Общее и частное в структурной организации белков надсемейства цитохромов Р450 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.28, кандидат биологических наук Мирошниченко, Юлиана Викторовна

• Мирошниченко, Юлиана Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мирошниченко, Юлиана Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Мотивы в структуре белка.

1.1.1 Виды мотивов.

1.1.2 Применение мотивов.

1.1.3 Методы выявления мотивов.

1.1.4 Базы данных мотивов.

1.1.5 Информационное содержание последовательностей.

1.1.6 Статистика сравнения последовательностей.

1.2 Надсемейство цитохромов Р450 как объект исследования.

1.2.1 Описание структуры цитохромов Р450.

1.2.2 Подходы к классификации надсемейства цитохромов Р450.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Выборка.

2.2 Локальное выравнивание.

2.3 Кластерный анализ.

2.4 Иерархическое выравнивание.

2.5 Выявление мотивов в консенсусной последовательности.

2.6 Работа с базой знаний по цитохромам Р450.

2.7 Общая методология исследования критериев, основанных на анализе консенсусной последовательности.

2.8 Использование программы BLAST для оценки состава консенсусной последовательности.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Предпосылки наличия мотивов в семействах и подсемействах цитохромов

Р450.

3.2 Алгоритм выявления структурно-функциональных мотивов.

3.3. Исследование свойств статистических критериев наличия мотивов в консенсусных последовательностях.

3.4 Мотивы общности.

3.5. Мотивы частного в семействе стероловых деметилаз.

3.6. Использование критерия оценки мотивов для корректировки границ кластеров.

4. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Общее и частное в структурной организации белков надсемейства цитохромов Р450»

Уникальной особенностью белков надсемейства цитохромов Р450, привлекающей внимание исследователей, является способность этих ферментов окислять широкий круг разнородных субстратов, при этом сохраняя общность принципов катализа, физико-химических свойств и пространственной структуры (Lewis D., 2001). Охарактеризовано множество функций цитохромов Р450: в настоящее время в надсемействе цитохромов Р450 насчитывается более 3000 генов из 250 различных видов организмов [http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html]. Разнообразие в структуре и функции цитохромов Р450 определяет задачу выявления общих закономерностей строения этих ферментов.

С точки зрения формального подхода первичные структуры цитохромов Р450 представляют собой крайне разобщенную группу биологических текстов. Средняя идентичность всего надсемейства не превышает 25%, что вполне сравнимо с данными об идентичности случайных последовательностей аналогичной длины (Archakov A.I. et al., 1998). Поэтому надсемейство цитохромов Р450 является адекватным объектом для проверки статистических методов работы с биологическими текстами. Действительно, ведь аминокислотные последовательности цитохромов Р450 являются одновременно неслучайными (что доказано многочисленными лабораторными экспериментами) и случайными (как они предстают с точки зрения стандартных статистических подходов). Именно за счет этого феномена предоставляется возможность разрабатывать эффективные методы анализа аминокислотных последовательностей.

Цель работы: разработка подхода для выявления в аминокислотных последовательностях белков надсемейства цитохромов Р450 формальных элементов, определяющих структурную общность и функциональную специфичность различных форм этого фермента.

Задачи:

1. Предложить алгоритмический метод выявления структурно-функциональных мотивов в группе белков (цитохромов Р450) и исследовать его свойства.

2. Выявить мотивы структурной общности для всего надсемейства белков.

3. Выявить мотивы частного в отдельной группе функционально родственных белков.

4. Разработать методику классификации цитохромов Р450 с учетом структурно-функциональных мотивов и сравнить результаты с традиционной номенклатурой.

В работе предлагается модель структурной организации белков надсемейства цитохромов Р450, согласно которой минимальным «строительным» блоком фермента является структурно-функциональный мотив - участок последовательности, проявляющий статистически значимую консервативность в ряду гомологичных аминокислотных последовательностей. Предложенный непараметрический критерий позволяет определять мотивы в группах функционально сходных цитохромов Р450. Выявлено пять основных мотивов общности, определяющих белок в составе надсемейства. Анализируя индивидуальные семейства, удалось выявить дифференцирующие мотивы - т.е. мотивы частного, ответственные за структурное обеспечение функциональной специфичности.

В основу работы положена «островная» гипотеза эволюции биомакромолекул (№зЫка\уа К., 1993), согласно которой совокупность термодинамических условий белкового фолдинга представляется в виде ограниченных участков разрешенных состояний - «островов», окруженных «морем» конформаций, для которых фолдинг невозможен. Белок, претерпевающий изменения в ходе эволюционного процесса (или в ходе экспериментов по мутагенезу) толерантен лишь к ограниченному количеству модификаций точечного характера, по мере введения мутаций, белок «перемещается» по острову, при этом сохраняя целостность своей третичной структуры. Однако, как только объем введенных мутаций превысит определенный порог (незначительный по отношению к общему числу точечных мутаций, которые теоретически можно было бы предложить), белок покидает пределы «острова» и теряет способность к приобретению стабильной пространственной конформации. Автор «островной» гипотезы обоснованно полагает, что термодинамически выгодные состояния составляют крайне малую часть всех возможных конформаций и, поэтому, ассоциирует первые с маленькими островами, разбросанными в море.

Для выполнения данной работы в «островную» гипотезу было введено существенное дополнение. Оно заключается в предположении о том, что мутации возникают в первичной структуре не хаотично, а лишь в некоторых участках, не затрагивая других. Основанием для такого предположения является значительное количество опубликованных данных о наличие в структурах белков и генов локальных областей, имеющих особое значение для реализации биологической функции биомакромолекулы. Выявив участки белка (гена), устойчивые к мутациям, можно ассоциировать с ними основные структурные требования фолдинга и катализа (для ферментов), тогда как вариабельные участки рассматривать как «эволюционный шум», который служит, с одной стороны, связующим структурным наполнителем, а с другой стороны, несет в себе потенциал для дальнейшего эволюционирования белка.

В работе впервые комплексно рассматриваются принципы формализации подходов к классификации надсемейства цитохромов Р450. Предложена алгоритмическая методика для оптимизации результатов кластерного анализа на основе структурно-функциональных мотивов, определяемых по результатам множественного выравнивания. Показано, что выявляемые в группах белков консервативные элементы соответствуют участкам белка, имеющим значение для обеспечения общности структуры фолда и для реализации специфичной ферментативной активности. Таким образом, предлагается новый подход к решению актуальной научной задачи, связанной с анализом структурно-функциональных взаимосвязей в белках.

С точки зрения практического применения, полученные результаты могут быть использованы для прогнозирования функции новых белков надсемейства цитохромов Р450. Созданная методология может быть применена для решения актуальных задач биотехнологии: биосинтез новых химических соединений и конструирование ферментов-монооксигеназ с заданной функцией.

Монооксигеназная реакция, катализируемая цитохромами Р450, заключается во внедрении в липофильную молекулу субстрата атома кислорода (1-й этап биотрансформации). В результате растворимость окисленного вещества повышается и, после конъюгации, вещество выводится из организма. Таким образом, следует отметить, что цитохромы Р450 играют значимую роль в обеспечении постоянства внутренней среды организма. Понимание гомеостатической роли цитохромов Р450 может быть расширено за счет включения функции регулирования уровня гормонов: гемовые монооксигеназы надпочечников, простаты, щитовидной железы, эпителия ЖКТ участвуют как в синтезе, так и деградации гормонов (Rozman D. & Waterman M.R., 1998).

Цитохромы Р450 представляют собой потенциальные мишени для действия лекарственных препаратов (McFadyen М.С. & Murray G.I, 2005; Karlgren М. et al., 2006). На основе ингибиторов цитохромов Р450 создано целое поколение противогрибковых лекарств (Schiaffella F. et al., 2005). Ведутся исследования в области компьютерного конструирования ингибиторов форм цитохромов Р450 семейства CYP1 А, активность которых сопряжена с развитием онкологических заболеваний, в частности, рака легких (Smith G.B. et al., 2001).

Уникальность моноокисгеназной функции, выполняемой цитохромами Р450, обуславливает своеобразие молекулярно-эволюционных процессов в надсемействе. В настоящее время известно более 3 тыс. форм цитохромов Р450 (Nelson D.R., 2005), эти белки выявлены в геномах животных, растений, грибов и бактерий. В геноме человека насчитывается 62 гена, кодирующих цитохромы Р450, в геноме растений генов цитохромов Р450 - более 200. Если функции более 70% цитохромов Р450 человека известны, то для растений экспериментальной информации значительно меньше: каталитическая функция известна менее чем для 5% растительных форм.

Многообразие форм цитохромов Р450, по мнению исследователей, является естественным депозитарием заготовок для использования в биотехнологии. Известны случаи, когда цитохромы Р450 принимают участие в катализе реакций биосинтеза противоопухолевых препаратов (Chau М. & Croteau R., 2004). Экстракты цитохромов Р450 (микросомальные фракции тканей растений и животных) используются в качестве биореакторов для получения новых химических веществ (Abecassis et al., 2003). Интенсивно ведутся работы в области создания химерных форм цитохромов Р450 с заданной каталитической функцией (Otey C.R., 2006).

Как уже упоминалось, функциональное разнообразие надсемейства цитохромов Р450 сочетается с значительными различиями на уровне первичной структуры. В то же время, все известные в настоящее время пространственные структуры цитохромов Р450 характеризуются единообразным фолдом (Poulos T.L., 1995).

Начиная с 1989 года поддерживается систематическая номенклатура надсемейства цитохромов Р450. В семейство выделяются белки, гомологичные на 40%; группы белков, гомолгичные более чем на 46% объединяются в подсемейство (Nelson D.R., 1996). Наряду с формальными признаками сходства последовательностей, при создании номенклатуры авторы использовали дополнительную информацию о сходстве строения генов и об особенностях функциональной активности.

По-видимому, одним из основных недостатков существующей классификации следует считать ее искусственность. Пользуясь традиционной систематикой невозможно сделать выводы ни в отношении эволюционного, ни в отношении функционального сходства ферментов, входящих в семейства и подсемейства. Формально указанный недостаток ведет к возникновению исключений, описывающих отнесение к классификационной группе белка, который в рамках определенного функционального контекста должен принадлежать другому подразделу классификации.

В ряде работ предпринимались попытки пересмотреть принципы классификации цитохромов Р450 (Archakov A.I. et al., 2001; Nelson D.R., 1998).

Предлагаемые решения основывались на применении методов кластерного анализа и множественного выравнивания последовательностей. В частности, основанный на иерархическом выравнивании подход инвентаризации надсемейства позволил в работе (Лисица A.B., 2002) получить консенсус для надсемейства цитохромов Р450. При этом использовались методики, анализирующие первичную структуру в целом, без дифференцированного анализа отдельных элементов. С другой стороны, уже в 1992 году было показано, что, несмотря на общее структурное разнообразие, в строении цитохромов Р450 можно выделить локальные участки, несущие функциональную нагрузку (Gotoh О., 1992). Это наблюдение до сих пор не потеряло своей актуальности: предложенное в 1992 году понятие участков узнавания субстрата используется во многих работах, посвященных изучению структуры и функции цитохромов Р450 (Podust L.M., Stojan J. et al., 2001; Goldstone H.M. & Stegeman J.J., 2006). Обобщенной математической модели классификации надсемейства с учетом локальных структурно-функциональных элементов предложено не было, несмотря на то, что в работе (Гусев С.А., 2002) были показаны частные случаи успешного применения алгоритмов поиска мотивов для анализа надсемейства цитохромов Р450.

Таким образом, актуальной является задача совершенствования алгоритмической методики выявления структурно-функциональных элементов (мотивов) в надсемействе цитохромов Р450. Для решения этой задачи привлекается концепция наличия элементов общего и частного в структурах белков надсемейства с учетом основных положений «островной гипотезы», рассматривающей термодинамические ограничения белкового фолдинга (NishikawaK., 1993).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Биоинформатика», Мирошниченко, Юлиана Викторовна

4. ВЫВОДЫ

4.1. Разработан алгоритмический метод, позволяющий выявлять участки локальной консервативности для заданного набора первичных структур белков. Метод основан на представлении множественного выравнивания в виде консенсусной последовательности с последующей статистической оценкой характера распределения консервативных остатков.

4.2. Для надсемейства цитохромов Р450 показано, что выявленные участки локального сходства соответствуют структурно-функциональным мотивам. В консенсусе надсемейства мотивы общности определяют фолд-детерминирующую основу белка, обеспечивают фиксацию гема, молекулярного кислорода и формирование канала доступа лиганда. В консенсусе семейства стероловых деметилаз мотивы частного отвечают участкам специфичного узнавания субстрата.

4.3. Применение разработанного алгоритма позволяет определять уровень отсечения при проведении кластеризации последовательностей надсемейства. Повышение уровня соответствия между составом кластеров и семействами, сформированными согласно общепринятой номенклатуре, свидетельствует о значимости выявляемых мотивов для задачи определения функциональной специфичности цитохромов Р450.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мирошниченко, Юлиана Викторовна, 2006 год

1. Айвазян С.А., Енюков И.С., Мешалкин Л.Д. (1983). Прикладная статистика. Основы моделирования и первичная обработка данных. Москва, Финансы и статистика. 471 стр.

2. Астахова Т.В., Олейникова М.А., Ройтберг М.А. (2002). Сравнительный анализ информационных биополимеров. Компьютеры и суперкомпьютеры в биологии (под ред. Лахно В.Д. и Устинина М.Н.). Москва-Ижевск, Институт компьютерных исследований. 449-457.

3. Волькенштейн М.В. (1986). Энтропия и информация. Москва, Наука.

4. Гайдышев И.П. (2001). Анализ и обработка данных. Специальный справочник. С.-Петербург, Питер.

5. Гусев С.А. (2002). Структурно-функциональные мотивы в последовательностях цитохромов Р450. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. ГУ НИИ БМХ РАМН им. В.Н. Ореховича, Москва.

6. Дегтяренко К.Н. (1992). Множественное выравнивание и анализ гомологии в надсемействе Р450. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Институт биологической и медицинской химии, Москва.

7. Лисица A.B. (2002). Протеомный индекс надсемейства цитохромов Р450. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. ГУ НИИ БМХ РАМН им. В.Н. Ореховича, Москва.

8. Ляшенко A.A. (1996). Применение иерархического подхода для выявления структурно-функциональных взаимосвязей в надсемействе цитохромов Р450. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. ГУ НИИ БМХ РАМН им. В.Н. Ореховича, Москва.

9. Рубин А.Б. (2004). Биофизика в 2-х томах. Т.1: Теоретическая биофизика: Учебник. Москва, Издательство МГУ; издательство «Наука». Глава 3.

10. Черныш М.Ф. (2000). Опыт применения кластерного анализа. Социололгия. 4M, 12:129-141.

11. Яцкив И., Гусарова Л. (2003). Методы определения количества кластеров приклассификации без обучения. Transport and Telecommunication. 4:23-28.

12. Abecassis V., Urban P., Truan G., Pompon, D. (2003). Exploration of natural and artificial sequence spaces: towards a functional remodelling of membrane-bound cytochrome P450s. Biocatalysis and Biotransformation. 21:55-66.

13. Altschul S.F., Erickson B.W. (1985). Significance of nucleotide sequence alignments: a method for random sequence permutation that preserves dinucleotide and codon usage. Mol BiolEvol. 2:526-38.

14. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990. 215:403-10.

15. Archakov A.I., Degtyrenko K.N. (1993). Structural classification of the P450 superfamily based on consensus sequence comparison. Biochem Mol Biol Int. 31:1071-80.

16. Archakov A.I., Bachmanova G.I. (1990). Cytochrome P450 and active oxygen. Taylor and Francis: London, 170-81.

17. Archakov A.I., Lisitsa A.V., Zgoda V.G., Ivanova M.S., Koymans L. (1998). Clusterization of P450 superfamily using the objective pair alignment method and the UPGMA program. J. Mol Model. 4:234-238.

18. Archakov A., Lisitsa A., Gusev S., Koymans L., Janssen P. (2001). Inventory of the cytochrome P450 superfamily. J.Mol.Model. 5:140-142.

19. Attwood T.K., Beck M.E., Bleasby A.J., Degtyarenko K., Parry Smith D.J. (1996). Progress with the PRINTS protein fingerprint database. Nucleic Acids Res. 24:182-8.

20. Attwood T.K., Bradley P., Flower D.R., Gaulton A., Maudling N., Mitchell A.L., Moulton G., Nordle A., Paine K., Taylor P., Uddin A., Zygouri C. (2003). PRINTS and its automatic supplement, prePRINTS. Nucleic Acids Res. 31:400-2.

21. Bacon D.J., Anderson W.F. (1986). Multiple sequence alignment. J Mol Biol. 191:153-61.

22. Bairoch A., Bucher P., Hofman K. (1996). The PROSITE database, its status in 1995. Nucleic Acids Res. 24:189-96.

23. Bateman A., Coin L., Durbin R., Finn R.D., Hollich V., Griffiths-Jones S., Khanna A., Marshall M., Moxon S., Sonnhammer E.L., Studholme D.J., Yeats C., Eddy S.R.2004). The Pfam protein families database. Nucleic Acids Res. 32:D 138-41.

24. Brazma A., Jonassen I., Eidhammer I., Gilbert D. (1998). Approaches to the automatic discovery of patterns in biosequences. J Comput Biol. 5:279-305.

25. Bucher P., Bairoch A. (1994). In Proc of 2nd Int. Conf. On Intell. Systems for Mol. Biol., pp. 53-61, AAAI Press.

26. Castro L.F., Santos M.M., Reis-Henriques M.A. (2005). The genomic environment around the Aromatase gene: evolutionary insights. BMCEvol Biol 5:43.

27. Chau M., Croteau R. (2004). Molecular cloning and characterization of a cytochrome P450 taxoid 2alpha hydroxylase involved in Taxol biosynthesis. Arch. Biochem. Biophys. 427:48-57.

28. Corpet F. (1988). Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res. 16:10881-90.

29. Cullin, C. (1992). Two distinct sequences control the targeting and anchoring of the mouse P450 1A1 into the yeast endoplasmic reticulum membrane. Biochem Biophys Res Commun. 184:1490-5.

30. Davies D.L., Bouldin D.W. (1979). A cluster separation measure. IEEE Trans. Pattern Anal. Machine Intell. 1:224-227.

31. Dayhoff M.O., Schwartz R.M., Orcutt B.C. (1978). In Atlas of Protein Sequence and Structure (ed. M.O. Dayhoff, ed.). Vol. 5, Suppl. 3., p.345. National Biomedical Research Foundation, Washington, DC.

32. Deken J. (1983). Probabilistic behavior of longest-common-subsequence length. In Time Warps, String Edits and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison. Sankoff D. & Kruskal J.B. (eds.), pp. 55-91, Addison-Wesley, Reading, MA.

33. Dembo A., Karlin S., Zeitouni O. (1994). Limit distribution of maximal non-aligned two-sequence segmental score. Ann. Prob. 22:2022-2039.

34. Doolittle R.F. (1989). In Prediction of Protein Structure and the Principles of

35. Protein Conformation, ed. G.D. Fasman, pp.599-623. New York: Plenum.

36. Doolittle R.F. (1986). OfURFs and ORFs: A Primer on How to Analyze Derived Amino Acid Sequences. Mill Valley: University Science Books.

37. Efron B., Halloran E., Holmes S. (1996). Bootstrap confidence levels for phylogenetic trees. Proc Natl Acad Sci USA. 93:13429-34.

38. Felsenstein J. (2006). Accuracy of coalescent likelihood estimates: do we need more sites, more sequences, or more Loci? Mol Biol Evol. 23:691-700.

39. Fitch W.M. (1983). Random sequences. J Mol Biol 163:171-6.

40. Gell-Mann M. (1994). A child learning the language: Algorithmic complexity and informational content. The quark and the jaguar: adventures in the simple and the complex. W.H. Freeman and Company: New York, 58-60.

41. Goldstone H.M., Stegeman J.J. (2006). A Revised Evolutionary History of the CYP1A Subfamily: Gene Duplication, Gene Conversion, and Positive Selection. J Mol Evol. Published online: 28 Apr 2006.

42. Gotoh O. (2000). Homology-based gene structure prediction: simplified matching algorithm using a translated codon (tron) and improved accuracy by allowing for long gaps. Bioinformatics. 16:190-202.

43. Gotoh O. (1999). Multiple sequence alignment: algorithms and applications. Adv Biophys. 36:159-206.

44. Gotoh O. (1996). Significant improvement in accuracy of multiple protein sequence alignments by iterative refinement as assessed by reference to structural alignments. J Mol Biol. 264:823-38.

45. Gotoh O. (1992). Substrate recognition sites in cytochrome P450 family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences. J Biol Chem. 267:83-90.

46. Graham-Lorence S., Peterson J.A. (1996). P450s: structural similarities and functional differences. FASEBJ. 10:206-14.

47. Graham S.E., Peterson J.A. (2002). Sequence alignments, variabilities, and vagaries. Methods Enzymol. 357:15-28.

48. Gray N. (1990). A program to find regions of similarity between homologous protein sequences using dot-matrix analysis. J Mol Graph. 8:11-5,25.

49. Gribskov M., McLachlan A.D., Eisenberg D. (1987). Profile analysis: detection of distantly related proteins. Proc Nail Acad Sci USA. 84:4355-8.

50. Gumbel E.J. (1958). Statistics of extremes. Columbia Iniversity Press, New York, NY.

51. Hedden P, Phillips AL, Rojas MC, Carrera E, Tudzynski B. (2001). Gibberellin Biosynthesis in Plants and Fungi: A Case of Convergent Evolution? J Plant Growth Regul. 20:319-331.

52. Henikoff S., Henikoff J.G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc Natl Acad Sci USA. 89:10915-9.

53. Henikoff S., Henikoff J.G. (1993). Performance evaluation of amino acid substitution matrices. Proteins. 17:49-61.

54. Hulo N., Bairoch A., Bulliard V., Cerutti L., De Castro E., Langendijk-Genevaux P.S., Pagni M., Sigrist C.J. (2006). The PROSITE database. Nucleic Acids Res. 34:D227-30.

55. Jaccard P. (1912). The distribution of flora in the alpine zone. New Phytologist. 11:37-50.

56. Jonassen I., Collins J.F., Higgins D.G. (1995). Finding flexible patterns in unaligned protein sequences. Protein Sci. 4:1587-95.

57. Jonassen I. Methods for discovering conserved patterns in protein sequences and structures. Chapter 7 in Bioinformatics: Sequence Structure and Databanks edited by Des Higgins and Willie Taylor, Practical Approach Series, Oxford University Press 2000.

58. Karlin S., Altschul S.F. (1990). Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes. Proc Natl Acad Sci USA. 87:2264-8.

59. Kimura M. (1991). The neutral theory of molecular evolution: a review of recent evidence. Jpn J Genet. 66:367-86.

60. Kocsor A., Kertesz-Farkas A., Kajan L., Pongor S. (2006). Application of compression-based distance measures to protein sequence classification: a methodological study. Bioinformatics. 22:407-12.

61. McFadyen M.C., Murray G.I (2005). Cytochrome P450 1B1: a novel anticancer therapeutic target. Future Oncol 1:259-63.

62. Nebert D.W., Nelson D.R., Adesnik M. et al. (1989). The P450 superfamily: updated listing of all genes and recommended nomenclature for the chromosomal loci. DNA. 8:1-13.

63. Nebert D.W., Nelson D.R. (1991). P450 gene nomenclature based on evolution. Methods Enzymol. 206:3-11.

64. Needleman S.B., Wunsch C.D. (1970). A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. JMolBiol. 48:443-53.

65. Nelson DR. (2003). Comparison of P450s from human and fugu: 420 million years of vertebrate P450 evolution. Arch Biochem Biophys. 409:18-24.

66. Nelson D.R. (1999). Cytochrome P450 and the individuality of species. Arch Biochem Biophys. 369:1-10.

67. Nelson D.R. (2005). Gene nomenclature by default, or BLASTing to Babel. Hum Genomics. 2:196-201.

68. Nelson D.R. (1998). Metazoan cytochrome P450 evolution. Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol 121:15-22.

69. Nelson D.R. (2002). Mining databases for cytochrome P450 genes. Methods Enzymol 357:3-15.

70. Nevill-Manning C.G., Wu T.D., Brutlag D.L. (1998). Highly specific protein sequence motifs for genome analysis. Proc Natl Acad Sci USA. 95:5865-71.

71. Nishikawa K. (1993). Island Hypothesis Protein Distribution in The Sequence Space. Viva Origino. 21:91-102.

72. Otey C.R., Landwehr M., Endelman J.B., Hiraga K., Bloom J.D., Arnold F.H. (2006). Structure-guided recombination creates an artificial family of cytochromes p450. PLoS Biol. 4:el 12.

73. Otey C.R., Silberg J.J., Voigt C.A., Endelman J.B., Bandara G., Arnold F.H.2004). Functional evolution and structural conservation in chimeric cytochromes p450: calibrating a structure-guided approach. Chem. Biol. 11:309-318.

74. Pietrokovski S., Henikoff J.G., Henikoff S. (1996). The Blocks database--a system for protein classification. Nucleic Acids Res. 24:197-200.

75. Podust L.M., Poulos T.L., Waterman M.R. (2001). Crystal structure of cytochrome P450 14alpha -sterol demethylase (CYP51) from Mycobacterium tuberculosis in complex with azole inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 98:3068-73.

76. Podust L.M., Stojan J., Poulos T.L., Waterman M.R. (2001). Substrate recognition sites in 14alpha-sterol demethylase from comparative analysis of amino acid sequences and X-ray structure of Mycobacterium tuberculosis CYP51. J Inorg Biochem. 87:227-35.

77. Posfai J., Bhagwat A.S., Posfai G., Roberts R.J. (1989). Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res. 17:2421-35.

78. Poulos T.L. (1995). Cytochrome P450. Curr Opin Struct Biol. 5:767-74.

79. Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A.J. (1987). High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam. J Mol Biol. 195:687-700.

80. Poulos T.L., Raag R. (1992). Cytochrome P450cam: crystallography, oxygen activation, and electron transfer. FASEB J. 6:674-9.

81. Reich J.G., Drabsch H., Daumler A. (1984). On the statistical assessment of similarities in DNA sequences. Nucl. Acids Res. 12:5529-5543.

82. Rozman D., Waterman M.R. (1998). Lanosterol 14alpha-demethylase (CYP51) and spermatogenesis. DrugMetab Dispos. 26:1199-201.

83. Saqi M.A., Sayle R. (1994). PdbMotif--a tool for the automatic identification and display of motifs in protein structures. ComputAppl Biosci. 10:545-6.

84. Sawyer S. (1989). Statistical tests for detecting gene conversion. Mol Biol Evol. 6:526-38.

85. Schiaffella F., Macchiarulo A., Milanese L., Vecchiarelli A., Costantino G., Pietrella D., Fringuelli R. (2005). Design, synthesis, and microbiological evaluation of new Candida albicans CYP51 inhibitors. J Med Chem. 48:7658-66.

86. Schuler G.D., Altschul S.F., Lipman D.J. (1991). A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 199:180-90.

87. Scordis P., Flower D.R., Attwood T.K. (1999). FingerPRINTScan: intelligent searching of the PRINTS motif database. Bioinformatics. 15:799-806.

88. Sellers P.H. (1984). Pattern recognition in genetic sequences by mismatch density. Bull. Math. Biol. 46:501-514.

89. Sherman B. (1950). A random variable related to the spacing of sample values. Ann. Math. Stat. 21:339-361.

90. Sherman B. (1957). Percentiles of the w(n) statistic. Ann. Math. Stat. 28:259-261.

91. Shrager J. (2003). The fiction of function. Bioinformatics. 19:1934-6.

92. Smith H.O., Annau T.M., Chandrasegaran S. (1990). Finding sequence motifs in groups of functionally related proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 87:826-30.

93. Smith R.F., Smith T.F. (1990). Automatic generation of primary sequence patterns from sets of related protein sequences. Proc Natl Acad Sci USA. 87:118-22.

94. Smith T.F., Waterman M.S. (1981). Identification of common molecular subsequences. J. Mol. Biol. 147:195-7.

95. Sneath P.H.A. (1995). The distribution of the random division of a molecular sequence. Binary. 7:148-152.

96. Sneath P.H.A. (1998). The effect of evenly spaced constant sites on the distribution of the random division of a molecular sequence. Bioinformatics. 14:608616.

97. Sneath P.H.A., Sokal R.R. (1973). Numerical Taxonomy. San Francisco: Freeman.

98. Sonnhammer E.L., Eddy S.R., Birney E., Bateman A., Durbin R. (1998). Pfam: multiple sequence alignments and HMM-profiles of protein domains. Nucleic Acids Res. 26:320-2.

99. Staden R. (1988). Methods to define and locate patterns of motifs in sequences. Comput Appl Biosci. 4:53-60.

100. Tatusova T.A., Madden T.L. (1999). BLAST 2 Sequences, a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences. FEMS Microbiol Lett. 174:247-50.

101. Taylor W.R. (1986). Identification of protein sequence homology by consensus template alignment. JMol Biol. 188:233-58.

102. Taylor W.R. (1990). Hierarchical method to align large numbers of biological sequences. Methods Enzymol. 183:456-74.

103. Via A., Helmer-Citterich M. (2004). A structural study for the optimisation of functional motifs encoded in protein sequences. BMC Bioinformatics. 5:50.

104. Walker J.M., ed. (2003). Directed Enzyme Evolution, Screening and Selection Methods. Totowa, Humana Press.

105. Wallace A.C., Borkakoti N., Thornton J.M. (1997). TESS: a geometric hashing algorithm for deriving 3D coordinate templates for searching structural databases. Application to enzyme active sites. Protein Sci. 6:2308-23.

106. Waterman M.S. (1994). Parametric and ensemble sequence alignment algorithms. Bull Math Biol. 56:743-67.

107. Whitlock J.P.J., Denison M.S. (1995). Induction of cytochrome P450 enzymes that metabolize xenobiotics. In: Cytochrome P450: Structure, Mechanism, Biochemistry. Ortiz de Montellano, P.R. (Ed.) Plenum Press: New York, 391.

108. Zhou D.J., Pompon D., Chen S.A. (1991). Structure-function studies of human aromatase by site-directed mutagenesis: kinetic properties of mutants Pro308-Phe, Tyr361-Phe, Tyr361-Leu, and Phe406-Arg. Proc Natl Acad Sci USA. 88:410-4.