MtLEC1, MtLEC1-like и их партнеры в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Поценковская Элина Андреевна

• Поценковская Элина Андреевна
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Поценковская Элина Андреевна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Механизмы регенерации у растений in vitro

1.1.1 Механизмы формирования каллуса

1.1.2 Механизмы регуляции соматического эмбриогенеза

1.2 Регуляция соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula

1.3 Транскрипционные факторы NF-Y

1.3.1 LEC1 и L1L

Заключение

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Растительный материал

2.2 Условия выращивания растений in vivo и in vitro

2.3 Штаммы микроорганизмов

2.4 Условия выращивания микроорганизмов

2.5 Агробактериальная трансформация растений

2.6 Молекулярно-биологические методы

2.6.1 Выделение РНК и ДНК

2.6.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.6.3 Клонирование

2.6.4 Редактирование генома растений

2.6.5 Трансформация микроорганизмов

2.6.6 Двугибридный анализ

2.7 Статистические и биоинформатические методы и компьютерные программы, используемые в работе

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Анализ функций генов MtLECl и MtLIL в соматическом эмбриогенезе

3.1.1 Оценка динамики экспрессии генов MtLECl и MtLlL

3.1.2 Анализ редактированных растений с потерей функции гена MtLECl

3.1.2.1 Получение редактированных растений с потерей функции гена MtLECl

3.1.2.2 Анализ потомков нередактированных растений, несущих в геноме трансгенную вставку для редактирования

3.1.2.3 Анализ редактированных потомков Т и Т2

3.1.2.4 Оценка влияния потери функции MtLEC1 на соматический эмбриогенез

3.1.2.5 Выводы и обсуждение

3.1.3 Оценка влияния сверхэкспрессии генов MtLEC1 и MtL1L на соматический эмбриогенез

3.1.3.1 Оценка влияния сверхэкспрессии MtLEC1 и MtL1L на соматический эмбриогенез в каллусах To

3.1.3.2 Оценка влияния сверхэкспрессии MtLEC1 на соматический эмбриогенез в каллусах T1

3.1.3.3 Выводы и обсуждение

3.2 Поиск генов MtNF-YA и MtNF-YC, функционирующих в ходе соматического эмбриогенеза у M. truncatula

3.2.1 Анализ экспрессии генов MtNF-YA и MtNF-YC в различных органах и тканях растений in vivo и in vitro

3.2.1.1 Анализ характера экспрессии генов MtNF-YA и MtNF-YC в различных тканях и органах растений с использованием баз данных

3.2.1.2 Анализ уровней экспрессии генов MtNF-YA и MtNF-YC в эмбриогенных каллусах

3.2.1.3 Анализ динамики экспрессии генов MtNF-YA и MtNF-YC в ходе соматического эмбриогенеза с помощью ПЦР в реальном времени

3.2.1.4 Количественный анализ экспрессии генов MtNF-YA и MtNF-YC в каллусах To со сверхэкспрессией MtLEC1 и ML1L

3.2.2 Оценка влияния сверхэкспрессии гена MtNF-YA3 на каллусогенез, соматический эмбриогенез и экспрессию других генов NF-Y в каллусах To

3.2.3 Выводы и обсуждение

3.3 Поиск партнеров MtLEC1 и MtL1L среди субъединиц MtNF-YA и MtNF-YC

3.3.1 Поиск взаимодействующих субъединиц NF-Y с помощью дрожжевой двугибридной системы

3.3.2 Анализ влияния на эмбриогенность коэкспрессии генов, кодирующих белки MtNF-Y, способные к взаимодействию с MtLEC1 и/или MtL1L

3.3.3 Выводы и обсуждение

Заключение

Выводы

Список литературы

Благодарности

Приложение

Список сокращений

2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

ABI3 - ABSCISSIC ACID INSENSITIVE

AREB3 - ABA-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN

BiFC - Bimolecular Fluorescence Complementation

bHLH - Basic Helix-Loop-Helix

bZIP - Basic Leucine Zipper

CRISPR - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CO - CONSTANS

EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assay

FT - FLOWERING LOCUS-T

FUS3 - FUSCA3

HFD - Histon Fold Domain

L1L - LECl-like

LEC1 - LEAFY COTYLEDON

LEC2 - LEAFY COTYLEDON

PIF4 - PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR4

SERK1 - SOMATIC EMBRYOGENESIS RELATED KINASE

WUS - WUSCHEL

АБК - абсцизовая кислота

АФК - активные формы кислорода

БАП - 6-бензиламинопурин

ЗЭ -зиготический эмбриогенез

НУК - 1-нафтилуксусная кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени СЭ - соматический эмбриогенез ТФ - Транскрипционный фактор

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «MtLEC1, MtLEC1-like и их партнеры в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula»

Актуальность темы исследования

Соматический эмбриогенез (СЭ) - это способ регенерации, в ходе которого растения формируют из соматических клеток биполярные эмбрионоподобные структуры. Как и обычные эмбрионы, эти структуры способны развиваться в новые растения (Elhiti, Stasolla, 2022). СЭ имеет большое значение для биотехнологии растений, где используется для трансформации растений и получения искусственных семян. Также этот процесс используют в качестве модели для изучения зиготического эмбриогенеза и регенерации в фундаментальных исследованиях.

Зернобобовые культуры, такие как горох, каян, бобы, арахис и соя, являются азотфиксаторами и источником диетического белка. Существует необходимость в улучшении зернобобовых культур: необходимы сорта, устойчивые к биотическим и абиотическим стрессам и имеющие более высокие качество и количество белка. Внедрение желаемых признаков с использованием технологий модификации генома позволит расширить возможности применения этих видов и повысить их урожайность (Dahl et al., 2012). Тем не менее, применение обычных протоколов трансформации растений для большинства зернобобовых затруднено, что объясняется низкой способностью к регенерации (Pratap et al., 2018). В связи с этим, изучение молекулярно-генетического контроля регенерации, в частности, соматического эмбриогенеза, и поиск способов стимуляции регенерации у бобовых являются актуальными направлениями исследований.

Степень разработанности темы исследования

Существуют растения, для которых разработаны протоколы получения соматических эмбрионов или регенерации побегов in vitro, но многие виды, линии и сорта остаются невосприимчивыми к любому типу

стимуляции регенерации, что часто делает невозможным их трансформацию и размножение in vitro. В настоящее время публикуется большое количество исследований генов, участвующих в регуляции СЭ, в частности - из-за возможности использования этих регуляторов для оптимизации и разработки методов трансформации и размножения различных видов растений.

К уже известным стимуляторам СЭ и/или регенерации побегов относятся гомеодомен-содержащий транскрипционный фактор (ТФ) WUSCHEL из семейства WOX у A. thaliana (Zuo et al., 2002), ТФ BABY BOOM из семейства AP2/ERF у Brassica napus (Boutilier et al., 2002), белки A. thaliana SOMATIC EMBRYOGENESIS RELATED KINASE 1 (SERK1) (Hecht et al., 2001), ТФ LEAFY COTYLEDON 1 (LEC1) (Lotan et al., 1998), PLETHORA (PLT5), WOUND-INDUCED DEDIFFERENTIATION1 (WIND1) (Lian et al., 2022) и GROWTH-REGULATING FACTOR5 TFs (Kong et al., 2020), а также их ортологи у других видов (Gulzar et al., 2020). Недавно было разработано несколько быстрых и эффективных протоколов трансформации Zea mays (Lowe et al., 2018), Nicotiana benthamiana (Maher et al., 2020), Triticum aestivum (Debernardi et al., 2020) и других видов (Gordon-Kamm et al., 2019) с использованием эктопической экспрессии морфогенетических регуляторов. Тем не менее, подобные подходы к регенерации и трансформации многочисленных видов растений, включая бобовые, все еще не разработаны.

Транскрипционный фактор LEC1, наряду с его близким гомологом LEC1-LIKE (L1L), является важным участником регуляции СЭ. Эктопическая экспрессия LEC1 или его ортологов вызывает формирование соматических эмбрионов (Brand et al., 2019; Lotan et al., 1998), а специфическая экспрессия этих генов или их ортологов во время СЭ была показана для многих видов растений (Brand et al., 2019; Rupps et al., 2016).

LECl и LlL также являются ключевыми регуляторами развития зиготического эмбриона и формирования семян в целом. Масштабный поиск мишеней LEC1 в семенах показал, что он напрямую регулирует экспрессию различных групп генов на разных стадиях эмбрионального развития, включая гены, связанные с эмбриональным морфогенезом, фотосинтезом и созреванием семян (Pelletier et al., 2017).

LEC1 и L1L являются членами семейства NF-YB. Белки NF-YB вместе с субъединицами семейств NF-YA и NF-YC способны образовывать тримерный транскрипционный фактор NF-Y, консервативный среди эукариот (Zhao et al., 2017).

Большинство исследователей в работах по участию генов NF-Y в эмбриогенезе сосредотачиваются на двух паралогах NF-YB: LECl и LlL. Однако, также было показано, что эктопическая экспрессия четырех генов NF-YA (NF-YAl, 5, в и 9), приводит к образованию вегетативной ткани с эмбриональными признаками, позволяя предположить, что эти гены также могут быть регуляторами эмбрионального развития (Mu et al., 2013). Также генетический анализ показал участие NF-YA2, 3 и 8 в развитии суспензоров и эмбрионов (Fornari et al., 2013). У O. sativa эктопическая экспрессия или нокаут OsNF-YA8 нарушают развитие семян, что проявляется в уменьшении размера семян и увеличении количества меловых зерен (хрупких, недозрелых с мучнистой консистенцией), при этом фенотипическое проявление мутаций аналогично эффекту мутаций в ортологах LECl и LlL у риса (Niu et al., 2023). Также для LEC1/L1L и NF-YC2 было показано совместное участие в регуляции зиготического эмбриогенеза (Yamamoto et al., 2009).

Эти данные позволяют предположить, что LEC1 и L1L, а также их ортологи, взаимодействуют с другими субъединицами из группы NF-Y, образуя комплекс NF-Y, участвующий в регуляции СЭ. Люцерна (Medicago

truncatula), модельное бобовое растение, широко используется для изучения СЭ (Iantcheva и Revalska, 2018; Rose, 2019). Люцерна обладает удобными для проведения биотехнологических экспериментов характеристиками, такими как самоопыление, короткий жизненный цикл (2-3 месяца) и секвенированный геном. Для этого вида также были получены линии с повышенной способностью к СЭ из различных неэмбриогенных линий (Hoffmann et al., 1997; Rose et al., 1999; Santos и Fevereiro, 2002).

Ранее в ходе выполнения магистерской диссертации были обнаружены гены, кодирующие транскрипционные факторы из семейства NF-Y у M. truncatula (MtNF-Y) и активно экспрессирующиеся в ходе СЭ, в том числе гены MtLEC1 и MtL1L. Также с помощью дрожжевой двугибридной системы была выявлена способность к взаимодействию некоторых белков MtNF-Y друг с другом. В настоящем исследовании мы более подробно изучили функции гена MtLECl и взаимодействие его белкового продукта с другими белками NF-Y.

Цели и задачи диссертационного исследования

Целью данного исследования является изучение роли MtLEC1, MtLEC1-like и генов из групп MtNF-YA и MtNF-YC в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Анализ функций генов MtLEC1 и MtL1L в соматическом

эмбриогенезе

1.1. Получение редактированных растений с потерей функции гена MtLEC1 и анализ их способности к соматическому эмбриогенезу

1.2. Оценка влияния сверхэкспрессии генов MtLEC1 и MtL1L на соматический эмбриогенез

2. Поиск генов MtNF-YA и MtNF-YC, функционирующих в ходе

соматического эмбриогенеза у M. truncatula

2.1. Анализ экспрессии генов MtNF-YA и MtNF-YC в различных органах и тканях растений in vivo и in vitro

2.1.1. Анализ характера экспрессии генов MtNF-YA и MtNF-YC в различных тканях и органах растений с использованием баз данных

2.1.2. Анализ уровней экспрессии генов MtNF-YA и MtNF-YC в эмбриогенных каллусах.

2.1.3. Анализ динамики экспрессии генов MtNF-YA и MtNF-YC в ходе соматического эмбриогенеза с помощью ПЦР в реальном времени

2.1.4. Количественный анализ экспрессии генов MtNF-YA и MtNF-YC в каллусах To со сверхэкспрессией MtLEC1 и MtL1L

2.2. Оценка влияния сверхэкспрессии гена MtNF-YA3 на каллусогенез, соматический эмбриогенез и экспрессию других генов NF-Y в каллусах To

3. Поиск партнеров MtLEC1 и MtL1L среди субъединиц MtNF-YA и

MtNF-YC

3.1. Поиск взаимодействующих субъединиц NF-Y с помощью дрожжевой двугибридной системы

3.2. Анализ влияния на эмбриогенность коэкспрессии генов, кодирующих белки MtNF-Y, способные к взаимодействию c MtLEC1 и/или MtL1L

Методология и методы диссертационного исследования

Работа выполнена с использованием молекулярно-биологических методов: клонирование генов методами Gateway и Golden Gate, выделение ДНК и РНК, обратная транскрипция, ПЦР, ПЦР в реальном времени, рестрикционный анализ, дрожжевая двугибридная система, трансформация дрожжей, бактерий и растений, редактирование растений с помощью CRISPR/Cas; методы культивирования растений in vitro в жидкой и на твердой среде; компьютерные программы: Snapgene, Ugene, MEGA, Ape и RStudio (использовались для работы с последовательностями ДНК in silico, филогенетического анализа, а также для статистической обработки и визуализации данных).

Степень достоверности и апробации результатов

Достоверность экспериментальных данных, представленных в диссертации, подтверждается воспроизводимостью результатов экспериментов и доказана с помощью методов математической статистики.

Результаты, описанные в исследовании, представлены в 3 исследовательских статьях, 2 публикациях по материалам конференции и одним свидетельством о государственной регистрации программы для ЭВМ, зарегистрированным в Реестре программ для ЭВМ:

1. Potsenkovskaia, E.A., Tvorogova, V.E., Simonova, V.Y., Konstantinov, Z.S., Kiseleva, A.S., Matveenko, A.G., Brynchikova, A.V., Lutova, L.A., 2024. CRISPR-Based Editing of the Medicago truncatula LEC1 Gene. Plants, 13, 3226. https://doi.org/10.3390/plants13223226, Scopus Q1

2. Творогова В.Е., Поценковская Э.А., 2023. Программа для поиска наиболее опасных нецелевых мишеней для геномного редактирования. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ 2023685244

https://fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=EVM&DocNumber=2 023685244&TypeFile=html.

3. Potsenkovskaia, E., Tvorogova, V., Yakovleva, D., Zlydneva, N., Lutova, L., 2022. Novel NF-Y genes expressed during somatic embryogenesis in Medicago truncatula. Plant Gene 31, 100364. https://doi.org/10.1016/i.plgene.2022.100364, Scopus Q2

4. Tvorogova, V. E., Krasnoperova, E.Y., Kudriashov, A.A., Kuznetsova, K.A., Potsenkovskaya, E.A., Fedorova, Y.A., Lutova, L.A., 2019. Transcriptomic analysis of Medicago truncatula calli with MtWOX9-1 overexpression. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii 23, 691-699. https://doi.org/10.18699/VJ19.542, ВАК K1, Scopus Q2

Также работа была представлена на 7 конференциях в виде устных и стендовых докладов. Опубликованы материалы двух конференций:

1. Potsenkovskaia, E.A., Tvorogova, V.E., Lutova, L.A., 2022. NF-Y genes in the somatic embryo development. Ecological genetics. K1, Q4

2. Potsenkovskaia, E., Tvorogova, V., Lebedeva, M., Lutova, L., 2020. Somatic Embryogenesis Regulators in Medicago truncatula. IN VITRO CELLULAR & DEVELOPMENTAL BIOLOGY-ANIMA, https://publons.com/wos-op/publon/36202281/ , Q3;

Иные публикации, близкие к теме диссертации:

1. Krasnoperova, E.Y., Tvorogova, V.E., Smirnov, K.V., Efremova, E.P., Potsenkovskaia, E.A., Artemiuk, A.M., Konstantinov, Z.S., Simonova, V.Y., Brynchikova, A.V., Yakovleva, D.V., Pavlova, D.B., Lutova, L.A., 2023. MtWOX2 and MtWOX9-1 Effects on the Embryogenic Callus Transcriptome in Medicago truncatula. Plants 13, 102. https://doi.org/10.3390/plants13010102, Q1

2. Tvorogova, V.E., Fedorova, Y.A., Potsenkovskaya, E.A., Kudriashov, A.A., Efremova, E.P., Kvitkovskaya, V.A., Wolabu, T.W., Zhang, F., Tadege, M., Lutova, L.A., 2019. The WUSCHEL-related homeobox transcription factor MtWOX9-1 stimulates somatic embryogenesis in Medicago truncatula. Plant Cell Tiss Organ Cult 138, 517-527. https://doi.org/10.1007/s11240-019-01648-w, Q1

Работа выполнена при поддержке Гранта Министерства Науки и Высшего Образования РФ в форме субсидий для создания и развития научного центра мирового уровня "Агротехнологии Будущего" № 075-15-2022-322 (2020-2023).

Научная новизна

В рамках данного исследования впервые были получены редактированные растения с потерей функции ортолога гена LECl у модельного объекта из семейства бобовых — Medicago truncatula. Этот результат является важным шагом в изучении молекулярных механизмов регуляции соматического эмбриогенеза у представителей этого семейства. До настоящего времени мутанты с потерей функции гена LECl или его паралогов и ортологов, были получены только для двух видов — Arabidopsis thaliana (крестоцветные) и Oryza sativa (злаковые), что ограничивало возможности сравнительного анализа механизмов регуляции соматического эмбриогенеза у различных таксонов растений (Guo et al., 2022; Lotan et al., 1998; Niu et al., 2021).

В результате исследования получены новые данные о способности к взаимодействию белков M. truncatula, относящихся к группе NF-Y, которые играют важную роль в регуляции процессов соматического эмбриогенеза ^Э). Кроме того, впервые была оценена роль генов MtLECl, MtLlL и MtNF-YA3 в процессе CЭ у M. truncatula.

Теоретическая и практическая значимость полученных результатов

Результаты исследования расширяют представления о молекулярных механизмах регуляции СЭ, дополняя их данными о функциях ортолога LEC1 у модельного бобового растения M. truncatula. Выявление способности к взаимодействию продукта данного гена с белками из семейств MtNF-YA и MtNF-YC открывает новые перспективы для изучения механизмов формирования эмбриональной компетентности клеток растений.

Практическая значимость работы обусловлена широким применением СЭ в современных биотехнологических подходах, включая генетическую трансформацию и микроклональное размножение растений для нужд сельского хозяйства и промышленности. Полученные результаты, раскрывающие механизмы регуляции СЭ, дополняют базу для разработки более эффективных протоколов индукции СЭ in vitro. Кроме того, данные исследования создают основу для разработки новых биотехнологических методов, направленных на увеличение продуктивности и устойчивости растений, что особенно важно в условиях изменения климата и роста потребностей в растительных ресурсах.

Основные научные результаты

1. Получена линия растений с потерей функции гена MtLEC1 с помощью технологии геномного редактирования CRISPR/Cas9 (Potsenkovskaia et al., 2024; основные результаты представлены на страницах 3-8; степень личного участия 80%: получение растительного материала, подбор мишеней для редактирования, получение конструкций для трансформации растений, трансформация эксплантов, получение регенерантов, in silico анализ, статистический анализ, анализ полученных данных, написание 12 из

15 страниц текста статьи, подготовка статьи к публикации; Творогова и Поценковская, 2023; основные результаты представлены на страницах 1; степень личного участия 50%: написание и тестирование программы поиска наиболее опасных нецелевых мишеней для редактирования)

2. Потеря функции MtLEC1 значительно уменьшает способность растений к соматическому эмбриогенезу in vitro. (Potsenkovskaia et al., 2024; основные результаты представлены на страницах 6-8; степень личного участия 80%: подготовка растительного материала, получение каллусов, оценка эмбриогенности каллусов и анализ полученных данных, написание 12 из 15 страниц текста статьи, подготовка статьи к публикации)

3. Белки MtNF-YA3, MtNF-YA4, MtNF-YA8, MtNF-YC1, MtNF-YC2, MtNF-YC3 способны образовывать комплексы с MtLECl и/или MtLlL в дрожжевой двугибридной системе. Кроме того, MtNF-YA3, MtNF-YA4 и MtNF-YA8 способны взаимодействовать с MtNF-YC1, MtNF-YC2, MtNF-YC3 в дрожжевой двугибридной системе. (Potsenkovskaia et al., 2022; основные результаты представлены на страницах 5-8; степень личного участия 80%: получение конструкций для трансформации дрожжей, постановка эксперимента с дрожжевой двугибридной системой в четырех повторностях, статистический анализ, in silico анализ, анализ полученных данных, написание 9 из 12 страниц текста статьи, подготовка статьи к публикации)

4. Некоторые гены семейства MtNF-YA и MtNF-YC экспрессируются в ходе СЭ и в развивающихся семенах (Potsenkovskaia et al., 2022; основные результаты представлены на страницах 3-6; степень личного участия 80%: анализ экспрессии в базах данных, количественный анализ qPCR, получение каллусов эксплантов

эмбриогенных и неэмбриогенных линий, анализ полученных данных, написание 9 из 12 страниц текста статьи, подготовка статьи к публикации; Tvorogova et а1., 2019Ь; основные результаты представлены на страницах 693-695; степень личного участия 30%: проанализирован транскриптом каллусов со сверхэкспрессией MtWOX9-1 по сравнению с контрольными каллусами с использованием новой версии генома М. ^псаШа, написание 1 из 9 страниц текста статьи)

5. Сверхэкспрессия MtNF-YA3 приводит к увеличению веса эмбриогенного каллуса, не изменяя при этом количество эмбрионов. (Potsenkovskaia et а1., 2022; основные результаты представлены на страницах 8-9; степень личного участия 80%: получение растительного материала, получение конструкций для трансформации растений, т silico анализ, трансформация эксплантов, оценка эмбриогенности каллусов и анализ полученных данных, статистический анализ, написание 9 из 12 страниц текста статьи, подготовка статьи к публикации)

Положения, выносимые на защиту

1. Ген М^ЕС1, регулирует развитие соматических эмбрионов у Medicago ^ипсаШ1а. Линия растений М. ^ипсаШ1а с потерей функции гена М^ЕС1, полученная с помощью технологии геномного редактирования CRISPR/Cas9, обладает сниженной способностью к образованию соматических эмбрионов.

2. Гены MtNF-YA3, MtNF-YA4, MtNF-YA8, MtNF-YC1, MtNF-YC2, MtNF-YC3 экспрессируются в ходе соматического эмбриогенеза, а их белковые продукты способны образовывать комплексы с белком М1ЬЕС1 и/или с его паралогом в гетерологичной системе.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Механизмы регенерации у растений in vitro

Регенерация растений in vitro - это процесс, в ходе которого клетки эксплантов (фрагментов тканей или органов растения) пролиферируют, образуют новые ткани и органы и в конечном счете формируют полноценное растение (Birnbaum и Alvarado, 2008; Dinneny и Benfey, 2008). Исследования растительных клеток и культур тканей in vitro начались к 1902 году, когда Готлиб Хаберланд представил гипотезу тотипотентности, согласно которой каждая клетка обладает всей генетической информацией, необходимой для создания полноценного растения (Feher, 2019; Haberlandt, 1902; Лутова, 2003). Возможность культивирования изолированных органов растений впервые была показана в 1922 году, а затем, в 1930-1940е годы была продемонстрирована способность культуры клеток к неограниченно долгому росту (Бутенко, 1999). Позже было обнаружено, что соотношение гормонов в среде для культивирования определяет морфогенетический путь, по которому пойдет культивируемая in vitro ткань: высокое и низкое соотношение цитокининов и ауксинов способствовало регенерации побегов и корней, соответственно, в то время как более сбалансированные концентрации этих гормонов приводили к неорганизованному росту клеточной массы и формированию каллуса (Skoog и Miller, 1957). В конце 1950-х годов было показано, что помимо последовательного органогенеза побегов и корней целые растения могут быть восстановлены из культивируемых растительных клеток только за один шаг путем формирования эмбриоидов (Reinert, 1959; Steward et al., 1958). Позднее этот путь был назван соматическим эмбриогенезом, и было обнаружено, что возможно развитие эмбрионоподобных структур из единичных соматических клеток (Backs-Hüsemann и Reinert, 1970).

Основным отличием регенерирующих побегов от соматических эмбрионов (эмбриоидов) является биполярная структура последних: для эмбриоида характерно наличие собственной оси, новой по отношению к материнскому организму, которая соединяет зачатки апексов побега и корня. В то же время почки регенерирующих побегов являются монополярными структурами, имеющими только апекс побега и связанными с материнским организмом (Батыгина et al., 2010).

Таким образом, регенерация растений in vitro может осуществляться путем соматического эмбриогенеза или органогенеза. При этом растения регенерируют из культивируемых in vitro клеток либо напрямую, либо опосредованно (через образование каллуса) (Perez-Garcia и Moreno-Risueno, 2018).

1.1.1 Механизмы формирования каллуса

Каллус - ткань, возникшая в результате неорганизованной пролиферации клеток органов растений (Лутова, 2003). Развитие каллуса может быть индуцировано экзогенным ауксином, другими гормонами или поранением. Аналогично примордиям боковых корней, образование каллуса под действием ауксина (при инкубации на среде для индукции каллуса, CIM; Valvekens et al., 1992) может начинаться в стволовых клетках перицикла и в таком случае не требует предшествующей дедифференцировки соматических клеток (Atta et al., 2009; Sugimoto et al., 2011, 2010). Помимо ауксина, каллус может образовываться в ответ на другие гормоны или поранение (обзор Ikeuchi et al., 2013). Ранение повышает уровень биосинтеза цитокинина, что приводит к активации пролиферации клеток и образованию каллуса. У A. thaliana. Образование каллусов, вызванных поранением, регулируется транскрипционными факторами WOUND-INDUCED

DEDIFFERENTIATION (WIND) 1-4 (Ikeuchi et al., 2017, 2016, 2013; Iwase et

al., 2015, 2011a, 2011b). Было обнаружено, что пути формирования каллуса, индуцированные ауксином и поранением, сходятся в одной и той же сети регуляции генов, основными элементами которой являются факторы транскрипции PLETHORA3 (PLT3), ENHANCER OF SHOOT REGENERATION 1 (ESR1) и HEAT SHOCK FACTOR B 1 (HSFB1) (Ikeuchi et al., 2018). Каллус гетерогенен и может содержать плюри- или тотипотентные клетки. Плюрипотентные клетки способны дать начало различным, но не всем, типам клеток организма; в частности, плюрипотентными клетками являются стволовые клетки меристем (Verdeil et al., 2007). В то же время тотипотентные клетки могут дать начало всем типам клеток растительного организма (Su и Zhang, 2014; Лутова, 2003).

1.1.2 Механизмы регуляции соматического эмбриогенеза

Одиночные клетки, образующие эмбрионы (эмбриогенные клетки), по определению являются тотипотентными, поскольку эмбрионы могут развиваться до целых растений. У моркови в культуре эксплантов гипокотилей в жидкой среде формирование соматического эмбриона можно проследить от отдельных клеток или небольших клеточных кластеров периваскулярного происхождения (Schmidt et al., 1997). В присутствии синтетического ауксина (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, 2,4-Д) эти клетки формируют проэмбриогенные клеточные массы как переходный этап перед эмбриогенезом. Второй сигнал, удаление ауксина, запускает формирование эмбрионов из проэмбриогенных клеточных масс (De Vries et al., 1988). Процесс регенерации через соматический эмбриогенез показан на рисунке 1.

Соматический эмбриогенез

Экспланты

У/

Почка

О

Прямой соматический эмбриогенез

Лист

Глобула

Сердце

Торпеда

Стадия семядолей

Незрелый эмбрион

Эмбриогенный каллус

Непрямой соматический эмбриогенез

Рисунок 1. Стадии соматического эмбриогенеза. Рисунок взят из статьи Yuan et al., 2024.

Механизмы молекулярно-генетической регуляции непрямого соматического эмбриогенеза были подробно исследованы на A. thaliana. Эмбриогенные каллусы формируются в 2,4-Д-содержащей культуральной среде. При перемещении их на среду со сниженным содержанием ауксина или без него, индуцируется эндогенный синтез ауксина. Синтез происходит в периферической области каллуса за счет экспрессии генов YUCCA (YUC) (Bai et al., 2013). Затем индуцируется синтез белков-переносчиков ауксина PINFORMED1 (PIN1). Их организованная ориентация приводит к накоплению ауксина в периферийных клеточных кластерах. Между ними, в областях, где наблюдается минимум ауксина, начинает экспрессироваться ген, кодирующий регулятор идентичности меристемы побега WUSCHEL (WUS) (Su et al., 2009). На этом раннем этапе индукции развития соматического эмбриона экспрессия WUS-RELATED HOMEOBOX 5 (WOX5), главного регулятора организации корневой меристемы, частично перекрывается с экспрессией WUS (Su et al., 2015). На следующем этапе примордии семядолей формируются в местах максимума ауксина на периферии каллуса. В это время можно обнаружить накопление цитокинина ниже области экспрессии WUS, и экспрессия WOX5 ограничивается этой богатой цитокинином областью. Место

экспрессии WOX5 связано с появлением корневой меристемы. Таким образом, апикально-базальная ось зародыша формируется еще до появления видимых соматических зародышей (Bai et al., 2013; Su et al., 2009, 2015). Индукция и реорганизация синтеза и распределения гормонов в каллусной ткани приводит к параллельному формированию меристем побега и корня, за которым следует развитие эмбрионоподобной структуры.

К числу классических регуляторов как соматического, так и зиготического эмбриогенеза можно отнести гены ТФ группы LAFL -LEAFY COTYLEDON 2 (LEC2), ABSCISIC ACID INSENSITIVE 3 (ABI3), FUSCA3 (FUS3) и LEAFY COTYLEDON 1 (LEC1). В зиготическом эмбриогенезе эти гены контролируют многие аспекты развития семян, такие как накопление питательных веществ, приобретение толерантности к высыханию, ингибирование роста трихом в семядолях или репрессия синтеза антоцианов (Santos-Mendoza et al., 2008). Кроме того, эти гены вовлечены в СЭ и, обобщая, в инициацию и регуляцию развития эмбриона (Boulard et al., 2018).

К индукторам СЭ также относят ТФ BABYBOOM и его паралог PLETHORA2, которые запускают развитие соматических эмбрионов за счет активации регуляторной сети LAFL (LEC1-ABI3-FUS3-LEC2) у проростков A. thaliana (Horstman et al., 2017). Показано также, что ТФ LEC2 способствует соматическому эмбриогенезу через прямую активацию WOX2 и WOX3 (Wang et al., 2020).

1.2 Регуляция соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula

Для M. truncatula характерен непрямой эмбриогенез, включающий в

себя развитие эмбриогенного каллуса из ткани экспланта на среде, содержащей ауксин и цитокинин: на этом этапе соматические клетки в каллусе приобретают эмбриогенную компетентность. Затем, после переноса каллуса на среду с меньшим содержанием ауксина, некоторые из этих клеток дают начало соматическим зародышам (Rose, 2019). Первые регенеранты M. truncatula были получены с помощью СЭ в 1989 году (Nolan et al., 1989). Была создана специальная высокоэмбриогенная линия (Rose et al., 1999) под названием Jemalong 2HA (2HA) из неэмбриогенной линии Jemalong A17 (A17). Впоследствии были получены две другие линии M. truncatula, у которых также можно было индуцировать СЭ: R108 (Hoffmann et al., 1997) из линии 108-1 и M9-10a (Araújo et al., 2004; Santos и Fevereiro, 2002) из линии M9. Стоит подчеркнуть, что во всех трех случаях высокоэмбриогенные линии были получены из неэмбриогенных за счет одного или двух раундов культивирования, включающих в себя образование каллусов из эксплантов, появление на них (изначально - в крайне редких случаях) соматических эмбрионов, и регенерацию из них взрослых растений. Таким образом были получены линии, способные передавать признак высокой эмбриогенности и в ряду половых поколений. Это позволяет предположить, что у неэмбриогенных линий M.truncatula в ходе культивирования in vitro и образования каллуса часть клеток может претерпевать генетические и/или эпигенетические изменения, приводящие к появлению наследуемой повышенной способности к СЭ (Rose, 2019).

Наличие таких высокоэмбриогенных линий позволяет анализировать изменения в экспрессии генов в эмбриогенных каллусах по сравнению с каллусами близкородственных неэмбриогенных линий. С использованием этой системы была показана специфическая экспрессия во время СЭ

нескольких генов, кодирующих вероятные регуляторы эмбриогенеза, включая транскрипционные факторы семейства B3 - MtLEC2, MtFUSCA3 и MtABI3 (Barreto et al., 2019). Таким образом был обнаружен высокий уровень экспрессии ортологов LEC1 - MtLECl и MtLIL - в каллусах эмбриогенной линии M. truncatula M9-10a по сравнению с каллусами ее предковой неэмбриогенной линии M9 (Orlowska et al., 2017). Также для M. truncatula было показано участие в СЭ других транскрипционных факторов, таких как MtWUSCHEL (Chen et al., 2009), MtWOX9-1 (Kurdyukov et al., 2014; Tvorogova et al., 2019a), ортологов BABYBOOM (Igielski и K^pczynska, 2017) и некоторых других белков: рецепторной киназы SERK1 (Nolan et al., 2003), пептида CLAVATA3 (Chen et al., 2009), метилтрансфераз гистонов TRITORAX (Orlowska и K^pczynska, 2018) и POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX2 (Orlowska et al., 2017).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Поценковская Элина Андреевна, 2026 год

Список литературы

1. Батыгина, Т.Б., Круглова, Н.Н., Горбунова, В.Ю., Титова, Г.Е., Сельдимирова, О.А., 2010. От микроспоры - к сорту, Наука. ed. Москва.

2. Бутенко, Р.Г., 1999. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе, ФБК-ПРЕСС. ed. Москва.

3. Лутова, Л.А., 2003. Биотехнология высших растений. Издательство СПб. ун-та, СПб.

4. Творогова В.Е., Поценковская Э.А., 2023. Программа для поиска наиболее опасных нецелевых мишеней для геномного редактирования. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ 2023685244 https://fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=EVM&DocNumber=2 023685244&TypeFile=html.

5. Albani, D., Robert, L.S., 1995. Cloning and characterization of a Brassica napus gene encoding a homologue of the B subunit of a heteromeric CCAAT-binding factor. Gene 167, 209-213. https://doi.org/10.1016/0378-1119(95)00680-X

6. Araüjo, S.D.S., Duque, A.S.R.L.A., Santos, D.M.M.F.D., Fevereiro, M.P.S., 2004. An Efficient Transformation Method to Regenerate a High Number of Transgenic Plants Using a New Embryogenic Line of Medicago truncatula cv. Jemalong. Plant Cell Tissue Organ Cult. 78, 123-131. https://doi.org/10.1023/B:TICU.0000022540.98231.f8

7. Atta, R., Laurens, L., Boucheron-Dubuisson, E., Guivarc'h, A., Carnero, E., Giraudat-Pautot, V., Rech, P., Chriqui, D., 2009. Pluripotency of Arabidopsis xylem pericycle underlies shoot regeneration from root and hypocotyl explants grown in vitro. Plant J. 57, 626-644. https://doi.org/10.1111/j. 1365-313X.2008.03715 .x

8. Backs-Hüsemann, D., Reinert, J., 1970. Embryobildung durch isolierte Einzelzellen aus Gewebekulturen vonDaucus carota. Protoplasma 70, 49-60. https://doi.org/10.1007/BF01276841

9. Bae, S., Park, J., Kim, J.-S., 2014. Cas-OFFinder: a fast and versatile

algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475.

https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu048

10. Bai, B., Su, Y.H., Yuan, J., Zhang, X.S., 2013. Induction of Somatic Embryos in Arabidopsis Requires Local YUCCA Expression Mediated by the Down-Regulation of Ethylene Biosynthesis. Mol. Plant 6, 1247-1260. https://doi.org/10.1093/mp/sss154

11. Barreto, H.G., Sagio, S.A., Chalfun-Junior, A., Fevereiro, P., Benedito, V.A., 2019. Transcriptional profiling of the AFL subfamily of B3-type transcription factors during the in vitro induction of somatic embryogenesis in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Tissue Organ Cult. PCTOC 139, 327-337. https://doi.org/10.1007/s11240-019-01687-3

12. Baud, S., Mendoza, M.S., To, A., Harscoet, E., Lepiniec, L., Dubreucq, B., 2007. WRINKLED1 specifies the regulatory action of LEAFY COTYLEDON2 towards fatty acid metabolism during seed maturation in Arabidopsis: Oil synthesis regulatory network in seeds. Plant J. 50, 825-838. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2007.03092.x

13. Baudin, M., Laloum, T., Lepage, A., Ripodas, C., Ariel, F., Frances, L., Crespi, M., Gamas, P., Blanco, F.A., Zanetti, M.E., De Carvalho-Niebel, F., Niebel, A., 2015. A phylogenetically conserved group of NF-Y transcription factors interact to control nodulation in legumes. Plant Physiol. pp.01144.2015. https://doi.org/10.1104/pp.15.01144

14. Benedito, V.A., Torres-Jerez, I., Murray, J.D., Andriankaja, A., Allen, S., Kakar, K., Wandrey, M., Verdier, J., Zuber, H., Ott, T., Moreau, S., Niebel, A., Frickey, T., Weiller, G., He, J., Dai, X., Zhao, P.X., Tang, Y., Udvardi, M.K., 2008. A gene expression atlas of the model legume Medicago truncatula. Plant J. 55, 504-513. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2008.03519.x

15. Birnbaum, K.D., Alvarado, A.S., 2008. Slicing across Kingdoms: Regeneration in Plants and Animals. Cell 132, 697-710. https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.01.040

16. Bolger, A.M., Lohse, M., Usadel, B., 2014. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 30, 2114-2120.

https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170

17. Boulard, C., Fatihi, A., Lepiniec, L., Dubreucq, B., 2017. Regulation and evolution of the interaction of the seed B3 transcription factors with NF-Y subunits. Biochim. Biophys. Acta BBA - Gene Regul. Mech. 1860, 1069-1078. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2017.08.008

18. Boulard, C., Thevenin, J., Tranquet, O., Laporte, V., Lepiniec, L., Dubreucq, B., 2018. LEC1 (NF-YB9) directly interacts with LEC2 to control gene expression in seed. Biochim. Biophys. Acta BBA - Gene Regul. Mech. 1861, 443-450. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2018.03.005

19. Boutilier, K., Offringa, R., Sharma, V.K., Kieft, H., Ouellet, T., Zhang, L., Hattori, J., Liu, C.-M., van Lammeren, A.A.M., Miki, B.L.A., Custers, J.B.M., van Lookeren Campagne, M.M., 2002. Ectopic Expression of BABY BOOM Triggers a Conversion from Vegetative to Embryonic Growth. Plant Cell 14, 1737-1749. https://doi.org/10.1105/tpc.001941

20. Brand, A., Quimbaya, M., Tohme, J., Chavarriaga-Aguirre, P., 2019. Arabidopsis LEC1 and LEC2 Orthologous Genes Are Key Regulators of Somatic Embryogenesis in Cassava. Front. Plant Sci. 10, 673. https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00673

21. Braybrook, S., Harada, J., 2008. LECs go crazy in embryo development. Trends Plant Sci. 13, 624-630. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2008.09.008

22. Cagliari, A., Turchetto-Zolet, A.C., Korbes, A.P., Maraschin, F.D.S., Margis, R., Margis-Pinheiro, M., 2014. New insights on the evolution of Leafy cotyledon1 (LEC1) type genes in vascular plants. Genomics 103, 380-387. https://doi.org/10.1016lj.ygeno.2014.03.005

23. Calvenzani, V., Testoni, B., Gusmaroli, G., Lorenzo, M., Gnesutta, N., Petroni, K., Mantovani, R., Tonelli, C., 2012. Interactions and CCAAT-Binding of Arabidopsis thaliana NF-Y Subunits. PLoS ONE 7, e42902. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0042902

24. Cao, S., Kumimoto, R.W., Gnesutta, N., Calogero, A.M., Mantovani, R., Holt, B.F., 2014. A Distal CCAAT /NUCLEAR FACTOR Y Complex Promotes Chromatin Looping at the FLOWERING LOCUS T Promoter

and Regulates the Timing of Flowering in Arabidopsis. Plant Cell 26, 1009-1017. https://doi.org/10.1105/tpc.113.120352

25. Char, S.N., Wei, J., Mu, Q., Li, X., Zhang, Z.J., Yu, J., Yang, B., 2020. An Agrobacterium -delivered CRISPR /Cas9 system for targeted mutagenesis in sorghum. Plant Biotechnol. J. 18, 319-321. https://doi.org/10.1111/pbi. 13229

26. Chaves-Sanjuan, A., Gnesutta, N., Gobbini, A., Martignago, D., Bernardini, A., Fornara, F., Mantovani, R., Nardini, M., 2021. Structural determinants for NF - Y subunit organization and NF - Y/DNA association in plants. Plant J. 105, 49-61. https://doi.org/10.1111/tpj.15038

27. Chen, S.-K., Kurdyukov, S., Kereszt, A., Wang, X.-D., Gresshoff, P.M., Rose, R.J., 2009. The association of homeobox gene expression with stem cell formation and morphogenesis in cultured Medicago truncatula. Planta 230, 827-840. https://doi.org/10.1007/s00425-009-0988-1

28. Curtis, M.D., Grossniklaus, U., 2003. A Gateway Cloning Vector Set for High-Throughput Functional Analysis of Genes in Planta. Plant Physiol. 133, 462-469. https://doi.org/10.1104/pp.103.027979

29. Dahl, W.J., Foster, L.M., Tyler, R.T., 2012. Review of the health benefits of peas ( Pisum sativum L.). Br. J. Nutr. 108, S3-S10. https://doi.org/10.1017/S0007114512000852

30. De Vries, S.C., Booij, H., Meyerink, P., Huisman, G., Wilde, H.D., Thomas, T.L., Van Kammen, A., 1988. Acquisition of embryogenic potential in carrot cell-suspension cultures. Planta 176, 196-204. https://doi.org/10.1007/BF00392445

31. Debernardi, J.M., Tricoli, D.M., Ercoli, M.F., Hayta, S., Ronald, P., Palatnik, J.F., Dubcovsky, J., 2020. A GRF-GIF chimeric protein improves the regeneration efficiency of transgenic plants. Nat. Biotechnol. 38, 1274-1279. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0703-0

32. Dinneny, J.R., Benfey, P.N., 2008. Plant Stem Cell Niches: Standing the Test of Time. Cell 132, 553-557. https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.02.001

33. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C., 1991. A simple and rapid

method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19, 1349-1349. https://doi.org/10.1093/nar/19.6.1349

34. Elhiti, M., Stasolla, C., 2022. Transduction of Signals during Somatic Embryogenesis. Plants 11, 178. https://doi.org/10.3390/plants11020178

35. Engler, C., Youles, M., Gruetzner, R., Ehnert, T.-M., Werner, S., Jones, J.D.G., Patron, N.J., Marillonnet, S., 2014. A Golden Gate Modular Cloning Toolbox for Plants. ACS Synth. Biol. 3, 839-843. https://doi.org/10. 1021/sb4001504

36. Fahraeus, G., 1957. The Infection of Clover Root Hairs by Nodule Bacteria Studied by a Simple Glass Slide Technique. Microbiology 16, 374-381. https://doi.org/10.1099/00221287-16-2-374

37. Feher, A., 2019. Callus, Dedifferentiation, Totipotency, Somatic Embryogenesis: What These Terms Mean in the Era of Molecular Plant Biology? Front. Plant Sci. 10, 536. https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00536

38. Fornari, M., Calvenzani, V., Masiero, S., Tonelli, C., Petroni, K., 2013. The Arabidopsis NF-YA3 and NF-YA8 Genes Are Functionally Redundant and Are Required in Early Embryogenesis. PLoS ONE 8, e82043. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082043

39. Gietz, D.R., Woods, R.A., 2002. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method, in: Methods in Enzymology. Elsevier, pp. 87-96. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(02)50957-5

40. Gnesutta, N., Chiara, M., Bernardini, A., Balestra, M., Horner, D.S., Mantovani, R., 2019. The Plant NF-Y DNA Matrix In Vitro and In Vivo. Plants 8, 406. https://doi.org/10.3390/plants8100406

41. Gnesutta, N., Saad, D., Chaves-Sanjuan, A., Mantovani, R., Nardini, M., 2017. Crystal Structure of the Arabidopsis thaliana L1L/NF-YC3 Histone-fold Dimer Reveals Specificities of the LEC1 Family of NF-Y Subunits in Plants. Mol. Plant 10, 645-648. https://doi.org/10.1016/j .molp.2016.11.006

42.

Gordon-Kamm, B., Sardesai, N., Arling, M., Lowe, K., Hoerster, G.,

Betts, S., Jones, T., 2019. Using Morphogenic Genes to Improve Recovery and Regeneration of Transgenic Plants. Plants 8, 38. https://doi.org/10.3390/plants8020038

43. Green, M.R., Sambrook, J.F., 2012. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor laboratory press, NY.

44. Gulzar, B., Mujib, A., Malik, M.Q., Sayeed, R., Mamgain, J., Ejaz, B., 2020. Genes, proteins and other networks regulating somatic embryogenesis in plants. J. Genet. Eng. Biotechnol. 18, 31. https://doi.org/10.1186/s43141-020-00047-5

45. Guo, F., Zhang, P., Wu, Y., Lian, G., Yang, Z., Liu, W., Buerte, B., Zhou, C., Zhang, W., Li, D., Han, N., Tong, Z., Zhu, M., Xu, L., Chen, M., Bian, H., 2022. Rice LEAFY COTYLEDON1 Hinders Embryo Greening During the Seed Development. Front. Plant Sci. 13, 887980. https://doi.org/10.3389/fpls.2022.887980

46. Gusmaroli, G., Tonelli, C., Mantovani, R., 2001. Regulation of the CCAAT-Binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana. Gene 264, 173-185. https://doi.org/10.1016/S0378-1119(01)00323-7

47. Haberlandt, G., 1902. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen., in: Sitzungser. Mat. Nat. K //Kais. Akad. Wiss., Wien, pp. 69-92.

48. Hackenberg, D., Keetman, U., Grimm, B., 2012a. Homologous NF-YC2 Subunit from Arabidopsis and Tobacco Is Activated by Photooxidative Stress and Induces Flowering. Int. J. Mol. Sci. 13, 3458-3477. https://doi.org/10.3390/ijms13033458

49. Hackenberg, D., Wu, Y., Voigt, A., Adams, R., Schramm, P., Grimm, B., 2012b. Studies on Differential Nuclear Translocation Mechanism and Assembly of the Three Subunits of the Arabidopsis thaliana Transcription Factor NF-Y. Mol. Plant 5, 876-888. https://doi.org/10.1093/mp/ssr107

50. Hecht, V., Vielle-Calzada, J.P., Hartog, M.V., Schmidt, E.D., Boutilier, K., Grossniklaus, U., de Vries, S.C., 2001. The Arabidopsis SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE 1 gene is expressed in developing ovules and embryos and enhances embryogenic competence in culture. Plant Physiol. 127, 803-816.

51. Hoffmann, B., Trinh, T.H., Leung, J., Kondorosi, A., Kondorosi, E., 1997. A New Medicago truncatula Line with Superior in Vitro Regeneration, Transformation, and Symbiotic Properties Isolated Through Cell Culture Selection. Mol. Plant-Microbe Interactions® 10, 307-315. https://doi.org/10.1094/MPML1997.10.3.307

52. Holdsworth, M.J., Bentsink, L., Soppe, W.J.J., 2008. Molecular networks regulating Arabidopsis seed maturation, after-ripening, dormancy and germination. New Phytol. 179, 33-54. https://doi.org/10.1111/j .1469-8137.2008.02437.x

53. Horstman, A., Li, M., Heidmann, I., Weemen, M., Chen, B., Muino, J. M., et al., 2017. The BABY BOOM transcription factor activates the LEC1-ABI3-FUS3-LEC2 network to induce somatic embryogenesis. Plant Physiol. 175, 848-857. doi: 10.1104/PP.17.00232

54. Huang, Junwen, Huang, Junjie, Feng, Q., Shi, Y., Wang, F., Zheng, K., Huang, Q., Jiang, J., Luo, S., Xie, Y., Han, D., Lai, J., Yang, C., 2023. SUMOylation facilitates the assembly of a Nuclear Factor-Y complex to enhance thermotolerance in Arabidopsis. J. Integr. Plant Biol. 65, 692-702. https://doi.org/10.1111/jipb.13396

55. Huang, M., Hu, Y., Liu, X., Li, Y., Hou, X., 2015. Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 Mediates Postembryonic Development via Interacting with PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR4. Plant Cell 27, 3099-3111. https://doi.org/10.1105/tpc. 15.00750

56. Iantcheva, A., Revalska, M., 2018. Early events during the induction of somatic embryogenesis in genera Medicago. Bulg. J. Agric. Sci. 24, 1042-1052.

57. Igielski, R., K^pczynska, E., 2017. Gene expression and metabolite profiling of gibberellin biosynthesis during induction of somatic embryogenesis in Medicago truncatula Gaertn. PLOS ONE 12, e0182055. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182055

58. Ikeuchi, M., Iwase, A., Rymen, B., Lambolez, A., Kojima, M., Takebayashi, Y., Heyman, J., Watanabe, S., Seo, M., De Veylder, L., Sakakibara, H., Sugimoto, K., 2017. Wounding Triggers Callus Formation via Dynamic Hormonal and Transcriptional Changes. Plant Physiol. 175, 1158-1174. https://doi.org/10.1104/pp.17.01035

59. Ikeuchi, M., Ogawa, Y., Iwase, A., Sugimoto, K., 2016. Plant regeneration: cellular origins and molecular mechanisms. Development 143, 1442-1451. https://doi.org/10.1242/dev.134668

60. Ikeuchi, M., Shibata, M., Rymen, B., Iwase, A., Bagman, A.-M., Watt, L., Coleman, D., Favero, D.S., Takahashi, T., Ahnert, S.E., Brady, S.M., Sugimoto, K., 2018. A Gene Regulatory Network for Cellular Reprogramming in Plant Regeneration. Plant Cell Physiol. 59, 770-782. https://doi.org/10. 1093/pcp/pcy013

61. Ikeuchi, M., Sugimoto, K., Iwase, A., 2013. Plant Callus: Mechanisms of Induction and Repression. Plant Cell 25, 3159-3173. https://doi.org/10. 1105/tpc. 113.116053

62. Iwase, A., Mita, K., Nonaka, S., Ikeuchi, M., Koizuka, C., Ohnuma, M., Ezura, H., Imamura, J., Sugimoto, K., 2015. WIND1-based acquisition of regeneration competency in Arabidopsis and rapeseed. J. Plant Res. 128, 3 89-397. https://doi.org/10. 1007/s 10265-015-0714-y

63. Iwase, A., Mitsuda, N., Koyama, T., Hiratsu, K., Kojima, M., Arai, T., Inoue, Y., Seki, M., Sakakibara, H., Sugimoto, K., Ohme-Takagi, M., 2011a. The AP2/ERF Transcription Factor WIND1 Controls Cell Dedifferentiation in Arabidopsis. Curr. Biol. 21, 508-514. https://doi.org/10.1016/j.cub.2011.02.020

64. Iwase, A., Ohme-Takagi, M., Sugimoto, K., 2011b. WIND1: A key molecular switch for plant cell dedifferentiation. Plant Signal. Behav. 6, 1943-1945. https://doi.org/10.4161/psb.6.12.18266

65. Jo, L., Pelletier, J.M., Harada, J.J., 2019. Central role of the LEAFY COTYLEDON1 transcription factor in seed development. J. Integr. Plant Biol. 61, 564-580. https://doi.org/10.1111/jipb.12806

66. Jo, L., Pelletier, J.M., Hsu, S.-W., Baden, R., Goldberg, R.B., Harada, J.J., 2020. Combinatorial interactions of the LEC1 transcription factor specify diverse developmental programs during soybean seed development. Proc. Natl. Acad. Sci. 117, 1223-1232. https://doi.org/10. 1073/pnas. 1918441117

67. Jyothishwaran, G., Kotresha, D., Selvaraj, T., Srideshikan, S.M., Rajvanshi, P.K., Jayabaskaran, C., 2007. A modified freeze-thaw method

for efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens. Curr. Sci 93, 770-772.

68. Kagaya, Y., Okuda, R., Ban, A., Toyoshima, R., Tsutsumida, K., Usui, H., Yamamoto, A., Hattori, T., 2005. Indirect ABA-dependent Regulation of Seed Storage Protein Genes by FUSCA3 Transcription Factor in Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 46, 300-311. https://doi.org/10.1093/pcp/pci031

69. Kaiser, C., Michaelis, S., Mitchell, A., 1994. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbour laboratory press, NY.

70. Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S.L., 2015. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat. Methods 12, 357-360. https://doi.org/10.1038/nmeth.3317

71. Kong, J., Martin-Ortigosa, S., Finer, J., Orchard, N., Gunadi, A., Batts, L.A., Thakare, D., Rush, B., Schmitz, O., Stuiver, M., Olhoft, P., Pacheco-Villalobos, D., 2020. Overexpression of the Transcription Factor GROWTH-REGULATING FACTOR5 Improves Transformation of Dicot and Monocot Species. Front. Plant Sci. 11, 572319. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.572319

72. Kopylova, E., Noé, L., Touzet, H., 2012. SortMeRNA: fast and accurate filtering of ribosomal RNAs in metatranscriptomic data. Bioinformatics 28, 3211-3217. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts611

73. Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., Tamura, K., 2018. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Mol. Biol. Evol. 35, 1547-1549. https://doi.org/10.1093/molbev/msy096

74. Kumimoto, R.W., Adam, L., Hymus, G.J., Repetti, P.P., Reuber, T.L., Marion, C.M., Hempel, F.D., Ratcliffe, O.J., 2008. The Nuclear Factor Y subunits NF-YB2 and NF-YB3 play additive roles in the promotion of flowering by inductive long-day photoperiods in Arabidopsis. Planta 228, 709-723. https://doi.org/10.1007/s00425-008-0773-6

75. Kumimoto, R.W., Zhang, Y., Siefers, N., Holt, B.F., 2010. NF-YC3, NF-YC4 and NF-YC9 are required for CONSTANS-mediated, photoperiod-dependent flowering in Arabidopsis thaliana: NF-YC function in flowering time. Plant J. 63, 379-391.

https://doi.Org/10.1111/j.1365-313X.2010.04247.x

76. Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M.B., Rose, R.J., 2014. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33, 349-362. https://doi.org/10.1007/s00299-013-1535-x

77. Kwong, R.W., Bui, A.Q., Lee, H., Kwong, L.W., Fischer, R.L., Goldberg, R.B., Harada, J.J., 2003. LEAFY COTYLEDON1 -LIKE Defines a Class of Regulators Essential for Embryo Development. Plant Cell 15, 5-18. https://doi.org/10.1105/tpc.006973

78. Laloum, T., De Mita, S., Gamas, P., Baudin, M., Niebel, A., 2013. CCAAT-box binding transcription factors in plants: Y so many? Trends Plant Sci. 18, 157-166. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2012.07.004

79. Lee, H., Fischer, R.L., Goldberg, R.B., Harada, J.J., 2003. Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 represents a functionally specialized subunit of the CCAAT binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 2152-2156. https://doi.org/10.1073/pnas.0437909100

80. Leyva-González, M.A., Ibarra-Laclette, E., Cruz-Ramírez, A., Herrera-Estrella, L., 2012. Functional and Transcriptome Analysis Reveals an Acclimatization Strategy for Abiotic Stress Tolerance Mediated by Arabidopsis NF-YA Family Members. PLoS ONE 7, e48138. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0048138

81. Li, C., Distelfeld, A., Comis, A., Dubcovsky, J., 2011. Wheat flowering repressor VRN2 and promoter CO2 compete for interactions with NUCLEAR FACTOR-Y complexes. Plant J. 67, 763-773. https://doi.org/10.1111/j. 1365-313X.2011.04630.x

82. Li, G., Zhao, H., Wang, L., Wang, Y., Guo, X., Xu, B., 2018. The animal nuclear factor Y: an enigmatic and important heterotrimeric transcription factor. Am. J. Cancer Res. 8, 1106-1125.

83. Li, W.-X., Oono, Y., Zhu, J., He, X.-J., Wu, J.-M., Iida, K., Lu, X.-Y., Cui, X., Jin, H., Zhu, J.-K., 2008. The Arabidopsis NFYA5 transcription factor is regulated transcriptionally and posttranscriptionally to promote drought resistance. Plant Cell 20, 2238-2251. https://doi.org/10.1105/tpc.108.059444

84. Lian, C., Li, Q., Yao, K., Zhang, Y., Meng, S., Yin, W., Xia, X., 2018. Populus trichocarpa PtNF-YA9, A Multifunctional Transcription Factor, Regulates Seed Germination, Abiotic Stress, Plant Growth and Development in Arabidopsis. Front. Plant Sci. 9, 954. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00954

85. Lian, Z., Nguyen, C.D., Liu, L., Wang, G., Chen, J., Wang, S., Yi, G., Wilson, S., Ozias-Akins, P., Gong, H., Huo, H., 2022. Application of developmental regulators to improve in planta or in vitro transformation in plants. Plant Biotechnol. J. 20, 1622-1635. https://doi.org/10.1111/pbi.13837

86. Liu, C., Zhang, L., Liu, H., Cheng, K., 2017. Delivery strategies of the CRISPR-Cas9 gene-editing system for therapeutic applications. J. Controlled Release 266, 17-26. https://doi.org/10.1016/j jconrel.2017.09.012

87. Liu, J.-X., Howell, S.H., 2010. bZIP28 and NF-Y Transcription Factors Are Activated by ER Stress and Assemble into a Transcriptional Complex to Regulate Stress Response Genes in Arabidopsis. Plant Cell 22, 782-796. https://doi.org/10.1105/tpc.109.072173

88. Liu, X., Hu, P., Huang, M., Tang, Y., Li, Y., Li, L., Hou, X., 2016. The NF-YC-RGL2 module integrates GA and ABA signalling to regulate seed germination in Arabidopsis. Nat. Commun. 7, 12768. https://doi.org/10.1038/ncomms12768

89. Livak, K.J., Schmittgen, T.D., 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-AACT Method. Methods 25, 402-408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262

90. Lotan, T., Ohto, M., Yee, K.M., West, M.A.L., Lo, R., Kwong, R.W., Yamagishi, K., Fischer, R.L., Goldberg, R.B., Harada, J.J., 1998. Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 Is Sufficient to Induce Embryo Development in Vegetative Cells. Cell 93, 1195-1205. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)81463-4

91. Love, M.I., Huber, W., Anders, S., 2014. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15, 550. https://doi.org/10.1186/s13059-014-0550-8

92. Lowe, K., La Rota, M., Hoerster, G., Hastings, C., Wang, N., Chamberlin, M., Wu, E., Jones, T., Gordon-Kamm, W., 2018. Rapid genotype "independent" Zea mays L. (maize) transformation via direct somatic embryogenesis. Vitro Cell. Dev. Biol. - Plant 54, 240-252. https://doi.org/10.1007/s11627-018-9905-2

93. Lu, Q., Tang, X., Tian, G., Wang, F., Liu, K., Nguyen, V., Kohalmi, S.E., Keller, W.A., Tsang, E.W.T., Harada, J.J., Rothstein, S.J., Cui, Y., 2009. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin: TREX-2 mRNA export complex. Plant J. 61, 259-270. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2009.04048.x

94. Ma, X.-J., Fu, J.-D., Tang, Y.-M., Yu, T.-F., Yin, Z.-G., Chen, J., Zhou, Y.-B., Chen, M., Xu, Z.-S., Ma, Y.-Z., 2020a. GmNFYA13 Improves Salt and Drought Tolerance in Transgenic Soybean Plants. Front. Plant Sci. 11, 587244. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.587244

95. Ma, X.-J., Yu, T.-F., Li, X.-H., Cao, X.-Y., Ma, J., Chen, J., Zhou, Y.-B., Chen, M., Ma, Y.-Z., Zhang, J.-H., Xu, Z.-S., 2020b. Overexpression of GmNFYA5 confers drought tolerance to transgenic Arabidopsis and soybean plants. BMC Plant Biol. 20, 123. https://doi.org/10.1186/s12870-020-02337-z

96. Maher, M.F., Nasti, R.A., Vollbrecht, M., Starker, C.G., Clark, M.D., Voytas, D.F., 2020. Plant gene editing through de novo induction of meristems. Nat. Biotechnol. 38, 84-89. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0337-2

97. Mann, H.B., Whitney, D.R., 1947. On a Test of Whether One of Two Random Variables Is Stochastically Larger than the Other. Annals of Mathematical Statistics, 18, 50-60. http://dx.doi.org/10.1214/aoms/1177730491

98. Masekesa, T.R., Gasura, E., Ngadze, E., Icishahayo, D., Kujeke, G.T., Chidzwondo, F., Robertson, I., 2016. Efficacy of Zeatin, Kinetin and Thidiazuron in induction of adventitious root and shoot from petiole explants of sweetpotato cv. Brondal. South African Journal of Botany.104,1-5. doi: 10.1016/j.sajb.2015.11.001.

99. Masiero, S., Imbriano, C., Ravasio, F., Favaro, R., Pelucchi, N., Gorla, M.S., Mantovani, R., Colombo, L., Kater, M.M., 2002. Ternary Complex

Formation between MADS-box Transcription Factors and the Histone Fold Protein NF-YB. J. Biol. Chem. 277, 26429-26435. https://doi.org/10.1074/jbc.M202546200

100. Mendes, A., Kelly, A.A., Van Erp, H., Shaw, E., Powers, S.J., Kurup, S., Eastmond, P.J., 2013. bZIP67 Regulates the Omega-3 Fatty Acid Content of Arabidopsis Seed Oil by Activating FATTY ACID DESATURASE3. Plant Cell 25, 3104-3116. https://doi.org/10.1105/tpc.113.116343

101. Min, L., Hu, Q., Li, Y., Xu, J., Ma, Y., Zhu, L., Yang, X., Zhang, X., 2015. LEAFY COTYLEDON1-CASEIN KINASE I-TCP15-PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR4 Network Regulates Somatic Embryogenesis by Regulating Auxin Homeostasis. Plant Physiol. 169, 2805-2821. https://doi.org/10.1104/pp.15.01480

102. Mu, J., Tan, H., Hong, S., Liang, Y., Zuo, J., 2013. Arabidopsis Transcription Factor Genes NF-YA1, 5, 6, and 9 Play Redundant Roles in Male Gametogenesis, Embryogenesis, and Seed Development. Mol. Plant 6, 188-201. https://doi.org/10.1093/mp/sss061

103. Mu, J., Tan, H., Zheng, Q., Fu, F., Liang, Y., Zhang, J., Yang, X., Wang, T., Chong, K., Wang, X.-J., Zuo, J., 2008. LEAFY COTYLEDON1 Is a Key Regulator of Fatty Acid Biosynthesis in Arabidopsis. Plant Physiol. 148, 1042-1054. https://doi.org/10.1104/pp.108.126342

104. Murray, M.G., Thompson, W.F., 1980. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8, 4321-4326. https://doi.org/10.1093/narZ8.19.4321

105. Niu, B., Xu, J., E, Z., Zhang, Z., Lu, X., Chen, C., 2023. Ectopic expression of OsNF-YA8, an endosperm-specific nuclear factor Y transcription-factor gene, causes vegetative and reproductive development defects in rice. Crop J. 11, 1719-1730. https://doi.org/10.1016/j.cj.2023.07.001

106. Niu, B., Zhang, Z., Zhang, J., Zhou, Y., Chen, C., 2021. The rice LEC1-like transcription factor OsNF-YB9 interacts with SPK, an endosperm-specific sucrose synthase protein kinase, and functions in seed development. Plant J. 106, 1233-1246. https://doi.org/10.! 111/tpj. 15230

107. Nolan, K.E., Irwanto, R.R., Rose, R.J., 2003. Auxin Up-Regulates MtSERK1 Expression in Both Medicago truncatula Root-Forming and Embryogenic Cultures. Plant Physiol. 133, 218-230. https://doi.org/10.1104/pp.103.020917

108. Nolan, K.E., Rose, R.J., Gorst, J.R., 1989. Regeneration of Medicago truncatula from tissue culture: increased somatic embryogenesis using explants from regenerated plants. Plant Cell Rep. 8. https://doi.org/10.1007/BF00274129

109. Okonechnikov, K., Golosova, O., Fursov, M., the UGENE team, 2012. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics 28, 1166-1167. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts091

110. Orlowska, A., Igielski, R., Lagowska, K., K^pczynska, E., 2017. Identification of LEC1, L1L and Polycomb Repressive Complex 2 genes and their expression during the induction phase of Medicago truncatula Gaertn. somatic embryogenesis. Plant Cell Tissue Organ Cult. PCTOC 129, 119-132. https://doi.org/10.1007/s11240-016-1161-8

111. Orlowska, A., K^pczynska, E., 2018. Identification of Polycomb Repressive Complex1, Trithorax group genes and their simultaneous expression with WUSCHEL, WUSCHEL-related Homeobox5 and SHOOT MERISTEMLESS during the induction phase of somatic embryogenesis in Medicago truncatula Gaertn. Plant Cell Tissue Organ Cult. PCTOC 134, 345-356. https://doi.org/10.1007/s11240-018-1425-6

112. Pecrix, Y., Staton, S.E., Sallet, E., Lelandais-Briere, C., Moreau, S., Carrere, S., Blein, T., Jardinaud, M.-F., Latrasse, D., Zouine, M., Zahm, M., Kreplak, J., Mayjonade, B., Satge, C., Perez, M., Cauet, S., Marande, W., Chantry-Darmon, C., Lopez-Roques, C., Bouchez, O., Berard, A., Debelle, F., Munos, S., Bendahmane, A., Berges, H., Niebel, A., Buitink, J., Frugier, F., Benhamed, M., Crespi, M., Gouzy, J., Gamas, P., 2018. Whole-genome landscape of Medicago truncatula symbiotic genes. Nat. Plants 4, 1017-1025. https://doi.org/10.1038/s41477-018-0286-7

113. Pelletier, J.M., Kwong, R.W., Park, S., Le, B.H., Baden, R., Cagliari, A., Hashimoto, M., Munoz, M.D., Fischer, R.L., Goldberg, R.B., Harada, J.J., 2017. LEC1 sequentially regulates the transcription of genes involved in diverse developmental processes during seed development. Proc. Natl.

Acad. Sci. 114. https://doi.org/10.1073/pnas.1707957114

114. Pereira, S.L.S., Martins, C.P.S., Sousa, A.O., Camillo, L.R., Araujo, C.P., Alcantara, G.M., Camargo, D.S., Cidade, L.C., De Almeida, A.-A.F., Costa, M.G.C., 2018. Genome-wide characterization and expression analysis of citrus NUCLEAR FACTOR-Y (NF-Y) transcription factors identified a novel NF-YA gene involved in drought-stress response and tolerance. PLOS ONE 13, e0199187. https://doi.org/10 1371/j ournal.pone .0199187

115. Perez-Garcia, P., Moreno-Risueno, M.A., 2018. Stem cells and plant regeneration. Dev. Biol. 442, 3-12. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2018.06.021

116. Pertea, M., Pertea, G.M., Antonescu, C.M., Chang, T.-C., Mendell, J.T., Salzberg, S.L., 2015. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nat. Biotechnol. 33, 290-295. https://doi.org/10.1038/nbt.3122

117. Potsenkovskaia, E., Tvorogova, V., Yakovleva, D., Zlydneva, N., Lutova, L., 2022. Novel NF-Y genes expressed during somatic embryogenesis in Medicago truncatula. Plant Gene 31, 100364. https://doi.org/10 1016/j .plgene.2022. 100364

118. Potsenkovskaia, E.A., Tvorogova, V.E., Simonova, V.Y., Konstantinov, Z.S., Kiseleva, A.S., Matveenko, A.G., Brynchikova, A.V., Lutova, L.A., 2024. CRISPR-Based Editing of the Medicago truncatula LEC1 Gene. Plants 13, 3226. https://doi.org/10.3390/plants13223226

119. Reinert, J., 1959. Über die Kontrolle der Morphogenese und die Induktion von Adventivembryonen an Gewebekulturen aus Karotten. Planta 53, 318-333. https://doi.org/10.1007/BF01881795

120. Romier, C., Cocchiarella, F., Mantovani, R., Moras, D., 2003. The NF-YB/NF-YC Structure Gives Insight into DNA Binding and Transcription Regulation by CCAAT Factor NF-Y. J. Biol. Chem. 278, 1336-1345. https://doi.org/10.1074/jbc.M209635200

121. Rose, R.J., 2019. Somatic Embryogenesis in the Medicago truncatula Model: Cellular and Molecular Mechanisms. Front. Plant Sci. 10, 267. https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00267

122. Rose, R.J., Nolan, K.E., Bicego, L., 1999. The Development of the Highly Regenerable Seed Line Jemalong 2HA for Transformation of Medicago truncatula — Implications for Regenerability via Somatic Embryogenesis. J. Plant Physiol. 155, 788-791. https://doi.org/10.1016/S0176-1617(99)80097-2

123. Rupps, A., Raschke, J., Rummler, M., Linke, B., Zoglauer, K., 2016. Identification of putative homologs of Larix decidua to BABYBOOM (BBM), LEAFY COTYLEDON (LEC1), WUSCHEL-related HOMEOBOX2 (WOX2) and SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-like KINASE (SERK) during somatic embryogenesis. Planta 243, 473-488. https://doi.org/10.1007/s00425-015-2409-y

124. Sambrook, J., Russell, D.W., 2006. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harb. Protoc. 2006, pdb.prot3932. https://doi.org/10.1101/pdb.prot3932

125. Santos, D., Fevereiro, P., 2002. Loss of DNA methylation affects somatic embryogenesis in Medicago truncatula. Plant Cell Tissue Organ Cult. 70, 155-161. https://doi.org/10. 1023/A: 1016369921067

126. Santos-Mendoza, M., Dubreucq, B., Baud, S., Parcy, F., Caboche, M., Lepiniec, L., 2008. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54, 608-620. https://doi.org/10.1111/j. 1365-313X.2008.03461 .x

127. Sashidhar, N., Harloff, H.J., Potgieter, L., Jung, C., 2020. Gene editing of three BnITPK genes in tetraploid oilseed rape leads to significant reduction of phytic acid in seeds. Plant Biotechnol. J. 18, 2241-2250. https://doi.org/10.1111/pbi.13380

128. Sato, H., Mizoi, J., Tanaka, H., Maruyama, K., Qin, F., Osakabe, Y., Morimoto, K., Ohori, T., Kusakabe, K., Nagata, M., Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K., 2014. Arabidopsis DPB3-1, a DREB2A Interactor, Specifically Enhances Heat Stress-Induced Gene Expression by Forming a Heat Stress-Specific Transcriptional Complex with NF-Y Subunits. Plant Cell 26, 4954-4973. https://doi.org/10.1105/tpc.114.132928

129. Schmidt, E.D.L., Guzzo, F., Toonen, M.A.J., Vries, S.C.D., 1997. A leucine-rich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant

cells competent to form embryos. Development 124, 2049-2062. https://doi.org/10.1242/dev.124.10.2049

130. Shen, B., Allen, W.B., Zheng, P., Li, C., Glassman, K., Ranch, J., Nubel, D., Tarczynski, M.C., 2010. Expression of ZmLEC1 and ZmWRI1 Increases Seed Oil Production in Maize. Plant Physiol. 153, 980-987. https://doi.org/10.1104/pp. 110.157537

131. Siefers, N., Dang, K.K., Kumimoto, R.W., Bynum, W.E., Tayrose, G., Holt, B.F., 2009. Tissue-Specific Expression Patterns of Arabidopsis NF-Y Transcription Factors Suggest Potential for Extensive Combinatorial Complexity. Plant Physiol. 149, 625-641. https://doi.org/10.1104/pp.108.130591

132. Siriwardana, C.L., Kumimoto, R.W., Jones, D.S., Holt, B.F., 2014. Gene Family Analysis of the Arabidopsis NF-YA Transcription Factors Reveals Opposing Abscisic Acid Responses During Seed Germination. Plant Mol. Biol. Report. 32, 971-986. https://doi.org/10.1007/s11105-014-0704-6

133. Skoog, F., Miller, C.O., 1957. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro, in: Symp. Soc. Exp. Biol. pp. 118-131.

134. Steward, F.C., Mapes, M.O., Mears, K., 1958. GROWTH AND ORGANIZED DEVELOPMENT OF CULTURED CELLS. II. Organization in Cultures Grown from Freely Suspended Cell. Am. J. Bot. 45, 705-708. https://doi.org/10.1002/j.1537-2197.1958.tb10599.x

135. Su, Y.H., Liu, Y.B., Bai, B., Zhang, X.S., 2015. Establishment of embryonic shoota€"root axis is involved in auxin and cytokinin response during Arabidopsis somatic embryogenesis. Front. Plant Sci. 5. https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00792

136. Su, Y.H., Zhang, X.S., 2014. The Hormonal Control of Regeneration in Plants, in: Current Topics in Developmental Biology. Elsevier, pp. 35-69. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-391498-9.00010-3

137. Su, Y.H., Zhao, X.Y., Liu, Y.B., Zhang, C.L., O'Neill, S.D., Zhang, X.S., 2009. Auxin-induced WUS expression is essential for embryonic stem cell renewal during somatic embryogenesis in Arabidopsis. Plant J. 59, 448-460. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2009.03880.x

138. Sugimoto, K., Gordon, S.P., Meyerowitz, E.M., 2011. Regeneration in plants and animals: dedifferentiation, transdifferentiation, or just differentiation? Trends Cell Biol. 21, 212-218. https://doi.org/10.1016/j .tcb.2010.12.004

139. Sugimoto, K., Jiao, Y., Meyerowitz, E.M., 2010. Arabidopsis Regeneration from Multiple Tissues Occurs via a Root Development Pathway. Dev. Cell 18, 463-471. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2010.02.004

140. Swain, S., Myers, Z.A., Siriwardana, C.L., Holt, B.F., 2017. The multifaceted roles of NUCLEAR FACTOR-Y in Arabidopsis thaliana development and stress responses. Biochim. Biophys. Acta BBA - Gene Regul. Mech. 1860, 636-644. https://doi.org/10.1016/j .bbagrm.2016.10.012

141. Tang, M., Gao, X., Meng, W., Lin, J., Zhao, G., Lai, Z., Lin, Y., Chen, Y., 2023. Transcription factors NF-YB involved in embryogenesis and hormones responses in Dimocarpus Longan Lour. Front. Plant Sci. 14, 1255436. https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1255436

142. Tao, Z., Shen, L., Gu, X., Wang, Y., Yu, H., He, Y., 2017. Embryonic epigenetic reprogramming by a pioneer transcription factor in plants. Nature 551, 124-128. https://doi.org/10.1038/nature24300

143. Tvorogova, V. E., Fedorova, Y.A., Potsenkovskaya, E.A., Kudriashov, A.A., Efremova, E.P., Kvitkovskaya, V.A., Wolabu, T.W., Zhang, F., Tadege, M., Lutova, L.A., 2019a. The WUSCHEL-related homeobox transcription factor MtWOX9-1 stimulates somatic embryogenesis in Medicago truncatula. Plant Cell Tissue Organ Cult. PCTOC 138, 517-527. https://doi.org/10. 1007/s 11240-019-01648-w

144. Tvorogova, V. E., Krasnoperova, E.Y., Kudriashov, A.A., Kuznetsova, K.A., Potsenkovskaya, E.A., Fedorova, Y.A., Lutova, L.A., 2019b. Transcriptomic analysis of Medicago truncatula calli with MtWOX9-1 overexpression. Vavilov J. Genet. Breed. 23, 691-699. https://doi.org/10.18699/VJ19.542

145. Valvekens, D., Van Lijsebettens, M., Van Montagu, M., 1992. Arabidopsis regeneration and transformation (Root Explant System), in: Lindsey, K. (Ed.), Plant Tissue Culture Manual. Springer US, Boston,

MA, pp. 1-17. https://doi.org/10.1007/978-1-4899-3778-0_1

146. Verdeil, J., Alemanno, L., Niemenak, N., Tranbarger, T., 2007. Pluripotent versus totipotent plant stem cells: dependence versus autonomy? Trends Plant Sci. 12, 245-252. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2007.04.002

147. Wang, F. X., Shang, G. D., Wu, L. Y., Xu, Z. G., Zhao, X. Y., Wang, J. W., 2020. Chromatin accessibility dynamics and a hierarchical transcriptional regulatory network structure for plant somatic embryogenesis. Dev. Cell 54, 742-757.e8. doi: 10.1016/J.DEVCEL.2020.07.003

148. Wang, M., Le Gourrierec, J., Jiao, F., Demotes-Mainard, S., Perez-Garcia, M.D., Oge, L., Hamama, L., Crespel, L., Bertheloot, J., Chen, J., Grappin, P., Sakr, S., 2021.Convergence and Divergence of Sugar and Cytokinin Signaling in Plant Development. Int J Mol Sci. 22(3),1282. doi: 10.3390/ijms22031282

149. Wang, W., Huang, P., Dai, W., Tang, H., Qiu, Y., Chang, Y., Han, Z., Li, X., Du, L., Ye, X., Zou, C., Wang, K., 2023. Application of Nicotinamide to Culture Medium Improves the Efficiency of Genome Editing in Hexaploid Wheat. Int. J. Mol. Sci. 24, 4416. https://doi.org/10.3390/ijms24054416

150. Wenkel, S., Turck, F., Singer, K., Gissot, L., Le Gourrierec, J., Samach, A., Coupland, G., 2006. CONSTANS and the CCAAT Box Binding Complex Share a Functionally Important Domain and Interact to Regulate Flowering of Arabidopsis. Plant Cell 18, 2971-2984. https://doi.org/10.1105/tpc.106.043299

151. Wu, H.-Y., Liu, K.-H., Wang, Y.-C., Wu, J.-F., Chiu, W.-L., Chen, C.-Y., Wu, S.-H., Sheen, J., Lai, E.-M., 2014. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant Methods 10, 19. https://doi.org/10.1186/1746-4811-10-19

152. Xing, H.-L., Dong, L., Wang, Z.-P., Zhang, H.-Y., Han, C.-Y., Liu, B., Wang, X.-C., Chen, Q.-J., 2014. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14, 327. https://doi.org/10.1186/s12870-014-0327-y

153. Xing, Y., Zhang, S., Olesen, J.T., Rich, A., Guarente, L., 1994. Subunit interaction in the CCAAT-binding heteromeric complex is mediated by a very short alpha-helix in HAP2. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 3009-3013. https://doi.org/10.1073/pnas.9L8.3009

154. Xu, P., Zhong, Y., Xu, A., Liu, B., Zhang, Y., Zhao, A., Yang, X., Ming, M., Cao, F., Fu, F., 2024. Application of Developmental Regulators for Enhancing Plant Regeneration and Genetic Transformation. Plants 13, 1272. https://doi.org/10.3390/plants13091272

155. Yamamoto, A., Kagaya, Y., Toyoshima, R., Kagaya, M., Takeda, S., Hattori, T., 2009. Arabidopsis NF-YB subunits LEC1 and LEC1-LIKE activate transcription by interacting with seed-specific ABRE-binding factors. Plant J. 58, 843-856. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2009.03817.x

156. Yaseen, M., Ahmad, T., Sablok, G., Standardi, A., Hafiz, I.A., 2013. Review: role of carbon sources for in vitro plant growth and development. Mol Biol Rep. 40, 2837-2849. https://doi.org/10.1007/s11033-012-2299-z

157. Yazawa, K., Kamada, H., 2007. Identification and characterization of carrot HAP factors that form a complex with the embryo-specific transcription factor C-LEC1. J. Exp. Bot. 58, 3819-3828. https://doi.org/10.1093/jxb/erm238

158. Yazawa, K., Takahata, K., Kamada, H., 2004. Isolation of the gene encoding Carrot leafy cotyledon1 and expression analysis during somatic and zygotic embryogenesis. Plant Physiol. Biochem. 42, 215-223. https://doi.org/10.1016/j .plaphy.2003. 12.003

159. Zanetti, M.E., Ripodas, C., Niebel, A., 2017. Plant NF-Y transcription factors: Key players in plant-microbe interactions, root development and adaptation to stress. Biochim. Biophys. Acta BBA - Gene Regul. Mech. 1860, 645-654. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2016.11.007

160. Zhang, J., Xue, H., 2013. OsLEC1/OsHAP3E Participates in the Determination of Meristem Identity in Both Vegetative and Reproductive Developments of Rice F. J. Integr. Plant Biol. 55, 232-249. https://doi.org/10.! 111/jipb.12025

161. Zhang, S., Zhang, R., Gao, J., Gu, T., Song, G., Li, W., Li, D., Li, Y., Li, G., 2019. Highly Efficient and Heritable Targeted Mutagenesis in Wheat via the Agrobacterium tumefaciens-Mediated CRISPR/Cas9 System. Int. J. Mol. Sci. 20, 4257. https://doi.org/10.3390/ijms20174257

162. Zhao, H., Wu, D., Kong, F., Lin, K., Zhang, H., Li, G., 2017. The Arabidopsis thaliana Nuclear Factor Y Transcription Factors. Front. Plant Sci. 07. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.02045

163. Zuo, J., Niu, Q.-W., Frugis, G., Chua, N.-H., 2002. The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. Plant J. 30, 349-359. https://doi.org/10.1046/j.1365-313X.2002.01289.x

Благодарности

Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю, Твороговой Варваре Евгеньевне, за мудрое руководство, терпение и неоценимую поддержку на всех этапах работы над диссертацией. Особую признательность хочу выразить Лутовой Людмиле Алексеевне за оказанное доверие и возможность выполнять работу в лаборатории генной и клеточной инженерии растений кафедры генетики и биотехнологии СПбГУ.

Благодарю весь коллектив лаборатории генной и клеточной инженерии растений, в особенности - Лебедеву Марию Александровну, Ганчеву Марию Семеновну, Кузнецову Ксению Андреевну, Ефремову Елену Павловну и Константинова Захара Сергеевича за поддержку в проведении экспериментов и дружескую атмосферу. Также выражаю признательность коллеге из университета Сириус Симоновой Веронике Юрьевне и коллеге из ВНИИСХМ Канцуровой Елизавете Степановне за моральную поддержку и обсуждение работы. Отдельная благодарность моей семье и друзьям за поддержку и веру в меня на протяжении всего этого пути, в особенности благодарю Кирсанова Александра Сергеевича за помощь с текстом, иллюстрациями, психологическую поддержку и невероятное терпение.

Работа выполнена при поддержке Гранта Министерства Науки и Высшего Образования РФ в форме субсидий для создания и развития научного центра мирового уровня "Агротехнологии Будущего" № 075-15-2022-322 (2020-2023). В работе использовано оборудование ресурсного центра научного парка СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий».

Приложение

Приложение 1. Номера генов, выбранных для экспериментов

Ген Номер гена в сборке v4 Номер гена в сборке v5

MtActin Medtr3g095530 MtrunA17Chr3g0129641

MtGAPDH Medtr4g103920 MtrunA17Chr4g0057861

MtH3L Medtr4g097170 MtrunA17Chr4g0054151

MtUbiquitin Medtr8g018230 MtrunA17Chr8g0342711

MtNF-YA1 Medtr1g056530 MtrunA17Chr3g0103391

MtNF-YA2 Medtr7g106450 MtrunA17Chr7g0267581

MtNF-YA3 Medtr2g041090 MtrunA17Chr2g0300261

MtNF-YA4 Medtr2g099490 MtrunA17Chr2g0329811

MtNF-YA5 Medtr3g061510 MtrunA17Chr3g0103391

MtNF-YA6 Medtr2g030170 MtrunA17Chr2g0288481

MtNF-YA7 Medtr8g037270 MtrunA17Chr8g0352251

MtNF-YA8 Medtr8g019540 MtrunA17Chr8g0343451

MtNF-YC1 Medtr1g082660 MtrunA17Chr1g0191681

MtNF-YC2 Medtr7g113680 MtrunA17Chr7g0272991

MtNF-YC3 Medtr3g099180 MtrunA17Chr3g0132191

MtNF-YC4 NA MtrunA17Chr2g0310741

MtNF-YC5 Medtr5g088760 MtrunA17Chr5g0441241

MtNF-YC6 Medtr2g081600 MtrunA17Chr2g0318881

MtNF-YC7 Medtr4g059710 MtrunA17Chr4g0029311

MtNF-YC8 Medtr3g012030 MtrunA17Chr3g0081161

MtNF-YC9 Medtr3g085430 MtrunA17Chr3g0122571

MtNF-YC10 Medtr2g023340 MtrunA17Chr2g0288481

мш^сп Medtr2g081630 MtrunA17Chr2g0318921

MO.1L Medtr4g133952 MtrunA17Chr4g0076381

МИЕС1 Medtr1g039040 MtrunA17Chr1g0165041

Приложение 2. Последовательности праймеров, подобранных для проводимых экспериментов

Ген Последовательность праймеров

Редактирование CRISPR

MИЖ1 ATTGGTTTGCTATTGGCATGTAC

MtLEC1_Oligo_rev ЫИЖ1 AAACGTACATGCCAATAGCAAAC

MtLEC1_DT1-BsF ЫИЖ1 ATATATGGTCTCGAT TGATACGAATCACGTTTGCTATGTT

М^ЕС^Т1-Р0 ЫИЖ1 TGATACGAATCACGTTTGCTATGTT TTAGAGCTAGAAATAGC

MtLEC1_DT2-R0 ЫИЖ1 AACATTGCCCATAGTATATCTTCAA TCTCTTAGTCGACTCTAC

MtLEC1_DT2-BsR ЫИЖ1 ATTATTGGTCTCGA AACATTGCCCATAGTATATCTTCAA

ПЦР-РВ

MtActin_rlt_for MtActin TCAATGTGCCTGCCATGTATGT

MtActin_rlt_rev MtActin ACTCACACCGTCACCA

MtGAPDH_rlt_for MtGAPDH TGGTCATCAAACCCTCAACA

MtGAPDH_rlt_rev MtGAPDH CCTCGTTCTTTCCGCTATCA

MtH3L_rlt_for MtH3L CTTTGCTTGGTGCTGTTTAGATGG

MtH3L_rlt_rev MtH3L ATTCCAAAGGCGGCTGCATA

MtUbiquitin_rlt_for MtUbiquitin ATGCAGATYCTTGTGAAGAC

MtUbiquitin_rlt_rev MtUbiquitin ACCACCCCGRAGACGGAG

MtNF-YA1_rlt_for MtNF-YA1 GAGTAATGCCTATGGATCTCAAC

MtNF-YA1_rlt_rev MtNF-YA1 TAAGGTTGCTTGATGATTTGGTGTA

MtNF-YA2_rlt_for MtNF-YA2 CTTCAAAGGAAACTAATGGAAGCA

MtNF-YA2_rlt_rev MtNF-YA2 GATAACACCACGCCCACCA

MtNF-YA3_rlt_for MtNF-YA3 GGCACAGAACAAACTCATCAAAAA

MtNF-YA3_rlt_rev MtNF-YA3 CCAGAATGTGAACCAGTGACAAA

MtNF-YA4_rlt_for MtNF-YA4 TTCAGCAGCAACAGGAGTTAGA

MtNF-YA4_rlt_rev MtNF-YA4 GGACGGATAGTCGGCGTT

MtNF-YA5_rlt_for MtNF-YA5 AATTCTCCCAACATGCGACA

MtNF-YA5_rlt_rev MtNF-YA5 CCCCTTCTTCCACTCTTTCA

MtNF-YA6_rlt_for MtNF-YA6 GCCAATCTTCAGTTAATGGGAATT

MtNF-YA6_rlt_rev MtNF-YA6 CCTCGTCTTGTTGATTCTCATCT

MtNF-YA7_rlt_for MtNF-YA7 AAAAAGCCCGAACACAACGA

MtNF-YA7_rlt_rev MtNF-YA7 TCCTGTTTTCCATTTGCCTGT

MtNF-YA8_rlt_for MtNF-YA8 CTTTGAATCGTAGTGGATAACAATGAAG

MtNF-YA8_rlt_rev MtNF-YA8 CAGTTGATTGAGTAGAAGAAGAATCTTG

MtNF-YC1_rlt_for MtNF-YC1 TCGGGAGGACTTGAAAGATGAA

MtNF-YC1_rlt_rev MtNF-YC1 ACGGATGAGACTGTGGAGCA

MtNF-YC2_rlt_for MtNF-YC2 GCCTGCTGATGCTCTTCCTT

MtNF-YC2_rlt_rev MtNF-YC2 GAGATGGTGGTCGCTGTTC

MtNF-YC3_rlt_for MtNF-YC3 TGGTGCTGCTGCTAGTGGT

MtNF-YC3_rlt_rev MtNF-YC3 CCTGAGAAGGCGGCTGAA

MtNF-YC4_rlt_for MtNF-YC4 TTCTGGCACACCTGCTGTAG

MtNF-YC4_rlt_rev MtNF-YC4 GTTCTCCTCTTGTTCTCTTCTGT

MtNF-YC5_rlt_for MtNF-YC5 TGTGCGAGAGTCCGATGAAG

MtNF-YC5_rlt_rev MtNF-YC5 TGGGATAGGAGTTGGTGTGGA

MtNF-YC6_rlt_for MtNF-YC6 GCAGGTGCATATTCAGGTATACT

MtNF-YC6_rlt_rev MtNF-YC6 GTTTCCATTTGCATGACAGTGGTAT

MtNF-YC7_rlt_for MtNF-YC7 TTAGCGGAAGATGCTTATGGTTG

MtNF-YC7_rlt_rev MtNF-YC7 CAGGAACAAAGTCGGACAGAAA

MtNF-YC8_rlt_for MtNF-YC8 GCCCCATTGCCTGAACCT

MtNF-YC8_rlt_rev MtNF-YC8 CCTCATCATAATCTTCCTCATCC

MtNF-YC9_rlt_for MtNF-YC9 GAATTGTAATTGCTACGGTTATGGGT

MtNF-YC9_rlt_rev MtNF-YC9 TTATTGGACGGTTTCTCTTCACC

MtNF-YC10_rlt_for MtNF-YC10 AAAATCAAATAGTGTCAGTGTCTCG

MtNF-YC10_rlt_rev MtNF-YC10 ATCAACAACCTTCTCAACTTCTTCA

MtNF-YC11_rlt_for MtNF-YCU CGTGAAAATGATATCAGGGGTTG

MtNF-YC11_rlt_rev MtNF-YCU AGAGTGGTGGCATCAGTACTAG

MtL1L_rlt_for MtL1L ATCAACAGCCAGCAACAGCAATG

MtL1L_rlt_rev MtL1L CCTCGTGTTCATCTCAGAAACTGA

MtLEC1_rlt_for MtLEC1 TGGCTGGAATAAGGGAACAAGAC

MtLEC1_rlt_rev MtLEC1 TCGTTTGCTTCGGATGTTATGAAG

Клонирование Gateway в pDONR207 для дрожжевой двугибридной системы

MtNF-YA3_attb1_for MtNF-YA3 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGAAGCCTTTTCTCTCTTTGAATC

MtNF-YA3_attb2_rev MtNF-YA3 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TCACCGGACAACAGAAGCAC

MtNF-YA4_attb1_for MtNF-YA4 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGAAGTGCTTATGCGAGAAAGAC

MtNF-YA4_attb2_rev MtNF-YA4 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TCACATGCGGACGGATAGTC

MtNF-YA8_attb1_for MtNF-YA8 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGTCAGAAAATCTAACTTTGAATATGAGTG

MtNF-YA8_attb2_rev MtNF-YA8 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TCACATAAGGACAGATAGTCGGTG

MtNF-YC1_attb1_for MtNF-YC1 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGATCATCAAGGTCATGGCC

MtNF-YC1_attb2_rev MtNF-YC1 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC CTAATGATCTGAAGGCGATTGTTG

MtNF-YC2_attb1_for MtNF-YC2 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGACCATCAAGGGCATAACCA

MtNF-YC2_attb2_rev MtNF-YC2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC CTAGTGATCTGGAGATGGTGGT

MtNF-YC3_attb1_for MtNF-YC3 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGAGAACAACAACCAACAACAA

MtNF-YC3_attb2_rev MtNF-YC3 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TCAGCTCTGGCCATCGCC

MtNF-YC7_attb1_for MtNF-YC7 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGCTTCTTCCAACAATTCAGTAG

MtNF-YC7_attb2_rev MtNF-YC7 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC CTAACCTCCTTTATTCCCTCTTGA

MtL1L_attb1_for MtLlL GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGAAACTGGAGGAGGGTTT

MtL1L_attb2_rev MtLlL GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCT CATTTATATTGATGGTGATGATGATG

MtLEC1_attb1_for MtLECl GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGCTGGAATAAGGGAACAA

MtLEC1_attb2_rev MtLECl GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCT CACATATTATTATTATGATTATCACGTTT

Клонирование Gateway в pDONR207 для эксперимента со сверхэкспрессией

MtNF-YA3_attb1_for MtNF-YA3 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGAAGCCTTTTCTCTCTTTGAATC

MtNF-YA3_attb2_rev MtNF-YA3 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TCACCGGACAACAGAAGCAC

MtL1L_attb1_for MtLlL GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGAAACTGGAGGAGGGTTT

MtL1L_attb2_rev MtLlL GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCT CATTTATATTGATGGTGATGATGATG

MtLEC1_attb1_for MtLEC1 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGCTGGAATAAGGGAACAA

MtLEC1_attb2_rev MtLECl GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCT CACATATTATTATTATGATTATCACGTTT

Клонирование Golden Gate MoClo

MtNF-YA4 BpiI AATG_for MtNF-YA4 TTGAAGACAAAATGAAGTGCTTATGCGAGAAA GAC

MtNF-YA4 BpiI GCTT_rev MtNF-YA4 TTGAAGACAAAAGCTCACATGCGGACGGATA

MtL1L BpiI AATG_for MtLlL TTGAAGACAAAATGGAAACTGGAGGAGGGTTT

MtL1L BpiI GCTT_rev MtLlL TTGAAGACAAAAGCTCATTTATATTGATGGTGA TGATGATG

MtLEC1 BpiI AATG_for MtLEC1 TTGAAGACAAAATGGCTGGAATAAGGGAACAA

MtLEC1 BpiI GCTT_rev MtLEC1 TTGAAGACAAAAGCTCACATATTATTATTATGAT TATCACGTTT

MtNF-YC3 BpiI AATG_for MtNF-YC3 TTGAAGACAAAATGGAGAACAACAACCAACA ACAA

MtNF-YC3 BpiI GCTT_rev MtNF-YC3 TTGAAGACAAAAGCTCAGCTCTGGCCATCGCC

Приложение 3. Праймеры для секвенирования

Название Последовательность

M13 for GTAAAACGACGGCCAGT

M13 rev CAGGAAACAGCTATGAC

MtLEC1_Medtr1g039040_target1_for GGTTTTTCCAAATTATATATTGAGATTTT

MtLEC1_Medtr1g039040_target1_rev CTTATGTATTCGGATACACATTCT

pDONR207_for TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC

pDONR207_rev GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC

Приложение 4. Векторные конструкции, полученные в работе

Название Комментарий

Редактирование CRISPR

pHSE401_MtLEC1_1 target Вектор с гРНК с мишенью 3 и последовательностью Cas9

pHSE401_MtLEC1_2 target Вектор с гРНК с мишенями 1 и 2 и последовательностью Cas9

Gateway donor plasmid

pDONR207_MtNF-YA3 Вектор ввода с кодирующей последовательностью гена

pDONR207_MtNF-YA4 Вектор ввода с кодирующей последовательностью гена

pDONR207_MtNF-YA8 Вектор ввода с кодирующей последовательностью гена

pDONR207_MtNF-YC1 Вектор ввода с кодирующей последовательностью гена

pDONR207_MtNF-YC2 Вектор ввода с кодирующей последовательностью гена

pDONR207_MtNF-YC3 Вектор ввода с кодирующей последовательностью гена

pDONR207_MtNF-YC7 Вектор ввода с кодирующей последовательностью гена

pDONR207_MtL1L Вектор ввода с кодирующей последовательностью гена

pDONR207_MtLEC1 Вектор ввода с кодирующей последовательностью гена

Дрожжевая двугибридная система

pGADT7-GW_MtNF-YA3 Вектор назначения с активирующим доменом GAL4

pGBKT7-GW_MtNF-YA3 Вектор назначения со связывающим доменом GAL4

pGADT7-GW_MtNF-YA4 Вектор назначения с активирующим доменом GAL4

pGBKT7-GW_MtNF-YA4 Вектор назначения со связывающим доменом GAL4

pGADT7-GW_MtNF-YA8 Вектор назначения с активирующим доменом GAL4

pGBKT7-GW_MtNF-YA8 Вектор назначения со связывающим доменом GAL4

pGADT7-GW_MtNF-YC1 Вектор назначения с активирующим доменом GAL4

pGBKT7-GW_MtNF-YC1 Вектор назначения со связывающим доменом GAL4

pGADT7-GW_MtNF-YC2 Вектор назначения с активирующим доменом GAL4

pGBKT7-GW_MtNF-YC2 Вектор назначения со связывающим доменом GAL4

pGADT7-GW_MtNF-YC3 Вектор назначения с активирующим доменом GAL4

pGBKT7-GW_MtNF-YC3 Вектор назначения со связывающим доменом GAL4

pGADT7-GW_MtNF-YC7 Вектор назначения с активирующим доменом GAL4

pGBKT7-GW_MtNF-YC7 Вектор назначения со связывающим доменом GAL4

pGADT7-GW_MtL1L Вектор назначения с активирующим доменом GAL4

pGBKT7-GW_MtL1L Вектор назначения со связывающим доменом GAL4

pGADT7-GW_MtLEC1 Вектор назначения с активирующим доменом GAL4

pGBKT7-GW_MtLEC1 Вектор назначения со связывающим доменом GAL4

Сверхэкспрессия

pMDC32_MtNF-YA3 Вектор назначения для сверхэкспрессии

pMDC32_MtL1L Вектор назначения для сверхэкспрессии

pMDC32_MtLEC1 Вектор назначения для сверхэкспрессии

Плазмиды МоС1о для совместной сверхэкспрессии генов

pICH41308_MtNF-YA4 Вектор уровня 0 с кодирующей последовательностью гена

pICH41308_MtNF-YC3 Вектор уровня 0 с кодирующей последовательностью гена

pICH41308_MtL1L Вектор уровня 0 с кодирующей последовательностью гена

pICH41308_MtLEC1 Вектор уровня 0 с кодирующей последовательностью гена

pICH41308_HygR Вектор уровня 0 с кодирующей последовательностью гена

pICH47732_MtL1L Вектор уровня 1 с последовательностью промотора и терминатора 35S из вируса мозаики цветной капусты, 5'иТК. и 3'UTR О из вируса табачной мозаики

pICH47732_MtLEC1 Вектор уровня 1 с последовательностью промотора и терминатора 35S из вируса мозаики цветной капусты, 5'иТК. и 3'UTR О из вируса табачной мозаики

pICH47742_MtNF-YC3 Вектор уровня 1 с последовательностью промотора и терминатора 35S из вируса мозаики цветной капусты, 5'иТК. и 3'UTR О из вируса табачной мозаики

pICH47751_HygR Вектор уровня 1 с последовательностью промотора и терминатора 35S из вируса мозаики цветной капусты, 5'иТК. и 3'UTR О из вируса табачной мозаики

pICH47761_MtNF-YA4 Вектор уровня 1 с последовательностью промотора и терминатора 35S из вируса мозаики цветной капусты, 5'иТК. и 3'UTR О из вируса табачной мозаики

pAGM4673 p35S:MtL1L:t35S p35S:MtNF-YC3:t35S p35S:HygR:t35S p35S:MtNF-YA4:t35S Вектор уровня 2 для трансформации в агробактерии

pAGM4673 p35S:MtLEC1:t35S p35S:MtNF-YC3:t35S p35S:HygR:t35S p35S:MtNF-YA4:t35S Вектор уровня 2 для трансформации в агробактерии

pAGM4673 p35S:GUS:t35S p35S:HygR:t35S Вектор уровня 2 для трансформации в агробактерии Плазмида получена в результате работы Константинова З.С.