатов работы

Результаты исследований были представлены на II Международной конференции «Проблема вида и видообразования», Томск (2001); на III Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2004); на III Международной конференции «Проблема вида и видообразования», Томск (2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано шесть работ.

Благодарности

Прежде всего я хотела бы выразить глубокую признательность научному руководителю, заведующему лабораторией эволюционной цитогенетики НИИ ББ при ТГУ, д.б.н., профессору В.Н. Стегнию за предоставленную возможность работы над интересной темой, общее руководство и помощь на всех этапах работы над диссертацией. Также, я искренне благодарна к.б.н. Сибатаеву А.К. за предоставление части материала, определение комаров, всестороннюю помощь и поддержку. Я признательна сотрудникам лаборатории эволюционной цитогенетики НИИ ББ при ТГУ Русаковой A.M., Шабановой Ю.В., Штумпф О.В. за помощь в сборе материала, а также, к.б.н. Брагинец О.П. за синтез RAPD - праймеров. Благодарю ст. преподавателя кафедры цитологии и генетики ТГУ Новикова Ю.М. за ценные комментарии к работе. В заключение хочу выразить свою признательность всем коллегам из лаборатории эволюционной цитогенетики НИИ ББ при ТГУ за участие и моральную поддержку.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Исследование видов, подвидов и внутривидовых форм, входящих в комплекс Culex pipiens (Diptera: Culicidae), представляет одну из важнейших проблем в таксономии комаров. Эта проблема существует десятилетиями из-за трудностей и споров, касающихся ряда сложных биологических вопросов: автогенности - неавтогенности, стеногамности - эвригамности, антропофилии - зоофилии - орнитофилии, гомодинамности -гетеродинамности, морфологии, распространения и гибридизации (Harbach, Harrison, Gad, 1984). Наиболее интересен в этом смысле подвид С. p. pipiens, две формы которого наделены альтернативными биологическими признаками (Виноградова, 2003), а также Culex torrentium - вид - двойник Culex pipiens.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Храброва, Наталья Валерьевна

выводы

1. Проведен анализ ДНК - маркеров у трех представителей комплекса Culex pipiens - Culex torrentium, С. p. pipiens, С. p. molestus

2. Выявлены, идентифицирующие Culex torrentium, специфичные фрагменты ДНК, амплифицирующиеся RAPD - праймерами ОРВ - 02 и OPA -11

3. Определение нуклеотидных последовательностей мономорфных RAPD - фрагментов позволило подобрать видоспецифичные SCAR - праймеры. Результатом использования SCAR - праймеров является амплификация специфичных фрагментов ДНК (SCAR - маркеров), позволяющих надежно идентифицировать особей С. torrentium и С. p. pipiens в природных популяциях

4. Показано, что рестрикционный анализ участка митохондриального гена COI, анализ размеров ПЦР фрагментов ITS2 регионов рДНК, а также маркеры, основанные на последовательности второго интрона гена АСЕ2, позволяют идентифицировать особей С. torrentium

5. Выявлено, что нуклеотидные последовательности участка митохондриального гена COI и участка второго интрона гена АСЕ2 идентичны у С. р. pipiens и С. р. molestus

6. Анализ изменчивости RAPD - маркеров в популяциях представителей комплекса Culex pipiens из г. Томска, Томской области и Республики Казахстан показал, что С. torrentium, С. р. pipiens и С. р. molestus умеренного климата генетически дифференцированы, природная гибридизация между ними отсутствует

7. Показано, что в открытых личиночных биотопах (Томская область и Республика Казахстан) доминантным видом является С. torrentium; личинки С. р. pipiens встречаются с небольшой частотой

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Храброва, Наталья Валерьевна, 2006 год

1. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. - Т. 38, № 9. - С. 1173 - 1195.

2. Виноградова Е. Б. О биологической обособленности подвидов Culex pipiens L. (Díptera, Culicidae) // Энтомол. обозрение. 1961. - Т. 40, вып. 1. - С. 63-75.

3. Виноградова Е.Б. Городской комар // Природа. 2003. - № 12. - С. 3 - 11.

4. Виноградова Е.Б. Комары комплекса Culex pipiens в России (таксономия, распространение, экология, физиология, генетика, практическое значение и контроль). СПб.: Изд - во Зоологического института РАН, 1997. - 307 с.

5. Виноградова Е.Б. Кровососущие комары комплекса Culex pipiens L. (Díptera, Culicidae), их практическое значение, систематика и биология // Энтомол. обозрение. 1966. - Т. 45, вып. 2. - С. 241 - 257.

6. Виноградова Е.Б. Наследование морфологических признаков при гибридизации в комплексе Culex pipiens L. (Díptera: Culicidae) // Тр. ЗИН АН СССР. 1965. - Т. 36. - С. 58 - 69.

7. Виноградова Е.Б., Шайкевич Е.В. Дифференциация городского комара Culex pipiens pipiens f. molestus и Culex torrentium (Díptera: Culicidae)молекулярно генетическими методами // Паразитология. - 2005. - Т. 39, № 6-С. 574 - 576.

8. Виноградская О.Н. К нахождению Culex torrentium Mart. (Culex exilis Dyar) в Подмосковье II Мед. паразитол. 1970. - T. 39, № 4. - С. 502 - 504.

9. Гречко В.В. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики//Генетика.-2002.-Т. 38, № 8.-С. 1013- 1033.

10. Гундерина Л.И., Салина Е.А. полиморфизм и дивергенция мультилокусных маркеров ДНК у видов двойников Chironomus riparius Meigen и Chironomus piger Strenzke (Díptera, Chironomidae) II Генетика. - 2003-T. 39, №8.-С. 1059- 1065.

11. Дубицкий A.M. Кровососущие комары (Díptera: Culicidae) Казахстана. -Алма Ата: Изд-во «Наука» Казахской ССР, 1970. - 222 с.

12. Кункова Е.В., Федорова В.Г. Дополнение к фауне комаров семейства Culicidae (Díptera) Новгородской области // Паразитология. 2003. - Т. 37, № 2. -С. 113-117.

13. Кухарчук Л.П. Экология кровососущих комаров (Diptera: Culicidae) Сибири. Новосибирск: Наука, 1981.-232 с.

14. Лопатин O.E. Биологические, экологические и биохимические особенности двух подвидов комаров Culex pipiens в синантропных популяциях: Автореф. канд. дис. / Алма Ата, 1988. - 16 с.

15. Лопатин O.E. Комары Culex pipiens: электрофоретическая изменчивость ферментов // Сибирский эколог, журнал. 2000. - № 4. - С. 461 - 475.

16. Оформление курсовых, дипломных, диссертационных работ: Краткие методические рекомендации / Сост.: B.C. Крылова, Е.Ю. Кичигина. Томск, 2002.-28 с.

17. Саура А., Локки Ю., Корвенконтио П., Локки М.-Л., Ултанен И. Генетическая обособленность малярийных комаров Anopheles beklemishevi и Anopheles messeae (Diptera, Culicidae) и их внутривидовой полиморфизм // Генетика. 1979.-Т. 15, № 12. - С. 2183 - 2194.

18. Сичинава Ш.Г. Реципрокное скрещивание С. p. pipiens с С. p. molestus, копуляция и соотношение полов родительских и гибридных поколений // Сообщ. АН ГрССР. 1975. - Т. 80, № 3. - С. 733 - 736.

19. Сичинава Ш.Г. Реципрокное скрещивание С. p. pipiens с С. p. molestus, автогенность и плодовитость родительских и гибридных поколений // Сообщ. АН ГрССР. 1976. - Т. 81, № 3. - С. 717 - 720.

20. Стегний В.Н. Популяционная генетика и эволюция малярийных комаров. Томск: Изд- во Томского гос. ун-та, 1991. - 136 с.

21. Шайкевич Е.В., Виноградова Е.Б. Молекулярно генетические методы идентификации городского комара Culex pipiens pipiens f. molestus (Diptera, Culicidae) II Паразитология. - 2004. - Т. 38, № 5. - С. 406 - 412.

22. Шингарев H.H. Заметки по Culicidae // Тропическая медицина и ветеринария. 1928. - С. 47 - 53.

23. Штакельберг A.A. Фауна СССР. Насекомые двукрылые. Семейство Culicidae. Т. 3, вып. 4. М. - Л.: Изд - во Академии наук СССР, 1937. - 260 с.

24. Apostol B.L., Black W.C., Reiter P., Miller B.R. Population genetics with RAPD PCR markers: the breeding structure of Aedes aegypti in Puerto Rico // Heredity. - 1996. - Vol. 76. - P. 325 - 334.

25. Aranda C., Eritjia R., Schaffner F., Escosa R. Culex {Culex) torrentium Martini (Diptera: Culicidae) a new species from Spain // European Mosq. Bull. 2000. - № 8.-P.7-9.

26. Avise J.C., Arnold J., Ball R.M. et al. Intraspecific phylogeography: The mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics // Annu. Rev. Ecol. Syst. 1987. - Vol. 18. - P. 489 - 522.

27. Avise J.C., Vrijenhoek R.C. Mode of inheritance and variation of mitochondrial DNA in hybridogenic fishes of the genus Poeciliopsis II Mol. Biol. Evol. 1987. - Vol. 4. - P. 514 - 525.

28. Ayres C.F.J., Romao T.P.A., Melo Santos M.A.V., Furtado A.F. Genetic diversity in Brazilian populations of Aedes albopictus II Mem. Inst. Oswaldo Cruz. -2002. - Vol. 97, № 6. - P. 871 - 875.

29. Barr A.R. Culex II Handbook of genetics, vol.3: Invertebrates of genetic interest.-New York, 1975.-P. 347-375.

30. Barr A.R. Cytoplasmic incompatibility in natural populations of a mosquito, Culexpipiens L. // Nature. 1980. - Vol. 283. - P. 71 - 72.

31. Barr A.R. Occurrence and distribution of the Culex pipiens complex // Bull. Wld. Hlth. Org. 1967. - Vol. 33. - P. 293 - 296.

32. Bates M. The nomenclature and taxonomic status of the mosquitoes of the Anopheles maculipennis complex // Ann. Entomol. Soc. Amer. 1940. - Vol. 33. -P. 343 -356.

33. Bermingham E., Lamb T., Avise J.C. Size polymorphism and heteroplasmy in the mitochondrial DNA in lower vertebrates // J. Hered. 1986. - Vol. 77. - P. 249 -252.

34. Birky C.W. Relaxed cellular controls and organelle heredity // Science. 1983. -Vol. 222.-P. 468-475.

35. Breeuwer J.A.J., Werren J.H. Microorganisms associated with chromosome destruction and reproductive isolation between two insect species // Nature. 1990. -Vol. 346.-P. 511 -558.

36. Bullini L. The electrophoretic approach to the study of parasites and vectors // Parassitologia. 1982. - Vol. 27. - P. 1 - 11.

37. Byrne K., Nichols R.A. Culex pipiens in London underground tunnels: differentiation between surface and subterranean populations // Heredity. 1999. -Vol. 82.-P. 7-15.

38. Carlson J.E., Tulsieram L.K., Glaubitz J.C. et al. Segregation of random amplified DNA markers in Fi progeny of conifers // Theoretical and Applied Genetics. 1991. - Vol. 83. - P. 194 - 200.

39. Caterino M.S., Cho S., Sperling F.A.H. The current state of insect molecular systematics: a thriving Tower of Babel // Annu. Rev. Entomol. 2000. - Vol. 45. - P. 1-54.

40. Chapman R.W., Stephens J.C., Lansman R.A., Avise J.C. Models of mitochondrial DNA transmission genetics and evolution in higher eukaryotes // Genet. Res. 1982. - Vol. 40. - P. 41 - 57.

41. Chevillon C., Eritja R., Pasteur N., Raymond M. Commensalism, adaptation and gene flow: mosquitoes of the Culex pipiens complex in different habitats // Genet. Res. 1995. - Vol. 66. - P. 147 - 157.

42. Chevillon C., Rivet Y., Raymond M. et al. Migration/selection balance and ecotypic differentiation in the mosquito Culex pipiens II Molecular Ecology. 1998-Vol. 7.-P. 197-208.

43. Christophers S.R. Note on morphological characters differentiating Culex pipiens L. from Culex molestus Forskal and the status of these forms // Trans. R. Ent. Soc. Lond. 1951. -Vol. 102, № 7. - P. 372 - 379.

44. Clancy D.J., Hoffman A.A. Cytoplasmic incompatibility in Drosophila simulans: evolving complexity // Trends Ecol. Evol. 1996. - Vol. 11. - P. 145 -146.

45. Clary D.O., Wolstenholme D.R. The mitochondrial DNA molecule of Drosophila yakuba\ nucleotide sequence, gene organization, and genetic code // J. of Mol. Evol. 1985. - Vol. 22. - P. 252 - 271.

46. Cockburn A.F. A simple and rapid technique for identification of large numbers of individual mosquitoes using DNA hybridization // Arch. Insect. Biochem. Phisiol. 1990. -Vol. 14.-P. 191-199.

47. Cohuet A., Simard F., Toto J. C. et al. Species identification within the Anopheles funestus group of malaria vectors in Cameroon and evidence for a new species // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 2003. - Vol. 69, № 2. - P. 200 - 205.

48. Collins F.H., Paskewitz S.M. A review of the use of ribosomal DNA (rDNA) to differentiate among cryptic Anopheles species // Insect Mol. Biol. 1996. - Vol. 5. -P. 1-9.

49. Collins F.N., Petrarca V., Mpofu S., Brandling-Bennet A.D. et al. Comparison of DNA probe and cytogenic methods for identifying field collected Anopheles gambiae complex mosquitoes // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1988. - Vol. 39. - P. 545 -550.

50. Cornel A.J., Porter C.H., Collins F.H. Polymerase chain reaction species diagnostic assay for Anopheles quadrimaculatus cryptic species (Diptera: Culicidae) based on ribosomal DNA ITS2 sequences // J. Med. Entomol. 1996. - Vol. 33. - P. 109-116.

51. Coyne J.A., Orr A. The evolutionary genetics of speciation // Phil. Trans. R. Soc. Lond. 1998. - Vol. 353. - P. 287 - 305.

52. Coyne J. A., Orr H.A. Patterns of speciation in Drosophila II Evolution. 1989. -Vol. 43. - P. 362-381.

53. Cross N.C.P., Dover G.A. Tsetse fly rDNA: An analysis of structure and sequence//Nucleic Acids Res.- 1987.-V. 15.-P. 15-30.

54. Cupp E.W., Ibrahim A.N. Identification of members of the Culex pipiens complex by immunodiffusion and Immunoelectrophoresis // J. Med. Ent. 1973. -Vol. 10, №3.-P. 277-281.

55. Dahl C. Taxonomic studies on Culex pipiens and C. torrentium II Biosystematics of Haematophagous Insects. Oxford Systematics Assoc., 1988. Special vol. 37.-P. 149-175.

56. Favia G., Dimopoulos G., Delia Torre A. et al. Polymorphisms detected by random PCR distinguish different chromosomal forms of Anopheles gambiae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 10315 - 10319.

57. Favia G., Dimopoulos G., Louis C. Analysis of the Anopheles gambiae genome using RAPD markers // Insect Mol. Biol. 1994. - Vol. 3. - P. 149 - 157.

58. Feder J.L., Chilcote C.A., Bush G.L. Are the apple maggot, Rhagoletis pomonella, and blueberry maggot, R. mendax, distinct species? Implications for sympatric speciation // Entomologia Experimentalis et Applicata. 1989. - Vol. 51.-P. 113-123.

59. Foley D.H., Bryan J.H. Electrophoretic keys to identify members of the Anopheles punctulatus complex of vector mosquitoes in Papua New Guinea // Med. Vet. Entomol. 1993. - Vol. 7. - P. 49 - 53.

60. Foley D.H., Meek S.R., Bryan J.H. The Anopheles punctulatus group of mosquitoes in Solomon Islands and Vanuatu surveyed by allozyme electrophoresis // Med. Vet. Entomol. 1994. - Vol. 8. - P. 340 - 350.

61. Foley D.H., Paru R., Dagoro H., Bryan J.H. Allozyme analysis reveals six species within the Anopheles punctulatus complex of mosquitoes in Papua New Guinea // Med. Vet. Entomol. 1993. - Vol. 7. - P. 37 - 48.

62. Fonseca D.M., Keyghobadi N., Malcolm C.A. et al. Emerging vectors in the Culex pipiens complex // Science. 2004. - Vol. 303. - P. 1535 - 1538.

63. Garner K J., Slavicek J.M. Identification and characterization of a RAPD-PCR marker for distinguishing Asian and North American gypsy moths // Insect Molecular Biology. 1996. - Vol. 5. - P. 81 - 91.

64. Gillies M.T., Gubbins S.J. Culex (Culex) torrentium Martini and Cx. (Cx.) pipiens L. in Southern English county, 1974 1975 // Mosquito Systematics. - 1982. -Vol. 14, №2.-P. 127- 130.

65. Gordeev M.I., Goriacheva I.I., Shaikevich E.V., Ejov M.N. Variability of the second internal transcribed spacer of the ribosomal DNA among five Palaearctic species of anopheline mosquitoes // European Mosq. Bull. 2004. - № 17. - P. 14 -19.

66. Gray M.W. Origin and evolution of mitochondrial DNA // Annu. Rev. Cell Biol. 1989. - Vol. 5. - P. 25 - 50.

67. Green C.A., Gass R.F., Munstermann L.E., Baimai V. Population genetic evidence for two species in Anopheles minimus in Thailand // Med. Vet. Entomol. -1990.-Vol. 4.-P. 25-34.

68. Green C.A., Munstermann L.E., Tan S.G. et al. Population genetic evidence for species A, B, C and D of the Anopheles dirus complex in Thailand and enzyme electromorphs for their identification // Med. Vet. Entomol. 1992. - Vol. 6. - P. 29 -36.

69. Guillemaud T., Pasteur N., Rousset F. Contrasting levels of variability between cytoplasmic genomes and incompatibility types in the mosquito Culex pipiens // Proc. R. Soc. Lond. 1997. - Ser. B, vol. 264. - P. 245 - 251.

70. Gyllensten U., Wharton D., Wilson A.C. Maternal inheritance of mitochondrial DNA during backcrossing of two species of mice // J. Hered. 1985. - Vol. 76. - P. 321 -324.

71. Hackett L.W. Recent findings bearing on the epidemiology of malaria in Europe // Med. Parasitol. and Paras. Dis. 1935. - Vol. 4, № 1 - 2. - P. 38 - 44.

72. Hackett L.W., Missirolli A. The varieties of Anopheles maculipennis and their relation to the distribution of malaria in Europe // Rivista di Malariologia. 1935. -Vol. 14.-P. 1-67.

73. Hall H.G. Parental analysis of introgressive hybridization between African and European honeybees using DNA RFLPs // Genetics. 1990. - Vol. 125. - P. 611 -621.

74. Harbach R.E., Harrison B.A., Gad A.M. Culex {Culex) molestus Forskäl (Diptera: Cilicidae): neotype designation, description, variation, and taxonomic status // Proc. Entomol. Soc. Wash. 1984. - Vol. 86, № 3. - P. 521 - 542.

75. Hayes C.G. West Nile virus: Uganda, 1937, to New York City, 1999 // Ann. N.Y. Acad. Sei. 2001. - Vol. 951. - P. 25 - 37.

76. Haymer D.S., Mclnnis D.O., Arcangeli L. Genetic variation between strains of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata, detected by DNA fingerprinting // Genome. 1992. - Vol. 35. - P. 528 - 533.

77. Hertig M. The rickettsia, Wolbachia pipientis (gen. et sp.n.) and associated inclusions of the mosquito, Culex pipiens II Parasitology. 1936. - Vol. 28. - P. 453 -486.

78. Jaenson T.G.T. Overwintering of Culex mosquitoes in Sweden and their potential as reservoirs of human pathogens // Med. Vet. Ent. 1987. - Vol. 1, № 2. -P. 151-156.

79. Jobling B. On two subspecies of Culex pipiens L. (Diptera) // Trans. R. Ent. Soc. Lond. 1938. - Vol. 87. - P. 193 - 216.

80. Jobling B. The development of mosquitoes in complete darkness // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1937. - Vol. 30. - P. 467 - 474.

81. Jupp P.G. Culex {Culex) pipiens and Culex {Cx.) torrentium (Diptera: Culicidae) in England: notes on their taxonomy and biology // Mosquito Systematics. 1979. - Vol. 11, № 2. - P. 121 - 126.

82. Kambhampati S., Black W.C. IV, Rai K.S. Random amplified polymorphic DNA of mosquito species and populations (Diptera: Cilicidae): techniques, statistical analysis, and applications // J. Med. Entomol. 1992. - Vol. 29. - P. 939 - 945.

83. Knight K.L. A review of the Culex pipiens complex in the Mediterranean subregion (Diptera, Culicidae) // Trans. R. Ent. Soc. Lond. 1951. - Vol. 102, № 7. -P. 354-364.

84. Knight K.L. Supplement to a catalog of the mosquitoes of the world (Diptera, Culicidae). College Park, 1978. - 107 p.

85. Koekemoer L. L., Kamau L., Hunt R. H., Coetzee M. A cocktail polymerase chain reaction assay to identify members of the Anopheles funestus (Diptera: Culicidae) group // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2002. - Vol. 6, № 6. - P. 804 - 811.

86. Kondo R., Satta Y., Matsuura E.T. et al. Incomplete maternal transmission of mitochondrial DNA in Drosophila II Genetics. 1990. - Vol. 126. - P. 657 - 663.

87. Krzywinski J., Besansky N. Molecular systematics of Anopheles: from subgenera to subpopulations // Annu. Rev. Entomol. 2003. - Vol. 48. - P. 111139.

88. Ma M., Beier J.C., Petrarca V., Gwadz R. W. et al. Differentiation of Anopheles gambiae and An. arabiensis (Diptera: Culicidae) by ELISA using immunoaffinity-purified antibodies to vitellogenin // J. Med. Entomol. 1990. - Vol. 27. - P. 564 -569.

89. MacGregor M.E. The occurrence of Roubaud's "Race autogene" in a German strain of Culex pipiens in England: with notes on rearing and bionomics // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1932. - Vol. 26. - P. 307 - 314.

90. Magnin M., Pasteur N., Raymond M. Multiple incompatibilities within populations of Culex pipiens L. in southern France // Genetica. 1987. - Vol. 74. -P. 125- 130.

91. Manguin S., Kengne P., Sonnier L. et al. SCAR markers and multiplex PCR -based identification of isomorphic species in the Anopheles dirus complex in Southeast Asia // Medical and Veterinary Entomology. 2002. - Vol. 16. - P. 46 -54.

92. Marshall J.F. The British mosquitoes. London, 1938. - 341 p.

93. Marshall J.F., Staley J. Some notes regarding the morphological and biological differentiation of Culex pipiens Linnaeus and Culex molestus Forskäl (Diptera, Culicidae) // Proc. R. Ent. Soc. Lond. 1937. - Ser. A, vol. 12, p. 1 - 2. - P. 17 - 26.

94. Mattingly P.F. Culex {Culex) torrentium Martini, a mosquito new in Great Britain//Nature.-1951a.-Vol. 168.-P. 172.

95. Mattingly P.F. The Culex pipiens complex. Introduction // Trans. R. Ent. Soc. Lond. 19516.-Vol. 102, №7. -P. 331 -342.

96. McLain D.K., Collins F.H. Structure of rDNA in the mosquito Anopheles gambiae and rDNA sequence variation within and between species of the An. gambiae complex // Heredity. 1989. - Vol. 62. - P. 233 - 242.

97. Miles S.J. Laboratory evidence for mate recognition between behaviour in a member of the Culex pipiens complex (Diptera: Culicidae) // Aust. J. Zool. 1977. -Vol. 25.-P. 491 -498.

98. Miles S.J., Paterson H.E. Protein variation and systematics in the Culex pipiens group of species // Mosquito Systematics. 1979. - Vol. 11, № 3. - P. 187 - 192.

99. Miller B.R., Crabtree M.B., Savage H.M. Phylogeny of fourteen Culex mosquito species, including the Culex pipiens complex, inferred from the internal transcribed spacers of ribosomal DNA // Insect Mol. Biol. 1996. - Vol. 5, № 2. - P. 93- 107.

100. Mitchell S.E., Narang S.K., Cockburn A.F. et al. Mitochondrial and ribosomal DNA variation among members of the Anopheles quadrimaculatus species complex// Genome. 1992. - Vol. 35. - P. 939 - 950.

101. Munstermann L.E., Conn J.E. Systematics of mosquito disease vectors (Diptera: Culicidae): Impact of molecular biology and cladistic analysis // Annu. Rev. Entomol. 1997. - Vol. 42. - P. 351 - 369.

102. Narang S.K., Kaiser P.E., Seawright J.A. Dichotomous electrophoretic key for the identification of sibling species A, B and C of the Anopheles quadrimaculatus (Say) species complex (Diptera: Culicidae) // J. Med. Entomol. 1989a. - Vol. 26. -P. 94-99.

103. Narang S.K., Kaiser P.E., Seawright J.A. Identification of species D, a new member of the Anopheles quadrimaculatus species complex: a biochemical key // J. Am. Mosq. Control Assoc. 19896. - Vol. 5. - P. 317 - 324.

104. Natvig L.R. Contributions to the knowledge of the Danish and Fennoscandian mosquitoes Culicini. Oslo: A.W. Broggers Boktrykkeri, 1948. - 567 p.

105. Nazni W.A., Lee H.L., Mori A. Restriction fragment patterns of DNA in Culex pipiens complex // Tropical Biomedicine. 1997. - Vol. 14. - P. 125 - 127.

106. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. 1978. - Vol. 89. - P. 583 - 590.

107. Onyeka J.O.A. The taxonomic value of pre alar scales in the identification of Culex {Culex) pipiens L. and Culex (Cx.) torrentium Martini (Diptera: Culicidae) // Mosquito Systematica - 1982.-Vol. 14.-P. 41 -51.

108. Otranto D., Traversa D., Guida B. et al. Molecular characterization of the mitochondrial cytochrome oxidase I gene of Oesteridae species causing obligate myiasis // Medical and Veterinary Entomology. 2003. - Vol. 17. - P. 307 - 315.

109. Page R. D. M. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers // Computer Applications in the Biosciences. 1996. - Vol. 12. -P. 357-358.

110. Paran I., Michelmore R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce // Theoretical and Applied Genetics. -1993.-Vol. 85.-P. 985-993.

111. Paskewitz S.M., Collins F.H. Use of polymerase chain reaction to identify mosquito species of the Anopheles gambiae complex // Med. Vet. Entomol. 1990. -Vol. 4.-P. 367-373.

112. Paskewitz S.M., Wesson D.M., Collins F.H. The internal transcribed spacers of ribosomal DNA in five members of the Anopheles gambiae species complex // Insect Mol. Biol. 1993. - Vol. 2, № 4. - P. 247 - 257.

113. Platonov A.E., Shipulin G.A., Shipulina O.Y. et al. Outbreak of West Nile virus infection, Volgograd Region, Russia, 1999 // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7.-P. 128- 132.

114. Porter C.H., Collins F.H. Species diagnostic differences in a ribosomal DNA internal transcribed spacer from the sibling species Anopheles freeborni and Anopheles hermsi (Diptera: Culicidae) // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1991. - Vol. 45. -P. 271 -279.

115. Power E.G.M. RAPD typing in microbiology a technical review // J. of Hospital Infection. - 1996. - Vol. 34. - P. 247 - 265.

116. Proft J., Maier W.A., Kampen H. Identification of six sibling species of the Anopheles maculipennis complex (Diptera: Culicidae) by a polymerase chain reaction assay // Parasitol. Res. 1999. - Vol. 85. - P. 837 - 843.

117. Ribeiro H., Ramos H.C., Capela R.A., Pires C.A. Research on the mosquitoes of Portugal (Diptera, Culicidae). Ill Further five new mosquito records // Sep. Garcia de Orta. - 1977. - Vol. 6. - P. 51 - 60.

118. Rice W.R., Hostert E.E. Laboratory experiments on speciation: what have we learned in 40 years?//Evolution. 1993.-Vol. 47.-P. 1637- 1653.

119. Schaffner F. A revised checklist of the French Culicidae // European Mosq. Bull.- 1998.-№2.-P. 1-9.

120. Service M.W. The taxonomy and biology of two sympatric sibling species of Culex, C. pipiens and C. torrentium (Diptera: Culicidae) // J. Zool. 1968. - Vol. 156. - P. 313 - 323.

121. Shute P.G. Culex molestus // Trans. R. Ent. Soc. Lond. 1951. - Vol. 102, № 7.-P. 380-382.

122. Smith J.L., Fonseca D.M. Rapid assays for identification of members of the Culex (iCulex) pipiens complex, their hybrids, and other sibling species (Diptera: Culicidae) // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2004. - Vol. 70, № 4. - P. 339 - 345.

123. Strong K.L., Mahon R.J. Genetic variation in the Old World screw-worm fly, Chrysomya bezziana (Diptera: Calliphoridae) // Bulletin of Entomological Research. -1991.-Vol. 81.-P. 491 -496.

124. Tamura K. The rate and pattern of nucleotide substitution in Drosophila mitochondrial DNA // Mol. Biol. Evol. 1992. - Vol. 9. - P. 814 - 825.

125. Tate P., Vincent M. The biology of autogenous and anautogenous races of Culex pipiens L. (Diptera: Culicidae) // Parasitology. 1936. - Vol. 28. - P. 115145.

126. Tsai T.F., Popovici F., Cernescu C. et al. An epidemic of West Nile encephalitis in southeastern Romania // Lancet. 1998. - Vol. 352. - P. 767 - 771.

127. Urbanelli S., Silvestrini F., Sabatinelli G. et al. Characterization of the Culex pipiens complex (Diptera: Culicidae) in Madagascar // J. Med. Entomol. 1995. -Vol. 32.-P. 778-786.

128. Wainhouse D., Jukes M.R. Geographic variation within populations of Panolis flammea (Lepidoptera: Noctuidae) in Britain // Bulletin of Entomological Research. -1997.-Vol. 87.-P. 95-99.

129. Walton C., Shape R.G., Pritchard S.J. et al. Molecular identification of mosquito species // Biological J. of the Linn. Soc. 1999. - Vol. 68. - P. 241 - 256.

130. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucl. Acids. Res. 1990. - Vol. 18. - P. 7213 - 7218.

131. Werren J.H., Zhang W., Guo L.R. Evolution and phylogeny of Wolbachia: reproductive parasites of arthropods // Proc. R. Soc. Lond. 1995. - Ser. B, vol. 261. -P. 55-71.

132. Wesson D.M., McLain D.K., Oliver J.H. et al. Investigation of the validity of species status of Ixodes dammini (Acari: Ixodidae) using rDNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993.-Vol. 90.-P. 10221 - 10225.

133. West D.F., Black W.C. Breeding structure of three snow pool Aedes mosquito species in northern Colorado//Heredity. 1998. - Vol. 81.-P. 371 -380.

134. Wilkerson R.C., Parsons T.J., Albright D.G. et al. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers readily distinguish cryptic mosquito species (Diptera: Culicidae: Anopheles) II Insect Molecular Biology. 1993. - Vol.1, № 4. -P. 205-211.

135. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids. Res. 1990. - Vol. 18. - P. 6531 - 6535.

136. Yasothornsrikul S., Panyim S., Rosenberg R. Diagnostic restriction fragment patterns of DNA from the isomorphic species of Anopheles dirus II Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 1988. - Vol. 19. - P. 703 - 708.

137. Yen J.H., Barr A.R. The etiological agent of cytoplasmic incompatibility in Culexpipiens II J. Invertebr. Pathol. 1973. - Vol. 22. - P. 242 - 250.