Мультифункциональный ядерный белок эукариот Е(у)2 и механизм его действия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук Краснов, Алексей Николаевич

• Краснов, Алексей Николаевич
• доктор биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор биологических наук Краснов, Алексей Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Инициация транскрипции РНК полимеразы II эукариот.

1.1. РНК полимераза II.

1.2. Коровые элементы промотора.

1.3. Базальная транскрипция. Общие факторы транскрипции.

1.4. Семейство TRF (ТВР-подобных факторов).

2. Хроматин.

2.1. Структура хроматина. Модификации гистонов.

2.2. Структурные и биохимические особенности гетерохроматина.

2.3. Гетерохроматин и транскрипция. Эффект положения гена.

2.4. Белковые комплексы, изменяющие структуру хроматина.

3. Gcn5-содержащие комплексы многоклеточных.

3.1. Транскрипция и ацетилирование.

3.2. Структурная организация GCN5 и PCAF белков и их функции.

3.3. ССЫ5-содержащие STAGA/TFTC-подобные комплексы массой 2 МДа.

3.4. GCNS-содержащие АТАС комплексы массой 700 кДа.

3.5. Трехмерная структура SAGA/TFTC-подобных комплексов.

3.6. Функции GCNS-содержащих комплексов.

4. Экспорт мРНК и транскрипция.

4.1. Рецептор и адаптеры экспорта мРНК.

4.2. TREX комплекс.

4.3. Sac3-Thp 1 -Sus 1 -Cdc31 комплекс.

5. Транскрипция на периферии ядра.

5.1. Эпигенетическое состояние генома.

5.2. Транскрипционно неактивный хроматин и ядерная периферия. Репрессия теломер у дрожжей.

5.3. Ядерная ламина и репрессия генов.

5.4. Транскрипционно активные гены на периферии ядра.

5.5. Влияние мРНК на прикрепление генов к ядерным порам.

5.6. SAGA комплекс участвует в организации связывания генов с ядерной порой.

6. Инсуляторы.

6.1. Доменная организация генома.

6.2. Инсуляторы генов теплового шока (scs и scs').

6.3. Su(Hw)-3aBHCHMbift инсулятор.

6.4. Инсуляторы в регуляторной области гена Abd-B.

6.5. Инсуляторы бета-глобиновых генов кур и млекопитающих.

6.6. Инсуляторы локуса HI9Tgf2.

6.7. Барьерная активность бета-глобиновых инсуляторов.

7. Гены теплового шока.

7.1. Гены теплового шока как модельная система.

7.2. Строение промотора.

7.3. Факторы теплового шока.

7.4. Транскрипция гена hsp70.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

2. Работа с дрожжами. Скрининг библиотеки кДНК в двугибридной системе.

3. Работа с клетками.

4. Работа с ДНК.

5. Работа с РНК.

6. Работа с белками.

7. Иммуноокрашивание.

8. Гибридизация in situ.

9. Электронная микроскопия.

10. Анализ изображений.

11. Хроматиниммунопреципитация.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Белок Е(у)2 важный компонент транскрипционной машины эукариот.

1.1. Введение.

1.2. Поиск белков, взаимодействующих с Е(у)2, в дрожжевой двухгибридной системе.

2. Анализ структуры гена и белка Е(у)2 эукариот.

2.1. Анализ аминокислотной последовательности белка Е(у)2 эукариот: у D.melanogaster существует ген-паралог е(у)2Ь.

2.2. Анализ экзон-интронной структуры гена е(у)2: ген е(у)2 является ретрокопией гена е(у)2Ь.

2.3. Е(у)2 экспрессируется повсеместно, тогда как Е(у)2Ь обладает тканеспецифичной экспрессией.

2.4. Промоторные регионы е(у)2 и е(у)2Ь генов обеспечивают их экспрессионный паттерн: в то время как е(у)2 обладает повсеместной экспрессией, экспрессия е(у)2Ь ограничена стадией первичных сперматоцитов.

2.5. Белок Е(у)2Ь не способен функционально заменить Е(у)2.

3. Белок Е(у)2 входит в состав SAGA гистонацетилтрансферазного комплекса дрозофилы.

3.1. Изучение взаимодействия Е(у)2 с компонентами SAGA комплекса дрозофилы.

3.2. Изучение внутриклеточной локализации Е(у)2 и компонентов SAGA комплекса дрозофилы.

4. SAGA комплекс участвует в транскрипции гена hsp70 до и после теплового шока.

4.1. Основные компоненты TFIID комплекса покидают сайты генов теплового шока после их активации.

4.2. Компоненты GCN5 НАТ-содержащего комплекса и комплекса Mediator, а также HSF присутствуют в сайтах теплового шока после их активации.

4.3. Данные хроматин-иммунопреципитации подтверждают данные иммуноокрашивания политенных хромосом.

5. Е(у)2 входит с состав нового ассоциированного с ядерной порой комплекса АМЕХ, который участвует в организации экспорта мРНК.

5.1. Е(у)2 взаимодействует с белком Xmas-2 (X-linked male sterile-2).

5.2. Белки E(y)2 и Xmas-2 необходимы для экспорта мРНК из ядра в цитоплазму.

5.3. Белки Е(у)2 и Xmas-2 необходимы для экспорта транскриптов hsp70 генов.

5.4. Изучение влияния Е(у)2 и Xmas-2 на расположение hsp70 локусов внутри ядра.

5.5. Изучение влияния Е(у)2 и Xmas-2 на регуляцию транскрипции hsp70 генов.

5.6. Е(у)2 необходим для экспорта мРНК гена trf2.

6. Е(у)2 входит в состав деубиквитиназного модуля SAGA комплекса, участвующего в формировании активной формы хроматина.

6.1. Белки Е(у)2, Nonstop, Sgfll формируют тройной модуль SAGA комплекса.

6.2. SAGA комплекс человека способен деубиквитинилировать гистоны Н2В и Н2А in vitro.

6.3. Деубиквитиназный модуль блокирует репрессию, опосредованную гетерохроматином.

7. Е(у)2 является новым компонентом 8и(Нш)-зависимых инсуляторов дрозофилы.

7.1. Е(у)2 взаимодействует с доменами цинковых пальцев белка Su(Hw).

7.2. Изучение взаимодействия Е(у)2 и Su(Hw) in vivo.

7.3. Е(у)2 рекрутируется на 8и(Н\¥)-зависимые инсуляторы.

7.4. Е(у)2 необходим для барьерной функции 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов.

7.5. Е(у)2 необходим для рекрутирования SAGA комплекса на 8и(Н\у)-зависимые инсуляторы.

7.6. Модель Su(Hw)-3aBHCHMoro инсулятора.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Основные результаты.

2. Ген е(у)2 функционально заменил исходный ген е(у)2Ъ в процессе эволюции.

3. Е(у)2 - новый компонент SAGA комплекса дрозофилы.

4. SAGA комплекс участвует в транскрипции гена hsp70 до и после теплового шока.

5. Е(у)2 входит с состав нового комплекса, осуществляющего экспорт мРНК.

6. Е(у)2 в комплексе с Xmas-2 осуществляет прикрепление hsp70 локусов к NPC.

7. Е(у)2 координирует транскрипцию генов, прикрепление к NPC и экспорт мРНК.

8. Биологический смысл прикрепления hsp70 локусов к ядерной поре.

9. Е(у)2 - новый белковый компонент 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов.

10. Возможные механизмы барьерной активности 8и(Н\у)-инсуляторов.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Мультифункциональный ядерный белок эукариот Е(у)2 и механизм его действия»

В последние годы произошел значительный прорыв в молекулярной биологии и медицине. Определены нуклеотидные последовательности геномов многих организмов, картированы гены, определены последовательности белков. В эту постгеномную эру важный вопрос заключается в том, какие механизмы лежат в основе реализации этой первичной генетической информации, как организм регулирует транскрипцию многих генов, какие регуляторные факторы задействованы и как. Большое значение имеет изучение взаимосвязей между различными этапами экспрессии генов и механизмов контроля этих этапов в процессе развития организма.

Исследование инсуляторов и других регуляторных элементов генома важно не только для понимания работы транскрипционной сети клетки, но и имеет большое прикладное значение для медицины, фармакологии и биотехнологии. Инсуляторы играют важную роль при создании ДНК-векторов для продукции биологически активных белков человека, используемых для диагностики и лечения различных заболеваний. Уровень продукции лекарственных белков напрямую зависит от эффективности работы этих регуляторных областей.

Многочисленные исследования показали, что в регуляции экспрессии генов задействовано несколько дискретных, контролируемых процессов: изменение структуры хроматина, изменение локализации гена внутри ядра и привлечение на промотор гена мультибелковых комплексов, активация транскрипции, элонгация и процессинг мРНК, экспорт мРНК из ядра в цитоплазму. В данной работе впервые описан механизм действия белка Е(у)2, связывающий все эти этапы реализации генетической информации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Краснов, Алексей Николаевич

выводы.

1. Найден ген е(у)2Ь, кодирующий белок Е(у)2Ь, являющийся паралогом белка Е(у)2. В то время как Е(у)2 экспрессируется во всех тканях организма и на всех стадиях развития, Е(у)2Ь является белком, специфическим для мужских зародышевых клеток. Показано, что ген е(у)2 является ретрокопией гена е(у)2Ь. Показано, что ретрокопия гена может функционально заменить исходный ген в эволюции.

2. Белок Е(у)2 входит в состав SAGA транскрипционного комплекса дрозофилы. Часть Е(у)2-содержащих SAGA комплексов находится в контакте с ядерными порами.

3. Изучена роль SAGA комплекса в активации транскрипции гена теплового шока hsp70. Показано, что именно SAGA, а не общие транскрипционные факторы, формирующие преинициаторный комплекс РНК-полимеразы II (TFIID, TFIIB и TFIIF), участвует в реинициации транскрипции на промоторе гена hsp70 при тепловом воздействии. Таким образом, SAGA комплекс необходим для активации транскрипции генов ответа на стресс.

4. Е(у)2 взаимодействует с белком Xmas-2 и вместе с ним входит в состав нового ассоциированного с ядерной порой комплекса АМЕХ, который участвует в организации экспорта мРНК. На модели кластера SAGA-зависимых генов теплового шока hsp70 было показано, что Е(у)2 является белком, координирующим транскрипцию hsp70 генов, их прикрепление к NPC и экспорт мРНК.

5. Показано, что Е(у)2 и Xmas-2 (комплекс АМЕХ) играют роль в тотальном экспорте мРНК из ядра в цитоплазму. В частности, АМЕХ участвует в транспорте мРНК генов домашнего хозяйства trf2 и actin из ядра в цитоплазму.

6. Идентифицирован компонент SAGA комплекса Sgfll, с которым непосредственно взаимодействует Е(у)2 в составе этого комплекса. Показано, что GCN5-coдержащий SAGA комплекс многоклеточных обладает деубиквитиназной активностью гистонов Н2А и Н2В. Идентифицированы три субъединицы SAGA комплекса человека Е(у)2, Sgfl 1 и Nonstop, которые формируют деубиквитиназный модуль. Показано, что этот модуль способен блокировать репрессию, опосредованную гетерохроматином и действовать как позитивный кофактор для активации транскрипции ядерными рецепторами.

7. Показано, что Е(у)2 является белковым компонентом Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов. Е(у)2 связывается с доменом цинковых пальцев белка Su(Hw) и необходим для барьерной, но не для энхансер-блокирующей, активности 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов. Показано, что SAGA комплекс рекрутируется на 8и(Н\у)-зависимые инсуляторы и что белок Е(у)2 необходим для этого. Предложена модель SuHw-E(y)2-SAGA инсуляторного комплекса, согласно которой, роль Е(у)2 в осуществлении барьерной функции заключается в рекрутировании гистон модифицирующих ферментов GCN5 и Nonstop на инсуляторы, что в свою очередь препятствует распространению гетерохроматина и репрессирующему действию белков группы Polycomb.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Краснов, Алексей Николаевич, 2009 год

1. Abruzzi, К. С., Belostotsky, D. A., Chekanova, J. A., Dower, К., and Rosbash, М. (2006) З'-end formation signals modulate the association of genes with the nuclear periphery as well as mRNP dot formation, EMBOJ25, 4253-4262.

2. Abruzzi, К. C., Lacadie, S., and Rosbash, M. (2004) Biochemical analysis of TREX complex recruitment to intronless and intron-containing yeast genes, EMBO J 23, 26202631.

3. Adelman, K., Marr, M. Т., Werner, J., Saunders, A., Ni, Z., Andrulis, E. D., and Lis, J. T. (2005) Efficient release from promoter-proximal stall sites requires transcript cleavage factor TFIIS, Mol Cell 17, 103-112.

4. Ahn, S. G., and Thiele, D. J. (2003) Redox regulation of mammalian heat shock factor 1 is essential for Hsp gene activation and protection from stress, Genes Dev 17, 516-528.

5. Akhtar, A., and Gasser, S. M. (2007) The nuclear envelope and transcriptional control, Nat Rev Genet 8, 507-517.

6. Andrulis, E. D., Neiman, A. M., Zappulla, D. C., and Sternglanz, R. (1998) Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silencing, Nature 394, 592-595.

7. Andrulis, E. D., Zappulla, D. C., Ansari, A., Perrod, S., Laiosa, С. V., Gartenberg, M. R., and Sternglanz, R. (2002) Escl, a nuclear periphery protein required for Sir4-based plasmid anchoring and partitioning, Mol Cell Biol 22, 8292-8301.

8. Aoyagi, N., and Wassarman, D. A. (2000) Genes encoding Drosophila melanogaster RNA polymerase II general transcription factors: diversity in TFIIA and TFIID components contributes to gene-specific transcriptional regulation, J Cell Biol 150, F45-50.

9. Asturias, F. J. (2004) RNA polymerase II structure, and organization of the prcinitiation complex, Сип-Opin Struct Biol 14, 121-129.

10. Avramova, Z., and Tikhonov, A. (1999) Are scs and scs' 'neutral' chromatin domain boundaries of the locus?, Trends Genet 15, 138-139.

11. Becker, P. В., and Horz, W. (2002) ATP-dependent nucleosome remodeling, Annu Rev Biochem 71, 247-273.

12. Bell, A. C., and Felsenfeld, G. (2000) Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene, Nature 405, 482-485.

13. Bell, А. С., West, A. G., and Felsenfeld, G. (1999) The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators, Cell 98, 387-396.

14. Bell, В., and Tora, L. (1999) Regulation of gene expression by multiple forms of TFIID and other novel TAFII-containing complexes, Exp Cell Res 246, 11-19.

15. Bender, M. A., Bulger, M., Close, J., and Groudine, M. (2000) Beta-globin gene switching and DNase I sensitivity of the endogenous beta-globin locus in mice do not require the locus control region, Mol Cell 5, 387-393.

16. Bender, M. A., Reik, A., Close, J., Telling, A., Epner, E., Fiering, S., Hardison, R., and Groudine, M. (1998) Description and targeted deletion of 5' hypersensitive site 5 and 6 of the mouse beta-globin locus control region, Blood 92, 4394-4403.

17. Berger, S. L. (2002) Histone modifications in transcriptional regulation, Curr Opin Genet Dev 12, 142-148.

18. Blackwood, E. M., and Kadonaga, J. T. (1998) Going the distance: a current view of enhancer action, Science 281, 60-63.

19. Blake, M. C., Jambou, R. C., Swick, A. G., Kahn, J. W., and Azizkhan, J. C. (1990) Transcriptional initiation is controlled by upstream GC-box interactions in a TATAA-less promoter, Mol Cell Biol 10, 6632-6641.

20. Blanton, J., Gaszner, M., and Schedl, P. (2003) Protein:protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo, Genes Dev 17, 664-675.

21. Boellmann, F., Guettouche, Т., Guo, Y., Fenna, M., Mnayer, L., and Voellmy, R. (2004) DAXX interacts with heat shock factor 1 during stress activation and enhances its transcriptional activity, Proc Natl Acad Sci US A 101, 4100-4105.

22. Bondarenko, V. A., Liu, Y. V., Jiang, Y. I., and Studitsky, V. M. (2003) Communication over a large distance: enhancers and insulators, Biochem Cell Biol 81, 241-251.

23. Brand, M., Yamamoto, K., Staub, A., and Tora, L. (1999) Identification of TATA-binding protein-free TAFII-containing complex subunits suggests a role in nucleosome acetylation and signal transduction, J Biol Chem 274, 18285-18289.

24. Brasset, E., and Vaury, C. (2005) Insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes, Heredity 94, 571-576.

25. Brickner, J. H., and Walter, P. (2004) Gene recruitment of the activated INOl locus to the nuclear membrane, PLoS Biol 2, e342.

26. Brownell, J. E., Zhou, J., Ranalli, Т., Kobayashi, R., Edmondson, D. G., Roth, S. Y., and Allis, C. D. (1996) Tetrahymena histone acetyltransferase A: a homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation, Cell 84, 843-851.

27. Buchenau, P., Hodgson, J., Strutt, H., and Arndt-Jovin, D. J. (1998) The distribution of polycomb-group proteins during cell division and development in Drosophila embryos: impact on models for silencing, J Cell Biol 141, 469-481.

28. Bulger, M., and Groudine, M. (1999) Looping versus linking: toward a model for longdistance gene activation, Genes Dev 13, 2465-2477.

29. Burke, T. W., and Kadonaga, J. T. (1997) The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila, Genes Dev 11, 3020-3031.

30. Burke, T. W., and Kadonaga, J. T. (1996) Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters, Genes Dev 10, 711-724.

31. Butler, J. E., and Kadonaga, J. T. (2002) The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression, Genes Dev 16, 2583-2592.

32. Cai, H. N., and Shen, P. (2001) Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity, Science 291, 493-495.39.