Новые метилтрансферазы митохондриальной рРНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Лаптев Иван Георгиевич

• Лаптев Иван Георгиевич
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Лаптев Иван Георгиевич

Оглавление

Список сокращений

Введение

Актуальность проблемы

Степень разработанности темы

Цели и задачи исследования

Объект исследования

Предмет исследования

Научная новизна исследования

Теоретическая значимость исследования

Практическая значимость исследования

Методология диссертационного исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Степень достоверности результатов

Апробация работы

Публикации

Личный вклад автора

Структура и объём диссертации

Модификации нуклеотидов митохондриальных рРНК (обзор литературы)

Особенности митохондриального аппарата трансляции млекопитающих

Модификации нуклеотидных остатков рРНК большой субчастицы

2'-0-метилирование

ш1Л-метилирование (ш1Л947)

Псевдоуридинилирование ¥1397

Модификации рРНК малой субчастицы

ш5и-метилирование (ш5и429)

ш5С метилирование (ш5С841)

ш4С-метилирование (ш4С839)

m26A-метилирование ^2^936 и m26A937)

Заключение

Материалы и методы

Реактивы и биопрепараты

Использованные растворы

Инактивация генов

Отбор моноклонов со сдвигом рамки считывания

Культивирование клеточных линий

Создание генетических конструкций для суперэкспрессии белков

Трансфекция клеточных линий

Выделение суммарной РНК

Выделение специфических РНК с помощью биотинированных ДНК-

олигонуклеотидов

Масс-спектрометрия РНК

Количественный ПЦР

Иммунопреципитация

Выделение митохондрий

Получение профилей митохондриальных рибосом

Масс-спектрометрия белков

Вестерн-блоттинг

Оценка эффективности митохондриальной трансляции

Измерение активностей дыхательных комплексов

Статистическая обработка результатов

Результаты

Постановка задачи

Создание клеточных линий с инактивированными генами TRMT2B и METTL15

TRMT2B и METTL15 метилируют Ш рРНК

TRMT2B метилирует некоторые митохондриальные тРНК

Отсутствие TRMT2B влияет на активность комплексов цепи переноса

электронов I, III и IV

METTL15 взаимодействует с интермедиатом сборки митохондриальной

рибосомы

Отсутствие METTL15 влияет на состав митохондриальных рибосом

Обсуждение

Выводы

Список литературы

Приложения

Список сокращений

CRISPR

ш*Л

Ш26Л

ш4С

m5U

Nm

TMPD

¥

АТФ

гРНК

ДМСО

ДСН

ДТТ

миторибосома

мРНК

мт-

ОРС

ПААГ

ПСА

ПЦР

рРНК

ТЕМЕД

тРНК

ЦП

ЭДТА

clustered regularly interspaced short palindromic repeats,

короткие палиндромные повторы, регулярно

расположенные группами

N1 -метиладенозин

N6, N^-диметиладенозин

N^-метилцитидин

5-метилуридин

2'-0-метилированный нуклеотид

ДД#',#'-тетраметил-«-фенилендиамин

псевдоуридин

аденозинтрифосфат

гидовая РНК

диметилсульфоксид

додецилсульфат натрия

дитиотреитол

митохондриальная рибосома матричная РНК митохондриальный (-ая, -ой) открытая рамка считывания полиакриламидный гель персульфат аммония полимеразная цепная реакция рибосомная РНК

ДД#',#-тетраметилэтилендиамид транспортная РНК центральный протуберанец этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые метилтрансферазы митохондриальной рРНК»

Актуальность проблемы

Рибосома, осуществляющая синтез белков, является одной из важнейших молекулярных машин. Её правильное функционирование и сборка жизненно необходимы для всех живых клеток. Обычно рРНК подвергается постранскрипционным модификациям, необходимым для правильного сворачивания её структуры. Для бактериальных рибосом известно более 30 [1] модифицированных нуклеотидов, для эукариотических (цитоплазматических) -более 200 [2]. В митохондриальных же рибосомах млекопитающих подвергаются модификации всего 9-10 нуклеотидов [3], что по сравнению с другими рибосомами очень мало. Учитывая возможное происхождение митохондрий от бактериального предшественника, считается, что в миторибосомах в процессе эволюции остались только самые важные для функционирования рибосомы модификации.

В 16S рибосомной РНК E. coli присутствует уникальный модифицированный нуклеотид m4Cm, за образование которого отвечают ферменты RsmH и RsmI [4], модифицирующие экзоциклическую аминогруппу и 2'-гидроксил, соответственно. В цитоплазматических рибосомных РНК млекопитающих эквивалентый нуклеотид 2'-О метилирован, но модификация аминогруппы отсутствует. 12S рРНК митохондрий, напротив, содержит модифицированный нуклеотид m4C в позиции, эквивалентной таковой в E. coli. Митохондриальный белок млекопитающих METTL15 [5,6] является гомологом белка RsmH E. coli и, как мы предположили, проводит модификацию митохондриальной рРНК.

Опираясь на известные данные о метилтрансферазах E. coli и S. cerevisiae и следуя аналогичным рассуждениям, мы также обнаружили вероятного кандидата на роль m5U метилтрансферазы 12S мт-рРНК млекопитающих - белок TRMT2B. TRMT2B является гомологом белка Trm2 S. cerevisiae, который приводит к образованию m5U54 тРНК [7] поэтому TRMT2B также является кандидатом на роль m5U54 метилтрансферазы мт-тРНК.

Степень разработанности темы

Почти для всех модификаций нуклеотидных остатков мт-рРНК млекопитающих найдены белки, ответственные за их наличие и практически для всех из них показано, что они важны для правильной сборки рибосомы, и их отсутствие приводит к проблемам с митохондриальной трансляцией. Исключение составляют ш5и429 и ш4С839 12Б мито-рРНК, для которых формирующие их ферменты не были известны до 2019 г.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы стало изучение функций т4С и т5и метилирования мт-рРНК митохондрий млекопитающих.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• получить клеточные линии с инактивированными генами ЫвШ15 и Ттш12Ъ с помощью системы CRISPR/Cas9;

• проверить наличие т4С и т5и метилирования в 12S мт-рРНК (и мт-тРНК для т5и) в нокаутных линиях;

• если наши гипотезы окажутся верными, выяснить, к каким последствиям для клетки приводит отсутствие данных метилтрансфераз (влияние на количество рРНК, количество мт-ДНК, эффективность трансляции, активность комплексов дыхательной цепи, влияние на сборку миторибосомы).

Объект исследования

Метилирование РНК и его влияние на жизненные процессы клетки.

Предмет исследования

Функция ш4С и ш5и метилирования митохондриальной 12Б рРНК мыши.

Научная новизна исследования

Впервые для клеток мыши была показана роль белков METTL15 и TRMT2B в модификации митохондриальной 12S рРНК; данная работа завершает полный список ферментов, ответственных за метилирование митохондриальных рРНК млекопитающих. Впервые созданы клеточные линии с инактивированными генами ЫвИ115 и Ттш12Ъ и показано, к каким последствиям для клетки это приводит. Для мышиных мт-тРНК определены признаки, при наличии которых Ш4 в них метилируется белком TRMT2B.

Теоретическая значимость исследования

В представленной работе мы показали, что белок METTL15 ответственен за m5U метилирование митохондриальной 12S рРНК, а TRMT2B - за m4U метилирование митохондриальных 12S рРНК и некоторых тРНК. Также было продемонстрировано, что отсутствие TRMT2B немного снижает активность дыхательных комплексов, субъединицы которых закодированы в митохондриальном геноме, а METTL15 метилирует рРНК на поздней стадии сборки малой субчастицы миторибосомы и необходим для своевременной диссоциации белка RBFA и полноценного метилирования 12S рРНК белком

Практическая значимость исследования

Результаты данной работы помогают понять функциональную роль метилирования 12S рРНК митохондрий млекопитающих.

Методология диссертационного исследования

В данной работе использовались современные методы исследований, такие как инактивация генов с помощью CRISPR-Cas9, анализ РНК и белков с помощью масс-спектрометрии. Для анализа функции изучаемых белков было создано несколько клеточных линий: линии с инактивированными генами, линии с регулируемой экспрессией генов изучаемых белков, а также генов белков с

довесками для иммунопреципитации. Для экзогенной экспрессии применялась система транспозонов Sleeping Beauty. Активность комплексов измерялась с помощью прибора Oxytherm (Hansatech instruments). Белковый состав фракций после разделения субчастиц рибосомы в градиенте сахарозы анализировали с помощью масс-спектрометрии.

Основные положения, выносимые на защиту

• Белки METTL15 и TRMT2B метилируют митохондриальную 12S рРНК

• TRMT2B метилирует мт-тРНК, последовательность Т-петли которых начинается с UU, за исключением мт-тРНК^ет (AGC)

• Отсутствие TRMT2B снижает активность дыхательных комплексов, субъединицы которых закодированы в митохондриях

• METTL15 метилирует 12S рРНК на поздней стадии сборки 28S субчастицы

Степень достоверности результатов

Достоверность результатов данного исследования подтверждается воспроизводимостью экспериментов и статистической обработкой данных. Все экспериментальные процедуры соответствуют поставленным целям и задачам. Результаты получены на современном научном оборудовании и с использованием реактивов, произведенных ведущими мировыми компаниями.

Апробация работы

Результаты данной работы были представлены на следующих научных конференциях:

• Ribosomes and Translation, «Modification of translation apparatus: in a search for a functional role» - доклад (представлялся Сергиевым П. В.), «Unraveling the functions of mitochondrial putative methyltransferases TRMT2B and METTL15» - постерная сессия, Россия, Петергоф, 13.05.2018-16.05.2019;

• Ribosome 2019 «Searching for unknown mammalian RNA methyltransferases» - доклад, México, Mérida, 06.01.2019-10.01.2019 (представлялся Сергиевым П. В.).

Публикации

1. Laptev I., Shvetsova E., Levitskii S., Serebryakova M., Rubtsova M., Zgoda V., Bogdanov A., Kamenski P, Sergiev P. and Dontsova O. METTL15 interacts with the assembly intermediate of murine mitochondrial small ribosomal subunit to form m4C840 12S rRNA residue // Nucleic Acids Res. 2020. Vol. 48, № 14. P. 8022-8034, IF 11,502 (Web of Science).

2. Laptev I., Shvetsova E., Levitskii S., Serebryakova M., Rubtsova M., Bogdanov A., Kamenski P, Sergiev P. and Dontsova O. Mouse Trmt2B protein is a dual specific mitochondrial metyltransferase responsible for m5U formation in both tRNA and rRNA // RNA Biology. 2020. Vol. 17, № 4. P. 441-450, IF 5,350 (Web of Science).

3. Laptev I., Dontsova O., Sergiev P. Epitranscriptomics of Mammalian Mitochondrial Ribosomal RNA // Cells. 2020. Vol. 9, № 10. P. 2181, IF 4,366 (Web of Science).

Личный вклад автора

Личный вклад автора в проведенное исследование заключался в сборе и анализе литературных данных, постановке задач, планировании и проведении экспериментальных процедур, анализе и оформлении полученных результатов, в представлении результатов на научных мероприятиях.

Структура и объём диссертации

Текст диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, приложений, списка литературы, который включает 145 источника. Объем диссертации 110 страниц, материал иллюстрирован 30 рисунками и 19 таблицами.

Модификации нуклеотидов митохондриальных рРНК*

(обзор литературы)

Митохондрии являются отличительной чертой эукариотических клеток. Одной из основных их функций является производство АТФ путём окислительного фосфорилирования. Для этого в их внутренней мембране расположено 5 белковых комплексов, участвующих в данном процессе: комплексы цепи переноса электрона 1-1У (дыхательные комплексы) и АТФ-синтаза. Все они состоят из большого количества белков, закодированных как в ядре, так и в самих митохондриях.

На данный момент считается, что митохондрии произошли от эубактериального симбионта, наиболее похожим на которого из современных организмов являются а-протеобактерии [8]. Со временем большая часть генома такого симбионта переместилась в ядро клетки-хозяина [9]. Так, в митохондриальной ДНК млекопитающих закодированы только 2 рРНК, 22 тРНК, а также 13 мРНК белков-субъединиц дыхательных комплексов и АТФ-синтазы (7 субъединиц КЛОИ-дегидрогеназы, комплекс I; цитохром Ь, комплекс III; 3 субъединицы цитохром с оксидазы, комплекс IV; 2 субъединицы АТФ-синтазы, комплекс V) (рис. 1). Все данные гены транскрибируются с трёх промоторов, закодированных в О-петле: ИБР1, ИБР2 и ЬБР. Продукты последних двух - это транскрипты, соответствующие большей части генома в то время как транскрипт с промотора ИБР1 захватывает только гены двух рРНК и двух тРНК - тРНКРЬе и тРНКш [10,11]. Интересно, что после процессинга митохондриальных транскриптов сохраняются РНК, комплементарные генам ND5, ND6 и CYTB, которые образуют межмолекулярные дуплексы с соответствующими кодирующими транскриптами и предположительно регулируют их экспрессию или стабильность [12].

Все гены остальных белков, которые нужны для поддержания и работы митохондрий закодированы в ядре, в том числе и все субъединицы

* В обзоре литературы нумерация нуклеотидов мт-рРНК приведена для человека, если не обговорено отдельно. В разделе Результаты и далее, нумерация представлена для мыши (Mus musculus).

сукцинатдегидрогеназы (комплекс II) и оставшиеся субъединицы других комплексов. Так что для правильного и успешного протекания всех процессов, происходящих в митохондриях, нужна хорошо скоординированная экспрессия ядерных и митохондриальных генов.

Особенности митохондриального аппарата трансляции млекопитающих

Несмотря на то, что митохондриальный аппарат трансляции произошёл от бактериального, они довольно сильно отличаются.

Митохондрии имеют генетический код, немного отличный от универсального: стоп кодон UGA в них кодирует триптофан, AUA вместо изолейцина кодирует метионин. Для AGA и AGG (AGR) кодонов в митохондриях нет тРНК, и долгое

Рисунок 1. Схематичное изображение митохондриальной ДНК млекопитающих [13]. Внешнее кольцо -тяжёлая цепь, внутреннее - лёгкая цепь. Красным обозначены гены рРНК, жёлтым - субъединицы NADH-дегидрогеназы (комплекс I), оранжевым - цитохром Ь (комплекс III), голубым - субъединицы цитохром c оксидазы (комплекс IV), бирюзовым - субъединицы АТФ-синтазы (комплекс V), белым - тРНК (подписаны однобуквенным кодом для аминокислот), серым - некодирующие РНК.

время они считались стоп-кодонами, но открытие сдвига рамки у миторибосомы на один нуклеотид назад (-1 ЁгатеБЫй^), в результате которого в Л-сайте оказывается стандартный ИЛО-кодон [14], поставило эту гипотезу под вопрос.

Матричные РНК митохондрий отличаются и от бактериальных, и от ядерных РНК эукариот. Как было сказано выше, с двух из трёх промоторов синтезируется весь митохондральный геном. Почти все гены белков и рРНК при этом разделены генами тРНК, что можно увидеть на рис. 1. Такое расположение генов и отсутствие целых полногеномных транскриптов привело к появлению теории тРНК-пунктуации [15], в которой считалось, что отдельные мРНК образуются после вырезания тРНК из ещё синтезирующихся транскриптов. В последствии данная теория подтвердилась и было показано, что это происходит с помощью РНКазы Р [16] и РНКазы Ъ [17] с 5'- и З'-концов тРНК соответственно, и транскрипт разделяется на отдельные мРНК. Большая часть мРНК моноцистронна, однако имеются две бицистронные мРНК, кодирующие ЛТР8/ЛТР6 и КО4Ь/МО4. Получившиеся мРНК в митохондриях млекопитающий, в отличие от мРНК митохондрий дрожжей, имеют очень короткие 5'-нетранслируемые области или не имеют их вовсе, при этом у них отсутствует последовательность Шайна-Дальгарно. После вырезания мт-тРНК происходит полиаденилирование мРНК, за исключением гена ND6 [18], единственного белок-кодирующего гена, расположенного на легкой цепи мт-ДНК. Для 7 из 13 мРНК данный процесс создаёт стоп-кодон. В то время как для бактериальных мРНК полиаденилирование - это сигнал для направления на деградацию [19], а для ядерных - защита от деградации и контроль качества зрелой мРНК, в мт-мРНК данный процесс не столь однозначен и может приводить как к увеличению стабильности мРНК, так и к уменьшению [20].

Отличаются и митохондриальные тРНК. Все они немного короче цитоплазматических, а некоторые даже не имеют О-петли. Несмотря на это, они могут сворачиваться в характерную для тРНК четвертичную структуру и участвовать в трансляции [21].

Таблица 1. Состав рибосом из бактерий, цитоплазмы и митохондрий эукариот и дрожжей (основано на [22]).

Бактерии (Escherihia coli) Цитоплазма эукариот [23] Митохондрии млекопитающих Митохондрии дрожжей

[23] [24-26] [27,28]

Рибосома

Коэффициент седиментации 70S 80S 55S 74S

Молеклярная масса, МДа 2.3 3.3-4.3 2.7 3.0

Число молекул

РНК в составе 3 4 3 2

рибосомы

Число белков 54 79-80 82 80

Большая субчастица

Кэоффициент седиментации 50S 60S 39S 54S

23S (2,904 о.) 26S-28S (3,396-5,034 о.) 16S (1,569 о.) 21S (3,296 о.)

рРНК 5.8S (156-158 о.)

5S (120 о.) 5S (120-121 о.) CP тРНК (73-75 о.)

Число белков 33 46-47 52 46

Малая субчастица

Кэоффициент седиментации 30S 40S 28S 37S

рРНК 16S (1,534 о.) 18S (1,800-1,870 о.) 12S (962 о.) 15S (1,649 о.)

Число белков 21 33 30 34

Довольно сильно отличаются митохондриальные рибосомы. Краткий список отличий представлен в таблице 1. Миторибосомы млекопитающих и их-субчастицы имеют меньшие коэффициенты седиментации по сравнению с бактериальными рибосомами, цитоплазматическими рибосомами и даже с миторибосомами дрожжей. Основной причиной этому служит сокращение рРНК -митохондриальные рРНК млекопитающих короче соответствующих бактериальных почти в два раза - и увеличение содержания белков [29].

Так как рРНК митохондрий млекопитающих короче, в ней отсутствуют некоторые структурные элементы. Считается, что это послужило причиной изменений в белковой части рибосомы. На месте утраченных петель рРНК

образовывались пустоты, которые заполнялись новыми белками, по большей части с превалированием кислых аминокислотных остатков, что имитировало РНК [30], а также К- и С- концевыми удлинениями существующих белков [31,32]. Интересным примером таких изменений является отсутствие в митохондриях гомолога инициаторного фактора трансляции бактерий Ш1 - его роль выполняет удлинение другого инициаторного фактора мт-Ш2 [33].

Другим примером может служить изменение в канале, связывающем мРНК. В согласии с тем, что в мРНК отсутствует последовательность Шайна-Дальгарно, в миторибосомах отсутствует участок, её связывающий, характерный для бактериальных рибосом. Частично эту роль выполняют белки, специфичные для миторибосом - тБ37, тБ38 и тБ39. Белок тБ37 участвует в связывании 5'-конца мРНК [34], 3'-часть мРНК, связывающаяся с рибосомой при инициации, при этом взаимодействует с другим мито-специфичным белком - тБ39 [35]. Для белка тБ38 известен ортолог - ЬБ22, -который присутствует в некоторых бактериях, имеющих безлидерные мРНК. Он участвует в формировании мРНК-канала, улучшает связывание 5'-конца мРНК в Р-сайте малой субчастицы. В дрожжевых митохондриях тБ38 селективно усиливает трансляцию некоторых мРНК [36].

В большой субчастице отсутствует 5 Б рРНК, её роль в миторибосомах млекопитающих выполняют мт-тРНКРЬе или мт-тРНКш [37,38], а в миторибосомах дрожжей вовсе отсутствует дополнительная рРНК [27]. 5Б рРНК является частью центрального протуберанца (ЦП) - структурного элемента большой субчастицы рибосомы, выполняющей связующую функцию между сайтом связывания ГТФаз и пептидилтрансферазным центром рибосомы [39]. Почему именно валиновая или фенилаланиновая мт-тРНК встраиваются в миторибосомы, до конца не понятно. Интересно, что предпочтение той или другой видоспецифично и примерно одинаково по разным тканям, но при этом они взаимозаменяемы [40]. Считается, что это может происходить из-за близкого расположения этих мт-тРНК к 16Б рРНК на геноме (рис. 1) и включение их в один полицистронный транскрипт с промотора ИБР1 [41].

Считается, что основные изменения в структуре рибосомы обусловлены большей специализацией митохондриальных рибосом для синтеза трансмембранных белков, обладающих высокой гидрофобностью [42].

Отличаются миторибосомы и по количеству модификаций нуклеотидных остатков рРНК. Так в цитоплазматических рибосомах эукариот постранскрипционной модификации подвергаются более 200 нуклеотидов [2], в бактериальных - более 30 [1], а в миторибосомах млекопитающих - всего 9-10 нуклеотидов (модификация т1А встречается не у всех млекопитающих) [3]. Все они находятся на поверхностях субчастиц, обращенных друг к другу, в функционально важных участках, взаимодействующих с рибосомными лигандами (рис. 2, 3). В следующих разделах речь пойдёт о модификациях нуклеотидных остатков рРНК митохондриальных рибосом млекопитающих и дрожжей, а также модификациях эквивалентных нуклеотидов в бактериальной и цитоплазматической рибосоме.

Модификации нуклеотидных остатков рРНК большой субчастицы

Большая субчастица содержит 16S рРНК и тРНК центрального протуберанца. Модификации подвергается 5 нуклеотидов, три из которых метилируются по рибозе ^т1145, ит1369 и Gm1370), один аденин метилируется по атому N1 (т1А947, специфичен для митохондрий млекопитающих) и один уридин превращается в псевдоуридин (¥1397) (рис. 2).

2'-0-метилирование

Gm1145

Метилирование От1145 является высоко консервативным и присутствует так же в рибосомах и бактерий, и цитоплазмы млекопитающих, и цитоплазмы и митохондрий дрожжей. Этот нуклеотид находится в пептидилтрансферазном центре рибосомы и контактирует с пептидил-тРНК, т.е. тРНК, связанной с растущей цепью белка. Консервативность данного метилирования и расположение нуклеотида позволяют предположить, что он является одним из важнейших для

трансляции, т.к. поддерживает конформацию остатков, контактирующих с тРНК внутри рибосомы [43].

Рисунок 2. Расположение модифицированных нуклеотидов в большой субчастице рибосомы и их локальное окружение. 39S субчастица показана со стороны межсубъединичного интерфейса. Зелёным отмечены белки, гомологи которых есть во всех рибосомах, жёлтым - белки, гомологичные бактериальным рибосомным белкам, фиолетовым - белки, специфичные для митохондриальных рибосом, тёмно-красным - 16S рРНК и тРНК в центральном протуберанце, голубым - нуклеотиды, подвергающиеся модификации. На локальных структурах жёлтыми стрелочками отмечены метилируемые атомы, а цветами, отличными от основного, показаны: синим - атомы азота, красным -атомы кислорода, оранжевым - атомы фосфора. Картинки сделаны с помощью программы UCSF Chimera на основе структуры с PDB ID 6VLZ.

В бактериях 2'-0-метилирование эквивалентного нуклеотида (G2251) производится белком RlmB. Делеция гена данного белка не приводит к заметному фенотипу [44].

В геноме дрожжей ген pet56 является ортологом rlmB бактерий. В работе [45] было показано, что при удалении промотора данного гена пропадает метилирование Gm2270 (эквивалентен Gm1145 в 16S мт-рРНК человека). В отличие от бактерий, уменьшенная экспрессия pet56 и инактивация данного гена приводит к заметным отличиям от клеток дикого типа: замедленный рост в среде с неферментируемыми источниками углерода (глицерин и этанол) при 30°C, сниженное потребление кислорода при росте при 18°C, а также сниженное количество собранной большой субчастицы миторибосомы [45,46]. Скорее всего Pet56p метилирует рРНК на ранних стадиях сборки большой субчастицы, т.к. была показана его активность in vitro на «голой» рРНК [45].

Ортологом RlmB в млекопитающих является MRM1. С помощью нокдауна гена данного белка было доказано, что MRM1 метилирует G1145 по рибозе в 16S рРНК человека [47]. Белок колокализуется с ДНК митохондрий и на градиентах мигрирует вместе с нуклеоидом, что может означать котранскрипционную активность данного фермента [48]. Также было показано, что метилирование G1145 белком MRM1 зависит от активности GTPBP5 (MTG2), который по большей части влияет на активность MRM2 [49].

Um1369

Метилирование Um1369 также является высоко консервативным [43]. Данный нуклеотид находится в пептидилтрансферазном центре рядом со входом растущей цепи белка в пептидный тоннель в непосредственной близости с 3'-ССА-концом тРНК.

В бактериях эквивалентный нуклеотид Um2552 метилируется белком RlmE (FtsJ) [50]. Он относится к белкам теплового шока. Отсутствие функционального белка приводит к яркому фенотипу - наибольшему замедлению роста бактерий по сравнению с нокаутами других генов рРНК

метилтрансфераз [51]. К такому же фенотипу приводит и мутация данного нуклеотида на любой другой [52,53]. Также было показано, что отсутствие данной метилтрансферазы приводит к уменьшению количества 70S рибосом и накоплению 45S предшественника большой субчастицы. RlmE может in vitro модифицировать 45S и 50S субчастицы, выделенные из нокаутного штамма, при этом 50S субчастицы метилируются лучше, что говорит о том, что данный белок участвует в поздних стадиях сборки большой субчастицы рибосомы [50,51,53]. При замене U2552C в 16S рРНК также происходит аккумуляция 45S субчастиц, причём происходит это скорее всего из-за отсутствия метилирования RlmE, а не из-за ухудшения связывания метилтрансферазы т.к. при данной мутации белок связывается с большой субчастицей не хуже, чем без мутации [53]. Все эти данные свидетельствуют о необходимости данного нуклеотида для поддержания структуры рРНК и сборке большой субчастицы рибосомы.

Как это ни удивительно, но данные фенотипы могут комплементироваться суперэкспрессией двух ГТФаз - ObgE (YhbZ) и EngA. При этом метилирование рРНК по U2552 не восстанавливается [54]. Интересно, что делеция engA приводит к похожему фенотипу - накоплению 40 S предшественников большой субчастицы [55]. Авторы данной работы показали, что в отсутствии белка, как и без метилирования U2552, большая субчастица является менее стабильной при малой концентрации Mg2+ и при этом из собранных 50S субчастиц диссоциируют белки, связывание которых происходит на поздних стадиях сборки. Для ObgE известно несколько функций. Считается, что он препятствует ассоциации большой и малой субчастиц рибосомы [56] а также необходим для правильной сегрегации хромосом при делении бактерий [57].

Дрожжевым гомологом RlmE, выполняющим ту же функцию является Mrm2p [58]. У клеток, не имеющих активного белка, как и в случае с бактериальным гомологом, наблюдается яркий фенотип, характерный для дефектов митохондрий - клетки с делецией данного гена не могут расти в среде с неферментируемым источником углерода при повышенной температуре (37°С), а долгий рост на среде с глюкозой вызывает появление маленьких колоний, которые

не могут расти на среде с неферментируемым источником углерода и при нормальной температуре. Интересно, что суперэкспрессия Mtg2p (гомолог ObgE E. coli) может частично комплементировать данный фенотип и потерю митохондриальной ДНК [59]. Как и бактериальный гомолог, Mrm2p скорее всего метилирует рРНК на поздних стадиях сборки миторибосомы, т.к. in vitro белок активен по отношению к большой субчастице, но не к депротеинизированной рРНК [58].

Гомологом RlmE у млекопитающих является белок MRM2, ответственный за метилирование U1369 в 16S мт-рРНК [47,60]. Изначально считалось, что белок имеет ядерную локализацию [61], но выводы были сделаны по локализации химерных белков с довесками на N-конце (GFP-MRM2 и FLAG-MRM2), которые могли отрезаться при транспортировке в митохондрии или препятствовать ей. Впоследствии было показано, что белок находится именно в митохондриях и на сахарозных градиентах мигрирует с большой субчастицей и с собранной рибосомой [48,60]. При нокдауне гена данного белка наблюдается снижение количества большой субчастицы рибосомы, что свидетельствует о проблемах со сборкой 39S субчастицы или её стабильностью. Как следствие - снижение эффективности митохондриальной трансляции, активности дыхательной цепи, роста в среде с галактозой [60]. Интересно, что MRM2 взаимодействует с GTPBP5 (MTG2), являющимся гомологом бактериального ObgE, и при его инактивации уменьшается степень метилирования U1369 [49]. У человека мутация в белке, приводящая к нефункциональному белку, вызывает синдром MELAS (Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes), что лишний раз показывает важность данного белка для правильного функционирования митохондрий [62].

Gm1370

Данный нуклеотид находится ещё ближе к пептидному тоннелю в рибосоме, а основание контактирует с 3'-ССА-концом тРНК, находящейся в A-сайте.

Эквивалентный нуклеотид не модифицируется в рибосомах бактерий и митохондриях дрожжей, но метилируется в цитоплазматических рибосомах дрожжей и млекопитающих [43]. Несмотря на отсутствие метилирования у бактерий, данный нуклеотид (G2553) важен, и при его заменах на любой другой происходит замедление роста и рибосомы становятся неспособны взаимодействовать с тРНК [52].

За метилирование G1370 в ^S^P^^ человека ответственен белок MRM3. Было показано, что MRM3 локализуется в митохондриях. На сахарозных градиентах он мигрирует вместе с нуклеоидом и с большой субчастицей миторибосомы [48,60]. При иммунопреципитации данного белка помимо белков большой субчастицы совыделяются РНК-шапероны (например p32/C1QBP, LRPPRC и GRSF1), факторы сборки MTERF3, DDX28 и псевдоуридинсинтаза RPUSD4 16S мт-рРНК [48]. Нокдаун гена данного белка приводит к накоплению интермедиата сборки большой субчастицы миторибосомы, что заметно по сахарозным градиентам [60], и как следствие - снижение эффективности трансляции [48,60], активности дыхательных комплексов и замедленному росту и в среде с глюкозой, и в среде с галактозой [60]. Все эти данные говорят о том, что мишенью MRM3 является интермедиат сборки 39S субчастицы, и что его присутствие или активность важны для правильной сборки рибосомы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лаптев Иван Георгиевич, 2021 год

Список литературы

1. Polikanov Y.S. et al. Structural insights into the role of rRNA modifications in protein synthesis and ribosome assembly // Nat Struct Mol Biol. 2015. Vol. 22, № 4. P. 342-344.

2. Sloan K.E. et al. Tuning the ribosome: The influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function // RNA Biology. 2017. Vol. 14, № 9. P. 1138-1152.

3. Bohnsack M.T., Sloan K.E. The mitochondrial epitranscriptome: the roles of RNA modifications in mitochondrial translation and human disease // Cell. Mol. Life Sci. 2018. Vol. 75, № 2. P. 241-260.

4. Kimura S., Suzuki T. Fine-tuning of the ribosomal decoding center by conserved methyl-modifications in the Escherichia coli 16S rRNA // Nucleic Acids Research. 2010. Vol. 38, № 4. P. 1341-1352.

5. Smith A.C., Robinson A.J. MitoMiner v3.1, an update on the mitochondrial proteomics database // Nucleic Acids Res. 2016. Vol. 44, № D1. P. D1258-D1261.

6. Calvo S.E., Clauser K.R., Mootha V.K. MitoCarta2.0: an updated inventory of mammalian mitochondrial proteins // Nucleic Acids Res. 2016. Vol. 44, № D1. P. D1251-D1257.

7. Nordlund M.E. et al. Identification of the TRM2 gene encoding the tRNA(m5U54)methyltransferase of Saccharomyces cerevisiae // RNA. 2000. Vol. 6, № 6. P. 844-860.

8. Sagan L. On the Origin of Mitosing Cells // J. Theoret. Biol. 1967. № 14. P. 225274.

9. Burger G., Gray M.W., Franz Lang B. Mitochondrial genomes: anything goes // Trends in Genetics. 2003. Vol. 19, № 12. P. 709-716.

10. Morozov Y.I. et al. A novel intermediate in transcription initiation by human mitochondrial RNA polymerase // Nucleic Acids Research. 2014. Vol. 42, № 6. P. 3884-3893.

11. Zollo O., Tiranti V., Sondheimer N. Transcriptional requirements of the distal heavy-strand promoter of mtDNA // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2012. Vol. 109, № 17. P. 6508-6512.

12. Rackham O. et al. Long noncoding RNAs are generated from the mitochondrial genome and regulated by nuclear-encoded proteins // RNA. 2011. Vol. 17, №2 12. P. 2085-2093.

13. Barshad G. et al. Mitochondrial DNA Transcription and Its Regulation: An Evolutionary Perspective // Trends in Genetics. 2018. Vol. 34, № 9. P. 682-692.

14. Temperley R. et al. Hungry Codons Promote Frameshifting in Human Mitochondrial Ribosomes // Science. 2010. Vol. 327, № 5963. P. 301-301.

15. Ojala D., Montoya J., Attardi G. tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria // Nature. 1981. Vol. 290, № 5806. P. 470-474.

16. Rossmanith W. et al. Human mitochondrial tRNA processing // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, № 21. P. 12885-12891.

17. Brzezniak L.K. et al. Involvement of human ELAC2 gene product in 3' end processing of mitochondrial tRNAs // RNA Biology. 2011. Vol. 8, №2 4. P. 616-626.

18. Temperley R.J. Investigation of a pathogenic mtDNA microdeletion reveals a translation-dependent deadenylation decay pathway in human mitochondria // Human Molecular Genetics. 2003. Vol. 12, № 18. P. 2341-2348.

19. Slomovic S., Schuster G. Exonucleases and endonucleases involved in polyadenylation-assisted RNA decay // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011. Vol. 2, № 1. P. 106-123.

20. Rorbach J. et al. Polyadenylation in Bacteria and Organelles // Polyadenylation / ed. Rorbach J., Bobrowicz A.J. Totowa, NJ: Humana Press, 2014. Vol. 1125. P. 211227.

21. Suzuki T., Nagao A., Suzuki T. Human Mitochondrial tRNAs: Biogenesis, Function, Structural Aspects, and Diseases // Annu. Rev. Genet. 2011. Vol. 45, № 1. P. 299329.

22. Greber B.J., Ban N. Structure and Function of the Mitochondrial Ribosome // Annu. Rev. Biochem. 2016. Vol. 85, № 1. P. 103-132.

23. Yusupova G., Yusupov M. High-Resolution Structure of the Eukaryotic 80S Ribosome // Annu. Rev. Biochem. 2014. Vol. 83, № 1. P. 467-486.

24. Greber B.J. et al. The complete structure of the 55S mammalian mitochondrial ribosome // Science. 2015. Vol. 348, № 6232. P. 303-308.

25. Amunts A. et al. The structure of the human mitochondrial ribosome // Science. 2015. Vol. 348, № 6230. P. 95-98.

26. Brown A. et al. Structures of the human mitochondrial ribosome in native states of assembly // Nat Struct Mol Biol. 2017. Vol. 24, № 10. P. 866-869.

27. Amunts A. et al. Structure of the Yeast Mitochondrial Large Ribosomal Subunit. 2014. Vol. 343. P. 6.

28. Desai N. et al. The structure of the yeast mitochondrial ribosome // Science. 2017. Vol. 355, № 6324. P. 528-531.

29. Hamilton M.G., O'Brien T.W. Ultracentrifugal characterization of the mitochondrial ribosome and subribosomal particles of bovine liver. Molecular size and composition // Biochemistry. 1974. Vol. 13, № 26. P. 5400-5403.

30. Schieber G.L., O'Brien T.W. Extraction of proteins from the large subunit of bovine mitochondrial ribosomes under nondenaturing conditions // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257, № 15. P. 8781-8787.

31. Suzuki T. et al. Proteomic analysis of the mammalian mitochondrial ribosome. Identification of protein components in the 28 S small subunit // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 35. P. 33181-33195.

32. Suzuki T. et al. Structural compensation for the deficit of rRNA with proteins in the mammalian mitochondrial ribosome. Systematic analysis of protein components of the large ribosomal subunit from mammalian mitochondria // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 24. P. 21724-21736.

33. Gaur R. et al. A single mammalian mitochondrial translation initiation factor functionally replaces two bacterial factors // Mol. Cell. 2008. Vol. 29, № 2. P. 180190.

34. Ayyub S.A., Varshney U. Translation initiation in mammalian mitochondria- a prokaryotic perspective // RNA Biology. 2020. Vol. 17, № 2. P. 165-175.

35. Kummer E. et al. Unique features of mammalian mitochondrial translation initiation revealed by cryo-EM // Nature. 2018. Vol. 560, № 7717. P. 263-267.

36. Mays J.-N. et al. The mitoribosome-specific protein mS38 is preferentially required for synthesis of cytochrome c oxidase subunits // Nucleic Acids Res. 2019. Vol. 47, № 11. P. 5746-5760.

37. Brown A. et al. Structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria // Science. 2014. Vol. 346, № 6210. P. 718-722.

38. Greber B.J. et al. The complete structure of the large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome // Nature. 2014. Vol. 515, № 7526. P. 283-286.

39. Bogdanov A.A. et al. Structure and function of 5S rRNA in the ribosome // Biochem. Cell Biol. 1995. Vol. 73, № 11-12. P. 869-876.

40. Rorbach J. et al. Human mitochondrial ribosomes can switch their structural RNA composition // Proc Natl Acad Sci USA. 2016. Vol. 113, № 43. P. 12198-12201.

41. Chrzanowska-Lightowlers Z., Rorbach J., Minczuk M. Human mitochondrial ribosomes can switch structural tRNAs - but when and why? // RNA Biology. 2017. Vol. 14, № 12. P. 1668-1671.

42. Ott M., Herrmann J.M. Co-translational membrane insertion of mitochondrially encoded proteins // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 2010. Vol. 1803, № 6. P. 767-775.

43. Sergiev P.V. et al. Structural and evolutionary insights into ribosomal RNA methylation // Nat Chem Biol. 2018. Vol. 14, № 3. P. 226-235.

44. Lovgren J.M., Wikstrom P.M. The rlmB Gene Is Essential for Formation of Gm2251 in 23S rRNA but Not for Ribosome Maturation in Escherichia coli // Journal of Bacteriology. 2001. Vol. 183, № 23. P. 6957-6960.

45. Sirum-Connolly K., Mason T. Functional requirement of a site-specific ribose methylation in ribosomal RNA // Science. 1993. Vol. 262, № 5141. P. 1886-1889.

46. Sirum-Connolly K. et al. Implications of a functional large ribosomal RNA with only three modified nucleotides // Biochimie. 1995. Vol. 77, № 1. P. 30-39.

47. Lee K.-W., Bogenhagen D.F. Assignment of 2'-0-Methyltransferases to Modification Sites on the Mammalian Mitochondrial Large Subunit 16 S Ribosomal RNA (rRNA) // J. Biol. Chem. 2014. Vol. 289, № 36. P. 24936-24942.

48. Lee K.-W. et al. Mitochondrial Ribosomal RNA (rRNA) Methyltransferase Family Members Are Positioned to Modify Nascent rRNA in Foci near the Mitochondrial DNA Nucleoid // J. Biol. Chem. 2013. Vol. 288, № 43. P. 31386-31399.

49. Maiti P. et al. Human GTPBP5 (MTG2) fuels mitoribosome large subunit maturation by facilitating 16S rRNA methylation // Nucleic Acids Research. 2020. Vol. 48, № 14. P. 7924-7943.

50. Caldas T. et al. The FtsJ/RrmJ Heat Shock Protein of Escherichia coli Is a 23 S Ribosomal RNA Methyltransferase // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 22. P. 16414-16419.

51. Bügl H. et al. RNA Methylation under Heat Shock Control // Molecular Cell. 2000. Vol. 6, № 2. P. 349-360.

52. Kim D.F., Green R. Base-Pairing between 23S rRNA and tRNA in the Ribosomal A Site // Molecular Cell. 1999. Vol. 4, № 5. P. 859-864.

53. Arai T. et al. Single methylation of 23S rRNA triggers late steps of 50S ribosomal subunit assembly // Proc Natl Acad Sci USA. 2015. Vol. 112, № 34. P. E4707-E4716.

54. Tan J., Jakob U., Bardwell J.C.A. Overexpression of Two Different GTPases Rescues a Null Mutation in a Heat-Induced rRNA Methyltransferase // Journal of Bacteriology. 2002. Vol. 184, № 10. P. 2692-2698.

55. Hwang J., Inouye M. The tandem GTPase, Der, is essential for the biogenesis of 50S ribosomal subunits in Escherichia coli // Mol Microbiol. 2006. Vol. 61, № 6. P. 1660-1672.

56. Feng B. et al. Structural and Functional Insights into the Mode of Action of a Universally Conserved Obg GTPase // PLoS Biol / ed. Petsko G.A. 2014. Vol. 12, № 5. P. e1001866.

57. Kobayashi G., Moriya S., Wada C. Deficiency of essential GTP-binding protein ObgE in Escherichia coli inhibits chromosome partition: GTP-binding protein ObgE in E. coli // Molecular Microbiology. 2001. Vol. 41, № 5. P. 1037-1051.

58. Pintard L. MRM2 encodes a novel yeast mitochondrial 21S rRNA methyltransferase // The EMBO Journal. 2002. Vol. 21, № 5. P. 1139-1147.

59. Datta K., Fuentes J.L., Maddock J.R. The Yeast GTPase Mtg2p Is Required for Mitochondrial Translation and Partially Suppresses an rRNA Methyltransferase Mutant, mrm2 // MBoC. 2005. Vol. 16, № 2. P. 954-963.

60. Rorbach J. et al. MRM2 and MRM3 are involved in biogenesis of the large subunit of the mitochondrial ribosome // MBoC / ed. Wolin S. 2014. Vol. 25, № 17. P. 25422555.

61. Ching Y.-P. et al. Identification and Characterization of FTSJ2, a Novel Human Nucleolar Protein Homologous to Bacterial Ribosomal RNA Methyltransferase // Genomics. 2002. Vol. 79, № 1. P. 2-6.

62. Garone C. et al. Defective mitochondrial rRNA methyltransferase MRM2 causes MELAS-like clinical syndrome // Human Molecular Genetics. 2017. Vol. 26, № 21. P. 4257-4266.

63. Chujo T., Suzuki T. Trmt61B is a methyltransferase responsible for 1-methyladenosine at position 58 of human mitochondrial tRNAs // RNA. 2012. Vol. 18, № 12. P. 2269-2276.

64. Robertus J.D. et al. Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 Â resolution // Nature. 1974. Vol. 250. P. 546-551.

65. Basavappa R., Sigler P.B. The 3 A crystal structure of yeast initiator tRNA: functional implications in initiator/elongator discrimination. // The EMBO Journal. 1991. Vol. 10, № 10. P. 3105-3111.

66. Bar-Yaacov D. et al. Mitochondrial 16S rRNA Is Methylated by tRNA Methyltransferase TRMT61B in All Vertebrates // PLOS Biology / ed. Dinman J.D. 2016. Vol. 14, № 9. P. e1002557.

67. Li X. et al. Base-Resolution Mapping Reveals Distinct m1A Methylome in Nuclear-and Mitochondrial-Encoded Transcripts // Molecular Cell. 2017. Vol. 68, № 5. P. 993-1005.e9.

68. Conrad J. et al. The rluC Gene of Escherichia coli Codes for a Pseudouridine Synthase That Is Solely Responsible for Synthesis of Pseudouridine at Positions 955, 2504, and 2580 in 23 S Ribosomal RNA // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, № 29. P. 18562-18566.

69. Huang L. et al. Identification of Two Escherichia coli Pseudouridine Synthases That Show Multisite Specificity for 23S RNA t // Biochemistry. 1998. Vol. 37, № 45. P. 15951-15957.

70. Ansmant I. et al. Identification of the Saccharomyces cerevisiae RNA:pseudouridine synthase responsible for formation of Y2819 in 21S mitochondrial ribosomal RNA. P. 6.

71. Antonicka H. et al. A pseudouridine synthase module is essential for mitochondrial protein synthesis and cell viability // EMBO Rep. 2017. Vol. 18, № 1. P. 28-38.

72. Arroyo J.D. et al. A Genome-wide CRISPR Death Screen Identifies Genes Essential for Oxidative Phosphorylation // Cell Metabolism. 2016. Vol. 24, № 6. P. 875-885.

73. Zaganelli S. et al. The Pseudouridine Synthase RPUSD4 Is an Essential Component of Mitochondrial RNA Granules // J. Biol. Chem. 2017. Vol. 292, № 11. P. 45194532.

74. Andersen N.M., Douthwaite S. YebU is a m5C Methyltransferase Specific for 16 S rRNA Nucleotide 1407 // Journal of Molecular Biology. 2006. Vol. 359, № 3. P. 777-786.

75. Demirci H. et al. Multi-site-specific 16S rRNA methyltransferase RsmF from Thermus thermophilus // RNA. 2010. Vol. 16, № 8. P. 1584-1596.

76. Metodiev M.D. et al. NSUN4 Is a Dual Function Mitochondrial Protein Required for Both Methylation of 12S rRNA and Coordination of Mitoribosomal Assembly // PLoS Genet / ed. Barsh G.S. 2014. Vol. 10, № 2. P. e1004110.

77. Bohnsack K., Höbartner C., Bohnsack M. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease // Genes. 2019. Vol. 10, № 2. P. 102.

78. Yakubovskaya E. et al. Structure of the Essential MTERF4:NSUN4 Protein Complex Reveals How an MTERF Protein Collaborates to Facilitate rRNA Modification // Structure. 2012. Vol. 20, № 11. P. 1940-1947.

79. Cámara Y. et al. MTERF4 Regulates Translation by Targeting the Methyltransferase NSUN4 to the Mammalian Mitochondrial Ribosome // Cell Metabolism. 2011. Vol. 13, № 5. P. 527-539.

80. Helser T.L., Davies J.E., Dahlberg J.E. Mechanism of kasugamycin resistance in Escherichia coli // Nature New Biology. 1972. Vol. 235.

81. Sparling P.F. Kasugamycin Resistance: 30S Ribosomal Mutation with an Unusual Location on the Escherichia coli Chromosome // Science. 1970. Vol. 167, № 3914. P. 56-58.

82. Helser T.L., Davies J.E. Change in Methylation of 16S Ribosomal RNA Associated with Mutation to Kasugamycin Resistance in Escherichia coli // Nature New Biology. 1971. Vol. 233. P. 12-14.

83. Van Buul C.P.J.J., Damm J.B.L., Van Knippenberg P.H. Kasugamycin resistant mutants of Bacillus stearothermophilus lacking the enzyme for the methylation of two adjacent adenosines in 16S ribosomal RNA // Molec. Gen. Genet. 1983. Vol. 189, № 3. P. 475-478.

84. Poldermans B., Goosen N., Knippenberg P.H.V. Studies on the function of two adjacent N6,N6-dimethyladenosines near the 3' end of 16 S ribosomal RNA of Escherichia coli. I. The effect of kasugamycin on initiation of protein synthesis. // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254, № 18. P. 9085-9089.

85. Cunningham P.R. et al. Site-specific mutation of the conserved m62 A m62 A residues of E. coli 16S ribosomal RNA. Effects on ribosome function and activity of the ksgA methyltransferase // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1990. Vol. 1050, № 1-3. P. 18-26.

86. Formenoy L. et al. Methylation of the conserved A1518-A1519 in Escherichia coli 16S ribosomal RNA by the ksgA methyltransferase is influenced by methylations around the similarly conserved U1512.G1523 base pair in the 3' terminal hairpin // Biochimie. 1994. Vol. 76, № 12. P. 1123-1128.

87. Xu Z. et al. A conserved rRNA methyltransferase regulates ribosome biogenesis // Nat Struct Mol Biol. 2008. Vol. 15, № 5. P. 534-536.

88. Connolly K., Rife J.P., Culver G. Mechanistic insight into the ribosome biogenesis functions of the ancient protein KsgA // Molecular Microbiology. 2008. Vol. 70, № 5. P. 1062-1075.

89. Boehringer D. et al. Structural Insights into Methyltransferase KsgA Function in 30S Ribosomal Subunit Biogenesis // J. Biol. Chem. 2012. Vol. 287, № 13. P. 1045310459.

90. Pletnev P. et al. Comprehensive Functional Analysis of Escherichia coli Ribosomal RNA Methyltransferases // Front. Genet. 2020. Vol. 11. P. 97.

91. Lafontaine D. et al. The DIM1 Gene Responsible for the Conserved m62Am62A Dimethylation in the 3'-Terminal Loop of 18 S rRNA is Essential in Yeast // Journal of Molecular Biology. 1994. Vol. 241, № 3. P. 492-497.

92. Zorbas C. et al. The human 18S rRNA base methyltransferases DIMT1L and WBSCR22-TRMT112 but not rRNA modification are required for ribosome biogenesis // MBoC / ed. Wolin S. 2015. Vol. 26, № 11. P. 2080-2095.

93. Seidel-Rogol B.L., McCulloch V., Shadel G.S. Human mitochondrial transcription factor B1 methylates ribosomal RNA at a conserved stem-loop // Nat Genet. 2003. Vol. 33, № 1. P. 23-24.

94. Liu X. et al. Structural insights into dimethylation of 12S rRNA by TFB1M: indispensable role in translation of mitochondrial genes and mitochondrial function // Nucleic Acids Research. 2019. P. gkz505.

95. Falkenberg M. et al. Mitochondrial transcription factors B1 and B2 activate transcription of human mtDNA // Nat Genet. 2002. Vol. 31, № 3. P. 289-294.

96. McCulloch V., Shadel G.S. Human Mitochondrial Transcription Factor B1 Interacts with the C-Terminal Activation Region of h-mtTFA and Stimulates Transcription

Independently of Its RNA Methyltransferase Activity // Molecular and Cellular Biology. 2003. Vol. 23, № 16. P. 5816-5824.

97. Cotney J., Wang Z., Shadel G.S. Relative abundance of the human mitochondrial transcription system and distinct roles for h-mtTFB1 and h-mtTFB2 in mitochondrial biogenesis and gene expression // Nucleic Acids Research. 2007. Vol. 35, № 12. P. 4042-4054.

98. Surovtseva Y.V., Shadel G.S. Transcription-independent role for human mitochondrial RNA polymerase in mitochondrial ribosome biogenesis // Nucleic Acids Research. 2013. Vol. 41, № 4. P. 2479-2488.

99. Metodiev M.D. et al. Methylation of 12S rRNA Is Necessary for In Vivo Stability of the Small Subunit of the Mammalian Mitochondrial Ribosome // Cell Metabolism. 2009. Vol. 9, № 4. P. 386-397.

100. Sharoyko V.V. et al. Loss of TFB1M results in mitochondrial dysfunction that leads to impaired insulin secretion and diabetes // Human Molecular Genetics. 2014. Vol. 23, № 21. P. 5733-5749.

101. Benchling | CRISPR Guide Design Software [Electronic resource] // Benchling. URL: https://www.benchling.com/crispr/ (accessed: 27.08.2020).

102. Kowarz E., Löscher D., Marschalek R. Optimized Sleeping Beauty transposons rapidly generate stable transgenic cell lines // Biotechnology Journal. 2015. Vol. 10, № 4. P. 647-653.

103. Bond S.R., Naus C.C. RF-Cloning.org: an online tool for the design of restriction-free cloning projects // Nucleic Acids Research. 2012. Vol. 40, № W1. P. W209-W213.

104. Aibara S. et al. Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells // JoVE. 2018. № 140. P. 57877.

105. Reschke M. et al. Characterization and Analysis of the Composition and Dynamics of the Mammalian Riboproteome // Cell Reports. 2013. Vol. 4, № 6. P. 1276-1287.

106. Vaudel M. et al. SearchGUI: An open-source graphical user interface for simultaneous OMSSA and X!Tandem searches // Proteomics. 2011. Vol. 11, № 5. P. 996-999.

107. Bantscheff M. et al. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review // Anal Bioanal Chem. 2007. Vol. 389, № 4. P. 1017-1031.

108. Fernández-Silva P. et al. In Vivo and In Organello Analyses of Mitochondrial Translation // Methods in Cell Biology. Elsevier, 2007. Vol. 80. P. 571-588.

109. Zhang J. et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells // Nat Protoc. 2012. Vol. 7, № 6. P. 1068-1085.

110. Baer R.J., Dubin D.T. Methylated regions of hamster mitochondrial ribosomal RNA: structural and functional correlates // Nucl Acids Res. 1981. Vol. 9, № 2. P. 323337.

111. Björk G.R., Isaksson L.A. Isolation of mutants of Escherichia coli lac king 5-methyluracil in transfer ribonucleic acid or 1-methylguanine in ribosomal RNA // J. Mol. Biol. 1970. Vol. 51, № 1. P. 83-100.

112. Hopper A.K. et al. Defects in modification of cytoplasmic and mitochondrial transfer RNAs are caused by single nuclear mutations // Cell. 1982. Vol. 28, № 3. P. 543-550.

113. Carter J.-M. et al. FICC-Seq: a method for enzyme-specified profiling of methyl-5-uridine in cellular RNA // Nucleic Acids Research. 2019. Vol. 47, № 19. P. e113-e113.

114. Golovina A.Y. et al. The yfiC gene of E. coli encodes an adenine-N6 methyltransferase that specifically modifies A37 of tRNA1Val(cmo5UAC) // RNA. 2009. Vol. 15, № 6. P. 1134-1141.

115. Golovina A.Y. et al. The last rRNA methyltransferase of E. coli revealed: The yhiR gene encodes adenine-N6 methyltransferase specific for modification of A2030 of 23S ribosomal RNA // RNA. 2012. Vol. 18, № 9. P. 1725-1734.

116. Chen H. et al. The human mitochondrial 12S rRNA m 4 C methyltransferase METTL15 is required for mitochondrial function // J. Biol. Chem. 2020. Vol. 295, № 25. P. 8505-8513.

117. Haute L.V. et al. METTL15 introduces N4-methylcytidine into human mitochondrial 12S rRNA and is required for mitoribosome biogenesis // Nucleic Acids Research. 2019. Vol. 47, № 19. P. 10267-10281.

118. Juhling F. et al. tRNAdb 2009: compilation of tRNA sequences and tRNA genes // Nucleic Acids Research. 2009. Vol. 37, № Database. P. D159-D162.

119. Siibak T., Remme J. Subribosomal particle analysis reveals the stages of bacterial ribosome assembly at which rRNA nucleotides are modified // RNA. 2010. Vol. 16, № 10. P. 2023-2032.

120. Sharma S., Lafontaine D.L.J. 'View From A Bridge': A New Perspective on Eukaryotic rRNA Base Modification // Trends in Biochemical Sciences. 2015. Vol. 40, № 10. P. 560-575.

121. Ero R. et al. Identification of pseudouridine methyltransferase in Escherichia coli // RNA. 2008. Vol. 14, № 10. P. 2223-2233.

122. Rozanska A. et al. The human RNA-binding protein RBFA promotes the maturation of the mitochondrial ribosome // Biochem. J. 2017. Vol. 474, № 13. P. 2145-2158.

123. Ott M., Amunts A., Brown A. Organization and Regulation of Mitochondrial Protein Synthesis // Annual Review of Biochemistry. 2016. Vol. 85, № 1. P. 77-101.

124. Powell C.A., Minczuk M. TRMT2B is responsible for both tRNA and rRNA m 5 U-methylation in human mitochondria // RNA Biology. 2020. Vol. 17, № 4. P. 451462.

125. Johansson M.J.O., Byström A.S. Dual function of the tRNA(m5U54)methyltransferase in tRNA maturation // RNA. 2002. Vol. 8, № 3. P. 324-335.

126. Suzuki T., Suzuki T. A complete landscape of post-transcriptional modifications in mammalian mitochondrial tRNAs // Nucleic Acids Research. 2014. Vol. 42, № 11. P. 7346-7357.

127. Boccaletto P. et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update // Nucleic Acids Research. 2018. Vol. 46, № D1. P. D303-D307.

128. Korostelev A. et al. Crystal Structure of a 70S Ribosome-tRNA Complex Reveals Functional Interactions and Rearrangements // Cell. 2006. Vol. 126, № 6. P. 10651077.

129. Schuwirth B.S. et al. Structures of the Bacterial Ribosome at 3.5 Ä Resolution // Science. 2005. Vol. 310, № 5749. P. 827-834.

130. Maden B.E.H., Wakeman J.A. Pseudouridine distribution in mammalian 18 S ribosomal RNA. A major cluster in the central region of the molecule // Biochem. J. 1988. Vol. 249, № 2. P. 459-464.

131. Davis D.R. Stabilization of RNA stacking by pseudouridine // Nucl Acids Res. 1995. Vol. 23, № 24. P. 5020-5026.

132. The RIKEN Genome Exploration Research Group Phase II Team and the FANTOM Consortium. Functional annotation of a full-length mouse cDNA collection // Nature. 2001. Vol. 409, № 6821. P. 685-690.

133. Wei Y. et al. Crystal and solution structures of methyltransferase RsmH provide basis for methylation of C1402 in 16S rRNA // Journal of Structural Biology. 2012. Vol. 179, № 1. P. 29-40.

134. Kowalak J.A. et al. Identities and Phylogenetic Comparisons of Posttranscriptional Modifications in 16 S Ribosomal RNA from Haloferax volcanii // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 32. P. 24484-24489.

135. Piekna-Przybylska D., Decatur W.A., Fournier M.J. The 3D rRNA modification maps database: with interactive tools for ribosome analysis // Nucleic Acids Research. 2007. Vol. 36, № Database. P. D178-D183.

136. Christian B.E., Spremulli L.L. Mechanism of protein biosynthesis in mammalian mitochondria // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 2012. Vol. 1819, № 9-10. P. 1035-1054.

137. Londei P. Evolution of translational initiation: new insights from the archaea // FEMS Microbiol Rev. 2005. Vol. 29, № 2. P. 185-200.

138. Akbergenov R. et al. Mutant MRPS5 affects mitoribosomal accuracy and confers stress-related behavioral alterations // EMBO Rep. 2018. Vol. 19, № 11.

139. Mai N., Chrzanowska-Lightowlers Z.M.A., Lightowlers R.N. The process of mammalian mitochondrial protein synthesis // Cell Tissue Res. 2017. Vol. 367, № 1. P. 5-20.

140. Lafontaine D., Vandenhaute J., Tollervey D. The 18S rRNA dimethylase Dimlp is required for pre-ribosomal RNA processing in yeast. // Genes Dev. 1995. Vol. 9, № 20. P. 2470-2481.

141. Meyer B. et al. The Bowen-Conradi syndrome protein Nep1 (Emg1) has a dual role in eukaryotic ribosome biogenesis, as an essential assembly factor and in the methylation of 191 in yeast 18S rRNA // Nucleic Acids Research. 2011. Vol. 39, № 4. P. 1526-1537.

142. Dammel C.S., Noller H.F. Suppression of a cold-sensitive mutation in 16S rRNA by overexpression of a novel ribosome-binding factor, RbfA. // Genes & Development. 1995. Vol. 9, № 5. P. 626-637.

143. Xia B. et al. The Role of RbfA in 16S rRNA Processing and Cell Growth at Low Temperature in Escherichia coli // Journal of Molecular Biology. 2003. Vol. 332, № 3. P. 575-584.

144. Datta P.P. et al. Structural Aspects of RbfA Action during Small Ribosomal Subunit Assembly // Molecular Cell. 2007. Vol. 28, № 3. P. 434-445.

145. Connolly K., Culver G. Overexpression of RbfA in the absence of the KsgA checkpoint results in impaired translation initiation: Quality control of small subunit biogenesis // Molecular Microbiology. 2013. Vol. 87, № 5. P. 968-981.

Приложения

Рисунок 16. Хроматограммы сиквенсов для сайтов нецелевой гибридизации для гРНК Mettl15. WT -клетки дикого типа, AMettl15_1 и AMettl15_2 - линии с инактивированным геном Mettl15. Номера сайтов указаны как в табл. 3.

Рисунок 17. Хроматограммы сиквенсов для сайтов неспецифической гибридизации для гРНК Trmt2b. WT - клетки дикого типа, ДTrmt2b_1 и ДTrmt2b_2 - линии с инактивированным геном Trmt2b. Номера сайтов указаны как в табл. 2.

Рисунок 18. Расположение S-аденозилметионина (SAM) и консервативного D101 в структуре RsmH (PDBID 3TKA). Бирюзовым показана основная цепь белка и атомы улерода в белке, фиолетовым - атомы углерода в SAM, жёлтым - атомы серы, красным - атомы кислорода. Картинка сделана с помощью программы UCSF Chimera.

тРНК мт-тРНКО1п

РНКаза Т1

Режим линейный

Последовательность тРНК UAG4G4AUAAG4G4UG4UUUAG4G4UAG4CACG4G4AG4AAUUUUG4 AAUUCUUAAG4UG4UAG4G4UUCAAUUCCUAUUG4UCCUAG4CCA

Координаты Последовательность фрагмента Ожидаемая масса (Да)

Л5:О9 ЛИЛЛОр 1658

И13:О17 ииилар 1612

С22:О25 СЛСОр 1304

Л29:О35 ЛЛИИИИОр 2247

Л36:О45 ЛЛИИСИИЛЛОр 3211

U52:G65 UUCAAUUCCUAUUGp/ m5UUCAAUUCCUAUUGp 4411/ 4425

И66:О71 ИССИЛОр 1916

тРНК мт-тРНКЬеи(ИИЛ)

РНКаза А

Режим с использованием рефлектрона

Последовательность тРНК AU|U|AGGGU|GGC|AGAGC|C|AGGAAAU|U|GC|GU|AAG AC|U|U|AAAAC|C|U|U|GU|U|C|C|C|AGAGGU|U|C|AAA U|C|C|U|C|U|C|C|C|U|AAU|AC|C|A

Координаты Последовательность фрагмента Ожидаемая масса (Да)

Л4:И8 ЛОООИр 1689.2

Л12:С16 ЛОЛОСр 1672.3

Л18:И24 ЛООЛЛЛИр 2331.3

Л30:С34 ЛЛОЛСр 1656.3

Л37:С41 ЛЛЛЛСр 1640.3

A51:U56 AGAGGUp/ AGAGGm5Up 2018.3/ 2032.3

Л59:И62 ЛЛЛИр 1312.2

2000 2010 2020 2030 2040 2050 1640.5 ~ "" ~ - - _

13 1С WT )56.5 1672.5 1689.5 ......-............ -..... 2032.6 1 ,1 2331.7 1

13 1640 1( 12.5 ко 6 156.6 1672.6 1689.6 ч 20 1 Ж. 18.7 23. 31.8

1400 1600 1800 2000 2200

т/г

тРНК мт-тРНК8ег(ИСЛ)

РНКаза А

Режим линейный

Последовательность тРНК GAGAAAGAC|AU|AU|AGGAU|AU|GAGAU|U|GGCU|U|GA AAC|C|AAU|U|U|U|AGGGGGU|U|C|GAU|U|C|C|U|U|C| C|U|U|U|C|U|U|AC|C|A

Координаты Последовательность фрагмента Ожидаемая масса (Да)

ОЛОЛЛЛОЛСр 3005

ЛООЛИр 1673

ОЛОЛИр 1673

ОЛЛЛСр 1656

AGGGGGUp/ 2380/

AGGGGGm5Up 2394

О1:С9 Л14:И18 О21:И25 О32:С36

A44:U50

тРНК мт-тРНКТуг

РНКаза А

Режим с использованием рефлектрона

Последовательность тРНК GGU|AAAAU|GGC|U|GAGU|AAGC|AU|U|AGAC|U|GU|AA AU|C|U|AAAC|AC|AGAGGU|U|U|AAAU|C|C|U|C|U|U|U |U|U|AC|C|AC|C|A

Координаты Последовательность фрагмента Ожидаемая масса (Да)

Л4:И8 ЛЛЛЛИр 1641.2

О13:И16 ОЛОИр 1344.2

Л17:С20 ЛЛОСр 1327.2

Л24:С27 ЛОЛСр 1327.2

Л31:И34 ЛЛЛИр 1312.2

Л37:С40 ЛЛЛСр 1311.2

A43:U48 AGAGGUp/ AGAGGm5Up 2018.3/ 2032.3

Л51:И54 ЛЛЛИр 1312.2

тРНК мт-тРНКА8П

РНКаза А

Режим с использованием рефлектрона

Последовательность тРНК UjAGAUjUjGAAGCjCjAGUjAAUjAGGGUjAUjЩUjAGCjU |GU|U|AAC|U|AAAU|U|U|U|C|GU|AGGU|U|U|AAU|U|C| C|U|GC|C|AAU|C|U|AGC|C|A

Координаты Ожидаемая масса (Да) Последовательность фрагмента

А2:И5 1328.2 АОАИр

О7:С11 1672.3 ОААОСр

А19:И23 1689.2 АОООИр

А39:И42 1312.2 АААИр

А49:и52 1344.2/ 1358.2 АООир/ АООш5ир

тРНК мт-тРНКMet

РНКаза Т1

Режим линейный

Последовательность тРНК AG|UAAG| G|UCAG| CUAAUUAAG|CUAUCG|G|G|CCCAUA CCCCG|AAAACG|UUG|G|UUUAAAUCCUUCCCG|UACUAC CA

Координаты Ожидаемая масса (Да) Последовательность фрагмента

Ш:66

Ш^П

C12:020

C21:О26

C29:О39

A40:045

и50:064

Ш5:А72

1329

1305

2905

1916

3493

1986

4715/ 4729

2455

UAAGp UCAОp

CUAAUUAAОp CUAUCGp CCf5CAUACCCCОp AAAACОp

иииАААиССииСССОр/ ш5иииАААиССииСССОр

^ША^А

тРНК мт-тРИК^^^

РНКаза Т1

Режим линейный

Последовательность тРНК AAG|AAAG|AUUG|CAAG|AACUG|CUAAUUCAUG|CUUCC AUG| иии AAAAACAUG|G|CUUUCUUACCA

Координаты Последовательность Ожидаемая масса (Да)

А4:О7 AAAGp 1352

А8:О11 AUUGp 1306

C12:О15 CAAGp 1328

А16:С20 AACUGp 1634

C21:G30 CUAAUUCAUGp 3187

C31:О38 CUUm5CCAUGp 2541

Ш9:050 иииАААААСАиОр/ ш5иииАААААСАиОр 3869/ 3883

C52:A62 CUUUCUUACCA 3349

тРНК мт- тРНК11*

РНКаза А

Режим с использованием рефлектрона

Последовательность тРНК GU|C|U|U|GAU|AGU|AU|AAAC|AU|U|AC|U|C|U|GGЩC |U|U|GU|AAAC|C|U|GAAAU|GAAGAU|C|U|U|C|U|C|U| U|C|U|C|AAGAC|AC|C|A

Координаты Последовательность Ожидаемая масса (Да)

A14:C17 AAACp 1311.2

A34:C37 AAACp 1311.2

G40:U44 GAAAUp 1657.2

045:и50 ОААОАир/ ОААОАш5ир 2002.3/ 2016.3

А62^66 AAGACp 1656.3

тРНК мт-тРНК^

РНКаза А

Режим с использованием рефлектрона

Последовательность тРНК AAGAU|AU|U|AGU|AAAAU|C|AAU|U|AC|AU|AAC|ЩU| U|GU|C|AAAGU|U|AAAU|U|AU|AGAU|C|AAU|AAU|C|U| AU|AU|AU|C|U|U|AC|C|A

Координаты Последовательность Ожидаемая масса (Да)

А1:Ш А12:Ш6 A35:U39 A41:U44

А48:и51

AAGAUp

AAAAUp

AAAGUp

AAAUp

АОАир/ АОАш5ир

1657.2

1641.2

1657.2

1312.2

1328.2/ 1342.2

тРНК мт-тРНК°1у

РНКаза Т1

Режим линейный

Последовательность тРНК ACUCCCUUAGjUAUAAUUAAUAUAACUGjACUUCCAAUUA G|UAG|AUUCUG|AAUAAACCCAG|AAG|AG|AG|UACCA

Координаты Последовательность Ожидаемая масса (Да)

АШ10 ШШ27 А28^39 А43^48 ACUCCCUUAGp UAUAAUUAAUAUAA CUGp ACUUCCAAUUAGp AUUCUGp 3162 5446 3821 1917

A49:G59 AAUAAACCCAGp 3561

U67:A71 UACCA 1514

3563

U-U-C-A-A-U-U-C-C-A-C-C-U-U-U-C-Gp

WT

3563

U-U-C-A-A-U-U-C-C-A-C-C-U-U-U-C-Gp

mt-tRNAGly

КО

3450 3475 3500 3525 3550 3575 3600 3625 3650 3675

1515

1918

1516

1919

3258

3563

3563

3823

WT

5449

КО 5447

1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500

т/г

тРНК цитоплазматическая тРНКО1у

РНКаза Т1

Режим с использованием рефлектрона

Последовательность тРНК G|CG|UUG|G|UG|G|UAUAGUG|G|UG|AG|CAUAG|CUG|C CUUCCAAG|CAG|UUG|ACCCG|G|G|UUCG|AUUCCCG|G| CCAACG|CACCA

Координаты Последовательность Ожидаемая масса (Да)

И11:О15 ИАИАОр 1634.2

С23:О27 САИАОр 1633.2

С31:О39 ССИИССААОр 2854.5

А46:050 АСССОр 1608.2

и53:056 ШСОр/ ш5ШСОр 1281.1/ 1295.1

А57:О63 Ш1АииСССОр 2234.3

С65:070 ССААСОр

С71:А75 САССА

\л/т

1295.2 и-и-С-Ср

КО

1285 1290 1295 1300 1305 1310 1315 1320

1634.3

\Л/Т

1937.3

ко

1937.4

2234.4 I

А А._

2234.4 I

1400

1600

1800

2000

2200

т/т.

Рисунок 30. Процентное содержание белков и факторов сборки малой субчастицы (оценивалось по LFQ intensity каждого белка в отдельности) во фракциях градиентов малой субчастицы и рибосомы в различных клеточных линиях: А) NS0 дикого типа, Б) AMettl15, В) AMettl15+METTL15. (количество mS37 оценивалось по одному уникальному пептиду, поэтому считается недостоверным). Показаны среднее и стандартные отклонения для трёх технических реплик.