«Молекулярное клонирование и функциональная характеристика нитратных транспортеров семейств NPF и NRT2 галофита Suaeda altissima (L.) Pall.: SaNPF6.3, SaNRT2.1, SaNRT2.5» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Храмов Дмитрий Евгеньевич

• Храмов Дмитрий Евгеньевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Храмов Дмитрий Евгеньевич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика семейства NPF

1.2. Функции белков семейства NPF у Arabidopsis thaliana

1.2.1. Участие белков NPF в транспорте нитрата

1.2.2. Участие белка AtNPF6.3 в транспорте других субстратов

1.2.3. Роль белка AtNPF6.3 в ответе на абиотические стрессы

1.2.4. Сигнальная роль трансцептора AtNPF6.3 в ответе на нитрат

1.3. Ортологи белков клады NPF6 у других видов растений

1.4. Высокоаффинные транспортеры нитрата семейства NRT2

1.4.1. Общая характеристика транспортеров семейства NRT2 A. thaliana

1.4.2. Участие белков AtNRT2.4 и AtNRT2.5 в ремобилизации нитрата при азотном голодании

1.4.3. Белок AtNRT2.1 и регуляция архитектуры корневой системы

1.4.4. Роль света и углеродного метаболизма в высокоаффинном поглощении нитрата

1.4.5. Участие белка AtNRT2.1 в системном сигнальном ответе на нитрат

1.4.6. Зависимое от катионов натрия поглощение нитрата у морского растения Zostera marina

1.4.7. Регуляция активности транспортеров семейства NRT2

1.4.8. Роль белков семейства NAR2 в функционировании высокоаффинной системы поглощения нитрата

1.4.9. Фосфорилирование аминокислотных остатков белков NRT2

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования и условия культивирования

2.1.1. Растения, использованные в работе

2.1.2. Бактериальные и дрожжевые штаммы, использованные в работе

2.2. Определение концентрации анионов нитрата и хлорида в органах растений

S. altissima

2.3. Выделение суммарной РНК из органов S. altissima и проведение обратной транскрипции

2.4. Определение относительного количества транскриптов генов SaNPF6.3, SaNRT2.1, SaNRT2.5 и SaNAR2.2 в органах S. altissima

2.5. Получение и трансформация ультракомпетентных клеток E. coli

2.6. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli

2.7. Определение последовательности 5' - и 3'-концевых фрагментов генов SaNPF6.3,

SaNRT2.1, SaNRT2.5 и SaNAR2

2.8. Клонирование полноразмерных кодирующих областей генов SaNPF6.3, SaNRT2.1, SaNRT2.5 и SaNAR2

2.9. Клонирование полноразмерной кодирующей области гена AtNPF6

2.10. Трансформация Agrobacterium tumefaciens

2.11. Бимолекулярная флуоресцентная комплементация (ЫБС) с участием белков SaNPF6.3, SaNRT2.1, SaNRT2.5 и SaNAR2

2.12. Трансформация дрожжей Hansenula polymorpha

2.13. Выделение геномной ДНК из клеток дрожжей H. polymorpha

2.14. Получение нокаут-мутанта дрожжей H. polymorpha по гену YNT1

2.15. Трансформация мутанта ауМ1 H. polymorpha и комплементационный анализ на селективных средах

2.16. Измерение поглощения нитрата клетками трансформантов ауМ1

H. polymorpha

2.17. Определение локализации белков 8аКЯТ2.5 и БаКЛК2.2 в клетках

H. polymorpha

2.18. Биоинформатический и статистический анализ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Клонирование и анализ т siMco полноразмерных кодирующих областей генов SaNPF6.3, SaNRT2.1, SaNRT2.5 и SaNAR2

3.2. Анализ экспрессии генов SaNPF6.3, SaNRT2.1, SaNRT2.5 и SaNAR2.2 в органах растений & altissima, выращенных в условиях различного ионного состава среды

3.3. Анализ содержания анионов нитрата и хлорида в органах растений & altissima

3.4. Анализ взаимодействия белков БаКЯТ2.1 и БаККТ2.5 с белком БаКЛК2

3.5. Комплементационный анализ в клетках мутанта ауМ1 дрожжей Hansenula polymorpha

3.6. Анализ поглощения нитрата из среды клетками трансформантов ауМ1

H. polymorpha

3.7. Исследование локализации белков БаКЯТ2.5 и БаКЛК2.2 в клетках

H. polymorpha

Заключение

Выводы

Список публикаций по теме диссертации

Список цитируемой литературы

Приложение

Список сокращений

BiFC - Bimolecular Fluorescence Complementation BTP - бис-трис пропан CFU - Colony Forming Units DMSO - диметилсульфоксид

LB - Lysogeny Broth (среда для выращивания бактерий)

mCherry - красный флуоресцентный белок

MES - 2-(#-морфолино)-этансульфоновая кислота

mGFP - зеленый флуоресцентный белок

NAR2 - Nitrate Assimilation Related Protein

NPF - NRT1/ PTR Family, семейство низко- или двуаффинных переносчиков NRT2 - Nitrate Transporter 2, семейство высокоаффинных транспортеров нитрата OD600 - оптическая плотность при 600 нм ORF - Open Reading Frame PEG - полиэтиленгликоль

PIPES - 1,4-пиперазиндиэтансульфоновая кислота

SD - synthetic dropout (селективная среда для выращивания ауксотрофных штаммов дрожжей)

SDS - додецилсульфат натрия

SLAC1 - Slow Anion Channel-Associated

SLAH3 - SLAC1 Homologue

YPD - yeast extract/peptone/dextrose (богатая среда для выращивания дрожжей) Трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Молекулярное клонирование и функциональная характеристика нитратных транспортеров семейств NPF и NRT2 галофита Suaeda altissima (L.) Pall.: SaNPF6.3, SaNRT2.1, SaNRT2.5»»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. В связи с глобальными изменениями климата и усиливающейся аридизацией увеличивается площадь земель, подвергнутых засолению. Накапливающиеся в почвах в высоких концентрациях ионы натрия и хлорида оказывают негативное влияние на рост растений и продуктивность сельскохозяйственных культур. Это приводит к существенному снижению урожая на почвах с высокой соленостью и огромным продовольственным потерям. Принимая во внимание рост населения Земли, становится очевидным, что засоление почв является глобальной проблемой и от ее успешного решения зависит продовольственная стабильность во многих регионах мира.

Одним из негативных эффектов высоких концентраций хлорида натрия в почве является нарушение поглощения и транспорта внутри растения элементов минерального питания. Азот является важнейшим биогенным элементом и необходим для полноценного роста и развития растений. Основными формами азота, доступными растению, являются нитрат и аммоний. Однако, в отличие от нитрата, аммоний в нейтральных и слабощелочных средах неустойчив и легко депротонируется с образованием летучего аммиака. Кроме того, аммоний в миллимолярных концентрациях оказывает токсическое воздействие на растения. Таким образом предпочтительной формой азота для растений является нитрат.

Поглощение нитрата из почв, содержащих хлорида натрия в высоких концентрациях, в значительной степени затруднено ввиду прямой конкуренции анионов нитрата и хлорида за ион-транспортирующие белки клеток корня. Понимание механизмов работы нитратных транспортеров растений и их физиологической роли в условиях высокой солености представляет собой необходимый этап в познании механизмов солеустойчивости растений и является важным шагом на пути к управлению продукционным процессом на засоленных почвах. В связи с этим, особенно актуальным является исследование нитратных транспортеров у галофитов - растений, способных осуществлять свой жизненный цикл в средах с высокой соленостью, поскольку галофиты эволюционно выработали механизмы, отвечающие за эффективное поглощение нитрата из сред с высокими концентрациями хлорид-ионов.

На молекулярном уровне белки четырех семейств отвечают за поглощение нитрата, его перераспределение между различными органами растения и запасание в вакуолях: (1) NPF (NRT1/PTR - Nitrate Transporter 1/Peptide Transporter Family), (2) NRT2 (Nitrate Transporter 2), (3) CLC (Chloride Channel) и (4) SLAC/SLAH (Slow Anion Channel-Associated Homologue). Переносчики семейств NPF и NRT2 вносят основной вклад в поглощение нитрата из внешней среды и осуществляют транспорт нитрата в симпорте с протонами. Для

проявления нитрат-транспортирующей активности многим белкам семейства NRT2 требуется взаимодействие с белком-активатором из семейства NAR2.

Степень разработанности темы. В настоящее время активно изучают механизмы поглощения и дальнего транспорта нитрата в растении. Основные компоненты системы поглощения нитрата - белки семейств NPF и NRT2 - обнаружены у многих видов растений. Для некоторых видов функционально охарактеризованы отдельные транспортеры, принадлежащие семействам NPF и NRT2. Помимо модельного растения A. thaliana (Filleur and Daniel-Vedele, 1999; Léran et al., 2014; Tsay et al., 1993; Zhuo et al., 1999) функции этих белков исследованы у ряда видов, имеющих сельскохозяйственное значение, таких как Oryza sativa, Hordeum vulgare, Zea mays и некоторых других (B. Guo et al., 2020; Jia et al., 2023; Longo et al., 2018; Trueman et al., 1996; Wen et al., 2017). Однако, в подавляющем большинстве случаев функциональная характеристика нитратных транспортеров выполнена на гликофитах, которые не отличаются высокой солеустойчивостью. Аналогичные работы на галофитах практически отсутствуют.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является исследование свойств нитратных транспортеров семейств NPF, NRT2 и NAR2 эугалофита Suaeda altissima (L.) Pall. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Идентифицировать и клонировать последовательности, кодирующие белки семейств NPF, NRT2 и NAR2 S. altissima.

2) Определить изменения в экспрессии генов NPF, NRT2 и NAR2 в органах S. altissima в зависимости от концентраций нитрата и хлорида натрия в среде.

3) Исследовать взаимодействие белков NRT2 с белком-активатором семейства NAR2 S. altissima.

4) Получить нокаут-мутант дрожжей Hansenula polymorpha по гену единственного в этом организме нитратного транспортера Ynt1.

5) Исследовать транспортную активность белков семейств NPF и NRT2 эугалофита S. altissima в гетерологичной системе экспрессии на основе мутанта Ayntl H. polymorpha.

Научная новизна. Впервые у экстремального эугалофита S. altissima были идентифицированы и клонированы полноразмерные кодирующие последовательности генов нитратных транспортеров SaNPF6.3, SaNRT2.1, SaNRT2.5 и регуляторного белка SaNAR2.2. Для всех исследуемых генов были показаны органоспецифичные изменения транскрипции в зависимости от концентрации нитрата и хлорида натрия в среде. Показано, что белки SaNRT2.1 и SaNRT2.5 in vivo непосредственно взаимодействуют с белком SaNAR2.2. Используя полученный в работе нокаут-мутант дрожжей H. polymorpha по гену

собственного нитратного транспортера Yntl, исследована нитрат-транспортирующая активность белка SaNPF6.3.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты являются научным заделом для дальнейшего исследования механизмов транспорта нитрата у галофитов и выявления их специфических особенностей, определяющих высокую эффективность поглощения нитрата из сильно засоленных почв. Клонированные гены нитратных транспортеров галофита могут быть использованы в генной инженерии для улучшения свойств сельскохозяйственно-значимых культурных растений, а именно повышения эффективности поглощения и использования последними почвенного нитрата.

Методология и методы исследования. В данной работе применяли молекулярно-биологические методы для клонирования исследуемых генов и оценки уровня их транскрипции. Анализ клонированных последовательностей проводили, используя методы биоинформатики. Для определения концентрации ионов в тканях растений и измерения поглощения нитрата трансформантами дрожжей применяли методы потенциометрии и спектрофотометрии. Для получения трансгенных штаммов дрожжей, транзиентной экспрессии в листьях табака и детекции флуоресцентных сигналов отдельных клеток использовали генно-инженерные методы и лазерную сканирующую конфокальную микроскопию. Анализ полученных данных проводили с использованием статистических методов.

Положения, выносимые на защиту.

1) Клонированные из эугалофита S. altissima нуклеотидные последовательности SaNPF6.3, SaNRT2.1, SaNRT2.5 и SaNAR2.2 кодируют белки, гомологичные соответствующим белкам A. thaliana, и относящиеся к семействам NPF, NRT2 и NAR2.

2) Все исследуемые в данной работе гены S. altissima демонстрируют зависимость уровня их транскрипции от концентрации нитрата и NaCl в среде.

3) Белки SaNRT2.1 и SaNRT2.5 in vivo непосредственно взаимодействуют с белком SaNAR2.2.

4) Экспрессия гена SaNPF6.3 в гетерологичной системе на основе нокаут-мутанта Ayntl дрожжей H. polymorpha приводит к поглощению нитрата дрожжевыми клетками и восстановлению их роста на селективной среде, содержащей нитрат в качестве единственного источника азота, что свидетельствует о нитрат-транспортирующей активности белка SaNPF6.3.

5) Экспрессии генов 8аЫЯТ2.1, 8аЫЯТ2.5 и 8аЫЛЯ2.2 в клетках нокаут-мутанта АуЫ1 дрожжей Н. ро1утотрЬа недостаточно для эффективного поглощения нитрата, что может объясняться внутриклеточной локализацией этих белков в дрожжевых клетках и необходимостью дополнительных посттрансляционных модификаций. Степень достоверности и апробация результатов. Все экспериментальные данные были получены как минимум в 3-4 биологических и 3-4 аналитических повторностях и подвергнуты статистическому анализу.

По теме диссертационной работы опубликовано 5 статей, все 5 публикаций - в международных рецензируемых научных изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Результаты работы были представлены на следующих научных конференциях и семинарах: X Съезд Общества физиологов растений России «Биология растений в эпоху глобальных изменений климата» (18-23 сентября 2023 года, г. Уфа), Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2024», секция «биология», подсекция «физиология растений» (12-26 апреля 2024 года, г. Москва), Межинститутский научный семинар ИФР РАН «Актуальные проблемы физиологии, молекулярной биологии и биотехнологии растений» (4 апреля 2024 года, г. Москва).

Личный вклад автора в исследование. Автор работы непосредственно участвовал в планировании и проведении всех экспериментов, обсуждении и написании научных статей, а также самостоятельно анализировал полученные данные. Все экспериментальные результаты получены лично автором или при его активном участии.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 110 страницах машинописного текста и включают 30 рисунков и 11 таблиц. Текст диссертационной работы состоит из следующих разделов: «введение», «обзор литературы», «объекты и методы исследования», «результаты и обсуждение», «заключение», «выводы», «список литературы» и «приложение». Список цитируемой литературы включает 149 источников, все на иностранном языке.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общая характеристика семейства NPF

Транспортные белки, относящиеся к семейству NPF, играют важную роль в поглощении нитрата из почвенного раствора, перераспределении этого аниона между разными органами и тканями растений, а также в рецепции нитрата как сигнальной молекулы. В секвенированных геномах различных видов высших растений идентифицировано от 20 до 139 членов этого семейства (Leran et al., 2014b; Longo et al., 2018). Семейство NPF в свою очередь входит в состав суперсемейства вторично-активных транспортеров MFS (Major Facilitator Superfamily), представители которого осуществляют транспорт различных соединений (сахаров, элементов минерального питания, вторичных метаболитов) в симпорте с протоном (Pao et al., 1998). К семейству NPF относятся не только транспортеры нитрата, но также и переносчики, отвечающие за трансмембранный перенос аминокислот, ди- и трипептидов, глюкозинолатов, дикарбоновых кислот и фитогормонов (гиббереллинов, ауксинов и АБК) (O'Brien et al., 2016; Corratge-Faillie and Lacombe, 2017; Kanstrup and Nour-Eldin, 2022;).

Филогенетический анализ белков семейства NPF из различных видов как однодольных, так и двудольных растений, показал, что это семейство делится на восемь различных клад (Leran et al., 2014b). Первые обнаруженные и наиболее хорошо изученные на молекулярном уровне белки семейства NPF относятся к кладе NPF6 (Wen and Kaiser, 2018). Предполагается, что транспортеры этой клады вносят основной вклад в поглощение нитрата и его перераспределение внутри растения.

1.2. Функции белков семейства NPF у Arabidopsis thaliana 1.2.1. Участие белков NPF в транспорте нитрата

Наиболее хорошо исследованный представитель транспортеров нитрата семейства NPF у Arabidopsis thaliana, AtNPF6.3, изначально был обнаружен при скрининге коллекции мутантов, полученных путем интеграции T-ДНК, по их устойчивости к хлорату, который является токсичным аналогом нитрата (Tsay et al., 1993). Впоследствии было показано, что AtNPF6.3 локализован в плазмалемме эпидермальных клеток корня, проводящих тканей и замыкающих клеток устьиц, что согласуется с его участием в поглощении нитрата и в перераспределении этого аниона между корневой системой и побегом (Huang N.-C. et al., 1996; Leran et al., 2013). Кроме того, было обнаружено, что AtNPF6.3 играет ведущую роль в транспорте нитрата, поскольку вклад AtNPF6.3 в поглощение этого аниона составляет от

10 до 80 % от общего количества поглощенного нитрата в зависимости от его концентрации в почвенном растворе (Huang N. C. et al., 1996; Liu K.-H. et al., 1999; Ye et al., 2019).

Определение трехмерной структуры белка AtNPF6.3 в 2014 г позволило предложить модель транспортного механизма, с помощью которого AtNPF6.3 осуществляет симпорт нитрата с протоном со стехиометрией 2 Н+/1 NO3" (Parker and Newstead, 2014; Sun et al., 2014). В основе этого механизма лежит последовательное переключение между несколькими информационными состояниями белка, в которых нитрат-связывающий аминокислотный остаток His356 ориентирован либо во внеклеточную среду, либо в цитозоль (рис. 1). В ходе транспорта нитрата через канал внутри белка AtNPF6.3, на пути аниона находятся несколько сайтов, играющих важную роль в этом процессе. Эти сайты, расположенные по направлению от внешней стороны мембраны к внутренней, включают консервативный ExxER мотив, аминокислотный остаток His356 и пару остатков K164 и E476. На первом этапе происходит протонирование ExxER мотива и остатка His356 с участием двух протонов из внешней среды. На этой стадии остатки K164 и E476 образуют солевой мостик, расположенный на внутренней стороне мембраны и закрывающий путь в цитозоль. Далее происходит связывание нитрата с протонированной формой His356, что приводит к конформационным перестройкам в белке, обеспечивающим разрыв солевого мостика и открывающим путь в цитозоль. На последней стадии, после диссоциации двух протонов и нитрата из комплекса с белком, происходит возвращение AtNPF6.3 в исходную конформацию.

Рис. 1. Механизм транспорта нитрата с участием белка AtNPF6.3 (по Parker & Newstead, 2014 с изменениями)(Nedelyaeva et al., 2024).

Также было установлено, что AtNPF6.3, в отличие от других транспортеров семейства NPF A. thaliana, является двуаффинным переносчиком, способным транспортировать нитрат как в режиме низкого сродства (при высокой концентрации нитрата в среде, превышающей 0,25 - 1 мМ) так и в высокоаффином режиме (при концентрации нитрата меньше, чем 0,25 - 1 мМ) (Liu K. H. and Tsay, 2003; Liu K. H. et al., 1999). Переход между двумя состояниями с разной аффинностью регулируется путем фосфорилирования специфического остатка Thr101 киназой CIPK23 (рис. 2). В дефосфорилированной форме AtNPF6.3 образует димеры с низкой структурной гибкостью полипептидных цепей и функционирует как низкоаффинный переносчик нитрата. При фосфорилировании Thr101 происходит диссоциация димера, что сопровождается увеличением структурной гибкости мономеров и повышением их сродства к нитрату. В такой форме AtNPF6.3 функционирует в высокоаффинном режиме. На такой механизм переключения между низко- и высокоаффинным состояниями указывают эксперименты с мутантной формой AtNPF6.3, содержащей замену T101D (Parker and Newstead, 2014). Эта точечная мутация локализована на трансмембранной альфа-спирали TM3 внутри

гидрофобного «кармана», образованного спиралями ТМ2 и ТМ4, и имитирует фосфорилированное производное Т101. При изучении термостабильности мутантной формы AtNPF6.3 методом кругового дихроизма, было обнаружено, что температура денатурации AtNPF6.3 с заменой Т10Ш на 9 °С ниже таковой для белка дикого типа, что указывает на большую конформационную подвижность мутантной формы.

Рис. 2. Модель переключения между низко- и высокоаффинными режимами работы транспортера AtNPF6.3 (Fang et al., 2021).

1.2.2. Участие белка AtNPF6.3 в транспорте других субстратов

Помимо нитрат-транспортирующей активности, AtNPF6.3 обладает способностью к транспорту ауксина (Krouk et я1., 2010). Это свойство определяет участие белка AtNPF6.3 в развитии боковых корней в зависимости от концентрации нитрата в почве. Когда концентрация нитрата в среде низка, AtNPF6.3 проявляет ауксин-транспортирующую активность, что в свою очередь предотвращает накопление ауксина в апикальной части бокового корня и тем самым ингибирует его удлинение. При повышении концентрации нитрата, наблюдается снижение потока ауксина, опосредуемого AtNPF6.3, что влечет за собой накопление этого фитогормона в кончике бокового корня и стимулирует его удлинение. Кроме того, было установлено, что фосфорилирование остатка Т101 в AtNPF6.3

необходимо для транспорта ауксина в условиях недостатка нитрата в среде (Bouguyon et al., 2015). Таким образом, эти наблюдения указывают на важную роль белка AtNPF6.3 в регуляции архитектуры корневой системы в зависимости от доступности нитрата.

Также было показано наличие хлорид-транспортирующей активности для белка AtNPF6.3 при низкой концентрации нитрата в среде и установлено, что поглощение хлорида, опосредуемое AtNPF6.3, ингибируется в присутствии нитрата (Wen et al., 2017). При анализе конформационной подвижности AtNPF6.3 методом FRET, не было выявлено существенных изменений в конформации белка AtNPF6.3 в процессе транспорта хлорида (Ho & Frommer, 2014). Также, по-видимому, отсутствует этап связывания хлорида с AtNPF6.3, поскольку в кристаллической структуре этого белка не удалось идентифицировать хлорид-ионы несмотря на то, что кристаллизация проводилась в хлорид содержащей среде (Sun et al., 2014). Эти данные свидетельствуют в пользу того, что транспорт хлорида через AtNPF6.3, в отличие от транспорта нитрата, может осуществляться по тому же механизму, что и транспорт в ионных каналах.

1.2.3. Роль белка AtNPF6.3 в ответе на абиотические стрессы

Солевой стресс и засуха Белок AtNPF6.3 локализован не только в клетках эпидермы корня и проводящих тканей, но и в замыкающих клетках устьиц и непосредственно участвует в регуляции работы устьичного аппарата. Было обнаружено, что мутанты A. thaliana по гену AtNPF6.3 имеют меньшую устьичную апертуру, чем растения дикого типа и являются более засухоустойчивыми (Guo F. Q. et al., 2003). Следовательно, в условиях засухи может происходить ингибирование активности AtNPF6.3, что приводит к снижению притока ионов в замыкающие клетки устьиц и, учитывая электрогенность транспорта, также предотвращает деполяризацию плазматической мембраны. Это ингибирует механизм открывания устьиц, уменьшает устьичную апертуру и в итоге способствует повышению засухоустойчивости. Кроме того, существует связь между сигналом АБК и негативной регуляцией AtNPF6.3 в условиях засухи. По-видимому, эта связь осуществляется через киназы SnRK2 и CIPK23, для которых показано участие как в передаче сигнала АБК, так и в регуляция активности AtNPF6.3 (Léran et al., 2015; Su et al., 2021).

Мутанты по гену AtNPF6.3 обладают большей устойчивостью к действию хлорида натрия, чем растения дикого типа. Однако, роль AtNPF6.3 в устойчивости к повышенным концентрациям NaCl сильно зависит от того какая именно форма минерального азота доступна растениям: нитрат или аммоний. В присутствии нитрата происходит аккумуляция катионов натрия в корнях и стеблях, при этом мутанты по гену AtNPF6.3 накапливают

существенно меньше натрия, чем растения дикого типа (Álvarez-Aragón et al., 2016; Álvarez-Aragón and Rodríguez-Navarro, 2017). Эти данные указывают на участие белка AtNPF6.3 в модуляции накопления и транспорта катионов натрия, которые, возможно, играют роль противоионов для нитрата. В случае, когда единственным источником азота для растений служит аммоний, проявляется эффект гиперчувствительности к NaCl, что связано с избыточным накоплением анионов хлорида (Liu X. X. et al., 2020). Учитывая собственную хлорид-транспортирующую активность AtNPF6.3 и то, что мутанты по гену AtNPF6.3 накапливали меньше хлорида, чем растения дикого типа, при росте на среде с аммонием, можно предположить, что именно AtNPF6.3 отвечает за поглощение и аккумуляцию анионов хлорида в этих условиях. Таким образом, токсический эффект NaCl обусловлен либо катионами натрия, либо анионами хлорида, в зависимости от того нитрат или аммоний служит источником азота, соответственно.

Стресс, обусловленный присутствием тяжелых металлов Тяжелые металлы в высоких концентрациях оказывают сильное ингибирующее влияние на процессы роста и развития растений и их накопление связано с активностью белка AtNPF6.3. Было обнаружено, что мутанты по гену AtNPF6.3 накапливают меньше кадмия в корнях и стеблях и обладают большей устойчивостью к присутствию этого металла в среде, чем растения дикого типа (Mao et al., 2014). Подобный эффект нокаут-мутации в гене AtNPF6.3 наблюдали также в случае накопления цинка (Pan et al., 2020). Несмотря на то, что точные молекулярные механизмы этих эффектов остаются не известными, стоит отметить связь этих процессов с поглощением нитрата, опосредуемым AtNPF6.3.

В отличие от кадмия и цинка, накопление свинца в растениях, дефектных по гену AtNPF6.3, было выше по сравнению с растениями дикого типа (Zhu et al., 2019). В дальнейшем было установлено, что это является следствием более высокой биодоступности свинца в ризосфере в результате ее закисления корнями нокаут-мутантов. В случае растений дикого типа, напротив, не наблюдали сильного снижения рН ризосферы, что было обусловлено 2H+/1NO3- симпортом, осуществляемым AtNPF6.3.

Стресс, обусловленный дефицитом калия и железа Калий является необходимым макроэлементом и выполняет много важных функций, среди которых поддержание активности ферментов, тургора и осмотического давления. Кроме того, калий является основным противоионом для нитрата при загрузке ксилемы и участвует в обеспечении катионно-анионного баланса. Однако, несмотря на наличие

положительной корреляции в накоплении калия и нитрата, молекулярные механизмы, обеспечивающие координированное поглощение этих двух ионов изучены недостаточно. Предполагают, что эта связь обусловлена взаимодействиями транспортеров нитрата и калиевых каналов с общими регуляторными белками. Например, было показано, что калиевый канал АКТ1 может активироваться при участии кальциевых сенсоров CBL1/9 и протеинкиназы С1РК23 (Хи Й а1., 2006). Комплекс CBL9-CIPK23 также непосредственно участвует в регуляции активности AtNPF6.3 (Но е а1., 2009). При высокой концентрации калия и нитрата в среде, С1РК23 неактивна и не способна фосфорилировать белки АКТ1 и AtNPF6.3. В дефосфорилированном состоянии АКТ1 обеспечивает лишь небольшой поток калия в клетку, а AtNPF6.3 функционирует в низкоаффинном режиме поглощения нитрата. При снижении доступности калия и нитрата, происходит Са2+-зависимая активация комплекса CBL9-CIPK23 и фосфорилирование белков АКТ1 и AtNPF6.3. В результате фосфорилирования, АКТ1 усиливает поглощение калия, а AtNPF6.3 переключается на высокоаффинный транспорт нитрата (Ьее й а1., 2007; Но й а1., 2009;).

Железо является микроэлементом, необходимым для роста и развития растений. Однако, часто растения находятся в условиях дефицита железа, особенно при росте на известковых почвах. Было обнаружено, что растения, дефектные по гену ЛШР¥6.3, более устойчивы к стрессу, вызванному дефицитом железа, чем растения дикого типа. Об этом судили по менее выраженному хлорозу листьев мутантных растений (Ьш X. е! а1., 2015). Однако, как выяснилось в дальнейшем, общее содержание железа в побегах и корнях мутантов по гену ЛШР¥6.3 и растений дикого типа не отличалось (Уе е! а1., 2022). Кроме того, двойные мутанты по генам основного транспортера железа ШТ1 и ЛШР¥6.3 не отличались по общему содержанию железа от одинарного мутанта по гену 1ЯТ1, хотя хлороз листьев у двойного мутанта был менее выражен. Эти наблюдения указывают на то, что AtNPF6.3-зависимое увеличение устойчивости к дефициту железа не связано с его поглощением из внешней среды, а скорее определяется ремобилизацией железа из апопласта в побегах растений (рис. 3). Действительно, было установлено, что нокаут-мутанты по гену ЛШР¥6.3 имеют более низкий рН клеточных стенок из-за отсутствия оттока протонов через AtNPF6.3, что приводит к большей доступности апопластного железа (Уе е! а1., 2022).

Apoplast

Wild-type plant

Higher apoplastic pH

NRT1.1-null mutants

" о

Q

О о

lower apoplastic pH Ï

'Fe2+

ШШ

NRT1.1

m

ЗДЛ

^ F

▼ о

Cytosol

О

i

ot

NRT1.1

О

0

о

Рис. 3. Участие транспортера AtNPF6.3 в ремобилизации железа из апопласта (Ye et al., 2022).

Стресс, обусловленный высокими концентрациями аммония

Растения способны поглощать и использовать аммоний в качестве источника азота, но в высоких концентрациях аммоний является токсичным. Было обнаружено, что нокаут -мутанты по гену AtNPF6.3 более устойчивы к высоким концентрациям аммония, чем растения дикого типа (Hachiya et al., 2010; Hachiya and Noguchi, 2011). Однако, такой фенотип мутантов проявлялся только в отсутствие нитрата, что указывает на независимость этого фенотипа от транспортной функции AtNPF6.3. Эти данные послужили одним из доказательств существования у белка AtNPF6.3 еще одной функции, не связанной непосредственно с транспортом нитрата, а именно сигнальной функции в ответ на нитрат. Показано, что сигнальный каскад, активируемый AtNPF6.3 после связывания нитрата, контролирует экспрессию многих генов, в том числе тех, которые кодируют транспортеры нитрата, ферменты ассимиляции нитрата и аммония (Nacry et al., 2013; O'Brien et al., 2016). Таким образом, повышенная устойчивость мутантов по гену AtNPF6.3 к высоким концентрациям аммония может быть связана с более высокой активностью ключевых ферментов метаболизма аммония таких, как глутаматдегидрогеназа и глутаминоксоглутаратаминотрансфераза, по сравнению с растениями дикого типа в отсутствии нитрата (Jian et al., 2018). Эти выводы подтверждаются также данными по устойчивости к аммонию растений, которые содержат в белке AtNPF6.3 точечную мутацию P492L. Эта замена приводит к нарушению транспортной функции AtNPF6.3, но не затрагивает его сигнальную функцию (Ho et al., 2009). Оказалось, что растения, содержащие AtNPF6.3 с точечной мутацией P492L, не отличаются от дикого типа по устойчивости к

высоким концентрациям аммония, то есть наличия только сигнальной функции AtNPF6.3 достаточно для проявления симптомов токсичности аммония (Jian et al., 2018).

Иначе обстоит дело при добавлении нитрата в среду. По мере увеличения концентрации нитрата в среде, происходит неравномерное повышение устойчивости к токсическому действию аммония у растений дикого типа и нокаут-мутантов по гену AtNPF6.3 (Xiao C. et al., 2022). Сначала растения дикого типа отстают в формировании устойчивости от мутантных растений, но уже при концентрации нитрата 0,2 мМ устойчивость нокаут-мутантов и растений дикого типа совпадает. При дальнейшем увеличении концентрации нитрата можно наблюдать как растения дикого типа становятся более устойчивыми, чем нокаут-мутанты, то есть происходит обращение фенотипа нокаут-мутантов по AtNPF6.3. В данном случае, повышение устойчивости растений дикого типа связано с предотвращением избыточного закисления среды в присутствии аммония. Дело в том, что один из токсических эффектов аммония определяется снижением рН среды, так как в результате поглощения и ассимиляции аммония образуется избыток свободных протонов, накапливающихся во внешней среде. Следовательно растения дикого типа лучше справляются с закислением среды при одновременном присутствии аммония и нитрата, благодаря AtNPF6.3-зависимому 2Н+^Оз--симпорту. Интересно, что также было показано участие в этом процессе нитратного выходного канала SLAH3, который формирует комплекс с AtNPF6.3 (Xiao C. et al., 2022). Этот комплекс осуществляет циклический транспорт нитрата, сопряженный с поглощением протонов из среды и тем самым участвует в поддержании оптимального рН ризосферы (рис. 4).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Храмов Дмитрий Евгеньевич, 2025 год

Список цитируемой литературы

1) Álvarez-Aragón, R., Haro, R., Benito, B., & Rodríguez-Navarro, A. (2016). Salt intolerance in Arabidopsis: shoot and root sodium toxicity, and inhibition by sodium-plus-potassium overaccumulation. Planta, 243(1). https://doi.org/10.1007/s00425-015-2400-7

2) Álvarez-Aragón, R., & Rodríguez-Navarro, A. (2017). Nitrate-dependent shoot sodium accumulation and osmotic functions of sodium in Arabidopsis under saline conditions. Plant Journal, 91(2), 208-219. https://doi.org/10.1111/tpj.13556

3) An, G., Ebert, P.R., Mitra, A., Ha, S.B. (1989). Binary vectors. In: Gelvin, S.B., Schilperoort, R.A., Verma, D.P.S. (eds) Plant Molecular Biology Manual. Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-94-009-0951-9 3

4) Balnokin, Y. V., Kotov, A. A., Myasoedov, N. A., Khailova, G. F., Kurkova, E. B., Lun'kov, R. V., & Kotova, L. M. (2005). Involvement of long-distance Na+ transport in maintaining water potential gradient in the medium-root-leaf system of a halophyte Suaeda altissima. Russian Journal of Plant Physiology, 52(4). https://doi.org/10.1007/s11183-005-0072-z

5) Benedito, V. A., Torres-Jerez, I., Murray, J. D., Andriankaja, A., Allen, S., Kakar, K., Wandrey, M., Verdier, J., Zuber, H., Ott, T., Moreau, S., Niebel, A., Frickey, T., Weiller, G., He, J., Dai, X., Zhao, P. X., Tang, Y., & Udvardi, M. K. (2008). A gene expression atlas of the model legume Medicago truncatula. Plant Journal, 55(3). https://doi.org/10.1111/j. 1365-313X.2008.03519.x

6) Bouguyon, E., Brun, F., Meynard, D., Kubes, M., Pervent, M., Leran, S., Lacombe, B., Krouk, G., Guiderdoni, E., Zazímalová, E., Hoyerová, K., Nacry, P., & Gojon, A. (2015). Multiple mechanisms of nitrate sensing by Arabidopsis nitrate transceptor NRT1.1. Nature Plants, 1. https://doi.org/10.1038/nplants.2015.15

7) Brownlee, A. G., & Arst, H. N. (1983). Nitrate uptake in Aspergillus nidulans and involvement of the third gene of the nitrate assimilation gene cluster. Journal of Bacteriology, 155(3). https://doi.org/10.1128/jb.155.3.1138-1146.1983

8) Castaings, L., Camargo, A., Pocholle, D., Gaudon, V., Texier, Y., Boutet-Mercey, S., Taconnat, L., Renou, J. P., Daniel-Vedele, F., Fernandez, E., Meyer, C., & Krapp, A. (2009). The nodule inception-like protein 7 modulates nitrate sensing and metabolism in Arabidopsis. Plant Journal, 57(3). https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2008.03695.x

9) Chen, X., Yao, Q., Gao, X., Jiang, C., Harberd, N. P., & Fu, X. (2016). Shoot-to-root mobile transcription factor HY5 coordinates plant carbon and nitrogen acquisition. Current Biology, 26(5). https://doi.org/10.1016/_i.cub.2015.12.066

10) Chopin, F., Orsel, M., Dorbe, M. F., Chardon, F., Truong, H. N., Miller, A. J., Krapp, A., & Daniel-Vedele, F. (2007). The Arabidopsis ATNRT2.7 nitrate transporter controls nitrate content in seeds. Plant Cell, 19(5). https://doi.org/10.1105/tpc.107.050542

11) Chu, X., Li, M., Zhang, S., Fan, M., Han, C., Xiang, F., Li, G., Wang, Y., Xiang, C. Bin, Wang, J. G., & Bai, M. Y. (2021). HBI1-TCP20 interaction positively regulates the CEPs-mediated systemic nitrate acquisition. Journal of Integrative Plant Biology, 63(5). https://doi.org/10.1111/jipb.13035

12) Corratgé-Faillie, C., & Lacombe, B. (2017). Substrate (un)specificity of Arabidopsis NRT1/PTR FAMILY (NPF) proteins. Journal of experimental botany, 65(12), 3107-3113. https://doi.org/10.1093/jxb/erw499

13) Damiani, I., Drain, A., Guichard, M., Balzergue, S., Boscari, A., Boyer, J. C., Brunaud, V., Cottaz, S., Rancurel, C., Da Rocha, M., Fizames, C., Fort, S., Gaillard, I., Maillol, V., Danchin, E. G., Rouached, H., Samain, E., Su, Y. H., Thouin, J., Touraine, B., ... Sentenac, H. (2016). Nod Factor Effects on Root Hair-Specific Transcriptome of Medicago truncatula: Focus on Plasma Membrane Transport Systems and Reactive Oxygen Species Networks. Frontiers in plant science, 7, 794. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00794

14) Delhon, P., Gojon, A., Tillard, P., & Passama, L. (1996). Diurnal regulation of NO3/- uptake in soybean plants III. Implication of the Dijkshoorn-Ben Zioni model in relation with the diurnal changes in NO3/- assimilation. Journal of Experimental Botany, 47(300). https://doi.org/10.1093/jxb/47.7.885

15) Engelsberger, W. R., & Schulze, W. X. (2012). Nitrate and ammonium lead to distinct global dynamic phosphorylation patterns when resupplied to nitrogen-starved Arabidopsis seedlings. Plant Journal, 69(6). https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2011.04848.x

16) Fang, X. Z., Fang, S. Q., Ye, Z. Q., Liu, D., Zhao, K. L., & Jin, C. W. (2021). NRT1.1 Dual-Affinity Nitrate Transport/Signalling and its Roles in Plant Abiotic Stress Resistance. Frontiers in plant science, 12, 715694. https://doi.org/10.3389/fpls.2021.715694

17) Feng, H., Fan, X., Yan, M., Liu, X., Miller, A. J., & Xu, G. (2011). Multiple roles of nitrate transport accessory protein NAR2 in plants. Plant Signaling and Behavior, 6(9). https://doi.org/10.4161/psb.6.9.16377

18) Filleur, S., & Daniel-Vedele, F. (1999). Expression analysis of a high-affinity nitrate transporter isolated from Arabidopsis thaliana by differential display. Planta, 207(3). https://doi.org/10.1007/s004250050505

19) Forde B. G. (2000). Nitrate transporters in plants: structure, function and regulation. Biochimica et biophysica acta, 1465(1-2), 219-235. https://doi.org/10.1016/s0005-2736(00)00140-1

20) Galván, A., Quesada, A., & Fernández, E. (1996). Nitrate and nitrite are transported by different specific transport systems and by a bispecific transporter in Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Biological Chemistry, 271(4). https://doi.Org/10.1074/jbc.271.4.2088

21) García-Robledo, E., Corzo, A., & Papaspyrou, S. (2014). A fast and direct spectrophotometric method for the sequential determination of nitrate and nitrite at low concentrations in small volumes. Marine Chemistry, 162. https://doi.org/10.1016/_j.marchem.2014.03.002

22) Gerasimov, A. S., Zeinalov, O. A., El'darov, M. A., & Shul'ga, A. A. (2012). Biosynthesis of human p2-adrenergic receptor in methylotrophic yeast Pichia pastoris and its purification. Molecular Biology, 46(2). https://doi.org/10.1134/S0026893312020057

23) Gietz, R. D., & Woods, R. A. (2002). Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in enzymology, 350, 87-96. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(02)50957-5

24) Guan, P., Ripoll, J. J., Wang, R., Vuong, L., Bailey-Steinitz, L. J., Ye, D., & Crawford, N. M. (2017). Interacting TCP and NLP transcription factors control plant responses to nitrate availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 114(9). https://doi.org/10.1073/pnas.1615676114

25) Guo, B., Li, Y., Wang, S., Li, D., Lv, C., & Xu, R. (2020). Characterization of the Nitrate Transporter gene family and functional identification of HvNRT2.1 in barley (Hordeum vulgare L.). PLoS ONE, 15(4). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0232056

26) Guo, F. Q., Young, J., & Crawford, N. M. (2003). The nitrate transporter AtNRT1.1 (CHL1) functions in stomatal opening and contributes to drought susceptibility in Arabidopsis. Plant Cell, 15(1), 107-117. https://doi.org/10.1105/tpc.006312

27) Hachiya, T., & Noguchi, K. (2011). Mutation of NRT1.1 enhances ammonium/low pH-tolerance in Arabiopsis thaliana. Plant Signaling and Behavior, 6(5). https://doi.org/10.4161/psb.6.5.15068

28) Hachiya, T., Watanabe, C. K., Boom, C., Tholen, D., Takahara, K., Kawai-Yamada, M., Uchimiya, H., Uesono, Y., Terashima, I., & Noguchi, K. (2010). Ammonium-dependent respiratory increase is dependent on the cytochrome pathway in Arabidopsis thaliana shoots. Plant, Cell and Environment, 33(11). https://doi.org/10.1111/j.1365-3040.2010.02189.x

29) Ho, C. H., & Frommer, W. B. (2014). Fluorescent sensors for activity and regulation of the nitrate transceptor CHL1/NRT1.1 and oligopeptide transporters. ELife, 2014(3). https://doi.org/10.7554/eLife.01917

30) Ho, C. H., Lin, S. H., Hu, H. C., & Tsay, Y. F. (2009). CHL1 Functions as a Nitrate Sensor in Plants. Cell, 138(6), 1184-1194. https://doi.org/10.1016/_j.cell.2009.07.004

31) Hu, B., Jiang, Z., Wang, W., Qiu, Y., Zhang, Z., Liu, Y., Li, A., Gao, X., Liu, L., Qian, Y., Huang, X., Yu, F., Kang, S., Wang, Y., Xie, J., Cao, S., Zhang, L., Wang, Y., Xie, Q., ... Chu, C. (2019). Nitrate-NRT1.1B-SPX4 cascade integrates nitrogen and phosphorus signalling networks in plants. Nature Plants, 5(4). https://doi.org/10.1038/s41477-019-0384-1

32) Hu, B., Wang, W., Ou, S., Tang, J., Li, H., Che, R., Zhang, Z., Chai, X., Wang, H., Wang, Y., Liang, C., Liu, L., Piao, Z., Deng, Q., Deng, K., Xu, C., Liang, Y., Zhang, L., Li, L., & Chu, C. (2015). Variation in NRT1.1B contributes to nitrate-use divergence between rice subspecies. Nature Genetics, 47(7), 834-838. https://doi.org/10.1038/ng.3337

33) Huang, N. C., Chiang, C. S., Crawford, N. M., & Tsay, Y. F. (1996). CHL1 Encodes a Component of the Low-Affinity Nitrate Uptake System in Arabidopsis and Shows Cell Type-Specific Expression in Roots. Plant Cell, 8(12). https://doi.org/10.1105/tpc.8.12.2183

34) Inoue, H., Nojima, H., & Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96(1). https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90336-P

35) Ishikawa, S., Ito, Y., Sato, Y., Fukaya, Y., Takahashi, M., Morikawa, H., Ohtake, N., Ohyama, T., & Sueyoshi, K. (2009). Two-component high-affinity nitrate transport system in barley: Membrane localization, protein expression in roots and a direct protein-protein interaction. Plant Biotechnology, 26(2). https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.26.197

36) Jacquot, A., Chaput, V., Mauries, A., Li, Z., Tillard, P., Fizames, C., Bonillo, P., Bellegarde, F., Laugier, E., Santoni, V., Hem, S., Martin, A., Gojon, A., Schulze, W., & Lejay, L. (2020). NRT2.1 C-terminus phosphorylation prevents root high affinity nitrate uptake activity in Arabidopsis thaliana. New Phytologist, 228(3). https://doi.org/10.1111/nph.16710

37) Jia, L., Hu, D., Wang, J., Liang, Y., Li, F., Wang, Y., & Han, Y. (2023). Genome-Wide Identification and Functional Analysis of Nitrate Transporter Genes (NPF, NRT2 and NRT3) in Maize. International Journal of Molecular Sciences, 24(16). https://doi.org/10.3390/ijms241612941

38) Jian, S., Liao, Q., Song, H., Liu, Q., Lepo, J. E., Guan, C., Zhang, J., Ismail, A. M., & Zhang, Z. (2018). NRT1.1-related NH4+ toxicity is associated with a disturbed balance between NH4+ uptake and assimilation. Plant Physiology, 178(4), 1473-1488. https://doi.org/10.1104/pp.18.00410

39) Kanstrup, C., & Nour-Eldin, H. H. (2022). The emerging role of the nitrate and peptide transporter family: NPF in plant specialized metabolism. Current opinion in plant biology, 68, 102243. https://doi.org/10.1016/_i.pbi.2022.102243

40) Kawachi, T., Sunaga, Y., Ebato, M., Hatanaka, T., & Harada, H. (2006). Repression of nitrate uptake by replacement of Asp105 by asparagine in AtNRT3.1 in Arabidopsis thaliana L. Plant and Cell Physiology, 47(10), 1437-1441. https://doi.org/10.1093/pcp/pcl010

41) Khramov, D. E., Nedelyaeva, O. I., Konoshenkova, A. O., Volkov, V. S., & Balnokin, Y. V. (2024). Identification and selection of reference genes for analysis of gene expression by quantitative real-time PCR in the euhalophyte Suaeda altissima (L.) Pall. Communicative & Integrative Biology, 77(1). https://doi.org/10.1080/19420889.2024.2372313

42) Khramov, D. E., Rostovtseva, E. I., Matalin, D. A., Konoshenkova, A. O., Nedelyaeva, O. I., Volkov, V. S., Balnokin, Y. V., & Popova, L. G. (2024). Novel Proteins of the High-Affinity Nitrate Transporter Family NRT2, SaNRT2.1 and SaNRT2.5, from the Euhalophyte Suaeda altissima: Molecular Cloning and Expression Analysis. International Journal of Molecular Sciences, 25(11), 5648. https://doi.org/10.3390/ijms25115648

43) Kiba, T., Feria-Bourrellier, A. B., Lafouge, F., Lezhneva, L., Boutet-Mercey, S., Orsel, M., Brehaut, V., Miller, A., Daniel-Vedele, F., Sakakibara, H., & Krapp, A. (2012). The Arabidopsis nitrate transporter NRT2.4 plays a double role in roots and shoots of nitrogen-starved plants. Plant Cell, 24(1). https://doi.org/10.1105/tpc. 111.092221

44) Kiba, T., Inaba, J., Kudo, T., Ueda, N., Konishi, M., Mitsuda, N., Takiguchi, Y., Kondou, Y., Yoshizumi, T., Ohme-Takagi, M., Matsui, M., Yano, K., Yanagisawa, S., & Sakakibara, H. (2018). Repression of nitrogen starvation responses by members of the arabidopsis GARP-type transcription factor NIGT1/HRS1 subfamily. Plant Cell, 30(4). https://doi.org/10.1105/tpc. 17.00810

45) Kodama, Y., & Hu, C. D. (2010). An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques, 49(5). https://doi.org/10.2144/000113519

46) Kotur, Z., Mackenzie, N., Ramesh, S., Tyerman, S. D., Kaiser, B. N., & Glass, A. D. M. (2012). Nitrate transport capacity of the Arabidopsis thaliana NRT2 family members and their interactions with AtNAR2.1. New Phytologist, 794(3). https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.2012.04094.x

47) Krouk, G., Lacombe, B., Bielach, A., Perrine-Walker, F., Malinska, K., Mounier, E., Hoyerova, K., Tillard, P., Leon, S., Ljung, K., Zazimalova, E., Benkova, E., Nacry, P., & Gojon, A. (2010). Nitrate-regulated auxin transport by NRT1.1 defines a mechanism for nutrient sensing in plants. Developmental Cell, 78(6), 927-937. https://doi.org/10.1016/_j.devcel.2010.05.008

48) Lauter, F. R., Ninnemann, O., Bucher, M., Riesmeier, J. W., & Frommer, W. B. (1996). Preferential expression of an ammonium transporter and of two putative nitrate transporters in root hairs of tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(15), 8139-8144. https://doi.org/10.1073/pnas.93.15.8139

49) Lee, S. C., Lan, W. Z., Kim, B. G., Li, L., Cheong, Y. H., Pandey, G. K., Lu, G., Buchanan, B. B., & Luan, S. (2007). A protein phosphorylation/dephosphorylation network regulates a plant potassium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(40). https://doi.org/10.1073/pnas.0707912104

50) Lejay, L., Tillard, P., Lepetit, M., Olive, F. D., Filleur, S., Daniel-Vedele, F., & Gojon, A. (1999). Molecular and functional regulation of two NO3/- uptake systems by N- and C-status of Arabidopsis plants. Plant Journal, 18(5), 509-519. https://doi.org/10.1046/U365-313X.1999.00480.x

51) Lejay, L., Wirth, J., Pervent, M., Cross, J. M. F., Tillard, P., & Gojon, A. (2008). Oxidative pentose phosphate pathway-dependent sugar sensing as a mechanism for regulation of root ion transporters by photosynthesis. Plant Physiology, 146(4). https://doi.org/10.1104/pp.107.114710

52) Leran, S., Edel, K. H., Pervent, M., Hashimoto, K., Corratge-Faillie, C., Offenborn, J. N., Tillard, P., Gojon, A., Kudla, J., & Lacombe, B. (2015). Nitrate sensing and uptake in Arabidopsis are enhanced by ABI2, a phosphatase inactivated by the stress hormone abscisic acid. Science Signaling, 8(375). https://doi.org/10.1126/scisignal.aaa4829

53) Leran, S., Munos, S., Brachet, C., Tillard, P., Gojon, A., & Lacombe, B. (2013). Arabidopsis NRT1.1 is a bidirectional transporter involved in root-to-shoot nitrate translocation. Molecular plant, 6(6), 1984-1987. https://doi.org/10.1093/mp/sst068

54) Leran, S., Varala, K., Boyer, J. C., Chiurazzi, M., Crawford, N., Daniel-Vedele, F., David, L., Dickstein, R., Fernandez, E., Forde, B., Gassmann, W., Geiger, D., Gojon, A., Gong, J. M., Halkier, B. A., Harris, J. M., Hedrich, R., Limami, A. M., Rentsch, D., ... Lacombe, B. (2014). A unified nomenclature of nitrate transporter 1/peptide transporter family members in plants. Trends in Plant Science, 19(1), 5-9. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2013.08.008

55) Lezhneva, L., Kiba, T., Feria-Bourrellier, A. B., Lafouge, F., Boutet-Mercey, S., Zoufan, P., Sakakibara, H., Daniel-Vedele, F., & Krapp, A. (2014). The Arabidopsis nitrate transporter NRT2.5 plays a role in nitrate acquisition and remobilization in nitrogen-starved plants. Plant Journal, 80(2). https://doi.org/10.1111/tpj.12626

56) Li, W., Wang, Y., Okamoto, M., Crawford, N. M., Siddiqi, M. Y., & Glass, A. D. M. (2007). Dissection of the AtNRT2.1: AtNRT2.2 inducible high-affinity nitrate transporter gene cluster. Plant Physiology, 143(1). https://doi.org/10.1104/pp.106.091223

57) Li, Z., Wu, X. N., Jacquot, A., Chaput, V., Adamo, M., Neuhäuser, B., Straub, T., Lejay, L., & Schulze, W. X. (2024). Phosphoregulation in the N-terminus of NRT2.1 affects nitrate uptake by controlling the interaction of NRT2.1 with NAR2.1 and kinase HPCAL1 in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany, 75(7). https://doi.org/10.1093/jxb/erad490

58) Liu, F., Xu, Y., Chang, K., Li, S., Liu, Z., Qi, S., Jia, J., Zhang, M., Crawford, N. M., & Wang, Y. (2019). The long noncoding RNA T5120 regulates nitrate response and assimilation in Arabidopsis. New Phytologist, 224(1), 117-131. https://doi.org/10.1111/nph.16038

59) Liu, G., Rui, L., Yang, Y., Liu, R., Li, H., Ye, F., You, C., & Zhang, S. (2023). Identification and Functional Characterization of MdNRT1.1 in Nitrogen Utilization and Abiotic Stress Tolerance in Malus domestica. International Journal of Molecular Sciences, 24(11). https://doi.org/10.3390/ijms24119291

60) Liu, K. H., Niu, Y., Konishi, M., Wu, Y., Du, H., Sun Chung, H., Li, L., Boudsocq, M., McCormack, M., Maekawa, S., Ishida, T., Zhang, C., Shokat, K., Yanagisawa, S., & Sheen, J. (2017). Discovery of nitrate-CPK-NLP signalling in central nutrient-growth networks. Nature, 545(7654). https://doi.org/10.1038/nature22077

61) Liu, K. H., & Tsay, Y. F. (2003). Switching between the two action modes of the dual-affinity nitrate transporter CHL1 by phosphorylation. EMBO Journal, 22(5), 1005-1013. https://doi.org/10.1093/emboj/cdg118

62) Liu, K. H., Huang, C. Y., & Tsay, Y. F. (1999). CHL1 is a dual-affinity nitrate transporter of Arabidopsis involved in multiple phases of nitrate uptake. The Plant cell, 11(5), 865-874. https://doi.org/10.1105/tpc. 11.5.865

63) Liu, X., Cui, H., Li, A., Zhang, M., & Teng, Y. (2015). The nitrate transporter NRT1.1 is involved in iron deficiency responses in Arabidopsis. Journal of Plant Nutrition and Soil Science, 178(4). https://doi.org/10.1002/jpln.201400480

64) Liu, X., Huang, D., Tao, J., Miller, A. J., Fan, X., & Xu, G. (2014). Identification and functional assay of the interaction motifs in the partner protein OsNAR2.1 of the two-component system for high-affinity nitrate transport. New Phytologist, 204(1). https://doi.org/10.1111/nph. 12986

65) Liu, X. X., Zhu, Y. X., Fang, X. Z., Ye, J. Y., Du, W. X., Zhu, Q. Y., Lin, X. Y., & Jin, C. W. (2020). Ammonium aggravates salt stress in plants by entrapping them in a chloride over-accumulation state in an NRT1.1-dependent manner. Science of the Total Environment, 746. https://doi.org/10.1016/_j. scitotenv.2020.141244

66) Longo, A., Miles, N. W., & Dickstein, R. (2018). Genome mining of plant NPFs reveals varying conservation of signature motifs associated with the mechanism of transport. Frontiers in plant science, 9, 1668. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.01668

67) Lupini, A., Mercati, F., Araniti, F., Miller, A. J., Sunseri, F., & Abenavoli, M. R. (2016). NAR2.1/NRT2.1 functional interaction with NO3- and H+ fluxes in high-affinity nitrate transport in maize root regions. Plant Physiology and Biochemistry, 102. https://doi.org/10.1016/_j.plaphy.2016.02.022

68) Lv, M., Dong, T., Wang, J., & Zuo, K. (2022). Genome-wide identification of nitrate transporter genes from Spirodela polyrhiza and characterization of SpNRT1.1 function in plant development. Frontiers in plant science, 13, 945470. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.945470

69) Lv, Q., Zhong, Y., Wang, Y., Wang, Z., Zhang, L., Shi, J., Wu, Z., Liu, Y., Mao, C., Yi, K., & Wu, P. (2014). SPX4 negatively regulates phosphate signaling and homeostasis through its interaction with PHR2 in rice. Plant Cell, 26(4). https://doi.org/10.1105/tpc. 114.123208

70) Machin, F., Medina, B., Navarro, F. J., Pérez, M. D., Veenhuis, M., Tejera, P., Lorenzo, H., Lancha, A., & Siverio, J. M. (2004). The role of Ynt1 in nitrate and nitrite transport in the yeast Hansenulapolymorpha. Yeast, 21(3). https://doi.org/10.1002/yea.1075

71) Maeda, Y., Konishi, M., Kiba, T., Sakuraba, Y., Sawaki, N., Kurai, T., Ueda, Y., Sakakibara, H., & Yanagisawa, S. (2018). A NIGT1-centred transcriptional cascade regulates nitrate signalling and incorporates phosphorus starvation signals in Arabidopsis. Nature Communications, 9(1). https://doi.org/10.1038/s41467-018-03832-6

72) Mao, Q. Q., Guan, M. Y., Lu, K. X., Du, S. T., Fan, S. K., Ye, Y. Q., Lin, X. Y., & Jin, C. W. (2014). Inhibition of nitrate transporter 1.1-controlled nitrate uptake reduces cadmium uptake in arabidopsis. Plant Physiology, 166(2), 934-944. https://doi.org/10.1104/pp.114.243766

73) Medici, A., & Krouk, G. (2014). The primary nitrate response: a multifaceted signalling pathway. Journal of experimental botany, 65(19), 5567-5576. https://doi.org/10.1093/jxb/eru245

74) Medici, A., Marshall-Colon, A., Ronzier, E., Szponarski, W., Wang, R., Gojon, A., Crawford, N. M., Ruffel, S., Coruzzi, G. M., & Krouk, G. (2015). AtNIGT1/HRS1 integrates nitrate and phosphate signals at the Arabidopsis root tip. Nature Communications, 6. https://doi.org/10.1038/ncomms7274

75) Menz, J., Li, Z., Schulze, W. X., & Ludewig, U. (2016). Early nitrogen-deprivation responses in Arabidopsis roots reveal distinct differences on transcriptome and (phospho-) proteome levels between nitrate and ammonium nutrition. Plant Journal, 55(5). https://doi.org/10.1111/tpj.13272

76) Morre-Le Paven, M. C., Viau, L., Hamon, A., Vandecasteele, C., Pellizzaro, A., Bourdin, C., Laffont, C., Lapied, B., Lepetit, M., Frugier, F., Legros, C., & Limami, A. M. (2011). Characterization of a dual-affinity nitrate transporter MtNRT1.3 in the model legume Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany, 62(15), 5595-5605. https://doi.org/10.1093/jxb/err243

77) Munos, S., Cazettes, C., Fizames, C., Gaymard, F., Tillard, P., Lepetit, M., Lejay, L., & Gojon, A. (2004). Transcript profiling in the chl1-5 mutant of Arabidopsis reveals a role of the nitrate

transporter NRT1.1 in the regulation of another nitrate transporter, NRT2.1. The Plant cell, 16(9), 2433-2447. https://doi.org/10.1105/tpc.104.024380

78) Murray, J. D., Liu, C. W., Chen, Y., & Miller, A. J. (2017). Nitrogen sensing in legumes. Journal of experimental botany, 68(8), 1919-1926. https://doi.org/10.1093/jxb/erw405

79) Nacry, P., Bouguyon, E. & Gojon, A. (2013). Nitrogen acquisition by roots: physiological and developmental mechanisms ensuring plant adaptation to a fluctuating resource. Plant Soil. 370, 1-29. https://doi.org/10.1007/s11104-013-1645-9

80) Nazoa, P., Vidmar, J. J., Tranbarger, T. J., Mouline, K., Damiani, I., Tillard, P., Zhuo, D., Glass, A. D. M., & Touraine, B. (2003). Regulation of the nitrate transporter gene AtNRT2.1 in Arabidopsis thaliana: Responses to nitrate, amino acids and developmental stage. Plant Molecular Biology, 52(3). https://doi.org/10.1023/A:1024899808018

81) Nedelyaeva, O. I., Khramov, D. E., Balnokin, Y. V., & Volkov, V. S. (2024). Functional and Molecular Characterization of Plant Nitrate Transporters Belonging to NPF (NRT1/PTR) 6 Subfamily. International Journal of Molecular Sciences, 25(24), 13648. https://doi.org/10.3390/ijms252413648

82) Nedelyaeva, O. I., Khramov, D. E., Khalilova, L. A., Konoshenkova, A. O., Ryabova, A. V., Popova, L. G., Volkov, V. S., & Balnokin, Y. V. (20236). Molecular Cloning, Expression and Transport Activity of SaNPF6.3/SaNRT1.1, a Novel Protein of the Low-Affinity Nitrate Transporter Family from the Euhalophyte Suaeda altissima (L.) Pall. Membranes, 13(10). https://doi.org/10.3390/membranes13100845

83) Nedelyaeva, O. I., Popova, L. G., Khramov, D. E., Volkov, V. S., & Balnokin, Y. V. (2023 а). Chloride Channel Family in the Euhalophyte Suaeda altissima (L.) Pall: Cloning of Novel Members SaCLCa2 and SaCLCc2, General Characterization of the Family. International Journal of Molecular Sciences, 24(2). https://doi.org/10.3390/ijms24020941

84) O'Brien, J. A., Vega, A., Bouguyon, E., Krouk, G., Gojon, A., Coruzzi, G., & Gutiérrez, R. A. (2016). Nitrate Transport, Sensing, and Responses in Plants. Molecular plant, 9(6), 837-856. https://doi.org/10.1016/_j.molp.2016.05.004

85) Ohkubo, Y., Kuwata, K., & Matsubayashi, Y. (2021). A type 2C protein phosphatase activates high-affinity nitrate uptake by dephosphorylating NRT2.1. Nature Plants, 7(3). https://doi.org/10.1038/s41477-021 -00870-9

86) Ohkubo, Y., Tanaka, M., Tabata, R., Ogawa-Ohnishi, M., & Matsubayashi, Y. (2017). Shoot-to-root mobile polypeptides involved in systemic regulation of nitrogen acquisition. Nature Plants, 3. https://doi.org/10.1038/nplants.2017.29

87) Okamoto, M., Kumar, A., Li, W., Wang, Y., Siddiqi, M. Y., Crawford, N. M., & Glass, A. D. M. (2006). High-affinity nitrate transport in roots of Arabidopsis depends on expression of the NAR2-like gene AtNRT3.1. Plant Physiology, 140(3), 1036-1046. https://doi.org/10.1104/pp.105.074385

88) Okamoto, M., Vidmar, J. J., & Glass, A. D. (2003). Regulation of NRT1 and NRT2 gene families of Arabidopsis thaliana: responses to nitrate provision. Plant & cell physiology, 44(3), 304-317. https://doi.org/10.1093/pcp/pcg036

89) Orsel, M., Chopin, F., Leleu, O., Smith, S. J., Krapp, A., Daniel-Vedele, F., & Miller, A. J. (2006). Characterization of a two-component high-affinity nitrate uptake system in Arabidopsis. Physiology and protein-protein interaction. Plant Physiology, 142(3). https://doi.org/10.1104/pp.106.085209

90) Orsel, M., Eulenburg, K., Krapp, A., & Daniel-Vedele, F. (2004). Disruption of the nitrate transporter genes AtNRT2.1 and AtNRT2.2 restricts growth at low external nitrate concentration. Planta, 219(4). https://doi.org/10.1007/s00425-004-1266-x

91) Orsel, M., Krapp, A., & Daniel-Vedele, F. (2002). Analysis of the NRT2 nitrate transporter family in Arabidopsis. Structure and gene expression. Plant Physiology, 129(2). https://doi.org/10.1104/pp.005280

92) Ota, R., Ohkubo, Y., Yamashita, Y., Ogawa-Ohnishi, M., & Matsubayashi, Y. (2020). Shoot-to-root mobile CEPD-like 2 integrates shoot nitrogen status to systemically regulate nitrate uptake in Arabidopsis. Nature Communications, 11(1). https://doi.org/10.1038/s41467-020-14440-8

93) Pan, W., You, Y., Weng, Y. N., Shentu, J. L., Lu, Q., Xu, Q. R., Liu, H. J., & Du, S. T. (2020). Zn stress facilitates nitrate transporter 1.1-mediated nitrate uptake aggravating Zn accumulation in Arabidopsis plants. Ecotoxicology and Environmental Safety, 190. https://doi.org/10.1016/_j.ecoenv.2019.110104

94) Pao, S. S., Paulsen, I. T., & Saier, M. H. (1998). Major Facilitator Superfamily. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(1), 1-34. https://doi.org/10.1128/MMBR.62.1.1-34.1998

95) Parker, J. L., & Newstead, S. (2014). Molecular basis of nitrate uptake by the plant nitrate transporter NRT1.1. Nature, 507(7490), 68-72. https://doi.org/10.1038/nature 13116

96) Pellizzaro, A., Alibert, B., Planchet, E., Limami, A. M., & Morère-Le Paven, M. C. (2017). Nitrate transporters: an overview in legumes. Planta, 246(4), 585-595. https://doi.org/10.1007/s00425-017-2724-6

97) Pellizzaro, A., Clochard, T., Cukier, C., Bourdin, C., Juchaux, M., Montrichard, F., Thany, S., Raymond, V., Planchet, E., Limami, A. M., & Morère-Le Paven, M. C. (2014). The Nitrate Transporter MtNPF6.8 (MtNRT1.3) transports abscisic acid and mediates nitrate regulation of

primary root growth in Medicago truncatula. Plant Physiology, 166(4). https://doi.org/10.1104/pp. 114.250811

98) Plett, D., Toubia, J., Garnett, T., Tester, M., Kaiser, B. N., & Baumann, U. (2010). Dichotomy in the NRT gene families of dicots and grass species. PLoS ONE, 5(12). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015289

99) Quesada, A., Galvan, A., & Fernandez, E. (1994). Identification of nitrate transporter genes in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal, 5(3). https://doi.org/10.1111/j.1365-313x.1994.00407.x

100) Quesada, A., Hidalgo, J., & Fernández, E. (1998). Three Nrt2 genes are differentially regulated in Chlamydomonas reinhardtii. Molecular and General Genetics, 258(4). https://doi.org/10.1007/s004380050743

101) Quesada, A., Krapp, A., Trueman, L. J., Daniel-Vedele, F., Fernández, E., Forde, B. G., & Caboche, M. (1997). PCR-identification of a Nicotianaplumbaginifolia cDNA homologous to the high-affinity nitrate transporters of the crnA family. Plant Molecular Biology, 34(2). https://doi.org/10.1023/A:1005872816881

102) Remans, T., Nacry, P., Pervent, M., Girin, T., Tillard, P., Lepetit, M., & Gojon, A. (2006). A central role for the nitrate transporter NRT2.1 in the integrated morphological and physiological responses of the root system to nitrogen limitation in Arabidopsis. Plant Physiology, 140(3). https://doi.org/10.1104/pp.105.075721

103) Riveras, E., Alvarez, J. M., Vidal, E. A., Oses, C., Vega, A., & Gutiérrez, R. A. (2015). The calcium ion is a second messenger in the nitrate signaling pathway of Arabidopsis. Plant Physiology, 169(2), 1397-1404. https://doi.org/10.1104/pp.15.00961

104) Robinson, S., & Downton, W. (1985). Potassium, Sodium and Chloride Ion Concentrations in Leaves and Isolated Chloroplasts of the Halophyte Suaeda australis R. Br. Functional Plant Biology, 12(5). https://doi.org/10.1071/pp9850471

105) Rothstein, R. J. (1983). One-Step Gene Disruption in Yeast. Methods in Enzymology, 101(C). https://doi.org/10.1016/0076-6879(83)01015-0

106) Rubin, G., Tohge, T., Matsuda, F., Saito, K., & Scheible, W. R. (2009). Members of the LBD family of transcription factors repress anthocyanin synthesis and affect additional nitrogen responses in arabidopsis. Plant Cell, 21(11). https://doi.org/10.1105/tpc.109.067041

107) Rubio, L., Díaz-García, J., Amorim-Silva, V., Macho, A. P., Botella, M. A., & Fernández, J. A. (2019). Molecular characterization of zosmaNRT2, the putative sodium dependent high-affinity nitrate transporter of Zostera marina L. International Journal of Molecular Sciences, 20(15). https://doi.org/10.3390/ijms20153650

108) Rubio, L., Díaz-García, J., Martín-Pizarro, C., Siverio, J. M., Raven, J. A., & Fernández, J. A. (2023). Identity and functional characterisation of the transporter supporting the Na+-dependent high-affinity NO3- uptake in Zostera marina L. Plant Cell and Environment, 46(9). https://doi.org/10.1111/pce. 14660

109) Shuvalov, A. V., Yurchenko, A. A., Nedelyaeva, O. I., Myasoedov, N. A., Karpichev, I. V., Khalilova, L. A., Popova, L. G., & Balnokin, Y. V. (2021). Identification of Some Anion Transporter Genes in the Halophyte Suaeda altissima (L.) Pall. and Their Expression under Nitrate Deficiency and Salinity. Russian Journal of Plant Physiology, 68(5). https://doi.org/10.1134/S1021443721050174

110) Sohn, J. H., Choi, E. S., Kim, C. H., Agaphonov, M. O., Ter-Avanesyan, M. D., Rhee, J. S., & Rhee, S. K. (1996). A novel autonomously replicating sequence (ARS) for multiple integration in the yeast Hansenula polymorpha DL-1. Journal of Bacteriology, 178(15). https://doi.org/10.1128/jb.178.15.4420-4428.1996

111) Sparkes, I. A., Runions, J., Kearns, A., & Hawes, C. (2006). Rapid, transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature Protocols, 1(4). https://doi.org/10.1038/nprot.2006.286

112) Su, H., Wang, T., Ju, C., Deng, J., Zhang, T., Li, M., Tian, H., & Wang, C. (2021). Abscisic acid signaling negatively regulates nitrate uptake via phosphorylation of NRT1.1 by SnRK2s in Arabidopsis. Journal of Integrative Plant Biology, 63(3), 597-610. https://doi.org/10.1111/jipb.13057

113) Sun, J., Bankston, J. R., Payandeh, J., Hinds, T. R., Zagotta, W. N., & Zheng, N. (2014). Crystal structure of the plant dual-affinity nitrate transporter NRT1.1. Nature, 507(7490), 7377. https://doi.org/10.1038/nature 13074

114) Tabata, R., Sumida, K., Yoshii, T., Ohyama, K., Shinohara, H., & Matsubayashi, Y. (2014). Perception of root-derived peptides by shoot LRR-RKs mediates systemic N-demand signaling. Science, 346(6207). https://doi.org/10.1126/science. 1257800

115) Tong, Y., Zhou, J. J., Li, Z., & Miller, A. J. (2005). A two-component high-affinity nitrate uptake system in barley. Plant Journal, 41(3). https://doi.org/10.1111/j. 1365-313X.2004.02310.x

116) Touchette, B. W., & Burkholder, J. A. M. (2000). Review of nitrogen and phosphorus metabolism in seagrasses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 250(1-2). https://doi.org/10.1016/S0022-0981 (00)00195-7

117) Trueman, L. J., Richardson, A., & Forde, B. G. (1996). Molecular cloning of higher plant homologues of the high-affinity nitrate transporters of Chlamydomonas reinhardtii and Aspergillus nidulans. Gene, 175(1-2). https://doi.org/10.1016/0378-1119(96)00154-0

118) Tsay, Y. F., Schroeder, J. I., Feldmann, K. A., & Crawford, N. M. (1993). The herbicide sensitivity gene CHL1 of Arabidopsis encodes a nitrate-inducible nitrate transporter. Cell, 72(5), 705-713. https://doi.org/10.1016/0092-8674(93)90399-b

119) Unkles, S. E., Hawker, K. L., Grieve, C., Campbell, E. I., Montague, P., & Kinghorn, J. R. (1991). crnA encodes a nitrate transporter in Aspergillus nidulans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 88(1). https://doi.org/10.1073/pnas.88.1.204

120) Varala, K., Marshall-Colon, A., Cirrone, J., Brooks, M. D., Pasquino, A. V., Leran, S., Mittal, S., Rock, T. M., Edwards, M. B., Kim, G. J., Ruffel, S., Richard McCombie, W., Shasha, D., & Coruzzi, G. M. (2018). Temporal transcriptional logic of dynamic regulatory networks underlying nitrogen signaling and use in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 115(25). https://doi.org/10.1073/pnas. 1721487115

121) Vidmar, J. J., Zhuo, D., Siddiqi, M. Y., & Glass, A. D. M. (2000). Isolation and characterization of HvNRT2.3 and HvNRT2.4, cDNAs encoding, high-affinity nitrate transporters from roots of barley. Plant Physiology, 122(3). https://doi.org/10.1104/pp. 122.3.783

122) Walter, M., Chaban, C., Schutze, K., Batistic, O., Weckermann, K., Nake, C., Blazevic, D., Grafen, C., Schumacher, K., Oecking, C., Harter, K., & Kudla, J. (2004). Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal, 40(3). https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2004.02219.x

123) Wang, W., Hu, B., Li, A., & Chu, C. (2020). NRT1.1s in plants: Functions beyond nitrate transport. Journal of Experimental Botany, 71(15), 4373-4379. https://doi.org/10.1093/jxb/erz554

124) Wang, W., Hu, B., Yuan, D., Liu, Y., Che, R., Hu, Y., Ou, S., Liu, Y., Zhang, Z., Wang, H., Li, H., Jiang, Z., Zhang, Z., Gao, X., Qiu, Y., Meng, X., Liu, Y., Bai, Y., Liang, Y., ... Chu, C. (2018). Expression of the nitrate transporter gene OsNRT1.1A/ OsNPF6.3 confers high yield and early maturation in rice. Plant Cell, 30(3), 638-651. https://doi.org/10.1105/tpc. 17.00809

125) Wang, Y. Y., Hsu, P. K., & Tsay, Y. F. (2012). Uptake, allocation and signaling of nitrate. Trends in plant science, 17(8), 458-467. https://doi.org/10.1016/j .tplants.2012.04.006

126) Wang, Y., Yuan, Z., Wang, J., Xiao, H., Wan, L., Li, L., Guo, Y., Gong, Z., Friml, J., & Zhang, J. (2023). The nitrate transporter NRT2.1 directly antagonizes PIN7-mediated auxin transport for root growth adaptation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 120(25). https://doi.org/10.1073/pnas.2221313120

127) Wen, Z., & Kaiser, B. N. (2018). Unraveling the Functional Role of NPF6 Transporters. Frontiers in plant science, 9, 973. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00973

128) Wen, Z., Tyerman, S. D., Dechorgnat, J., Ovchinnikova, E., Dhugga, K. S., & Kaiser, B. N. (2017). Maize NPF6 proteins are homologs of arabidopsis CHL1 that are selective for both nitrate and chloride. Plant Cell, 29(10), 2581-2596. https://doi.org/10.1105/tpc.16.00724

129) Wirth, J., Chopin, F., Santoni, V., Viennois, G., Tillard, P., Krapp, A., Lejay, L., Daniel-Vedele, F., & Gojon, A. (2007). Regulation of root nitrate uptake at the NRT2.1 protein level in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry, 282(32). https://doi.org/10.1074/jbc.M700901200

130) Wu, S., & Letchworth, G. J. (2004). High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol. BioTechniques, 36(1). https://doi.org/10.2144/04361dd02

131) Xiao, C., Sun, D., Liu, B., Fang, X., Li, P., Jiang, Y., He, M., Li, J., Luan, S., & He, K. (2022). Nitrate transporter NRT1.1 and anion channel SLAH3 form a functional unit to regulate nitrate-dependent alleviation of ammonium toxicity. Journal of Integrative Plant Biology, 64(4), 942-957. https://doi.org/10.1111/jipb.13239

132) Xiao, Q., Chen, Y., Liu, C., Robson, F., Roy, S., Cheng, X., Wen, J., Mysore, K., Miller, A. J., & Murray, J. D. (2021). MtNPF6.5 mediates chloride uptake and nitrate preference in Medicago roots. The EMBO Journal, 40(21). https://doi.org/10.15252/embj.2020106847

133) Xiong, Y., Wang, S., Cui, C., Wu, X., & Zhu, J. (2023). Suaeda salsa NRT1.1 Is Involved in the Regulation of Tolerance to Salt Stress in Transgenic Arabidopsis. International Journal of Molecular Sciences, 24(16). https://doi.org/10.3390/ijms241612761

134) Xu, J., Li, H. D., Chen, L. Q., Wang, Y., Liu, L. L., He, L., & Wu, W. H. (2006). A Protein Kinase, Interacting with Two Calcineurin B-like Proteins, Regulates K+ Transporter AKT1 in Arabidopsis. Cell, 125(7), 1347-1360. https://doi.org/10.1016/_i.cell.2006.06.011

135) Yan, M., Fan, X., Feng, H., Miller, A. J., Shen, Q., & Xu, G. (2011). Rice OsNAR2.1 interacts with OsNRT2.1, OsNRT2.2 and OsNRT2.3a nitrate transporters to provide uptake over high and low concentration ranges. Plant, Cell and Environment, 34(8). https://doi.org/10.1111/_i.1365-3040.2011.02335.x

136) Ye, J. Y., Tian, W. H., & Jin, C. W. (2019). A reevaluation of the contribution of NRT1.1 to nitrate uptake in Arabidopsis under low-nitrate supply. FEBS Letters, 593(15), 2051-2059. https://doi.org/10.1002/1873-3468.13473

137) Ye, J. Y., Zhou, M., Zhu, Q. Y., Zhu, Y. X., Du, W. X., Liu, X. X., & Jin, C. W. (2022). Inhibition of shoot-expressed NRT1.1 improves reutilization of apoplastic iron under iron-deficient conditions. Plant Journal, 112(2), 549-564. https://doi.org/10.1111/tpi.15967

138) Yong, Z., Kotur, Z., & Glass, A. D. M. (2010). Characterization of an intact two-component high-affinity nitrate transporter from Arabidopsis roots. Plant Journal, 63(5). https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2010.04278.x

139) Yue, L., Liu, M., Liao, J., Zhang, K., Wu, W., & Wang, Y. (2025). CPK28-mediated phosphorylation enhances nitrate transport activity of NRT2.1 during nitrogen deprivation. New Phytologist, 245(1), 249-262. https://doi.org/10.1111/nph.20236

140) Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., & Deisseroth, K. (2007). Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature, 446(7136). https://doi.org/10.1038/nature05744

141) Zhang, J., Liu, Y. X., Zhang, N., Hu, B., Jin, T., Xu, H., Qin, Y., Yan, P., Zhang, X., Guo, X., Hui, J., Cao, S., Wang, X., Wang, C., Wang, H., Qu, B., Fan, G., Yuan, L., Garrido-Oter, R., ... Bai, Y. (2019). NRT1.1B is associated with root microbiota composition and nitrogen use in field-grown rice. Nature Biotechnology, 37(6). https://doi.org/10.1038/s41587-019-0104-4

142) Zhang, L., Hu, B., Deng, K., Gao, X., Sun, G., Zhang, Z., Li, P., Wang, W., Li, H., Zhang, Z., Fu, Z., Yang, J., Gao, S., Li, L., Yu, F., Li, Y., Ling, H., & Chu, C. (2019). NRT1.1B improves selenium concentrations in rice grains by facilitating selenomethinone translocation. Plant Biotechnology Journal, 17(6). https://doi.org/10.1111/pbi. 13037

143) Zhang, X., Cui, Y., Yu, M., Su, B., Gong, W., Baluska, F., Komis, G., Samaj, J., Shan, X., & Lin, J. (2019). Phosphorylation-mediated dynamics of nitrate transceptor NRT1.1 regulate auxin flux and nitrate signaling in lateral root growth. Plant Physiology, 181(2), 480-498. https://doi.org/10.1104/pp.19.00346

144) Zhou, J. J., Fernández, E., Galván, A., & Miller, A. J. (2000). A high affinity nitrate transport system from Chlamydomonas requires two gene products. FEBS Letters, 466(2-3). https://doi.org/10.1016/S0014-5793(00)01085-1

145) Zhou, J. J., Theodoulou, F. L., Muldin, I., Ingemarsson, B., & Miller, A. J. (1998). Cloning and functional characterization of a Brassica napus transporter that is able to transport nitrate and histidine. Journal of Biological Chemistry, 273(20), 12017-12023. https://doi.org/10.1074/jbc.273.20.12017

146) Zhou, J., Jiao, F. C., Wu, Z., Li, Y., Wang, X., He, X., Zhong, W., & Wu, P. (2008). OsPHR2 is involved in phosphate-starvation signaling and excessive phosphate accumulation in shoots of plants. Plant Physiology, 146(4). https://doi.org/10.1104/pp.107.111443

147) Zhu, J., Fang, X. Z., Dai, Y. J., Zhu, Y. X., Chen, H. S., Lin, X. Y., & Jin, C. W. (2019). Nitrate transporter 1.1 alleviates lead toxicity in Arabidopsis by preventing rhizosphere

acidification. Journal of Experimental Botany, 70(21), 6363-6374. https://doi.org/10.1093/ixb/erz374

148) Zhuo, D., Okamoto, M., Vidmar, J. J., & Glass, A. D. M. (1999). Regulation of a putative high-affinity nitrate transporter (Nrt2;1At) in roots of Arabidopsis thaliana. Plant Journal, 17(5). https://doi.org/10.1046/i.1365-313X.1999.00396.x

149) Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., & Muzyczka, N. (1996). A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. Journal of Virology, 70(7). https://doi.org/10.1128/ivi.70.7.4646-4654.1996

Приложение

П1. Карты векторных конструкций

Рис. 27. Карта векторной конструкции pCHLX-SaNPF6.3. pYNR1 и tYNR1 - промотор и терминатор гена нитратредуктазы YNR1 Н. polymorpha (штамма DL-1); CmR - ген хлорамфениколацетилтрансферазы; HpLEU2 - ген биосинтеза лейцина (ауксотрофный маркер)

(КБ рптег]

Рис. 28. Карта векторной конструкции pCHLX-SaNRT2.1. pYNR1 и tYNR1 - промотор и терминатор гена нитратредуктазы YNR1 Н. polymorpha (штамма DL-1); CmR - ген хлорамфениколацетилтрансферазы; HpLEU2 - ген биосинтеза лейцина (ауксотрофный маркер)

ÍKS primer]

Рис. 29. Карта векторной конструкции pCHLX-SaNRT2.5. pYNR1 и tYNR1 - промотор и терминатор гена нитратредуктазы YNR1 Н. polymorpha (штамма DL-1); CmR - ген хлорамфениколацетилтрансферазы; HpLEU2 - ген биосинтеза лейцина (ауксотрофный маркер)

ЦУ 'ТЗ ргоггкЛег (М13 геу'| 1ас орега!:ог | Час ргоггшег САР ЫпШпд511е

Рис. 30. Карта векторной конструкции pCCUR2-SaNAR2.2. pYNR1 и tYNR1 - промотор и терминатор гена нитратредуктазы YNR1 Н. polymorpha (штамма DL-1); CmR - ген хлорамфениколацетилтрансферазы; HpURA3 - ген биосинтеза урацила (ауксотрофный маркер)

П2. Белки, использованные для построения филогенетических деревьев

Таблица 10. Список белков семейства NRT2, использованных для построения

филогенетического дерева на рисунке 12а.

Вид растения Название белка GenBank ID

Arabidopsis thaliana AtNRT2.1 NP 172288.1

AtNRT2.2 NP 172289.1

AtNRT2.3 NP 200886.1

AtNRT2.4 NP 200885.1

AtNRT2.5 NP 172754.1

AtNRT2.6 NP 190092.1

AtNRT2.7 NP 196961.1

Amaranthus tricolor AtrNRT2.1 XP 057535583.1

AtrNRT2.5 XP 057530035.1

Beta vulgaris BvNRT2.1 XP 010685329.1

BvNRT2.4 XP 048504348.1

BvNRT2.5 XP 010695818.2

Brassica napus BnNRT2.6 XP 013677304.1

BnNRT2.7 XP 013726185.2

Brassica rapa BrNRT2.6 XP 009107824.2

BrNRT2.7 XP 009125986.2

Cannabis sativa CsaNRT2.5 XP 030496215.2

Capsella rubella CrNRT2.5 XP 006307313.1

CrNRT2.6 XP 006293136.1

CrNRT2.7 XP 006286495.1

Cucumis sativus CsNRT2.1 AZP53714.1

CsNRT2.2 AGO64298.1

CsNRT2.3 AGO64299.1

CsNRT2.4 NP 001274401.1

CsNRT2.5 NP 001295862.1

Chenopodium quinoa CqNRT2.1 XP 021716511.1

CqNRT2.5 XP 021713512.1

Eutrema salsugineum EsNRT2.5 XP 006417172.1

EsNRT2.6 XP 006419073.1

Glycine max GmNRT2.4 XP 003539195.1

Hordeum vulgare HvNRT2.1 AAC49531.1

HvNRT2.2 AAC49532.1

HvNRT2.4 KAE8777997.1

HvNRT2.5 KAE8819762.1

Medicago truncatula MtNRT2.1 XP 013455974.2

MtNRT2.7 KEH30005.1

Nicotiana sylvestris NsNRT2.7 XP 009757883.1

Raphanus sativus RsNRT2.5 XP 018449553.1

Solanum lycopersicum S1NRT2.3 NP 001234127.1

S1NRT2.7 XP 004233327.2

Spinacia oleracea SoNRT2.1 XP 021865042.1

SoNRT2.5 XP 021845686.1

Suaeda altissima SaNRT2.1 WPS65192.1

SaNRT2.5 WPH61290.1

Vigna angularis VaNRT2.1 XP 017409445.1

Таблица 11. Список белков семейства NAR2, использованных для построения

филогенетического дерева на рисунке 14а.

Вид растения Название белка GenBank ID

Amaranthus tricolor AtrNAR2.2 XP 057534669.1

Arabidopsis lyrata A1NAR2.1 XP 020871335.1

Arabidopsis thaliana AtNAR2.1 NP 199831.1

Arabidopsis thaliana AtNAR2.2 NP 001190826.1

Asparagus officinalis AoNAR2.1 XP 020246811.1

Beta vulgaris BvNAR2.2 XP 010667500.1

Brassica rapa BrNAR2.1 XP 009134048.2

Capsicum chinense CchNAR2.2 PHU23681.1

Chenopodium quinoa CqNAR2.2 XP 021720161.1

Eutrema salsugineum EsNAR2.1 XP 006402168.1

Eutrema salsugineum EsNAR2.2 XP 024005789.1

Glycine max GmNAR2.1 XP 003549822.1

Hordeum vulgare HvNAR2.1 AAP31850.1

Hordeum vulgare HvNAR2.2 AAP31851.1

Iris pallida IpNAR2.1 KAJ6792152.1

Medicago truncatula MtNAR2.1 XP 013457733.1

Oryza sativa OsNAR2.1 Q6ZI50.1

Oryza sativa OsNAR2.2 Q7XK12.1

Perilla frutescens PfNAR2 KAH6794745.1

Phtheirospermum japonicum PjNAR2.1 GFQ07351.1

Salvia hispanica ShNAR2.1 XP 047977271.1

Sesamum indicum SiNAR2.1 XP 020548343.1

Solanum pennellii SpNAR2.2 XP 015069077.1

Spinacia oleracea SoNAR2.2 XP 021863523.1

Suaeda altissima SaNAR2.2 WPH61291.1

Triticum aestivum TaNAR2.2 AAV35211.1

Triticum aestivum TaNAR2.1 AAV35210.1

Vigna radiata VrNAR2.1 XP 014490580.1