Молекулярный анализ эмбрионального развития Hydra путем вычитательной гибридизации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.00, кандидат биологических наук Генихович, Григорий

  • Генихович, Григорий
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2004, КильКиль
  • Специальность ВАК РФ03.00.00
  • Количество страниц 142
Генихович, Григорий. Молекулярный анализ эмбрионального развития Hydra путем вычитательной гибридизации: дис. кандидат биологических наук: 03.00.00 - Биологические науки. Киль. 2004. 142 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Генихович, Григорий

Содержание

Сокращения

1. Введение

1.1. Характерные особенности оогенеза и эмбрионального развития

1.2. Hydra - модель для изучения постоянного формирования

паттерна и морфогенезов во взрослом состоянии

1.2.1. Филогенетическое положение, анатомия и гистология

гидры

1.2.2. Гаметогенез у Hydra

1.2.3. Эмбриональное развитие гидры

1.2.4. Формирование паттерна у взрослых животных: система позиционной информации

1.2.5. Формирование паттерна у взрослых животных: региональная спецификация судьбы клеток

1.2.6. Что известно об эмбрионе гидры на молекулярном уровне

и что остается узнать?

1.3. Цели данного исследования

2. Результаты

2.1. Конструирование кДНК-библиотеки из ранних эмбрионов путем вычитательной гибридизации и ее анализ

2.1.1. Конструирование кДНК-библиотеки из ранних эмбрионов

путем вычитательной гибридизации

2.1.2. Анализ полученных последовательностей

2.1.3. Проверка качества вычитательной кДНК-библиотеки путем

RT ПЦР

2.1.4. Примеры генов с известными гомологами

2.2. HyEED-1 - консервативный регуляторный ген, участвующий в эмбриогенезе

2.2.1. Клонирование HyEED-1

2.2.2. Анализ экспрессии HyEED

2.3 НуЕМВ-1 - ген без известных гомологов, задействованный в

эмбриогенезе

2.3.1. Клонирование и анализ НуЕМВ-1

2.3.2. Анализ экспрессии НуЕМВ-1 методом гибридизации in situ

3. Обсуждение

3.1. Эмбриональное развитие: что происходит на молекулярном уровне?

3.2. Преимущества и недостатки подавляющей вычитательной гибридизации

3.3. Проверка качества библиотеки: необходимо ли это?

3.4. Анализ последовательностей кластеров и синглетов

библиотеки Kiel 3

3.4.1. Общая информация

3.4.2. Не имеющие гомологов гены в библиотеке Kiel 3

3.5. НуЕМВ-1 - не имеющий гомологов, неизвестный ранее ген

3.6. Ген Hydra Embryonic Ectoderm Development эпигенетика и происхождение интерстициальных клеток

3.6.1. Функции белков группы Polycomb

3.6.2. Hydra EED - самый ранний генетический маркер интерстициальных клеток

3.7. Заключительные соображения

4. Резюме

5. Материалы

5.1. Используемые животные

5.2. Среды

5.3. Растворы

5.3.1. Растворы общего назначения

5.3.2. Растворы для гибридизации in situ и окрашивания антителами и методом TUNEL

5.4. Наборы реагентов

5.5. Ферменты (не из наборов реагентов)

5.6. Химические реагенты

5.7. Радиоактивные нуклеотиды

5.8. Векторы

5.9. Антитела

5.10. Праймеры и олигонуклеотиды

5.11. Приборы

5.12. Прочие материалы

5.13. Компьютерные программы

6. Методы

6.1. Животные и условия культивирования

6.2. Выделение геномной ДНК

6.3. Выделение тотальной и матричной РНК

6.4. Синтез кДНК путем обратной транскрипции

6.5. Лигирование сплинкеретт

6.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

6.6.1. Амплификация фрагментов ДНК

6.6.2. RT ПЦР

6.6.3. 3" RACE ПЦР

6.6.4. 5' RACE ПЦР

6.6.5. ПЦР с вырожденным праймером

6.7. Гибридизация по Саузерну

6.8. Гибридизация по Нозерну

6.9. Клонирование и секвенирование

6.9.1. АТ-лигирование продуктов ПЦР

6.9.2. Компетентные клетки

6.9.3. Электропорация и проверка на наличие вставки

6.9.4. Выделение плазмид

6.9.5. Секвенирование с использованием системы Li-COR

6.9.6. Секвенирование с использованием системы MEGABACE 500

6.10. Подавляющая вычитательная гибридизация

6.11. Выращивание библиотеки в бактериях и приготовление макроэррэев

6.11.1. Выращивание библиотеки в бактериях, репликация и

хранение клонов

6.11.2. Упорядоченное нанесение клонов библиотеки на

нейлоновую мембрану и обработка фильтров

6.11.3. Гибридизация макроэррэев

6.12. Гибридизация in situ

6.12.1. Приготовление меченных дигоксигенином проб

6.12.2. Гибридизация in situ на целых зародышах

6.12.3. Гибридизация in situ на целых полипах

6.12.4. Гибридизация in situ на замороженных срезах эмбрионов

6.13. Окрашивание антителами

6.13.1. Окрашивание антителами взрослых полипов

6.13.2. Окрашивание антителами замороженных срезов

6.14. Окраска по методу TUNEL

7. Литература

8. Благодарности

9. Официальное заявление

Сокращения

1 Минута

а Секунда

а.к. Аминокислота

БСА Бычий сывороточный альбумин

В Вольт

ВКМ Внеклеточный матрикс

г Грамм

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНКаза Дезоксирибонуклеаза

ДЭПК Диэтилпирокарбонат

Ед Единица (активности фермента)

кДНК Комплементарная ДНК

л Литр

кВ Киловольт

мг Миллиграмм

мкг Микрограмм

мкФ Микрофарада

мл Миллилитр

мкл Микролитр

мм Миллиметр

м/о Весовые проценты

мРНК Матричная РНК

нг Нанограм

нм Нанометр

о/о Объемные проценты

пмоль Пикомоль

Рис. Рисунок

РНК Рибонуклеиновая кислота

РНКаза Рибонуклеаза

см Сантиметр

тРНК Транспортная РНК

УФ Ультрафиолет

ЭДТА Этилен диамин тетраацетат, натриевая соль

ВАС Искусственая бактериальная хромосома

BCIP 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp Пара нуклетодидов

Cpm Импульс в минуту

DABCO Триэтилендиамин

DAPI 4,6-диамидино-2-фенилиндол

dATP Дезоксирибоаденозин трифосфат

dCTP Дезоксирибоцитидин трифосфат

ddH20 Бидистиллированная вода

dGTP Дезоксирибогуанидин трифосфат

dH20 Дистиллированная вода

Dig Дигоксигенин

dNTP Дезоксирибонуклеотид трифосфат

dTTP Дезоксириботимидин трифосфат

dUTP Дезоксирибоуридин трифосфат

EST Expressed sequence tag

et al. И другие

FITC Флуоресцеин изотиоцианат

GAPDH Глицеральдегид-З-фосфат дегидрогеназа

HS Гибридизационный раствор

1-клетка Интерстициальная клетка

IPTG Изопропил-1-тио-р-0-галактозид

kb Тысяча пар нуклеотидов

LB Luria broth

M Молярный

MAB Maleic acid buffer

mM Милимолярный

NBT Тетразол нитросиний

NCBI Национальный центр биотехнологической информации

QD600 Оптическая плотность при длине волны 600 нм

ORF Открытая рамка считывания

PBS Phosphate-buffered saline

PCR Полимеразная цепная реакция

PEG Полиэтиленгликоль

PRC Репрессорный комплекс белков группы поликомб

RACE Rapid amplification of cDNA ends

rpm Обороты в минуту

RT Обратная транскрипция

SDS Додецилсульфат натрия

SSC Sodium salino-cytrate

Та Температура отжига праймера

TdT Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза

TEMED N, N, N', N'- тетраэтил метилдиамин

Тт Температура плавления праймера

TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine-digoxigenin triphosphate nick-end labeling

UTP Рибоуридин трифосфат

UTR Нетранслируемый участок

X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-р-Р-галактозид

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биологические науки», 03.00.00 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярный анализ эмбрионального развития Hydra путем вычитательной гибридизации»

1. Введение

1.1 Характерные особенности оогенеза и эмбрионального развития

Программа развития многоклеточного животного включает в себя формирование самой сложной клетки организма, яйцеклетки, ее оплодотворение и быстрое, но при этом безошибочное, развитие исключительно сложно устроенного тела животного. Самое очевидное и, в то же время, важнейшее свойство оогенеза и эмбрионального развития заключается в том, что эти процессы происходят с каждым живым существом только один раз за всю их жизнь. В ходе оогенеза или раннего развития происходит детерминация осей тела, затем специфицируются обширные области зародыша, клетки пролиферируют и дифференцируются, образуя, в конечном счете, части тела. Общепринятым считается то, что закладка осей, формирование паттерна, морфогенетические движения, зависимая от положения в зародыше спецификация судьбы клетки, активные и всеохватывающие процессы пролиферации и дифференциации клеток являются характерными особенностями оогенеза и эмбрионального развития. Все эти процессы требуют жесткого контроля за экспрессией генов, что возможно только в строго организованной среде из структурных белков, желтка, мембранных компонентов и специфически распределенных в пространстве материнских мРНК. После того как формирование паттерна завершается, а части тела и органы уже сформированы, задачей организма становится, в первую очередь, поддержание гомеостаза, обновление клеточных популяций, борьба с патогенами и, наконец, репродукция. Эта смена задачи отражается в наличии значительного числа структурных и регуляторных генов (и материнских, и зиготических), которые необходимы для построения организма животного, но не для его поддержания. Эти гены экспрессируются кратковременно в ходе оогенеза (если это гены материнского эффекта) и эмбриогенеза. Например, материнская мРНК bicoid запасается на переднем полюсе яйца Drosophila, белок, транслированный с этой мРНК, образует градиент, и, после того как передне-задняя ось плодовой мушки специфицирована, bicoid больше не экспрессируется до тех пор, пока не приходит время сформировать новое яйцо (Bereleth et al., 1988; FlyBase http://flybase.bio.indiana.edu/). Hunchback экспрессируется в яичниках Drosophila; его РНК имеется во всех частях эмбриона, но в передней части, где белок bicoid связывается с энхансерами hunchback в зиготических ядрах, дополнительно транскрибируется еще некоторое количество hunchback. Hunchback

работает вместе с bicoid, регулируя формирование передней части зародыша, и также не экспрессируется во взрослой дрозофиле до тех пор, пока не начинается оогенез (FlyBase http://flybase.bio.indiana.edu/). Зиготический ген serendipity-a кодирует компонент цитоскелета, необходимый для целлюляризации. Этот ген начинает экспрессироваться во время двенадцатого клеточного цикла, достигает максимальной интенсивности экспрессии в начале четырнадцатого цикла, а к концу его полностью исчезает (см. обзор Mazumdar and Mazumdar, 2002). Эти данные свидетельствуют о том, что существуют процессы, специфичные для эмбрионального развития, и они требуют определенного генетического контекста.

В то же время существуют животные, у которых формирование паттерна, пролиферация и дифференциация клеток происходят постоянно или случаются периодически и во взрослом состоянии. За их необычную природу эти процессы даже получили название «соматических эмбриогенезов» (Tokin, 1969). Соматические эмбриогенезы типичны для животных, стоящих по обе стороны эволюционной границы Eumetazoa: для губок и книдарий.

1.2. Hydra - модель для изучения постоянного формирования

паттерна и морфогенезов во взрослом состоянии

Пресноводная гидра - типичное, хоть и просто устроенное, многоклеточное животное с истинными тканями, примитивной нервной системой и стабильными клеточными типами. С середины XVIII-oro века гидра привлекала внимание исследователей, благодаря своей уникальной способности к регенерации (Trembley, 1744). Она способна восстанавливать себя из маленького кусочка и даже из полученных путем центрифугирования агрегатов диссоциированных клеток (Gierer et al., 1972; Gierer, 1974; Bosch, 2003). Пролиферация и дифференциация клеток, зависящая от положения в теле полипа спецификация судьбы клеток, морфогенетические движения постоянно происходят во взрослых полипах в ходе того, как клетки делятся в гастральном отделе тела гидры и смещаются в голову и ногу животного, а также в периодически образующиеся почки (Bode et al., 1986). Таким образом, процессы, типичные для эмбрионального развития более эволюционно продвинутых многоклеточных животных, могут изучаться на почкующейся и регенерирующей гидре. Все это, вкупе с простотой организации полипа, особенно с

наличием у него единственной оси тела, и эволюционным положением гидры в типе Сшс1апа - древней сестринской группе (Рис. 1.1) для всех билатеральносимметричных многоклеточных животных - обусловило выбор гидры в качестве модельного организма эволюционной биологии развития. Интерес к этому организму так велик, что в последние годы ведется крупномасштабный ЕБТ-проект, а сейчас также запускается геномный проект по пресноводной гидре.

Bilatería

также в соответствии с таксономической базой данных ITIS (http://www.itis.usda.gov/)

С точки зрения эволюции каскадов развития, гидра предоставляет информацию о том, какой базовый набор регуляторных генов необходим для того, чтобы многоклеточное животное было многоклеточным животным. По мере того, как у книдарий обнаруживаются гены консервативных транскрипционных факторов, выясняются их предполагаемые анцестральные функции. Зачастую функция этих генов у Bilatería сильно отличается от функции у Hydra. Например, у гидры имеется два гомолога гена brachyury (Technau and Bode, 1999), который у всех трехслойных животных является специфичным для мезодермы. А у гидры нет мезодермы. У гидры и других книдарий были обнаружены гомологи нескольких Нох- и РагаНох-генов, например гомологи labial, Abdominal-B, Gsx и caudal (Gauchat et al., 2000; Ferrier and Holland, 2001). У билатеральносимметричных животных эти гены управляют спецификацией клеток в зависимости от их позиции относительно передне-задней оси, а у книдарий нет явной передне-задней оси, поскольку апикально-базальная ось не может быть однозначно названа ее гомологом.

1.2.1. Филогенетическое положение, анатомия и гистология гидры

Гидра принадлежит к типу Cnidaria, включающему в себя радиальиосимметричных двуслойных животных, возраст древних окаменелых остатков которых датирован более чем 500 миллионами лет (Xiao et al., 2000). Книдарии были названы так благодаря наличию в стенке тела у них стрекательных клеток, называемых книдоцитами или нематоцитами. Класс Hydrozoa включает в себя семь отрядов, и представлен, в подавляющем большинстве, морскими колониальными животными, для которых характерно закономерное чередование бесполого, представленного полипом, и полового, представленного медузой, поколений. Гидра, в отличие от морских родственников, полностью лишена медузоидного поколения. Просто устроенные гонады формируются прямо на стенках тела мужских и женских полипов. В благоприятных условиях гидра размножается почкованием, но осенью или в неблагоприятных условиях она переключается на половой процесс, который будет описан ниже. Анатомия полипа проста. Он представляет собой двуслойную трубку, у которой на апикальном конце, называемом головой, находится окруженный венчиком

Рис. 1.2 Анатомия Hydra и схема стенки ее тела (по Ruppert and Barnes, 1994)

щупальцев гипостом со ртом, а на базальном конце, именуемом ногой, - стебелек и подошва (Рис. 1.2). Почка закладывается на границе нижних двух третей тела.

Книдоциль

Стрекательная капсула

Рецепторная ресничка

Эпителиально-мышечная

«летка

Интерстициальная клетка Чувствительная клетка

Эктодерма -

Мезоглея

Энтодерма

Нейрон

Продольные миофибриллы Вазальная мембрана (2) Кольцевые миофибриллы Ядро

Железистая клетка Гранулярный материал

Ресничка

Эпителиально-мышечная кпетк_

Пищеварительная вакуоль

Стенка тела состоит из двух слоев - эктодермы и энтодермы. Существуют три стабильных клеточных линии: эпителиально-мышечные клетки эктодермы, эпителиально-мышечные клетки энтодермы и система стволовых интерстициальных клеток (David and Campbell, 1972; Campbell and David, 1974). Эпителиально-мышечные клетки являются основным клеточным типом, отвечающим за поддержание формы тела животного и за формирование паттерна в нормальной и экспериментальных ситуациях. Обычно эти клетки именуются просто эпителиальными.

Соматические Половые

Рис. 1.3 Пути дифференциации стволовых интерстициальных клеток

Интерстициальные стволовые клетки (I-клетки) располагаются в пространствах между базальными частями эктодермальных эпителиально-мышечных клеток. Как показано на Рис. 1.3, интерстициальные клетки могут пролиферировать (примерно 60%) и дифференцироваться (примерно 40%) в соматические производные, такие как нервные клетки, железистые клетки и стрекательные клетки, а также в гаметы (Bosch and David, 1987; Bosch et al., 1991).

1.2.2. Гаметогенез у Hydra

Считается, что, в отличие от многих других групп животных, книдарии не имеют стабильной линии клеток зародышевого пути (см. обзор Extavour and Akam, 2003). И сперматогонии, и оогонии образуются из субпопуляции стволовых интерстициальных клеток, которая становится детерминирована дать начало половым клеткам. В то же время, интерстициальные клетки и бесполых полипов, и полипов, претерпевающих гаметогенез, постоянно экспрессируют маркерные гены клеток зародышевого пути, такие как гомологи vasa, названные Cnvasl и Cnvas2 (Mochizuki et

А

т

Рис. 1.4 Анатомия и гистология семенника гидры А) Мужской полип. В) Поперечный срез полипа через семенник Ect - эктодерма, End — эндодерма, М -мезоглея. С) гистология семенника D) схема среза, показанного на (С). Sg - сперматогонии, Sc -сперматоциты, Sd - сперматиды, Sz - сперматозоиды, сперматозоиды Ер - эпителиально-мышечная клетка. Видно характерное расположение клеток на разных стадия сперматогенеза и изменения в размере их ядер. (Из Kuznetsov et al., 2001 с изменениями)

al., 2001), и гомолог nanos, называемый Cnnosl (Mochizuki et al., 2000). У книдарий образуются истинные гонады - специальные участки тела, которые заселяются мигрирующими в них

первичнополовыми клетками.

Гонады гидр устроены

исключительно примитивно. Это просто обособленные участки, в которых между мезоглеей и эктодермальным слоем

аккумулируются первичнополовые клетки.

В то время как формирование мужских половых клеток (Рис. 1.4) идет по вполне обычному пути, причем клетки, находящиеся на более ранних стадиях

сперматогенеза находятся ближе, а сперматиды и зрелые

дальше от мезоглеи (Brien, 1966; Kuznetsov et al., 2001), оогенез гидры очень необычен. Те интерстициальные

клетки, которые должны стать оогониями, начинают делиться и образуют кластеры, клетки в которых соединены цитоплазматическими мостиками. В ходе превращения интерстициальной клетки в оогонию ее внутриклеточные структуры претерпевают серьезные изменения: объем цитоплазмы увеличивается, развивается шероховатый эндоплазматический ретикулум, накапливаются гранулы гликогена и липидные капли, из гладких пузырьков формируется множество аппаратов Гольджи, возрастает число митохондрий, гладкие мембранные пузырьки и трубочки сливаются с цитоплазматической мембраной, значительно увеличивая ее поверхность и происходит активная эмиссия рибонуклеопротеидного материала из ядра в цитоплазму (Aizenshtadt,

1974). Как было продемонстрировано путем цитофотометрического измерения содержания в клетках ДНК, все клетки кластера претерпевают первое деление мейоза и становятся ооцитами I (Aizenshtadt and Marshak, 1974). Затем происходит детерминация одной из клеток кластера, которая должна стать яйцеклеткой, в то время как остальные клетки кластера станут эндоцитами яйцеклетки (Рис. 1.5). Механизм индукции будущей яйцеклетки не изучен. Возможно, необходим контакт с мезоглеей, поскольку показано, что растущее яйцо всегда соединяется с эпителиально-мышечными клетками энтодермы, достигая их через мезоглею длинными клеточными отростками (Aizenshtadt, 1978). Имеются данные, что гомеобокс-содержащий ген CnOtx, вероятно, играет роль в детерминации будущего яйца (Miller et al., 2000).

Растущий ооцит формирует интердигитации с окружающими его ооцитами и начинает «откусывать» и фагоцитировать части их цитоплазмы. Мембраны, окружающие эти фагоцитированные фрагменты, разбираются, превращаясь в маленькие пузырьки, а цитоплазма фрагментов интегрируется в цитоплазму быстрорастущего ооцита. В определенный момент растущий ооцит начинает поглощать соседние ооциты, и, хотя некоторое их число лизируется и переваривается, подавляющее большинство этих эндоцитов или клеток-нянек сохраняются в фагоцитарных вакуолях на протяжении всего эмбрионального развития (Aizenshtadt, 1978; Martin et al., 1997). Когда ооцит достигает своего окончательного размера, эктодерма прорывается, и ооцит продавливается через разрыв и оказывается обращенным во внешнюю среду.

1-клетка

®

Рис. 1.5 Схема оогенеза гидры

Фагоцитарный тип оогенеза не уникален для гидры. Ооциты губок также поглощают окружающие клетки, хотя в случае гаплосклерид это не ооциты, а соматические клетки (Ereskovskii, 1999). Самое загадочное в этом процессе то, что эндоциты губок и книдарий не подвергаются немедленному цитолизу после поглощения их растущими ооцитами. Напротив, в яйцеклетках и эмбрионах гидры они остаются транскрипционно и, возможно, трансляционно активны (Frôbius et ai., 2003). Путем эксперимента "nuclear run-on" нам удалось показать, что при добавлении

I-клетка, Кластер

вступающая ооцитов I в оогенез

Селекция будущей яйцеклетки

Фагоцитоз соседних ооцитов

радиоактивного UTP к препарату ядер из двадцати одно-, двух- и четырехклеточных эмбрионов в ядрах происходит синтез радиоактивной мРНК нескольких регуляторных и структурных генов (Рис. 1.6А). Следует подчеркнуть, что такие ядерные препараты содержали несколько тысяч ядер эндоцитов на каждое ядро бластомера. Более того, ядрышки эндоцитов окрашиваются нитратом серебра, что является характеристикой метаболически активных ядрышек, в которых происходит синтез рибосомальной РНК (Рис. 1.6В-С). Наконец, путем гибридизации in situ на парафиновых срезах зародышей разных стадий удалось показать присутствие в эндоцитах мРНК гена Cnnosl (Рис. 1.6D-I).

Хоннегер с соавторами (Honneger et al., 1989) сначала назвали эндоциты

Рис. 1.6 Эндоциты в зародышах гидры А) Результаты эксперимента "nuclear run-on". РНК синтезируется ядрами 20 зародышей на стадии 1-4 клетки. В-С) Окрашивание серебром

свидетельствует об активности ядрышек эндоцитов (стрелка).

D) Полутонкий срез через одноклеточный зародыш в процессе первого деления дробления (черная стрелка) и результаты гибридизации in situ со смысловой (Е) и антисмысловой (F) пробой против Cnnosl. Виден гибридизационный сигнал в эндоцитах (стрелки).

G) Полутонкий срез через кутикулярный зародыш и результаты гибридизации in situ со смысловой (Н) и антисмысловой (I) пробой против Cnnosl. Кутикула окрашена неспецифически (Из Fróbius et al., 2003)

HyAlx

Frizzled

Cnnos1

CnOtx

íJ^K - Й* '' . ■ 7 HyTcf

-¡к* ■ Actin

HyBra 1

• p-Catenin

- ' \ * Heady

CnNk-2

X

я"

F ^ ^fs л I

Ш

jf

ягг

-v Zy-.;- у* ■ ~ - _ - ■ ■

y

апоптотическими клетками, однако недавно появилось детальное исследование Технау и др., в котором показано, что эндоциты пребывают в состоянии ареста апоптоза (Technau et al., 2003). Было продемонстрировано, что активность каспаз является пермиссивной для начала оогенеза. Ингибирование каспаз на стадии 1-2 оогенеза (Miller et al., 2000), соответствующей сползанию и пролиферации интерстициальных клеток и появлению утолщения стенки тела в зоне будущего яичника, ведет к абортивному оогенезу и невозможности фагоцитоза эндоцитов. Ингибирование каспаз на более поздних стадиях никак на ход оогенеза не влияет. Таким образом, индукция апоптоза необходима для инициации, но нежелательна для протекания оогенеза. Эндоциты являются TUNEL-негативными и остаются TUNEL-негативными в ходе всего оогенеза и эмбриогенеза. Хроматин эндоцитов каким-то образом защищен от воздействия ДНКазы I. Обработка ДНКазой I ведет к резкому увеличению TUNEL-позитивных эпителиально-мышечных клеток, но не влияет на эндоциты. Арест апоптоза обусловлен, вероятно, повышенной пероксидазной активностью эмбриона. Пероксидазы и каталазы ингибируют апоптоз, препятствуя оксидативному стрессу митохондрий (Zhang et al., 1997). Эндоциты гидры обладают повышенной пероксидазной активностью, начиная с самых ранних стадий оогенеза и кончая вылуплением молодого полипа, в котором эндоциты до сих пор присутствуют в энтодермальных клетках. В течение первых 1 -3 суток после вылупления пероксидазная активность волнообразно уменьшается от апикального к базальному концу полипа. Это коррелирует с деградацией и исчезновением эндоцитов. При этом фагосомы, в которых находятся эндоциты, сливаются с кислыми вторичными лизосомами. Все эндоциты в слившихся с лизосомами фагосомах становятся TUNEL-позитивными и быстро деградируют (Technau et al., 2003).

1.2.3. Эмбриональное развитие гидры

Эмбриогенез гидры был детально описан Мартин с соавторами (Martin et al., 1997). Наружное оплодотворение происходит после того, как ооцит оканчивает второе деление созревания (Tardent, 1985). Затем яйцо начинает радиально дробиться (Рис. 1.7B-D), причем анимальные бластомеры (лежащие у гидры дистально относительно стенки тела материнского полипа) немного меньше вегетативных. Через 8 часов после

Fig. 1.7 Оогенез и эмбриогенез Hydra А) Женский полип Hydra. Стрелка указывает на яйцевой бугорок - скопление интерстициальных клеток, превращающихся в оогонии. В) Яйцеклетка. С) Первая борозда дробления. D) Дробящиеся зародыши разных стадий. Е) Целобластула. F) Гаструла. G) Стадия формирования шипов. Н) Зародыш на кутикулярной стадии, все еще прикрепленный к материнскому полипу. I) Вылупляющаяся гидра.

оплодотворения образуется целобластула, состоящая из примерно 76 полигональных клеток, окружающих крупную первичную полость (Рис. 1.7Е). Гаструляция происходит в виде иммиграции, начинающейся на анимальном полюсе и волнообразно распространяющейся к вегетативному полюсу. Клетки по одной смещаются в бластоцель и полностью заполняют его. К 12 часам после оплодотворения гаструляция заканчивается (Рис. 1.7F). Результатом иммиграции является напоминающий паренхимулу зародыш, эктодермальный слой которого окружает неорганизованную внутреннюю клеточную массу. Стоит отметить, что подавляющее число эндоцитов каким-то образом оказываются именно в этих внутренних клетках, в то время как

эктодермальные клетки содержат мало эндоцитов. Еще через 12 часов, проходящих без каких-либо видимых изменений, эктодермальные клетки начинают образовывать филоподии и секретируют плотную многослойную кутикулу. Эта, так называемая, «стадия образования шипов» (Рис. 1.7G) длится примерно 24 часа. Когда кутикула окончательно сформирована, филоподии втягиваются, и зародыш достигает покоящейся зимующей стадии, которая может длиться до 24 недель (Рис. 1.7Н). Эта стадия называется кутикулярной. Через некоторое время такой эмбрион отделяется от материнского полипа. Перед вылуплением неорганизованная внутренняя клеточная масса формируется в энтодермальный слой; образуются гастроваскулярная полость, мезоглея, гипостом, щупальца и подошва. После окончания всех этих морфогенетических событий молодая гидра начинает сжиматься и разжиматься до тех пор, пока ей не удается вылупиться через разрыв в кутикуле (Рис 1.71). Молодые полипы имеют все соматические производные интерстициальных клеток и способны охотиться, поглощать и переваривать пищу. Они могут регенерировать так же хорошо, как и взрослые гидры. На нынешний момент не известно эффективных физических или химических индукторов вылупления.

1.2.4. Формирование паттерна у взрослых животных: система

позиционной информации

Как уже упоминалось, формирование паттерна происходит у гидры постоянно. Поток клеток в почки, голову и ногу требует перманентного строгого контроля со стороны стабильной системы позиционной информации. Действие этой системы было досконально изучено, благодаря способности полипа к регенерации частей тела в ходе морфаллактического процесса. Результаты множества экспериментов с пересадками позволили Альфреду Гиреру и Хансу Майнхардту применить модель реакции-диффузии Алана Тьюринга для описания морфогенетических процессов у гидры (Gierer and Meinhardt, 1972). Постулируется, что голова и нога являются источниками пар морфогенетических градиентов: крутого локального градиента активатора спецификации головы (или ноги) и пологого градиента ингибитора спецификации головы (или ноги), захватывающего большую территорию. Клетки, производящие активатор, индуцируют своих ближайших соседей также начать производить активатор но, в то же время и ингибитор. Если предположить, что активатор плохо

диффундирует, а ингибитор, напротив, диффундирует хорошо, то вокруг исходного источника активатора создается область его высокой концентрации, в то время как легко диффундирующий ингибитор распространяется значительно дальше и подавляет синтез активатора везде кроме исходной зоны активации. Последующее развитие модели Майнхардтом (Meinhardt, 1993) постулировало наличие градиента «плотности источников», описывающего способность ткани производить активатор. Существование плотности источников хорошо объясняет, почему полип с ампутированной головой и ногой всегда регенерирует голову на бывшем апикальном конце, а ногу - на бывшем базальном конце, а не наоборот.

Количество активатора и ингибитора в каждой точке тела гидры воспринимается клетками как «позиционное значение», причем голова имеет наибольшее, а нога наименьшее позиционное значение. Изменение позиционного значения (или плотности источников в модели Майнхардта) легко проследить по изменению способности ткани к регенерации головы: чем ближе к бывшей голове была самая апикальная часть декапитированной культи, тем быстрее она регенерирует голову, и тем раньше она начинает экспрессировать маркерные гены головы. Клетки реагируют на изменения позиционного значения, изменяя свое дифференциационное состояние. Голова и нога играют роль организующих центров и, в сущности, сами устанавливают систему позиционных значений. Это можно наблюдать в экспериментах с пересадками, поскольку латерально пересаженные в гастральный отдел гидрам-реципиентам головы и ноги индуцируют респецификацию окружающих тканей и образование эктопической оси (Berking, 1981; MacWilliams, 1982). Оба клеточных слоя гидры вносят вклад в формирование системы позиционных координат. Это было продемонстрировано в исключительно элегантном эксперименте Смид и Тарданом (Smid and Tardent, 1982). У гидры ампутировались голова и нога, и полученный цилиндрический фрагмент обрабатывался прокаином. Такая обработка позволяла отделить эктодерму от энтодермы, не нарушая их целостности. Затем энтодермальный фрагмент разворачивался на 180° и вставлялся обратно в эктодермальную трубку. Из 33 экспериментальных культей 8 регенерировали голову с апикальной стороны эктодермапьного фрагмента, 3 регенерировали голову с апикальной стороны энтодермального фрагмента, а 22 сформировали новую ось, перпендикулярную исходной, так что голова сформировалась в том месте, где суммарное позиционное значение эктодермы и энтодермы было максимальным.

На систему позиционных значений могут оказывать влияние различные вещества. Форболовые эфиры, диацилглицерол, арахидоновая кислота, к примеру, увеличивают позиционное значение, что приводит к формированию у обработанных этими веществами животных эктопических голов или отдельных эктопических щупальцев (Müller, 1989; Müller, 1990; Weinziger et al., 1994). Хлорид лития, напротив, понижает позиционное значение, приводя к образованию эктопических ног (Hassel et al., 1993). Таким же действием обладают пептиды педибин и Нут 346 (Grens et al., 1996).

Система позиционных значений предопределяет морфологию гидры, так как разные регуляторные гены и гены-реализаторы включаются и выключаются в зависимости от позиции клетки в теле полипа. Основываясь на экспрессии генов, можно сказать, что существует пять отчетливых отделов тела гидры: гипостом, зона формирования щупальцев и основания щупальцев, гастральный отдел, стебелек и подошва. Что может играть роль физического носителя позиционной информации, остается, в значительной степени, невыясненным. Изменения в составе внеклеточного матрикса могут участвовать в обеспечении клеток молекулярными адресами. Известны гены астациновых металлопротеиназ матрикса, которые у гидры дифференциально экспрессируются в зависимости от положения относительно апикально-базальной оси и могут играть роль в зависимой от позиции вдоль оси тела модификации внеклеточного матрикса. Например, ген НМР-1 экспрессируются энтодермальными железистыми клетками в виде градиента от головы к ноге, а кодируемый им белок формирует градиент, соответствующий градиенту мРНК. При отрезании головы экспрессия НМР-1 возрастает в первые два часа после операции (Yan et al., 1995; Yan et al., 2000a). В отличие от НМР-1, НМР-2 формирует противонаправленный градиент (Yan et al., 2000b), но его белок равномерно распределен вдоль всего тела гидры до самых оснований щупальцев. Наконец, Farm 1 экспрессируется везде кроме головы и ноги и является чувствительным к понижению позиционных значений хлоридом лития и педибином (Kumpfmüller et al., 1999).

Похожие диссертационные работы по специальности «Биологические науки», 03.00.00 шифр ВАК

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.