Новый синтетический низкомолекулярный ингибитор тромбина HC-019s-IOC. Исследование свойств in vitro и in vivo тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Суров, Степан Сергеевич

  • Суров, Степан Сергеевич
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2012, МоскваМосква
  • Специальность ВАК РФ03.01.02
  • Количество страниц 126
Суров, Степан Сергеевич. Новый синтетический низкомолекулярный ингибитор тромбина HC-019s-IOC. Исследование свойств in vitro и in vivo: дис. кандидат биологических наук: 03.01.02 - Биофизика. Москва. 2012. 126 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Суров, Степан Сергеевич

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления о гемостазе человека

1.1.1. Тромбоцитарное звено гемостаза

1.1.2. Плазменное звено гемостаза

1.1.3. Роль сосудистой стенки в гемостазе

1.1.4. Патологическое функционирование системы свёртывания крови: тромбоз

1.2. Тромбин как мишень антикоагулянтной терапии

1.2.1. Структура, функции и регуляция активности тромбина

1.2.2. Антитромботические средства

1.2.2.1. Антитромбоцитарная терапия

1.2.2.2. Антикоагулянтные средства

1.2.2.3. Ингибиторы активности тромбина: принципы и практика

1.3. Инфузионно-трансфузионная терапия кровопотери

1.3.1. Основные цели

1.3.2. Общие сведения о современных инфузионных растворах

1.3.3. Влияние плазмозамещающих растворов на систему гемостаза

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Компьютерный дизайн и синтез нового прямого низкомолекулярного ингибитора тромбина

2.2.2. Измерение ингибирующей активности соединения 19б по отношению к тромбину и фактору Ха

2.2.3. Определение типа ингибирования и кинетических констант для соединения 19б по отношению к тромбину

2.2.4. Устойчивость ингибитора в водных растворах

2.2.5. Устойчивость ингибитора в водных растворах

2.2.6. Определение стандартных времен свертывания

2.2.7. Измерение генерации тромбина

2.2.8. Измерение пространственной динамики роста сгустка (тромбодинамики)

2.2.9. Измерение острой токсичности ингибитора 19s

2.2.10. Исследование антикоагулянтных свойств ингибитора при внутривенном введении кроликам

2.2.11. Модель гемодилюции на крысах

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Исследования свойств нового синтетического низкомолекулярного ингибитора тромбина НС-019s-IOC in vitro

3.1.1. Изучение тромбин- и фХа-ингибирующей способности соединения HC-019s-IOC в буферном растворе

3.1.2. Определение типа ингибирования и кинетических констант для соединения 19s по отношению к тромбину

3.1.3. Влияние HC-019s-IOC на стандартные времена свёртывания

3.1.4. Влияние HC-019s-IOC на генерацию тромбина

3.1.5. Изучение антикоагулянтной активности 19s в плазме методом тромбодинамики

3.1.6. Устойчивость ингибитора в водных растворах

3.2. Исследования свойств нового синтетического низкомолекулярного ингибитора тромбина НС-019s-IOC in vivo

3.2.1 Исследование токсичности соединения 19s

3.2.2. Антикоагулянтные свойства ингибитора при его внутривенном введении кроликам

3.2.3. Модель гемодилюционной гиперкоагуляции при кровопотере на крысах

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биофизика», 03.01.02 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новый синтетический низкомолекулярный ингибитор тромбина HC-019s-IOC. Исследование свойств in vitro и in vivo»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Нарушения в системе свёртывания крови являются причиной более чем трети смертей при различных патологических состояниях: сердечнососудистых заболеваниях, травмах различной природы и хирургических операциях, сепсисе, ожогах, онкологических заболеваниях, заболеваниях, связанных с патологией гемостаза, и т.п. Возникающие при этом гиперкоагуляционные состояния способны приводить к тромбозам -патологическому свёртыванию крови различной локализации. Изменения, происходящие при функционировании стенок сосудов и в системе свёртывания крови и приводящие к тромбозам, не до конца изучены, однако понимание этих процессов необходимо для разработки и усовершенствования антитромботических средств.

В качестве основных направлений воздействия на систему гемостаза для предупреждения и лечения тромбозов можно выделить: применение ингибиторов сериновых протеиназ системы свёртывания; применение антагонистов витамина К, снижающих синтез печенью предшественников прокоагулянтных факторов системы свертывания; применение антитромбоцитарных препаратов, снижающих активацию и агрегацию тромбоцитов и препятствующих дальнейшему тромбообразованию; применение фибринолитических агентов.

В настоящее время в клинике используются, в основном, три антитромботических препарата: нефракционированный гепарин или его аналоги низкого молекулярного веса, оральный антикоагулянт варфарин (антагонист витамина К) и ингибитор активации тромбоцитов - аспирин. Эти лекарства имеют ограничения в применении и побочные эффекты, что лимитирует их использование и побуждает к поиску и разработке новых препаратов, не менее эффективных, но свободных от недостатков стандартных средств. Современные представления о гемостазе и тромбозе и

опыт использования антитромботических средств (антикоагулянтов, тромболитических и антитромбоцитарных агентов) говорят о том, что перспективной является разработка синтетических низкомолекулярных прямых ингибиторов тромбина, так как именно этот фермент является ключевым в системе свёртывания крови, а его повышенная активность способна приводить к тромбозам. Синтетические низкомолекулярные ингибиторы тромбина имеют целый ряд преимуществ перед антикоагулянтами, используемыми в клинике в настоящее время: это быстрота наступления действия, высокая эффективность, предсказуемая фармакокинетика, отсутствие необходимости постоянного мониторинга состояния гемостаза. На сегодняшний день в мире клинически используются только два таких ингибитора - вводимый внутривенно аргатробан и пероральный антикоагулянт (пролекарство) дабигатран этексилат. Ни один из них не лицензирован в России. Однако эти препараты также имеют ряд недостатков: аргатробан обладает низкой стабильностью и коротким временем жизни в плазме, что требует его частых инфузий для поддержания терапевтических концентраций; дабигатран этексилат может быть использован перорально, однако пока только для ограниченного числа патологий, кроме того, он имеет низкий процент биодоступности. Таким образом, поиск новых, эффективных и безопасных низкомолекулярных синтетических ингибиторов тромбина является весьма актуальной задачей современной фундаментальной науки и клинической медицины.

Цель работы

Ранее, в результате совместной работы нескольких институтов и лабораторий (Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Лаборатории физической биохимии ФГБУ Гематологический научный центр МЗСР РФ, Научно-исследовательского вычислительного центра МГУ им. М. В. Ломоносова, Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН), был осуществлён

компьютерный дизайн и синтез нового ряда синтетических низкомолекулярных ингибиторов тромбина. Цель настоящей работы состояла в исследовании функциональных свойств одного из новых ингибиторов (HC-019s-IOC), его способности оказывать антикоагуляционное действие как in vitro, так и in vivo.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Определить тип механизма ингибирования и параметры ингибирования тромбина под действием исследуемого соединения в чистой буферной системе (по влиянию на скорость гидролиза хромогенного субстрата).

2. Определить параметры антикоагулянтного действия данного соединения в плазме in vitro (в стандартных временах свертывания, а также в тестах генерации тромбина и тромбодинамики).

3. Оценить стабильность растворов исследуемого соединения при стерилизации автоклавированием и последующем длительном хранении.

4. Определить острую токсичность HC-019s-IOC (при внутрибрюшинном введении на мышах).

5. Исследовать антикоагулянтные свойств ингибитора в опытах in vivo при внутривенном введении кроликам и в модели гемодилюции при кровопотере у крыс.

Научная новизна работы

В работе впервые подробно экспериментально исследованы свойства нового низкомолекулярного синтетического прямого ингибитора тромбина HC-019s-IOC. Доказан конкурентный тип ингибирования и определена константа ингибирования тромбина в чистой системе. Показано, что данное соединение может являться эффективным антикоагулянтом в плазме как in vitro, так и в опытах in vivo.

Впервые разработана модель для изучения изменений свертывания при умеренной гемодилюции в ходе восполнения кровопотери (на крысах). С помощью этой модели показано, что умеренная гемодилюция in vivo физиологическим раствором вызывает состояние гиперкоагуляции, которое может быть успешно преодолено путем добавления в стандартный плазмозамещающий раствор ингибитора тромбина.

Все полученные результаты показывают, что исследованный новый ингибитор тромбина является перспективным для клинического применения, т.к. он более эффективен и стабилен, а также не более токсичен, чем применяемый в клинике аргатробан.

Научно-практическое значение

Научное значение данной работы состоит в разработке методики испытаний препаратов с целью исследования их возможного антитромботического действия. Кроме того, впервые показано, что умеренная гемодилюция in vivo стандартным плазмозамещающим раствором (ПЗР) может являться риск-фактором для развития гиперкоагуляции, и что этого можно избежать, добавляя в стандартные ПЗР ингибитор тромбина.

Практическое значение работы состоит в разработке отечественного препарата для лечения тромботических осложнений на основе нового ингибитора тромбина HC-019s-IC>C. Доклинические испытания показали, что данный ингибитор является перспективным для клинического применения и превосходит по своим параметрам применяемый в мировой практике аргатробан.

Положения, выносимые на защиту:

1. Исследуемое вещество - HC-019s-IOC - является высокоэффективным конкурентным ингибитором тромбина в буферной системе и практически не ингибирует фактор Ха.

2. HC-019s-IOC является эффективным антикоагулянтом в плазме in vitro: он удлиняет стандартные времена свертывания, снижает эндогенный тромбиновый потенциал и скорость пространственного роста сгустка пропорционально концентрации добавленного в плазму ингибитора.

3. Новый ингибитор имеет приемлемую острую токсичность.

4. Водные растворы ингибитора (в микромолярных концентрациях) способны переносить стерилизацию автоклавированием и оставаться стабильными при длительных временах хранения как при +4°С, так и при комнатной температуре.

5. Внутривенное введение HC-019s-IC)C кроликам оказывает антикоагулянтное действие (снижает эндогенный тромбиновый потенциал плазмы).

6. Восполнение умеренной (23%) кровопотери физиологическим раствором приводит к гиперкоагуляции у крыс; восполнение кровопотери физиологическим раствором, дополнительно содержащим HC-019s-IC)C, отменяет возникновение этой гиперкоагуляции.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления о гемостазе человека

Под термином «гемостаз» подразумевают, как правило, комплекс реакций организма, направленных на предупреждение и остановку кровотечений. Всякий раз при повреждении и разрыве сосуда развивается гемостаз, в котором участвуют несколько механизмов: (1) сужение сосуда; (2) образование тромбоцитарной пробки; (3) формирование кровяного сгустка в результате коагуляции крови; (4) врастание в кровяной сгусток фиброзной ткани, что окончательно закрывает место разрыва в сосуде. В целом, традиционно выделяют первичный - сосудисто-тромбоцитарный - и вторичный - плазменный - гемостаз.

При повреждении сосуда первым срабатывает первичный гемостаз -вазоконстрикция (резкое сужение сосуда) позволяет уменьшить объем крови, проходящей через место повреждения, а тромбоциты, активируясь и агрегируя на поврежденной поверхности за счет высвобождаемых из поврежденного эндотелия веществ, образуют рыхлый сгусток, предотвращающий потерю клеток крови, но не плазмы. Характерное время срабатывания этих систем составляет 15-20 секунд при серьезной травме сосудистой стенки и 1-2 минуты при незначительной [1]. На фоне этих событий развивается плазменное свёртывание, активирующееся при контакте крови с клетками, лежащими под эндотелием. Работа плазменного звена приводит к образованию плотного фибринового сгустка, полностью предотвращающего потерю крови. С течением времени происходит дальнейшее уплотнение сгустка (ретракция) и лизис тромба. Все компоненты гемостаза тесно связаны между собой - сосудистая стенка и тромбоциты предоставляют свои поверхности для проведения реакций свёртывания и секретируют вещества, регулирующие тромбообразование, а ключевой фермент системы свёртывания - тромбин - является мощным активатором

тромбоцитов и регулятором фибринолиза [2,3]. Рассмотрим процессы тромбоцитарного, плазменного и сосудистого гемостаза подробнее.

1.1.1. Тромбоцитарное звено гемостаза

Тромбоциты представляют собой безъядерные клетки крови, присутствующие в ней в концентрации 150000-300000 в 1 мкл. Они являются первой, а иногда и единственной (при незначительных травмах) защитой организма при повреждении сосуда [4]. Активация тромбоцитов представляет собой сложный процесс, в котором участвуют многочисленные вещества. Контакт тромбоцитов с рядом физиологических веществ - АДФ, тромбином, коллагеном, тромбоксаном А2, вазопрессином, адреналином, а также их механическое повреждение, активация системы комплемента, воздействие кальциевым ионофором приводят к драматическим изменениям в клетке: тромбоциты, в норме имеющие блюдцевидную форму, начинают увеличиваться в размере, принимают неправильную форму с множеством расходящихся псевдоподий, приобретают способность к адгезии и агрегации; их сократительные белки мощно сокращаются, способствуя выделению про-и антикоагулянтных веществ из содержащихся в тромбоцитах гранул, тромбоциты изменяют также состав своей мембраны, позволяя факторам свёртывания связываться и реагировать на ней, и отщепляют микровезикулы, способные поддерживать реакции свёртывания [2].

Разнообразие активаторов тромбоцитов и их сложные взаимодействия не до конца понятны, однако существующие данные позволяют построить примерную картину событий при повреждении сосуда [5,6]. Основными первоначальными активаторами тромбоцитов являются АДФ и коллаген. Первый выделяется при разрушении клеток, а второй обнажается из-под поврежденного эндотелия. АДФ является сравнительно слабым активатором и даже не может вызвать все виды секреции тромбоцита. Тем не менее, АДФ обеспечивает активацию тромбоцитов в потоке, их адгезию к коллагену и агрегацию. Это приводит к формированию первичного тромбоцитарного

тромба. Коллаген, а затем и тромбин, который вырабатывается плазменной системой свертывания, полностью активируют тромбоциты. Те, в свою очередь, секретируют АДФ и тромбоксан А2, вовлекая в процесс активации новые тромбоциты. Кроме того, коллаген и тромбин вызывают изменения в клеточной мембране, приводящие к связыванию факторов и ускорению реакций свертывания. Прочие активаторы тромбоцитов, такие как адреналин, не присутствуют в организме в количествах, способных вызвать активацию. Скорее всего, их роль заключается в базовой регуляции чувствительности гемостаза путем изменения порога активации тромбоцитов сильными активаторами [7].

Участие тромбоцитов в плазменном свёртывании осуществляется двумя основными способами - экспозиция прокоагулянтной поверхности и секреция альфа-гранул. В норме мембрана тромбоцитов не поддерживает реакций свёртывания, отрицательно заряженные фосфолипиды (в первую очередь, фосфатидилсерин) сосредоточены на внутренней стороне мембраны; такое неравновесное распределение фосфолипидов поддерживается за счет работы фермента аминофосфолипидной транслоказы. Активация тромбоцитов приводит к активации фермента скрамблазы, который быстро перебрасывает фосфолипиды с одной стороны мембраны на другую, что приводит к потере асимметрии мембраны за короткий промежуток времени [8]. Помимо фосфатидилсерина, тромбоциты при активации экспрессируют особые белки-рецепторы, способные специфически взаимодействовать с факторами свертывания. Факторы свертывания могут связываться с мембранами активированных тромбоцитов. Главным образом, это происходит благодаря их взаимодействию с фосфатидилсерином через кальциевые мостики, однако специфические белковые взаимодействия также могут вносить свой вклад [9]. Связывание факторов с тромбоцитами критично для свёртывания, так как это приводит к ускорению его ключевых реакций на 3-5 порядков.

Вторым механизмом действия тромбоцитов на свёртывание является секреция гранул. Тромбоциты содержат три вида гранул, для свертывания основными являются альфа-гранулы (а-гранулы) и плотные гранулы. Альфа-гранулы содержат высокомолекулярные вещества — фактор V, фактор фон Виллебранда, протеазу нексин 2, ингибитор протеина С и другие [10]. Плотные гранулы секретируют низкомолекулярные вещества, такие как АДФ, АТФ, остеонектин и другие [11]. Тромбоксан А2 не секретируется из гранул, а синтезируется при активации. В целом, содержание всех этих веществ внутри тромбоцитов невелико по сравнению с их содержанием в плазме. Однако внутри тромбоцитарного сгустка это соотношение может сильно меняться из-за высокой концентрации тромбоцитов в сгустке. Например, тромбоцитарный фактор V составляет суммарно только 20% от плазменного, но оценки показывают, что в тромбоцитарном сгустке его концентрация может быть в 300 раз больше, чем в плазме [12].

1.1.2. Плазменное звено гемостаза

Сама по себе тромбоцитарная пробка не является полноценной преградой для потери плазмы, а сжатие сосудов дает сравнительно слабый эффект, который способен остановить кровь только при небольших повреждениях, поэтому на фоне этих процессов начинает работать плазменная система свертывания. Плазменная система представляет собой совокупность белков, образующих сложный ферментативный каскад реакций [5]. Конечной целью этого каскада является формирование фибринового сгустка в месте повреждения стенки сосуда. Важно, что сгусток должен быть сформирован только при наличии повреждения и строго в месте этого повреждения: отклонения в работе системы свертывания крови как в сторону кровоточивости, так и в сторону повышенного тромбообразования ведут к серьезным нарушениям на уровне целого организма, вплоть до летального исхода.

В каскаде свертывания, наиболее существенные реакции которого представлены на рис.1, продукт каждой ферментативной реакции является катализатором для следующей реакции. На каждой стадии профермент (предшественник) превращается в соответствующий активный фермент (сериновую протеазу), который катализирует превращение следующего профермента в сериновую протеазу. Основные белки системы свертывания называются факторами свертывания и нумеруются римскими цифрами в историческом порядке их открытия, часть из них имеет собственные имена; приставка "а" к номеру фактора показывает, что он находится в активной форме.

/-ч пС

(VllaJ фермент | Va | кофактор ( Xlal ингибирование

© зимоген | V | прокофактор 0-активация

Рис. 1. Основные реакции плазменной системы свертывания крови. Активация факторов свёртывания и превращения под действием ферментативного катализа показаны красными и черными стрелками, соответственно. Ингибирование показано короткими пустыми стрелками. Условные обозначения: TF - тканевой фактор, римскими цифрами обозначены соответствующие факторы свертывания, II -протромбин, Па - тромбин, PC -протеин С, АРС - активированный протеин С. Два находящихся рядом обозначения факторов свертывания - комплекс, образованный этими факторами (например, VIIaTF -внешняя теназа, IXaVIIIa - внутренняя теназа , XaVa - протромбиназа). Связывание тромбина с тромбомодулином, активация и секреция тромбоцитов, контактная активация свертывания не показаны. Рисунок воспроизведен из [13]

В организме в норме активация свертывания идет по так называемому внешнему пути. Клетки практически всех тканей организма, за исключением эндотелиальных клеток, выстилающих сосуды, и клеток крови, экспрессируют трансмембранный гликопротеин - тканевый фактор (tissue factor, TF), являющийся инициатором активации свёртывания в организме. В норме TF не контактирует с кровью, однако любое повреждение эндотелия приводит к тому, что плазма вступает в контакт с клетками, несущими TF. В плазме постоянно присутствует фактор Vila - сериновая протеаза, которая сама по себе почти не обладает ферментативной активностью. Однако, когда фактор Vila связывается с TF, возникает комплекс внешней теназы, который обладает мощной ферментативной активностью и способен активировать факторы IX и X. Далее эти активные факторы диссоциируют от комплекса и посредством диффузии достигают фосфолипидных мембран субэндотелиальных клеток или активированных тромбоцитов. При этом фактор Ха связывается с протромбином, активируя его до тромбина -последнего и главного фермента в каскаде. Сами по себе реакции активации фактора X фактором 1Ха и протромбина фактором Ха протекают очень медленно. Однако небольшие количества тромбина, сделанные в этих реакциях, запускают петли положительных обратных связей, приводящие к взрывному образованию тромбина. В первую очередь, тромбин увеличивает количество внешней теназы путем активации фактора VII. Кроме того, тромбин активирует факторы VIII и V. Их активные формы являются кофакторами для факторов 1Ха и Ха, соответственно. Тромбин также активирует тромбоциты, что приводит к формированию комплексов 1Ха-VHIa (внутренняя теназа) и Xa-Va (протромбиназа) на их мембранах. Эти комплексы, собирающиеся в присутствии кальция, способны работать на 3-5 порядков быстрее, чем ферменты в отсутствие кофакторов. Кроме того, тромбин активирует фактор XI, который способен активировать фактор IX.

Тромбин также способен ингибировать свёртывание через путь протеина С. Активированный тромбином протеин С расщепляет и ингибирует факторы Va и Villa, приводя к инактивации комплексов внутренней теназы и протромбиназы.

Активация протеина С тромбином на несколько порядков ускоряется трансмембранным белком тромбомодулином, который присутствует в мембранах эндотелиальных клеток и связывает тромбин.

Действие протеина С усиливается его кофактором, протеином S. Он представляет собой белок, близкий по структуре к факторам IX, X, И, протеину С, но не способный активироваться и не обладающий ферментативной активностью. Протеин S ускоряет расщепление факторов Va и Villa. Фактор Va в составе протромбиназы защищен от ингибирования активированным протеином С, но протеин S снимает эту защиту.

В целом, все активные ферменты системы ингибируются присутствующими в плазме ингибиторами протеаз, основными из которых являются антитромбин III (AT III) и ингибитор пути тканевого фактора (tissue factor pathway inhibitor, TFPI). AT III — главный ингибитор тромбина, тогда как TFPI ингибирует внешнюю теназу по сложному Ха-зависимому механизму [14]. Кроме AT III и TFPI, в ингибировании факторов свертывания в разной степени участвуют а2-макроглобулин, a i-антитрипсин, а2-антиплазмин, кофактор гепарина И, ингибитор протеина С, С1-ингибитор и другие.

TFPI - ингибитор, принадлежащий к семейству ингибиторов типа Кунитца [15]. Он содержит несколько ингибиторных доменов и способен связать фактор Vila одним из них только тогда, когда другой домен связывает фактор Ха. Таким образом, в системе присутствует отрицательная обратная связь - фактор Ха замедляет собственное производство, связываясь с TFPI. Стоит отметить, что TFPI действует только на фактор Vila, связанный с тканевым фактором [16].

В дополнение к пути тканевого фактора (внешний путь), свертывание может быть активировано так называемым контактным (внутренним) путем, который запускается при контакте плазмы с отрицательно заряженными чужеродными поверхностями [17]. В этом пути работают фактор XII, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген. Фактор XII связывается с чужеродной поверхностью, что приводит к изменению его конформации и запуску сети реакций контактного пути. На выходе этой системы происходит активация фактора XI, вслед за чем происходит активация фактора IX. После этого ф1Ха присоединяет к себе фХ и активирует его. Тот, в свою очередь, активирует протромбин до тромбина. Внешняя теназа также может активировать фактор IX, так что внешний и внутренний пути активации сходятся к одному -- общему пути свёртывания - на уровне протромбиназного комплекса.

Как упоминалось выше, последним ферментом в каскаде свертывания является тромбин, на который также замкнута основная регуляция системы. Тромбин осуществляет превращение белка фибриногена в фибрин, который полимеризуется, формируя фибриновую сеть и переводя кровь из жидкого в желеобразное состояние. Фибриноген является гликопротеином, присутствующим в плазме (в концентрации ~9 мкМ) и в а-гранулах тромбоцитов [18]. Фибриноген состоит из трех пар полипептидов, связанных между собой дисульфидными мостиками. Эти полипептиды обозначаются как Аа-, В(3- и у-цепи. Превращение фибриногена в фибрин протекает в несколько стадий. На первом этапе тромбин воздействует на Ы-концевые участки цепей фибриногена, отделяя от этих концов по две молекулы фибринопептидов А и В. В результате этой реакции фибриноген преобразуется в фибрин-мономер, в центре которого образуется реакционная поверхность с измененным электронным зарядом. Реакционная поверхность фибрин-мономера взаимодействует с комплиментарными поверхностями на И-концах других молекул фибрин-мономеров, что приводит к спонтанной агрегации фибрин-мономеров. При этом фибрин-мономеры оказываются

соединёнными между собой посредством гидрофобных, ионных и водородных взаимодействий. Затем под влиянием фактора ХШа, активированного тромбином, этот растворимый фибрин-полимер превращается в нерастворимый фибрин. После стабилизации ХШа фактором многократно повышается устойчивость сгустка к действию химических растворителей и системы фибринолиза. Также многократно увеличивается жесткость сгустка. Волокна фибрина укрепляют и фиксируют в месте повреждения сосуда первичный тромбоцитарный тромб, препятствуя его размыванию кровотоком.

1.1.3. Роль сосудистой стенки в гемостазе

Стенка сосуда принимает непосредственное участие в регуляции свёртывания крови. Помимо того, что она служит естественным барьером между кровью и другими тканями, ее клетки секретируют и/или экспрессируют различные биологически активные вещества, регулирующие тромбообразование. К ним относится фактор фон Виллебранда, эндотелиальный фактор релаксации (оксид азота), тромбомодулин, тканевый фактор, ингибитор пути тканевого фактора и другие. Кроме того, мембраны эндотелиальных клеток содержат рецепторы, которые при определенных условиях связывают молекулярные лиганды и клетки, свободно циркулирующие в кровотоке. Очень многие аспекты жизнедеятельности этих клеток регулируются тромбином через его взаимодействие со специфическими поверхностными рецепторами. В норме стенки сосудов обладают ярко выраженной антитромботической активностью. Известно, что с их поверхностью постоянно связано большое количество АТ III, а также ТРР1. На поверхности клеток эндотелия содержится трансмембранный белок тромбомодулин, связывающий тромбин и производящий поразительные изменения в его специфичности. В комплексе с тромбомодулином тромбин в сильной степени теряет свои прокоагулянтные свойства, взамен резко возрастает его способность активировать протеин С: скорость активации

возрастает на три-четыре порядка. Предполагается, что антикоагулянтные свойства сосудистой стенки играют роль в механизме локализации тромба ш vivo [5,19].

1.1.4. Патологическое функционирование системы свёртывания крови: тромбоз

Нарушения работы системы свертывания крови могут приводить как к кровоточивости, так и к тромбозам. Выделяют приобретенные и наследственные нарушения свертывания.

К наследственным нарушениям относят генетические нарушения, приводящие к изменениям в структуре факторов свертывания или их концентрации в крови.

Среди основных видов приобретенных нарушений, приводящих к кровоточивости выделяют дефицит витамина К, развитие специфических ингибиторов к факторам свертывания, болезни печени, синдром массивных трансфузий [20]. Однако более частыми явлениями в клинической практике являются нарушения, ведущие к тромбозам.

Тромбоз - прижизненное образование сгустков крови в просвете сосудов или полостях сердца, связанное с патологическим функционированием системы свёртывания крови. При повреждении сосуда тромбоциты и фибрин формируют тромб для предотвращения кровопотери, однако при некоторых условиях тромб способен формироваться и без повреждения сосудов. При интенсивном свёртывании тромб может отделиться от сосуда в виде тромбоэмболы, впоследствии вызывая тромбоэмболию [21]. Ситуация, при которой тромб занимает более 75% площади просвета сосуда, затрудняет требуемое кровоснабжение тканей, вызывая гипоксию и ацидоз. Дальнейшее увеличение перекрывания сосуда приводит к аноксии и инфаркту (некрозу ткани).

Развитию тромбоза способствуют поражение сосудистой стенки (атеросклеротического, воспалительного и прочих происхождений),

замедление кровотока, локальная или системная гиперкоагуляция. Эти факторы были опубликованы в 1856 г. и известны как «триада Вирхова» [22]. Как правило, тромбозы разделяют на два вида - тромбоз периферических вен и артериальный тромбоз, каждый из которых может быть представлен различными подтипами (основными и часто встречающимися из которых являются тромбофлебиты, тромбоз глубоких вен нижних конечностей, тромбоэмболия лёгочной артерии и прочие). Тромбоз в системе коронарного кровообращения приводит к инфаркту миокарда, тромбоз сосудов мозга - к инсульту. Лечение тромбозов и тромбоэмболий осуществляется при помощи различных фибринолитических, спазмолитических и противовоспалительных средств. Нередки случаи оперативного удаления тромба, однако главная роль в лечении и предупреждении тромбозов отводится применению антикоагулянтов.

1.2.Тромбин как мишень антикоагулянтной терапии 1.2.1. Структура, функции и регуляция активности тромбина Тромбин (фактор свёртывания Па) — фермент, играющий ключевую роль в системе гемостаза - вместе с рядом других факторов системы свёртывания крови (Vila, IXa, Ха, XIa, ХПа, активированным протеином С, калликреином) принадлежит к классу сериновых протеиназ, отличительной особенностью которого является наличие функционально необходимой аминокислоты серина в активном центре. Таким образом, тромбин является родственником пищеварительных ферментов - трипсина и химотрипсина.

Несмотря на то, что в литературе в качестве первооткрывателя тромбина часто упоминается шотландский физиолог Буханан, в середине XIX в. наблюдавший, что добавление уже свернувшегося сгустка к плазме инициирует быстрое свёртывание, более правильно назвать Александра Шмидта тем человеком, который предсказал существование тромбина и описал его как фермент, образующийся из неактивного зимогена и превращающий фибриноген в фибрин (работы Шмидта второй половины

XIX в. также заложили теоретические и экспериментальные основы современной модели гемостаза) [23-26]. Трехмерная кристаллографическая структура тромбина была выявлена лишь в 1989 г [27], что позволило объяснить многие свойства фермента на структурном уровне и привело к пониманию процессов распознавания тромбином своих макромолекулярных субстратов [28,29].

Тромбин является активной формой протромбина - предшественника сериновой протеиназы, синтезирующегося, в основном, в печени и циркулирующего в крови в виде неактивного зимогена. В результате активации протромбина фактором Ха или протромбиназой (ферментативный комплекс, формирующийся на мембранах тромбоцитов из факторов Ха и Va в присутствии ионов кальция, который активирует протромбин на пять порядков быстрее, чем одиночный фактор Ха) молекула протромбина массой 72 кДа расщепляется по двум пептидным связям и распадается на две части -так называемый фрагмент 1.2. и активный фермент - а-тромбин - с молекулярной массой 37 кДа. Образовавшийся тромбин является центральным звеном процесса свёртывания крови. Он тут же начинает проявлять свои прокоагулянтные свойства, превращая растворимый фибриноген в фибрин, активируя факторы V, VIII и XI и тем самым увеличивая своё собственное производство, активируя тромбоциты и фактор XIII, что приводит к стабилизации и укреплению фибриновой сети за счет образующихся поперечных сшивок.

Время, за которое прокоагулянтная активность тромбина в плазме снижается вдвое, составляет всего около 14 сек, так как он быстро связывается со своими естественными ингибиторами и кофакторами — антитромбином III, а2-макроглобулином, тромбомодулином, кофактором гепарина II [23]. Основным механизмом естественного ингибирования тромбина является его необратимая связь с AT III в эквимолярном соотношении, после которой комплекс Ila-AT III транспортируется в печень и претерпевает деградацию в купферовских клетках [30]. Ингибирование

тромбина кофактором гепарина II происходит за счет образования троичного или двоичного комплекса в присутствии или отсутствии гепарина, соответственно [31]. При связывании тромбина с тромбомодулином -интегральным белком клеточных мембран эндотелиальных клеток -происходит активация протеина С, который инактивирует факторы Va и Villa, входящие в теназный и протромбиназный комплексы, что препятствует дальнейшему образованию тромбина (примечательно, что комплекс тромбин-тромбомодулин способен ингибировать и фибринолиз, активируя TAFI (thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor, тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза)) [32]. Также тромбин может ингибироваться циркулирующим в плазме и способным высвобождаться из а-гранул активированных тромбоцитов а2-макроглобулином, который, помимо тромбина, ингибирует плазмин и калликреин. Таким образом, в присутствии ингибиторов и кофакторов, тромбин может проявлять антикоагулянтные свойства. Переключение между про- и антикоагулянтной активностью тромбина происходит благодаря тому, что воздействие на экзосайты и активный центр молекулы тромбина его субстратами происходит по-разному.

Для более четкого представления этих процессов следует рассмотреть устройство молекулы тромбина, трехмерная структура которого представлена на рис. 2.

Тромбин состоит из двух полипептидных цепей; А-цепь (6 кДа) из 36 аминокислотных остатков ковалентно связана дисульфидным мостиком с В-цепью (31 кДа), состоящей из 259 остатков. При рассмотрении молекулы тромбина, как правило, уделяют мало внимания А-цепи - считается, что эта интегральная часть фермента не имеет функциональной роли и является неким «придатком», образовавшимся после активации протромбина. Тем не менее, А-цепь насыщена заряженными остатками, которые могут обеспечивать полярные взаимодействия с субстратами В-цепи, а мутации

протромбина, связанные с А-цепью, способны приводить к кровотечениям

Рис. 2. Структура тромбина. Синим цветом обозначен каталитический центр, содержащий активный сайт; голубым и сиреневым - экзосайты I и 11: зеленым и желтым -летля-60 и у-петля. Воспроизведено из [34J

В каталитическом центре тромбина, расположенном между двумя бочкообразными доменами В-цепи, находится активный сайт фермента, содержащий каталитическую триаду из остатков аминокислот Asp J 02, His 57, Serl95 (нумерация традиционно дается по положению соответствующих остатков в молекуле сериновой протеазы химотрипсииа) [35]. Условно в активном центре выделяют три субсайта - т.н. «карманы» SI, S2 и S3, которые распознают аминокислотные остатки в молекуле субстрата в положениях PI, Р2 и РЗ и расщепляют пептидную связь в них. Карман S1 содержит остаток аспарагиновой кислоты Asp 189, что обеспечивает распознавание и специфичность к субстратам, содержащим в положении Р1 остаток аргинина. Структура S2 ограничивает взаимодействие только маленькими и гидрофобными остатками, такими, как пролии, в положении Р2. Периферийный карман S3 (т.н. «арил-связывающий центр») специфичен

[33].

Активный

Экзосайт I

к большим гидрофобным и ароматическим остаткам. Активный сайт фермента обрамляют также гидрофобная петля-60 и гидрофильная у-петля [36]. Эти элементы характерны именно для молекулы тромбина и не представлены в других сериновых протеиназах, они служат для тонкой настройки взаимодействия тромбина со своими субстратами и ингибиторами, ограничивая и делая специфичным доступ к активному центру. Особенностью тромбина является наличие анион-связывающих экзосайтов, отвечающих за распознавание элементов субстрата, удаленных от активного центра [37]. Экзосайт I, расположенный в 20 А от активного сайта, содержит положительно заряженные остатки, что создает сильное электростатическое поле, которое обеспечивает оптимальную ориентацию ряда субстратов и кофакторов тромбина (фибриноген, фибрин, тромбомодулин, PARI и PAR3 рецепторы) и упрощает образование эффективных комплексов с ними. Экзосайт II также является положительно заряженным анионсвязывающим сайтом, расположенным на противоположной от экзосайта I стороне молекулы тромбина. Он ответственен за связь с полианионными лигандами, такими как гепарин и гликозаминогликаны.

Еще одна важная составляющая молекулы тромбина - петля, содержащая Na-связывающий сайт [38]. Предположительно, функции тромбина меняются при связывании с ионами Na+ - например, увеличивается вероятность взаимодействия небольших молекул с активным сайтом тромбина, а также создаётся преимущество во взаимодействии прокоагулянтных субстратов (таких как фибриноген, факторы V и VIII, PAR рецепторы тромбоцитов) над антикоагулянтными (протеин С). Любопытно при этом, что связанный с Na+ тромбин эффективнее ингибируется антитромбином III [39]. При физиологической концентрации Na+ в крови (140 мМ) около 60% молекул тромбина оказываются связанными с ним, находясь, тем самым, в прокоагулянтной форме. Роль Na-связывающего сайта и природа связанных с ним алостерических изменений не до конца ясны, в литературе ведется

дискуссия о противоречивости данных, полученных относительно кристаллических структур тромбина и функций сайта в его молекуле [40,41].

В основном, прокоагулянтные реакции с участием тромбина (расщепление фибриногена, активация факторов V и VIII) протекают без кофакторов, в этих реакциях активно задействованы оба экзосайта, I и И. В то же время, тромбомодулин связывается с тромбином через экзосайт I, а некоторые его формы способны взаимодействовать с экзосайтом II. Это блокирует экзосайт, и прокоагулянтные реакции оказываются невозможными, так как фибриноген и факторы свёртывания не способны достичь перегороженного тромбомодулином активного сайта. Подобное переключение приводит к тому, что тромбин способен функционировать в различных режимах. Например, используемый в антикоагулянтной терапии гепарин является кофактором при связывании тромбина с антитромбином III или кофактором гепарина И, блокируя экзосайт II и делая невозможным ход прокоагулянтных реакций; фибрин связывает тромбин через экзосайт I и стимулирует активацию фактора XIII. Тромбоцитарный гликопротеин Iba связывается с тромбином через экзосайт I для расщепления PARI рецептора при активации тромбоцита, а также для активации фактора XI [42].

Таким образом, в зависимости от концентрации различных кофакторов и субстратов и от эффективности их связывания, тромбин способен переключаться в один из режимов, обеспечивающих проведение либо про-, либо антикоагулянтных реакций с его участием. Теория о конкуренции кофакторов при связывании с экзосайтами, приводящей к функционированию тромбина в различных режимах, активно развивается и доступно представлена в обзорах [34,43].

Взаимодействие субстратов и кофакторов с активным центром и экзосайтами тромбина, приводящее к потере прокоагулянтной активности этого фермента, лежит в основе использования антитромботических препаратов натурального происхождения в клинической практике. Помимо упомянутого выше гепарина, являющегося природным полианионным

полисахаридом, выделенный из слюнной железы медицинской пиявки гирудин практически необратимо связывается с активным центром и экзосайтом I тромбина, ингибируя его активность.

Механизмы действия гепарина и гирудина не позволяют этим ингибиторам оказывать влияние на сохраняющий прокоагулянтную активность тромбин, связанный с фибрином (эта связь осуществляется через экзосайт I). Это даёт повод для поиска прямых ингибиторов тромбина, взаимодействующих с активным сайтом фермента и способных эффективно бороться с нежелательной активностью тромбина и тромбообразованием в различных патологических ситуациях.

1.2.2. Антитромботические средства

Фармакологическое воздействие при предупреждении и лечении нежелательного тромбообразования направлено на несколько мишеней в системе свёртывания крови. Такими мишенями являются тромбоциты, а также некоторые ферменты каскада свёртывания.

1.2.2.1. Антитромбоцитарная терапия

Помимо образования тромбоцитарного тромба в местах повреждения сосудов, тромбоциты участвуют и в патологическом тромбообразовании при инфаркте миокарда, инсультах и тромбозах периферических сосудов. Антитромбоцитарные препараты предназначены для снижения агрегационных свойств тромбоцитов и предупреждения их активации, ведущей к ускорению реакций свёртывания. Обычно антитромбоцитарные препараты подразделяют на несколько видов.

Ингибиторы циклооксигеназ. Основным ингибитором этого класса является применяемый уже более 40 лет аспирин. Аспирин ингибирует циклооксигеназу 1, необходимую для синтеза тромбоксана А2 - мощного активатора тромбоцитов. Так как новые молекулы белков в тромбоцитах не синтезируются, действие аспирина необратимо и сохраняется до конца жизни тромбоцитов (7-10 суток). Таким образом, повторный приём аспирина

приводит к кумуляции его аитиагрегантиого действия. Аспирин не только значительно снижает вероятность первого инфаркта миокарда у людей, предрасположенных к сердечно-сосудистым заболеваниям (первичное предупреждение), но также и сокращает риск его возникновения у пациентов, перенесших инфаркт (вторичное предупреждение) [44]. Однако аспириновая терапия имеет ряд осложнений, вызывая язву желудка и кровотечения. Большие дозы аспирина не только не усиливают его действие, но могут и ослаблять его из-за ингибирования продукции простациклина, которая почти не страдает при малых дозах.

Антагонисты АДФ-рецепторов. Связывание АДФ с Р2¥12-рецептором, сопряженным с Gj белком, ингибирует аденилатциклазу, снижая содержание цАМФ и повышая концентрацию внутриклеточного кальция, что приводит к активации тромбоцита; соответственно, блокада этого рецептора нарушает функцию тромбоцитов. К лекарствам-антагонистам Р2Y12-рецепторов относят клопидогрель и тиклопидин - наиболее широко используемые препараты в этой группе, служащие для лечения острых коронарных синдромов и профилактики инсультов; а также празугрель, сильнее снижающий риск ишемии по сравнению с клопидогрелем и являющийся более сильным ингибитором Р2У12 [45]. Препараты этой группы являются про-лекарствами и нуждаются в превращении в активное вещество, поэтому имеют отсроченное время начала действия.

Ингибиторы PARI рецептора. PARI рецепторы, экспрессирующиеся на тромбоцитах, могут быть активированы тромбином, что вызывает секрецию веществ и агрегацию тромбоцитов. PARI рецепторы - относительно новая цель антитромбоцитарной терапии. Антагонисты PARI - Е5555 и SCH530348 - находятся на разных стадиях клинических испытаний [46,47].

Ингибиторы гликопротеида ИЪ/IIIa. Агрегация тромбоцитов - ключевой момент в процессе роста тромба. Ингибирование тромбоцитарного гликопротеида Ilb/IIIa блокирует участки связывания активированных тромбоцитов с фибриногеном и прочими лигандами, нарушая их агрегацию.

В клинике для этих целей служат абциксимаб и эптифибатид, применяемые при коронарных тромбозах, нестабильной стенокардии и коронарной ангиопластике [48]. Отмечается, что основным побочным эффектом этих препаратов является повышенная кровоточивость, способная развиваться в 10% случаев.

Стоит отметить, что в клинической практике не используются средства, препятствующие связыванию тромбоцитов с коллагеном или фактором фон Виллебрандта, которое необходимо для адгезии к сосудистой стенке. В теории, ингибирование этих ранних этапов формирования тромбоцитарного тромба снижало бы роль тромбоцитов в гемостазе, однако, вероятно, приводило бы к кровотечениям. Тем не менее, такие ингибиторы разрабатываются [49].

1.2.2.2. Антикоагулянтые средства

Антикоагулянты - вещества, блокирующие свёртывание на различных стадиях, - используются для лечения широкого спектра состояний, к которым приводят артериальные или венозные тромбозы. Антикоагулянты способны ингибировать стадии начала и распространения свёртывания, блокируя активность комплекса тканевого фактора с фактором Vila или блокируя факторы 1Ха, Ха с их кофакторами фVIIIa и фVa, соответственно; или, будучи нацеленными на тромбин, могут снижать образование фибрина.

Из разработанных ингибиторов начальной фазы свёртывания на различных стадиях клинических испытаний находятся парентеральные агенты тифакогин - рекомбинантная форма TFPI [50]; рекомбинантный полипептид NAPc2 - антикоагулянтный белок, выделенный из червей Ancylostoma caninum [51], связывающийся с некаталитическим сайтом фХ или фХа и ингибирующий фVa в комплексе TF-Va [52,53]; а также фактор свёртывания Vila с необратимо заблокированным активным сайтом FVIIai, конкурентно связывающийся с тканевым фактором [54]. Несмотря на обнадёживающие результаты в животных моделях тромбоза [55,56], FVIIai продемонстировал разочаровывыющие результаты при клинических исследованиях [57] и в

дальнейшем перестал рассматриваться как средство лечения артериальных тромбозов.

Ингибиторы факторов 1Ха и Ха, а также их кофакторов фУШа и фУа блокируют стадию распространения свёртывания и, тем самым, образование тромбина. В разработке и на различных стадиях проверок находится целый ряд подобных ингибиторов. Парентеральный ингибитор ф1Ха, RB006, являющийся РНК-аптамером, и связывающийся с ф1Ха с высокой аффинностью [58], продемонстрировал обещающие результаты в первой фазе клинических исследований [59]. Дальнейшее исследование орального прямого ингибитора ТТР889, ингибирующего ф1Ха в комплексе внутренней теназы, было остановлено после второй стадии клинической проверки [60].

Факторы Villa и Va, кофакторы внутренней теназы и протромбиназы, соответственно, инактивируются в организме активированным протеином С (вместе с кофактором протеином S). Стратегии, нацеленные на усиление роли протеина С, заключаются в клиническом использовании как полученных из плазмы, так и рекомбинантных форм протеина С и активированного протеина С [61,62]; а также рекомбинантного аналога внеклеточного домена тромбомодулина [63], связывающегося с тромбином и переводящего его из прокоагулянтной формы в мощный активатор протеина С.

На ингибировании фХа стоит остановиться подробнее, так как он играет важную роль в системе свёртывания. Именно на нём сходятся внутренний и внешние пути свёртывания, петли положительных обратных связей и именно он ответственен за превращение протромбина в тромбин. При активации гемостаза по внешнему пути фХа создает пикомолярные концентрации тромбина, необходимые для активации кофакторов свёртывания - фУ и фУШ, что приводит к образованию комплексов внутренней теназы и протромбиназы и дальнейшей генерации фХа и тромбина (петли положительных обратных связей). Сам по себе фХа медленно активирует протромбин, в составе же протромбиназного комплекса это делается на пять

порядков быстрее. Таким образом, ингибирование фХа способно заблокировать взрывное производство тромбина, приводящее к тромбин-индуцированной активации свёртывания и тромбоцитов. Существующие ингибиторы фХа можно разделить на непрямые и прямые. Непрямые ингибиторы действуют в качестве катализаторов ингибирования фактора Ха антитромбином III, усиливая действие последнего, в то время как прямые ингибиторы напрямую связываются с активным сайтом фХа, блокируя взаимодействие фактора со своими субстратами. В отличие от нефракционированного гепарина и гепаринов низкого молекулярного веса, являющихся типичными представителями непрямых ингибиторов фХа и образующих комплекс гепарин-АТ III, прямые ингибиторы связываются не только со свободным фХа, но и могут инактивировать фХа в составе протромбиназного комплекса [64-66]. Эти свойства могут обеспечивать преимущества прямых ингибиторов над непрямыми. Непрямые ингибиторы фХа, парентерально вводимые синтетические пентасахариды фондапаринукс и идрапаринукс [67,68], являются аналогами пентасахаридной последовательности, отвечающей за связь гепарина с антитромбином. Вводимый внутривенно отамиксабан [69], а также орально доступные апиксабан [70] и ривароксабан [71], являются прямыми ингибиторами фХа. Это небольшие молекулы, обратимо блокирующие активный центр фактора Ха, демонстрирующие обнадёживающие результаты в профилактике тромбоэмболий, лечении тромбозов глубоких вен, профилактике инсультов. Подробнее о существующих ингибиторах фХа, как используемых клинически, так и находящихся на различных стадиях исследований, можно узнать из обзорных статей [72,73].

Благодаря существенной роли фактора Ха в свёртывании, его ингибиторы могли бы иметь преимущества над ингибиторами тромбина, так как они блокируют стадию распространения свёртывания, приводящую к активной наработке тромбина, образованию артериальных и венозных тромбов, насыщенных тромбоцитами и фибрином, соответственно. В научной

литературе ведется широкое обсуждение того, что же является лучшей мишенью антикоагулянтной терапии - фактор Ха или тромбин, а также того, какова роль этих факторов при патологических процессах; эта дискуссия далека от завершения [74-76]. Действительно, блокирование каскада свёртывания на уровне фХа способно привести к снижению образования фибрина, однако ничего не известно о том, насколько безопасным может являться такое блокирование на более высоких по отношению к тромбину уровнях каскада свёртывания [77,78]. Кроме того, главным недостатком ингибиторов фактора Ха является то, что они не нейтрализуют уже образовавшийся тромбин, что важно при различных патологических процессах, а лишь прекращают его производство. При использовании ингибиторов фХа небольшие количества уже образовавшегося тромбина остаются в циркуляции и могут способствовать сохранению нормального гемостаза на фоне прекращения ускоренного образования тромбина. Также стоит отметить, что прямое сравнение селективных ингибиторов фХа и прямых ингибиторов тромбина в животных моделях тромбоза показало, что ингибиторы фХа менее эффективны [79,80].

Из сказанного выше логично предположить, что тромбин представляет собой оптимальную мишень для антикоагулянтной терапии, ведь именно он является основным регулятором свёртывания, расщепляющим фибриноген, активирующим факторы V, VIII, XI, XIII и тромбоциты, активирующим (в комплексе с тромбомодулином) протеин С и выполняющим еще целый ряд физиологических функций. Учитывая столь важную роль тромбина в системе свёртывания крови, перейдем к рассмотрению средств, ингибирующих его активность.

1.2.2.3. Ингибиторы активности тромбина: принципы и практика

Существующие стратегии воздействия на систему гемостаза с целью предупреждения нежелательного тромбообразования можно разделить на три основных направления: использование антагонистов витамина К, которые снижают синтез печенью предшественников факторов свёртывания;

применение прямых и непрямых ингибиторов сериновых протеиназ системы свёртывания крови; применение антитромбоцитарных препаратов, снижающих активацию и агрегационные свойства тромбоцитов и тем самым препятствующих дальнейшей активации свёртывания. Основные препараты, используемые при этом, таковы: оральный антикоагулянт варфарин (антагонист витамина К); нефракционированный гепарин - непрямой ингибитор тромбина и фХа; ингибитор агрегации тромбоцитов аспирин. Имеющиеся у этих препаратов ограничения использования и побочные эффекты побуждают к поиску новых антикоагулянтов, обладающих не меньшей эффективностью и свободных от недостатков стандартно используемых препаратов.

Ингибирование тромбина, фермента, превращающего фибриноген в фибрин, может осуществляться как прямым, так и непрямым образом. Непрямые ингибиторы, специфичные к тромбину, могут подавлять его синтез или действовать как катализаторы его естественных ингибиторов — AT III и/или кофактора гепарина II. Напротив, прямые ингибиторы связываются с тромбином напрямую, блокируя его взаимодействие с субстратами, предотвращая образование фибрина и тромбин-индуцируемую активацию факторов V, VIII, XI, XIII, тромбоцитов. Рассмотрим подробнее каждый из этих классов ингибиторов.

Непрямые ингибиторы тромбина

Антагонисты витамина К

К непрямым антикоагулянтам - антагонистам витамина К - относятся вещества группы кумаринов, наиболее используемым в клинике представителем которых является варфарин. Механизм антикоагуляционного действия антагонистов витамина К связан с тем, что они блокируют синтез витамин K-зависимых факторов свёртывания печенью. Синтезирующиеся в печени факторы II (протромбин), VII, IX, X, протеины С и S приобретают биологическую активность лишь после у-карбоксилирования остатков

глутаминовой кислоты на Ы-концевом участке молекулы, превращающего их в остатки у-карбоксиглутаминовой кислоты [81]. Последние, благодаря способности связывать Са , осуществляют сборку активных каталитических комплексов на мембранах активированных тромбоцитов, тем самым обеспечивая функционирование факторов. Витамин К (в форме гидрохинона) является одним из кофакторов этого у-карбоксилирования, в ходе которого гидрохиноновая форма витамина К переходит в окисленную эпоксидную форму. Для продолжения реакций у-карбоксилирования и синтеза биологически активных факторов эпоксид должен опять восстановиться в гидрохинон, что осуществляется под действием фермента витамин-К-эпоксидредуктазы. Именно этот фермент и ингибируется терапевтическими дозами препаратов группы кумаринов. Это приводит к снижению уровня всех витамин К-зависимых факторов свёртывания на 30-50%, а их образующиеся молекулы обладают сниженной активностью (10-40% от нормальной) из-за недостаточного у-карбоксилирования. Популярность варфарина и его широкое использование (варфарин был введен в клиническую практику в начале 50-х годов XX века, варфарин принамет около 1% населения США) объясняются тем, что это едва ли не единственный орально доступный антикоагулянт, который можно принимать в течение длительного времени. Как правило, его назначают при лечении и предупреждении тромбоэмболии, профилактике аритмий, легочной эмболии, а также пациентам, перенесшим протезирование сердечных клапанов. Однако применение варфарина имеет ряд ограничений и недостатков. Помимо того, что он не влияет на активность полностью у-карбоксилированных молекул, ответ на терапию развивается медленно и проявляется через сутки, достигая максимального уровня через несколько дней. Около 97% варфарина связывается с белками плазмы крови (главным образом, с альбумином). Данный препарат довольно сильно связывается как с компонентами пищи, так и со многими лекарствами [82]. В ряде случаев у принимающих варфарин больных могут возникать геморрагические

осложнения; также существует повышенная генетическая чувствительность к варфарину, связанная с мутацией в аллелях, кодирующих варфарин-метаболизирующий фермент [83,84]. Всё это говорит о том, что существует индивидуальная вариабельность чувствительности к варфарину, и при его приеме нужны определенные диетарные и фармакологические ограничения, а также систематический мониторинг свертывания. Контроль регулярности и эффективности лечения варфарином, как правило, оценивают по протромбиновому времени (ПВ) или международному нормализованному отношению (MHO). Терапевтические значения MHO, при которых снижается риск тромбозов и эмболий и при этом незначительно повышается вероятность кровотечений, установлены эмпирически и составляют 2-3 [85].

Гепарины

Гепарин - гликозаминогликан, содержащийся в гранулах тучных клеток. Его молекула представлена несколькими полисахаридными цепями, связанными с общим белковым ядром. Длина полисахаридных цепей гепарина может быть разной; это значит, что молекулярный вес нефракционированного гепарина (unfractionated heparin, UFH) колеблется в широких пределах - от 3 до 40 тысяч дальтон, в среднем составляя 15 тысяч дальтон, или около 40 моносахаридов [86]. Путем гель-фильтрации, преципитации этанолом или частичной деполимеризации с помощью азотистой кислоты и других реагентов нефракционированный гепарин может быть разделен на фракции более низкого молекулярного веса от 1 до 10 тысяч дальтон (в среднем 4500 Да, то есть 15 моносахаридов). Низкомолекулярные гепарины (low-molecular weight heparins, LMWH) отличаются от обычного и друг от друга фармакокинетическими свойствами и механизмами действия в зависимости от величины среднего молекулярного веса [87].

Антикоагулянтные свойства нефракционированного гепарина были описаны в 1916 году. В 1936 году Бринкхаус и сотр. обнаружили, что антикоагуляционное действие гепарина опосредуется одним из компонентов

плазмы, который они назвали его кофактором гепарина. Тридцатью годами позже выяснилось, что им является антитромбин III - белок плазмы, быстро инактивирующий тромбин и фактор Ха в присутствии гепарина. Антитромбин III необратимо связывает и ингибирует тромбин, а также практически все активированные факторы свёртывания (за исключением фУПа). Гепарин ускоряет взаимодействие AT III с тромбином более чем в 1 ООО раз благодаря тому, что служит матрицей, связывающей оба белка; при этом изменяется конформация реактивного центра AT III, и он становится более доступным для тромбина [88]. После образования комплекса тромбин-антитромбин III молекула гепарина высвобождается в неизмененном виде. Участок молекулы гепарина, отвечающий за связь с AT III, представляет собой пентасахаридную последовательность, содержащую остаток глюкозамина. Эта структура обнаруживается примерно в 30% молекул гепарина. Другие гликозаминогликаны лишены этой структуры и не способны активировать антитромбин III (аналог этой структуры лежит в основе действия препарата фондапаринукс, упомянутого выше). При ингибировании тромбина полисахаридная последовательность должна состоять из не менее 18 остатков Сахаров, что соответствует молекулярному весу 5400Да. Гепарины меньшего веса не могут одновременно связывать антитромбин III и тромбин и поэтому не ускоряют инактивацию последнего, однако способны ингибировать фактор Ха, так как для этого требуется связь гепарина только с AT III. Именно этим объясняется разница в антикоагулянтном действии нефракционированного гепарина и гепаринов низкого молекулярного веса - в зависимости от длин полисахаридных цепей тромбин и фактор Ха ингибируются одинаково эффективно (в случае нефракционированного гепарина), или же - в случае низкомолекулярных гепаринов - антитромботическое действие осуществляется, в первую очередь, за счет ингибирования активности фХа (рис. 3)

pentasaccharide «=s>o=i>c= polysaccharidic chain

Рис. 3. Сверху: схематическое представление распределения по молекулярным весам в препаратах нефракционированного гепарина (UH) и гепаринов низкого молекулярного веса (LMWH). Снизу: образование комплексов гепарин-антитромбин Ш-фХа и гепарин-антитромбин Ш-тромбин гепаринами с различной длиной полисахаридных цепей. Воспроизведено из [89]

За 1 ед принимается количество гепарина, предотвращающее свёртывание 1 мл цитратной овечьей плазмы в течение часа после добавления 0,2 мл 1% СаС12. При увеличении концентрации гепарина по сравнению с требуемой для активации AT III (более 4 ед/мл) в 10 раз антикоагулянтный эффект проявляется независимо от наличия AT III. Он связан с тем, что гепарины усиливают действие и другого ингибитора тромбина - кофактора гепарина II (см. выше) [90]. Еще одно антитромботическое свойство гепарина заключается в том, что он стимулирует высвобождение TFPI из мест связывания на эндотелии, что приводит к снижению образования протромбиназы во внешнем пути свёртывания [91].

Гепарин применяют при нестабильной стенокардии и инфаркте миокарда, при баллонной коронарной ангиопластике и установке стента, при операциях, требующих искусственного кровообращения. Стандартные дозы гепарина обычно вводят путем внутривенной инфузии. Гепарин начинает действовать быстро, практически сразу после введения. Время полужизни

36

прямо зависит от вводимой дозы (от 30 мин при введении 25 ед/кг до 150 мин при введении 400 ед/кг). Действие гепарина зависит от уровня AT III в плазме, связывания и нейтрализации белками плазмы, от скорости выведения препарата, которая индивидуальна - таким образом, при одинаковых дозах гепарин дает непредсказуемый антикоагулянтный ответ у разных пациентов, что требует частого мониторинга [92]. Терапевтической дозой считается доза, соответствующая концентрации гепарина в плазме 0,63-0,7 ед/мл. Контроль над лечением проводят, определяя АЧТВ, при этом обычно считается достаточным удлинение АЧТВ в 1,7-2,5 раза.

Низкомолекулярные гепарины эффективны и также применяются при профилактике венозных тромбозов, ТЭЛА, нестабильной стенокардии. Главное их преимущество перед обычным гепарином - более предсказуемая фармакокинетика, позволяющая назначать их подкожно без лабораторного контроля, что дает возможность лечить многих больных на дому. Кроме того, лечение низкомолекулярными гепаринами реже осложняется гепариновой тромбоцитопенией, остеопорозом и кровоточивостью [93,94].

Основным осложнением, возникающим при длительной гепаринотерапии, является тромбоцитопения - снижение числа тромбоцитов ниже 150000 мкл"1 или на 50% от исходного уровня. В литературе описано два типа гепарин-индуцированной тромбоцитопении, различающихся по своему патогенезу и клиническим проявлениям [95]. Во врачебной практике под термином гепарин-индуцированная тромбоцитопения подразумевают второй тип заболевания. При первом типе происходит прямое взаимодействие молекул нефракционированного гепарина с мембранами тромбоцитов, вызывающее активацию и агрегацию тромбоцитов с развитием тромбоцитопении. При своевременной отмене гепарина количество тромбоцитов восстанавливается, дополнительного лечения не требуется. Гепарин-индуцированная тромбоцитопения второго типа возникает в течение первых 4-15 суток после первого применения гепарина. Она характеризуется выработкой антител и парадоксальными тромбозами. Причиной подобных осложнений считается

выработка антител класса IgG к комплексу гепарина с фактором тромбоцитов 4, высвобождающимся из a-гранул при агрегации тромбоцитов. Образующиеся иммунные комплексы связываются с FcyIIa-рецепторами тромбоцитов, вызывая агрегацию тромбоцитов, выброс еще большего количества фактора тромбоцитов 4 и образование тромбина [96,97].

Таким образом, несмотря на то, что антитромботическая терапия гепарином является популярной и достаточно успешной, применение нефракционированного гепарина имеет ряд недостатков и ограничений.

Прямые ингибиторы тромбина

Гирудин

Гирудин - представитель класса прямых ингибиторов, известный довольно давно, так как содержится в слюнных железах медицинских пиявок Hirudo Medicinalis; он был идентифицирован в конце XIX века Хайкрафтом (он же дал название «гирудин»), однако выделить гирудин в чистом виде и полностью выявить его структуру удалось лишь в 1955 и 1976 годах, соответственно [98]. Это полипептид, содержащий 65 аминокислотных остатков, с молекулярной массой около 7000 Да, быстро и ингибирующий тромбин, соединяясь с ним в активном центре и связываясь с экзосайтом I (т.н. фибриноген-распознающий экзосайт, см. выше). Константа диссоциации комплекса тромбина с гирудином очень низка и составляет 20 фМ [99], что делает ингибирование практически необратимым. Это не вполне желательно, так как не существует антидотов гирудина. Существующий рекомбинантный гирудин доступен в двух формах - лепирудин и дезирудин. Их отличие от природного гирудина заключается в отсутствии сульфатной группы у тирозина в позиции 63 (ТугбЗ). Такое отличие приводит к уменьшению силы связывания с тромбином, при этом увеличиваются константы диссоциации, составляющие 60 фМ и 200 фМ для лепирудина и дезирудина, соответственно [100,101]. Несмотря на то, что применение дезирудина и лепирудина было одобрено при лечении тромбозов глубоких вен после

операций на суставах, а также гепарин-индуцированной тромбоцитопении и связанных с ней тромбозов, клиническое использование рекомбинантных гирудинов имеет ряд ограничений: они имеют относительно небольшое время жизни (1^/2 составляет около 60 минут после внутривенного введения), способны вызывать геморрагические осложнения и появление антигирудиновых антител [102-105].

На основе «бивалентного» связывания гирудина с тромбином был разработан и синтезирован ряд синтетических аналогов гирудина, называемых гирулогами [106]. Они также являются мощными ингибиторами, проявляющими селективность по отношению к тромбину. Единственным представителем этого класса веществ в клинике является бивалирудин — протеин, состоящий из 20 аминокислотных остатков, обратимо ингибирующий тромбин и одобренный в качестве альтернативы гепарину к применению у пациентов, подвергшихся коронарной ангиопластике и перенесших острый коронарный синдром. Время полу жизни после внутривенной инфузии бивалирудина составляет 25 минут, его константа ингибирования составляет 2,3 нМ [107].

Понимание всей сложности физиологии системы свёртывания крови и функционирования тромбина как ключевого фермента тромбообразующих процессов, а также анализ особенностей использования широко распространенных ингибиторов тромбина, описанных выше, привели к идее создания низкомолекулярных синтетических прямых субстрато-подобных ингибиторов тромбина, связывающихся только с активным центром фермента и способных заменить гепарин (и его производные) и варфарин на основе большей эффективности и меньшего количества побочных эффектов. Действительно, такие ингибиторы в меньшей степени связывались бы с белками плазмы и давали бы более предсказуемый антикоагулянтный ответ, не инактивировались бы фактором тромбоцитов 4 и не вызывали бы их активацию, инактивировали бы как свободно циркулирующий тромбин, так и

тромбин, сорбированный на фибриновом сгустке, и не требовали бы для эффективности своего действия наличия кофакторов типа антитромбина III или кофактора гепарина II. Основными требованиями, предъявляемыми к вновь синтезируемым синтетическим ингибиторам тромбина, являются следующие [108]:

- низкие значения IQ. Константа ингибирования - одна из основных характеристик эффективности ингибиторов тромбина, однако слишком низкая Ki может вызывать ряд проблем (например, наблюдаемых при использовании гирудина - очень мощного ингибитора с необратимым связыванием);

- селективность по отношению к тромбину. Тромбин - фермент, относящийся к классу сериновых протеиназ, поэтому его ингибиторы способны также связываться с другими представителями этого класса (например, трипсином). Тем не менее, существует предположение, что менее специфичные двойные ингибиторы факторов свёртывания могут быть более эффективными [109];

- оральная биодоступность;

сбалансированная липофильность:гидрофильность. Выраженные гидрофобные свойства прямого ингибитора тромбина могут обуславливать его повышенную связь с белками плазмы крови;

- незначительный вывод через гепатобилиарную систему. Считается, что подобная элиминация вещества может привести к гепатотоксичности (случай ксимелагатрана - см. ниже).

Рассмотрим подробнее вещества, относящиеся к этому классу.

Аргатробан

Аргатробан - нековалентный синтетический ингибитор тромбина с молекулярной массой 508,7, содержащий аргинин в качестве Р1-фрагмента (рис. 4). Впервые описанный в 1978 году и подвергшийся клиническим испытаниям в начале 80-х годов [110], аргатробан был одобрен FDA (Food

rc I

and Drug Administration, Управление по контролю качества—продуктов й " лекарств) в 2000 году для антикоагулянтной терапии и профилактики тромбозов у пациентов с гепарин-индуцируемой тромбоцитопенией (ГИТ) и в 2002 году для пациентов с подкожным коронарным вмешательством с риском гепарин-индуцируемой тромбоцитопении.

fA.W, (anhydrous): 565.7 Рис. 4. Химическая структура аргатробана

Аргатробан является селективным обратимым ингибитором тромбина (Ki = 38 нМ) с незначительной ингибиторной активностью по отношению к другим сериновым протеиназам - трипсину и фХа (константы ингибирования для этих протеиназ больше, чем константа для тромбина, в 240 и 1430 раз, соответственно) [111]. Среди фармакокинетических характеристик аргатробана стоит отметить время полужизни, составляющее 40-50 минут; связывание с белками плазмы крови, составляющее 54% (20% из которых - связывание с альбумином); метаболизм вещества, осуществляемый печенью (в результате образуются 4 метаболита, один из которых обладает сниженной в 5 раз активностью, прочие неактивны) [112]. Аргатробан, гирудин и бивалирудин являются парентеральными ингибиторами тромбина, одобренными к применению в Северной Америке, однако, в отличие от двух последних, аргатробан не вызывает выработку антител и эффективен в отношении сорбированного на сгустке тромбина [113,114]. Несмотря на свой малый молекулярный вес, аргатробан предназначен для парентерального введения из-за наличия высокоосновного

гуанидинового остатка, препятствующего абсорбции из желудочно-кишечного тракта. Кроме того, клинические исследования пациентов без ГИТ показали, что аргатробан не однозначно выгоден по сравнению с гепарином при артериальных инфарктах и ряде коронарных синдромов [115,116].

Дабигатрана этексилат

Дабигатрана этексилат является орально доступным пролекарством, абсорбирующимся из ЖКТ и под действием эстераз превращающимся в активный метаболит, дабигатран (рис. 5).

Рис. 5. Структура дабигатрана (Ri=H, R^H) и дабигатрана этексилата (Ri=CH2-CH3, R2=COO-(CH2)5-CH3)

Под торговой маркой Прадакса (Pradaxa, Boehringer Ingelheim) дабигатрана этексилат в 2008 г был одобрен Европейским Медицинским Агентством для предупреждения тромбоэмболий у пациентов, подвергшихся протезированию бедренных и коленных суставов [117]. Дабигатран -конкурентный обратимый ингибитор тромбина с К[=4.5 нМ (Kt для фХа и трипсина составляют 3,76 мкМ и 50 нМ, соответственно) [118]. Биодоступность этого препарата составляет около 5%, а абсорбция требует кислой среды, что приводит к индивидуальным различиям в фармакокинетических и фармакодинамических параметрах. Время достижения пиковых плазменных концентраций дабигатрана составляет 2

часа, время полужизни - 8 и 17 часов при однократном и многократном приёме, соответственно [119]. Около 80% препарата выводится через почки в неизменённом виде, что затрудняет его использование у пациентов с почечной недостаточностью [120]. Среди побочных явлений употребления дабигатрана указывается вероятность кровотечений, хотя в предклинических испытаниях эта вероятность не была статистически значима. Испытания дабигатрана для лечения тромбоэмболий различной природы продолжаются [77,121].

Ксгшелагатран

Ксимелагатран - первый оральный прямой ингибитор тромбина, в 20032004 г.г. одобренный к применению в ряде европейских стран для предотвращения тромбоэмболий в ортопедической хирургии. Ксимелагатран - пролекарство, трансформирующееся в активную форму (мелагатран) при двухступенчатом метаболизме, в ходе которого происходит эфирный гидролиз и восстановление гидрокисльной группы (рис.6) [122,123]. Ксимелагатран сложно назвать селективным ингибитором тромбина (К1 = 3 нМ для тромбина, К1 = 4 нМ для трипсина), однако по отношению к прочим сериновым протеиназам он вполне селективен. Ксимелагатран абсорбируется через ЖКТ с биодоступностью 20% и быстро биотрансформируется в мелагатран (сам по себе имеющий биодоступность 5.8%) через 2х-ступенчатый метаболизм. Его время полужизни - 4-5 часов [124].

о

/ n ын2

Рис.6. Структура мелагатрана (К.1=Н, Яг-Н) и ксимелагатрана (111=СН2-СНз, Я2=ОН)

Ксимелагатран удовлетворял всем требованиям для идеального антитромботика и по ряду показаний был готов заменить варфарин [125,126]: будучи оральным антикоагулянтом, он не взаимодействовал с едой и лекарствами, давал предсказуемый ответ на терапию и не требовал постоянного мониторинга, а также демонстрировал неплохие результаты при лечении и профилактике венозных тромбоэмболий, кардиоэмболий, ишемий [127]. Однако в 2006 году из-за обнаруженной гепатотоксичности фирма-производитель лекарства удалила ксимелагатран из клинической практики и остановила все клинические испытания с ним [128], сфокусировавшись на разработке и испытании схожей с мелагатраном структуры А2Б0837 [129].

Идея использования пролекарств, являющихся предшественниками активных действующих соединений (мелагатрана и дабигатрана в случае ксимелагатрана и дабигатрана этексилата, соответственно), позволяет решить проблему доставки ингибиторов в кровь при пероральном применении препаратов. В подобных пролекарствах «защищены» полярные амидиновые и карбоксильные группы ингибиторов, высвобождающиеся при энзиматическом гидролизе. Несмотря на перспективность использования пролекарств, их дизайн и применение сопряжены с определенными фармакологическими, фармакокинетическими, токсикологическими и клиническими ограничениями.

Несмотря на интенсивную разработку прямых ингибиторов тромбина [130], на сегодняшний день в мире клинически используются только два таких ингибитора: аргатробан и одобренный для ограниченного клинического применения оральный ингибитор дабигатран этексилат. Ни один из них не лицензирован в России, что побуждает к активной деятельности в сфере разработки прямых ингибиторов тромбина в нашей стране.

1.3. Инфузионно-трансфузионная терапия кровопотери

1.3.1. Основные цели

Кровопотеря - одна из распространённых травм, сопровождающая хирургические операции, различного рода ранения и патофизиологические процессы. Только на долю неконтролируемых кровотечений в мире приходится около 4% всех смертей, и их количество год от года только растёт [131]. Инфузионно-трансфузионная терапия, проводимая при кровопотерях, предполагает внутривенное вливание различных сред и растворов. Основные цели, преследуемые при этом - восполнение дефицита объёма циркулирующей крови, поддержание гемостатической и кислородтранспортной функций крови. Для достижения последних двух целей используется переливание свежезамороженной плазмы (СЗП), концентратов клеток крови или отдельных факторов свёртывания, а также инфузии кислородпереносящих растворов. Однако самой важной задачей при кровопотере является восполнение объёма циркулирующей жидкости, что позволяет нормализовать артериальное давление, объём сердечного выброса, обеспечить необходимую перфузию органов и тканей, сохранить нормальные реологические показатели крови, а также предупредить коллапс сосудов, развитие синдрома малого выброса и централизацию кровообращения [132]. С этой целью применяются плазмозамещающие растворы (ПЗР) различной природы, которые принято делить на две группы: кристаллоидные (водные растворы минеральных солей или других водорастворимых молекул) и коллоидные (содержащие большие полимерные молекулы, например, желатин) растворы. Стоит отметить, что сама по себе кровь тоже является коллоидным раствором.

1.3.2. Общие сведения о современных инфузионных растворах

Кристаллоидные растворы

Типичными представителями группы кристаллоидов являются классический 0,9% раствор хлорида натрия («физиологический раствор») и

более сбалансированные по составу полиионные растворы. Из последних в нашей стране нашёл широкое применение раствор Рингера, содержащий хлориды натрия, калия и кальция с добавкой гидрокарбоната натрия, тогда как за рубежом широко применяется его более дорогой вариант, включающий в свой состав лактат — Рингер-лактат [133]. К бесспорным преимуществам кристаллоидов относятся их невысокая цена, хорошая переносимость, отсутствие реактогенности, влияния на функцию почек и иммунную систему [134]. Главным же их недостатком является низкий и кратковременный волемический (объемозамещающий) эффект. Его причины становятся ясны при обращении к современным представлениям о водных секторах организма, согласно которым всю жидкость в нём можно разделить на три сектора, или пространства - внутриклеточное, интерстициальное и внутрисосудистое (рис. 7).

Эндотелий сосудов

Внутриклеточное пространство 60%

Интерстициальное пространство

Клеточная мембрана

«Свободная вода«

Коллоидные растворы

Вмутрисосудастое

пространство 7%

Изотонические

солевые растворы

Рис. 7. Водные секторы организма и «рабочие» пространства инфузионных растворов. Воспроизведено из [134]

Наибольшим по объёму является внутриклеточный сектор (около 60% от общего объёма жидкости в организме), который отделён от интерстициального (33%) клеточной мембраной, свободно проницаемой для воды. Транспорт электролитов через эту мембрану энергозависим, а для крупных коллоидных молекул невозможен вовсе. Границей же интерстиция и внутрисосудистого пространства (соответственно, 7%) служит сосудистая

стенка, свободно проницаемая для воды и электролитов и в норме непроницаемая для коллоидных молекул. Следовательно, после введения в организм изотонические солевые растворы равномерно распределяются между внутрисосудистым и интерстициальным секторами, причём в том соотношении, в котором эти сектора соотносятся между собой. Это приводит к тому, что через 1-1,5 часа после инфузии в сосудистом русле останется лишь 20-30% введённого объёма, основная же часть раствора «уйдёт» в интерстициальный сектор. Такие особенности поведения солевых растворов требуют использования объёмов, в 3-4 раза превосходящих кровопотерю, что, при больших инфузиях, приводит к перегрузке интерстиция [135]. Часть жидкости в этом случае посредством лимфатической системы будет возвращена в сосудистое русло. Однако возможности лимфатического дренажа не безграничны, и избыток интерстициальной жидкости переходит в так называемое третье пространство (рыхлая соединительная ткань, естественные полости и т.д.), вызывая отёчный синдром, одним из самых опасных проявлений которого является отёк лёгких. Кроме того, инфузии физиологического раствора в объёмах, необходимых для коррекции острой кровопотери, могут привести к развитию гиперхлоремического ацидоза [136]. Существующие данные о случаях послеоперационной тошноты и рвоты и усилении болевого синдрома при преимущественном использовании солевых растворов при операциях в сравнении с коллоидами [137] дополняют список недостатков кристаллоидных растворов.

Коллоидные растворы

Состоящие из более крупных молекул, чем кристаллоидные растворы, коллоидные растворы в норме не способны выходить за пределы сосудистого русла, что делает их эффективным средством восполнения объема циркулирующей крови (ОЦК). Коллоидные плазмозамещающие растворы разделяют на естественные (компоненты крови), к которым относятся свежезамороженная плазма (СЗП) и альбумин, и синтетические коллоиды. Свежезамороженная плазма могла бы стать идеальным плазмозамещающим

средством, однако опасность передачи вирусных инфекций (гепатиты В и С, ВИЧ и др.), трудно прогнозируемые посттрансфузионные осложнения и невысокий волемический эффект (меньше 1,0) привели к тому, что на сегодняшний день переливание СЗП в клинике проводится только с целью предотвращения или восстановления гемостатических нарушений, связанных с дефицитом факторов свёртывания крови. Это отражено и в рекомендациях Всемирной Организации Здравоохранения, согласно которым гиповолемия не входит в перечень показаний для трасфузий СЗП, хотя в ряде случаев этой среде всё же отведена и функция объёмозамещения - в ситуациях, когда введенная доза синтетических растворов уже достигла максимальной, а потребность в коллоидах сохраняется или использование синтетических коллоидов невозможно [134]. Не рекомендованы к использованию при восполнении ОЦК и растворы альбумина - известны пирогенные и аллергенные реакции на многие коммерческие образцы этих растворов, обусловленные наличием в них различных примесей. Кроме того, сильно ограничивает применение данного препарата его способность в условиях повышенной проницаемости сосудов выходить из сосудистого русла и, увеличивая онкотическое давление в интерстициальном секторе, приводить к отёкам тканей, прежде всего лёгких. Наконец, существует ряд исследований, из которых наибольшую известность приобрело Кохрановское исследование 1998 года, выявивших достоверно более высокую смертность среди пациентов отделений реанимации, получавших растворы альбумина, по сравнению с контрольной группой [138]. Приведенные недостатки естественных коллоидных растворов, их высокая цена и ограничения в изготовлении и хранении способствовали развитию и более широкому внедрению в клиническую практику плазмозамещающих растворов на основе синтетических коллоидов.

Наиболее старыми относительно появления и использования в медицине (с 1915 г.) являются синтетические коллоидные растворы на основе желатина, производимые из коллагена крупного рогатого скота. В зависимости от

способа получения их подразделяют на оксиполижелатины, мочевиносвязанные желатины и растворы модифицированного желатина. Представителями оксиполижелатиновых растворов являются отечественные желатиноли. Вследствие несовершенной технологии, эти растворы имеют широкий диапазон молекулярно-массового распределения (от 5 до 100 кД), с чем связан ряд их недостатков: низкий волемический эффект (около 0,5), опасность «утечки» активного вещества в интерстициальное пространство, слабое влияние на коллоидно-осмотическое давление плазмы и нередкие анафилактоидные реакции [139]. Многих этих недостатков лишён Гелофузин - представитель растворов модифицированного желатина, для которого характерно более узкое распределение по молекулярной массе (около 30000 Да), близкий к 1 волемический эффект, препятствующая выходу из сосудистого русла форма молекулы, высокое коллоидно-осмотическое давление, практически отсутствующие реакции непереносимости и возможность частичной (до 10%) метаболизации активного вещества.

Другим видом синтетических коллоидных плазмозаменителей являются растворы на основе декстрана, водорастворимого высокомолекулярного полисахарида, получаемого из бактерий определенного типа. Для его промышленного получения используют метод выращивания бактериальной культуры, причем определенные условия роста бактерий способствуют синтезу декстрана необходимой молекулярной массы. Доступными в нашей стране в настоящее время являются 6% раствор среднемолекулярного декстрана - полиглюкин и 10% раствор низкомолекулярного декстрана -реополиглюкин, обладающий реокорригирующим эффектом. Плазмозамещающие растворы на основе декстрана обладают высокой водоудерживающей способностью, хорошим (больше 1,0) волемическим эффектом и благоприятным влиянием на гемореологию, особенно характерным для низкомолекулярных декстранов [140]. В то же время известны и неблагоприятные эффекты декстранов, среди которых торможение синтеза альбумина печенью, временное изменение антигенных

свойств крови и возможность возникновения синдрома острого гиперонкотического повреждения почек. При почти отсутствующем метаболизме декстрана в организме больного на почки ложится и вся нагрузка по его выделению, что делает невозможным применение декстранов у больных с ишемией почек и почечной недостаточностью [141]. Тем не менее, в нашей стране препараты декстрана пока остаются самыми популярными коллоидными плазмозаменителями. Это обусловлено их высокой эффективностью в быстром и предсказуемом восстановлении ОЦК, а также доступностью [139].

Одними из самых популярных в мире плазмозамещающих средств являются растворы на основе гидроксиэтилированного крахмала (ГЭК) [142]. Эти синтетические коллоиды производят из кукурузного или картофельного крахмала, их химическая структура очень сходна с гликогеном. Поведение препаратов ГЭК в организме существенно отличается от свойственного другим синтетическим и природным коллоидам, длительность циркуляции которых в крови определяется в первую очередь "почечным" порогом (около 50 кД), так как крахмал очень быстро расщепляется а-амилазой. Замещение гидроксильных групп гидроксиэтиловыми делает молекулу ГЭК более устойчивой к гидролизу и придаёт ей принципиально новые свойства, зависящие как от числа замещенных групп (степень замещения), так и от их положения в глюкозном кольце. Чем выше степень замещения и чем больше отношение молекул, замещённых в положении С2, к числу молекул, замещенных в положении С6, тем более устойчиво вещество к активности амилазы. Поэтому совершенствование препаратов ГЭК происходит путем манипулирования молекулярной массой, степенью замещения и соотношением замещений в положениях С2 и С6 - тремя параметрами, служащими основой для классификации ГЭК. В целом препараты крахмалов целесообразнее классифицировать по поколениям: I - высокомолекулярные высокозамещенные крахмалы (ГЭК 450/0.7), II - среднемолекулярные среднезамещенные (ГЭК 200/0.5-0.6) и III - среднемолекулярные

низкозамещенные (ГЭК 130/0.4). Оправдана и более обиходная классификация на хета- (heta-), пента- (penta-) и тетракрахмалы (tetrastarch), соответственно. Нельзя сказать, что задача получения максимально устойчивого к гидролизу вещества является главной при создании препаратов ГЭК. Напротив, чрезмерно длительная циркуляция в крови и депонирование в тканях - недостатки, обуславливающие целый ряд побочных эффектов. Правильно рассчитанный гидролиз приводит к образованию в кровеносном русле крупных осколков молекул, число которых превышает первоначальное, а значит, создает коллоидно-осмотическое давление, превышающее исходное. Оптимальный плазмозамещающий раствор группы ГЭК должен состоять из достаточно однородных по размеру молекул, не очень быстро подвергающихся гидролизу, с равномерным постепенным образованием молекул, масса которых немного превышает почечный порог. Эти молекулы в свою очередь подвергаются гидролизу и выведению из организма с мочой. Растворы ГЭК совершенствуются, в последних поколениях их выгодно отличают биологическая инертность, длительная циркуляция в сосудистом русле, отсутствие характерных для декстранов реакций антиген-антитело и низкая аллергенность. Не выявлено для них и повышения уровня гистамина, возникающего при прямом введении растворов желатина, а свойства крупных разветвлённых молекул крахмалов позволяют им удерживаться в просвете капилляров при синдроме повышенной проницаемости и даже служить своеобразной «заплаткой» на повреждённом эндотелии [143]. К недостаткам препаратов ГЭК относится, прежде всего, их довольно высокая цена (примерно в 4 раза выше, чем у полиглюкина). По-видимому, наиболее совершенным коллоидным плазмозаменителем может быть признан препарат ГЭК третьего поколения с молекулярной массой 130, степенью замещения 0,4 и соотношением С2:С6 9:1, получивший коммерческое название "Волювен" (Fresenius Kabi, Германия) [144-146]. В 6% растворе этот плазмозаменитель обеспечивает непосредственный волемический эффект, равный единице, с

четырёхчасовым плато и волемической стабилизацией до 6 часов. Для "Волювена" не описано анафилактоидных реакций, отсутствуют доказательства нарушения функции почек, а максимальная суточная доза может достигать 50 мл/кг.

1.3.3. Влияние плазмозамещаюгцих растворов на систему гемостаза

Применение плазмозамещаюгцих растворов при инфузионно-трансфузионной терапии способно влиять на гемостаз. Можно выделить два механизма реализации данного воздействия: гемодилюция, неизбежно возникающая при использовании плазмозамещающих растворов, а также специфическое взаимодействие коллоидных трансфузионных сред с компонентами системы гемостаза. Стоит отметить, что сами ситуации, при которых требуются переливания ПЗР (травмы, ожоги, инфекции с развитием септического шока и т.п.), вызывают повышение прокоагулянтной и протромботической активности, так как при этом в крови увеличиваются концентрации тканевого фактора или прокоагулянтных белков, происходит активация свёртывания поверхностью бактерий, а также вследствие кровопотери падает давление. Повышенная прокоагулянтная активность может привести к коагулопатии потребления факторов свёртывания с последующим осложнением в виде синдрома диссеминированного внутрисосудистого свёртывания (ДВС), сопровождающегося геморрагиями [147], и объемные трансфузии лишь усугубят подобные осложнения.

Взаимодействие коллоидных трансфузионных сред с компонентами системы гемостаза может привести к снижению коагулянтных свойств крови. Так, например, предполагается, что гидроксиэтилкрахмалы способны образовывать комплексы с фактором фон Виллебранда и фУШ с последующей ускоренной элиминацией их из кровотока [148]. Снижение активности фактора фон Виллебранда косвенно отражается и на функции тромбоцитарного звена, приводя к снижению агрегации тромбоцитов. Взаимодействие коллоидных растворов с мембранами тромбоцитов способно

производить т.н. "силиконизирующее" или "обволакивающее" действие на последние, проявляющееся в образовании пленки из молекул коллоидного раствора на поверхности тромбоцитов, препятствующей их адгезии и агрегации [149]. Данный механизм описан как для препаратов ГЭК, так и для декстранов [150,151]. Применение декстранов также может привести к активации фибринолиза [152], формирующийся же под влиянием декстрана тромб получается рыхлым и легче подвергается деструкции [153].

Применяемые в клинической практике ПЗР не содержат в своём составе компонентов системы свёртывания крови, поэтому переливание значительных объёмов этих растворов ведёт к разбавлению плазмы и, следовательно, к изменению в концентрациях факторов свёртывания -гемодилюции. Естественно, это сказывается на состоянии коагуляционной системы, однако вопрос о том, какие последствия для её работы имеет подобное разбавление, на данный момент остаётся открытым.

Действительно, снижение концентраций факторов свёртывания при гемодилюции не всегда приводит к возникновению гипокоагуляции (как кажется на первый взгляд), ведь помимо прокоагулянтных факторов, таких как протромбин или фибриноген, происходит разбавление и антикоагулянтных факторов системы свёртывания - антитромбина, протеина С и других. Сложно сказать, как именно отреагирует система на их одновременное разбавление, к снижению концентраций каких из них она станет более чувствительной. Стоит учесть, что состояние свёртывания при этом будет обуславливаться степенью разбавления: при достаточно высокой степени разбавления в системе будет отсутствовать необходимое для формирования сгустка количество фибриногена.

Клинической иллюстрацией гипокоагуляции, возникающей при гемодилюции, яляются геморрагии микрососудистого русла, наблюдающиеся при объемных инфузиях ПЗР [154,155], хотя причиной подобных кровотечений может являться истощение запаса факторов свёртывания при их исходной активации, как, например, в случае ДВС [156]. Вместе с тем,

некоторые исследования фиксируют возникновение гиперкоагуляционных и тромботических осложнений при операциях, требующих объемных вливаний ПЗР [157-159], однако повышенная активация свёртывания может быть следствием стресса и наличия раневых поверхностей, сопутствующих подобным операциям.

Экспериментальные модели in vitro также дают неоднозначные и порой противоречивые результаты. Определение стандартных времен свёртывания при разбавлении крови ПЗР показывает, что ПЗР вызывают гипокоагуляцию - времена свёртывания удлиняются относительно таковых в неразбавленных образцах [155,156,160]. В работах с использованием тромбоэластографии также показано снижение скорости образования и силы сгустка при разбавлении плазмы ПЗР [161] и ингибировании свёртывания при разбавлении крови различными ПЗР [162]. Авторы последней работы оценивали систему свёртывания, определяя в разбавленной крови концентрацию тромбин-АТ III комплекса, что не вполне корректно, ведь разбавление крови приводит к снижению концентрации AT III и, следовательно, к снижению количества комплексов тромбин-АТ III. Тем не менее, ряд тромбоэластографических исследований, проведенных на разбавленных плазмах, демонстрирует ускорение активации свёртывания [163,164].

Измерение влияния гемодилюции на свёртывание при одинаковых степенях разбавления in vitro и in vivo показало, что разбавления, приводящие к замедлению свёртывания in vitro, могут приводить к гиперкоагуляции in vivo [165,166]. По всей видимости, снижение концентраций факторов свёртывания в организме не пропорционально степени разбавления, так как недостающие факторы могут выходить в кровоток из различных депо (например, из печени). Это приводит к тому, что реальная степень разбавления в организме оказывается меньше, чем ожидаемая или получаемая in vitro.

В другом исследовании сравнивали образцы разбавленной Рингер-лактатом плазмы пациентов, подвергаемых операциям на сердце, с образцами их же плазмы, разбавленной in vivo. В результате было получено, что гемодилюция кристаллоидным раствором как in vivo, так и in vitro укорачивает активированное время свёртывания и параметры тромбоэластограммы [167], однако механизм возникновения гипрекоагуляции определен не был.

Описанные противоречия в получаемых результатах ставят вопрос об адекватности тестов, используемых при исследовании свёртывания in vitro. Классические клоттинговые тесты, нашедшие наиболее широкое применение, в целом чувствительны к изменениям факторов свёртывания, а не ингибиторов. Методика постановки этих тестов предполагает разведение плазмы в несколько раз, а используемая в них активация системы свёртывания достаточно сильна и далека от физиологических условий. Логично предположить, что данные тесты вряд ли способны отобразить гиперкоагуляцию при гемодилюции. Новые и активно развиваемые методы анализа системы свёртывания - тест генерации тромбина [168] и тест тромбодинамики, в основе которого лежит измерение пространственной скорости роста фибринового сгустка [169], - используют более слабую активацию, близкую к существующей в организме, что делает их чувствительными к состояниям гипо- и гиперкоагуляции.

При использовании этих методов для оценки статуса системы свёртывания в плазме, in vitro разбавленной различными ПЗР, было обнаружено, что при разбавлении плазмы до 2,5-3 раз происходит усиление свёртывания [170]. Разбавление плазмы как кристаллоидными, так и коллоидными растворами приводит к увеличению генерируемого тромбина, тогда как параметры пространственной динамики свёртывания при разбавлении чувствительны к типу используемого ПЗР — кристаллоидный физиологический раствор активирует свертывание при разбавлении плазмы, различные виды

коллоидов могут как увеличивать, так и практически не изменять, а иногда и уменьшать скорость роста фибринового сгустка в пространстве.

Влияние гемодилюции на свёртывание in vivo было изучено на двух группах пациентов (здоровые добровольцы и доноры костного мозга с кровопотерей 1-2 л), которым переливали как коллоидные, так и кристаллоидные растворы [171]. Состояние системы гемостаза при этом оценивали, измеряя скорости роста сгустка в пространстве, эндогенный тромбиновый потенциал и параметры тромбоэластографии с течением времени после инфузии ПЗР. Исследуемые параметры были повышены для обеих групп пациентов через 2 часа после гемодилюции, после чего постепенно снижались, достигая в большинстве случаев исходного уровня через 48 часов после инфузии.

Наблюдаемое появление гиперкоагуляции при разбавлении плазмы кристаллоидными растворами, а также то, что при восполнении кровопотери в первую очередь всегда переливают самый популярный из них -физиологический раствор, - навело авторов работы [170] на мысль о введении ингибитора тромбина в состав стандартного кристаллоидного ПЗР. Это позволило бы предупредить гиперкоагуляцию при гемодилюции таким раствором. При экспериментальной проверке этой гипотезы в состав ПЗР вводился антитромбин III или разработанный авторами синтетический низкомолекулярный ингибитор тромбина. Показано, что подобный манёвр приводит к частичной коррекции гиперкоагуляционных нарушений in vitro.

При обобщении сказанного становится понятно, что реакция системы свёртывания на разбавление искусственными плазмозамещающими растворами зависит от массы факторов: типа ПЗР, степени разбавления, времени после гемодилюции, через которое оценивается свёртывание, и методов такой оценки, степени травмы и её способности активировать свёртывание, и других. Эти факторы, видимо, и лежат в основе противоречивых данных, получаемых разными исследователями. В ряде работ [163,164,170,171] было показано, что при умеренных степенях

разбавления крови (до 2-2,5 раз) ПЗР вызывают гиперкоагуляцию. Высказанная идея о добавлении в ПЗР ингибиторов свёртывания представляется хорошим и элегантным способом предотвратить эффект гемодилюционной гиперкоагуляции.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

В работе использовали бедную тромбоцитами (platelet poor plasma, РРР) или свободную от тромбоцитов (platelet free plasma, PFP) плазму крови человека, приготовленную из крови здоровых доноров, заготовленной на 3,8% цитрате натрия (pH 5.5) на станции переливания крови ГНЦ МЗСР. Соотношение кровь : цитрат составляло 9:1. Для приготовления РРР кровь центрифугировали 15 минут при 1600g и комнатной температуре. Чтобы приготовить свободную от тромбоцитов плазму, РРР дополнительно центрифугировали 5 минут при 10000g и комнатной температуре.

Работу с животными проводили на беспородных мышах линии C57BL/6 (самки), и крысах линии Wistar (самцы), а также на кроликах породы Советская Шиншилла (самцы). Условия содержания (виварий) и работы с животными соответствовали международным требованиям [172]. Проведение исследований было одобрено этическим комитетом Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. Для наркотизации животных использовали натриевую соль тиопентала (ОАО «Синтез», Россия). При определении острой токсичности препарата для улучшения его растворимости использовали кремофор EL (макрогол-35-глицерол-рицинолеат, «Caesar & Loretz GmbH», Германия).

Низкомолекулярный прямой синтетический ингибитор тромбина HC-019s-ЮС (19s) был разработан совместно сотрудниками ЦТПФХФ РАН (Москва, Россия), лаборатории физической биохимии Гематологического научного центра МЗСР РФ (Москва, Россия) и Научно-исследовательского вычислительного центра МГУ (Москва, Россия) и синтезирован в Институте органической химии РАН (Москва, Россия). Структура ингибитора приведена на рис. 8.

о"

РЗ Р2 PI

Рис. В. Структура низкомолекулярного прямого ингибитора тромбина HC-019s-IOC с обозначением отдельных фрагментов молекулы ингибитора (PI, Р2 и РЗ), связывающихся с различными участками активного центра в молекуле тромбина (SI, S2 и S3, соответственно)

Для растворения ингибитора при приготовлении его растворов различных концентраций использовали диметилсульфоксид (ДМСО) («Serva», Германия), этанол 95% («Росбио», Россия) или физиологический раствор -0,9% раствор хлорида натрия (ООО «Завод Медсинтез», Россия).

Для измерения активности тромбина и фактора Ха в буферных системах были использованы специфичный по отношению к тромбину хромогенный субстрат Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA (Хромозим-ТН, СТН), где pNA - остаток пара-нитроанилина, синтезированный в Российском кардиологическом научно-производственном комплексе Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи, и специфичный по отношению к фактору Ха хромогенный субстрат S2765 («Chromogenix», Италия). Лиофильно высушенный человеческий тромбин был произведен НПО «Ренам» (Россия), а человеческий фактор Ха - фирмой «Enzyme Research Laboratories» (США).

При измерении генерации тромбина был использован медленный флюорогенный тромбиновый субстрат Z-Gly-Gly-Arg-AMC-HCl, где Z -остаток бензилоксикарболина, a AMC - остаток 7-амино-4-метилкумарина («Bachem», Швейцария); фосфатидилсерин и фосфатидилхолин («Avanti Polar Lipid Inc.», США); 7-амино-4-метилкумарин (AMC) фирмы «Sigma» (США).

Для определения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ) и тромбинового времени (ТВ) пользовались готовыми наборами реагентов «Коагуло-Тест», «Диагем-П» и «Тромбин-Тест», соответственно, производства НПО «Ренам» (Москва, Россия).

В экспериментах по измерению тромбодинамики (определению пространственного роста фибринового сгустка) использовали пластиковые измерительные кюветы и активаторные вставки к ним с иммобилизованным на торцевой поверхности тканевым фактором (ООО «Гемакор», Россия). Контактную активацию в пробах предотвращали, добавляя ингибитор трипсина из кукурузы (corn trypsin inhibitor, CTI), который является также ингибитором фактора ХПа. CTI был выделен в Институте Белка РАН (Пущино, Россия).

В работе были также использованы: лиофильно высушенный МИЧ-аттестованный тромбопластин из мозга кролика («Ренам», Россия); полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой бОООДа («Serva», Германия); 4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазин-2-этаносульфоновая кислота (HEPES) и безводный СаС12 («Sigma», США); хлорид натрия и трехзамещенный цитрат натрия («Реахим», Россия); а также 10% молочная кислота («Labchem Inc.», США).

Все остальные использованные в работе реактивы были отечественного производства (марки «чда» или «хч»),

2.2. Методы

2.2.1. Компьютерный дизайн и синтез нового прямого низкомолекулярного ингибитора тромбина

Исследуемый низкомолекулярный ингибитор тромбина был получен в результате комплексной работы по поиску нового ряда ингибиторов тромбина, включавшей в себя такие стадии, как компьютерный дизайн и скрининг химических структур различных органических лигандов -

потенциальных ингибиторов тромбина (как уже существующих, так и виртуальных) с помощью докинговой программы SOL; отбор наиболее перспективных соединений; синтез и последующая экспериментальная проверка прямого антитромбинового и антикоагулянтного действия этих соединений. Детальное описание всех этих процессов не входит в задачи настоящей работы, но может быть найдено в литературе [173-178].

Вкратце, программа докинга SOL рассчитывает величину свободной энергии связи органического лиганда с активным центром фермента-мишени, используя алгоритм поиска минимума энергий фермент-лигандных взаимодействий. Активный центр фермента представлен при этом набором решеток для описания различных типов фермент-лигандных взаимодействий - электростатических, Ван-дер-Ваальсовых. Использованные параметры алгоритма были исходно подобраны так, чтобы наилучшим образом описать комплексы тромбина с его известными ингибиторами - бензимидазолом и аргатробаном. При докинге были рассмотрены все возможные положения каждого лиганда внутри области докинга, покрывающей активный центр тромбина. Фермент при этом полагали неподвижным, лиганды же рассмативались как полностью подвижные - все их вращательные степени свободы были разморожены; длины связей и валентные углы не менялись.

На первой стадии компьютерного скрининга работа велась со структурами, входящими в базу данных NCI (National Cancer Institute, Национальный институт рака) - из известных соединений, в принципе способных взаимодействовать с активным центром тромбина, отбирались те, которые удовлетворяли ряду критериев: достаточно высокие значения свободной энергии при связывании лиганда с активным центром тромбина (т.н. скоринг-функция) AGcmi3< -5.5 ккал/моль, приемлемое расположение лиганда в активном центре тромбина, которое проверяли визуально. Эта стадия служила, главным образом, для уточнения параметров и улучшения настройки докинговой программы для расчета связывания лигандов в активном центре тромбина. Второй этап включал непосредственное

конструирование новых химических веществ с возможным антитромбиновым действием - после скрининга виртуальных лигандов из библиотек NCI и ИОХ РАН на основе упомянутых выше критериев были выяснены структуры фрагментов PI, Р2 и РЗ молекул потенциальных ингибиторов.

Синтез новых прямых ингибиторов тромбина был проведен Институтом Органической Химии РАН, последовательность стадий синтеза представлена на рис. 9.

Похожие диссертационные работы по специальности «Биофизика», 03.01.02 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Суров, Степан Сергеевич

выводы

1. Показано, что 19s является высокоэффективным конкурентным ингибитором человеческого тромбина в буферной системе, но практически не ингибирует фактор Xa (K¡ составляют 0,8 нМ и 92,5 мкМ для тромбина и фХа, соответственно).

2. Новый ингибитор тромбина обладает антикоагулянтными свойствами в плазме in vitro: а) удлиняет стандартные времена свертывания (концентрации, вызывающие удвоение АЧТВ, ПВ и ТВ в плазме человека, составляют 282 нМ, 550 нМ и 25 нМ, соответственно); б) снижает эндогенный тромбиновый потенциал в плазме человека (IC50 - 550 нМ), кролика (1С50 = 250 нМ) и крысы (1С50 = 220 нМ); в) снижает параметры теста тромбодинамики - начальную и стационарную скорости роста сгустка в пространстве и его размер после 60 мин свертывания (1С5о составляют 21 мкМ, 15 мкМ и 11 мкМ соответственно).

3. Показано, что новый ингибитор стабилен при стерилизации автоклавированием и сохраняет свою активность при более чем двухгодовом хранении в водных растворах как при +4°С, так и при комнатной температуре.

4. Показано, что ингибитор 19s является достаточно безопасным. Величина острой токсичности 19s при внутрибрюшинном введении мышам (LD50 2ч) составляет 419 мг/кг, что более, чем в 1000 раз превышает его предполагаемую терапевтическую концентрацию.

5. Показано, что исследуемый ингибитор может быть использован в качестве антитромботического средства, так как способен снижать генерацию тромбина у кроликов in vivo.

6. Продемонстрировано, что при умеренных степенях гемодилюции (23±4,5%) физиологическим раствором у крыс развивается состояние гиперкоагуляции. Добавление ингибитора тромбина 19s (2 мкМ) в физиологический раствор позволяет скомпенсировать вызываемые гемодилюцией гиперкоагуляционные нарушения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе была проведена всесторонняя экспериментальная проверка антитромбиновых и антикоатулянтных свойств нового низкомолекулярного прямого ингибитора тромбина HC-019s-IOC. При этом была разработана специальная многоступенчатая стратегия этих испытаний, которая может быть применена также для исследования других новых ингибиторов тромбина. Эта проверка показала высокую эффективность соединения НС-19s-IOC как ингибитора тромбина не только в водных растворах, но и в плазме in vitro. В этих экспериментах новый ингибитор ничем не уступал единственному используемому сегодня в клинике прямому низкомолекулярному ингибитору тромбина - аргатробану, а по некоторым показателям даже превосходил его. HC-019s-IOC проявил также наличие реальной антикоагулянтной активности при введении в организм in vivo в моделях на животных. Было показано, что новый ингибитор является безопасным, а также обладает прекрасной стабильностью при длительном хранении в водных растворах, что позволяет создать на его основе новый плазмозамещающий раствор. Переливание такого раствора может быть полезным в случае необходимости введения для коррекции кровопотери достаточно больших объемов ПЗР. Как было показано в настоящей работе, умеренная гемодилюция физиологическим раствором in vivo вызывает гиперкоагуляцию, которую может скорректировать введение в исходный ПЗР ингибитора тромбина.

Полученные результаты позволяют надеяться, что новый прямой низкомолекулярный ингибитор тромбина HC-019s-IOC может оказаться перспективным для клинического применения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Суров, Степан Сергеевич, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Шмидт Р, Тевс Г. Физиология человека (том 2). Москва: Мир, 2010.

2. Heemskerk JW, Bevers ЕМ, Lindhout Т. Platelet activation and blood coagulation. Thromb Haemost 2002; 88(2): 186-193.

3. Kalafatis M, Swords NA, Rand MD, Mann KG. Membrane-dependent reactions in blood coagulation: role of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Biochim Biophys Acta 1994; 1227(3): 113-129.

4. Гайтон А., Холл Дж. Медицинская физиология. М., Логосфера, 2008.

5. Butenas S, Mann KG. Blood coagulation. Biochemistry (Mosc) 2002; 67(1): 3-12.

6. Bouchard BA, Tracy PB. Platelet regulation of thrombin generation in cardiovascular disease. Ital Heart J. 2001; 2(11): 819-823.

7. Lanza F, Beretz A, Stierle A, Hanau D, Kubina M, Cazenave JP. Epinephrine potentiates human platelet activation but is not an aggregating agent. Am J Physiol. 1988; 255(6):H1276-88.

8. Sahu SK, Gummadi SN, Manoj N, Aradhyam GK. Phospholipid scramblases: an overview. Arch Biochem Biophys. 2007; 462(1): 103-14.

9. Zwaal RF, Comfurius P, Bevers EM. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim Biophys Acta. 1998; 1376(3): 433-453.

10. Harrison P., Martin Cramer E. Platelet a-granules. Blood Reviews 1993 7(1): 52-62.

11.McNicol A, Israels SJ. Platelet dense granules: structure, function and implications for haemostasis. Thromb Res. 1999; 95(1):1-18.

12. Chesney CM, Pifer D, Colman RW. Subcellular localization and secretion of factor V from human platelets. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981; 78(8):5180-4.

13. Пантелеев MA, Васильев CA, Синауридзе ЕИ, Воробьев АИ, Атауллаханов ФИ. Практическая коагулология. Москва, Практическая Медицина, 2011.

14. Bajaj MS, Birktoft JJ, Steer SA, Bajaj SP. Structure and biology of tissue factor pathway inhibitor. Thromb Haemost. 2001; 86(4): 959-972.

15.Lwaleed BA, Bass PS. Tissue factor pathway inhibitor: structure, biology and involvement in disease. J Pathol. 2006; 208(3):327-39.

16. Crawley JT, Lane DA. The haemostatic role of tissue factor pathway inhibitor. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2008; 28(2):233-42.

17. Colman RW, Schmaier AH. Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, profibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes. Blood. 1997; 90(10): 3819-3843.

18.Blomback B. Fibrinogen and fibrin — proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis. Thromb Res. 1996; 83(1): 1-75.

19. Sagripanti A, Carpi A. Antithrombotic and prothrombotic activities of the vascular endothelium. Biomed Pharmacother. 2000; 54(2): 107-11.

20. Шиффман ФДж. Патофизиология крови. СПб: Бином, 2000.

21.Furie В, Furie ВС. Mechanisms of thrombus formation. N Engl J Med. 2008; 359(9):938-49.

22. Brotman DJ, Deitcher SR, Lip GY, Matzdorff AC. Virchow's triad revisited. South Med J. 2004; 97(2):213-4.

23. Goldsack NR, Chambers RC, Dabbagh K, Laurent GJ. Thrombin. Int J Biochem Cell Biol. 1998; 30(6):641-6.

24. Huntington JA. Structural Insights into the Life History of Thrombin, in: Recent Advances in Thrombosis and Hemostasis 2008. Editors Tanaka K., Davie EW. Springer 2008.

25. Owen CA. Prothrombin. In: Nichols WL, Bowie EJ (eds) A history of blood coagulation. Mayo Foundation for Medical Education and Research, Rochester, MN, 2001.

26. Marcum JA. Defending the priority of 'remarkable researches' : The discovery of fibrin ferment. Hist Philos Life Sci. 1998; 20(l):51-76.

27. Bode W, Mayr I, Baumann U, Huber R, Stone SR, Hofsteenge J. The refined 1.9 A crystal structure of human alpha-thrombin: interaction with D-Phe-Pro-Arg

chloromethylketone and significance of the Tyr-Pro-Pro-Trp insertion segment. EMBOJ. 1989;8(11):3467-75.

28. Bode W, Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases. Eur J Biochem 1992; 204: 433-51.

29. Bode W. The structure of thrombin, a chameleon-like proteinase. J Thromb Haemost. 2005; 3(11):2379-88.

30. Kounnas MZ, Church FC, Argraves WS, Strickland DK. Cellular internalization and degradation of antithrombin III-thrombin, heparin cofactor II-thrombin, and alpha 1-antitrypsin-trypsin complexes is mediated by the low density lipoprotein receptor-related protein. J Biol Chem. 1996; 271(11):6523-9.

31. Tollefsen DM, Blank MK. Detection of a new heparin-dependent inhibitor of thrombin in human plasma. J Clin Invest 1981; 68(3): 589-596.

32. Weiler H, Isermann BH. Thrombomodulin. J Thromb Haemost. 2003;l(7):1515-24.

33. De Cristofaro R, Carotti A, Akhavan S, Palla R, Peyvandi F, Altomare C, Mannucci PM. The natural mutation by deletion of Lys9 in the thrombin A-chain affects the pKa value of catalytic residues, the overall enzyme's stability and conformational transitions linked to Na+ binding. FEBS J. 2006; 273(1): 159-69.

34. Crawley JT, Zanardelli S, Chion CK, Lane DA. The central role of thrombin in hemostasis. J Thromb Haemost. 2007; 5(Suppl 1):95-101.

35. Bode W, Turk D, Karshikov A. The refined 1.9-A X-ray crystal structure of D-Phe-Pro-Arg chloromethylketone-inhibited human alpha-thrombin: structure analysis, overall structure, electrostatic properties, detailed active-site geometry, and structure-function relationships. Protein Sci. 1992; 1(4):426-71

36. Huntington JA. Molecular recognition mechanisms of thrombin. J Thromb Haemost. 2005; 3(8):1861-72.

37. Bock PE, Panizzi P, Verhamme IM. Exosites in the substrate specificity of blood coagulation reactions. J Thromb Haemost. 2007; 5(Suppl l):81-94.

38. Di Cera E, Guinto ER, Vindigni A, Dang QD, Ayala YM, Wuyi M, Tulinsky A. The Na+ binding site of thrombin. J Biol Chem. 1995; 270(3 8):22089-92.

39. Dang OD, Vindigni A, Di Cera E. An allosteric switch controls the procoagulant and anticoagulant activities of thrombin. Proc Natl Acad Sei USA. 1995; 92( 13):5977-81.

40. Huntington JA, Esmon CT. The molecular basis of thrombin allostery revealed by a 1.8 A structure of the "slow" form. Structure (Camb) 2003; 11: 469-79.

41. Pineda AO, Chen ZW, Bah A, Garvey LC, Mathews FS, Di Cera E. Crystal structure of thrombin in a self-inhibited conformation. J Biol Chem 2006; 281: 32922-8.

42. Di CeraE. Thrombin interactions. Chest. 2003; 124(3 Suppl):l 1S-7S.

43. Lane DA, Philippou H, Huntington JA. Directing thrombin. Blood. 2005; 106(8):2605-12.

44. Hennekens CH, Sechenova O, Hollar D, Serebruany VL. Dose of aspirin in the treatment and prevention of cardiovascular disease: current and future directions. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2006; 11(3):170-6.

45. Wiviott SD, Braunwald E, McCabe CH, Montalescot G, Ruzyllo W, Gottlieb S, Neumann FJ, Ardissino D, De Servi S, Murphy SA, Riesmeyer J, Weerakkody G, Gibson CM, Antman EM; TRITON-TIMI 38 Investigators. Prasugrel versus Clopidogrel in patients with acute coronary syndromes. N Engl J Med. 2007; 357(20):2001-15.

46. Siller-Matula JM, Krumphuber J, Jilma B. Pharmacokinetic, pharmacodynamic and clinical profile of novel antiplatelet drugs targeting vascular diseases. Br J Pharmacol. 2010; 159(3):502-17.

47.Gurbel PA, Jeong YH, Tantry US. Vorapaxar: a novel protease-activated receptor-1 inhibitor. Expert Opin Investig Drugs. 2011; 20(10): 1445-53.

48. Kong DF, Califf RM, Miller DP, Moliterno DJ, White HD, Harrington RA, Tcheng JE, Lincoff AM, Hasselblad V, Topol EJ. Clinical outcomes of therapeutic agents that block the platelet glycoprotein Ilb/IIIa integrin in ischemic heart disease. Circulation. 1998; 98(25):2829-35.

49. Meadows TA, Bhatt DL. Clinical aspects of platelet inhibitors and thrombus formation. Circ Res. 2007; 100(9): 1261-75.

50. Abraham E, Reinhart K, Opal S, Demeyer I, Doig C, Rodriguez AL, Beale R, Svoboda P, Laterre PF, Simon S, Light B, Spapen H, Stone J, Seibert A, Peckelsen C, De Deyne C, Postier R, Pettila V, Artigas A, Percell SR, Shu V, Zwingelstein C, Tobias J, Poole L, Stolzenbach JC, Creasey AA; OPTIMIST Trial Study Group. Efficacy and safety of tifacogin (recombinant tissue factor pathway inhibitor) in severe sepsis: a randomized controlled trial. JAMA. 2003; 290(2):23 847.

51. Cappello M, Vlasuk GP, Bergum PW, Huang S, Hotez PJ. Ancylostoma caninum anticoagulant peptide: a hookworm-derived inhibitor of human coagulation factor Xa. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92(13):6152-6.

52. Bergum PW, Cruikshank A, Maki SL, Kelly CR, Ruf W, Vlasuk GP. Role of zymogen and activated factor X as scaffolds for the inhibition of the blood coagulation factor Vila-tissue factor complex by recombinant nematode anticoagulant protein c2. J Biol Chem. 2001; 276(13):10063-71.

53. Lee AY, Vlasuk GP. Recombinant nematode anticoagulant protein c2 and other inhibitors targeting blood coagulation factor Vila/tissue factor. J Intern Med. 2003; 254(4):313-21.

54. Rao LV, Ezban M. Active site-blocked activated factor VII as an effective antithrombotic agent: mechanism of action. Blood Coagul Fibrinolysis. 2000; 11 Suppl l:S135-43.

55. Golino P, Ragni M, Cirillo P, D'Andrea D, Scognamiglio A, Ravera A, Buono C, Ezban M, Corcione N, Vigorito F, Condorelli M, Chiariello M. Antithrombotic effects of recombinant human, active site-blocked factor Vila in a rabbit model of recurrent arterial thrombosis. Circ Res. 1998; 82(l):39-46.

56. Hoist J, Kristensen AT, Kristensen HI, Ezban M, Hedner U. Local application of recombinant active-site inhibited human clotting factor Vila reduces thrombus weight and improves patency in a rabbit venous thrombosis model. Eur J Vase Endovasc Surg. 1998; 15(6):515-20.

57. Lineoff AM. First clinical investigation of a tissue-factor inhibitor administered during percutaneous coronary revascularization: a randomized, double-blind, dose-escalation trial assessing safety and efficacy of FFR-FVIIa in percutaneous transluminal coronary angioplasty (ASIS) trial [abstract]. J Am Coll Cardiol 2000; 36:312.

58. Rusconi CP, Scardino E, Layzer J, Pitoc GA, Ortel TL, Monroe D, Sullenger BA. RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa. Nature. 2002; 419(6902):90-4.

59. Dyke CK, Steinhubl SR, Kleiman NS, Cannon RO, Aberle LG, Lin M, Myles SK, Melloni C, Harrington RA, Alexander JH, Becker RC, Rusconi CP. First-in-human experience of an antidote-controlled anticoagulant using RNA aptamer technology: a phase la pharmacodynamic evaluation of a drug-antidote pair for the controlled regulation of factor IXa activity. Circulation. 2006; 114(23):2490-7.

60. Eikelboom JW, Zelenkofske SL, Rusconi CP. Coagulation factor IXa as a target for treatment and prophylaxis of venous thromboembolism. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2010; 30(3):382-7.

61. Ettingshausen CE, Veldmann A, Beeg T, Schneider W, Jäger G, Kreuz W. Replacement therapy with protein C concentrate in infants and adolescents with meningococcal sepsis and purpura fulminans. Semin Thromb Hemost. 1999; 25(6):537-41.

62. Bernard GR, Vincent JL, Laterre PF, et al. Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis. N Engl J Med 2001; 344:699-709.

63. Kearon C, Comp P, Douketis JD, et al. Dose-response study of recombinant human soluble thrombomodulin (ART-123) in the prevention of venous thromboembolism after total hip replacement. J Thromb Haemost 2005; 3:962968.

64. Rezaie AR. Prothrombin protects factor Xa in the prothrombinase complex from inhibition by the heparin-antithrombin complex. Blood. 2001; 97(8):2308-13.

65. Krishnaswamy S, Vlasuk GP, Bergum PW. Assembly of the prothrombinase complex enhances the inhibition of bovine factor Xa by tick anticoagulant peptide. Biochemistry. 1994; 33(25):7897-907.

66. Hérault JP, Bernat A, Pflieger AM, Lormeau JC, Herbert JM. Comparative effects of two direct and indirect factor Xa inhibitors on free and clot-bound prothrombinase. J Pharmacol Exp Ther. 1997; 283(1): 16-22.

67. Walenga JM, Jeske WP, Samama MM, Frapaise FX, Bick RL, Fareed J. Fondaparinux: a synthetic heparin pentasaccharide as a new antithrombotic agent. Expert Opin Investig Drugs. 2002; 11(3):397-407.

68. Herbert JM, Hérault JP, Bernat A, van Amsterdam RG, Lormeau JC, Petitou M, van Boeckel C, Hoffmann P, Meuleman DG. Biochemical and pharmacological properties of SANORG 34006, a potent and long-acting synthetic pentasaccharide. Blood. 1998; 91(11):4197-205.

69. Nutescu EA, Pater K. Drug evaluation: the directly activated Factor Xa inhibitor otamixaban. IDrugs. 2006; 9(12):854-65.

70. Pinto DJ, Orwat MJ, Koch S, Rossi KA, Alexander RS, Smallwood A, Wong PC, Rendina AR, Luettgen JM, Knabb RM, He K, Xin B, Wexler RR, Lam PY. Discovery of l-(4-methoxyphenyl)-7-oxo-6-(4-(2-oxopiperidin-l-yl)phenyl)-4,5,6,7-tetrahydro-lH-pyrazolo[3,4-c]pyridine-3-carboxamide (apixaban, BMS-562247), a highly potent, selective, efficacious, and orally bioavailable inhibitor of blood coagulation factor Xa. J Med Chem. 2007 ; 50(22):5339-56.

71. Roehrig S, Straub A, Pohlmann J, Lampe T, Pernerstorfer J, Schlemmer KH, Reinemer P, Perzborn E. Discovery of the novel antithrombotic agent 5-chloro-N-({(5S)-2-oxo-3- [4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l,3-oxazolidin-5-yl}methyl)thiophene- 2-carboxamide (BAY 59-7939): an oral, direct factor Xa inhibitor. J Med Chem. 2005; 48(19):5900-8.

72. Eikelboom JW, Weitz JI. New anticoagulants. Circulation. 2010; 121(13):1523-32.

73. Eriksson BI, Quinlan DJ, Weitz JI. Comparative pharmacodynamics and pharmacokinetics of oral direct thrombin and factor xa inhibitors in development. Clin Pharmacokinet. 2009; 48(1): 1-22.

74. Kaiser B. Factor Xa Versus Factor Ha Inhibitors. Clin Appl Thromb Hemost. 1997; 3(1): 16-24.

75. Weitz JI. Factor Xa or thrombin: is thrombin a better target? J Thromb Haemost. 2007; 5 Suppl 1:65-7.

76. Prager NA, Abendschein DR, McKenzie CR, Eisenberg PR. Role of thrombin compared with factor Xa in the procoagulant activity of whole blood clots. Circulation. 1995; 92(4):962-7.

77. Weitz JI, Hirsh J, Samama MM New antithrombotic drugs: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition). Chest. 2008; 133(6 Suppl):234S-256S.

78. Mousa SA. Novel Anticoagulant Therapy: Principle and Practice, in: Thrombin: Physiology and Disease. Editors Maragoudakis ME, Tsopanoglou NE. Springer Science+Business Media, LLC 2009.

79. Biemond BJ, Friederich PW, Levi M, Vlasuk GP, Biiller HR, ten Cate JW. Comparison of sustained antithrombotic effects of inhibitors of thrombin and factor Xa in experimental thrombosis. Circulation. 1996; 93(1): 153-60.

80. van Ryn J, Hauel N, Priepke H, Gerlach K, Schuler-Metz A, Wienen W. Comparison of the Antithrombotic Effectiveness of the Direct Thrombin Inhibitor, Dabigatran Etexilate, and Two Factor Xa Inhibitors in an A-V Shunt Model of Thrombosis in Rabbits. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2007 110: Abstract 3154.

81.Furie B, Bouchard BA, Furie BC. Vitamin K-dependent biosynthesis of gamma-carboxyglutamic acid. Blood. 1999; 93(6): 1798-808.

82. Harder S, Thurmann P. Clinically important drug interactions with anticoagulants. An update. Clin Pharmacokinet. 1996; 30(6):416-44.

83. Palareti G, Leali N, Coccheri S, Poggi M, Manotti C, D'Angelo A, Pengo V, Erba N, Moia M, Ciavarella N, Devoto G, Berrettini M, Musolesi S. Bleeding

complications of oral anticoagulant treatment: an inception-cohort, prospective collaborative study (ISCOAT). Italian Study on Complications of Oral Anticoagulant Therapy. Lancet. 1996; 348(9025):423-8.

84. Krynetskiy E, McDonnell P. Building individualized medicine: prevention of adverse reactions to warfarin therapy. J Pharmacol Exp Ther. 2007; 322(2):427-34.

85. Holbrook AM, Pereira JA, Labiris R, McDonald H, Douketis JD, Crowther M, Wells PS. Systematic overview of warfarin and its drug and food interactions. Arch Intern Med. 2005; 165(10):1095-106.

86. Hirsh J, Dalen JE, Deykin D, Poller L. Heparin: mechanism of action, pharmacokinetics, dosing considerations, monitoring, efficacy, and safety. Chest. 1992; 102(4 Suppl):337S-351S.

87. Hirsh J, Warkentin TE, Raschke R, Granger C, Ohman EM, Dalen JE. Heparin and low-molecular-weight heparin: mechanisms of action, pharmacokinetics, dosing considerations, monitoring, efficacy, and safety. Chest. 1998; 114(5 Suppl):489S-510S.

88. Jin L, Abrahams JP, Skinner R, Petitou M, Pike RN, Carrell RW. The anticoagulant activation of antithrombin by heparin. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94(26): 14683-8.

89. Boneu B. Low molecular weight heparins: are they superior to unfractionated heparins to prevent and to treat deep vein thrombosis? Thromb Res. 2000; 100(2):V113-20.

90. Tollefsen DM, Majerus DW, Blank MK. Heparin cofactor II. Purification and properties of a heparin-dependent inhibitor of thrombin in human plasma. J Biol Chem. 1982; 257(5):2162-9.

91. Hoppensteadt DA, Walenga JM, Fasanella A, Jeske W, Fareed J. TFPI antigen levels in normal human volunteers after intravenous and subcutaneous administration of unfractionated heparin and a low molecular weight heparin. Thromb Res. 1995; 77(2): 175-85.

92. Hirsh J, Warkentin TE, Shaughnessy SG, Anand SS, Halperin JL, Raschke R, Granger C, Ohman EM, Dalen JE. Heparin and low-molecular-weight heparin: mechanisms of action, pharmacokinetics, dosing, monitoring, efficacy, and safety. Chest. 2001; 119(1 Suppl):64S-94S.

93. van Den Belt AG, Prins MH, Lensing AW, Castro AA, Clark OA, Atallah AN, Burihan E. Fixed dose subcutaneous low molecular weight heparins versus adjusted dose unfractionated heparin for venous thromboembolism. Cochrane Database Syst Rev. 2000;(2):CD001100.

94. Quinlan DJ, McQuillan A, Eikelboom JW. Low-molecular-weight heparin compared with intravenous unfractionated heparin for treatment of pulmonary embolism: a meta-analysis of randomized, controlled trials. Ann Intern Med. 2004; 140(3):175-83.

95. Franchini M. Heparin-induced thrombocytopenia: an update. Thromb J. 2005;3:14.

96. Brieger DB, Mak KH, Kottke-Marchant K, Topol EJ. Heparin-induced thrombocytopenia. J Am Coll Cardiol. 1998; 31(7): 1449-59.

97. Cines DB, Rauova L, Arepally G, Reilly MP, McKenzie SE, Sachais BS, Poncz M. Heparin-induced thrombocytopenia: an autoimmune disorder regulated through dynamic autoantigen assembly/disassembly. J Clin Apher. 2007; 22(1 ):31-6.

98. Wallis RB. Hirudins: from leeches to man. Semin Thromb Hemost. 1996; 22(2): 185-96.

99. Stone SR, Hofsteenge J. Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudin. Biochemistry. 1986; 25(16):4622-8.

100. Römisch J, Diehl KH, Hoffmann D, Krahl-Mateblowski U, Reers M, Stüber W, Pâques EP. Comparison of in vitro and in vivo properties of rhirudin (HBW 023) and a synthetic analogous peptide. Haemostasis. 1993; 23(5):249-58.

101. Braun PJ, Dennis S, Hofsteenge J, Stone SR. Use of site-directed mutagenesis to investigate the basis for the specificity of hirudin. Biochemistry. 1988;27(17):6517-22.

102. Salzet M. Leech thrombin inhibitors. Curr Pharm Des. 2002; 8(7):493-503.

103. Matheson AJ, Goa KL. Desirudin: a review of its use in the management of thrombotic disorders. Drugs. 2000; 60(3):679-700.

104. Eichler P, Friesen HJ, Lubenow N, Jaeger B, Greinacher A. Antihirudin antibodies in patients with heparin-induced thrombocytopenia treated with lepirudin: incidence, effects on aPTT, and clinical relevance. Blood. 2000; 96(7):2373-8.

105. Greinacher A, Lubenow N, Eichler P. Anaphylactic and anaphylactoid reactions associated with lepirudin in patients with heparin-induced thrombocytopenia. Circulation. 2003; 108(17):2062-5.

106. Maraganore JM, Bourdon P, Jablonski J, Ramachandran KL, Fenton JW 2nd. Design and characterization of hirulogs: a novel class of bivalent peptide inhibitors of thrombin. Biochemistry. 1990; 29(30):7095-101.

107. Shammas NW. Bivalirudin: pharmacology and clinical applications. Cardiovasc Drug Rev. 2005; 23(4):345-60.

108. Schwienhorst A. Direct thrombin inhibitors - a survey of recent developments. Cell Mol Life Sci. 2006; 63(23):2773-91.

109. Nar H, Bauer M, Schmid A, Stassen JM, Wienen W, Priepke HW, Kauffmann IK, Ries UJ, Hauel NH. Structural basis for inhibition promiscuity of dual specific thrombin and factor Xa blood coagulation inhibitors. Structure. 2001; 9(l):29-37.

110. Okamoto S, Hijikata A, Kikumoto R, Tonomura S, Hara H, Ninomiya K, Maruyama A, Sugano M, Tamao Y. Potent inhibition of thrombin by the newly synthesized arginine derivative No. 805. The importance of stereo-structure of its hydrophobic carboxamide portion. Biochem Biophys Res Commun. 1981; 101(2):440-6.

111. Jeske W, Walenga JM, Lewis BE, Fareed J. Pharmacology of argatroban. Expert Opin Investig Drugs. 1999; 8(5):625-54.

112. Kondo LM, Wittkowsky AK, Wiggins BS. Argatroban for prevention and treatment of thromboembolism in heparin-induced thrombocytopenia. Ann Pharmacother. 2001; 35(4):440-51.

113. Walenga JM, Ahmad S, Hoppensteadt D, Iqbal O, Hursting MJ, Lewis BE. Argatroban therapy does not generate antibodies that alter its anticoagulant activity in patients with heparin-induced thrombocytopenia. Thromb Res. 2002; 105(5):401-5.

114. Walenga JM. An overview of the direct thrombin inhibitor argatroban. Pathophysiol Haemost Thromb. 2002; 32 Suppl 3:9-14.

115. Vermeer F, Vahanian A, Fels PW, Besse P, Müller E, Van de Werf F, Fitzgerald D, Darius H, Puel J, Garrigou D, Simoons ML; ARGAMI Study Group. Argatroban and alteplase in patients with acute myocardial infarction: the ARGAMI Study. J Thromb Thrombolysis. 2000; 10(3):233-40.

116. Di Nisio M, Middeldorp S, Büller HR. Direct thrombin inhibitors. N Engl J Med. 2005;353(10): 1028-40.

117. European public assessment report (EPAR) for Pradaxa. European Medicines Agency. Доступно по адресу http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR__-

Summary for the public/human/000829/WC500041060.pdf.

118. Eisert WG, Hauel N, Stangier J, Wienen W, Clemens A, van Ryn J. Dabigatran: an oral novel potent reversible nonpeptide inhibitor of thrombin. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2010; 30(10):1885-9.

119. Stangier J, Rathgen K, Stähle H, Gansser D, Roth W. The pharmacokinetics, pharmacodynamics and tolerability of dabigatran etexilate, a new oral direct thrombin inhibitor, in healthy male subjects. Br J Clin Pharmacol. 2007; 64(3):292-303.

120. Blech S, Ebner T, Ludwig-Schwellinger E, Stangier J, Roth W. The metabolism and disposition of the oral direct thrombin inhibitor, dabigatran, in humans. Drug Metab Dispos. 2008; 36(2):386-99.

121. Fareed J, Wahi R, Hoppensteadt DA. An update on new anticoagulant drugs. Eastern Journal of Medicine. 2009; 14: 84-93.

122. Gustafsson D, Antonsson T, Bylund R, Eriksson U, Gyzander E, Nilsson I, Elg M, Mattsson C, Deinum J, Pehrsson S, Karlsson O, Nilsson A, Sorensen H. Effects of melagatran, a new low-molecular-weight thrombin inhibitor, on thrombin and fibrinolytic enzymes. Thromb Haemost. 1998; 79:1108.

123. Gustafsson D, Elg M. The pharmacodynamics and pharmacokinetics of the oral direct thrombin inhibitor ximelagatran and its active metabolite melagatran: a mini-review. Thromb Res. 2003; 109 Suppl 1:S9-15.

124. Gustafsson D, Nystrôm J, Carlsson S, Bredberg U, Eriksson U, Gyzander E, Elg M, Antonsson T, Hoffmann K, Ungell A, Sorensen H, Nâgârd S, Abrahamsson A, Bylund R. The direct thrombin inhibitor melagatran and its oral prodrug H 376/95: intestinal absorption properties, biochemical and pharmacodynamic effects. Thromb Res. 2001; 101(3): 171-81.

125. Olsson SB; Executive Steering Committee of the SPORTIF III Investigators. Stroke prevention with the oral direct thrombin inhibitor ximelagatran compared with warfarin in patients with non-valvular atrial fibrillation (SPORTIF III): randomised controlled trial. Lancet. 2003; 362(9397) :1691-8.

126. Albers GW, Diener HC, Frison L, Grind M, Nevinson M, Partridge S, Halperin JL, Horrow J, Olsson SB, Petersen P, Vahanian A; SPORTIF Executive Steering Committee for the SPORTIF V Investigators. Ximelagatran vs warfarin for stroke prevention in patients with nonvalvular atrial fibrillation: a randomized trial. JAMA. 2005; 293(6):690-8.

127. Testa L, Andreotti F, Biondi Zoccai GG, Burzotta F, Bellocci F, Créa F. Ximelagatran/melagatran against conventional anticoagulation: a meta-analysis based on 22,639 patients. Int J Cardiol. 2007; 122(2): 117-24.

128. "AstraZeneca Decides to Withdraw Exanta" (Press release). AstraZeneca. February 14, 2006. Доступно по адресу

http://www.astrazeneca.com/Media/Press-releases/Article/2006Q214— AstraZeneca-Decides-to-Withdraw-Exanta.

129. Deinum J, Mattsson C, Inghardt T, Elg M. Biochemical and pharmacological effects of the direct thrombin inhibitor AR-H067637. Thromb Haemost. 2009; 101(6):1051-9.

130. Schwienhorst A. Direct thrombin inhibitors - a survey of recent developments. Cell Mol Life Sci. 2006; 63(23):2773-91.

131. Spahn DR, Rossaint R. Coagulopathy and blood component transfusion in trauma. Br J Anaesth, 2005, 95(2): 130-139.

132. Phillips GR 3rd, Kauder DR, Schwab CW. Massive blood loss in trauma patients. The benefits and dangers of transfusion therapy. Postgrad Med. 1994; 95(4):61-2, 67-72.

133. Guidet B, Soni N, Delia Rocca G, Kozek S, Vallet B, Annane D, James M. A balanced view of balanced solutions. Crit Care. 2010; 14(5):325.

134. Буланов АЮ. Место коллоидных и кристаллоидных объёмозамещающих растворов в терапии острой кровопотери. Consilium medicum. Хирургия. 2006, 8(2).

135. Nolan J. Fluid replacement. Br Med Bull. 1999; 55(4):821-843.

136. Handy JM, Soni N. Physiological effects of hyperchloraemia and acidosis. Br J Anaesth. 2008; 101(2):141-50.

137. Moretti EW, Robertson KM, El-Moalem H, Gan TJ. Intraoperative colloid administration reduces postoperative nausea and vomiting and improves postoperative outcomes compared with crystalloid administration. Anesth Analg. 2003; 96(2):611-617.

138. Cohrane Injuries Group Albumin Reviewers. Human albumin administration in critically ill patients: a systematic review of randomized controlled trials. BMJ. 1998; 317(7153): 235-240.

139. Буланов АЮ. Инфузионная терапия: современное состояние, проблемы, перспективы. Вестник службы крови России, 2005, 4: 1.

140. Boldt J, Suttner S. Plasma substitutes. Minerva Anestesiol. 2005; 71(12):741-58.

141. Davidson IJ. Renal impact of fluid management with colloids: a comparative review. Eur J Anaesthesiol. 2006; 23(9):721-38.

142. Treib J, Baron JF, Grauer MT, Strauss RG. An international view of hydroxyethyl starches. Intensive Care Med. 1999; 25(3):258-68.

143. Горобец EC. Современные тенденции в периоперационной инфузионной терапии. Consilium medicum, 2002, 4(6).

144. Gallandat Huet RC, Siemons AW, Baus D, van Rooyen-Butijn WT, Haagenaars JA, van Oeveren W, Bepperling F. A novel hydroxyethyl starch (Voluven) for effective perioperative plasma volume substitution in cardiac surgery. Can J Anaesth. 2000; 47(12):1207-15.

145. Waitzinger J, Bepperling F, Pabst G, Opitz J, Muller M, François Baron J. Pharmacokinetics and Tolerability of a New Hydroxyethyl Starch (HES) Specification [HES (130/0.4)] after Single-Dose Infusion of 6% or 10% Solutions in Healthy Volunteers. Clin Drug Investig. 1998; 16(2): 151-60.

146. Niemi TT, Miyashita R, Yamakage M. Colloid solutions: a clinical update. J Anesth. 2010; 24(6):913-25.

147. Gando S, Sawamura A, Hayakawa M. Trauma, shock, and disseminated intravascular coagulation: lessons from the classical literature. Ann Surg. 2011; 254(1): 10-9.

148. Treib J, Haass A, Pindur G. Coagulation disorders caused by hydroxyethyl starch. Thromb Haemost. 1997; 78(3):974-83.

149. Буланов АЮ, Городецкий BM, Шулутко ЕМ. Коллоидные объемозамещающие растворы и гемостаз. Российский журн. анестезиологии и интенс. Терапии. 1999; 2: 25-31.

150. Boldt J, Knothe С, Zickmann В, Andres Р, Dapper F, Hempelmann G. Influence of different intravascular volume therapies on platelet function in patients undergoing cardiopulmonary bypass. Anesth Analg. 1993; 76(6): 1185-90.

151. de Jonge E, Levi M. Effects of different plasma substitutes on blood coagulation: a comparative review. Crit Care Med. 2001; 29(6):1261-7.

152. Carlin G, Karlström G, Modig J, Saldeen T. Effect of dextran on fibrinolysis inhibition activity in the blood after major surgery. Acta Anaesthesiol Scand. 1980; 24(5):375-8.

153. Carr ME, Gabriel DA. The effect of dextran 70 on the structure of plasma-derivied fibrin gels. J Lab Clin Med. 1980; 96(6): 985-993.

154. Hardy JF, De Moerloose P, Samama M. Massive transfusion and coagulopathy: pathophysiology and implications for clinical management. Can J Anaesth. 2004; 51(4):293-310.

155. Ciavarella D, Reed RL, Counts RB, Baron L, Pavlin E, Heimbach DM, Carrico CJ. Clotting factor levels and the risk of diffuse microvascular bleeding in the massively transfused patient. Br J Haematol. 1987; 67(3):365-8.

156. Hewson JR, Neame PB, Kumar N, Ayrton A, Gregor P, Davis C, Shragge BW. Coagulopathy related to dilution and hypotension during massive transfusion. Crit Care Med. 1985; 13(5):387-91.

157. Janvrin SB, Davies G, Greenhalgh RM. Postoperative deep vein thrombosis caused by intravenous fluids during surgery. Br J Surg. 1980; 67(10): 690-693.

158. Tuman KJ, Spiess BD, McCarthy RJ, Ivankovich AD. Effects of progressive blood loss on coagulation as measured by thrombelastography. Anesth Analg. 1987; 66(9):856-63.

159. Ng KF, Lo JW. The development of hypercoagulability state, as measured by thrombelastography, associated with intraoperative surgical blood loss. Anaesth Intensive Care. 1996; 24(1): 20-25.

160. de Souza MA, Klamt JG, Garcia LV. Effects of acute normovolemic hemodilution on blood coagulation: comparison between tests of an in vivo and an in vitro model. Rev Bras Anestesiol. 2010; 60(4):363-75.

161. Nielsen VG. Colloids decrease clot propagation and strength: role of factor Xlll-fibrin polymer and thrombin-fibrinogen interactions. Acta Anaesthesiol Scand. 2005; 49(8): 1163-71.

162. Brummel-Ziedins K, Whelihan MF, Ziedins EG, Mann KG. The resuscitative fluid you choose may potentiate bleeding. J Trauma. 2006; 61(6): 1350-1358.

163. Ruttmann TG, James MFM, Viljoen JF. Haemodilution induced a hypercoagulable state. Br J Anaesth. 1996; 76(3): 412-414.

164. Nielsen VG, Lyerly RT 3rd, Gurley WQ. The effect of dilution on plasma coagulation kinetics determined by thrombelastography is dependent on antithrombin activity and mode of activation. Anesth Analg. 2004; 99(6): 1587-92.

165. Nielsen VG, Baird MS. Extreme hemodilution in rabbits: an in vitro and in vivo Thrombelastographic analysis. Anesth Analg. 2000; 90(3): 541-545.

166. Asskali F, Lehmann G, Förster H. Thrombelastographic coagulation analysis following in vitro and in vivo haemodilution with hydroxyethyl starch (HES). Anasthesiol Intensivmed Notfallmed Schmerzther. 2002; 37(5):258-66.

167. Srivastava AR, Banerjee A, Misra BB, Minhas H, Virmani S. Does hemodilution by the crystalloid priming solution derange the efficacy of anticoagulation during cardiopulmonary bypass? J Card Surg. 2008; 23(3):239-45.

168. Hemker HC, Giesen P, AlDieri R, Regnault V, de Smed E, Wagenvoord R, Lecompte T, Béguin S. The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb. 2002; 32(5-6):249-53.

169. Ovanesov MV, Krasotkina JV, UTyanova LI, Abushinova KV, Plyushch OP, Domogatskii SP, Vorob'ev AI, Ataullakhanov FI. Hemophilia A and В are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim Biophys Acta. 2002; 1572(l):45-57.

170. Синауридзе ЕИ, Горбатенко AC, Грибкова ИВ, Сулимов ВБ, Романов АН, Кондакова OA, Ажигирова MA, Дереза TJI, Кузнецов ЮВ, Боголюбов АА, Атауллаханов ФИ. Гиперкоагуляция, вызываемая

разбавлением плазмы искусственными плазмозамещающими растворами. Технологии живых систем. 2008; 5(1):3-14.

171. Синауридзе ЕИ, Буланов АЮ, Щербакова ОВ, Горбатенко АС, Атауллаханов ФИ. Усиление коагуляции, вызываемое переливанием искусственных плазмозамещающих растворов. Терапевтический архив. 2009; 1: 52-55.

172. Guide for the Care and Use of Laboratory Anamals. Eighth Edition. The National Academies Press, Washington, D.C., USA, 2010, pp. 41-104.

173. Е.И. Синауридзе, Ф.И. Атауллаханов, А.А. Бутылин, В.Б. Сулимов, A.H. Романов, A.A. Боголюбов, Ю.В. Кузнецов, И.В. Грибкова, А.С. Горбатенко, О.А. Кондакова. Новые соединения, обладающие функцией ингибиторов тромбина, и фармацевтические композиции на их основе. Патент РФ № 2354647, (заявка № 2007124201 от 28.06.2007), патентообладатель ООО «Бионика», Москва, Россия (2009).

174. Е.И. Синауридзе, Ф.И. Атауллаханов, А.А. Бутылин, В.Б. Сулимов, А.Н. Романов, А.А. Боголюбов, Ю.В. Кузнецов, И.В. Грибкова, А.С. Горбатенко, О.А. Кондакова. Новые соединения, обладающие функцией антикоагулянтов, фармацевтические композиции на их основе для лечения тромботических состояний и плазмозамещающий раствор для коррекции гиперкоагуляционных нарушений при гемодилюции. Патент РФ № 2353616, (заявка № 2007124202 от 28.06.2007), патентообладатель ООО «Бионика», Москва, Россия (2009).

175. Sinauridze EI, Ataullakhanov FI, Butylin AA, Sulimov VB, Romanov AN, Bogolyubov AA, Kuznetsov YuV, Gribkova IV, Gorbatenko AS, Kondakova OA. New antithrombin function compounds and pharmaceutical compositions based oh them. International Patent Application PCT/RU2008/000400 of June 27, 2008 (priority of June 28, 2007). Applicant: Bionika, Moscow, Russia.

176. Sinauridze EI, Ataullakhanov FI, Butylin AA, Sulimov VB, Romanov AN, Bogolyubov AA, Kuznetsov YuV, Gribkova IV, Gorbatenko AS, Kondakova OA. New anticoagulant compounds, pharmaceutical compositions on their basis to

tread thrombotic conditions, and plasma-substituting solution to correct hypercoagulation defects of hemodilution. International Patent Application PCT/RU2008/000401 of June 27, 2008 (priority of June 28, 2007). Applicant: Bionika, Moscow, Russia.

177. Sinauridze EI, Romanov AN, Gribkova IV, Kondakova OA, Surov SS, Gorbatenko AS, Butylin AA, Monakov MYu, Bogolyubov AA, Kuznetsov YuV, Sulimov VB, Ataullakhanov FI. New synthetic thrombin inhibitors: Molecular design and experimental verification. PLoS ONE, 2011, 6(5): el9969. doi: 10.13 71/j ournal.pone.OO 19969.

178. Е.И. Синауридзе, A.H. Романов, O.A. Кондакова, И.В. Грибкова, С.С. Суров, А.С. Горбатенко, Ю.В. Кузнецов, А.А. Боголюбов, В.Б. Сулимов, Ф.И. Атауллаханов. Новые прямые низкомолекулярные синтетические ингибиторы тромбина. Технологии живых систем, 2011, 8(3):34-47.

179. Lottenberg R, Christensen U, Jackson CM, Coleman PL. Assay of coagulation proteases using peptide chromogenic and fluorogenic substrates. Methods Enzymol. 1981; 80 Pt C:341-61.

180. Lottenberg R, Hall JA, Fenton JW 2nd, Jackson CM. The action of thrombin on peptide p-nitroanilide substrates: hydrolysis of Tos-Gly-Pro-Arg-pNA and D-Phe-Pip-Arg-pNA by human alpha and gamma and bovine alpha and beta-thrombins. Thromb Res. 1982; 28(3):313-32.

181. Sonder S A, Fenton J W 2nd. Thrombin Specificity with Tripeptide Chromogenic Substrates: Comparison of Human and Bovine Thrombins with and without Fibrinogen Clotting Activities. Clin. Chem., 1986, 32(6):934-937.

182. Доступно на сайте: http://www.aniara.com/pdf/SS-ANIARA-A229014-EVALXaCS 1165-S2765.pdf

183. Доступно на сайте:

http://chromogenicsubstrates.com/substrates/chromogenic substrates products s-2765.htm

184. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты. Москва, «Мир» 1982. т.2., гл. 8, с. 483-487

185. Cheng YC, Prusoff W. Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochemical Pharmacology, 1973, 22:3099-3108

186. Доступно на сайте:

http://www.renam.ru/dokumentaciya/instrukcii/plazmennYi-gemostaz/Instrukciya к naboru KOAGULO TEST.pdf/at download/file

187. Доступно на сайте:

http://www.renam.ru/dokumentaciya/instrukcii/plazmennyi-gemostaz/Insrukciya к naboru DIAGEM P.pdf/at download/file

188 Доступно на сайте:

http://www.renam.ru/dokumentaciya/instrukcii/plazmennyi-gemostaz/Instrukciya к naboru TROMBIN-TEST.pdf/at download/file

189. Hemker HC, Giesen PL, Ramjee M, Wagenvoord R, Beguin S. The thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma. Thromb. Haemost. 2000; 83(4): 589-591.

190. Ованесов MB. Влияние факторов внутреннего пути свертывания на пространственную динамику роста сгустка. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Гематологический научный центр РАМН, Москва, 2002.

191. Ovanesov MV, Lopatina EG, Saenko EL, Ananyeva NM, Ul'yanova LI, Plyushch OP, Butilin AA, Ataullakhanov FI. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Thromb. Haemost., 2003, 89(2):235-242.

192. Карамзин CC. Исследование биофизических аспектов пространственной динамики роста фибринового сгустка iv-vitro. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Гематологический научный центр РАМН, Москва, 2010.

193. Прозоровский В.Б. Практическое пособие по ускоренному определению средних эффективных доз и концентраций биологически активных веществ. Байкальск, СпбГУ, 1994, 46 стр.

194. Deichman WB, LeBlanc. Determination of the approximate lethal dose with about six animals. J Ind Hyg Toxicol. 1943; 25: 415-417.

195. Litchfield JT Jr, Wilcoxon F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J Pharmacol Exp Ther. 1949; 96(2):99-113.

196. The Laboratory Rat. Edited by Georg J Krinke. Academic Press, 2000, p.486

197. Ginsberg JA, Crowther MA, White RH, Ortel TL. Anticoagulation therapy. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2001:339-57.

198. Laux V, Perzbom E, Heitmeier S, von Degenfeld G, Dittrich-Wengenroth E, Buchmiiller A, Gerdes C, Misselwitz F. Direct inhibitors of coagulation proteins - the end of the heparin and low-molecular-weight heparin era for anticoagulant therapy? Thromb Haemost. 2009 Nov;102(5):892-9.].

199. Романов A.H., Кондакова O.A., Григорьев Ф.В., Сулимов А.В., Лущекина С.В., Мартынов Я.Б., Сулимов В.Б. Компьютерный дизайн лекарственных средств: программа докинга SOL. Вычислительные методы и программирование. 2008; 9:213-233.

200. Kikumoto R, Tamao Y, Tezuka T, Tonomura S, Нага H, Ninomiya К, Hijikata A, Okamoto S. Selective inhibition of thrombin by (2R,4R)-4-methyl-l-[N2-[(3-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-8-quinolinyl++ +) sulfonyl]-l-arginyl)]-2-piperidinecarboxylic acid. Biochemistry. 1984; 23(l):85-90.

201. Castellone DD, Van Cott EM. Laboratory monitoring of new anticoagulants. Am J Hematol. 2010; 85(3): 185-7.

202. Nagashima H. Studies on the different modes of action of the anticoagulant protease inhibitors DX-9065a and Argatroban. I. Effects on thrombin generation. J Biol Chem. 2002; 277(52):50439-44.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.