Окислительный стресс во взаимодействиях опухоли и организма тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук в форме науч. докл. Шварцбурд, Полина Михайловна

• Шварцбурд, Полина Михайловна
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1997

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Шварцбурд, Полина Михайловна

Эти механизмы не могут объяснить, каким образом опухолевым клеткам удается поддерживать высокую свободно-радикальную устойчивость, тогда как подавляющее большинство асцитных опухолевых клеток (по данным Apffel С.А.) содержат внутриклеточные липопротеины, обогащенные полиненасыщенными жирнокислотными остатками (DiPaolo J.A., 1963), которые в свою очередь являются наиболее чувствительными мишенями для липидной пероксидации. Почему же опухолевые клетки при этом столь устойчивы к повреждающему действию свободных радикалов? Чтобы объяснить этот эффект была экспериментально проверено теоретическое предположение Dormandy T.L. о потенциальной способности внутриклеточных липидных гранул с высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) работать ловушками токсичных радикалов. В то время как клетки, где основной пул ПНЖК входит в состав жизненно-важных мембран (плазматических, ядерных, микросомальных) должны обладать , более низкой устойчивостью к CP-индуцируемой летальности.

Для проверки этой гипотезы была выбрана высокоагрессивная перевиваемая опухоль - асцитная гепатома Зайделя (АГЗ) с высоким содержанием ЛП-гранул; а также менее агрессивная опухоль Эрдиха (АОЭ), содержащая сравнительно меньше липопротеинов, В клетках АГЗ и АОЭ проводилось микроскопирование с применением метода интерференционного контраста с полным расщеплением изображения ЛП-гранул. Было установлено, что в начальных стадиях развития опухолевого процесса (АГЗ, АОЭ), диаметр ЛП-гранул был столь мал, что его можно было измерить только благодаря цветовому контрастному изображению ЛП-гранул (Рис.ЗА). Клетки АГЗ (без экзогенной стимуляции) обнаруживали также способность формировать кластерные структуры из плотно-упакованных ЛП-гранул (Рис.ЗВ, Рис.4А). Это позволяло выполнять измерения окислительной устойчивости непосредственно в таких кластерах. Сам факт формирования ЛП-кластеров в опухолевых клетках был описан еще в ранних работах Аррге! С.А. Однако до наших исследований не было известно, что из ЛП-гранул в опухолевых клетках [особенно делящихся] могут формироваться квазисимметричные, пространственно-упорядоченные структуры, различающиеся по форме. 'Наиболее неожиданными оказались кластеры, где ЛП-гранулы были плотно-упакованы [наподобие "бильярдных шаров"] в треугольно-подобные структуры, располагающиеся симметрично по обе стороны от линии межклеточного раздела в делящихся, индивидуальных АГЗ клетках (Рис. З.В). Следует отметить, что после липидораство'римой фиксации эти разрозненные кластеры экстрагировались как единая структура (Рис.3.Г; черные неокрашиваемые участки). Ко второму наиболее распространенному типу ЛП-упаковки следует отнести "кэппообразные кластеры" из ЛП-гранул (Рис.4А). Чаще всего такие кластеры выявлялись в приповерхностных зонах опухолевых клеток (Рис.4А), откуда они могли попасть во внеклеточную среду в составе везикул, отделяемых от АГЗ клеток (Рис.4Б).Функциональное значение процесса формирования таких кластеров остается неизвестным, но их размеры (от 3 до 6 мк в поперечнике) позволяет непосредственно в них измерять устойчивость ЛП-гранул к пероксидативному стрессу и сравнивать ее с соответствующей резистентностью единичных опухолевых клеток и ее участков цитоплазмы, где не обнаруживались видимые ЯП-гранулы. В результате проведения таких измерений было установлено, что только после перехода опухолей (АГЗ, АОЭ) в стационарную фазу своего развития, в опухолевых клетках наблюдалось увеличение доли флуоресцирующих продуктов окисления [в частности, ФП-ПОЛ (Рис.5А, 6Б)], тогда как в участках цитоплазмы, в которых не обнаруживались ЛП-гранулы, уровень образования ФП-ПОЛ, напротив, был низок (Рис.5Б, 6Б).

Сутки

Разеише опухоли дгз

Развитие опухоли

Рис.5. Динамика изменения диаметра ЛП-гранул и уровня образования флуоресцирующих продуктов (ФП) перекисного окисления липидов (ФП-ПОЛ), тестируемые в одиночных АГЗ-клетках (А), их кластерах из ЛП-гранул (Б) и участках цитоплазмы, где ЛП-гранулы не обнаруживались (Б) в процессе роста асцитной гепатомы Зайделя (АГЗ) in vivo. Рост опухоли оценивался по изменению объема асцитной опухоли и количеству опухолевых клеток в нем (А).

2 4 6 é 10 12 14 Сутки

0,9 £

Развитие опухоли АОЭ

2 4 6 8 10 12 14 Сутки Развитие опухоли АОЭ

Рис.6. Динамика изменения диаметра ЛП-гранул (Б) и уровня ФП-ПОЛ в одиночных клетках АОЭ (Б), а также участках АОЭ-цитоплазмы, где ЛП-гранулы не обнаруживались (Б) в процессе развития асцитной опухоли Эрлиха (АОЭ) in vivo. Рост асцитной опухоли оценивался по увеличению ее объема и приросту клеточной массы (А).

Проведение непосредственных измерений в АГЗ-кластерах из ЛП-гранул, позволяло установить, что именно в ЛП-гранулах сосредоточено подавляющее большинство флуоресцирующих продуктов окисления, которые образуются в опухолевых клетках в ответ на окислительный стресс, индуцированный УФ-светом. Аналогичная закономерность выявлялась in vitro, при оценки окислительной устойчивости стационарно-растущих АОЭ-клеток в модельной системе, при экзогенном действии аскорбат-индуцированного стресса (Рис.7). В этих условиях, АОЭ-клетки сохраняли высокую устойчивость к образованию малонового диальдегида (одного из конечных продуктов перекисного окисления липидов). В противоположность высокой устойчивости АОЭ-клеток, фракция липидов из этих же клеток обнаруживала крайне низкую устойчивость к прямому действию свободных радикалов, что выражалось в высоком уровне образования малонового диальдегида (Рис.7). Все эти данные в совокупности подтверждают гипотезу Dormandy о потенциальной способности ЛП-гранул, в определенных метаболических ситуациях, работать ловушками токсичных радикалов и снижать уровень клеточной летальности в ответ на окислительный стресс.

Рис.7. Временная кривая развития аскорбат-индуци-рованного перекис-ного окисления липидов (ПОЛ) в целых опухолевых клетках [взятых на стационарной фазе роста АОЭ in vivo] и их липидной фракции. Среда инкубации содержала 0,5 мМ аскорбата и 12 мМ Fe2+ в 50 мМ К, Ыа-фосфатного буфера, pH 6,0.

Важно отметить, что приобретение опухолевыми ЛП-гранулами защитного потенциала от внутриклеточных радикалов коррелировало с увеличением объема ЛП-гранул (Рис.5Б, 6Б) [прежде всего, за счет депонирования в них нейтральных липидов с высоким уровнем ненасыщенных жирнокислотных остатков (DiPaolo J.A.)] и снижением энергетического потенциала опухолевых митохондрий (Рис.8) [тестирование состояния митохондрий производилось с помощью потенциал-чувствительного витального красителя -родамина-123].

В таких митохондриях снижена способность к ß-окис-лению жирных кислот, и как следствие, уровень АТФ в таких стационарно-растущих опухолевых АОЭ-клетках был резко снижен (Schmidt Н, 1991). Известно, что синтез нейтральных липидов АТФ-независим [в противоположность синтезу фосфолипидов], поэтому не удивительно, что в опухолевых клетках с низким уровнем АТФ складываются благоприятные условия для преимущественного образования нейтральных липидов в форме ЛП-гранул. В частности, в период активной мобилизации липидов из тканей опухоленосителя и их последующей преимущественной аккумуляции в опухолевых клетка (для опухоли Эрлиха это происходило в период между 6 и 8 сутками роста АОЭ //7 vivo (Рис.9)].

Рис.8. Уменьшение интенсивности митохондриальной флуоресценции родамина-123 при переходе in vivo от экспоненциальной (Б) в стационарную (Г) фазу роста клеток АОЭ коррелировало с увеличением размера внутриклеточных липопротеиновых (ЛП) гранул [переход от (А) к (В); Л П-гранулы при этом можно было непосредственно наблюдать при фазово-контрастном микроскопировании (В)]

Многие опухолевые клетки имеют ряд общих метаболических свойств с эмбриональными клетками. В частности, и эмбриональные, и опухолевые клетки проявляют высокую резистентность к токсичному действию кислорода (модель гипероксигенации). В лаборатории профессора

Рис.9. Изменение некоторые параметров метаболизма глюкозы и липидов в процессе развития асцитной опухоли Эрлиха in vivo. А - содержание глюкозы (1) общих липидов (II) в плазме крови опухоленосителя; В - относительное содержание полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) к насыщенным жирным кислотам (НЖК) в динамике роста АОЭ.

Frank I. было установлено, что клетки легкого из эмбриона или новорожденного приобретают большую устойчивость к токсичному действию атмосферного кислорода, если животные в период беременности получали диету с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот. Такая повышенная устойчивость формировалась у эмбрионов [позднего срока развития] или новорожденных не за счет активации антиоксидантных защитных систем, а за счет образования внутриклеточных липид-содержащих гранул с высоким уровнем полиненасыщенных жирных кислот. Такие гранулы обнаруживали липидный состав (Sosenko I.R.) сходный с опухолевыми ЛП-гранулами (DiPaolo J.А.). Формирование в опухолевых и эмбриональных клетках липидного депо (ЛП-гранул) является, вероятно, проявлением одного из наиболее древних и примитивных механизмов клеточной защиты. В частности, в опухолевых клетках (АОЭ, АГЗ), развивающихся in vivo, такой защитный механизм потенциально способен эффективно функционировать только на поздних этапах взаимодействия опухоли и организма, когда в опухолевых клетках эффективность работы основных

-а» «»«•*«»> ¡[fifi ~ А . 1 II1 iи \щ

• Щ\ i сод J ff

• щ л iíiiii iütii ' ■

Развитие опухоли (АОЭ)

Рис. 10. Изменение активности Н202-продуди-рующего фермента [СОД: супероксидцисмутазы (А)] и Н202-удшшющего фермента [ГП: глютатион пероксидазы (В)] в клетках асцитной опухоли Эрлиха (АОЭ) в динамике опухолевого развития in vivo. Рост АОЭ характеризовался приростом доли АОЭ-клеток и накоплением асцитной опухолевой жидкости (С). Заштрихованная область выделяет период (6-9 сутки), при котором клетки АОЭ проявляют окислительный дисбаланс [между активностями СОД и ГП ферментов]: Развитие этого дисбаланса коррелировало с фазой быстрого увеличения объема асцитной жидкости в опухоли (С; заштрихованная область). антиоксидантных систем значительно снижена. В частности, существенно снижена активность супероксид-дисмутазы (Рис.10); резко уменьшен пул эндогенных НАД(Ф)Н, функционирующих как кофакторы глутатионзависимых антиоксидантных ферментов. По данным Е.А. Нейфаха в этот период также снижено содержание важного липофильного антиоксиданта - альфа-токоферола.

В последние года накопилось немало данных не только о высокой устойчивости различных опухолей к повреждающему действию свободных радикалов, но и о способности опухолевых клеток к генерации свободных радикалов [как при экзогенной стимуляции (Orr W.F.,1994), так и без таковой (Nathan С.F.,1991), когда опухолевые клетки в условиях in vitro продуцировали низкий, но постоянный уровень внеклеточных гидропероксидов]. В опытах Bozzi А. также была подтверждена способность опухолевых клеток продуцировать Н202 при переходе клеток от гипоксии к нормоксии in vitro. При этом в опухолевых клетках возникал временный дисбаланс между повышением активности Н202-продуцирующего фермента (супероксид-дисмутазы - СОД) и снижением активности Н202-удаляющего фермента (глутатион пероксидазы - ГП). Пободный окислительный дисбаланс обнаруживался также в опухолевых клетках АОЭ в период поступления нормоксической плазмы к гипоксическим асцитным АОЭ-клеткам, растущим в перитонеальной полости. Возникновение этого временного дисбаланса (между СОД и ГП-зой) коррелировало с фазой быстрого накопления асцитной жидкости в опухоли (Рис. 10) и диссеминацией опухолевого процесса, что многими авторами (Orr W.F., Young S.D.) связывается со способностью опухолевых ¡слеток, в определенных ситуациях, локально генерировать оксиданты, прежде всего Н202 (Orr W.F). До настоящего времени в опухолевых клетках не идентифицирована ферментативная система, способная продуцировать свободные рад,и калы без экзогенной стимуляции опухолевых клеток (Nathan С.F.), а также не выявлены места ее внутриклеточной локализации. Используя витальный цитохимический краситель - пара-нитро-тетразолий фиолетовый, удалось визуализировать [по локальному образованию окрашенного формазана] места эндогенной генерации супероксидных радикалов в клетках АОЭ. Действительно, было установлено, что формазан образовывался в части опухолевых клетках АОЭ только в период быстрой аккумуляции, поступающей нормоксической плазмы в перитонеальную полость, к гипоксическим АОЭ-клеткам. Неожиданностью оказался тот факт, что формазановые гранулы располагались в тесном контакте с

Рис.11. Выявление мест внутриклеточной локализации формазана (малые темные гранулы), формирующиеся в результате свободно-радикального восстановления витального тетразолиевого цитокра-сителя (пара-нитро-тетразолия фиолетового) в клетках АОЭ и на их ЛП-гранулах. Установлен тесные контакт между формаза-новыми гранулами и ЛП-гранулами (и их соотношение 1:1).

ЛП-гранулами (Рис.11) и на каждой ЛП-грануле выявлялось не более одной формазановой гранулы. Неизвестно, что отражает факт такого тесного контакта, очевидно лишь одно, что при таком внутриклеточной расположении • мест, возможных источников генерации оксидантов, их действие не должно негативно повлиять на выживаемость опухолевых клеток и их интегральную резистентность.

СНИЖЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЯ КАК ВАЖНЫЙ ФАКТОР, СПОСОБСТВУЮЩИЙ РАЗВИТИЮ КОМПЛЕКСА ВТОРИЧНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ХОЗЯИНА.

Хорошо известна высокая конкурентноспособность большинства злокачественных опухолей за основные метаболиты, кофакторы и незаменимые антиоксиданты опухоленосителя. В зависимости от скорости развития этих процессов, следует ожидать снижение потенциальной устойчивости жизненноважных органов и их клеток к повреждающему действию оксидантов [как эндогенно, так и экзогенного генеза]. В опухолевых клетках АОЭ такое снижение отчетливо проявляется уже к 9 суткам развития АОЭ in vivo, когда уже не происходит прироста численности опухолевых клеток, а также объема асцитной жидкости в АОЭ (Рис.бА). Такому снижению устойчивости нормальных клеток опухоленосителя (Рис. 12) предшествует период (между 6 и 8 сутками) активной мобилизации липидов хозяина, обогащенных альфа- токоферолом (Нейфах Е.А.) (Рис.9) и их последующий транспорт в развивающиеся клетки АОЭ.

100*.

ФП-ПОЛ

ТИМУС

СЕЛЕЗЕНКА

ПЕЧЕНЬ

ЦИТОПЛАЗМА

ЦИТОПЛАЗМА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТОК АОЭ ЛП-ГРАНУЛЫ

Рис.12. Снижение свободно-радикальной устойчивости участков цитоплазмы нормальных клеток опухоленосителя (спленоцитов, тимоцитов, клеток печени), развивающееся к 9 суткам опухолевого роста АОЭ in vivo (рост ФП-ПОЛ, незаштрихованные столбцы) и их сравнение с контрольными нормальными клетками (заштрихованные столбцы) и с участками цитоплазмы опухолевых клеток АОЭ, также сохраняющих высокую устойчивость на разных этапах опухолевого роста [в противоположность опухолевым ЛП-гранулам, которые в период (11-14 сутки) теряли соответствующую устойчивость [свободно-радикальная устойчивость тестировалась внутриклеточно по уровню образования ФП-ПОЛ].

Вероятно, что именно снижение содержания в тканях опухоленосителя ряда незаменимых витаминов-антиоксидантов [таких как: витамин Е (альфа-токоферол), витамины А и Д] является патологической основой для уменьшения окислительной устойчивости этих тканей к стресс-индуцированным повреждения. Это в свою очередь повышает вероятность преимущественного развития окислительного стресса в тех тканях опухоленосителя, где могут сформироваться локальные клеточные очаги, хронически продуцирующие оксиданты и/или эндотоксины [в частности, фактор некроза опухоли, цитотоксическое действие которого также происходит посредством индукции свободно-радикальных реакция в митохондриях клеток-мишеней]. Известно, что в условиях организма именно активированные фагоциты являются основными источниками, где эндогенно могут синтезироваться эндотоксины и генерироваться оксиданты. Поэтому, логично было предположить, что именно в органах опухоленосителя [с конституционно высоким содержанием ретикулоэндо-телиальных клеток (как в селезенке, печени, легком)] можно ожидать развитие окислительного стресса, индуцирующего появление СР-модифицированных белков и липидов. Именно появление последних я рассматриваю как возможную патологическую основы для развития ряда вторичных болезней опухоленосителя.

Рис. 13. Схема развития основных реакций клетки на окислительный стресс, при которых индуцируется образование ряда патофизиологических значимых флуоресцирующих соединений. Часть этих соединений можно идентифицировать по длине волны их флуоресценции, а также по их реакции на УФ-свет. В частности, по различиям в скорости УФ-фотодеструкции, которая максимальная для ФП-ПОЛ и практически отсутствует для СР-модифицированного ферритина, тогда как некоторые производные ретиналей демонстрируют рост интенсивности флуоресценции, но только в гипоксических условиях.

Как же тестировать развитие окислительного стресса и его патологические последствия в условиях нативной клетки? На Рис.13 представлена обощенная схема, где суммированы современные знания о последовательности развития каскада приспособительных клеточных реакций на окислительный стресс и повышающих выживаемость клеток к повторных действиям стресса. Из этой схемы видно (Рис.13), то развитие адаптационных, клеточных реакций на окислительный стресс сопровождается появлением, а также исчезновением нескольких групп внутриклеточных флуо-рофоров, которые могут быть использованы как чувствительные маркеры, позволяющие оценивать участие того или иного типа клеточного ответа на стресс. В частности, высокая чувствительность ненасыщенных жирных кислот к окислению используется клеткой как триггерный механизм, запускающий экспрессию ряда защитных стресс-индуцированных белков [среди которых гем-оксигеназа, расщепляющая клеточные гем-содержащие белки в ответ на окислительный стресс]. Освобождающиеся при этом высокотоксичные ионы железа акуммулируются в форме ферритина. Такой ответ клетки на окислительный стресс обратим, и после прекращения действия стрессора, накопленное железо реутилизируется из ферритинового депо. O'Connel M.J. установил, что ферритин можно необратимо модифицировать свободными радикалами в условиях in vitro, при этом водорастворимый ферритин становится водонерастворимым, устойчивым к протеолизу и приобретает желтую флуоресценцию сходную по спектрокинетическим свойствам с флуоресценцией гемосидерина и липофусцина [известного пигмента старения]. Известно, что развитие злокачественного опухолевого процесса индуцирует развитие гиперферритинемии, прежде всего в селезенке опухоле-носителя. Это связывают, в первую очередь, с развитием стойкой тенденции к повышенному катаболизму в селезенке опухоленосителя эритроцитов с повышенной регидностью. Развитие селезеночной гиперферритинемии обычно рассматривается как прявление системного действия опухоли на организм хозяина. До начала проведения моих исследований не было известно является ли ферритин, накапливающийся в селезенке опухоленосителя необратимо модифицированным или нет.

С помощью прямых микроспектрофлуоресцентными измерений нативных тканей опухоленосителя было установлено (Рис.14) появление только в ткани селезенки желтой флуоресценции с высокой устойчивостью к Уф-фотодеструкции [такая флуоресценция обычно обнаруживалась в селезенке не ранее 9 суток роста АОЭ]. Аналогичные спектрокинетические параметры (Рис.14) характерны также для ферритина, модифицированного свободными радикалами in vitro (O'Connel M.J.) и липофусцина. Эти данные указывают, что одним из результатов системного действия, развивающейся опухоли (АОЭ) на организм хозяина, является возникновения вторичной болезни накопления [селезеночной гиперферритинемии, где большая часть ферритина приобретала необратимую модификацию, вероятно, в результате локального действия эндогенно-генерируемых свободных радикалов]. Этому способствует,

Рис.14. Спектрокинетические изменения флуорес-ценции нативной ткани селезенки, [взятой из опухоленосителя на 9 сутки роста АОЭ] при действии УФ-света (А=365нм). Стрелка показывает быстрое уменьшение интенсивности флуоресценции (в спектральной полосе 430-460нм, характерное для ФП-ПОЛ). Пунтрирные линии показывают желто-оранжевую флуоресценцию селезеночных пигментов (с высокой устойчивостью к УФ-фотодеструкции). прежде всего уменьшение порога устойчивости спленоцитов к окислительному стрессу (Рис. 12), а также развитие спленомегалии с миелоидной гиперплазией [ведь именно тканевые миелоциты, как активно фагоцитирующие клетки, являются основным источником, продуцирующим оксиданты и эндотоксины в селезенке опухоленосителя]. В условиях развития кратковременного окислительного стресса, повышается экспрессия индуцибильной формы ферритина, где временно акуммулируется железо и тем самым уменьшается вероятность развития свободно-радикальных реакций окисления [с помощью реакций Фентона]. Одновременно с этими процессами развивается и вторичная анемия, неспецифически ингибирующая различные пролиферативные процессы [так как железо необходимый активатор рибонуклеотид редуктазы - ключевого фермента синтеза ДНК]. После прекращения действия окислительного стресса, организм способен реутилизировать железо из ферритинового депо. Многие клиницисты и экспериментаторы отмечали, что развитие злокачественного опухолевого процесса часто сопровождается появлением загадочной необратимой анемии, преимущественно индуцированной низкой реутилизацией железа из ферритинового депо, хотя в организме опухоленосителя наблюдается гиперферритинемия и обнаруживаются массивные отложения железа в селезенке и печени. Наши экспериментальные находки позволяют предположить, что низкая реутилизация железа из ферритина вызвана его необратимой модификацией [возможно с образованием внутрипротеиновых "сшивок", затрудняющих процесс "изъятия" железа из ферритинового депо]. В результате в организме опухоленосителя формируется новый "порочный функциональный цикл" (Рис.15), когда анемия из временной, защитной реакции . организма на окислительный стресс, становится хронической и необратимой. Представленная схема (Рис.15) объясняет, почему этот тип анемии противопоказано лечить с помощью экзогенных препаратов железа. Это обусловлено тем, что введение железосодержащих препаратов, с одной стороны, ускоряет процессы опухолевой пролиферации; а с другой стороны, на фоне хронического окислительного стресса организма, экзогенно поступающее железо будет опять преимущест

ИНГИ6ИРОВАНИЕ ПРОЛИФЕРАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ / КЛЕТОК ИЗ-ЗА НЕДОСТАТКА ИОНОВ ЖЕЛЕЗА

НЕОБРАТИМАЯ АНЕМИЯ

НИЗКАЯ РЕУТИЛИЗАЦИЯ ИОНОВ ЖЕЛЕЗА ИЗ ДЕПО СРМФ

МОБИЛИЗАЦИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКА АНТИ0КСИДАНТ08 ХОЗЯИНА В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ

СНИЖЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ КЛЕТОК ХОЗЯИНА К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ

ПОВЫШЕННАЯ ПОВРЕЖДАЕМОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ

ВРЕМЕННАЯ ГИПОФЕРРИМИЯ КРОВИ ИЗ-ЗА ДЕПОНИРОВАНИЯ ИОНОВ ЖЕЛЕЗА В ФОРМЕ ФЕРРИТИНА

ГИПЕРФЕРРИТИНЕМИЯ В СЕЛЕЗЕНКЕ

ОБИЛЬНОЕ НАКОПЛЕНИЕ СР - МОДИФИЦИРОВАННОГО ФЕРРИТИНА (СРМФ] В СЕЛЕЗЕНКЕ

УСИЛЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ЭНДОТОКСИНОВ АКТИВИРОВАННЫМИ МАКРОФАГАМИ

ГЕНЕРАЦИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ (СР), ИНДУЦИРУЕМАЯ ЭНДОТОКСИНОМ (ФИО)

УСИЛЕНИЕ

ИНТОКСИКАЦИИ

ЛЕТАЛЬНЫЙ ИСХОД

Рис.15. Предполагаемая последовательность событий, индуцирующая формирование в организме опухоленоси-теля нового "порочного цикла" [средний круг, обозначенный сплошной линией], как патологической основы для дальнейшей прогрессии анемии, развивающейся на фоне нарастающей эндотоксикации опухоленосителя (при выживании части опухолевых клеток, но в отсутствии их пролиферации). Развитие этого "порочного", патологического цикла связано с системным действием опухоли и развитием вторичной болезни накопления [селезеночной гиперферритинемии, где ферритин после свободно-радикальной модификации утрачивает способность к эффективной реутилизации железа (возможно, он также может действовать как перманентный локальный раздражитель тканевого фагоцитов)]. Необходимость железа для процесса пролиферации, неспецифически ограничивает скорость клеточного деления нормальных клеток при стресс-индуцированной временной анемии '[внутренний малый цикл, короткая пунктирная линия], а также ингибирует пролиферацию опухолевых клеток при опухоль-индуцированной анемии [как обратимой, так и необратимой]. венно накапливаться в форме ферритине, а не использоваться для целей эритропоэза. В опытах на животных Manuel D.N. установил, что на поздних стадиях развития опухолевого процесса, именно селезенка становится основным источником эндотоксина (ФИО), увеличение концентрации которого, и является непосредственной причиной смерти опухолено-сителя от эндотоксического шока. Причины почему именно селезенка становится в этот период основным местом синтеза эндотоксинов неизвестны. Можно предположить, что внеклеточные отложения модифицированного ферритина [помимо индуктора необратимой анемии] могут также действовать по аналогии с "инертной занозой", которую безрезультатно пытаются катаболизировать многочисленные селезеночные фагоциты, продуцируя при этом провоспа-лительные эндотоксины и усиливая таким образом, развитие воспалительной реакции в селезенке опухоленосителя. Напротив, в зоне роста • опухоли, а также в нормальных тканях, непосредственно прилегающих к опухоли ("опухолевом поле"), стойко поддерживается противовоспалительная реакция, дополнительно защищающая опухолевые клетки [и без того с повышенной устойчивостью к окислительному стрессу] от повреждающего действия оксидантов и эндотоксинов. Формирование в одном организме опухоленосителя этих двух антагонистических тканевых центров [опухолевого и селезеночного, резко отличающихся по окислительной устойчивости], способствует выживанию части опухолевой популяции на фоне, нарастающей эндотоксикации хозяина (Рис.16). Представленные в данном разделе экспериментальный данные подтверждают гипотезу, что формирование стойкого дисбаланса, между повышенной окислительной устойчивостью опухоли и снижением защитного потенциала тканей опухоленосителя к свободно-радикальным повреждениям, является патологической основой для развития некоторых вторичных болезней опухоленосителя.

ОПУХОЛЕВЫЙГ РОСТ

МОБИЛИЗАЦИЯ И ТРАНСПОРТ ЖИЗНЕННОВАЖНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ХОЗЯИНА В ОПУХОЛЬ

МЕТАБОЛ ИСТИЧЕСКАЯ ДЕПРЕССИЯ КЛЕТОК ХОЗЯИНА КАК ОСНОВА ДЛЯ РОСТА КЛЕТОЧНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ

ВЫСОКАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ОКИСЛИТЕЛЬНЫМ ПОВРЕЖДЕНИЯМ

МИНМ ' |

ЗАЩИТНОЕ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЕ ТКАНЕВОЕ ПОЛЕ", ФОРМИРУЮЩЕЕСЯ ЛОКАЛЬНО ВОКРУГ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК г

ФОРМИРОВАНИЕ

ЛОКАЛЬНЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ

ЦЕНТРОВ (КАК В СЕЛЕЗЕНКЕ) [+

1 СИНТЕЗ ЭНДОТОКСИНОВ (КАК ФНО)

ВЫЖИВАНИЕ НЕКОТОРЫХ1 ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК | | ПРИ ЭНДОТОКСИКАЦИИ^1,

МОБИЛИЗАЦИЯ И

ТРАНСПОРТ АНТИОКСИДАНТОВ ХОЗЯИНА В

Опухолевые клетки

ПРИОБРЕТЕНИЕ ОПУХОЛЕНОСИТЕПЕМ НИЗКОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ОКИСЛИТЕЛЬНЫМ ПОВРЕЖДЕНИЯМ

РАЗРУШАЮЩИЕСЯ КЛЕТКИ ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЯ КАК ИНДУКТОРЫ СПЛЕНОМЕГАЛИИ И АКТИВАТОРЫ ТКАНЕВЫХ МАКРОФАГОВ

I ЭНДОТОКСИМИЯ I 1 ^СОЗЯИНА^ смерть i i опуюл№004те£ш|

Рис. 16. Интегральная схема, объясняющая происхождение опухоль-индуцированной эндотоксикации и анемии хозяина как результат противостояния двух антагонистических тканевых центров: 1) защитного, противо-воспали-тельного "опухолевого поля", формирующегося из фено-типически нормальных клеток, непосредственно окружающих опухоль; 2) воспалительных, локальных очагов, формирующихся в селезенке, которая при этом становится основным источником генерации эндотоксинов в организме опухоленосителя. Это противостояние развивается на фоне высокой устойчивости опухолевых клеток к повреждающему действию окислительного стресса и при потери такой устойчивости у большинства нормальных, тканей и клеток опухоленосителя.

Рис. 17. Применение интерференционного микроскопи-рования с полным расщепленным изображением для выявления перфторуглеродов в нативных цитологических препаратах.

A. Кровь контрольного животного после 2-х часовой инкубации с перфтордекалином. В центре кадра - капля перфтордекалина (зеленое изображение справа) и шиловидный эритроцит (зеленое изображение слева). Благодаря тому, что коэффициент преломления перфтордекалина меньше, чем у воды (фон), тогда как коэффициент преломления клетки выше, чем у воды -изображение перфтордекалина и клетки при расщеплении оказываются смещенными в противоположные стороны, что и позволяет их идентифицировать.

Б. Сорбционное взаимодействие капель перфтордекалина (зеленое изображение сверху) и окисленных липосом (зеленое изображение снизу).

B. Сорбционное взаимодействие мелких капель перфтордекалина (зеленое изображение справа) и липосом (зеленое изображение слева). Слева, сбоку - крупная капля перфтордекалина.

Г. Кровь, оттекающая от солидной опухоли [саркома С-45], после инкубации in vitro с перфтордекалином. Видно, что капли перфтордекалина (зеленое изображение сверху) разного размера связаны между -собой нитевидной, фибрино-подобной структурой биологической природы (зеленое изображение снизу).

Д. Результат инкубации крови, оттекающей от спонтанной опухоли крысы, с перфтордекалином. Видно, что капли перфтордекалина (голубое изображение сверху) сорбируют компоненты плазмы крови (голубое изображение снизу).

Е. Клетки асцитной гепатомы Зайделя (зеленое изображение снизу), окруженные более мелкими каплями перфтордекадина (зеленое изображение сверху).

Развитие окислительного стресса в организме опухоленосителя сопровождается увеличением содержания ряда токсичных продуктов окисления, общим свойством которых является их повышенная гидрофобность.

Эндотоксины также преимущественно концентрируются в гидрофобной части липопротеинов, которые после этого приобретают высокотоксические свойства. Поэтому удаление таких гидрофобных, токсичных продуктов из организма опухоленосителя может помочь уменьшить последствия окислительного стресса. Американское агенство по испытаниям противоопухолевых соединений недавно представило отчет - 5-летний итог клинических испытаний, сочетанного применения противоопухолевых курсов радиоци-онной терапии и эмульсионных сред, на основе перфтор-органических соединений [как газотранспортирующих средств, в частности, применяемые для увеличения напряжения кислорода в зоне роста опухоли]. Установлено, что применение перфторорганических эмульсий [в неоперабельных стадиях развития опухолевого процесса] не только способствовало ингибированию опухолевого роста, но и уменьшало эндотоксикацию организма, подавляло дальнейшее распространение опухолевого процесса, и тем самым увеличивало показатели 5-летней выживаемости больных. Механизмы такого антитоксического действия химически инертные перфторорганических соединений неизвестны. Нам впервые удалось показать высокую сорбционную активность этих соединений, что стало возможным благодаря нашим методическим разработкам и созданию уникального метода (Яшин В.А., Шварцбурд П.М., Карнаухов В.Н., 1986), позволившего непосрественно наблюдать за поведением химически инертные перфторорганические соединений в любых нативных цитологических образцах (Рис.17). выводы

1. Впервые обнаружены пространственно-упорядоченные кластерные структуры из липопротеиновых гранул (ЛП-гранул) в клетках асцитной гепатомы Зайделя (АГЗ), но не в клетках асцитной опухоли Эрлиха (АОЭ). Этот результат получен методом интерференционной микроскопии, с полным расщеплением изображения.

2. Разработан микроспектральный метод, позволивший впервые определять устойчивость нативных тканей, а также одиночных, живых клеток и внутриклеточных компартментов к развитию перекисного стресса. Предложенный спектрокинетический метод позволяет разделять сигналы флуоресценции продуктов перекисного окисления липидов и НАД(Ф)Н, которые не могли быть разделены по положению максимумов их флуоресценции.

3. Исследована сравнительная динамика порога устойчивости нормальных и опухолевых клеток различных тканей к окислительному стрессу. Установлена потенциальная способность внутриклеточных, опухолевых ЛП-гранул работать ловушками свободных радикалов, ограничивая таким образом летальные повреждения опухолевых клеток от цитотоксического действия высокореакционных радикалов. Определены метаболические условия, способствующие развитию защитного потенциала у опухолевых ЛП-гранул.

4. Установлено, что в стадии быстрого накопления асцитной опухолевой жидкости, в опухолевых клетках АОЭ возникает временный окислительный дисбаланс: между ферментами, генерирующими и удаляющими гидропероксиды, что указывало на потенциальную способность опухолевых клеток (в отсутствии экзогенной стимуляции) продуцировать оксиданты [аналогично модельной ситуации - "гипоксия-реоксигенация" опухолевых клеток in vitro]. Цитохимическим методом определено внутриклеточное расположение систем, потенциально способных к эндогенному образованию свободных радикалов внутри опухолевых клеток.

5. Установлена стадия, когда в большинстве нормальных тканей и клеток опухоленосителя снижается порог устойчивость к повреждающему действию окислительного стресса (при сохранении его опухолевыми клетками АОЭ). Возникновение этого дисбаланса между устойчивостью опухолевых и нормальных клеток коррелирует с развитием ряда вторичных болезней опухоленосителя [селезеночной гиперферритинемии, анемии, эндотоксемии], что позволяет рассматривать данный окислительный дисбаланс как патологическую основу развития "Паранеопл этического синдрома" в организме опухоленосителя.

6. Впервые в селезенке опухоленосителя обнаружена флуоресценция, характерная для необратимо модифицированного свободными радикалами ферритина. Установлено, что такая флуоресценция обнаруживается только на стадии развития селезеночной гиперферритинемии, предшествовавшей прогрессии анемии и эндотоксикации организма. На основании полученных данных, предложена последовательность событий, индуцирующих формирование в организме опухоленосителя "порочного цикла". Его функционирование, сдерживает рост опухолевых клеток, но усиливает анемию и эндотоксикацию организма.

7. Впервые экспериментально установлена сорбционная активность химически инертных перфторорганических (ПФО) соединений. Выявлена способность ПФО-соединений эффективно сорбировать ряд окисленных компонентов крови, непосредственно оттекающих из опухоли, и тем самым уменьшать окислительный стресс в организме. Открытие этого явления стало возможным благодаря нашим разработкам уникального метода, позволившего непосредственно визуализировать химически инертные ПФО-соединения в любых нативных цитологических препаратах.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Шварцбурд П.М., Гаранина H.H. К вопросу о местном иммунорегуляторном действии злокачественных опухолей. Тезисы доклада, 5 Всесоюзный симпозиум по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ, г.Рига, 1983, стр. 102-103.

2. Шварцбурд П.М. Цитолюминесцентные исследования субпопуляционного состава асцитной гепатомы Зайделя на разных стадиях ее развития. Тезисы доклада, 2 Всесоюзное совещание "Люминесцентный анализ в медицине и биологи и его аппаратурное обеспечение", г.Рига, 1985, стр 43.

3. Шварцбурд П.М., Гаранина H.H. О местном иммунорегуляторном действии злокачественных опухолей. "Экспериментальная, онкология", 1985, т.7, №5, 71-73.

4. Сухоруков Б.И.Шварцбурд П.М. Влияние концентрации ионов водорода в среде на состояние хроматина в лимфоидных клетках, "Биофизика", 1985, т.30, №4, 637641.

5. Шварцбурд П.М. О некоторых возможностях использования флюорохрома акридинового оранжевого для изучения процессов дифференцировки в различных одиночных опухолевых клетках. Тезисы доклада. 6 Конференция онкологов Прибалтийских республик и 8 республиканская конференция онкологов Латв. ССР "Профилактика,- ранняя диагностика и лечении злокачественных новообразований", 1985, Рига, стр. 69-70.

6. Шварцбурд П.М. Эндогенные энергетические параметры лимфоцитов нативной крови как показатель их иммунологической реактивностию. Сборник докладов, 4 Всесоюзный симпозиум "Регуляция иммунного гомеоста-за", 1986, Ленинград, стр. 257-258.

7. Яшин В.А., Шварцбурд Л.М., Карнаухов В.Н. Применение микроскопа Перавал-интерфако для выявления перфтор-углеродов в тканях организма. "Йенское обозрение". 1986, №1, стр.42-44.

8. Шварцбурд П.М. Кластерные структуры из липидсодер-жащих органелл в нативных клетках асцитной гепатомы

Зайделя. Топография распределения, структурные особенности. Препринт, ОНТИ НЦБН АНСССР, стр. 1-12.

9. Шварцбурд П.М., Асланиди К.Б. Спектральные характеристики липидсодержащих кластеров в нативных опухолевых клетках. Тезисы доклада, 1 Всесоюзное рабочее совещание "Биофизика рака", Черноголовка, 1987, стр.149.

10. Григоренко Е.В., Шварцбурд П.М. Особенности возрастного метаболизма высокораковой линии мышей AKR. Сборник докладов "Молекулярные основы биотехнологии", Пущино, 1987, стр.68-69.

11. Шварцбурд П.М., Асланиди К.Б., Карнаухов В.Н. О происхождении флуоресценции липофусциновых гранул, Тезисы доклада, 5 Всесоюзный съезд геронтологов и гериатров, г.Тбилиси, 1988, стр.104.

12. Шварцбурд П.М., Асланиди К.Б., Маевский Е.И., Григоренко Е.В. Кислородзависимый цитокиллинг и особенности липидного обмена опухолевых клеток.Тезисы доклада, 4 Всесоюзный съезд патофизиологов, г.Кишенев, 1989, стр.71.

13. Schwartsburd P.M., Aslanidi K.B. Estimation of the intensity of lipid peroxidation in refractive granuls of native ascitic tumor cells during cancer development, (Abstract) International conference "Regulation of free reaction", Varna, Bulgaria, 1989, p.166.

14. Шварцбурд П.М., Асланиди К.Б.,Карнаухов В.Н. К вопросу о происхождении эффекта "возгорания" флуоренции в липофусциновых гранулах. "Биофизика", 1989, т.ЗО, вып.4, стр. 593-597.

15. Шварцбурд П.М. Липопротеины очень низкой плотности и их окислительный метаболизм - важный патогенетический фактор, определяющий состояние нервной и иммунной систем в зоне роста опухолей. Тезисы докладов. 5 Всесоюзный симпозиум "Взамодействие нервной и иммунной систем", Ленинград-Ростов/Дону, 1990, 188189.

16. Григоренко Е.В., Шварцбурд П.М. Предопухолевые изменения метаболизма печени высокораковой линии мышей AKR. Тезисы доклада. Всесоюзный симпозиум "Биохимия опухолевой клетки", Минск, стр. 36-37.

17. Шварцбурд П.М. О причинах ингибирования роста и селективности цитотоксическосо действия ненасыщенных жирных кислот на опухолевые клетки. Тезисы доклада, Всесоюзной симпозиум "Биохимия опухолевой клетки", Минск, 1990, стр. 158-159.

18. Schwartsburd P.M., Maevsky E.I. Can reactions of "respiratory burst" occur in tumor cells? Abstracts 2-th Meeting the Federation of Europ. Biochem. Soc. (FEBS), Hungary, 1990, p. 157.

19. Schwartsburd P.M., Aslanidi K.B. Resistance of single tumor cells and their intracellular compartments to lipid peroxidation. "Med. Oncol. & Tumor Pharmacother", 1991, 8, 57-61.

20. Schwartsburd P.M., Aslanidi K.B. Spectrokinetic characteristics of two types of fluorescence of refractive granules in native individual cells from ascitic tumors. "Biomedical Science", 1991, 2, pp.391-397.

21. Schwartsburd P.M., Aslanidi'K.B. Analysis of some metabolic conditions promoting selective sensitity of tumor cell to peroxidative stress. "Med. Oncol. & Tumor Pharmacother.", 1991,2,235-241.

22. Schwartsburd P.M. About the origin of fluorescent products formation in the native cells anf their granules upon chronic peroxidative stress. Abstract. Fourth International Symposium of Lipofuscin and ceroid pigments. "Biology of Aging-92", Tampere, Finland, pp.21.

23. Schwartsburd P.M. Lipoprotein granules in tumor cells as the effective traps and quenchers of free radicals, Abstract, 25th Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology, Stockholm, Sweeden, 1993, P006:09.

24. Schwartsburd P.M., Lankin V Z. Tumor lipoproteins as protectors of hypoxic tumor cells against oxidative stress. Abstract. Fourth European Congress of Cell Biology, Czechoslovakia, Praque, 1994, 18, p.567 (Th-117).

25. Schwartsburd P.M., Lankin V Z. Liproteins in hypoxic tumor cells as traps of free radicals. "Medical Oncology", 1994, 11, 3/4,101-110.

26. Schwartsburd P.M. On the origin of heterogenety of lipofuscin fluorophores and their possible interrelations. "Gerontology", 1995, 41, Suppl. 2, 29-37.

27. Schwatsbood P.M., Lankin V.Z. Endogenous induction of transient oxidant imbalances in Ehrlich cells as possible trigger to fast tumor fluid accumulation. Medical Oncology,

1995, 12, 203-207.

28. Schwartsburd P.M., Lankin V.Z. Oxidant-imbalance state in tumor ascitic ceils as a possible trigger to fast fluid influx into peritoneal cavity. Abstract. Keystone Symposium "Oxidant Stress: From Molecules to Man", USA, 1996, A2 141.

29. Schwartsburd P.M. A new mechanism connecting high levels of tumor resistance with increased ability to metastasize. Abstract. International Symposium "Anticancer Targets and Strategies for the Twenty-First Century", Castres, Fr&nce,

1996, pp.109.

30. Schwartsburd P M. An integrated view on the genesis of irreversible anemia and endotoxemia in cancer-bearing host. "Frontier Perspectives", 1997, 7(1) (in publication).

31. Шварцбурд П.М. Почему опасно лечить анемию у опухоленосителей. Тезисы доклада. I Международный Симпозиум "Фундаментальные науки и альтернативная медицина", 1997, г.Пущино, стр. 45-46.

32. Schwartsburd P.M. Is cancer induced "Tumor field" to formation of new immunological privileged sites in tumor-bearing host? (in press).

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АТФ аденозинтрифосфат

ЛП-гранулы липопротеиновые гранулы

ПОЛ перекисное окисление липидов

ФП-ПОЛ флуоресцирующие продукты перекисного окисления липидов НАДН восстановленный никотинамидадениндинуклеотид

НАД окисленный никотинамидадениндинуклеотид

НАДФН восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат

МДА малоновый диальдегид

СОД супероксиддисмутазы

ГП глутатионпероксиаза

АГЗ асцитная гепатома Зайделя

АОЭ асцитная опухоль Эрлиха

СР свободные радикалы

СРМФ свободно-радикально модифицированный ферритин ФНО фактор некроза опухоли

ПФО-соединения перфторорганические соединения

Работа частично поддержена Российским Фондом Фундаментальных Исследований (гранты № 96-04-50263: № 96-04-49053).

Выражаю глубокую ÔMHûqafiHàcfHb сбоим цчи(Яеляж -Марии Николаевне /¿онурамовой, Валерию Николаевичу Карнацховц и безвременно цшеуишщ otíí нас профессору ß .M 3)ильмащ, а (пакже всем, моим соавМорам и коллегам, без помощи и nóqqe/гжкл которых 3it¿a paáotíia ¿tjiUa âtn невозможна. Особую ¿AaiúqapHúciñb выражаю f¿. .dcAxiHuqu за (перление к автору и псшлць в paéottie и оформлении рукописи.