Научное обоснование методов контроля остаточных количеств лекарственных средств и диоксинов в продукции животного происхождения, кормах и окружающей среде тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Сатюкова Людмила Павловна

• Сатюкова Людмила Павловна
• доктор наук
• 2025

Оглавление диссертации доктор наук Сатюкова Людмила Павловна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика антибиотиков. Их классификация

1.2 Характеристика исследуемых лекарственных препаратов

1.2.1 Хлорамфеникол

1.2.2 Сульфаниламиды

1.2.3 Нитрофураны

1.2.4 Макролиды

1.2.5 Хинолоны

1.2.6 Тетрациклины

1.2.7 Аминогликозиды

1.3 Способы получения лекарственных препаратов

1.4 Применение антибиотиков при выращивании сельскохозяйственных животных

1.5 Необходимость применения антибиотиков в животноводстве и птицеводстве

1.6 Опасность применения антибиотиков, в животноводстве и птицеводстве

1.7 Мониторинговый анализ лекарственных препаратов в РФ

1.8 Контроль остаточных количеств лекарственных средств в Российской Федерации

1.9 Методы обнаружения остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства и птицеводства

2.1 Чужеродные экотоксиканты и методы контроля в ветеринарии

2.2 Основные факторы воздействия диоксинов и диоксиноподобных конгенеры

2.3 Молекулярный механизм действия диоксинов. Диоксиновый рецептор

2.4 Признаки интоксикации животных диоксинами

2.5 Источники возникновения диоксинов и диоксиноподобных ПХБ

2.6 Источники загрязнения диоксинами пищевых продуктов, комового сырья и кормов, воды и почвы

2.7 Санитарные нормы эквивалента токсичности диоксинов и диоксиноподобных ПХБ

2.8 Методы отбора проб для официального контроля уровней диоксинов (PCDD/PCDF), диоксин-подобных конгенеров и не диоксин-подобных соединений в некоторых пищевых продуктах

2.9 Требования к методам выявления диоксинов и диоксиноподобных ПХБ, которые должны соблюдаться при скрининговых или подтверждающих испытаниях

2.10 Основные современные методы обнаружения диоксинов и диоксиноподобных ПХБ в продуктах питания, кормах, объектах окружающей среды

3 Современные методы выявления лекарственных препаратов и экотоксикантов в объектах ветеринарного надзора в окружающей среде

3.1 Скрининговые методы контроля

3.1.1 Микробиологический скрининговый метод

3.1.2 Группа скрининговых методов иммуноанализа для определения лекарственных препаратов и экотоксикантов

3.1.3 Биологический скрининговый метод для определения диоксинов -метод DR.CALUX®

3.2 Подтверждающие методы определения лекарственных препаратов и диоксинов в объектах ветеринарного надзора и окружающей среды

3.2.1 Метод ВЭЖХ МС/МС определения лекарственных препаратов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1 Основное содержание работы

4.2 Объекты исследования

4.3 Оборудование и реактивы

4.4 Методика расчета метрологических характеристик

4.5 Методика измерения хлорамфеникола в пищевом сырье и продукции животного происхождения, комовом сырье и готовых кормах с помощью тест-набора 1пСЛР

4.5.1 Приготовление рабочих растворов

4.5.2 Пробоподготовка сырья и продукции животного происхождения, сырья кормового и кормов для продуктивных и непродуктивных животных

4.5.3 Методика измерения с помощью тест-системы ИФА анализа

4.5.4. Определение метрологических характеристик методики

измерений хлорамфеникола

4.6.1 Приготовление рабочих растворов

4.6.2 Пробоподготовка сырья и продукции животного происхождения, сырья кормового и кормов для продуктивных и непродуктивных животных

4.6.3 Методика ИФА измерения

4.6.4 Определение метрологических характеристик методик измерений метоболитов нитрофуранов

4.7 Методика измерения стрептомицина в пищевом сырье и продукции животного происхождения, комовом сырье и готовых кормах с помощью тест-набора InSTREPTO

4.7.1 Приготовление рабочих растворов

4.7.2 Пробоподготовка сырья и продукции животного происхождения, сырья кормового и кормов для продуктивных и непродуктивных животных

4.7.3 Методика ИФА измерения

4.7.4 Определение метрологических характеристик методики измерений стрептомицина

4.8 Методика измерения антибиотиков сульфаниламидной группы хлорамфеникола в пищевом сырье и продукции животного происхождения, комовом сырье и готовых кормах с помощью тест-набора InSULFA

4.8.1 Приготовление рабочих растворов

4.8.2 Пробоподготовка сырья и продукции животного происхождения, сырья кормового и кормов для продуктивных и непродуктивных животных

4.8.3 Методика ИФА измерения

4.9 Методика измерения антибиотиков группы хинолонов в пищевом сырье и продукции животного происхождения с помощью тест-набора

ГпдШШ

4.9.1 Приготовление рабочих растворов

4.9.2 Пробоподготовка сырья и продукции животного происхождения

4.9.3 Методика ИФА измерения

4.9.4 Определение метрологических характеристик методики измерений хинолонов

4.10 Методика измерения антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевом сырье и продукции животного происхождения, комовом сырье и готовых кормах с помощью тест-набора InTETRACYCLINE

4.10.1 Приготовление рабочих растворов

4.10.2 Пробоподготовка сырья и продукции животного происхождения, сырья кормового и кормов для продуктивных и непродуктивных животных

4.10.3 Методика ИФА измерения

4.10.4 Определение метрологических характеристик методики измерений тетрациклинов

4.11 Методика измерения пенициллина в пищевом сырье и продукции животного происхождения, комовом сырье и готовых кормах с помощью тест-набора InPENICILLIN

4.11.1 Приготовление растворов

4.11.2 Пробоподготовка сырья и продукции животного происхождения, сырья кормового и кормов для продуктивных и непродуктивных животных

4.11.3 Методика ИФА измерения

4.11.4 Определение метрологических характеристик методики измерений пенициллина

5.1 Расчет метрологических характеристик нитрозамина АГД

5.2 Расчет метрологических характеристик стрептомицина

6.1 Методика измерения тилозина в пищевой продукции и кормах с

помощью тест-набора InTYLOSIN

6.1.1 Приготовление растворов

6.1.2 Пробоподготовка образцов для исследования

6.1.3 Методика ИФА измерения

6.1.4 Определение метрологических характеристик методики измерений тилозина

6.1.5 Усовершенствование метода выявления тилозина

7 Анализ мониторинговых испытаний продукции животного

происхожденя и кормов унифицированным методом выявления остаточных количеств лекарственных средств

8.1 Метод количественного контроля остаточных количеств диоксинов в продукции животного происхождения, кормах и окружающей среде с помощью тест-набора In®Dioxm/Furan

8.2 Оборудование и реактивы

8.3 Условия выполнения измерений и требования безопасности

8.4 Отбор и хранение проб

8.5 Подготовка к выполнению измерений

8.5.1 Подготовка оборудования

8.5.2 Приготовление растворов и вспомогательных материалов для пробоподготовки

8.6 Пробоподготовка образцов

8.6.1 Пробоподготовка воды

8.6.2 Пробоподготовка мяса, рыбы, рыбной продукции и объектов нерыбного промысла в том числе сушёной продукции и рыбной продукции для детского питания; яиц (без пересчета на жир)

8.6.3 Пробоподготовка мяса, мясных продуктов, субпродуктов и консервов из них, молочных продуктов, молока, яиц и продуктов из них, в том числе детского пита-ния в пересчёте на жир

8.6.4 Пробоподготовка зерна для кормовых и пищевых целей, продуктов переработки зерна, кормового сырья, кормов и комбикормов на зерновой основе

8.6.5 Пробоподготовка почвы и донных отложений

8.7 Порядок выполнения измерений с помощью тест-набора In®Dioxm/Furan

8.8 Определение метрологических характеристик методики измерений диоксинов

9 Мониторинговый контроль продукции животного происхождения,

кормов и окружающей среды в период с 2018 по 2024 года

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ОБОЗНАЧЕНИЯ, СОКРАЩЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

532

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Научное обоснование методов контроля остаточных количеств лекарственных средств и диоксинов в продукции животного происхождения, кормах и окружающей среде»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Обеспечение качества и безопасности пищевой продукции является одной из приоритетных задач государственной политики Российской Федерации. Это отражено в Стратегии повышения качества и безопасности пищевой продукции в Российской Федерации до 2030 года, утвержденной распоряжением Правительства Российской Федерации от 08 сентября 2022 года № 2567-р [1. Распоряжение Правительства РФ от 8 сентября 2022 г. № 2567-р]. Основные цели Стратегии включают обеспечение полноценного питания, профилактику заболеваний, повышение продолжительности и качества жизни населения, а также стимулирование производства и реализации на рынке пищевой продукции надлежащего качества [1. Распоряжение Правительства РФ от 8 сентября 2022 г. № 2567-р]. Для достижения поставленных целей требуется совершенствование систем прослеживаемости, методов контроля качества и безопасности пищевого сырья, кормов для животных, а также мониторинга окружающей среды. Особое внимание уделяется необходимости разработки и внедрения современных методов анализа, которые позволят расширить диапазоны определения и перечень контролируемых показателей безопасности продукции. Это особенно важно в свете требований Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации, которая подчеркивает необходимость обеспечения высоких стандартов качества пищевой продукции и кормов [2. Указ Президента Российской Федерации от 28.02.2024 № 145 «О Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации»].

Одной из ключевых задач научно-технологического развития, обозначенной в Указе Президента Российской Федерации от 28 февраля 2024 г. № 145 «О Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации», является обеспечение производства высококачественной, биологически полноценной и безопасной животноводческой продукции, кормов, а также контроль экосистем сельскохозяйственных угодий и окружающей среды [2. Указ Президента Российской Федерации от 28.02.2024 № 145 «О Стратегии

научно-технологического развития Российской Федерации»].

Ветеринарные препараты, широко используемые в животноводстве для лечения, профилактики заболеваний и стимуляции роста, при неправильном применении могут приводить к накоплению их остатков в пищевых продуктах. Это представляет серьезную угрозу для здоровья потребителей, так как такие вещества могут вызывать аллергические реакции, способствовать развитию антибиотикорезистентности, оказывать токсическое, канцерогенное или тератогенное действие [Baynes R. E., Dedonder и др., 2016; Beyene 2016]. В связи с этим особую актуальность приобретает контроль качества мясной и другой продукции животного происхождения на всех этапах производства, включая обязательную ветеринарно-санитарную экспертизу [Егоров Н.С., 2004; Базарнова Ю.Г., 2005]. Модификации тилозинсодержащих препаратов проявляют высокую лечебно-профилактическую эффективность при бактериальных болезнях молодняка и рекомендованы для использования в ветеринарной практике [Зуев Н.П., 2018]. Несмотря на все плюсы лекарственного препарата тилозина, в случае его нерационального применения при лечении животных, остатки антибиотика попадают в продукты животного происхождения - молоко, молочные продукты, мясо, мясные продукты, рыбу, морепродукты, яйца, яйцепродукты, мёд, сырье и корма для продуктивных и непродуктивных животных и птиц. Употребление такой пищи может снизить эффективность лечения инфекционных заболеваний у человека, привести к возникновению нечувствительных к данному антибиотику (резистентных) штаммов микроорганизмов. Пищевая добавка Е713 (тилозин) — относится к антибиотикам, используется в технологических целях в процессе производства пищевых продуктов [Гуляева А.Ю., 2023].

Еще одной значимой проблемой является загрязнение окружающей среды стойкими органическими загрязнителями (СОЗ), среди которых наиболее опасными считаются диоксиниы и диоксиноподобные соединения. Эти вещества обладают высокой токсичностью и способностью накапливаться в биологических объектах, что приводит к массовым отравлениям животных и

человека, а также к выбраковке продукции животноводства и кормов [Желтов В.А., 2004]. Хотя в России официально не зарегистрированы случаи отравления животных диоксинами, их присутствие в продуктах животноводства и объектах окружающей среды выявляется все чаще, что свидетельствует о реальной угрозе для здоровья населения и животных [Желтов В.А., 2002; Сара-пулова Г.И., 2005].

Особую сложность представляет анализ диоксинов из-за необходимости разделения многочисленных конгенеров в многокомпонентных смесях [Сара-пулова Г.И., 2011; Тремасов М.Я., 2010]. В настоящее время критерии безопасности, установленные в Технических регламентах Таможенного Союза «О безопасности пищевой продукции», гармонизируются с международными стандартами, такими как Директивы Европейского Союза и Кодекс Алимен-тариус. Однако эти документы требуют постоянного обновления и совершенствования в связи с появлением новых данных о токсигенности и распространении загрязнителей.

Таким образом, усовершенствование отечественных тест-систем ИФА, разработка и внедрение современных унифицированных методов выявления лекарственных средств и диоксинов в продукции животноводства, кормах и окружающей среде являются актуальной научной и практической задачей, решение которой будет способствовать обеспечению безопасности и качества жизни населения.

Степень научной разработанности темы. На сегодняшний день накоплен значительный объем данных, свидетельствующих о загрязнении продуктов питания и окружающей среды диоксинами, тяжелыми металлами и лекарственными веществами в концентрациях, превышающих установленные нормативы [Галимзянова Г.Д., Федоров Г.Ю., 2016; Новиков В.А., Тремасов М.Я., Иванов А.А., 2011]. Одной из ключевых проблем является контаминация сырья и продуктов питания антропогенными и природными токсикантами, что создает серьезные риски для безопасности пищевой продукции [Витол И.С. и

др., 2010].

Особую актуальность приобретают вопросы совершенствования методов оценки безопасности сырья и продукции животного происхождения, а также гармонизации критериев безопасности с международными требованиями. Это связано с процессами технического регулирования и интеграции в рамках Евразийского экономического союза и Всемирной торговой организации [Алексеева Е.Ю., Посконная Т.Ф., 2004; Романенко Г.А., 2005].

Неправильное использование антибиотиков, особенно тилозина в ветеринарной практике может приводить к накоплению их остатков в пищевом сырье и готовой продукции. Это обуславливает необходимость контроля остаточного содержания антибиотиков на всех этапах производства, а также при мониторинге окружающей среды [Долгов В.А. и др., 2015; Шурдуба Н.А. и др., 2013; Белоусов В.И., Виткова О.Н., 2015; Sachi S., Ferdous J. и др., 2019].

Для контроля лекарственных препаратов и экотоксикантов в настоящее время используются высокочувствительные, но относительно затратные и трудоемкие методы токсико-химического анализа, такие как газовая и жидкостная хроматография [Дорожкин В.И., Желтов В.А., 2015]. Практическая значимость контроля точности результатов измерений массовой доли тило-зина, позволяет решить возможность аттестации методики контроля тилозина [Гуляева А.Ю., Хрущев А.Ю. и др. 2023]. При отборе проб для анализа эко-токсиканотов необходимо учитывать особенности поведения и распределения диоксинов и их производных в организме и окружающей среде. Диоксины поступают в природу в составе сложных многокомпонентных смесей, что значительно усложняет их идентификацию и количественное определение [Желтов В.А., 2002; Тремасов М.Я., 2009].

В связи с необходимостью проведения масштабных мониторинговых исследований особое внимание уделяется разработке и внедрению унифицированных современных методов выявления остаточных количеств лекарственных средств и диоксинов в продукции животного происхождения, кормах и окружающей среде. Наиболее перспективными в этом направлении являются методы на основе иммуноферментного анализа (ИФА), а также

усовершенствованные подходы к совокупности действий над объектом анализа [Желтов В.А., 2015; Тремасов М.Я., 2010].

Таким образом, несмотря на значительное количество известных методов контроля, создание более доступных, точных и высокочувствительных отечественных тест-систем и разработка к ним унифицированных методик, соответствующих современным требованиям безопасности контроля лекарственных препаратов, диоксинов и диоксиноподобных соединений в продуктах ветеринарного контроля и объектах окружающей среды, остается актуальной задачей.

Целью данной работы совершенствование унифицированных высокочувствительных средств контроля и методов выявления количесвтенного содержания остаточных количеств лекарственных средств, диоксинов и диокси-ноподобных конгенеров в продукции животноводства, кормах и окружающей среде с использованием единой вытяжки при уникальной пробоподготовке, как скрининговым методом иммуноферментного анализа (ИФА), так и подтверждающими методами ВЭЖХ МС/МС и ГХ МС/МС ВР.

Для достижения указанной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать унифицированные методы выявления остаточных количеств токсикантов на основе как для проведения иммуноферментного анализа (ИФА), так и проведении анализа подтверждающими методами ВЭЖХ МС/МС и ГХ МС/МС ВР, позволяющие обеспечение биологическую безопасность и проводить оперативный мониторинговый контроль пищевой и кормовой продукции ветеринарного надзора и окружающей среды в условиях производственных и аккредитованных лабораторий.

2. Провести метрологическую аттестацию разработанных унифицированных методов, включая определение основных стандартных характеристик (точность, чувствительность, селективность, воспроизводимость, правильность) в соответствии с требованиями ГОСТ КОЛЕС 17025-2019 и ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002.

3. Разработать и валидировать новый унифицированный метод выявления диоксина и диоксиноподобных конгенеров, с помощью твердофазной хроматографической диоксиновой колонки, обеспечивающей высокую степень извлечения целевых аналитов из сложных матриц (мясо, молоко, яйцо, мёд, рыба, нерыбные продукты, корма, почва, вода).

4. Оценить правильность получаемых результатов в продуктах животного происхождения, кормах и объектах окружающей среды с использованием внутренних стандартов (спайк-образцов) и стандартных образцов 2,3,7,8-ТХДД (2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин). Подтвердить полученные результаты высокочувствительными методами анализа на основе газовой хроматографии с масс-спектрометрией высокого разрешения (ГХ-МС/МС ВР) и высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектромет-рией (ВЭЖХ-МС/МС).

5. Экспериментально обосновать возможность применимости разработанных унифицированных методов выявления лекарственных средств и диоксинов в продукции животноводства, кормах и окружающей среде с помощью тест-систем ИФА, ВЭЖХ МС/МС и ГХ МС/МС ВР, провести сравнительный анализ этих методов.

Научная новизна работы. При выполнении данной работы были разработаны оригинальные унифицированные способы выявления остаточных количеств лекарственных средств, тилозина и диоксинов из продукции животноводства, кормов и окружающей среды на основе скринингового метода контроля ИФА, а также подтверждающих методов анализа с помощью ВЭЖХ МС/МС и ГХ МС/МС ВР.

- изучены и экспериментально обоснованы унифицированные методы пробоподготовки количественного метода выявления остаточных количеств лекарственных средств, диоксинов и их конгенеров, используя современные отечественные ИФА тест-системы, а также приборные методы контроля с помощью ВЭЖХ МС/МС и ГХ МС/МС ВР, что позволило оптимизировать проведение мониторингового контроля качества и безопасности продуктов

животного происхождения, кормового сырья и кормов для продуктивных и непродуктивных животных, а также объектов окружающей среды;

- усовершенствована методика контроля тилозина в продукции животного происхождения и кормах с применением тест-системы InTYLOSIN, что позволило выявлять остатки данного антибиотика в более низких концентрациях с одновременным анализом большого количества проб. Метод применим как в крупных лабораториях, так и в производственных условиях, что делает его универсальным инструментом для контроля безопасности продуктов животноводства и кормов;

- оптимизирован унифицированный способ концентрирования и выявления на открытых хроматографических твердофазных диоксиновых колонках для выявления сложных смесей диоксинов и их конгенеров, что обеспечило надежную идентификацию и количественный анализ данных веществ с использованием скринингового метода ИФА, а также возможности из полученного эллюента проведения анализа выявления высокотоксичных диоксинов и диоксиноподобных конгенеров, идентифицируя их методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием высокого разрешения.

- изучен и разработан и метрологически аттестован метод количественного определения остаточного содержания суммы диоксинов и их фуранов в продуктах животноводства, кормах и в экосистеме скрининговым методом ИФА с применением современной отечественной тест-системы In®Dioxin/Furan.

- дана оценка преимущества с метрологическим обоснованием усовершенствованных методов контроля остаточного количества лекарственных средств, тилозина и диоксина в продукции животноводства, кормах и окружающей среде.

Теоретическая и практическая значимость

Представленный в настоящей диссертационной работе комплекс современных новых унифицированных методов выявления для контроля важных ксенобиотиков (лекарственных препаратов, тилозина, диоксинов и их

конгенеров) расширяет возможность скринингового метода ИФА, а также проведения анализа из полученных аналитов подтверждающими методами контроля ВЭЖХ МС/МС и ГХ МС/МС ВР в продукции животного происхождения, кормах и окружающей среде.

Данные методы прошли метрологическую аттестацию и официально могут быть использованы для проведения мониторинговых испытаний в аккредитованных и аттестованных лабораториях. Полученные результаты могут служить теоретическим и практическим обоснованием использования разработанных и адаптированных методик для ускоренного контроля остаточных количеств лекарственных препаратов и диоксинов в продукции животного происхождения, кормах и окружающей среде с применением отечественных тест-систем и подтверждающих методов контроля.

Для практического использования разработаны:

- современный скрининговый метод выявления лекарственных препаратов с помощью новых отечественных тест-систем ИФА «Количественное определение остаточного содержания лекарственных препаратов в пищевых продуктах и кормах методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем Ингвар» МИ 06-2023 от 14.03.2023г. (номер в ФР.1.31.2023.45626), что впервые позволяет проводить контроль лекарственных средств едиными современными отечественными тест-наборами Ингвар;

разработана и унифицированная методическая рекомендация скринин-гового метода контроля в продуктах животноводства, кормовом сырье и комбикормах, со снижением границы предела выявления количественного анализа тилозина, чем в аналогичных методах ИФА диагностики, «Скрининг метод определения остаточного содержания тилозина в объектах ветеринарного надзора с использованием усовершенствованной тест-системы ИФА InTYLOSIN®» (рассмотрены на научном совете секции зоотехнии и ветеринарии РАН и рекомендованы к применению (протокол № 2 от 10.04.2025г.));

- разработана и унифицирована методическая рекомендация скрининго-вого метода контроля «Определение остаточного содержания диоксинов и ди-оксиноподобных ПХБ в объектах ветеринарного надзора и объектах окружающей среды методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы In®Dioxin/Furan» (рассмотрены на научном совете секции зоотехнии и ветеринарии РАН и рекомендованы к применению (протокол № 2 от 10.04.2025г.));

Получены патенты:

- №2827514 «Способ определения тилозина в объектах ветеринарного надзора» от 30 сентября 2024 г.;

- № 2829074 «Способ определения диоксинов в объектах ветеринарного надзора» от 23 октября 2024 г.

Данные, полученные в ходе испытаний, используются при обучении студентов (лекции, практические занятия по ветеринарно-санитарной экспертизе, контролю качества пищевой продукции, инструментальному контролю в лабораториях), бакалавров, магистров и аспирантов ФГБОУ ВО «РОСБИО-ТЕХ», ФГАОУ ВО «РУДН им. Патриса Лумумбы», при обучении специалистов Россельхознадзора на курсах дополнительного образования, внедрены и активно применяются в практической деятельности: лаборатория ФГБУ «ВНИИЗЖ», лаборатория ООО ЦСЭМ «Московский», испытательная лаборатория «Бетта» ООО «НПКБ», лаборатория ФГБУ «Национальный центр безопасности рыбной и сельскохозяйственной продукции». На основании результатов работы составлены учебное пособие «Современные инструментальные методы исследований в лабораториях ветеринарно-санитарной экспертизы ИФА метод определения остаточного содержания лекарственных препаратов в продуктах животноводства и кормах с использованием усовершенствованных тест-систем», а также «Федеральная государственная информационная система в области ветеринарии. Организация работы и порядок оформления ветеринарных сопроводительных документов (ВСД) в компоненте ФГИС ВЕ-ТИС».

Методология и методы исследования. Методологические и теоретические основы, проведенные в работе, основываются на современных данных отечественных и зарубежных публикаций по тематике исследований и результатов собственных испытаний, направленные на выявление остаточных количеств ксенобиотиков (лекарственные препараты, тилозин, диоксины) в продукции животноводства, кормах и окружающей среде. Для достижения поставленной цели диссертационной работы и обоснования применения полученных результатов использовались новые разработанные скрининговые методы, а для подтверждения полученных результатов использовали утвержденные доступные методы контроля.

Методологический подход включал анализ накопленных литературных данных по теме, изучены общепринятые методы выявления ветеринарных препаратов и диоксинов в продукции животноводства, кормах и окружающей среде, проведена систематизация и обобщение полученных результатов исследования. В проведении экспериментальных работ использовали сырье и готовой продукцию животного происхождения, сырье и корма для разных видов животных и птиц, а также почву и воду.

Основные положения, выносимые на защиту:

- сравнительный анализ разработанных, унифицированных и оптимизированных методов пробоподготовки продукции животного происхождения и кормов для выявления количественного содержания остатков лекарственных средств с помощью тест-систем ИФА и ВЭЖХ МС/МС из единого эллюента;

- сопоставление полученных результатов по выявлению остаточного количества лекарственных средств из сырья и готовой продукции животного происхождения, сырья и кормов для разных видов животных и птиц, методом ИФА с помощью отечественных тест-систем с аттестованными методами высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ МС/МС);

- сравнительный анализ полученных результатов метода ИФА с помощью отечественных тест-систем и аттестованных методик и тест-систем

определения лекарственных средств, применяемых на территории Российской Федерации;

- сопоставление унифицированного способа концентрирования и выявления на открытых хроматографических твердофазных диоксиновых колонках для выявления сложных смесей суммы диоксинов, с количественным анализом данных веществ с помощью скринингового метода ИФА, а также возможности из полученного эллюента проведения анализа выявления высокотоксичных диоксинов и их конгенеров, идентифицируя их методом ГХ МС/МС ВР.

- результаты анализа полученных выводов и метрологических характеристик диоксинов в сырье и готовой продукции животного происхождения, сырье и кормах для разных видов животных и птиц, а также окружающей среде с помощью отечественной тест-системы In®Dioxin/Furan;

- оценка селективности унифицированных методов контроля лекарственных средств и диоксинов, определение пороговых количественных значений, метрологическое обоснование относительной расширенной неопределенности, проведение мониторингового контроля сырья и готовой продукции животного происхождения, сырья и кормов для разных видов животных и птиц, а также окружающей среды, с помощью отечественных тест-систем ИФА, ВЭЖХ МС/МС и ГХ МС/МС ВР.

- обоснование применения модифицированных методов контроля лекарственных средств, тилозина и диоксина с помощью отечественных тест-систем, а также ВЭЖХ МС/МС и ГХ МС/МС ВР в условиях непрерывной работы лабораторий.

Личный вклад автора. Все этапы представленной работы включая: планирование исследования, сбор и предварительная подготовка образцов, подбор методов испытаний, осуществление всех иммуноферментных методов испытания, подтверждение полученных результатов аттестованными методами, анализ и обобщение полученных результатов, статистическая обработка полученных результатов выполнены при непосредственном участии автора диссертационной работы. Выбор направления научной проблемы, целей, задач

исследования, обсуждение, обоснование и формулирование выводов, подготовка к публикациям результатов исследований и апробация их на научно-практических конференциях были проведены автором лично или при его определяющем участии. Участие всех соавторов отражено в совместных публикациях.

Степень достоверности и апробация результатов.

Достоверность проведенных исследований и полученных результатов подтверждается использованием современных методов исследований, сертифицированного высокоточного оборудования, современных методов контроля. Степень достоверности подтверждена методом внесения внутренних стандартов (спайк-образцов) поставляемые с тест-наборами ИФА, и стандартных образцов 2,3,7,8-ТХДД (2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин), изготовленных ООО «ЭКРОСХИМ» в объектах контроля, и аналитическим сопоставлением с существующими сведениями. Также было применение статистической обработки числовых данных. Обработка числовых данных проводилась с использованием прикладных программ «Microsoft Excel» с определением достоверности полученных данных (уровень значимости (P)<0,05). Научные положения литературно обоснованы, выводы основаны на полученных результатах. Материалы доложены на научных конференциях, опубликованы в рецензируемых источниках.

Апробация работы и публикация результатов исследования.

Работа выполнялась на базе кафедры «Ветеринарно-санитарная экспертиза и биологическая безопасность» ФГБОУ ВО «РОСБИОТЕХ». Часть лабораторных дополнительных подтверждающих испытаний выявления остатков лекарственных препаратов, тилозина и диоксинов в сырье и готовой продукции животного происхождения, сырье и кормах для разных видов животных и птиц, а также окружающей среде, проводились на базе химико-токсикологического отдела ИЦНМВЛ ФГБУ «ВНИИЗЖ» с использованием поверенного лабораторного оборудования. В подтверждение полученных данных, разработанных уникальных методов ИФА диагностики, холостые и пробы с

внесенными внутренними стандартами были проанализированы аттестованными методами ВЭЖХ МС/МС, ГХ МС/МС ВР, а также был проведен сравнительный анализ применяемых методик выполнения измерений определения лекарственных средств в продуктах животноводства и кормах, с аттестованными, ранее применяемыми на территории РФ, методиками.

Основные результаты диссертационной работы одобрены

Научно-методической комиссией ФГБОУ ВО «РОСБИОТЕХ», доложены и обсуждены на международных научно-практических конференциях:

-Международной научно-практической конференции «Развитие современной науки: тенденции, проблемы, перспективы», Болгария, г. София, 2018 г.;

-Международной научно-практической конференции студентов и аспирантов «Проблемы ветеринарно-санитарной экспертизы и биологической безопасности», Москва, 2019;

-Международной научно-практической конференции «Discovery science research», Петрозаводск. 2020;

-Международной научно-практической конференции «Современная наука и ее ресурсное обеспечение: инновационная парадигма, Поснова М.В.», Петрозаводск, 2020;

- Международном научно-исследовательском конкурсе «Наш выбор-наука», г. Петрозаводск, 2022г.;

-Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы лабораторного контроля при ветеринарно-са-нитарной экспертизе пищевого сырья и кормов», Москва, 2023г.;

-Научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарной экспертизы и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» под девизом «Здоровое животное - безопасная пища - здоровый человек», Москва, 2023;

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Сатюкова Людмила Павловна, 2025 год

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Все продукты питания, поступающие в торговые сети, в обязательном

порядке проходят ветеринарно-санитарную экспертизу для подтверждения их безопасности для потребителя. Это регламентируется как национальными стандартами например, Техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» [199], так и международными нормами Codex Alimentäres [248,248,249,250,251].

Особую актуальность в последние годы приобретает проблема остаточных количеств фармацевтических препаратов, в частности антибиотиков, которые могут накапливаться в продукции животного происхождения из-за их широкого применения в ветеринарии — для лечения, профилактики заболеваний и стимуляции роста. По данным ВОЗ (2023), устойчивость к антибиотикам, вызванная их избыточным присутствием в пище, входит в топ-10 глобальных угроз здоровью человечества [20,49,118,130,132,133,316,316].

Длительное поступление даже малых доз антибиотиков с пищей способно провоцировать развитие антибиотикорезистентности у людей, аллергические реакции и дисбиозы [263]. Для минимизации рисков необходим многоуровневый контроль:

1. Мониторинг на всех этапах производства — от кормов до готовой продукции.

2. Совершенствование методов анализа. Сегодня применяют хроматографию (HPLC, GC-MS), иммуноферментный анализ (ИФА) и микробиологические тесты.

3. Соблюдение регламентов применения ветеринарных препаратов, включая сроки вывода животных из-под обработки [26].

1.1 Общая характеристика антибиотиков. Их классификация.

Антибиотики - это вещества, вырабатываемые микроорганизмами (чаще всего микроскопическими грибами, реже бактериями) или их аналогами и синтетическими производными, способными подавлять жизнедеятельность других микроорганизмов [4,7,8,11,45,48,81,84,85,86,87,115,116,117].

Всего в мире известно чуть больше 1300 видов антибиотических веществ. Все эти виды антибиотиков классифицируют по:

1) Химической структуре

2) По происхождению

3) По спектру активности

4) По типу действия на микробную клетку

5) По механизму действия

По химической структуре антибиотики бывают:

1) бета-лактамными. К ним относятся антибиотики природного происхождения (бензилпенициллин, феноксибензилпенициллин), полусинтетического происхождения пенициллины (оксациллин - оказывает действие на стафилококки, препараты широкого спектра действия - ампициллин, карбени-циллин, азлоциллин и т.д.), цефалоспорины: цефотаксим, цефалотин и т.д.);

2) аминогликозиды, к которым относятся природные и полусинтетические препараты (стрептомицин, амикацин и т.д.);

3) природные и полусинтетические тетрациклины;

4) макролиды (эритромицин и олеандомицин и их производные);

5) антрациклины - является одной из основных групп противоопухолевых антибиотиков.

По происхождению:

1) Природные

2) Полусинтетические

3) Синтетические

По спектру активности антибиотики разделяют на:

1) активные в отношении грамположительных микроорганизмов

2) широкого спектра действия: то есть активные в отношении и грампо-ложительных, и грамотрицательных микроорганизмов (тетрациклины)

3) противотуберкулезные

4) противогрибковые

5) действующие на простейших (тетрациклины)

6) действующие на гельминтов

7) противоопухолевые

8) иммуномодуляторы (циклоспорин)

По типу действия на микробную клетку:

1) бактериостатические, которые приводят лишь к задержке роста и деления клетки)

2) бактерицидные, в течение короткого количества времени приводящие к гибели клетки

По механизму действия (основные):

1) ингибиторы синтеза клеточной стенки микроорганизма

2) антибиотики ингибиторы синтеза белка на уровне рибосом (хлорам-феникол, тетрациклины и т.д.) и антибиотики ингибиторы РНК-полимеразы (рифампицин) [260,113,114,115,135].

Антибактериальными свойствами обладают антибиотики следующих групп:

> Амфениколы (хлормафеникол (Chloramphenicol, син. Laevomycetin)

> Тетрациклины

> Пенициллины

> Сульфаниламиды

> Макролиды (тилозин)

> Нитрофураны

> Аминогликозиды (стрептомицин)

> Хинолоны

Антибиотики — это биологически активные вещества, продуцируемые микроорганизмами (преимущественно грибами ро-

дов Pénicillium, Aspergillus, Cephalosporium и бактери-

ями Streptomyces, Bacillus), а также их синтетические аналоги, избирательно подавляющие рост патогенных микроорганизмов [26,27,28,45,48,83,85,86,87].

Ключевые характеристики:

1. По происхождению:

^ Природные (бензилпенициллин, стрептомицин) ^ Полусинтетические (амоксициллин, азитромицин) > Синтетические (хлорамфеникол, фторхинолоны) [78,79].

2. По химической структуре (основные группы) [131,135,261] Таблица 1 - Основные группы антибиотиков и их характеристики

Группа Примеры Особенности

в-лак- тамы пенициллины, цефа-лоспорины Нарушают синтез клеточной стенки

Тетрациклины доксициклин Широкий спектр, бакте-риостатики

Макролиды эритромицин, тило-зин Низкая токсичность

Ами-ногликозиды стрептомицин, гента-мицин Бактерицидное действие

Антра-циклины доксорубицин Противоопухолевые

> >

бактерий) >

> >

3. >

> >

4. >

рост

>

По спектру активности:

Узкого спектра (например, только против грамположительных

Широкого спектра (тетрациклины, фторхинолоны) Противогрибковые (нистатин) Противоопухолевые (актиномицин D) [311]. По механизму действия:

Ингибиторы синтеза клеточной стенки (пенициллины) Ингибиторы синтеза белка (макролиды) Нарушение репликации ДНК (хинолоны) [252]. По типу воздействия:

Бактериостатические (тетрациклины) — обратимо подавляют Бактерицидные (цефалоспорины) — вызывают гибель клеток.

Градация антибиотиков по способности вызывать резистентность:

Антибактериальные вещества можно ранжировать по возрастанию риска развития устойчивости микроорганизмов [14,17,18,26,28,50,55,64,80, 82,88,85,87,135]:

1. Низкий риск:

> Бацитрацин

> Флавомицин

> В иргиниамицин

2. Умеренный риск:

> Тилозин и другие макролиды

> Нитрофураны

> Полимиксины

3. Высокий риск:

> Природные пенициллины

> Тетрациклины

4. Очень высокий риск:

> Ампициллин

> Цефалоспорины

5. Критический риск:

> Сульфаниламиды

> Стрептомицин и другие аминогликозиды

> Хлорамфеникол[11,26,28,47,48,54,64,66,68,72,75,78,135,159,

181,182].

Актуальные проблемы и выводы:

> Антибиотикорезистентность: По данным ВОЗ (2023), устойчивость к в-лактамам и фторхинолонам выросла на 15% за 5 лет [313].

> Остатки в продукции: 12% проб мяса в РФ (2023) содержат следы тетрациклинов [131,132,135, 210].

Следовательно, необходим:

1. Строгий контроль применения антибиотиков в ветеринарии и

животноводстве.

2. Регулярный мониторинг остаточных количеств в пищевой продукции.

3. Внедрение альтернативных методов профилактики заболеваний [236,240,246,252,282].

1.2 Характеристика исследуемых лекарственных препаратов

Совершенно новым и перспективным направлением в животноводстве стало применение антибиотиков в качестве стимуляторов роста и увеличения массы животных. Добавление небольших количеств антибиотиков - пенициллина, хлортетрациклина, окситетрациклина - к кормовому рациону молодняка животных и птиц способствует значительному ускорению их роста [131,135,148,191,206,208,270, 244].

Эти антимикробные препараты, используемые в сельском хозяйстве в субтерапевтических дозах для выращивания поголовья, получили название "кормовые антибиотики". Они применяются в виде кормовых добавок с двумя основными целями:

1. Обеспечение сохранности кормов, профилактика и лечение эпизодических заболеваний;

2. Стимуляция роста животных [54,64,70,75,206,208,265,317, 214,20,315].

К кормовым антибиотикам относят специальные препараты, которые при введении в рационы животных и птицы:

> Улучшают обмен веществ

> Оптимизируют координацию физиологических процессов

> Повышают коэффициент использования кормов

> Активизируют защитные реакции организма [80,87,191,208,249].

В результате такого воздействия:

> Молодые животные лучше развиваются и быстрее растут

> Повышается их продуктивность

> Снижается заболеваемость

> Сокращается отход поголовья [80,82,84,87,117,208, 305,125,254].

При рациональном применении кормовых антибиотиков в условиях правильного кормления и содержания животных достигаются следующие показатели:

> Увеличение прироста массы тела на 10-15%

> Снижение расхода кормов на единицу продукции на 10-20%

> Уменьшение себестоимости мяса

> Сокращение периода откорма на 10-15 дней [87,191,134,209, 215,291].

Однако следует учитывать, что антибиотики, применяемые в ветеринарии, могут накапливаться в организме животных и способствовать развитию резистентности у патогенных микроорганизмов. Это происходит двумя основными путями:

1. За счет биосинтеза микроорганизмами ферментов, инактивирую-щих лекарственный препарат [253].

2. Путем изменения структуры соединений, на которые направлено действие антибиотика, что позволяет микроорганизмам сохранять жизнеспособность даже в присутствии антимикробного препарата [283,314].

1.2.1 Хлорамфеникол

Хлорамфеникол (Chloramphenicol, син. Laevomycetin) — эффективный синтетический антибиотик широкого спектра действия, запрещенный к использованию в животноводстве и ветеринарии для лечения скота и птицы. Это связано с токсичностью левомицетина, проявляющейся в развитии тяжелых заболеваний [17,28,45,54, 212, 316,316].

Впервые антибиотик левомицетин (хлорамфеникол) был выделен в 1947 г. К 1948 г. хлорамфеникол стали широко использовать, но уже к 1950 г. стало понятно, что он может вызывать тяжелые и даже смертельные нарушения кроветворения. Он вызывает нарушения в процессе синтеза белка микробной клетки благодаря связыванию с рРНК рибосом, тем самым мешая развитию и размножению бактериальных клеток [75,79,89].

Левомицетин применяется только для лечения опасных болезней (дизентерия, брюшной тиф и др.) в связи с его высокой токсичностью. При накоплении в организме он может:

> Разрушать эритроциты

> Вызывать апластическую анемию

> Провоцировать "серый синдром" у детей (серая кожа, тошнота, повышение давления) [75,79,80,81,83].

На территории таможенного союза остаточное содержание хлорамфени-кола в пищевых продуктах животного происхождения и кормах не допускается (<0,0003 мг/кг). Для скринингового контроля содержания левомицетина в продовольственном сырье широко используют:

1. Иммуноферментный анализ (ифа)

> Высокая производительность

^ Хорошая специфичность

> Низкие пределы обнаружения [148,157,158, 159,166].

На территории таможенного союза остаточное содержание хлорамфени-кола в пищевых продуктах животного происхождения и кормах не допускается <0,0003 мг/кг [199]. Для скринингового контроля содержания левомице-тина в продовольственном сырье широко используют иммуноферментный анализ (ифа), который позволяет за короткий срок проанализировать большое число образцов и характеризуется высокими специфичностью и точностью, низкими пределами определения [148,149,157,158, 159,166].

1.2.2 Сульфаниламиды

Сульфаниламиды — синтетические антибактериальные препараты, производные сульфаниловой кислоты. В отличие от антибиотиков, оказывают исключительно бактериостатическое действие. Их механизм основан на структурном сходстве с парааминобензойной кислотой (ПАБК), что позволяет им выступать конкурентными антагонистами в биохимических процессах [84,86].

Историческая справка:

Герхард Домагк в 1935 году открыл антибактериальные свойства "красного стрептоцида", особенно эффективного против стрептококковых инфекций, вызывающих раневые осложнения. Классификация:

1. Ш-замещенные (сульфадиметоксин)

2. Ж-замещенные (фталилсульфатиазол) Механизм действия:

> Связываются с белками плазмы крови

> Вытесняют ПАБК в синтезе фолиевой кислоты

> Нарушают образование нуклеиновых кислот

> Замедляют рост и размножение микроорганизмов [3,27,28,72,149] Применение в животноводстве:

> Профилактика инфекционных заболеваний

> Стимуляция роста (увеличение массы на 4-5%)

> Снижение затрат на единицу продукции [3,4,7,8,78] Негативные эффекты:

Сульфаниламиды обладают рядом побочных действий, оказывающих негативное влияние на организм животных и человека:

1. Неврологические нарушения:

> Головные боли

> В тяжелых случаях - менингит

2. Желудочно-кишечные расстройства

3. Аллергические реакции:

> Кожные высыпания

> Образование аллергенов в крови

4. Способность проникать через гематоэнцефалический барьер

между кровеносной системой и ЦНС [3,4,8,11,14,18].

На территории Российской Федерации, максимально допустимая концентрация лекарственных препаратов в пищевых продуктах ограничена

законодательством. Для сульфаниламида введены допустимые нормы содержания в мясе и внутренних органов - это 0,1 мг/кг, а в содержании в молоке -не более 0,025 мг/кг, нормы регулируются решением Комиссии №299 «Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к продукции (товарам), подлежащей санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)». [116,117,130,131,135].

В соответствии с Техническим регламентом Евразийского экономического союза "О безопасности мяса птицы и продукции его переработки» (ТР ЕАЭС 051/2021), не допускается (<0,01 мг/кг) [131,135,157,196].

1.2.3 Нитрофураны

Нитрофураны представляют собой класс синтетических антибактериальных соединений, которые образуются путем введения нитрогруппы в пятое положение молекулы 2-замещенного фурана. С химической точки зрения эти соединения классифицируются как 5-нитро-2-фурфулиденгидразоны или 5-нитро-2-фурил(в-акрилиден)гидразоны. К числу наиболее распространенных представителей данной группы относятся: нитрофурал (известный как фура-цилин), нитрофурантоин (фурадонин), фуразолидон и фуразидин (фурагин) [4,7,8,11,18,26,27,28,50,54,55,70,72, 93,113,114].

Фармакологическая активность нитрофуранов охватывает широкий спектр микроорганизмов, включая:

^ Грамположительные бактерии

^ Грамотрицательные бактерии

^ Отдельные виды крупных вирусов

> Простейшие (трихомонады и лямблии) [82,83,88,93, 187].

Особенности фармакокинетики:

1. Быстрый метаболизм в организме животных

2. Низкая молекулярная масса, способствующая:

> Легкому всасыванию в кишечнике

> Быстрому проникновению в различные ткани

> Преодолению гематоэнцефалического барьера

> Трансплацентарному переходу

Механизм действия:

Нитрофураны внутри клеток восстанавливаются и повреждают ДНК, так как имеют высокую реакционную способность, что приводит к гибели микроорганизмов [26,28,34,45]. Микроорганизмы практически не устойчивы к ним, так как это зависит от вида препарата. Например, БГКП резистентность возникает только к фурагину. Несмотря на то, что зависимость микроорганизмов развивается плохо, необходимо заранее выявлять чувствительность бактерий. В плазме нитрофураны могут передвигаться свободно либо с белками, это возможно при различной степени их ионизации.

Метаболизм:

Период полувыведения в организме исходных препаратов колеблется от нескольких минут до часа, при этом метаболиты образуют прочные связи с белками, в результате чего длительное время сохраняются в организме. Например:

^ АОЗ является основным метаболитом фуразолидона

> АМОЗ - основным метаболитом фуралтадона

> АГД - фурадонином

> СЕМ - фурацилином

Вышеуказанные метаболиты являются первичными и наиболее типичными, но вторичные метаболиты более токсичны [148,191,192,206,268, 307].

Регуляторные аспекты:

В Европейском и Таможенном союзах установлены максимально допустимые уровни (МДУ) остаточных количеств метаболитов нитрофуранов в продуктах питания <0,001 мг/кг. Однако данные мониторинга качества пищевых продуктов свидетельствуют о том, что, несмотря на установленные законодательством запреты, их продолжают использовать не только в развивающихся странах, но и в Европейском союзе, что обусловлено их высокой антибактериальной активностью, дешевизной и доступностью [56, 88, 144, 145, 103, 195,196,197,198,199,200,201].

Методы контроля:

Для скринингового контроля содержания метаболитов нитрофуранов в продуктах животного происхождения и кормах широко используют:

1. Иммуноферментный анализ (ИФА), который позволяет:

^ Проводить исследования большого количества образцов за короткий срок

^ Обеспечивает высокую специфичность и точность

> Имеет низкие пределы определения [72,154,157,158,166,159].

1.2.4 Макролиды

Макролиды представляют собой обширный класс антибактериальных средств, которые по происхождению подразделяются на природные и полусинтетические. Основу их химической структуры составляет макроцикличе-ское лактонное кольцо. Первым представителем этой группы, открытым еще в 1952 году, стал эритромицин, который до сих пор сохраняет свое клиническое значение [45,47,48,66,68,70,75,219].

Особенностью макролидов является их способность хорошо распределяться по различным тканям и органам, создавая терапевтические концентрации во многих клеточных структурах. Среди современных представителей этого класса особое место занимает тилозин - антибиотик, нашедший широкое применение в ветеринарной практике.

Применение тилозина:

Тилозин активно используется в животноводстве для:

> Лечения инфекционных заболеваний

> Профилактики бактериальных осложнений

У различных видов сельскохозяйственных животных:

1. Птицы (куры, индейки)

2. Свиней

3. Овец

4. Крупного рогатого скота [8,11,17,47,66,68,83,88,116].

Важно отметить, что в отличие от многих других макролидов, тилозин не применяется в медицине для лечения людей ни в России, ни в других странах мира.

Побочные эффекты:

При длительном применении тилозин может вызывать:

1. Изменения картины крови

2. Сдвиг рН мочи в щелочную сторону

5. Нарушения углеводного обмена (снижение толерантности к глюкозе) [45,50,54,64,66,68,75,93].

6. Кроме того, этот антибиотик обладает выраженными аллергенными свойствами, причем аллергические реакции могут развиваться как у животных, так и у людей, контактирующих с препаратом. Характерно, что повышенная чувствительность к тилозину часто сопровождается аналогичной реакцией и на другие антибиотики макролидного ряда [45,48,50,148].

Проблема антибиотикорезистентности:

Особую озабоченность вызывает способность микроорганизмов развивать:

1. Перекрестную устойчивость между тилозином и другими макролидами

2. Множественную лекарственную резистентность (к различным классам антибиотиков)

Эти факторы приводят к тому, что даже незначительные дозы тилозина, поступающие в организм, могут способствовать формированию устойчивых штаммов бактерий, что впоследствии делает неэффективными другие макро-лидные препараты при лечении серьезных инфекций [2,4,47,62,66,68, 257,260].

Методы контроля:

Для мониторинга содержания тилозина и других макролидов используются: Стандартные лабораторные методики и авторская методика ИФА [66,118,123,132,157,158, 159,166,219].

7. Рассмотрим использования сырья после использования препарата группы макролидов, на убой допускаются свиньи не раньше чем через 30 дней после введения препарата, а сырье используют по истечению 68 дней. КРС не раньше чем через 30 дней, а молочное сырье, возможно, употреблятьв пищу только по истечению 60 дней, после применения антибиотических средств [66,68,118,123,219].

Современные исследования подтверждают, что некорректное применение тилозина в ветеринарной практике приводит к его накоплению в продуктах животноводства. Речь идет не только о традиционных мясомолочных продуктах, но и о таких специфических категориях, как мед, яйца и субпродукты. Это создает серьезную фармакологическую проблему - при регулярном потреблении таких продуктов у человека может развиться антибиотикорези-стентность, что существенно осложняет лечение бактериальных инфекций [54,55,64,66,68,118,123,159,219].

В технологическом аспекте добавка Е713 (тилозин) представляет собой антибиотик природного происхождения, синтезируемый актинобактериями Streptomyces fradiae. Важно подчеркнуть, что в пищевой промышленности эта субстанция имеет исключительно ветеринарное применение - ее используют для терапии сельскохозяйственных животных и птицы, но не в качестве технологического компонента продуктов питания.

Нормативная база [52,53,56,57]:

В ЕАЭС и странах ЕС тилозин классифицируется как лекарственное средство. Категорически запрещено его использование как кормовой добавки. Установлены строгие предельно допустимые концентрации:

> Мясная продукция (включая субпродукты и рыбу) - <100 мкг/кг

> Яичная продукция - <200 мкг/кг

> Молочные продукты - <50 мкг/кг

Фармакокинетические особенности:

Максимальная концентрация наблюдается в легочной ткани. Процесс элиминации происходит [66,68,70,75,80,117,118,123,158,159,219]:

1. Через гепатобилиарную систему (с желчью)

2. Почечным путем

3. С лактатом (у лактирующих животных)

4. С ооцитами (у несушек)

Ветеринарные ограничения:

1. Забой животных разрешен только после 8-дневного карантина

2. Молоко подлежит утилизации в течение 96 часов после последней инъекции.

3. Продукция, полученная с нарушением сроков, допускается только

для:

> Производства кормов для плотоядных

> Изготовления мясокостной муки

Ключевой момент: добавка Е713 отсутствует в реестре разрешенных пищевых добавок. Контроль за оборотом ветеринарных препаратов на основе ти-лозина осуществляется уполномоченными государственными ветеринарными службами. [157,158,159, 166].

1.2.5 Хинолоны

Хинолоны - группа синтетических антибактериальных препаратов, включающая подгруппу фторхинолонов. Эти соединения обладают выраженным бактерицидным действием, обусловленным способностью ингибировать ДНК-гиразу и топоизомеразу IV бактериальных клеток, что приводит к нарушению процессов репликации ДНК и гибели микроорганизмов [33, 48,64,70,80,135,158,162,165,168,236].

Классификация хинолонов

В клинической практике хинолоны принято классифицировать на четыре поколения:

1. Первое поколение (нефторированные хинолоны):

^ Налидиксовая кислота

^ Оксолиновая кислота

> Пипемидовая кислота. Основное применение: лечение неослож-нённых инфекций мочевыводящих путей [33,159,162,168,262].

2. Второе поколение (фторхинолоны):

> Ципрофлоксацин

> Норфлоксацин

> Офлоксацин

Обладают расширенным спектром активности, включая грамотрицатель-ные бактерии [159,162,168,272].

3. Третье поколение:

> Левофлоксацин

> Спарфлоксацин

Эффективны против атипичных патогенов (Chlamydia, Mycoplasma) [285].

4. Четвёртое поколение:

> Моксифлоксацин

Демонстрируют активность в отношении анаэробов и полирезистентных штаммов [159,256].

Проблемы применения в ветеринарии и медицине

1. Использование в животноводстве:

> Применяются в качестве стимуляторов роста

> Используются для профилактики и лечения инфекций Это приводит к накоплению остаточных количеств препаратов в продуктах животного происхождения [159,286].

2. Риски для здоровья человека:

^ Аллергические реакции

^ Гепатотоксическое действие

> Потенциальные канцерогенные эффекты Согласно данным EFSA (2021), существует корреляция между остатками хи-нолонов в пище и развитием антибиотикорезистентности у человека [159,162,168,257].

3. Фармакокинетические особенности:

^ Способность проникать через плацентарный барьер

> Экскреция с грудным молоком

> Выведение преимущественно почками (70-80%) и печенью (2030%) [86].

Проблема антибиотикорезистентности

Широкое применение хинолонов привело к возникновению устойчивых штаммов бактерий. Основные механизмы резистентности:

> Мутации в генах gyrA и рагС [159,162,168,236]

> Активация систем активного выведения антибиотиков [285]

> Формирование биоплёнок [159,256]

Именно поэтому в настоящее время особое внимание уделяется мониторингу остаточных количеств хинолонов в продуктах животноводства, особенно в мясе сельскохозяйственных животных и птицы [159,162,286].

Регулирование содержания хинолонов в пищевой продукции

1. Международные нормативы:

> В Европейском Союзе и странах Таможенного Союза установлены максимально допустимые уровни (МДУ) для различных хинолонов:

^ Энрофлоксацин: 0,1 мг/кг для мяса птицы

^ Ципрофлоксацин: 0,02 мг/кг для мышечной ткани свиней [159,

258].

2. Российское законодательство:

> Согласно Техническому регламенту ЕАЭС 051/2021 "О безопасности мяса птицы и продукции его переработки": Предельно допустимая концентрация (ПДК) для большинства хинолонов не должна превышать 0,01 мг/кг [33,57,162,168].

Контроль осуществляется:

> Россельхознадзором (плановые проверки)

> Аккредитованными лабораториями (испытательные центры)

3. Методы анализа:

> Жидкостная хроматография с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС)

> Иммуноферментный анализ (ИФА) для скрининга Преимущества: чувствительность до 0,001 мг/кг, соответствие ГОСТ 319032012 [157,158, 159,162,166,168,171].

Мониторинг остаточных количеств хинолонов в мясной продукции

Статистика нарушений в РФ (2022-2023 гг.):

1. По данным Россельхознадзора [51,118,123,130,132]:

^ 2,3% проб куриного мяса превышали ПДК по энрофлоксацину

^ 1,7% проб свинины содержали остатки ципрофлоксацина выше нормы

^ Наибольшее количество нарушений зафиксировано в продукции птицеводческих хозяйств Центрального ФО (3,1%)

2. Результаты плановых проверок [20,49,51]:

^ 84% случаев превышения связаны с несоблюдением сроков вывода препаратов

^ 12% - с использованием запрещённых комбинаций антибиотиков

^ 4% - с фальсификацией ветеринарной документации

Таблица 2 - Сравнительный анализ МДУ хинолонов (мг/кг) [49,51,118,

196, 250, 300, 267]:

Препарат РФ (ТР ЕАЭС 051/2021) ЕС (Reg. EU 37/2010) США (FDA, 2023)

Энрофлоксацин 0,01 (мясо птицы) 0,1 (все виды мяса) 0,1 (грудка)

Ципрофлокса-цин 0,01 0,02 0,05

Данофлоксацин 0,01 0,2 (печень КРС) Не регламентирован

Офлоксацин Запрещён 0,03 0,05

Ключевые различия в регулировании:

1. Россия:

> Единый жёсткий норматив 0,01 мг/кг для большинства хинолонов

> Полный запрет офлоксацина в животноводстве

2. Европейский Союз:

^ Дифференцированные нормы для разных видов тканей

^ Допускается применение данофлоксацина в скотоводстве

3. США:

^ Более мягкие нормативы для ципрофлоксацина

> Отсутствие ограничений для данофлоксацина [20,49,51,118,123,

130].

1.2.6 Тетрациклины

Тетрациклины представляют собой группу антибиотиков широкого спектра действия, относящихся к классу поликетидов. Эти соединения имеют схожее химическое строение, основанное на конденсированной четырехцик-лической системе. В практической ветеринарии наиболее распространены три природных тетрациклина: хлортетрациклин (ауреомицин), окситетрациклин (террамицин) и тетрациклин, а также их полусинтетические производные [4,7,8,18,26,27,29,78,154,159,160,167].

Физические свойства:

> Внешний вид: мелкокристаллические порошки желтого или желто-коричневого цвета

> Растворимость: плохо растворимы в воде (0,5-1,0 мг/мл при комнатной температуре)

^ Стабильность: устойчивы в кислой среде (рН 2,0-5,0), разрушаются в щелочных условиях

> Чувствительность: разлагаются под действием света и окислителей [7,8].

2. Механизм антимикробного действия. Тетрациклины проявляют бактериостатическое действие, которое реализуется через следующие механизмы:

^ Проникновение через клеточную стенку грамположительных бактерий и наружную мембрану грамотрицательных микроорганизмов

^ Обратимое связывание с SOS-субъединицей бактериальных рибосом

> Блокировка доступа аминоацил-тРНК к акцепторному участку (А-сайту)

^ Нарушение процесса элонгации пептидной цепи

^ Подавление синтеза бактериальных белков [244,246,246]

3. Спектр активности и клиническое применение. Тетрациклины демонстрируют активность против:

> Грамположительных бактерий (Staphylococcus spp., Streptococcus

spp.)

> Грамотрицательных микроорганизмов (Pasteurella spp., Haemophilus spp.)

> Анаэробов (Clostridium spp., Fusobacterium spp.)

> Атипичных патогенов (Chlamydia spp., Mycoplasma spp.)

> Риккетсий и некоторых простейших [192,193,194]

Основные показания к применению в ветеринарии:

1. Лечение респираторных заболеваний (пастереллез, микоплазмоз)

2. Терапия желудочно-кишечных инфекций (сальмонеллез, колибак-териоз)

3. Борьба с мочеполовыми инфекциями (лептоспироз, бруцеллез)

4. Лечение кожных заболеваний (экземы, инфицированные раны)

4. Фармакокинетические особенности. После введения тетрациклины демонстрируют следующие параметры:

^ Биодоступность при пероральном применении: 75-80%

> Время достижения максимальной концентрации: 2-4 часа

> Связывание с белками плазмы: 20-60%

^ Период полувыведения: 6-10 часов у большинства видов животных

Основные пути выведения:

> Почки (60-70% в неизмененном виде)

> Желчь (15-30%)

> Фекалии (10-15%) [84,85,86,88]

5. Побочные эффекты и ограничения. Несмотря на широкое применение, тетрациклины могут вызывать:

1. Гепатотоксичность (особенно при длительном применении)

2. Фотосенсибилизацию (у светлокожих животных)

3. Нарушение формирования костной ткани у молодняка

4. Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта

5. Тератогенное действие (проникают через плацентарный барьер) Противопоказания:

^ Беременность (особенно первый триместр)

> Период лактации

^ Выращивание молодняка мясных пород

> Тяжелые поражения печени и почек [81,82,83,85]

6. Регуляторные аспекты и контроль остатков. В соответствии с Техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 021/2011:

Максимально допустимые уровни (МДУ) в пищевых продуктах:

> Мясо всех видов: 0,01 мг/кг

> Молоко: 0,01 мг/кг

^ Яйца: не допускается Обязательный карантинный период: ^ Крупный рогатый скот: 28 дней

> Свиньи: 21 день

> Птица: 14 дней [195,196,199,200,201,202,213]

1.2.7 Аминогликозиды

Аминогликозиды представляют собой группу антибиотиков олигосаха-ридной природы, характеризующихся наличием аминосахаров в молекулярной структуре. Основу их химического строения составляет аминоциклитол, преимущественно 2-дезоксистрептамин, соединенный гликозидными связями с агликоновой частью. Природными продуцентами данных соединений выступают актиномицеты рода Streptomyces (стрептомицин, неомицин) и бактерии рода Micromonospora (гентамицин, сизомицин). Современная фармацевтическая промышленность также производит полусинтетические производные, такие как амикацин и нетилмицин, обладающие улучшенными фармакологическими свойствами [158,159,178,179,191,192].

Исторический обзор

История открытия аминогликозидов связана с исследованиями Зель-мана Ваксмана в Ратгерском университете (США). В 1943 году научной группой под его руководством был выделен стрептомицин из культуры Streptomyces griseus. Данное открытие явилось результатом систематического скрининга более 10 000 штаммов микроорганизмов. Хронология внедрения стрептомицина включает следующие этапы:

> 1944 год - первые успешные испытания против Mycobacterium tuberculosis

> 1946 год - начало промышленного производства

> 1947 год - внедрение в клиническую практику

> 1952 год - присуждение Ваксману Нобелевской премии по физиологии и медицине [309]

Аминогликозиды представляют собой группу антибактериальных препаратов, характеризующихся наличием в молекуле аминосахаров, соединенных гликозидными связями. В клинической практике принято выделять четыре поколения этих антибиотиков:

1. Первое поколение:

^ Стрептомицин

^ Канамицин

> Неомицин

> Мономицин

Характеризуются узким спектром активности и выраженной нефротоксично-стью.

2. Второе поколение:

> Гентамицин ^ Тобрамицин

Обладают расширенным спектром действия, включая синегнойную палочку.

3. Третье поколение:

> Амикацин

> Нетилмицин ^ Сизомицин

Проявляют активность против штаммов, резистентных к предыдущим поколениям.

4. Четвертое поколение: