Нейротропные эффекты семакса в неонатальном периоде и на фоне повреждения дофаминергической системы мозга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Себенцова, Елена Андреевна

• Себенцова, Елена Андреевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Себенцова, Елена Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. АКТГ/МСГ-подобные пептиды (меланокортины)

2. Рецепторы меланокортинов

3. Экстрагормональные эффекты меланокортинов

3.1. Ноотропные эффекты меланокортинов

3.2. Действие меланокортинов на двигательную активность и эмоциональное состояние животных

3.3. Влияние меланокортинов на иммунную систему

3.4. Роль меланокортинов в регуляции пищевого поведения

3.5. Действие меланокортинов на болевую чувствительность

3.6. Влияние меланокортинов на половое поведение 26 ^ 3.7. Кардиотропные эффекты меланокортинов

4. Нейропротекторные и нейротрофические эффекты меланокортинов

4.1. Регенерация нервов и протекторное влияние меланокортинов

4.2. Влияние меланокортинов на развивающуюся нервную систему

5. Влияние меланокортинов на различные медиаторные системы мозга

6. Синтетические аналоги меланокортинов

7. Аналог фрагмента АКТГ4-10 - Семакс

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Методы оценки двигательной активности, исследовательского поведения, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения животных

2. Методы оценки способности животных к обучению

3. Оценка болевой чувствительности животных

4. Методы оценки уровня физической выносливости

5. Статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Исследование отставленных поведенческих эффектов хронического неонатального введения семакса детенышам белых крыс

1.1. Отставленные эффекты хронического внутрибрюшинного введения семакса в течение второй-третьей недель постнатального развития крыс

1.1.1. Изучение ориентировочно-исследовательской активности, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения крыс

1.1.2. Изучение отставленного влияния семакса на обучение животных

1.2. Отставленные эффекты хронического внутрибрюшинного введения семакса в течение первой недели постнатального развития крыс

1.2.1. Оценка влияния семакса на ориентировочно-исследовательскую активность и уровень тревожности крыс

1.2.2. Изучение отставленного влияния семакса на обучение животных

1.3. Отставленные эффекты хронического внутрибрюшинного введения семакса в течение второй недели постнатального развития крыс

1.3.1. Влияние семакса на ориентировочно-исследовательскую активность и уровень тревожности крыс

1.3.2. Изучение отставленного влияния семакса на обучение животных

1.4. Отставленные эффекты хронического интраназального введения семакса в течение второй-третьей недель постнатального развития крыс

1.4.1 Влияние семакса на ориентировочно-исследовательскую активность и уровень тревожности крыс

1.4.2. Изучение отставленного влияния семакса на обучение животных

1.5. Исследование влияния однократного введения семакса на поведение и способность к обучению детенышей белых крыс

1.5.1. Влияние семакса на ориентировочно-исследовательскую активность и уровень тревожности крыс

1.5.2. Влияние семакса на обучение ювенильных крыс

1.6. Обсуждение результатов

Глава 2. Исследование нейропротекторных эффектов семакса на фоне МФТПвызванных нарушений дофаминергической системы мозга крыс 104 2.1. Оценка двигательной активности и ориентировочно-исследовательской реакции животных через сутки после введения нейротоксина

2.2. Изучение уровня тревожности белых крыс через двое суток после введения нейротоксина

2.3. Изучение двигательной активности и исследовательской реакции крыс через трое суток после введения МФТП

2.4. Оценка исследовательской активности и тревожности белых крыс через четверо суток после введения нейротоксина

2.5. Обсуждение результатов

Глава 3. Исследование эффектов семакса на фоне блокады ДА-рецепторов галоперидолом

3.1. Влияние семакса, галоперидола и их совместного введения на двигательную активность и ориентировочно-исследовательскую реакцию животных

3.2. Влияние семакса, галоперидола и их совместного введения на выработку условного рефлекса активного избегания болевого раздражителя

3.3. Обсуждение результатов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Нейротропные эффекты семакса в неонатальном периоде и на фоне повреждения дофаминергической системы мозга»

Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов являются АКТГ/МСГ-подобные пептиды, объединяемые в настоящее время термином меланокортины. Интерес к данным соединениям вызван тем, что пептиды этого класса обладают широким спектром физиологической активности. Многочисленные эксперименты, проводившиеся в последние десятилетия как в нашей стране, так и за рубежом, показали, что меланокортины, помимо известного гормонального действия, улучшают обучение и внимание; влияют на мотивационные процессы; ускоряют регенерацию в нервно-мышечной системе; оказывают протекторное действие при повреждениях в ЦНС; воздействуют на развитие нервной системы; моделируют половое поведение; оказывают противовоспалительное и жаропонижающее действие; взаимодействуют с опиоидной системой; влияют на болевую чувствительность и сердечно-сосудистую систему; вызывают снижение потребления пищи и веса тела; влияют на функционирование экзокринных желез. Использование коротких фрагментов природных гормонов позволило отделить эндокринные (кортикотропные и меланотропные) свойства исходных молекул от их экстрагормонального действия. Доказательство широкого спектра физиологической активности меланокортинов и открытие семейства их рецепторов предоставило новые возможности для исследования веществ, потенциально применимых в клинике при различных патологиях.

Препятствием для использования природных меланокортинов в клинике является низкая биодоступность этих пептидов при системном введении. Для создания лекарственных препаратов на основе АКТГ-подобных пептидов необходимо было разработать их стабилизированные аналоги, лишенные гормональных эффектов. Многими исследователями были предприняты попытки создания высокоэффективных аналогов фрагментов АКТГ путем различных модификаций первичной структуры молекулы. В результате этих экспериментов были разработаны аналоги природных меланокортинов, лишенные гормональных эффектов и обладающие выраженной биологической активностью и высокой устойчивостью к действию протеаз.

В результате многолетних исследований был разработан аналог АКТГ4-10 пролонгированного действия - семакс, используемый в настоящее время в медицине в качестве ноотропного лекарственного средства. Исследования активности этого пептида в экспериментах на животных показали, что он улучшает память и внимание, обладает антигипоксическим и антигеморрагическим эффектами, способствует уменьшению тяжести клинических и нейрофизиологических проявлений экспериментального ишемическиго инсульта. Клинические исследования показали его высокую эффективность при лечении интеллектуально-мнестических расстройств различного генеза, а также при профилактике и лечении постнаркозных мнестических нарушений. Введение семакса оказывает выраженное позитивное действие при лечении инсульта.

Однако, несмотря на то, что семакс уже более 10 лет используется в клинической практике, исследования эффектов этого пептида, направленные на определение спектра физиологической активности препарата и на выяснение механизмов его нейротропного действия, продолжаются. Изучение нейропротекторных эффектов семакса на экспериментальных моделях различных патологических состояний позволит расширить возможности клинического применения этого препарата. Кроме того, актуальной задачей является выявление всех вероятных последствий воздействия семакса на развивающийся мозг с целью выяснения его возможных отставленных эффектов.

Представленная работа посвящена исследованию влияния хронического неонатального введения семакса на различные поведенческие параметры, характеризующие двигательную активность, ориентировочно-исследовательскую реакцию, тревожно-фобический уровень и обучение животных, а также изучению зависимости отставленных эффектов семакса от сроков и способов его неонатального введения детенышам крыс. Кроме того, целью работы явилась оценка возможного протекторного действия семакса на фоне МФТП-вызванных нарушений дофаминергической системы мозга крыс и блокады рецепторов дофамина галоперидолом. Полученные данные будут способствовать выяснению механизмов действия и расширению клинического применения лекарственного препарата семакс.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ АКТГ/МСГ-подобные пептиды (меланокортины)

Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов являются АКТГ/МСГ-подобные пептиды, в настоящее время объединяемые термином меланокортины (МК). Семейство природных меланокортинов включает в себя адренокортикотропный гормон (АКТГ), меланоцитстимулирующие гормоны (а-, Р- и у-МСГ) и их фрагменты. Все природные МК образуются из 31-36-кДа белка-предшественника - проопиомеланокортина (ПОМК) [Eipper et al, 1980; Розен, 1994]. ПОМК состоит из 265 аминокислотных остатков и содержит в себе последовательности не только АКТГ и всех трех видов МСГ, но также липотропина, а-, Р- и у-эндорфинов и Met-энквфалина [Nakanishi et al, 1979]. Основным регионом, в котором синтезируются МК, являются передняя (АКТГ) и средняя (а- и р-МСГ) доли гипофиза. а-МСГ был впервые выделен из гипофизарного экстракта в 1955 году, как один из первых пептидных гормонов. Далее была описана аминокислотная (а. к.) последовательность АКТГ и Р-МСГ. Позже, в семидесятых годах, была исследована последовательность ПОМК, а также было обнаружено, что мРНК этого белка-предшественника экспрессируется не только в гипофизе, но и в других регионах мозга [Nakanishi et al, 1979]. Иммунохимические исследования показали широкое распространение меланокортинов в различных структурах ЦНС [Krieger, 1983]. МК могут попадать в мозг благодаря ретроградному кровотоку от гипофиза. Однако гипофиз не является единственным источником меланокортинов - синтез этих пептидов происходит также непосредственно в тканях мозга, где обнаружены ПОМК-содержащие нейроны, которые развиваются независимо от другого фонда АКТГ-содержащих клеток в гипофизе [Tonnaer et al, 1982]. Клеточные тела данных нейронов локализовании главным образом в вентромедиальной части гипоталамуса, в частности, на уровне аркуатного ядра и, в меньшей степени, в дорсальном гипоталамусе и амигдале. Эти гипоталамические нейроны образуют сеть разветвленных волокон, проникающих в различные структуры головного мозга. Самая высокая концентрация ПОМК обнаружена в медиальной субстанции: области, локализованной в переднем перивентрикулярном гипоталамусе, откуда исходит гипофизарный портальный тракт, подходящий к передней доле гипофиза. Другие нервные волокна идут в амигдалу и лимбическую систему к околоводопроводному серому веществу, тегментуму, голубому пятну, гиппокампу и неокортексу. В мозге крыс высокие концентрации АКТГ обнаружены в нижних ядрах ствола мозга, в околоводопроводном сером веществе, дорсальном ядре шва; средние — в голубом пятне, парабранхиальных ядрах, большом ядре шва и ядре солитарного тракта. Предполагается, что АКТГ в ядре солитарного тракта имеет местное происхождение, а ретикулярная формация продолговатого мозга может получать АКТГ-содержащую иннервацию от соответствующих нейронов гипоталамуса и продолговатого мозга [Глебов, Горячева, 1990]. Меланокортины были обнаружены также во многих периферических тканях, таких как органы кровообращения, почки, кишечник, поджелудочная железа, надпочечники, семенники, яичники, плацента и кожа [Eberle, 1988].

В результате многочисленных исследований было обнаружено несколько мест связывания МК в мозге. Ими оказалась область заднего таламуса, септогиппокампаль-ный комплекс, лимбические структуры и область среднего мозга [Witter, 1980].

Протеолитический процессинг ПОМК происходит путем расщепления данной молекулы прогормона конвертазами РС1 и РС2, которые узнают пару основных остатков (лизин и аргинин) и расщепляют связь между ними. Затем следует отщепление основных остатков с С-конца при помощи карбоксипептидазы Е [Korner, 1991; Zhou, 1994]. В результате действия РС1 образуется АКТГ и p-LPH, а при помощи РС2 - а-МСГ и p-эндорфин. а-МСГ синтезируется путем вьпцепления 13 а.к. остатков с N-конца молекулы АКТГ. В дальнейшем, посттрансляционная модификация а-МСГ включает в себя амидирование пептида с С-конца и ацетилирование его N-конца.

По некоторым данным при введении и, по-видимому, при эндогенном выбросе кортикотропин циркулирует в крови 3-5 минут, быстро захватывается тканями и разрушается [Sydnor, Sayers, 1953]. Деградация молекулы АКТГ начинается с N-конца, причем уже через 1 минуту после внутривенного введения гормона 50 % метки определяется в коже и мышцах, меньшее количество - в плазме, почках, кишечнике и печени. В коже и мышцах уже в этот период содержатся, главным образом, метаболиты АКТГ, а через 5 минут - во всех тканях обнаруживаются только фрагменты этого гормона [Ambler et al, 1982]. Однако по данным других авторов повышенное содержание АКТГ в плазме крови сохраняется в течение нескольких часов после введения экзогенного гормона [Allen et al, 1974; Nicholson et al, 1978]. При этом меченый АКТГ регистрируется в спиномозговой жидкости, однако его концентрация там в 100 раз ниже, чем в плазме. Эти данные свидетельствуют о том, что АКТГ очень плохо проникает через гематоэнцефалический барьер. При системном введении только 1-2% гормона проникает в мозг [Mezey, 1978; Nicholson et al, 1978].

Анализ а.к. последовательности меланокортинов показал что АКТГ, а- и Р-МСГ содержат в своей структуре общую последовательность - Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly, которая очень важна для реализации их эффектов [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Эта последовательность может быть расположена в различных участках пептидной молекулы гормонов. В молекулах а-МСГ и АКТГ гептапептид локализован в 4-10-м положениях цепи, в (3- МСГ - в 7-13-м. В у-МСГ аналогичный фрагмент присутствует, но в пятом положении вместо остатка Glu - Gly, а в 10-ом - вместо Gly - Asp (рис. 1). Наличие гептапептида у всех представителей этого семейства определяет общность их функциональных свойств, таких как влияние на пигментацию меланоцитов (меланоцитстимулирующая активность) и жировой обмен в липоцитах (липотропная активность), стимуляция синтеза кортикостероидов в коре надпочечников и пролиферация ее клеток (кортикотропная активность). Сохраняя способность проявлять различные виды биологической активности, каждый гормон способен наиболее выражено выполнять одну из них. Так, кортикотропная активность АКТГ примерно на порядок выше, чем у МСГ. И наоборот, меланоцитстимулирующее действие МСГ выше, чем АКТГ [Розен, 1994].

АКТГ Ser-Tyr-Ser- Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-GlyjLys-Pro-Val- + 26 а.к. а-МСГ Ac-Ser-Tyr-Ser Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-GlyjLys-Pro-Val-NH2

Р-МСГ Asp-Ser-Gly-Pro-Tyr-Ly^-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-GlyiSer-Pro-Pro-Lys-Asp-OH i « y-MC Lys-Tyr-Valj-Met-G/j-His-Phe-Arg-Trp-^ip-jArg-Phe-Gly i

Рис. 1. Аминокислотная последовательность природных меланокортинов.

Молекула АКТГ состоит из 39 аминокислотных остатков. Участок молекулы с 4 по 10 аминокислоту, АКТГ4.10, является актоном гормона (рис. 2). Участок АКТГ 15.21, особенно тетрапептид АКТГ15-18, обуславливает специфическое связывание молекулы гормона с рецептором, то есть является гаптоном. Роль усилителей меланоцитстимулирующей активности молекулы, по-видимому, выполняют трипептиды АКТГ1.3 и АКТГп.13. С-концевой фрагмент АКТГ25-33 наиболее вариабелен, он обуславливает иммуногенные свойства гормона, характерные для каждого вида животных. Функционально активные участки молекулы защищены от действия экзопептидаз фрагментом АКТГ20-24, который играет роль стабилизатора [Розен, 1994].

АКТГ усилитель меланоцит-стимулирующей ативности актон АКТГ усилитель меланоцит-стимулирующей активности стабилизатор функционально активных участков молекулы АКТГ фрагмент, обладающий иммуногенными свойствами Г

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12

13

14

15

16

17

18

19

20 21 22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39 л а-меланоцитстимулирующий гормон J фрагмент обуславливающий специфическое связывание молекулы АКТГ с рецептором Л J стимулятор секреции инсулина

Рис.2. Функционально-структурная организация молекулы АКТГ [Розен, 1994].

Таким образом, различные участки молекулы АКТГ обусловливают отдельные составляющие биологического ответа гормона. Множественность участков АКТГ, обладающих биологической активностью, определяет наличие различных биологических эффектов АКТГ и возможность связывания его с различными рецепторами.

Рецепторы меланокортинов

Меланокортиновые рецепторы были выделены и клонированы в 1992-1994 годах. Они принадлежат к семейству рецепторов, связанных с G-белками, представляют собой семидоменные трансмембранные белки. По сравнению с другими рецепторами, связанными с G-белками, MCR имеют в своей структуре короткую вторую экстрацеллюлярную петлю, интрацеллюлярные домены на С-конце и короткий экстрацеллюлярный N-концевой домен [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Существует 5 типов МС рецепторов: MC1R - MC5R. Все 5 типов MCR схожи по строению: на N-конце рецепторов расположен участок, способный к N-гликозилированию, а также цистеиновый остаток на С-конце, который является потенциальным сайтом для ацетилирования жирных кислот. Все 5 форм MCR функционально связываются с аденилатциклазой и активируют сАМР-зависимый сигнальный путь. Однако, также существуют данные об активации для MC3R фосфоинозитольного пути [Konda et al, 1994] и Jak/STAT пути для MC5R [Buggy et al, 1998]. Меланокортиновые рецепторы содержат в своей структуре участки, узнаваемые протеинкиназой С и протеинкиназой A [Mountjoy et al, 1992], что указывает на возможность фосфориляции. Подтипы рецепторов различаются по аминокислотному составу. Наиболее схожи МС4 и МС5 рецепторы - их структуры одинаковы на 60%. Аминокислотный состав MC1R и MC3R совпадает на 45%, а состав MC2R и MC4R - лишь на 38%. [Schioth et al, 1998].

АКТГ, а-, р-МСГ обладают высокой афинностью ко всем видам MCR, за исключением рецепторов 2 типа. MC2R более селективны к АКТГ. Селективность, функции и области экспрессии MCR представленны в таблице 1 [Starowicz, Przewlocka, 2003].

Меланокортиновые рецепторы 1 типа

Гены MC1R были клонированы впервые из клеток меланомы мыши и из культуры клеток человеческих меланоцитов [Schioth et al, 1998; Chhajlani, 1992].

Таблица 1. Мелашжиртнпопмс рецепторы рецептор агонисты и степень экспрессия мРНК функции их аффинности

МС1 а-МСГ=АКТГ> Р-МСГ>У-МСГ

МС2

АКТГ

Меланоциты, к-ки Лейдинга, семенники, желтое тело яичника, плацента, макрофаги, моноциты, нейтрофилы, эндотелнальные кки, фибробласты, к-ки глиомы, астроциты, о кол о водопроводное серое вещество, гипофиз.

Кора надпочечников.

Пигментация кожи и волос, иммуно-модуляция, противовоспалите льные эффекты.

Стеро идо генная и л и политическая активность.

МСЗ сх-МСГ=р-МСГ= у-МСГ=АКТГ

МС4 а-МСГ=АКТГ> (3-МСГ»у-МСГ

Головной мозг (Г.м.): гипоталамус, ядро уздечки, латеральное септальное ядро перегородки, вентральная покрышка. Периферические ткани (П.т.): плацента, двенадцатиперстная кишка, поджелудочная железа, желудок.

Г. м.: пгпоталамус, зрительная кора, область септума. гиппокамп, передние бугры четверохолмия, ядро оптического тракта, ствол мозга и спинной мозг. В течение онтогенеза: г. м., спинной мозг, вегетативная нервная система и мозговое вещество надпочечников.

Кардиовасцикуляр ные функции, терморегуляция, контроль над пищевым поведением.

Включены в вегетативные и нейро-эндокринные функции; регуляция потребления пищи И весового гомео-стаза; гипераль-гезия, боль; грум инг, стресс.

МС5 <х-МСТ>АКТГ= р-МС.Г»у-МСГ

П.т.: кожа, надпочечники, скелетная мускулатура, костный мозг, селезенка, тимус, семенники и яичники, матка, легкие, печень, щитовидная железа, желудок, почки, экзокринные железы. Г.м.: кора, мозжечок.

Функции не очень хорошо изучены. П р ед полож ите л ь-но: нейро/миотро-фические, противовоспалительные эффекты; слабая липолитическая активность а-МСГ в адипоцитах; регуляция секреции альдостерона, продукции сальных желез и функций экзо-кринных желез; терморегуляция.

Из всех клонированных МС рецепторе MC1R обладали наиболее высокой аффинностью к а-МСГ [Mountjoy, 1994], который является физиологическим регулятором быстрого изменения цвета у низших позвоночных, включая рыб, амфибий и рептилий; а также стимулирует меланогенез в меланоцитах млекопитающих [Sawyer, 1980]. MC1R были найдены во многих периферических тканях, а также в ЦНС [Wikberg, 1999; Hartmeyer et al, 1997] (табл. 1). MCI рецепторы контролируют способность меланоцитов выделять пигмент меланин. Опыты показали, что активация рецепторов приводит к увеличению черно-коричневой пигментации животных, а уменьшение рецепторной активности к увеличению красно-желтой пигментации [Wikberg et al, 2000]. У человека активация MC1R приводит к появлению загара.

Увеличение ультрафиолетовой радиации приводит к усилению синтеза а-МСГ и АКТГ в эпидермисе, они связываются с MC1R и, как следствие, повышается пигментация кожи [Wakamatsu et al, 1997]. Мутации MC1R могут приводить к повреждению их функций и появлению людей со светлой кожей различной степени и низкой способностью к загару [Healy et al, 2000]. MC1R обнаружен в клетках иммунной системы [Catania et al, 1996]. Недавно было показано, что моноциты из 5 типов МС рецепторов экспрессируют только MC1R. Митогены, эндотоксины и провоспалительные цитокины повышают уровень экспрессии MC1R в моноцитах. [Luger et al, 1998]. Эти данные свидетельствуют о возможном участии MC1R в реализации иммуномодулирующих эффектов меланокортинов.

Меланокортиновые рецепторы 2 типа

Вскоре после открытия MC1R были клонированы меланокортиновые рецепторы в коре надпочечников, с которыми предпочтительно связывается АКТГ, - MC2R. MC2R главным образом экспрессируется в зоне пучка (сайт глюкокортикоидной продукции) и в зоне гломерулы (сайт меланокортикоидной продукции) коры надпочечноков [Chhajlani et al, 1993]. MC2R опосредуют стероидные эффекты АКТГ [Xia et al, 1996]. Кроме того, мРНК MC2R экспрессируется в коже человека [Slominski et al, 1996]. Экспрессия MC2R была также обнаружена в белой жировой ткани грызунов (но не человека). Было высказано предположение, что MC2R, экспрессируемые в адипоцитах различных млекопитающих, опосредуют липолитическую активность АКТГ [Boston, 1998].

Мутации гена, кодирующего МС2 рецепторы, которые вызывают ослабление рецепторных функций, приводят к наследственной глюкокортикоидной недостаточности [Elias et al, 1999]. Однако иногда этот синдром проявляется у людей с нормальным МС2-геном, что говорит о существовании других нарушений, приводящих к этому заболеванию [Huebner et al, 1999].

Меланокортиновые рецепторы 3 типа

Меланокортиновые рецепторы 3 типа обладают афинностью к а-, Р-, у-МСГ и АКТГ. На периферии экспрессия MC3R показана во многих органах и тканях (табл. 1) [Gantz et al, 1993; Chhajlani, 1996]. Экспрессия MC3R также широко представлена в ЦНС: в гипоталамусе, таламусе, гиппокампе, передней миндалине и коре. Такое распределение MC3R указывает на возможную роль этого рецептора в реализации кардиоваскулярных эффектов МК и контроле над пищевым поведением [Low et al, 1994]. Высокая плотность MC3R также показана в вентромедиальных ядрах гипоталамуса, включая аркуатное ядро, и в заднем гипоталамусе. Изучение связывания I-NDP-MSH показало высокую плотность MC3R в вентромедиальных ядрах гипоталамуса и в прилежащем ядре, а также в медиальной преоптической зоне и центральном сером веществе. Наличие MC3R в прилежащем ядре представляет большой интерес для выяснение участия меланокортиновой системы в развитии наркотической зависимости [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Высокий уровень MC3R представлен в прозрачной перегородке и обонятельном бугорке. Существует предположение, что большое распространение рецепторов в ЦНС говорит об их пресинаптическом расположении [Wikberg et al, 2000]. Кроме того, показано, что большое количество этих рецепторов находится в клетках аркуатного ядра, которое известно, как место продукции ПОМК [Roselli-Rehfuss et al, 1993]. На основании этого было высказано предположение о том, что MC3R функционируют как ауторецепторы и контролируют выброс меланокортинов из ПОМК-содержащих нейронов [Wikberg et al, 2000]. Установлено, что в течение онтогенеза крыс экспрессия МСЗ рецепторов в ЦНС подвергается изменениям: при рождении экспрессия довольно низкая, затем она возрастает в течение 21 дня и далее остается неизменной [Xia, Wikberg, 1997].

Функции МСЗ рецепторов пока недостаточно изучены, однако существует предположение об участии этих рецепторов в контроле полового поведения [Wikberg et al, 2000]. Изучение мутаций гена данного рецептора также не выявило его функций, поскольку мутации не были связаны фенотипическими характеристиками [Li et al, 2000].

Меланокортиновые рецепторы 4 типа

Вторым типом нейрональных меланокортиновых рецепторов, которые были клонированы, являются MC4R [Gantz et al, 1993]. Детальное изучение органов человека продемонстрировало низкий уровень MC4R на периферии. При этом экспрессия MC4R, также как MC3R, широко распространена в ЦНС: таламусе, гипоталамусе, стволе мозга и коре. Распространение MC4R в этих регионах мозга свидетельствует об их возможном участии в регуляции вегетативных и нейроэндокринных функций. MC4R экспрессируются также в спинном мозге [Mountjoy et al, 1997]. МС4 рецепторы появляются в эмбриональном мозге задолго до МСЗ рецепторов. Они были обнаружены в эмбрионах крыс на 18 день, в то время как МСЗ рецепторы еще отсутствовали [Kistler-Heer et al, 1998]. Во время развития эмбриона эти рецепторы активно экспрессируются в нервной системе, что говорит об их возможном участии в развитии нервной системы [Wikberg et al, 2000].

Основной функцией МС4 рецепторов является контроль веса тела и регуляция пищевого поведения [Wikberg, 1999]. Однако центральные МС4 рецепторы могут быть также вовлечены в регуляцию других эффектов МСГ-пептидов. В частности, есть предположения, что чрезмерный грумминг и некоторые виды стереотипического поведения (синдром потягивания-зевания), вызванные введением АКТГ и а-МСГ, осуществляются именно через МС4 рецепторы [Wikberg et al, 2000].

Меланокортиновые рецепторы 5 типа

Последними из меланокортиновых рецепторов были клонированы гены MC5R. Данный тип рецепторе наиболее гомологичен MC4R и наименее схож с MC2R. MC5R мРНК экспрессируется в большом количестве в экзокринных железах, таких как слезные, семенные, препунциальные, сальные железы и простата [van der Kraan et al, 1998]. MC5R экспрессируются во многих других периферических тканях (табл. 1). Кроме того, MC5R представлены в некоторых областя мозга, включая гипофиз, обонятельную луковицу, черную субстанцию и стриатум [Griffon et al, 1994]. Экспрессия MC5R мРНК обнаружена у мышей в адипоцитах, но в более низком уровне, чем мРНК меланокортиновых рецепторов 2 типа. Функции MC5R до сих пор не до конца изучены, известно что их активация опосредует слабую липолитическую активность а-МСГ в адипоцитах некоторых видов грызунов [Boston et al, 1996]. У животных с дисфункцией MC5R была понижена продукция сала из сальных желез, что приводило к затруднению отталкивания воды мехом и нарушению терморегуляции

Chen, 1997]. Есть данные, что MC5R расположены на ацинарных клетках секреторного эпителия слезных желез, что говорит об их возможной роли в регуляции секреции слез [van der Kraan et al, 1998].

Экстрагормональные эффекты меланокортинов

Первые данные по негормональным эффектам меланокортинов - влиянию АКТГ на поведение животных были получены в середине 50-х годов [Mirsky et al, 1953; Murphy, Miller, 1955]. Дальнейшие исследования показали, что наряду со способностью оказывать действие на меланоциты и выброс глюкокортикоидов, меланокортины могут улучшать внимание, память и способность к обучению, влиять на моторные функции и половое поведение, модулировать потребление пищи, ускорять регенерацию нервной ткани и оказывать противовоспалительное действие [De Wied, Jolles, 1982; Starowicz, Przewlocka, 2003; Strand, 1999]. Было высказано предположение о том, что некоторые из этих эффектов опосредованы через кору надпочечников и являются составной частью гормонального действия АКТГ. Однако вскоре выяснилось, что экстирпация надпочечников не приводит к исчезновению влияния АКТГ на поведение [Bohus et al, 1968]. Позже были обнаружены пять рецепторов меланокортинов и доказано, что гормональные эффекты АКТГ осуществляются только через МС2 рецепторы [Schioth, 1996], а действие меланокортинов на другие функции организма, в том числе поведение, может иметь различные механизмы и осуществляться через другие подтипы рецепторов.

Ноотропные эффекты меланокортинов

Первые сведения о действии АТКГ на память появились в середине 50-х годов. Было показано, что удаление передней доли гипофиза, где вырабатывается АКТГ, приводит к нарушению выработки условных рефлексов у экспериментальных животных [Mirsky et al, 1953; Murphy, Miller, 1955]. Введение АКТГ нормализовало процесс обучения пшофизэктомированных животных [De Wied, 1964]. Затем было обнаружено, что АКТГ ускоряет обучение и у интактных животных [Bohus, Endroczi, 1965]. На основании многочисленных исследований было сделано заключение, что АКТГ обладает ноотропной активностью. Нейротропные эффекты кортикотропина не зависят от гормонального действия, а являются результатом его прямого влияния на центральную нервную систему, так как было показано, что аналогичным действием на обучение обладают а- и Р-МСГ, хотя они содержат лишь часть аминокислотной последовательности АКТГ и проявляют низкую кортикотопную активность [Bohus, De Wied, 1966; De Wied, 1969].

В настоящее время в литературе представлено большое количество данных по влиянию АКТГ и МСГ на выработку условных рефлексов. При этом в случае использования моделей обучения с отрицательным (болевым) подкреплением результаты неоднозначны. В одних работах показано, что у интактных животных эти гормоны улучшают выработку рефлексов с болевым подкреплением [Beaty et al, 1970; Van Wimersma Greidanus, 1980], в других - не обнаружено влияние АКТГ на способность животных избегать болевой раздражитель [Kelsey, 1975]. По-видимому, неоднозначность эффектов АКТГ при обучении животных в тестах с отрицательным подкреплением может быть связана с различным уровнем эндогенного АКТГ, в значительной степени зависящего от условий эксперимента. Исследования влияние АКТГ и МСГ на выработку рефлексов с положительным (пищевым, питьевым) подкреплением однозначно демонстрируют улучшающий эффект [Stratton, Kastin, 1975; Garrud et al, 1974; Kastin et al, 1975]. В литературе также встречается множество данных о положительном действии АКТГ и МСГ на сохранение и угашение предварительно выработанных рефлексов. Торможение угашения под действием этих гормонов наблюдалось в самых различных модификациях опытов: в тестах активного [De Wied, 1966; Nyakas, Endroczi, 1980] и пассивного избегания удара током [Dempsey et al, 1975; Wiegant, Gispen, 1977], с пищевым [Gray, 1977] и половым [Bohus, 1974] подкреплением, в тестах, основанных на вкусовом отвращении [Levine et al, 1977; Smotherman, Levine, 1978].

Дальнейшие исследования показали, что способностью ускорять обучение животных и улучшать сохранение выработанных навыков обладают также и фрагменты АКТГ и МСГ, заведомо лишенные гормональной активности. Изучение нейротропной активности фрагментов АКТГ, проведенные как в нашей стране, так и за рубежом, позволили выявить зависимость эффектов пептидов от их структуры, дозы и времени введения. Эксперименты показали, что фрагменты АКТГ4.7, АКТГ5.10 и АКТГ4.10 ускоряют выработку условных рефлексов у экспериментальных животных. АКТГ5.7 не оказывает влияния на обучение. Наиболее активным из исследованных пептидов является АКТГ4.10. Наименьшим фрагментом АКТГ, сохраняющим поведенческую активность, является АКТГ4.7 [De Wied et al, 1975]. Остаток Phe в позиции 7 играет ключевую роль в проявлении поведенческих эффектов фрагментов АКТГ. Замена этой аминокислоты на D-энантиомер в АКТГ и о, АКТГ4.10ШШ АКТГ4.7 приводила к появлению противоположного эффекта - замедлению выработки условной реакции избегания [Ашмарин и др., 1980; Garrud et al., 1974]. Ноотропные эффекты фрагментов АКТГ зависят от дозы и эта зависимость имеет обратный V-образный характер. При этом эффекты природных пептидов - фрагментов АКТГ весьма кратковременны и их длительность ограничивается приблизительно 30 минутами. Кроме того, было показано, что для пролонгирования действия фрагментов АКТГ бессмысленно увеличивать количество вводимого пептида, так как это приводит к исчезновению эффекта [Ашмарин и др., 1997].

Исследования на добровольцах показали, что введение АКТГ4.10 приводит к повышению селективного внимания (Miller et al, 1974; Sandman et al, 1975). Положительный эффект пептидов был более выражен в том случае, когда в опытах участвовали люди с исходно плохой памятью или пожилые люди с ослабленными познавательными способностями.

До настоящего времени не выяснены механизмы, лежащие в основе ноотропного действия МК. С одной стороны, можно преждположить, что эффекты пептидов опосредуются через повышение состояния возбудимости и уровня мотиваций. Это приводит к усилению избирательности внимания, то есть происходит усиление значимости стимулов, имеющих непосредственное отношение к экспериментальной ситуации, и ослабление внимания к посторонним стимулам, что, в конечном счете, приводит к возможности появления стимулспецифических ответов [de Wied, 1974]. С другой стороны, имеются данные о том, что фрагменты АКТГ влияют на специфические механизмы памяти — процессы формирования, хранения и воспроизведения памятного следа. Это подтверждается опытами с введением пептидов после сеансов обучения [Flood et al, 1976].

Для выяснения механизма действия фрагментов АКТГ проводили исследования эффектов пептидов при различных повреждениях областей мозга. Так, перерезка в районе заднего таламуса полностью снимала положительное влияние АКТГио на сохранение приобретенного навыка. Перерезка в области лимбических структур и инъекции пептидов в эти районы мозга показали, что такие образования как перегородка, гшпюкамп, миндалина тоже вовлечены в проявление поведенческих эффектов АКТГ-подобных пептидов. Основываясь на этих данных, можно предположить, что для реализации своих эффектов МК используют не на одну конкретную область мозга, а нуждаются в целой анатомически не поврежденной лимбической системе [Van Wimersma Greidanus et al., 1983].

До сих пор неясно, какой из рецепторов принимает участие в ноотропном действии меланокортинов. Наиболее вероятными кандидатами являются МСЗ, МС4 и МС5 рецепторы, поскольку они экспрессируются в мозге и периферических тканях [Hoi et al, 1995]. Однако в литературе встречаются данные, противоречащие этому предположению. Так острое (1мг) или хроническое (1мг ежедневно в течение 6 недель) интраназальное введение АКТГ4.10 людям улучшало кроткосрочную память. Кроме этого пептида, ученые использовали дезацетил-а-МСГ, пептид, способный с высокой степенью аффинности связываться со всеми типами МС рецепторов, находящихся в мозге. Опыты показали, что дезацетил-а-МСГ менее эффективно улучшал показатели памяти. Это говорит о том, что механизм ноотропных эффектов меланокортинов связан не только с известными МС рецепторами [Smolnik et al, 2000].

Действие меланокортинов на двигательную активность и эмоциональное состояние животных

Исследования показали, что АКТГ оказывает влияние на двигательную активность и исследовательское поведение животных. При этом внутрижелудочковая инъекция гормона вызывает резкое снижение двигательной активности через 15 минут после введения [Amir et al., 1980]. При периферическом введении АКТГ также наблюдаются изменения двигательной активности и ориентировочно-исследовательской реакции (ОИР) животных. В данном случае влияние гормона определяется условиями, в которых находится животное во время эксперимента. Инъекция АКТГ перед помещением животного в новые условия приводит к усилению двигательной активности в том случае, когда крысу тестируют в отсутствие сильных внешних раздражителей, в таких условиях поведение в большей степени определяется исследовательской мотивацией. Увеличение двигательной активности свидетельствует, по-видимому, об усилении ОИР под действием АКТГ [Антонова и др., 1980]. В случае, когда животное помещается в стрессогенные условия (яркий свет, шум), введение гормона приводит к уменьшению двигательной активности. В этих условиях поведение крыс определяется в основном оборонительной мотивацией, проявлением которой является реакция затаивания [Denenberg et al, 1975]. Следовательно, введение АКТГ приводит к усилению оборонительной реакции. Таким образом, кортикотропин способен усиливать поведенческие реакции, характерные для той ситуации, в которой находится животное, что согласуется с его ролью адаптивного гормона.

Показано, что МСГ и АКТГ способны увеличивать грумминг у крыс. Грумминг -это активное поведение животных, направленное на поверхность тела, т.е. умывание, лизание, чистка гениталий, почесывание. Усиление грумминга наблюдается у грызунов при помещении в новую или стрессогенную ситуацию, в этом случае интенсивный грумминг является примером так называемой "смещенной активности", которая возникает у животных при высокой эмоциональной напряженности [Spruijt, Gispen, 1983]. Поскольку наличие новых или стрессогенных условий активирует гипоталамо-гипофизарную систему, то, вероятно, чрезмерный грумминг, вызванный стрессом, объясняется выбросом меланокортинов.

Чрезмерный грумминг животных вызывается внутрижелудочковым введением а-МСГ и синтетических агонистов МС рецепторов, NDP-MSH и меланотаном-П [Wikberg et al, 2000]. Однако селективный агонист MC3R - Nle-y-МСГ не оказывает влияния на грумминг при этом введении [Adan et al, 1999]. Грумминг крыс, вызыванный внутрижелудочковом введением а-МСГ и АКТГ, блокируется антагонистом МС рецепторов HS014 [Klusa et al, 1998]. Полученные данные свидетельствуют о том, что действие меланокортинов на грумминг опосредуется МС4 рецепторами.

Области мозга, в которых экзогенные меланокортины вызывают грумминг животных, являются областями, иннервирующимися ПОМК-нейронами, что говорит о роли эндогенных меланокортинов в грумминге животных. Это подтверждается также и тем, что внутрижелудочковое введение блокатора МС рецепторов SHU9119 или антител к АКТГ подавляет грумминг у крыс [Wikberg et al, 2000].

Внутрижелудочковое введение АКТГ/МСГ-подобных пептидов способно вызывать у млекопитающих другой вид поведения, также характеризующий эмоциональную напряженность, - это синдром стереотипического поведения, состоящего из чередования потягивания и зевания. Синдром потягивания и зевания, вызванный а-МСГ, снимается предварительным введением антагониста МС рецепторов HS014, что говорит об участии этих рецепторов (преимущественно MC4R) в формировании этот процесса [Vergoni et al, 1998]. Этот синдром также возникает при введении АКТГi.24 и а-МСГ в паравентрикулярные ядра гипоталамуса [Argiolas et al, 2000].

Влияние меланокортинов на иммунную систему

Большое число данных указывает на то, что АКТГ/МСГ-подобные пептиды способны ингибировать процессы воспаления. Показано, что а-МСГ ослабляет воспалительные процессы при болезнях кишечника [Rajora et al, 1997; Ceriani et al, 1994], артритах, воспалениях мозга, ишемии мозга [Rajora et al, 1997], ишемии почек [Chiao et al, 1997] и дерматитах. МК показали свою эффективность в различных моделях воспаления, как острого, так и хронического [Luger et al, 1999]. Уровень а-МСГ возрастает при воспалении, что, вероятно, является частью естественной защитной реакции организма [Ichiyama et al, 2000]. В последнее время большое количество исследований посвящено созданию противовоспалительных лекарственных препаратов на основе соединений, активирующих МК рецепторы.

Наблюдающийся при воспалении подъем температуры тела является защитной реакцией организма, однако важно чтобы он не достигал критического уровня. В последние 25 лет были идентифицированны многие эндогенные вещества, которые регулируют подъем температуры тела при воспалении, такие как интерлейкины и TNF-а. Также показано, что эндогенными антиперетиками могут являться аргинилвазопрессин, а-МСГ и глюкокортикоиды, при этом а-МСГ оказывает наиболее мощное воздействие [Strand, 1999; Morrow et al, 1993]. Во время жара и лихорадки концентрация а-МСГ возрастает в септальной области мозга [Lipton et al, 1997; Bell et al, 1987], что свидетельствует о важной роли эндогенного гормона в контроле над подъемом температуры тела. Антипиретический эффект МК не контролируется надпочечниками, т.к. после адреналэктомиии жаропонижающее действие а-МСГ сохраняется [Catania et al, 1993]. Исследования in vivo показали, что антагонист МС рецепторов - SHU9119 при внутрижелудочковом (в/ж) введении вызывает усиление эндотоксининдуцируемой лихорадки у крыс [Huang et al, 1997]. При этом внутривенное (в/в) введение этого препарата было не эффективно. Следовательно, эндогенные МК оказывают жаропонижающее действие путем активации MCR, расположенных в мозге, причем этот эффект не связан с активацией гипофизарноадреналовой оси. MC3R и MC4R экспрессируются в областях мозга, участвующих в терморегуляции, таких как септум, преоптическая зона, передний гипоталамус, что указывает на участие этих рецепторов в антиперитических эффектах МК. Периферическое введение а-МСГ также индуцирует антипиретическое действие, хотя снижение лихорадки менее выражено, чем при центральном введении.

Центральное введение а-МСГ ингибирует воспаление в периферических тканях. Например, показано, что а-МСГ, а также его С-концевой трипептиный фрагмент, при центральном введении ингибируют местное кожное воспаление, вызванное апликацией IL-lp или IL-8. Возможно, этот эффект опосредуется через нисходящие нервные пути, которые способны модулировать воспаление в периферических тканях [Lotti et al, 2002]. Точные механизмы противовоспалительных эффектов а-МСГ при центральном введении до сих пор не ясны.

Меланокортины оказывают также местное противовоспалительное действие на периферии. Пептиды этого класса обнаружены во многих периферических тканях организма, например, экспрессия гена ПОМК показана у крыс в перитонеальных макрофагах, кроме того, там же экспрессируется мРНК MC3R. Показано, что пептиды, содержащие последовательность АКТГ4.10, подавляют аккумуляцию перитонеальных макрофагов при остром воспалении [Getting et al, 1999]. Предполагается, что MC3R являются мишенью для этих пептидов. Активация MC3R может ослаблять острый воспалительный ответ или острую фазу хронического воспаления.

В моноцитах и макрофагах а-МСГ ингибирует продукцию и снижает активность иммунорегуляторных и провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины IL-1 и IL-2, и у-интерферон (INF-y), при этом усиливают продукцию факторов, подавляющих воспаление, таких как IL-10. В макрофагах, кроме того, а-МСГ подавляет продукцию оксида азота (N0), связанную с воспалением, ингибируя экспрессию индуцибельной NO-синтазы [Star et al, 1995]. Показано также, что а-МСГ ингибирует хемотаксис нейтрофилов в экспериментах in vitro. Ограничение миграции нейтрофилов приводит к ослаблению воспаления. В макрофагах, моноцитах и нейтрофилах экспрессируются рецепторы меланокортинов, следовательно, а-МСГ может непосредственно влиять на клетки, участвующие в реакции воспаления.

Многие типы клеток, которые реагируют на меланокортины, экспрессируют МС рецептор 1 типа. К таким клеткам относятся макрофаги, моноциты, нейтрофилы, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки глиомы, меланоциты и клетки меланомы. Было продемонстрировано, что в норме человеческие моноциты содержат низкий уровень MC1R, который повышается при активации моноцитов в результате воздействия различных агентов, таких как липополисахарид или цитокины [Evidence et al, 1997]. Таким образом, можно предположить,что меланокортины воздействуют на перечисленные выше клетки через MC1R. Однако рядом авторов показана экспрессия MC3R в макрофагах мыши [Getting et al, 1999], а также наличие MC5R в культуре клеток В-лимфоцитов [Buggy et а1,1998]. Экспрессия обоих типов рецепторов (MC1R, MC5R) показана в тучных клетках человека [Artuc et al, 1999]. Следовательно, в реализации противовоспалительного действия меланокортинов участвуют различные типы меланокортиновых рецепторов.

Роль меланокортинов в регуляции пищевого поведения

Пищевое поведение регулируется комплексом физиологических реакций, включая центральные и периферические механизмы. Лептин и инсулин - это важнейшие медиаторы, выделяющиеся на периферии. В контроль этой функции вовлечены также регуляторы ЦНС: нейропептид Y, КРФ, галанин, орексин, моноамины и многое другое. Эти факторы контролируют потребление пищи и, как следствие, массу тела и рост.

Первые сообщения о том, что меланокортины вовлечены в регуляцию пищевого поведения появились в середине 70-х годов, когда стало известно, что центральное введение а-МСГ уменьшает количество потребляемой пищи [Panskepp, 1976]. Позже было показано, что внутрижелудочковое введение цикличного гептапептида MT-II, агониста MC3R и MC4R, также влияет на пищевое поведение грызунов [Hruby, 1995]. Увеличение экспрессии гена агоути-протеина в ЦНС приводит к ожирению и пониженному содержанию лептина и инсулина в крови. Поскольку агоути-протеин имеет высокое сродство к MC4R, то, по-видимому, именно эти рецепторы и участвуют в регуляции пищевого поведения [Wikberg, 1999]. Кроме того, инактивация гена MC4R у мышей приводит к выраженному увеличению аппетита и повышению роста и веса тела [Huszar et al, 1997].

Центральное введение АКТГ1-24 и а-МСГ приводило к анорексии, в то время как неселективный антагонист МС4 рецепторов SHU9119 и селективный антагонист этих рецепторов HS014 вызывали выраженный орексигенный эффект [Kask et al, 1998 В]. Было также показано, что селективный агонист MC4R р-МСГ выражено и дозозависимо уменьшает потребление пищи, а селективный агонист MC3R - yl-МСГ не влияет на потребление пищи [Kask et al, 2000]. Таким образом, все эти данные доказывают важную роль MC4R в регуляции пищевого поведения.

Изучение влияния внутрижелудочкового введения различных агонистов и антагонистов меланокортиновых рецепторов на пищевое поведение голубей показало, что МС4 рецепторы регулируют потребление пищи и энергетический гомеостаз не только у млекопитающих, но и у птиц [Strader et al, 2003].

Механизмы действия МС4 рецепторов на потребление пищи до конца не изучены. Некоторые данные говорят о взаимодействии этих рецепторов с системой лептина. Так, блокатор MC4R HS014 подавляет эффекты лептина на пищевое поведение [Kask et al, 1998 А]. Кроме того, животные с нокаутом МС4 рецепторов не реагировали на введение лептина [Marsh et al, 1999]. Таким образом, возможно действие лептина на пищевое поведение опосредуется через МС4 рецепторы.

Внутрижелудочковое введение КРФ так же, как и АКТГ1-24, вызывает анорексический эффект. КРФ способен блокировать стимуляцию потребления пищи, вызванную голодом, инсулиновой гипогликемией, активацией норадренергической или опиоидной системы [Vergoni et al, 1990]. Интересно, что анорексический эффект КРФ не связан (или связан в небольшой степени) с действием АКТГ, поскольку не блокируется антагонистом МС4 рецепторов HS014 [Vergoni et al, 1999].

Действие меланокортинов на болевую чувствительность.

Роль меланокортинов в регуляции болевой чувствительности остается до настоящего времени не выясненной. Сведения о влиянии АКТГ и МСГ на восприятие боли противоречивы. Исследование влияния этих гормонов на болевую чувствительность животных показали, что эффекты пептидов этого класса зависят от структуры, способа введения и дозы пептида. Было показано, что системное введение АКТГ приводит к повышению порога болевой чувствительности как у крыс [Li et al., 1990], так и у человека [Kshatri et al., 1997]. Однако в ряде работ не было выявлено влияния АКТГ на болевую чувствительность при системном введении [Gispen et al., 1976]. При внутримозговом введении направленность воздействия меланокортинов на болевую чувствительность зависит от места введения пептида. Показано, что введение АКТГ в область околоводопроводного серого вещества (ОВС) вызывает повышение болевого порога [Li et al., 1990]. Предварительное введение блокатора опиоидных рецепторов налоксона не предотвращает снижения болевой чувствительности, вызванного введением АКТГ в ОСВ. Анальгетические эффекты также наблюдаются после введения в эту область а-МСГ [Walker, et al., 1980]. Однако в некоторых работах не показано изменение болевой чувствительности после введения АКТГ в ОСВ [Jacquet et al., 1981]. Противоречия между результатами различных исследований можно, отчасти, объяснить различиями в дозе введенного АКТГ. Это предположение находит свое подтверждение в работе, выполненной на мышах [Amir, 1981], в которой показано, что при введении различных доз АКТГ могут наблюдаться различные типы болевой реакции (гипо- и гиперальгезия).

Введение АКТГ1.24 в дозе 5-10 мкг в боковые желудочки мозга вызывает гиперальгезию у крыс в тестах "отдергивания хвоста" и "горячая пластина". Предварительное введение морфина снижает, а налоксона потенциирует этот эффект [Bertolini et al., 1979; Fratta et al., 1981]. Гиперальгетические эффекты также наблюдались при в/ж введении а-МСГ в дозах от 0,1 до 10 мкг в тесте "отдергивания хвоста". Снижение болевого порога наблюдалось через 20 мин после введения препарата и продолжалось в течение часа [Sandman et al., 1981]. Однако при исследовании влияния в/ж инъекции а-МСГ на болевую чувствительность животных в тесте "горячая пластина" было показано, что введение пептида в дозах 0,1; 1 и 10 мкг оказывает анальгетическое действие [Ohkubo et al., 1985]. Снижение болевой чувствительности в тесте "горячая пластина" зарегистрировано также при в/ж введении фрагментов АКТГ 1.9,5.9 и 7.9 в дозах 100-150 мкг [Genedani et al., 1978].

Проводилось исследование анальгетической активности аналога АКТГ4.9 - ORG 2766. Было показано, что введение этого пептида в ОСВ вызывает дозозависимые анальгетические эффекты в тесте "отдергивания хвоста" [Walker et al., 1981]. При этом эффективные дозы (3-30 мкг) ORG 2766 были сопоставимы с дозами морфина при внутрижелудочковом введении. Предварительное введение налоксона не препятствовало анальгетическим эффектам ORG 2766. Внутрижелудочковое введение пептида не оказывало влияния на болевую чувствительность животных. Авторы работы делают выводы о неопиоидной природе анальгетических эффектов ORG 2766.

Таким образом, в зависимости от способа введения, дозы и структуры меланокортинов может наблюдаться как снижение, так и повышение болевой чувствительности. Проведенные исследования позволяют сделать заключение о неопиоидной природе анальгетических эффектов меланокортинов. Гиперальгетическое действие этих пептидов, вероятно, опосредуется опиоидной системой организма [Fratta et al., 1981; Li etal., 1990].

Влияние меланокортинов на половое поведение

АКПТМСГ-подобные пептиды способны влиять на половое поведение самцов и самок животных. У самцов крыс, котов и кроликов внутрижелудочковое введение АКТГ1-24 или а-МСГ может усиливать эрекцию и эякуляцию даже в отсутствии самки. а-МСГ в 10 раз повышает частоту эрекций в течение 60 минут после внутрижелудочкового введения. Антагонист МК4 рецепторов HS014 лишь частично блокирует этот ответ [Vergoni et al, 1999]. Есть данные, что увеличение полового поведения под действием меланокортинов ослабляется введением селективных МКЗ блокаторов. А поскольку HS014 является также частичным блокатором МКЗ рецепторов, то возможно влияние меланокортинов на половое поведение опосредовано именно через МКЗ рецепторы [Wikberg, 2000].

Синтетический агонист МК-рецепторов - меланотан-И, применяется в медицине при лечении половых расстройств у мужчин. Это соединение способно в несколько раз увеличить частоту эрекций [Wessells et al., 1998].

Есть данные, что действие АКТГ/МСГ-подобных пептидов на половое поведение осуществляется при участии N0. Так внутрижелудочковое введение блокатора N0-синтазы NAME понижает вызванную АКТГ эрекцию [Poggioli et al., 1995]. Кроме того, влияние меланокортинов на половое поведение меняется при действии блокаторов мускариновых рецепторов и блокаторов кальциевых каналов, что говорит о вовлечении в этот процесс большого количества различных нейромедиаторных систем [Argiolas et al., 2000].

Кардиотропные эффекты меланокортинов

В конце 80-х годов было показано, что меланокортины могут оказывать действие на кардиоваскулярную систему. Так, у-МСГ проявлял прессорные эффекты, повышал церебральный кровоток и частоту сердечных сокращений (ЧСС) при внутривенном введении [Gruberet et al., 1989]. Внутрижелудочковое введение у-МСГ также вызывало длительное повышение артериального давления [Sun et al., 1992] . Однако эти эффекты не снимались введением блокатора МСЗ и МС4 рецепторов SHU9119 и, следовательно, не были связаны с рецепторами этого типа. Есть предположения, что действие у-МСГ на кардиоваскулярную систему опосредуется через центральный механизм, не связаный с известными видами МС рецепторов. Возможно, структуры, ответственные за кардиоэффекты у-МСГ, находятся в областях близких к третьему желудочку, поскольку повреждение этих областей приводит к снижению прессорных эффектов у-МСГ [Wikberg, 2000].

В отличие от у-МСГ, внутривенное введение АКТГ 1.24 вызывает понижение артериального давления, что сопровождается рефлекторной тахикардией. Однако более короткие пептиды, например АКТГ4-10, оказывают прессорное действие при периферическом введении, но их эффекты в 5-10 раз слабее, чем эффекты у-МСГ [Van Bergen et al., 1995]. Авторы полагают, что для вазопрессорного и тахикардического действия необходима последовательность His-Phe-Arg-Trp, расположенная близко к С-концевой области молекулы пептида.

Центральное введение а-МСГ и АКТГ вызывало выраженный гемодинамический эффект - увеличивалось артериальное давление. Этот эффект блокировался внутрижелудочковым введением агоути-протеина, антагониста МС рецепторов [Dunbar, Lu, 2000]. Таким образом, эффекты а-МСГ и АКТГ на кардиоваскулярную систему, в отличие от у-МСГ, осуществляются через МС рецепторы (возможно МС4) [Wikberg et al., 2000]. а-МСГ и некоторые фрагменты АКТГ (АКТГ1.24, АКТГМ6 и АКТГ4-ю) проявляют восстанавливающее действие при экспериментальном геморрагическом шоке. Введение этих пептидов нормализует сердечный выброс и другие параметры сердечно-сосудистой системы, что приводит к увеличению времени жизни животного после острой кровопотери. Этот эффект АКТГ и МСГ- пептидов возможно связан с подавлением сверхпродукции фактора некроза опухоли-а (TNF-а) при шоке. Было показано, что при кровопотере у крыс сильно повышается уровень TNF-a в крови (в норме TNF-a в крови отсутствует). АКТГ1.24 выраженно понижает этот уровень и восстанавливает кардиоваскулярные функции [Wikberg et al., 2000].

Нейропротекторные и нейротрофические эффекты меланокортинов

Многочисленные эксперименты показали, что, помимо пречисленных выше эффектов, МК обладают нейропротекторным и нейротрофическим действием. Так как исследованию именно этих свойств МК посвящена представленная работа, то нейропротекторное и нейротрофическое действие МК будут охарактеризованы более подробно.

Регенерация нервов и протекторное влияние меланокортинов

Нейротрофические эффекты меланокортинов были продемонстрированы во мнигих экспериментах in vitro и in vivo.

Исследования in vitro показали, что МК влияют на нервные клетки в культуре -эффекты этих пептидов включают в себя повышение выживаемости нейронов, увеличение прорастания отростков, усиление синтеза белка и др. [Strand et al., 1993]. Эксперименты показали, что а-МСГ стимулирует прорастание отростков в клетках о нейробластомы линии Neuro2A. При этом введение антагониста MC4R (D-Apr АКТГ4. ю) ингибирует стимулирующее действие пептида [Adan et al., 1996]. Также показано, что а-МСГ увеличивает прорастание отростков в культурах нейронов спинного мозга [Van der Neut, 1988]. Аналоги фрагментов АКТГ ORG 2766 и BIM 22015 также ускоряют прорастание отростков в культуре клеток спинного мозга в отсутствие фактора роста нервов (NGF), при этом эффекты пептидов были соспоставимы с эффектами самого NGF [Strand et al., 1993]. Литературные данные также указывают на то, что МК оказывают влияние на рост и дифференциацию центральных нейронов в культуре клеток. Обработка культуры церебральных нейронов цыпленка АКТГ1.24 приводит к увеличению клеточного метаболизма и стимулирует прорастание отростков [Daval, 1983]. Введение AKTTVio и АКТГ1.24 в культуру клеток мозга, полученных из эмбрионов крысы, приводит к увеличению плотности нейрональных сетей и нейронных связей [Richter-Landsberg, 1986].

Меланокортины (а-МСГ, АКТГ) ускоряют регенерацию аксонов после повреждения периферических нервных волокон и стимулируют прорастание отростков в нейронах ЦНС. В случае повреждение периферических нервов и при ряде патологий МК являются эффективными ростовыми факторами, ускоряющими и улучшающими регенерацию нервов и мышечную реиннервацию [Strand et al., 1993]. Морфологические исследования показали, что введение МК приводит к возрастанию числа регенирирующих аксонов, улучшает образование концевых пластинок и увеличивает количество реиннервированных моторных единиц, то есть МК воздействуют на весь комплекс реиннервации мышечных волокон регенерирующим нервом NGF [Strand et al., 1993]. а-МСГ оказывает стимулирующее влияние in vivo на прорастание отростков нейронов спинного мозга после травмы. У животных, получавших а-МСГ, ускорялось также функциональное восстановление. В экспериментальной модели травмы спинного мозга у взрослых крыс, присутствие а-МСГ в коллагеновом матриксе, заполняющем место повреждения, вызывало прорастание внутрь него регенерирующих волокон [Joosten et al., 1999]. МК облегчают восстановление как сенсорных, так и моторных функций после повреждения или перерезки периферических нервов у крыс [Edwards et al., 1984]. Введение синтетического антагониста а-МСГ, [D-Тгр7,Ala8,D-Phe1 °]а-МСГб н, в течение первых 10 дней после повреждения седалищного нерва крысы приводило к значительному замедлению восстановления функции организма. Это свидетельствует о том, что эндогенные меланокортины участвуют в регенерации нервной ткани и стимулируют рост периферических нервных волокон [Plantinga et al, 1995].

АКТГ/МСГ-подобные пептиды также способны оказывать положительное действие на восстановление функций организма при повреждениях центральной нервной системы, вызванными как перерезками в различных регионах мозга, так и введением нейротоксинов. Было показано, что АКТГ способен ускорять восстановление поврежденного гиппокампа и нормализовать поведение животных после повреждения или перерезки свода. Периферическое введение аналога АКТГ4.10 BIM 22015 способствовало востановлению когнитивных функций у животных с повреждением фронтальной коры [Antonawich et al., 1994]. Нейропротекторное действие меланокортииов было показано на животных с нарушением дофаминэргической (ДА) системы. После повреждения черной субстанции мозга инъекцией 6-OHDA у крыс наблюдались признаки, характерные для болезни Паркинсона (нарушения поведения и расстройства моторных функций). Восстановление всех этих функций значительно ускорялось при введении аналога АКТГ4.9 - ORG 2766. У животных, получавших пептид, отмечено ускорение восстановления поведенческих, морфологических и биохимических показателей по сравнению с контрольной группой [Strand et al., 1993]. Кроме того, исследования показали, что у крыс, которым вводили ORG 2766, наблюдается увеличение содержания ДА по сравнению с контролем [Antonawich et al., 1993]. В основе функционального восстановления после повреждения структур ЦНС могут лежать различные механизмы. С одной стороны, эти механизмы могут включать в себя защиту нейронов от дальнейшего разрушения, иннициацию синаптогенеза или пролиферации новых нейронов. С другой стороны, функциональное восстновление может происходить за счет компенсаторных процессов, таких как изменение плотности рецепторов, коллатеральный спрутинг, изменение скорости обмена медиаторов или их высвобождения неповрежденными нейронами [Antonawich et al., 1994]. Процессы регенерации в ЦНС маловероятны, но МК могут осуществлять защиту нейронов, увеличивать деиннервационную чувствительность или облегчать компенсаторные процессы, которые ускоряют функциональное восстановление [Strand et al., 1993].

Изучение зависимости "структура - активность" показало, что нейротрофические эффекты меланокортииов, также как их ноотропное действие, обусловлены общей последовательностью АКТГ и МСГ - фрагментом АКТГ4-10. Положительные эффекты МК на повреждение нервного волокна имеют дозозависимый характер и более выражены при введении в короткий период после повреждения [Edwards et al., 1984]. Наиболее действенными пептидами являются а-МСГ и аналог АКТГ4.9 ORG 2766 [De Wied et al, 1990].

Таким образом, МК оказывают нейротрофическое влияние при повреждениях нервной системы, следовательно, пептиды этого класа можно рассматривать как ростовые факторы [De Wied et al., 1990]. Способность экзогенных меланокортииов стимулировать восстановление периферической нервной системы может отражать возможное участие аналогичных эндогенных пептидов в физиологическом ответе организма на повреждение. Вероятно, АКТГ/МСГ-подобные пептиды образуются в травмированном нерве в ответ на повреждение. Биологически активные МК были обнаружены в экстрактах дегенерирующих нервов, тогда как в контрольных экстрактах активности обнаружено не было [Plantinga et al., 1995]. В пользу участия эндогенных МК в процессах восстановления периферической нервной системы свидетельствует то, что после двусторонней перерезки периферических нервов возрастает уровень АКТГ4.10 в мотонейронах обоих вентральных рогов [Lee et al., 1994]. Восстановление центральных нейронов при действии МК, вероятно, осуществляет за счет нейропротекторного действия пептидов, так как МК наиболее эффективны при введении сразу после повреждения нервной системы [Attella et al., 1992; Wolterink et al., 1990]. Нейротрофическое действие меланокортинов, возможно, осуществляется через МСЗ, МС4 и МС5 типы рецепторов, которые экспрессируются в нервной ткани. Более того, короткий пептидный фрагмент АКТГ4.10, который узнается данными типами рецепторов, вызывает регенерацию нервных отростков in vivo [Bijlsma et al., 1983] и in vitro [Van der Neut et al., 1988]. Экспрессия MC4R в спинном мозге и MC5R в скелетной мускулатуре мыши также указывает на то, что данные типы рецепторов могут играть роль в нейротрофических эффектах а-МСГ.

Влияние меланокортинов на развивающуюся нервную систему.

В исследованиях in vitro было показано, что меланотрофы средней доли гипофиза влияют на дифференцировку гипоталамических дофаминергических нейронов. В присутствие меланотрофов в культуре эмбриональных гипоталамических нейронов увеличивается доля дофаминергических нейронов, стимулируется рост их нервных волокон. Оказалось, что фактором, обеспечивающим нейротрофический эффект на дофаминергические нейроны, является а-МСГ, в то время как увеличение их числа зависит от присутствия других факторов. Схожий результат наблюдался в культуре гипоталамических нейронов, выделенных из мозга новорожденных крыс, однако, в этом случае а-МСГ был ответственен за оба эффекта [Egles et al, 1998].

С различным ответом клеток на действие а-МСГ в разные периоды развития хорошо сочетаются данные об изменении рецепции клеток во время онтогенеза. Было выявлено, что в течение всего эмбрионального периода доминирующим рецептором является МС4. Он обнаруживается во всех эмбриональных областях, связывающих а-МСГ, включая симпатические ганглии, сенсорные и моторные ядра продолговатого мозга, мозжечок и энторинальную кору. Наблюдаются быстрые всплески в экспрессии, часто совпадающие по времени с формированием нейронной сети, что дает основания предполагать важную роль МС4 рецепторов в раннем онтогенезе. Позже эти функции принимает, вероятно, другой рецептор - МСЗ, который удается обнаружить только в постнатальный период, при этом наблюдается быстрая его экспрессия в вентромедиальном и аркуатном ядрах [Kistler-Heer et al., 1998].

Введение АКТГ/МСГ-подобных пептидов животным в раннем онтогенезе, когда структуры мозга и нейрональные проекции еще развиваются, приводит к ускорению созревания нервно-мышечной системы и влияет на развитие центральной нервной системы [Strand et al., 1989]. Изучение действия МК на развитие нервно-мышечной системы показало, что АКТГ4.10 и а-МСГ положительно влияют на рост и созревание мышечных и нервных волокон как в эмбриональный, так и в постнатальный период. АКТГ-подобные пептиды влияют на скорость развития и морфологию нервно-мышечного контакта. Данные электронной микроскопии свидетельствуют об ускорении формирования концевой пластинки под влиянием АКТГ [Strand et al., 1989]. Следует отметить, что данные пептиды способны непосредственно влиять на рост и развитие мышечной ткани только в ранний эмбриональный период. Введение пептидов на более поздних сроках беременности влияло только на рост и созревание нервных волокон, а ускорение развития мышечной системы происходило за счет увеличения иннервации мышц. В течение первых двух недель жизни крыс введение фрагментов АКТГ или а-МСГ ускоряло дальнейшие созревание нервно-мышечной системы. Восприимчивость нервно-мышечной системы к АКТГ/МСГ-пептидам исчезало, когда ее развитие завершалось [Strand et al, 1993]. В постнатальный период существуют возрастные отличия чувствительности, выявляемые в поведенческих тестах. В частности, двигательная активность увеличивается при введении АКТГ в течение второй постнатальной недели, но не изменяется при введении в течение первой [Rose et al., 1998].

Неонатальное введение АКТГ, его фрагментов и аналогов влияет также на состояние различных рецепторных систем. Были показаны изменения связывающих характеристик рецепторов кортикостероидов в гиппокампе у крыс [Nyakas et al., 1997]. Выявлено действие на рецепторы серотонина [Pransatelli, 1989]. Перинатальное воздействие, приводящее к повышению уровня АКТГ и кортикостероидов, обеспечивает значительные долговременные изменения функций центральных моноаминергических систем. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что неонатальное введение меланокортинов оказывает влияние на созревание системы биогенных аминов мозга, что приводит к изменению содержания и скорости обмена этих нейромедиаторов у взрослых животных [Alves et al., 1997; Nyakas et al., 1981;

Strand et al., 1989]. Результатом неонатальных инъекций AKTIVio является повышение синтеза катехоламинов в большинстве групп катехоламинергических нейронов. Происходит повышение уровней дофамина, норадреналина и их метаболитов в гиппокампе и стволе мозга [Шилова и др., 1996]. Наблюдается также повышенная концентрация моноаминов в переднем мозге, что свидетельствует об ускоренном развитии этих структур у животных, подвергавшихся в неонатальном возрасте введению АКТГ. Наблюдаемые нейрохимические изменения моноаминергических систем в ранний постнатальный период приводит в дальнейшем к изменению функций гипоталамо-гипофизарной системы надпочечников [Alves et al., 1997]. Обнаружено, что реакция катехоламинергических нейронов на неонатальное введение АКТГ является зависимой от генотипа. При сравнении эффектов введения пептида на разных линиях мышей, были выявлены различия как в количественном их выражении, так и в пространственном распределении в структурах мозга. Также существовали зависимые от генотипа различия в поведении [Шилова и др., 1998].

Показано долговременное нейропротекторное воздействие неонатального введения меланокортинов. Так, введение аналога АКТГ4.9 ORG 2766 в ранний постнатальный период оказывало благоприятное воздействие на выживаемость холинергических нейронов при цитотоксическом инсульте увзрослых животных [Horvath et al., 2000].

Исследования показали, что хроническое введение меланокортинов в течение первых 3 недель жизни крыс приводит к долговременным, отставленным изменениям поведения животных [Acker et al., 1985]. Так, у взрослых животных, получавших ежедневно инъекцию фрагмента АКТПмо в раннем неонатальном периоде, отмечено улучшение выработки рефлекса пассивного избегания [Nyakas et al., 1981], показано также ускорение обучения в Т-образном лабиринте [Acker et al., 1985]. Что касается реакции активного избегания, влияния неонатального воздействия АКТГ и АКТГ4-10 на выработку рефлекса не обнаружено, однако, существует значимая разница во времени угасания навыков: у животных, получавших пептиды, навык сохраняется в течение более длительного времени [Nyakas et al., 1981].Отставленные изменения исследовательского поведения взрослых животных зависят от сроков неонатального введения меланокортинов - инъекции АКТГ4.10 в дозе 10 мкг/кг в течение 1-й недели жизни крысят не влияют, а в течение 2-й недели вызывают увеличение исследовательской активности крыс [Rose et al., 1988, Strand et al., 1989]. Однако, имеющиеся в литературе данные о влиянии неонатального введения АКТГ и АКТГ4.10 на ориентировочно-исследовательскую активность, различны. Некоторые исследователи не выявили значимого влияния на интенсивность иследовательской реакции [Nyakas et al., 1997]. Воздействие на развитие нервной системы оказывает также синтетический аналог АКТГ4.9 - ORG 2766. Введение этого пептида в 1-й, 3-й и 5-й дни постнатального развития приводило в дальнейшем к улучшению обучения крыс в возрасте 3 мес в водном лабиринте Мориса, а также к снижению длительности иммобилизации в тесте принудительного плавания [Felszeghy et al., 1993; Horvath et al., 1999].

Известно, что неонатальные стрессогенные воздействия вызывают долговременные отставленные изменения адаптивного поведения животных, такие как снижение исследовательской активности, увеличение уровня тревожности и ухудшение обучения [Huot et al., 2002; Nyakas et al., 1981; Penke et al., 2001]. Введение МК в ранний неонатальный период вызывает противоположные изменения. Было высказано предположение о том, что неонатальное введение меланокортииов компенсирует влияние на поведение неонатального стресса, вызванного экспериментальными процедурами. Вероятно, пептиды этого класса в ранний постнатальный период воздействуют на развитие и организацию мозговых структур и функциональных связей, вовлеченных в регуляцию адаптивного поведения [Nyakas et al., 1981].

Показано изменение сексуального поведения крыс, как самцов, так и самок в результате перинатального введения АКТГ. Эти изменения коррелируют с изменениями в росте и метаболизме развивающихся серотонинергических и дофаминергических систем в гипоталамических ядрах, связанных с половым поведением. Показано, что самцы крыс, которые пренатально подвергались воздействия АКТГ1.24 (0,5 мг/кг веса тела самки, 2 раза в день, в течение 3-ей недели пренатального развития), демонстрируют снижение полового поведения, что сопровождается у них повышенным содержанием серотонина в медиальной преоптической области [Strand et al., 1989]. Однако постнатальное введение этого пептида (с 1 по 14 день постнатального развития, 0,5 мг/кг ежедневно), напротив, приводит к усилению полового поведения взрослых животных [Strand et al., 1993]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ответ развивающейся нервной системы на воздействие меланокортииов зависит от сроков введения этих пептидов.

Таким образом, в настоящее время накоплен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о нейротрофическом влиянии меланокортииов на развивающуюся и регенерирующую нервно-мышечную систему. Использование коротких фрагментов АКТГ и их аналогов, лишенных гормональной активности, позволяет отделить эндокринные свойства гормонов от их нейротрофических эффектов. Структурно-функциональные исследования показали, что, как и в случае поведенческих эффектов, ответственной за нейротрофическую активность является N-концевая область молекулы АКТГ - фрагмент АКТГ4.10. Иммунохимические исследования показали наличие эндогенного фрагмента АКТГ4.10 в мозге взрослых животных только в волокнах аркуатного ядра и средней септальной области. В случае исследования мозга животных в ранний неонатальный период показано присутствие эндогенного АКТГ4.10 как в аркуатном ядре и средней септальной области, так и в стриатуме, коре, гиппокампе, перивентрикулярной области. У взрослых животных иммунореактивность к АКТГ4.10 отмечена после повреждения нервной системы -например, при повреждении черной субстанции этот пептид обнаружен в стриатуме и других регионах мозга. Основываясь на иммунохимической локализации фрагмента АКТГ4-10 можно предположить, что роль этого пептида в функционировании взрослого организма в норме незначительна, однако в период развития нервной системы и во время регенерации нервной ткани эндогенный фрагмент АКТГ4-10 образуется в мозге и является нейропротекторным и нейротрофическим фактором [Antonawich et al., 1994]. Дальнейшее исследование нейротропных и нейропротекторных эффектов меланокортинов имеют большое значение как для понимания регуляции процессов развития и регенерации нервной ткани, так и для создания лекарственных препаратов на основе регуляторных пептидов.

Влияние меланокортинов на различные медиаторные системы мозга.

В настоящее время собраны обширные сведения по вопросу о влиянии меланокортинов на различные нейромедиаторные системы. Проведены исследования способности пептидов этого класса вязьюаться с ралзичными рецепторами. Было показано, что АКТГ1.39 в микромолярных концентрациях взаимодействует in vitro с дофаминовыми [Florijn et al, 1991], опиатными [Snell, Snell, 1982], холинергическими Mi [Florijn et al, 1991], серотонинергическими 5-HT1A 5-HT1B [Florijn et al, 1991, Pranzatelli, 1988] и глютаматергическими [Trifiletti, Pranzatelli, 1992] рецепторами. АКТГ не связывается с бензодиазепиновыми, ГАМКд, гистаминовыми Hi [Florijn et al., 1991], p-адренергическими [Duman et al., 1984] и мускариновыми M2 [Wiemer et al., 1988] рецепторами. Обычно большей активностью обладают АКТГ1.39 и фрагменты большей длины, а короткие фрагменты менее активны [Snell, Snell, 1982]. Однако это верно не во всех случаях - АКТГ7.16 активнее, чем АКТГ1.24 взаимодействует с дофаминовыми D2 рецепторами [Florijn et al, 1991] и опиатными рецепторами [Terenius, 1975]. Таким образом, не существует прямой зависимости между длиной аминокислотной цепи и способностью связываться с рецепторами.

Меланокортины способны изменять активность ферментов, участвующих в биосинтезе медиаторов. Так, было показано, что однократное введение АКТГ4.7 увеличивает активность ацетилхолинэстеразы головного мозга крыс [Алексидзе и др., 1983]. Меланокортины воздействуют на метаболизм многих нейромедиаторов. Показано влияние этих пептидов на синтез, освобождение, обратный захват и обмен таких медиаторов, как дофамин, норадреналин, ацетилхолин, серотонин и ГАМК. Однако механизм влияния МК на метаболизм медиаторов в большинстве случаев не выяснен. Так же, как в отношении связывания с различными рецепторами, эффекты МК не являются специфичными для одной медиаторной системы [Pranzatelli, 1994].

Важную роль в формировании пямятного следа играет система биогенных аминов мозга, поэтому было исследовано влияние МК на эту медиаторную систему. В настоящее время можно считать доказанным, что периферическое введение АКТГ может изменять активность катехоламинергической системы мозга [Dunn, Gispen, 1977]. Так, например, было продемонстрировано, что введение АКТГ4-10 увеличивает флуоресценцию дофамина в переднем мозге [Lichtensteiger et al., 1977]. При инъекции фрагментов АКТГ увеличивается скорость обмена норадреналина, изменяется его содержание в определенных участках мозга — снижается в вентромедиальных ядрах гипоталамуса, в аркуатном ядре и увеличивает в голубом пятне [Fekete et al., 1978]. Кроме того, было показано, что введение АКТГ после обучения животных в тесте выработки условного рефлекса избегания тока слабой интенсивности приводила к снижению содержания норадреналина в мозге на 20-40% (измерение проводились через 10 минут после сеанса обучения). Уровень мозгового норадреналина возвращался к контрольному уровню через 30 минут [Gold, McGaugh, 1978]. На основании этих данных было высказано предположение о том, что одним из действий АКТГ-подобных пептидов на ЦНС может быть увеличение освобождения норадреналина в ответ на внешние воздействия [Gold, Delanoy, 1981]. Известно, что при действии раздражающих факторов снижается содержание норадреналина в мозге, что объясняется высвобождением моноамина. Предполагается, что фрагменты АКТГ ускоряют освобождение норадреналина из депо или оказывают влияние на его метаболизм в мозге.

Существует множество данных о воздействии фрагментов АКТГ и их аналогов на дофаминергическую систему. Так, например, при в/ж введении АКТГ1.24 в течение часа наблюдается повышение концентрации дофамина (ДА) в области хвостатого ядра, что сопровождается чрезвычайным грумингом [Florijn et al., 1993]. Известно также, что АКТГ1.24 и АКТГыо оказывают модулирующее действие на дофаминовые рецепторы полосатого тела, при этом пептиды на 50% увеличивают захват [3Н]-ДА в синаптосомах [Громов, 1992]. За последнее время проводился ряд работ по исследованию влияния МК на связывание дофаминергических лигандов с Д2 рецепторами in vitro. Выяснилось, что АКТГ1.24 и АКТГ4.10 уменьшают связывание агониста Д2 рецепторов [3Н]Ы-пропилнорапоморфина ([3H]NPA) с мембраной стриатума. Анализ показал, что между АКТГ1.24 и [3H]NPA имеет место конкурентная борьба за связывание с Д2 рецептором. Также было продемонстрировано, что АКТГ1.24 препятствует связыванию антагониста Д2 рецепторов [3Н]-спиперона с мембраной стриатума, гипофиза, перегородки и черной субстанции. АКТГ 1.24 также способен вытеснять лиганды из комплекса с другими рецепторами, такими, как Д1 рецепторы, серотониновые 5-НТ1А и 5-НТ1В, мускариновые Ml и гистаминовые HI рецепторы, однако, для этого необходимы гораздо более высокие концентрации АКТГ1.24 [Florijn et al., 1991].

Множественность эффектов меланокортинов может свидетельствовать о модулирующем влиянии пептидов этого класса на нейротрансмиссию. Анатомические связи ПОМК-содержащих нейронов с различными участками мозга, связанными с разными нейромедиаторами, обеспечивает возможность МК функционировать в качестве нейромодуляторов [Pranzatelli, 1994].

Синтетические аналоги меланокортинов

Широкий спектр физиологической активности меланокортинов открывает возможности для использования препаратов этого класса в клинической практике при различных патологических состояниях. Однако препятствием для применения этих соединений в клинике является их низкая биодоступность и недостаточная продолжительность действия. Длительность нейротропных эффектов природного фрагмента АКТГ4ю составляет 30—60 мин [Ашмарин и др., 1997]. Многими исследователями предпринимались попытки повышения эффективности меланокортинов путем модификации структуры молекулы природных пептидов. В результате этих экспериментов были получены аналоги природных меланокортинов, лишенные гормональных эффектов и обладающие выраженной активностью.

Первые попытки создания лекарств на основе фрагментов АКТГ относятся к началу 70-х годов. Одним из возможных путей увеличения эффективности регуляторных пептидов является введение в их структуру D-аминокислот, что приводит к повышению устойчивости пептида к действию протеаз. Так, замена Met4 на сульфоксид метионина, Arg8 на D-Lys, а Тгр9 на Phe привела к появлению нового пептида ORG 2766 (Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-0H), который значительно более активен, чем АКТГ4.9 [Greven, De Wied, 1977]. Препарат ORG 2766 сохраняет поведенческую активность при пероральном введении. При этом он не проявляет меланоцитстимулирующей и стероидогенной активности, не приводит к мобилизации липидов из жирового депо и не обладает опиоидной активностью. Однако в дальнейшем было показано, что направленность действия этого пептида на сохранение навыка зависит от дозы - введение малых доз (0,5-1,0 нг/кг) улучшает, а больших доз (от 5 нг/кг) ухудшает сохранение навыка [Fekete, De Wied, 1982]. Исследования показали нейротрофическое влияние ORG 2766 после токсического воздействия 6-OHDA на нигростриатум. Этот пептид также оказывает положительный эффект на регенерацию периферических нервных волокон у крыс [De Koning, Gispen, 1987]. Действие Org 2766 также исследовалось на моделях аутоиммунных заболеваний, при которых наблюдается деградация миелиновых оболочек и ослабление нейронных функций. Было показано, что аналог восстанавливает координацию движений животных и препятствует демиелинизации аксонов [Duckers et al, 1993].

Ряд структурных изменений, в том числе замена С-концевой СООН-группы, позволил получить два новых аналога фрагментов АКТГ - НОЕ 427 (Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH(CH2)8-NH2) и ORG 31433 (Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-o-(CH2)8-СН3), которые оказались в 10-100 раз мощнее, чем ORG 2766. Однако, так же как и ORG 2766, в малых дозах эти пептиды облегчают выработку условных рефлексов, в больших - нарушают процесс выработки навыка. ORG 31433 существенно ускоряет функциональное восстановление после повреждения п. accumbens 6-OHDA [Wolterink et al., 1991]. HOE 427 более устойчив к действию протеаз, чем ORG 2766, обладает большей липофильностью и, вероятно, поэтому более эффективен по сравнению с другими синтетическими аналогами при исследовании памяти и способности к обучению. Этот пептид при подкожном введении ликвидирует у крыс амнезию, вызванную электрошоком, улучшает обучение и память в различных тестах [Hock et al, 1988]. Показано, что даже единичное введение НОЕ 427 людям пожилого возраста с нарушением когнитивных функций, а также пациентам с болезнью Альцгеймера оказывало небольшое, но достоверное положительное влияние на внимание и настроение больных.

Был синтезирован и исследован еще один аналог АКТГ». i о - BIM-22015 (D-Ala-Gln-Tyr-Phe-Arg-Trp-Gly-NH2). Изучение эффектов этого пептида на фоне повреждения фронтальной коры показало, что животные, получавшие BIM в течение 20 дней после операции, не отличались по уровню обучаемости от ложнооперированных в тесте водный лабиринт. Также исследовались долговременные эффекты BIM-22015, когда инъекции препарата прекращали за 30 дней до начала обучения. И в этом случае BIM оказывал нормализующее действие на оперированных животных [Attella et al., 1992].

Все перечисленные выше аналоги фрагментов АКТГ содержат D-аминокислоты. Однако введение в состав молекулы неприродных аминокислот ведет к появлению у пептида новых биологических свойств, которые в ряде случаев, нельзя считать полезными. В частности, накопление в стареющем организме неприродных D-аминокислот может, по мнению ряда авторов, быть причиной, возникновения злокачественных новообразований. Кроме того, как уже указывалось, терапевтический диапазон аналогов АКТГ, содержащих D-аминокислоты, очень узок - введение доз 0,51,0 нг/кг ускоряет обучение, тогда как увеличение дозы всего до 5,0 нг/кг приводит к ухудшению сохранения навыка. Возможно именно по этой причине эти аналоги в настоящее время используются только в клинических экспериментах и лекарственные препараты на их основе не разработаны [Ашмарин и др., 1997]. Таким образом, включение энантиомеров природных аминокислот хоть и усиливает действие пептидов, но одновременно приводит к целому ряду неблагоприятных побочных последствий. Следовательно, необходимо было разработать принципиально иной способ продления "жизни" фрагментов АКТГ в организме.

Клонирование МС рецепторов открыло пути идентификации их природных агонистов и антагонистов, а также синтетических соединений, проявляющих аффинность к МС рецепторам. Основной прогресс был сделан в развитии синтетических аналогов а-МСГ. Одним из синтетических пептидов, проявляющий агонистические свойства к МС рецепторам, является меланотан-1 - (Nle4, D-Phe7)a-MSH или NDP-MSH, который является наиболее мощным из линейных аналогов меланокортинов [Sawyer et al, 1980].Степень его аффинности к МС рецепторам можно представить следующей последовательностью: MC1R > MC3R > MC4R > MC5R.

Исследование структуры а-МСГ привели к разработке циклического пептида -Ac-Nle4-cyclo(Asp5-His6-D-Phe7-Arg8-Trp9-Lys10)-NH2 или меланотана-П (MT-II). MT-II активирует МС рецепторы, он является сильным, но не селективным агонистом рецепторов 3,4 и 5 типа [Al-Obeidi et al, 1989]. Показано, что с 6 по 9 фрагмент а-МСГ, His6-Phe7-Arg8-Trp9, заключенный в лактамовое кольцо меланотана-П, является активным центром при взаимодействии с меланокортиновыми рецепторами; N-конец МТ-П (Ac-Nle4), не включенный в лактамовое кольцо является структурной особенностью определяющей силу и селективность MT-II к человеческим меланокортиновым рецепторам 3-5 типа. Данная последовательность не оказывает влияния на связывание, аффинность и активацию человеческих MC4R, но, похоже, она необходима для полной активации MC5R [Bednarek et al, 1999].

Антагонистами меланокортиновых рецепторов являются соединения SHU9119 и HS014. Модификация молекулы MT-II привела к разработке SHU9119, который является селективным антагонистом MC3R и MC4R [Hurby et al, 1995]. SHU9119 (Ас-cyclo-(Nle4-Asp5-D-Nal(2)7-Lys10)a-MSH4-io-NH2) представляет собой циклический лактамовый пептид. Позже был синтезирован еще один синтетический антагонист MCR - HS014 [Wikberg et al, 1999]. Степень селективности данного лиганда К МС рецепторам 4 типа в 20, 30 и 200 раз выше, чем к МСЗ, МС1 и МС5 рецепторам соответственно. SHU9119 и HS014 широко используются в исследованиях механизмов, лежащих в основе различных эффектов МК пептидов и их рецепторов. В 1998 году был синтезирован и исследован еще один сильный антагонист MCR - HS024, который также как SHU9119 и HS014, является селективным антагонистом МСЗ и МС4 рецепторов, однако в отличие от этих пептидов он также взаимодействует с рецепторами 1 и 5 типа [Kask et al, 1998].

В последние годы были разработаны и синтезированы новые циклические МК аналоги: HS963, HS964, HS005 и HS006, которые можно описать общей формулой [Cys4-X7-Cysu]a-MSH4.n, отличающейся только в 7 позиции [Schioth et al, 1998, Kask et al, 1998]. В дальнейшем на основе HS964 были разработаны аналоги HS007, HS009 и HS011, в которых были сделаны замены в 5, 6 и 10 положениях. Исследование аффинности этих аналогов к MCR позволило авторам сделать заключение о важной роли последовательности АКТГ6.9 (His6-Phe7-Arg8-Trp9) для связывания с рецепторами.

Таким образом, за последние десятиления разработано, синтезировано и исследовано большое количество синтетических агонистов и антагонистов меланокортиновых рецепторов. Применения этих соединений в экспериментах способствовало выяснению функций МС рецепторов различных типов. Однако

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА 41 большинство из этих соединений не может быть использовано в клинической практике, что связано с их низкой биодоступностью при периферическом введении.

Семакс — аналог АКТГ4.10 пролонгированного действия

Исследования, проведенные в Институте молекулярной генетики РАН и на Биологическом факультете МГУ показали, что пролонгировать эффекты пептида и увеличить его устойчивость к действию пептидаз можно путем включения в структуру молекулы участков, обогащенных пролиновыми остатками. Известно, что в органах и тканях большинства теплокровных животных широко представлены экзо- и эндопептидазы с низкой специфичностью. Они не расщепляют связи -АА-Рго-, где АА — любая аминокислота, а также другие последовательности, обогащенные пролиновыми остатками. Специфические пролингидроксилазы сосредоточены главным образом в отдельных органах и тканях в небольшом количестве. На основании этого было высказано предположение, что присоединение к С-концу фрагмента АКТГ4. 7 обогащенной пролином цепочки приведет как к усилению эффекта пептида, так и к его пролонгированию [Ашмарин и др., 1997]. Изучение нейротропной активности ряда аналогов АКТГ4.10 с различными модификациями С-концевой области показало, что наибольшей активностью обладает аналог, в котором три С-концевые аминокислоты заменены на последовательность Pro-Gly-Pro [Пономарева-Степная М.А. и др., 1986; Ashmarin et al, 1995]. Этот пептид (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) сохраняет свои эффекты в широком интервале доз от 0,015 до 0,15 мг/кг, при этом длительность его действия составляет порядка 20-24 часов. Аминокислотную последовательность пептида избрали для разработки лекарственного препарата "Семакс" [Ашмарин и др., 1997].

Исследование влияния семакса на обучение животных показало, что внутрибрюшинное введение этого пептида ускоряет выработку пищевого навыка в Т-образном лабиринте. Положительное действие семакса на обучение животных показано также в тесте выработки УРПИ. Внутрибрюшинное введение пептида в дозе 0,015 мг/кг за 1 час до начала эксперимента достоверно увеличивало латентный период захода в темный отсек во второй день обучения. Аналогичный эффект наблюдался при введении пептида за 6 часов до начала опыта [Ashmarin et al, 1995]. Было показано, что семакс стимулирует мнестические процессы не только у интактных животных, но и в условиях патологии: введение пептида значительно ослабляло амнезию, вызванную электрическим шоком [Ашмарин и др., 1997].Показано также, что этот аналог не изменяет уровень ориентировочной реакции и эмоциональное состояние животных в тесте «открытое поле». Кроме того, не было отмечено влияние семакса в дозе 0,05 мг/кг на частоту сердечных сокращений, частоту дыхания и температуру тела фиксированных животных [Пономарева-Степная и др., 1984].

Исследование устойчивости семакса к действию протеаз сыворотки крови показало, что первым шагом деградации молекулы является отщепление N-концевого метионина. При этом образуется достаточно стабильный интермедиат Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro [Potaman et al, 1991 A, Potaman et al, 1993].

Исследование ноотропных эффектов семакса было проведено и на людях-добровольцах. Опыты показали, что интраназальное введение пептида в дозе 0,016 мг/кг достоверно повышало внимание и краткосрочную память испытуемых при тестировании как в начале, так и в конце рабочего дня. Данные ЭЭГ показали, что интраназальное введение пептида в количестве 0,25-1,0 мг вызывает изменение энцефалографических параметров аналогичное изменениям, возникающим при введении типичных ноотропных препаратов [Kaplan et al, 1996].

Для сравнения эффектов семакса с эффектами других ноотропов были проведены исследования его антигипоксического действия. Опыты, проведенные на крысах, показали, что этот пептид в 2,5 раза увеличивает время жизни животных на экстримальной «высоте» (12000 м), а также положительно влияет на адаптацию организма к гипоксии. В исследованиях на людях-добровольцах обнаружена способность препарата купировать постгипервентиляционные ЭЭГ-эффекты, вызванные компенсаторным уменьшением мозгового кровотока [Каплан и др., 1992].

Проводилось исследование влияния семакса на последствия острой пшобарической гипоксии у крысят различного возраста. Было показано, что предварительное однократное введение семакса в дозе 0,05 мг/кг приводит к повышению индивидуальной устойчивости животных к гипоксии, положительно влияет на параметры сердечной деятельности во время гипоксии и ослабляет отставленные изменения поведения животных, вызванные кислородной недостаточностью [Балан и др., 1999; Маслова и др., 1999].

Семакс способен оказывать нейропротекторное действие. Большие дозы семакса (0,15-0,3 мг/кг) увеличивают выживаемость животных и уменьшают выраженность неврологического дефекта при экспериментальном ишемическом инсульте [Ашмарин и др., 1997]. Кроме того, опыты, проведенные на эмбриональных культурах клеток мозга крыс, показали, что семакс в дозе 0,1-10 мкМ увеличивает количество выживших нейронов в 1,5-3 раза по сравнению с контролем и при этом не влияет на пролиферацию глиальных клеток. Авторы предполагают, что семакс осуществляет свое нейротрофическое действие через регуляцию уровня экспрессии нейротрофических факторов [Гривенников и др., 1999].

Нейротрофические свойства семакса подтвердились во время исследования действия препарата при заболеваниях зрительного нерва различной этиологии. Введение семакса интраназально или в виде эндоназального электрофореза, особенно в острой стадии заболевания, эффективно защищало нервную ткань от последствий повреждений. При этом достоверно увеличивался прирост остроты зрения, расширялось суммарное поле зрения, повышалась электрическая чувствительности и проводимость зрительного нерва, улучшалось цветовое зрение [Полунин и др., 2000].

Обнаружено положительное действие семакса в остром периоде полушарного ишемического инсульта. Семакс вводился интраназально в суточной дозе 12,18 и 24 мг в течение 5 дней. Первое введение осуществлялось через 3-4 часа после поступления больного в клинику, т.е. в первые часы заболевания. Совместно с введением семакса все больные подвергались комплексной базисной терапии. Клинические испытания показали, что интраназальное введение семакса совместно с интенсивной терапией острого полушарного ишемического инсульта оказывает благоприятное действие на выраженность и темпы восстановительных процессов, способствуя ускорению регресса общемозговых и очаговых нарушений [Гусев и др., 1997].

Для определения возможности использования семакса в коррекции постреанимационных неврологических нарушений были проведены исследования действия препарата на модели клинической смерти. Остановка общего кровообращения осуществлялась пережатием сосудистого пучка сердца крыс. Спустя 10 минут животных оживляли с помощью закрытого массажа сердца и искусственной вентиляции легких. Далее у крыс оценивали степень запоминания экспериментальной обстановки при повторном тестировании в "открытом поле". Ежедневное интраназальное введение семакса в дозе 0,05 мг/кг в течении двух недель нормализовало параметры ориентировочно-исследовательской реакции крыс, приближая их значения к интактному контролю [Волков и др., 1992; Геренко и др., 1991].

Данные о положительном действии семакса на восстановление мнестических функций мозга в постреанимационный период были получены и при клинических исследованиях. Изучалось влияние препарата на восстановление функций ЦНС у больных с тяжелыми формами постреанимационной патологии (интеллектуальными и мнестическими расстройствами). У 89% больных, получавших семакс, отмечалось значительное улучшение состояния. Нейропсихологическое исследование выявило улучшение внимания, запоминания, познавательных способностей, подвижности мышц, слухоречевой памяти. Данные энцефалографического обследования также подтвердили эффективность препарата - отмечалось улучшение показателей функционального состояния мозга [Алексеева и др., 1999].

В литературе встречаются данные о том, что семакс возможно обладает антистрессорным действием. Известно, что при эмоциональном стрессе наблюдается усиление экспресси гена c-Fos в разных структурах мозга. Наиболее выраженная экспрессия этого гена выявлена в мозге предрасположенных к эмоциональному стрессу животных. Предварительное внутрибрюшинное введение семакса вызывает снижение индуцированной стрессом экспрессии гена c-Fos в паравентрикулярном гипоталамусе и медиальных отделах перегородки у предрасположенных к эмоциональному стрессу крыс [Умрюхин и др., 2001].

Механизм действия семакса до настоящего времени не выяснен. Важнейшим аспектом для понимания центральных эффектов пептида является оценка его способности проникать через ГЭБ. Была проведена серия экспериментов с использованием меченного тритием семакса. Исследования показали, что после внутривенного введения в головной мозг экспериментальных животных проникает 0,01% введенного пептида [Potaman et al, 1991 В]. Эти данные сравнимы с величинами, описанными для другого аналога АКТГ4.10- Org 2766 (0,004%) [Ашмарин и др., 1997].

Далее были предприняты попытки выявить рецепторное связывание семакса с препаратами плазматических мембран нейронов и глиальных клеток мозга крыс и целыми нейронами. До настоящего времени обнаружить специфические рецепторы пептида не удалось. Однако есть данные, что семакс способен связываться с мембранами нервных клеток базальных ядер переднего мозга крыс, причем это связывание специфично и обратимо. Возможно, что рецепторы, с которыми связывается семакс, представлены в очень ограниченных количествах и немногих структурах мозга [Гривенников и др., 1999].

Существует предположение, что эффекты семакса связаны с изменением активности ацетилхолинэргической системы. Введение пептида в дозе 0,150 мг/кг вызывает увеличение активности ацетилхолинэстеразы в гиппокампе и белом веществе головного мозга более чем в 2 раза. Действие препарата наблюдается в течение 2-3 часов после инъекции. В других отделах мозга активация не наблюдалась [Алексидзе и др., 1983].

Показано также влияние семакса на обмен моноаминов в мозге. При однократном внутрибрюшинном введении в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг семакс увеличивает содержание дофамина, серотонина и его метаболита 5-оксииндолуксусной кислоты. Эффект наблюдался в течение 24 часов после введения пептида. При хроническом ежедневном введении семакса в дозе 0,6 мг/кг (1 раз в сутки) в течение 7 дней наблюдалась тенденция к снижению уровня дофамина и достоверное уменьшение содержания серотонина в гипоталамусе [Еремин и др., 2002].

В настоящее время препарат семакс широко используется в клинике для лечения различных заболеваний ЦНС. Однако создатели препарата считают, что лечебный потенциал семакса не исчерпан, и в будущем могут быть выявлены новые показания к его применению [Ашмарин и др., 1997]. В последние годы в печати появились работы об исследовании действия семакса на патологические состояния, не связанные с повреждением нервной системы. Например, опыты, проведенные на лабораторных животных показали, что семакс способен положительно влиять на течение острого панкреатита у крыс. Однократное внутрибрюшинное введение препарата в дозе 0,1 мг/кг уменьшало летальность животных, снижало гиперферментацию, активацию перекисного окисления липидов, сосудистую проницаемость, улучшало микроциркуляцию и ускоряло заживление зон деструкции в поджелудочной железе [Иванова, Яснецов, 2000]. Изучение влияния семакса на систему гемостаза показали, что семакс способен взаимодействовать с высокомолекулярным гепарином с образованием комплексного соединения, обладающего антикоагулянтными и фибринолитическими свойствами как в условиях in vitro, так и in vivo при внутривенном введении. Авторы предполагают, что семакс, особенно в комплексе с гепарином, может быть перспективным антитромботическим средством [Ляпина и др., 2000].

Есть данные о возможном противовоспалительном действии семакса. Было показано, что семакс обладает способностью изменять активность нейтрофилов человека, влияя на обмен ионов кальция [Асташкин и др., 2000].

На основании вышесказанного можно сделать вывод, что семакс обладает целым комплексом положительных эффектов на ЦНС. Препарат стимулирует функции переднего мозга: усиливает избирательное внимание в момент восприятия информации, улучшает консолидацию памяти, повышает способность к обучению. При этом, в отличие от большинства ноотропных препаратов непептидной природы, семакс не вызывает истощения соответствующих функций. Препарат увеличивает адаптационные возможности мозга, повышая его устойчивость к стрессорным повреждениям, гипобарической и сосудистой гипоксии, способствует уменьшению тяжести последствий экспериментального ишемического инсульта у животных. Клинические испытания показали высокую эффективность семакса при лечении интеллектуально-мнестических расстройств и астенических состояний различного генеза, а также при профилактике и лечении постнаркозных мнестических нарушений [Ашмарин и др., 1997; Ashmarin et al, 1995].

Однако, не смотря на то, что семакс уже более десяти лет используется в клинической практике, до настоящего времени не достаточно исследованы его нейротрофические и нейропротекторные свойства, не изучено влияние этого пептида на развивающийся мозг.

Целью представленной работы являлось изучение последствий хронического неонатального введения семакса, а также исследование эффектов данного пептида на фоне нарушений дофаминергической системы мозга различной природы.

Перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Исследование отставленных поведенческих эффектов хронического неонатального введения семакса детенышам белых крыс.

2. Изучение зависимости отставленных эффектов семакса от сроков и способов его неонатального введения.

3. Исследование протекторного действия семакса на фоне МФТП-вызванных нарушений дофаминергической системы мозга крыс.

4. Изучение эффектов семакса на фоне блокады рецепторов дофамина галоперидолом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на нелинейных белых крысах. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде и соблюдением 12-ти часового светового режима дня (искусственное освещение с 9 до 21 часа).

В первой части работы опыты проводились на детенышах белых крыс обоего пола. Крысята каждого выводка содержались в отдельной клетке вместе с матерью до достижения ими месячного возраста, после чего крысят делили на самцов и самок и отсаживали от матери. Каждый выводок делили на опытных и контрольных крыс. В ходе экспериментов регистрировали изменение массы тела крысят, а также время открытия глаз.

В опытах использовали гептапептид Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), синтезированный в Секторе регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН. Препарат вводили в дозе 0,05 мг/кг, в водном растворе; при внутрибрюшинном введении в объеме 2 мл/кг, при интраназальном введении - 1 мкл/10 г массы тела. Контрольным животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды в соответствующие сроки.

Всего проводилось пять серий опытов с различными сроками и способами введения препарата:

1 - ежедневное в/б введение в течение первой недели постнатального развития;

2 - ежедневное в/б введение в течение второй недели постнатального развития;

3 - ежедневное в/б введение в течение второй-третьей недель жизни;

4 - ежедневное и/н введение в течение второй-третьей недель жизни;

5 - однократное в/б введение препарата.

Во всех сериях с хроническим введением препарата эксперименты проводились в соответствии со следующим временным графиком:

• тест "открытое поле" I (бесстрессорная модификация) .17 день;

• оценка физической выносливости .18-21 дни;

• тест "приподнятый крестообразный лабиринт" I .30 день;

• тест "открытое поле" II (бесстрессорная модификация) .32 день;

• выработка условной реакции пассивного избегания.36 и 39 дни;

• выработка условного пищедобывательного рефлекса на место в сложном лабиринте .41-45 день;

• тест "открытое поле" III (бесстрессорная модификация) .50 день;

• тест "приподнятый крестообразный лабиринт" II .52 день;

• тест "открытое поле" (стрессогенная модификация)

56 день, .62 день; .63 день.

• тест "горячая пластина' к

• тест вертикальная сетка и. н

Кроме того, в отдельной серии опытов изучалось отставленное воздействие хронического в/б введения семакса в течение 2-3 недель жизни крыс на депрессивные составляющие поведения животных в тесте "принудительное плавание". Крыс подвергали процедуре "принудительного плавания" два раза (на 30 и 50 дни жизни) или однократно (на 50 день жизни).

При изучении влияния острого введения семакса на поведение и способность к обучению детенышей белых крыс оценивали исследовательскую активность животных в бесстрессорной модификации теста "открытое поле" (ОП) в возрасте 17 и 30 дней и уровень тревожности в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" (ПКЛ) в возрасте 31 день и стрессогенной модификации теста ОП возрасте 56 дней. Воздействие острого введения пептида на способность крысят к обучению оценивали в тех же тестах и в те же сроки, что и в при изучении эффектов хронического введения. Во всех экспериментах этой серии пептид вводили однократно, в/б за 15 мин до тестирования. При изучении влияния семакса на выработку пищедобывательного рефлекса в сложном лабиринте пептид вводили ежедневно за 15 мин до сеанса обучения. Контрольные животные получали инъекцию дистиллированной воды в том же объеме и в те же сроки.

При обработке результатов значения параметров поведения для каждого выводка нормировали к собственному контролю, что было связано с вариабельностью показателей поведения крыс различных выводков. Отличия между контролями разных выводков не достигали уровня значимости, однако приводили к увеличению дисперсии показателей. Исходные данные представлены в Приложении (табл. 8-21).

Во втором и третьем разделах работы опыты проводились на взрослых самцах нелинейных белых крыс массой 180-230 г.

В опытах были использованы следующие препараты:

• Гептапептид Семакс, препарат вводили в водном растворе, и/и в объеме 0,1 мл/кг.

• Нейротоксин МФТП (1 -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина гидрохлорид, C12H15N-HCI), синтезированный в Институте Фармакологии РАМН. Препарат вводили в/б в дозе 25 мг/кг, в физиологическом растворе в объеме 1 мл/кг.

• Галоперидол ("Гедеон Рихтер", Венгрия). Препарат вводился в/б в дозе 0,1 или 0,2 мг/кг, в водном растворе в объеме 1 мл/кг.

Контрольные животные получали инъекцию растворителя в эквивалентном объеме в соответствующие сроки.

Методы оценки двигательной активности, исследовательского поведения, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения животных

Тест "Открытое поле"

Открытое поле" представляет собой арену диаметром 80 см с деревянным полом, расчерченным восемью диаметрами и двумя концентрическими окружностями, находящимися на равном расстоянии друг от друга. Арена окружена стенкой высотой 40 см. Над ареной на высоте 80 см помещена красная лампа мощностью 15 Вт, яркая лампа мощностью 200 Вт и электрический звонок. При тестировании животное помещали в центр арены и в течение 2-х минут визуально оценивали следующие показатели:

- латентный период выхода из центра поля;

- горизонтальную двигательную активность (пробег) - число пройденных секторов;

- вертикальную двигательную активность (стойки) - число подъемов на задние лапы;

- количество выходов в центр поля - число пересечений внутренней концентрической окружности;

- число умываний (груминг) - число касаний морды передними лапами.

Опыты проводились в двух модификациях - бесстрессорной (в тишине, при свете красной лампы) и стрессогенной (при ярком свете и звуке электрического звонка).

Тест "норковая камера".

Экспериментальная установка представляет собой квадратную арену с круглыми отверстиями в полу, расчерченном на квадраты. В ходе экспериментов были использованы 2 различные экспериментальные камеры - НК1 и НК2. НК1 - деревянная камера размером 40x40x30 см с 13 отверстиями в полу, который расчерчен на 9 квадратов. НК2 - металлическая камера размером 47x47x27 см с 16 отверстиями, пол расчерчен на 16 квадратов. Использование двух различных установок позволяло при повторном тестировании изучать реакцию животного на новые экспериментальные условия. В ходе опыта животное помещали в угол камеры и в течение 3-х минут визуально регистрировали следующие показатели:

- латентный период выхода из стартового квадрата;

- горизонтальная двигательная активность (пробег) число пересеченных квадратов;

- число обследованных отверстий (норки);

- вертикальная двигательная активность (стойки) число подъемов на задние лапы;

- количество умываний (груминг)- число касаний морды передними лапами.

Опыты проводились в тишине при свете красной лампы.

Тест "Приподнятый крестообразный лабиринт"

Экспериментальная камера состоит из четырех расходящихся из центра рукавов (длина 35 см, высота стенок 20 см). Два противоположных рукава затемнены и закрыты с торцов стенками; два других - освещены и открыты. Лабиринт устанавливали на высоте 50 сантиметров от пола. Крысу помещали в центр лабиринта и в течение 3 минут регистрировали следующие показатели:

- латентный период захода в закрытый рукав;

- общее время нахождения на свету;

- количество выходов на открытые рукава;

- количество свешиваний с открытых рукавов лабиринта;

- вертикальная двигательная активность (стойки)- число подъемов на задние лапы;

- количество умываний (груминг) - число касаний морды передними лапами.

Метод "принудительного плавания"

Метод "принудительного плавания" применяется для выявления антидепрессантных свойств фармакологических препаратов. Тестирование проводилось в цилиндрической емкости объемом 25 л на 2/3 заполненной водой (t=27-28°С). Животное помещалось в воду и в течение 10 минут визуально регистрировались следующие параметры:

- суммарная длительность активного плавания - крыса совершает активные плавательные движения, перемещаясь внутри емкости;

-суммарная длительность иммобилизации - животное полностью неподвижно, над поверхностью воды выступает только нос;

- суммарная длительность клайминга - крыса совершает активные движения передними лапами, пытаясь выбраться из воды (карабкается по стенке сосуда);

- длительность первого периода активного плавания;

- латентный период первой иммобилизации;

- число периодов активного плавания;

- число периодов иммобилизации, -число периодов клайминга.

Методы оценки способности животных к обучению.

Выработка условного рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя (УРПШ Обучение проводилось в экспериментальной камере (размерЗ0x22x35 см), разделенной перегородкой с отверстием на два отсека: один - ярко освещенный, другой -затемненный. Камера устанавливалась на решетчатый металлический пол, подсоединенный к источнику тока. В первый день эксперимента животное помещали в освещенный отсек камеры и регистрировали латентный период (ЛП 1) перехода в темный отсек, в котором крысу подвергали неизбегаемому удару электрическим током длительностью 3 сек. Напряжение подбиралось индивидуально для каждого животного по вокализации (в диапазоне 60-90 В), частота составляла 50 Гц, длительность - 10 мсек. После отключения тока крысу оставляли в затемненном отсеке на 20 секунд. Через 72 часа проводили проверку выработки навыка пассивного избегания болевого раздражителя. Животное на 3 минуты помещали в светлый отсек камеры и регистрировали латентный период перехода в темный отсек (ЛП 2), суммарное время, проведенное в светлом отсеке, число стоек и умываний в светлом отсеке.

Выработка условного рефлекса активного избегания болевого раздражителя ГУ РАЮ.

Обучение проводили в экспериментальной камере (размер 30x22x35 см) с решетчатым полом, в углу которой на высоте 25 см находилась полка. На пол камеры подавали электрический ток со стимулятора ЭСЛ-2. Условным раздражителем служил звук звонка; безусловным - удар тока (напряжение подбиралось индивидуально для каждого животного в диапазоне 70-100 В, частота составляла 200 Гц, длительность - 1 мсек). Продолжительность звучания звонка составляла 3 сек. Через 2 сек после его выключения подавался безусловный раздражитель. Условной реакцией являлся прыжок на полку. Если избавление не наступало в течение 20 сек, то напряжение отключали. Длина временных интервалов между сочетаниями колебалась случайным образом в пределах 7-30 секунд. В работе использовали двухдневную схему выработки УРАИ. Каждое животное ежедневно получало 15 сочетаний условного и безусловного раздражителей. Препараты вводили только перед первым сеансом обучения. В качестве показателей выработки УРАИ использовали:

- количество выполненных реакций (КВР) - число избеганий болевого раздражителя, т.е. число прыжков на полку до включения тока, в ответ на условный сигнал;

- число коротколатентных избавлений (КЛИ) - число прыжков на полку через 1-2 сек после включения тока;

- число межсигнальных реакций (МСР) - число прыжков на полку до включения условного раздражителя;

- количество невыполненных реакций (КНР) - число случаев, когда животное не запрыгивало на полку в течение 20 секунд действия болевого раздражителя.

Выработка условного пищедобывательного рефлекса на место (сложный лабиринт).

Сложный лабиринт представляет собой квадратную камеру, разделенную пятью прозрачными перегородками на 6 коридоров. В каждой перегородке имелось прямоугольное отверстие. Перед экспериментом животных подвергали 24-часовой пищевой депривации. За сутки до обучения крыс помещали в лабиринт на 30 мин с целью адаптации и угашения ориентировочно-исследовательской реакции. В последующие 4 дня животное помещали в лабиринт по 5 раз подряд ежедневно, причем длительность каждой посадки не превышала 3-х минут. В ходе обучения визуально регистрировали следующие показатели:

- количество выполненных реакций - число случаев, когда животное находит подкрепление в течение 3-х минут пребывания в лабиринте;

- количество ошибок - число любых отклонений от правильной траектории движения;

- время выполнения реакции.

В дни опыта животных кормили один раз в сутки непосредственно после эксперимента.

Оценка болевой чувствительности животных

Тест "горячая пластина"

Величину болевого порога измеряли с помощью анальгезиметра фирмы Ugo Basile (Italy). Животное помещали на металлическую поверхность, разогретую до 53° С. Регистрировали латентный период поведенческой реакции на болевой раздражитель -время от момента посадки до первого облизывания задней лапы. Проводили 3 измерения болевой чувствительности, при обработке данных эти значения усредняли.

Методы оценки уровня физической выносливости.

Физическая выносливость животных в возрасте 18-20 дней оценивалась в тестах "вертикальный стержень", "горизонтальный стержень" и "качели". В тестах животное помещали на деревянный стержень с шероховатой поверхностью таким образом, чтобы оно было лишено иной опоры, и регистрировали время удержания.

Вертикальный стержень (диаметр 9 мм) укреплялся на высоте 28 см. Горизонтальный стержень (диаметр 5 мм) укреплялся на высоте 19 см. Установка "качели" представляет собой подвижный деревянный стержень диаметром 7 мм, расположенный горизонтально на высоте 22 см и имеющий возможность свободно качаться в нескольких направлениях.

Тест "вертикальная сетка"

Статическую физическую выносливость животных в возрасте двух месяцев оценивали в тесте "вертикальная сетка". Экспериментальная установка представляет собой проволочную сетку с ячейками 1.5x1.5 мм, площадью 30x60 см. Сверху и с боков сетка ограничена деревянными стенками. Установку располагали на краю стола. При тестировании животное помещают на сетку и регистрируют время, прошедшее с момента посадки на сетку до момента падения с нее. Каждую крысу тестируют три раза, при обработке данных полученные результаты усредняли.

Статистическая обработка данных

При обработке результатов использовались стандартные методы статистического анализа. Вычислялись средние, стандартные отклонения и стандартные ошибки среднего массивов данных. При сравнении характеристик массивов применяли как параметрические (ANOVA), так и непараметрические (Фишера, х2) критерии. Названные операции и оценка форм распределений массивов осуществлялись с помощью пакета статистических программ STATISTIKA. На рисунках представлены данные в виде среднего ± стандартная ошибка среднего. Различия между группами считали достоверными при вероятности ошибки р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Как уже указывалось в обзоре литературы, введение меланокортииов животным в ранний постнатальный период, когда структуры мозга и нейрональные проекции еще развиваются, приводит к ускорению созревания нервно-мышечной системы и влияет на развитие центральной нервной системы. Хроническое введение меланокортииов в течение первых 3 недель жизни крыс приводит к долговременным, отставленным изменениям поведения животных [Strand et al., 1989]. Изучение физиологической активности аналога АКТГ4.10 семакса показало, что этот пептид улучшает память и внимание, обладает антигипоксическим и нейропротекторным эффектами. Таким образом, семакс сохраняет нейротропную активность природных фрагментов АКТГ, не оказывает гормонального действия, и при этом его эффекты проявляются в течение длительного времени [Ашмарин и др., 1997]. Однако практически все исследования эффектов семакса проводились в экспериментах на взрослых животных, его влияние на развивающийся мозг не изучено. Поэтому первая часть работы была посвящена изучению возможного нейротрофического действия семакса на нервную систему ювенильных крыс.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Себенцова, Елена Андреевна

выводы

1. Показано, что хроническое введение семакса в дозе 0,05 мг/кг в течение первых трех недель постнатального развития крыс приводит к изменению исследовательского поведения, снижению уровня тревожности и степени депрессивности животных, а также положительно влияет на их способность к обучению. Отмеченные изменения поведения регистрируются в течение 1,5-2 месяцев после последней инъекции пептида, т. е. носят отставленный долговременный характер.

2. Неонатальное введение семакса оказывает модулирующее влияние на развивающийся мозг и может приводить к компенсации последствий неонатального стресса.

3. Обнаружено, что хроническое введение семакса в дозе 0,2 мг/кг нормализует параметры двигательной активности и тревожности животных с МФТП-вызванными нарушениями дофаминергической системы мозга.

4. Однократное введение семакса ослабляет нарушения процесса обучения и практически не влияет на снижение двигательной активности крыс, вызванные блокадой рецепторов дофамина галоперидолом.

5. Семакс может оказывать нейротрофическое и нейропротекторное влияние в процессе развития и при фармакологическом повреждении нервной системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Известно, что введение природных и синтетических меланокортинов животным в ранний постнатальный период, когда структуры мозга и нейрональные проекции еще развиваются, приводит к ускорению созревания нервно-мышечной системы и влияет на развитие центральной нервной системы [Strand et al., 1989].

Исследование поведения животных, получавших семакс в различные периоды неонатального развития, показало, что введение пептида, как и природного фрагмента АКТГ4—Ю, в течение первой недели вызывает снижение, а в течение второй или второй-третьей недель жизни - увеличение исследовательской активности животных [Шилова и др., 1996; Rose et al., 1988]. Анализ полученных результатов показал, что направленность и выраженность влияния неонатального введения семакса на параметры исследовательского поведения животных зависят от величины регистрируемых параметров в контрольных группах крыс. Следовательно, влияние семакса на исследовательское поведение животных носит модулирующий, нормализующий характер. При этом можно отметить, что у крыс, получавших пептид 7 дней, изменение поведения к 50-му дню становятся менее выраженными, а у животных, которым семакс вводили 14 дней, — усиливаются. Следовательно, выраженность отставленных изменений исследовательского поведения крыс зависит от длительности его хронического неонатального введения. Направленность изменений тревожности у животных, получавших семакс в неонатальном периоде, при всех использованных сроках введения оказалась одинаковой - животные всех опытных групп отличались более низким уровнем тревожности по отношению к соответствующему контролю. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что неонатальное введение семакса детенышам белых крыс приводит в дальнейшем к смещению баланса мотиваций, определяющих поведение животных, в сторону большей выраженности ориентировочно-исследовательской составляющей и меньшей - пассивно-оборонительной. Исследование влияния неонатального введения семакса на депрессивные составляющие поведения животных в тесте «принудительное плавание» показало, что инъекции пептида в течение второй-третьей недель жизни приводят к снижению этих показателей, т. е. оказывают антидепрессантное воздействие. Оценка отставленного воздействия неонатального введения семакса на способность крыс к обучению показала, что при всех исследованных сроках инъекций наблюдается улучшение выработки реакции пассивного избегания болевого раздражителя, кроме того, введение пептида как в первую, так и во вторую недели приводит к ускорению выработки пищедобывательного навыка. Отсутствие влияния внутрибрюшинного введения семакса в течение второй-третьей недель развития на обучение в сложном лабиринте, вероятно, связано с высокими показателями обучения в контрольной группе крыс. Таким образом, внутрибрюшинное неонатальное введение семакса во все исследованные сроки оказывает положительное влияние на обучение животных. Характер и направленность отставленных изменений поведения крыс, которым интраназально вводили семакс в течение второй-третьей недель жизни, совпадает с изменениями поведения, наблюдавшимися при внутрибрюшинном введении пептида в те же сроки. Следовательно, эффекты хронического неонатального введения семакса не зависят от способа его введения. При остром введении семакса крысам соответствующего возраста наблюдается ускорение обучения животных и повышение исследовательской активности, влияния на уровень тревожности при однократном введении пептид не оказывал. Таким образом, эффекты острого введения семакса крысятам в значительной степени совпадают с эффектами, которые наблюдаются при остром введении пептида взрослым животным [Ashmarin et al., 1995], и отличаются от эффектов хронического неонатального введения.

На основании полученных данных можно заключить, что хроническое введение семакса в течение первых трех недель постнатального развития приводит к изменению исследовательской активности, снижению уровня тревожности и степени депрессивности, а также улучшению способности крыс к обучению. Изменения поведения в различных тестах регистрируются через 2—8 недель после последней инъекции пептида, т. е. носят отставленный долговременный характер. Следовательно, неонатальное введение семакса, как и других природных и синтетических меланокортинов, оказывает нейротрофическое модулирующее воздействие на развитие центральной нервной системы животных. Отставленные изменения поведения животных, получавших семакс в период раннего постнатального развития, можно оценить как положительные.

У незрелорождающихся животных, таких как мыши и крысы, развивающийся мозг особенно чувствителен к внешним, в том числе фармакологическим, воздействиям в течение трех первых недель постнатального развития, поскольку в этот период происходит интенсивный рост мозга, активная дифференцировка нейронов и созревание функциональных связей между структурами [FeiTer et al., 1990]. Известно, что вплоть до периода полового созревания в нервной системе крыс происходят значительные изменения, такие как развитие и усложнение синаптических контактов, изменение концентрации рецепторов и активности ферментативных систем, связанных с метаболизмом медиаторов [Угрюмов, 1999]. Показано, что АКТГ/МСГ-подобные пептиды в ранний постнатальный период воздействуют на развитие и организацию мозговых структур и функциональных связей, вовлеченных в регуляцию адаптивного поведения [Nyakas, 1981]. Характер изменений поведения животных, получавших инъекции семакса, - изменение исследовательской активности, снижение уровня тревожности и степени депрессивности, улучшение обучения — также свидетельствует о влиянии пептида на развитие адаптивного поведения у крыс. Кроме того, направленность изменений поведения животных, вызванных неонатальным введением семакса, указывает на возможность компенсации последствий неонатального стресса под действием пептида. Сопоставление с данными литературы, а также с результатами, полученными ранее в экспериментах на взрослых животных, позволяет предположить, что зарегистрированные нами изменения поведения животных связаны с модулирующим воздействием семакса на развивающуюся систему биогенных аминов мозга [Alves et al., 1997; Nyakas et al., 1981; Strand et al., 1989].

Многочисленные эксперименты показали, что меланокортины способны оказывать положительное действие на восстановление функций организма при повреждениях центральной нервной системы, вызванными как перерезками в различных регионах мозга, так и введением нейротоксинов. В частности, нейропротекторное действие меланокортинов было показано на животных с нарушением дофаминергической системы мозга, в случае повреждения черной субстанции мозга инъекцией 6-OHDA [Strand et al, 1993; Antonawich et al., 1993].

Проведенные нами эксперименты показали, что интраназальное введение семакса ослабляет нарушения поведения, вызванные однократной инъекцией нейротоксина МФТП. Введение пептида в меньшей дозе - 0,05 мг/кг уменьшало выраженность нарушений поведения, вызванных введением нейротоксина, однако эффекты семакса в этой дозе были недостоверны. В большей дозе - 0,2 мг/кг инъекции пептида в значительной мере нормализовали поведение животных. Крысы, которым вводили семакс в этой дозе, характеризовались более высокой двигательной и ориентировочной активностью и сниженным уровнем тревожности по сравнению с животными, получавшими только МФТП. Следовательно, интраназальное введение семакса способствует функциональному восстановлению животных с нарушениями ДА-ергической системы мозга, оказывает протекторное действие на МФТП-вызванной модели паркинсонизма. Однако для достижения значимого эффекта необходимо использовать большую дозу пептида, чем в случае ноотропного действия [Ashmarin et al., 1995] и нейротрофического влияния на развивающуюся нервную систему.

В основе протекторного действия семакса при МФТП-вызванных нарушениях поведения животных может лежать модулирующее влияние пептида на ДА-ергическую систему мозга. Усиление синтеза и увеличение выброса ДА неповрежденными нейронами может привести к увеличению концентрации медиатора в стриатуме до уровня, характерного для бессимптомной стадии паркинсонизма. Зарегистрированные нами протекторные эффекты семакса также могут быть связаны с нейротрофической активностью пептида [Shadrina et al., 2001; Долотов и др., 2003], обуславливающей ослабление повреждения и восстановление функции обратимо поврежденных ДА-синтезирующих нигростриатных нейронов.

Для выяснения возможного механизма нейропротекторного действия семакса нами изучались эффекты пептида на фоне блокады ДА-рецепторов галоперидолом. Эксперименты показали, что введение семакса в дозах 0,05-0,6 мг/кг практически не влияет на нарушения двигательной активности, вызванные введением блокатора, однако инъекция пептида в дозе 0,05 мг/кг в значительной степени ослабляет отрицательное влияние галоперидола на выработку УРАИ. Следовательно, введение семакса нормализует формирование условного рефлекса, нарушенного блокадой ДА-рецепторов.

Известно, что АКТГ-подобные пептиды оказывают модулирующее влияние на дофаминергическую систему мозга - увеличивают концентрацию ДА в отдельных структурах мозга, активируют синтез и усиливают выброс медиатора в ответ на внешние стимулы [Gold, Delanoy, 1981]. Исследование влияния семакса на содержание и обмен моноаминов в мозге крыс показало, что введение пептида в дозах 0,15 и 0, 6 мг/кг приводит к увеличению скорости оборота серотонина, но не влияет на дофаминергическую систему мозга [Еремин и др., 2004 А]. Дальнейшие исследования показали, что инъекция семакса в дозе 0,6 мг/кг потенцирует поведенческие и нейрохимические эффекты d-амфетамина [Еремин и др., 2004 Б]. Полученные результаты свидетельствуют о возможном модулирующем влиянии семакса на ДА-ергическую систему мозга. Однако также нельзя исключить возможность вовлечения других нейромедиаторных систем мозга в механизмы протекторного действия семакса на фоне нарушения ДА-ергической системы мозга.

Таким образом, интраназальное введение семакса способствует функциональному восстановлению животных с нарушениями ДА-ергической системы мозга, оказывает протекторное действие на МФТП-вызванной модели паркинсонизма, а также нормализует формирование условного рефлекса, нарушенного блокадой ДА-рецепторов галоперидолом. Механизмы данного воздействия могут быть связаны как с усилением компенсаторных процессов, необходимых для функционального восстановления, так и увеличением выживаемости нейронов.

В настоящее время накоплен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о нейротрофическом влиянии природных и синтетических меланокортинов на развивающуюся и регенерирующую нервно-мышечную систему [Strand et al, 1993]. Способность экзогенных меланокортинов стимулировать развитие и восстановление нервной системы может отражать возможное участие аналогичных эндогенных пептидов в этих процессах.

Структурно-функциональные исследования показали, что ответственной за нейротрофическую активность является N-концевая область молекулы АКТГ -фрагмент АКТГ4.10. Основываясь на иммунохимической локализации этого фрагмента было высказано предположение о том, что в период развития нервной системы и во время регенерации нервной ткани эндогенный фрагмент АКТГ4.10 образуется в мозге и является нейропротекторным и нейротрофическим фактором [Antonawich et al, 1994]. Перечисленные выше результаты свидетельствуют о том, что семакс, также как его природный прототип АКТГ4.Ю, оказывает нейропротекторное и нейротрофическое влияние в период развития и на фоне повреждения нервной системы. Следовательно, наличие в структуре пептида последовательности Met-Glu-His-Phe (АКТГ4.7) является достаточным для сохранения нейропротекторных и нейротрофических свойств меланокортинов и замена аминокислотных остатков в молекуле АКТГ4.10 на последовательность Pro-Gly-Pro не приводит к потере этих эффектов. Проведенные ранее исследования показали, что семакс более устойчив к действию протеаз сыворотки крови, чем природный фрагмент АКТГ4.10 [Potaman et al, 1991; Potaman et al, 1993]. Высокая протеолитическая устойчивость семакса лежит в основе пролонгированности его ноотропных эффектов [Ashmarin et al., 1995]. Можно предположить, что протеолитическая устойчивость семакса также определяет выраженность его нейротрофического и нейропротекторного действия. Полученные данные могут послужить основой для расширения клинического применения лекарственного препарата семакс, в частности, для лечения патологий у детей в ранний постнатальный период и в терапии болезни Паркинсона.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Себенцова, Елена Андреевна, 2005 год

1. Алексеева Г.В., Боттаев Н.А., Горошкова В.В. Применение семакса в отдаленном периоде у больных с постгипоксической патологией мозга // Анестезиология и реаниматология, 1999, N 1, с. 40-43.

2. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Грачев С.В., Мясоедов Н.Ф. Изучение влияния семакса на Са2+ -ответы нейтрофилов человека // ДАН, 2000, т. 374, N 3, с. 401-403.

3. Ашмарин И.П., Стукалов П.В., Ещенко Н.Д. Биохимия мозга // Изд-во С.-Петербургского университета, 1999, 325.

4. Ашмарин И.П., Антонова Л.В., Титов С.А., Максимова Л.А., Каменский А.А. Возможные механизмы разнонаправленного действия АКТГ4-10 и его аналога, содержащего D-изомер фенилаланина, на поведение // Журнал ВНД, 1980, т. 30, вып. 6, с. 1196-1202.

5. Балан П.В., Маклакова А.С., Крушинская Я.В., Соколова Н.А., Кудашов Н.И. Отставленные эффекты острой гипобарической гипоксии в эксперименте: влияние гептапептида семакс (AKTT4.7-PGP) // Акушерство и генекология,- 1999.-№1.- с. 46-49.

6. Беспалов АЛО., Звартау Э.Э. Нейропсихофармакология антагонистов NMDA-рецепторов. // Спб., Невский диалект. 2000. - 297 с.

7. Геренко А.Н., Незавибатько В.Н., Волков А.В., Каменский А.А. Двигательная активность крыс в посреанимационном периоде // Вестн. МГУ, сер. 16, Биология, 1991, N3, с. 24.

8. Глебов Р.Н., Горячева Т.В. АКТГ как нейропептид. Функциональная роль в мозге. // Патол. физиология и эксп. тер., 1990, N4, с. 54-57.

9. Гривенников И.А., Долотов О.В., Гольдина Ю.И. Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих // Молекулярная биология, 1999, т. 33, N 1, с. 120-126.

10. Громов JI.A. Нейропептиды //1992, Киев: "Здоровье", с. 248

11. Еремин К.О., Кудрин B.C., Андреева Л.А., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский К. С. Влияние семакса на содержание и обмен моноаминов в мозге мышей линии C57/BL // Нейрохимия, 2002, т. 19, N 3, с. 202-205.

12. Еремин К.О., Кудрин B.C., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский К.С. Влияние семакса на дофамин- и серотонинергические системы мозга // ДАН.-2004 (а).-т. 394. №1. с. 1-3.

13. Иванова Ю.В., Яснецов В.В. Влияние семакса и мексидола на течение острого панкреатита у крыс // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2000, т. 63, N 1, с. 41-44.

14. Каплан А.Я., Кошелев В.Б., Незавибатько В.Н., Ашмарин И.П. Повышение устойчивости организма к гипоксии с помощью нейропептидного лекарственного препарата семакс // Физиология человека, 1992, т. 18, N 5, с. 104-107.

15. Крыжановский Г.Н., Карабань И.Н., Магаева С.В., Карабань Н.В. Компенсаторные и восстановительные процессы при паркинсонизме // 1995.-Киев.- изд-во "Книга".

16. Машковский М. Д. Лекарственные средства. 1997, Харьков, "Торсинг".

17. Полунин Г.С., Нуриева С.М., Баяндин Д.Л., Шеремет Н.Л., Андреева Л.А. Определение терапевтической эффективности нового отечественного препарата «Семакс» при заболеваниях зрительного нерва // Вестник офтальмологии, 2000, т. 116,N 1, с. 15-18.

18. Пономарева-Степная М.А., Незавибатько В.Н., Антонова Л.В., Андреева Л.А., Потаман В.Н., Каменский А.А., Ашмарин И.П. Декапептид седативного действия // Хим.-фарм. Ж., 1986, N 10, с. 1195-1199.

19. Пономарева-СтепнаяМ.А., Незавибатько В.Н., Антонова Л.В., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Потаман В.Н., Каменский А.А., Ашмарин И.П. Аналог АКТГ4.10 -стимулятор обучения пролонгированного действия // Хим.-Фарм. Ж., 1984, N 7, с. 790-795.

20. Розен В.Б. Основы эндокринологии // М.: Изд-во МГУ, 1994

21. Рыжавский Б. Я. Развитие головного мозга в ранние периоды онтогенеза: последствия некоторых воздействий // Соросовский образовательный журнал, 2000, т. 6(1), с. 37-43.

22. Угрюмов М.В. Механизмы нейроэндокринной регуляции // М., «Наука». 1999.

23. Черкес В.А. Базальные ганглии // В: Частная физиология нервной системы. Л., Наука. - 1983.-с. 383-411.

24. Шилова О.Б., Полетаева И.И., Веретенников Н.А., Корочкин Л.И Влияние неонатального введения АКТГ 4-10 на поведение и катехоламинэргическую систему мозга взрослых мышей различных линий // ДАН, 1996, т. 348, N 5, с. 715718.

25. Acker G.R., Berran J., Strand F.L. ACTH neuromodulation of the developing motor system and neonatal learning in the rat // Peptides. 1985, v. 6, N 2, p. 41-49.

26. Allen J.P., Kendall J.W., McGilvra R., Vancura C. Immunoreactive ACTH in cerebrospinal fluid // J. Clin. Endocrinol, 1974, v. 38, p. 486-493.

27. Al-Obeidi F, Castrucci AM, Hadley ME, Hruby VJ. Potent and prolonged acting cyclic lactam analogues of alphamelanotropin: design based on molecular dynamics. // Journal of Medicinal Chemistry 1989, v. 32 N12, p.2555-2561.

28. Ambler.L., Bennet H.P., Hudson A.M, McMartin C. Fate of human corticotropin immediately after intravenous administration to the rat // J. Endocrinol., 1982, v. 93, N 2, p. 287-292.

29. Amir S. Effects of ACTH on pain responsiveness in mice: interaction with morphine // Neuropharmacology, 1981, v. 20, N 10, p. 959-962.

30. Amir S., Galina Z.H., Blaiz R., Brown Z.W., Amit Z. Opiate receptors may mediate the suppressive but not the excitatory action of ACTH on motor activity in rats // Eur. J. Pharmacol, 1980, v. 66, p. 307-313.

31. Antonawich F.J., Azmitia E.C., Kramer H.K., Strand F.L. Specificity versus redundancy of melanocortins in nerve regeneration // Ann. NY Acad. Sci., 1994, v. 739, p. 60-73.

32. Antonawich F.J., Azmitia E.C., Strand F.L. Rapid neurotrophic actions of an ACH/MSH(4-9) analogue after nigrostriatal 6-OHDA lesioning // Peptides, 1993, v. 14 (6), p. 1317-1324.

33. Argiolas A., Melis MR., Murgia S., Schioth H.B. ACTH- and a-MSH-induced grooming, stretching, Yawning and penile erection in male rats: site of action in the brain and role of melanocortin receotors // Brain Res Bull, 2000, v. 51, p. 425-431.

34. Artuc M., Grutzkau A., Luger Т., Henz B.M. Expression of MCI- and MC5-receptors on the human mast cell line HMC-1. // An. NY Acad. Sci., 1999, v. 885, p. 364-367.

35. Ashmarin I.P., Nezavibatko V.N., Levitskaya N.G., Koshelev V.B., Kamensky A.A. Design and investigation of an ACTH(4-10) analogue lacking D-amino acids and hydrophobic radicals //Neurosci. Res. Commun., 1995, v. 16, p. 105-112.

36. Attella M.J., Hoffman S.W., Pilotte M.P., Stein D.G. Effects of BIM-22015, an analog ACTH(4-10), on functional recovery after frontal cortex injury // Behav. Neural. Biol. 1992, v.57, N 2, p.157-166.

37. Beaty P.A., Beatty W.W., Bowman R.E., Gilchrist J.C. The effects of ACTH, adrenalectomy and dexametasone on the acquisition of an avoidance response in rats // Physiol. Behav, 1970, v. 5, p. 939-944.

38. Bell R.C., Lipton J.M. Pulsatile release of antipyretic neuropeptide alpha-MSH from septum of rabbit during fever // The American Journal of Physiology, 1987, v. 252, p. 1152-1157.

39. Bernheimer H., Birkmayer W., Hornykiewicz O. Et al. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson's and Huntington's diseases: clinical and neurochemical correlation // J. Neurol. Sci, 1973, v. 20, p. 415-455.

40. Bertolini A., Poggioli R., Ferrari W. ACTH-induced analgesia in rats // Experientia, 1979, v. 35, N9, p. 1216-1217.

41. Bijlsma WA, Schotman P, Jennekens FG, Gispen WH, De Wied D. The enhanced recovery of sensorimotor function in rats is related to the melanotropic moiety of ACTH/MSH neuropeptides. // European Journal of Pharmacology 1983, v. 92, N3-4, p.231-236.

42. Bohus B. Pituitary-adrenal hormones and forced extinction of a passive avoidance response in the rat // Brain Res., 1974, v. 66, p. 366-367.

43. Bohus В., De Wied D. Inhibitory and facilitatory effect of two related peptides on extinction of avoidance behaviour // Science, 1966, v. 153, p. 318-320.

44. Bohus В., Endroczi E. The influence of pitutary-adrenocortical function on the avoiding conditioned reflex activity in rats // Acta Physiological Academiae Scientiarum Hungaricae, 1965, v. 26, p. 183-189.

45. Bohus В., Nyakas C.S., Endroczi E. Effects of adrenocorticotropic hormone on avoidance behaviour of intact and adrenalectomized rats // Inter. J. Neuropharmacol., 1968, v. 7, p. 307-314.

46. Boston B.A. The role of melanocortins in adipocyte function. // Annals of the New York Academy of Sciences, 1998, v. 885, p. 75-84.

47. Boston B.A., Cone R.D. Characterization of melanocortin receptor subtype expression in murine adipose tissues and in the 3T3-L1 cell line. // Endocrinology, 1996, v. 137, N5, p. 2043-2050.

48. Buggy J.J. Binding of alpha-melanocyte-stimulating hormone to its G-protein-coupled receptor on B-lymphocytes activates the Jak/STAT pathway. // The Biochemical Journal, 1998, v. 331, N 1, p. 211-216.

49. Catania A., Lipton J.M. a-Melanocyte stimulating hormone in the modulation of host reactions. // Endocrine Reviews, 1993, v. 14, N 5, p. 564-576.

50. Catania A., Rajora N., Capsoni F., Minonzio F., Star R.A, Lipton J.M. The neuropeptide alpha-MSH has specific receptors on neutrophils and reduces chemotaxis in vitro. // Peptides, 1996, v. 17, N 4, p. 675-679.

51. Ceriani G., Diaz J., Murphree S,, Catania A., Lipton J.M. The neuropeptide alpha-melanocyte-stimulating hormone inhibits experimental arthritis in rats. // Neuroimmunomodulation, 1994, v.l, N 1, p. 28-32.

52. Chalmers D.V., Levine S. The development of heart rate responses to weak and strong shock in the preweaning rat. // Dev. Psychobiol., 1974, v. 7 (6), p. 519-527.

53. Chen W., Kelly M.A., Opitz-Araya X., Thomas R.E., Low M.J., Cone R.D. Exocrine gland dysfunction in MC5-R-deficient mice: evidence for coordinated regulation of exocrine gland function by melanocortin peptides // Cell, 1997, v. 91, p. 789-798.

54. Chhajlani V. Distribution of cDNA for melanocortin receptor subtypes in human tissues. // Biochemistry and Molecular Biology Int., 1996, v. 38, N 1, p. 73-80.

55. Chhajlani V., Muceniece R., Wikberg J.E.C. Molecular cloning of a novel human melanocortin receptor. // Biochem. Biophys. Res. Comm., 1993, v. 195, N 2, p. 866873.

56. Chhajlani V., Wikberg J.E.C. Molecular cloning and expression of the humanmelanocyte stimulating hormone receptor cDNA. // FEBS Letters, 1992, v. 309, N 3, p. 417-420.

57. Chiao H., Kohda Y., McLeroy P., Craig L., Housini I., Star R.A. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against renal injury after ischemia in mice and rats. // The Journal of Clinical Investigation, 1997, v. 99, N 6, p. 1165-1172.

58. Daval J.L., Louis J.C., Gerard M.J., Vincendon G. Influence of adrenocorticotropic hormone on the growth of isolated neurons in culture. // Neuroscience Letters, 1983, v. 36, N3, p. 299-304.

59. De Koning P., Gispen W.H. Org 2766 improves functional and electrophysiologic aspects of regenerating sciatic nerve in the rat // Peptides, 1987, v. 8, p. 415-418.

60. De Wied D. Effects of peptide hormones on behaviour // Frontiers in Neuroendocrinology, 1969, p. 97-140.

61. De Wied D. Influence of anterior pitutary on avoidance learning and escape behavior // American Journal of Physiology, 1964, v. 7, p. 307-314.

62. De Wied D. Inhibitory effect of ACTH and related peptides on extinction of conditioned avoidance brhaviour in rats // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1966, v. 122, p. 28-32.81