Определение следовых концентраций аминокислот, различных органических кислот и сахаров при их совместном присутствии методом реакционной хромато-масс-спектрометрии в водных и органических растворах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат химических наук Соболевский, Тимофей Геннадьевич

• Соболевский, Тимофей Геннадьевич
• кандидат химических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат химических наук Соболевский, Тимофей Геннадьевич

список сокращений. введение.

глава 1. методы полумения летучих производных аминокислот, различных органических кислот и сахаров (литературный обзор).

1.1. Газохроматографический анализ аминокислот.

1.2. Газохроматографический анализ жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксокислот, спиртов, сахаров и родственных соединений.

глава 2. оборудование, исходные вещества и методика эксперимента.

2.1. Оборудование.

2.2. Исходные вещества и материалы.

2.3. Методика эксперимента.

2.3.1. Приготовление растворов модельных соединений.

2.3.2. Дериватизация аминокислот с использованием гексаметилдисилазана

2.3.3. Дериватизация модельных соединений с использованием N.O-бис(триметилсилил)трифторацетамида и Ь/-метил-Ь/третбутилдиметилсилилтрифторацетамида.

2.3.4. Дериватизация аминокислот с использованием изобутилхлорформиата

2.3.5. Дериватизация жирных и дикарбоновых кислот с использованием изобутилхлорформиата.

2.3.6. Приготовление лиофилизированных препаратов культуральной жидкости с клетками бактерий Escherichia Coli.

2.3.7. Приготовление клеточных культур фибробластов и аденокарциномы прямой кишки человека.

2.3.8. Экстракция из лиофилизата Escherichia Coli.

2.3.9. Дериватизация экстрактов из реальных образцов.

2.3.10. Газохроматографическое определение продуктов дериватизации.

2.3.11. Масс-спектрометрическая идентификация продуктов дериватизации

глава 3. дериватизация модельных соединений и оптимизация условий гх-мс определения летучих производных.

3.1. Оптимизация условий газохроматографического определения.

3.2. Силилировлние жирных, дикарбоновых, гидрокси-, okco- и аминокислот. сахаров, спиртов и стеролов.

3.2.1. Дериватизация гексаметилдисилазаном.

3.2.2. Дериватизация МО-бис(триметилсилил)трифторацетамидом.

3.2.3. Дериватизация аминокислот М-метил-Nтретбув 1лдиметилсилилтрифторацетамидом.

3.3. э1ерификация и ацилирование жирных, дикарбоновых и аминокислот.

3.3.1. Дериватизация изобутилхлорформиатом.

глава 4. хромато-масс-спектрометрическая идентификация продуктов дериватизации изучаемых соединений.

4.1. Электронная ионизация.

4.1.1. Изучение масс-спектров силильных эфиров жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов и оценка пределов детектирования.

4.1.2. Изучение масс-спектров изобутоксикарбонильных эфиров аминокислот и алкиловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот и оценка пределов детектирования.

4.2. Химическая ионизация.

4.2.1. Изучение масс-спектров силильных эфиров гидрокси-, оксокислот, Сахаров, спиртов и стеролов и оценка пределов детектирования.

4.2.2. Изучение масс-спектров изобутоксикарбонильных эфиров аминокислот и алкиловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот и оценка пределов детектирования.

глава 5. изучение состава соединений, выделенных из клеточных культур

5.1. Определение состава соединений, выделенных из аиофиаизированной культуры Escherichia Сои.

5.2. Определение состава жирных, дикарбоновых и аминокислот в клетках аденокарциномы и фибробллстов человека.

глава 6. определение следовых содержаний аминокислот в водных растворах.

6.1. Изучение возможности сорбционного концентрирования следовых количеств изобутоксикарбонильных производных аминокислот из органического раствора и ГХмс анализа всего концентрата.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Определение следовых концентраций аминокислот, различных органических кислот и сахаров при их совместном присутствии методом реакционной хромато-масс-спектрометрии в водных и органических растворах»

Актуальность темы. В настоящее время dcc чаще возникает необходимость высокоселектпвного и высокочувствительного определения состава таких биологически важных соединении, как ампиокислоты, органические кислоты и сахара, в различных объектах. Подобные исследования проводятся при диагностике различных заболеваний, в том числе врожденных. Состав органических кислот и Сахаров - один из показателен качества пищевой продукции и различных напитков. Микробиологические исследования также требуют определения состава этих классов соединении па ультрапизком уровне.

При определении таких соединении в ряде случаев используется жидкостная хроматография и капиллярный электрофорез, поскольку эти методы позволяют проводить определение указанных соединений напрямую (после предварительной очистки пробы). Однако пределы обнаружения (за исключением ВЭЖХ с амперометричеекпм детектированием), достигаемые в этом случае, сравнительно высоки, а в качестве элюепта необходимо использование органических растворителей высокой степени чистоты. Следует отметить также, что сочетание этих методов с масс-спектрометрией до сих пор находит лишь ограниченное применение, при этом пределы обнаружения существенно выше, чем в случае использования реакционной хромато-масс-спсктрометрнн. Кроме этого, жидкостная хроматография и капиллярный электрофорез не позволяют проводить определение соединений различных классов при их совместном присутствии в смеси.

Газовая хроматография находит более широкое применение в анализе указанных соединений, и, как правило, определение проводят с использованием пламеппо-ионизационного детектора. Поскольку рассматриваемые соединения, как правило, не подлежат прямому газохроматографическому анализу, необходимо проведение иредколопочиой дериватизации для переведения таких соединений в соответствующие летучие производные. В существующих публикациях, посвященных газохроматографическому определению соединений этих классов, уропепь рабочих концентраций составляет обычно 10"' - KTVo, и в подавляющем болыиннстис случаен не проводится определение всех рассматриваемых соединений при их совместном присутствии в смеси (или же определяют лишь несколько представителей каждого класса). Кроме того, наблюдается значительная противоречивость данных по условиям получения различных производных рассматриваемых классов соединений.

В настоящее время панболее часто используется два основных метода получения летучих производных вышеуказанных соединений: силилироваиие мреже - этернфикацпя (ацплироваинс) различными реагентами, в том числе ал-килхлорформиатами. Данные но условиям проведения реакции силилирования зачастую противоречивы - разные авторы предлагают различные температурные режимы проведения реакции, время дериватизацнп и используют разные растворители. Результаты, полученные разными авторами в эквивалентных условиях, также отличаются. Второй тип реагентов (различные алкилхлорфор-мнаты) сравнительно недавно получил применение для дериватизацни аминокислот и жирных кислот. Основным достоинством данного тина реагентов является то, что реакция протекает практически мгновенно в водно-оргаиичсской среде при комнатной температуре, хотя выход (степень конверсии) очень сильно зависит от выбранного алкнлхлорформната и вспомогательного реагента (спирта). Эта реакция все еще мало изучена в анализе жирных, дикарбо-иовых и гидроксикислот. Нет публикаций, и которых происходило бы одновременное определение амнио-, жирных, дикарбоповых и гидроксикислот и Сахаров в одной пробе.

Применимость некоторых описанных в литературе методов получения летучих производных показана только на модельных смесях соединений, а не на реальных объектах, хотя ясно, что матрица может оказывать настолько сильное мешающее влияние, что ни о каком не только количественном, но и качественном установлении состава не может быть и речи. Также в литературе совершенно не рассматривается применение концентрирования при определении изучаемых соединений. Как правило, только малая часть реакционной смеси, полученной после дериватизацни, подвергается анализу (1-2 мкл из 0.5-1 avi копечного экстракта), что приводит к значительному повышению пределов обнаружения, н не позволяет в полной мере раскрыть возможности, предоставляемые современным аналитическим оборудованием.

Необходимо отметить псмиогочпсленность работ но использованию реакционной хромато-масс-спектрометрии для анализа отдельных групп соединений, относящихся к рассматриваемым классам, хотя она является более высокочувствительным и, в большинстве случаев - высокоселективиым методом. Кроме того, масс-снектры летучих производных регистрируют для относительно больших количеств веществ, хотя известно, что общий вид масс-спектра зависит от концентрации, н чем ниже концентрация, тем больше масс-спектр может отличаться от библиотечного.

Цели и задачи исследования. Цслыо данной работы являлась разработка способа определения жирных, дикарбоповых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, спиртов и стеролов в водных и органических растворах (экстрактах) при их совместном присутствии в смеси на уровне следовых концентраций методом реакционной хромато-масс-спсктрометрип и снижения пределов обнаружения за счет использования сорбциоиного концентрирования из органического раствора (экстракта) с последующим анализом всего концентрата.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить закономерности силнлнровапия различных жирных, дикарбоповых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов в органических растворах с использованием гексаметилдисилазапа (ГМДС), N,0-бнс(триметилсилил)грифторацетамида (БСТФА), УУ-метил-ТУ-третбутил-димстилсилилтрифторацетамнда (МТБСТФА) и различных растворителей, и выбрать условия ГХ-МС определения соответствующих тримс-тилсилильпых (ТМС) и третбугилдиметилсилильиых (ТБДМС) производных;

- изучить масс-спектры электронной (ЭИ) и химической (ХИ) ионизации для различных количеств этих производных и пронести оценку пределов детектирования в режиме регистрации полного ионного тока и селективного ионного детектирования;

- разработать методологию определения жирных, днкарбоиовых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов п стеролов при их одновременном присутствии в смеси на уровне следов методом реакционной ГХ-МС;

- изучить условия дериватизации в водпо-оргаппчсском растворе для аминокислот, жирных, дикарбоновых и других органических кислот с помощью реакции этерифпкации - ацилирования (реагент - нзобутилхлорформиат, ИБХФ) и разработать условия ГХ-МС определения получающихся производных;

- изучить масс-спектры ЭИ н ХИ для различных количеств соответствующих изобутоксикарбонильных производных и алкиловых эфиров и оценить пределы детектирования;

- изучить состав жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, выделенных экстракцией из лиофнлизнрованпой культуры Е. Coli (после дериватизации);

- изучить состав жирных, дикарбоновых и аминокислот, выделенных из клеточных культур адснокарципомы прямой кишки человека и фиброб-ластов (после дериватизации), и возможность дифференциации этих типов клеток;

- разработать способ определения следовых количеств аминокислот в водном растворе, основанный на получении //-изобутоксикарбопил-О-гептаф-торбутиловых (ИБОК-ГФБ) производных, их экстракции хлороформом, сорбциоппом концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата.

Научная иоптпа. В работе изучены условия дериватизации широкого круга веществ (всего 60 соединении), принадлежащим к классам аминокислот, жирных, дикарбоновых, гидрокси- и оксокпслот, а также Сахаров, спиртов и стеролов с использованием следующих реагентов: ГМДС, БСТФА, МТБСТФА, ИБХФ. Показаны преимущества и недостатки каждого способа получения летучих производных п установлены оптимальные условия дериватизации и определения изученных веществ при их совместном присутствии.

Для всех производных изучены масс-спектры ЭИ для различных количеств веществ. Получены масс-спектры ЭИ ТМС производных ряда органических кислот, Сахаров и стеролов, отсутствующие в библиотеке масс-спектральных данных NIST98. Впервые представлены масс-спектры ЭИ TV-изобуток-сикарбоиил-О-нзобутиловых и Л^-нзобутокснкарбоиил-О-гептафторбутиловых эфиров аминокислот, а также гептафгорбутиловых эфнров жирных и дикарбоновых кислот. Установлены пределы детектирования всех соответствующих производных в режиме регистрации полного ионного тока (по масс-хроматограмме) и селективного ионного детектирования, которые

Q п о м составили 2.5x10" -2.0x10 г и 1.4x10 - 1.0x10 г в пробе (в зависимости от соединения и типа производных).

В режиме ХИ положительных ионов изучены масс-спектры ТМС производных гидрокси- и оксокислот, стеролов и Сахаров; TV-изобутоксикарбонил-О-нзобутнловых н //-изобутокснкарбоиил-О-гептафторбутиловых эфиров аминокислот, а также изобутиловых и гепгафторбутиловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот. Показано, что пределы детектирования всех изученных производных составляли 3.4х10'9 - 5.0х10"12г в режиме регистрации полного

Q п ионного тока (по масс-хроматограмме) и 1.0x10 - 1.0x10 г в случае селективного ионного детектирования (в зависимости от соединения и типа производных).

Предложена методология определения жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смеси па уровне следов, основанная на обработке одной части образца смесыо БСТФА с пиридином (после высушивания), а другой - смесыо ИБХФ с гептафторбутаполом в водно-органическом растворе. При этом в первом случае в виде ТМС производных определяются все классы соединений, кроме аминокислот, а во втором - аминокислоты, жирные, дикарбоиовыс и короткоцеиные гидрокси- и оксокислоты.

Па основании проведенных исследовании установлен состав свободных аминокислот, а также других органических кислот и Сахаров в лиофилизи-рованпой культуре клеток Е. Coli (штамм К-12 HfrH thi).

Проведено исследование состава жирных, дпкарбоиовых и аминокислот в суспензии клеток адснокарципомы прямой кишки человека и фибробластов и показана возможность дифференциации этих типов клеток на основании различия в составе аминокислот.

Предложен способ определения аминокислот в водных растворах, основанный па получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбциониом концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата, позволяющий снизить пределы обнаружения по крайней мерс на 2 порядка.

Практическая значимость. Предложенная методология позволяет решать задачи определения следовых концентрации широкого круга веществ в водных н органических растворах при их совместном присутствии. Изученные закономерности дернватпзацпп соединений различных классов позволяют выбрать наиболее подходящий реагент и условия проведения реакции в зависимости от цели и задач исследования, а также предполагаемого состава смеси.

Масс-спектры ЭИ и ХИ, полученные для различных производных всех изученных соединений, позволяют увеличить селективность определения и дополнительно снизить пределы детектирования при использовании селективного ионного детектирования.

Масс-спектры ЭИ соединений, отсутствующих в библиотеке масс-спек-тральных данных NIST 98, позволяют увеличить достоверность идентификации, что особенно важно в анализе аминокислот в виде изобутоксикар-бопильпых производных.

Разработанная методология анализа микробиологических образцов позволяет проводить высокочувствительное и селективное определение широкого круга соединений в указанных объектах.

Предложенный способ определения аминокислот в раковых клетках и фнбробластах позволяет увеличить достоверность дифференциации раковых и здоровых клеток.

Разработанный способ сорбциониого концентрирования из органических растворов обеспечивает возможность снижения пределов обнаружения по крайней мере на 2 порядка благодаря ГХ-МС анализу всего концентрата. На защиту выносятся:

- оптимизированные условия дерпватпзацнн соединений, принадлежащих к классам жирных, дикарбоиовых, гидроксн-, оксо- и аминокислот, спиртов, Сахаров и стеролов с использованием таких реагентов, как ГМДС, БСТФА, МТБСТФА, ИБХФ;

- масс-спектры ЭИ ТМС производных различных органических кислот, Сахаров, спиртов и стеролов, а также Л'-изобутоксикарбонил-О-изобутиловых, Л^изобутоксикарбоипл-О-гснтафторбутнловых эфиров аминокислот, пзобутиловых и гептафторбутиловых эфиров жирных и дикарбоиовых кислот, и соответствующие пределы детектирования;

- масс-спектры ХИ положительных ионов ТМС производных гидрокси- и оксокислот, спиртов, Сахаров и стеролов, TV-изобутоксикарбопил-О-изо-бутиловых и TV-изобутоксикарбонил-О-гсптафторбутиловых эфиров аминокислот, изобутиловых и гептафторбутиловых эфиров жирных и дикарбоиовых кислот, и соответствующие пределы детектирования;

- методология определения жирных, дикарбоиовых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смссн, основанная на обработке одной части образца смссыо БСТФА с пиридином (после высушивания), а другой - смссыо ИБХФ с геитафторбутанолом в водпо-оргаиичсском растворе;

- результаты определения состава соединении изученных классов, выделенных экстракцией из лиофилнзироваиной клеточной культуры Е. Coli;

- способ дифференциации клеток аденокарциномы и фибробластов, основанный па определении различия в составе аминокислот методом реакционной ГХ-МС;

- способ определения аминокислот в водном растворе, основанный на получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбционном концентрировании производных и ГХ-МС анализе всего концентрата, позволяющий снизить пределы обнаружения по крайней мере па 2 порядка. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены па

Питтсбургскон копфереицмп по аналитической химии и прикладной спектроскопии (12-17 марта 2000 г., Новый Орлеан, Луизиана, США), 24-м Международном симпозиуме но хроматографии (15-20 сентября 2002 г., Лейпциг, Германия), и 8-м Международном симпозиуме по гибридным методам в хроматографии (4-6 февраля 2004 г., Брюгге, Бельгия).

Публикации. По материалам работы опубликовано 8 работ в виде статей и тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка использованных литературных источников.

Заключение диссертации по теме «Аналитическая химия», Соболевский, Тимофей Геннадьевич

Выводы

1. Изучены условия силилнрования следовых количеств 60 различных жирных, дикарбоновых, гндрокси-, оксо- и аминокислот, спиртов, Сахаров и стеролов в органических растворах с использованием гсксаметилдисилазана, N,0-бис(триметилсилил)трифторацетамида и уУ-метил-уУ-третбутилдиметилси-лилтрифторацетамида и различных растворителей; показаны преимущества и ограничения каждого из способов дериватизацни, установлены оптимальные условия дериватизацни и определения изученных соединений при их совместном присутствии в смеси.

2. Изучены условия этерификации / ацилирования аминокислот, жирных, дикарбоновых и ряда других органических кислот в водно-органических растворах с использованием изобутнлхлорформната в сочетании с изобута-полом и гептафторбутаполом, и выбраны оптимальные условия проведения этой реакции.

3. Изучены масс-спектры электронной и химической ионизации ТМС, ТБДМС, ИБОК-ИБ, ИБОК-ГФБ, ИБ и ГФБ производных, и оценены пределы детектирования в режиме регистрации полного ионного тока (по масс-хроматограмме) и селективного ионного детектирования, которые составили 2.0x10'12- 3.4x10'9г и 1.0x10'12- 1.4x10"9г в пробе, соответственно (в зависимости от соединения и способа ионизации); впервые представлены Macc-cneicipbi электронной ионизации ИБОК-ИБ и ИБОК-ГФБ производных аминокислот, а также ГФБ эфиров жирных и дикарбоновых кислот.

4. Предложена методология определения следовых содержаний жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смеси, основанная на обработке одной части образца смесыо БСТФА с пиридином (после высушивания), а другой - смесыо ИБХФ с гептафторбутаполом в водио-органическом растворе.

5. При использовании разработанной методологии определен состав жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, выделенных экстракцией ннрндпном н водой нз лнофнлизнропанной культуры Е. Coli, и проведена оценка их содержания.

6. В экспериментально выбранных условиях определен состав жирных, дикарбоновых и аминокислот в культурах клеток адепокарциномы прямой кишки человека и фибробластов, и показана возможность увеличения достоверности дифференциации этих клеток, основанной на установленном различии в составе аминокислот.

7. Предложен способ определения аминокислот в водных растворах, основанный па получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбцнопном концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата, позволяющий снизить пределы обнаружения по меньшей мере на 2 порядка.

Заключение

В результате проведенного исследования изучены условия получения летучих производных широкого круга соединений, принадлежащих к классам жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, стеролов и спиртов (всего 60 веществ) с использованием таких реагентов как гексаметилднсилазаи, //,0-бис(триметилсилнл)трифторацетамид, //-метнл-//-третбутилднметиленлилтрифторацетамид и изобутилхлорформиат (в сочетании с изобутанолом и гептафторбутанолом). Показаны достоинства и недостатки каждого реагента, области их применения в газохроматографическом анализе, и приведены рекомендации по выбору того или иного реагента в зависимости от поставленной задачи.

В работе получены масс-спектры различных летучих производных изученных соединений в режиме электронной и химической ионизации, причем для многих производных масс-спсктры были зарегистрированы и описаны впервые. Очевидно, что без знания характеристичных ионов и их интенсив-постей невозможна достоверная идентификация, а также высокочувствительное и высокоселектпвное определение того или иного соединения. Оценка пределов детектирования для производных соединений указанных классов была проведена в режиме регистрации полного ионного тока (но масс-хроматограмме) и селективного ионного детектирования. Показано, что пределы детектирования для изученных классов соединений составляют

19 q примерно от 1.0x10" до 1.0x10" г в зависимости от вещества, способа ионизации н детектирования. Эта информация является полезной при выборе реагента для дериватизации и способа ионизации, поскольку от этого во многом зависит чувствительность и селективность определения.

На основании проведенных исследований предложена комплексная методология анализа жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смеси иа уровне следов. Она подразумевает обработку одной части образца смесью пиридина и БСТФА (после высушивания), а другой — смесыо ИБХФ с гептафторбутанолом в водно-органическом растворе с последующим ГХ-МС анализом соответствующих продуктов дериватизации. При этом в нервом случае в виде ТМС производных определяются все классы соединений, кроме аминокислот, а во втором - аминокислоты, жирные, дикарбоновые и короткоцениые гидрокси- и оксокислоты.

При использовании предложенной методологии был определен состав жирных, дикарбоиовых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров в лиофилизированпой культуре Escherichia Coli. Кроме этого, был изучен состав жирных, дикарбоиовых и аминокислот в клетках аденокарципомы прямой кишки человека и фибробластах. Показано, что физиологически активные клетки аденокарципомы существенно отличаются по аминокислотному составу от здоровых клеток. Это открывает перспективы более достоверного дифференцирования раковых и здоровых клеток в дополнение к существующим традиционным гистологическим методам исследования и определению высокомолекулярных веществ-признаков онкологических заболеваний.

Разработан способ определения аминокислот в водных растворах, основанный па получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбцноппом концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата. Этот способ позволяет снизить концентрационные пределы обнаружения соответствующих производных аминокислот (а также - потенциально - алкиловых эфиров жирных и дикарбоиовых кислот) по меньшей мере на 2 порядка. Кроме этого, было показано, что ввод пробы без растворителя существенно снижает фон от неподвижной фазы капиллярной колонки и обеспечивает в ряде случаев получение более узких и симметричных пиков.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Соболевский, Тимофей Геннадьевич, 2004 год

1. Т.М. Larson, М. Gawlitzek, II. Evans, U. Albcrs, J. Cacia. Chemometric Evaluation of On-Line High-Pressure Liquid Chromatography in Mammalian Cell Cultures: Analysis of Amino Acids and Glucose // Biotechnol. Bioeng. 2002. 77. 5. P. 553-563.

2. K. Blau, G. King. Handbook of Derivatives for Chromatography / Heyden: London, 1978.

3. R.W. Zumwalt, D. Roach, C.W. Gchrke. Gas-Liquid Chromatography of Amino Acids In Biological Substances//J. Chromatogr. 1970. 53. P. 171-193.

4. R.W. Zumwalt, K. Kuo, C.W. Gehrke. A Nanogram and Picogram Method for Amino Acid Analysis by Gas-Liquid Chromatography // J. Chromatogr. 1971. 57. P. 193-208.

5. C. Deng, C. Shang, Y. Ни, X. Zhang. Rapid Diagnosis of Phenylketonuria and Other Aminoacidemias by Quantitative Analysis of Amino Acids in Neonatal Blood Spots by Gas Chromatography Mass Spectrometry // J. Chromatogr. B. 2002. 775. P. 115-120.

6. P. Dallakian, II. Budzikievvicz. Gas Chromatography Chemical Ionization Mass Spectrometry in Amino Acid Analysis of Pyoverdins // J. Chromatogr. A. 1997. 787. P. 195-203.

7. C.W. Gehrke, II. Nakamoto, R.W. Zumwalt. Gas-Liquid Chromatography of Protein Amino Acid Trimethylsilyl Derivatives // J. Chromatogr. 1969. 45. P. 24-51.

8. C.W. Gehrke, K. Leimer. Trimethylsilylation of Amino Acids. Derivatization and Chromatography //J. Chromatogr. 1971. 57. P. 219-238.

9. C.W. Gehrkc, К. Lcimcr. Trimcthylsilylation of Amino Acids. Effect of Solvents on Derivatization Using Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide // J. Chromatogr. 1970. 53. P. 201-208.

10. I. Matsumoto, T. Kuhara. A New Chemical Diagnostic Method for Inborn Errors of Metabolism by Mass Spectrometry Rapid, Practical, and Simultaneous Urinary Metabolites Analysis // Mass. Spectrom. Rev. 1996. 15. P. 43-57.

11. S.L. MacKenzic, D. Tenaschuk, G. Fortier. Analysis of Amino Acids by Gas-Liquid Chromatography as /er/.-Butyldimcthylsilyl Derivatives. Preparation of Derivatives in a Single Reaction//J. Chromatogr. 1987. 387. P. 241-253.

12. I. Starke, E. Kleinpeter, B. Kamm. Separation, Identification, and Quantification of Amino Acids in L-Lysine Fermentation Potato Juices by Gas Chromatography Mass Spectrometry // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. 371. P. 380-384.

13. P. Simek, A. Hcydova, A. Jegorov. High Resolution Capillary Gas Chromatography Mass Spectrometry of Protein and Non-Protein Amino Acids, Amino Alcohols, and Hydroxycarboxylic Acids as their tert.

14. Butyldimethylsilyl Derivatives//J. High Resolut. Chromatogr. 1994. 17. P. 145152.

15. Zs.F. Katona, P. Sass, I. Molnar-Perl. Simultaneous Determination of Sugars, Acids and Amino Acids in Apricots by Gas Chromatography Mass Spectrometry//:. Chromatogr. A. 1999. 847. P. 91-102.

16. P. Ilusck. Simultaneous Profile Analysis of Plasma Amino and Organic Acids by Capillary Gas Chromatography //J. Chromatogr. B. 1995. 669. P. 352-357.

17. P. Ilusck. Chloroformates in Gas Chromatography as General Purpose Derivatizing Agents//J. Chromatogr. B. 1998. 717. P. 57-91.

18. P. Ilusck, P. Matucha, A. Vrankova, P. Simek. Simple Plasma Work-up for a Fast Chromatographic Analysis of Homocysteine, Cysteine, Methionine and Aromatic Amino Acids // J. Chromatogr. B. 2003. 789. P. 311-322.

19. P. Musek. Rapid Derivatization and Gas Chromatographic Determination of Amino Acids//J. Chromatogr. 1991. 552. P. 289-299.

20. S. Matsumura, II. Kataoka, M. Makita. Determination of Amino Acids in Human Scrum by Capillary Gas Chromatography // J. Chromatogr. B. 1996. 681. P. 375-380.

21. II. Kataoka, S. Matsumura, II. Koizumi, M. Makita. Rapid and Simultaneous Analysis of Protein and Non-Protein Amino Acids as N(0,S)-Isobutoxycarbonyl Methyl Ester Derivatives by Capillary Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1997. 758. P. 167-173.

22. A.P. Vonderheide, M. Montcs-Bayon, J.A. Caruso. Solid-Phase Microextraction as a Sample Preparation Strategy for the Analysis of Seleno Amino Acids by Gas Chromatography Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry // Analyst. 2002. 127. P. 49-53.

23. S. Casal, M.B. Olivcira, М.Л. Fcrreira. Gas Chromatographic Quantification of Amino Acid Enantiomcrs in Food Matrices by their A^O.Sj-Ethoxycarbonyl Ileptafluorobutyl Ester Derivatives // J. Chromatogr. A. 2000. 866. P. 221-230.

24. I. Abe, N. Fujimoto, T. Nishiyama, K. Terada, T. Nakahara. Rapid Analysis of Amino Acid Enantiomers by Chiral-Phase Capillary Gas Chromatography 11 J. Chromatogr. A. 1996. 722. P. 221-227.

25. P. Cao, M. Moini. Quantitative Analysis of Fluorinatcd Ethylchloroformate Derivatives of Non-Protein Amino Acids Using Positive and Negative Chemical Ionization Gas Chromatography Mass Spectrometry // J. Chromatogr. A. 1995. 710. P. 303-308.

26. A. Namcra, M. Yashiki, M. Nishida, T. Kojima. Direct Extract Derivatization for Determination of Amino Acids in Human Urine by Gas Chromatography and Mass Spectrometry // J. Chromatogr. B. 2002. 776. P. 49-55.

27. K.-R. Kim, J.-H. Kim, C.-H. Oh, T.J. Mabry. Capillary Gas Chromatography of Protein Amino Acids as N(0,S)-isobutoxycarbonyl tert.-Butyldimethylsilyl Derivatives in Aqueous Samples // J. Chromatogr. 1992. 605. P. 241-249.

28. K.-R. Kim, J.-II. Kim, E. Cheong, C. Jcong. Gas Chromatographic Amino Acid Profiling of Wine Samples for Pattern Recognition // J. Chromatogr. A. 1996. 722. P. 303-309.

29. C. Rodicr, R. Sternberg, F. Raulin, C. Vidal-Madjar. Chemical Derivatization of Amino Acids for In Situ Analysis of Martian Samples by Gas Chromatography //J. Chromatogr. A. 2001. 915. P. 199-207.

30. M.W. Duncan, A. Poljak. Amino Acid Analysis of Peptides and Proteins on the Femtomole Scale by Gas Chromatography Mass Spectrometry // Anal. Chem. 1998. 70. 5. P. 890-896.

31. M. Murase, Y. Kimura, Y. Nagata. Determination of Portal Short-Chain Fatty Acids in Rats Fed Various Dietary Fibers by Capillary Gas Chromatography // J. Chromatogr. B. 1995. 664. P. 415-420.

32. G. Manni, F. Caron. Calibration and Determination of Volatile Fatty Acids in Waste Leachatcs by Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1995. 690. P. 237-242.

33. L.K. Ng. Analysis by Gas Chromatography Mass Spectrometry of Fatty Acids and Esters in Alcoholic Beverages and Tobaccos // Anal. Chim. Acta. 2002. 465. P. 309-318.

34. T. Seppancn-Laakso, I. Laakso, R. Hiltunen. Analysis of Fatty Acids by Gas Chromatography, and its Relevance to Research on Health and Nutrition // Anal. Chim. Acta. 2002. 465. P. 39-62.

35. P. Husek, P. Simck, E. Tvrzicka. Simple and Rapid Procedure for the Determination of Individual Free Fatty Acids in Serum // Anal. Chim. Acta. 2002. 465. P. 433-439.

36. II.-J. dc Geus, I. Aidos, J. dc Boer, J.B. Luten, U.A.Th. Brinkman. Characterization of Fatty Acids in Biological Oil Samples Using Comprehensive

37. Multidimensional Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 2001. 910. P. 95103.

38. D.-S. Lee, B.-S. Noh, S.-Y. Bae, K. Kim. Characterization of Fatty Acids Composition in Vegetable Oils by Gas Chromatography and Chemometrics // Anal. Chim. Acta. 1998. 358. P. 163-175.

39. D.M. Hasselbaink, T.II.M. Roemen, G.J. Van der Vusse. Determination of Long-Chain Fatty Acids in Heart and Skeletal Muscle by Capillary Gas Chromatography // Anal. Chim. Acta. 2002. 465. P. 351-357.

40. E. Tvrzicka, M. Vccka, B. Stankova, A. Zak. Analysis of Fatty Acids in Plasma Lipoproteins by Gas Chromatography Mass Spectrometry. Quantitative Aspects // Anal. Chim. Acta. 2002. 465. P. 337-350.

41. T. Rezanka, I I. Rezankova. Characterization of Fatty Acids and Triacylglycerols in Vegetable Oils by Gas Chromatography and Statistical Analysis // Anal. Chim. Acta. 1999. 398. P. 253-261.

42. J.L. Guil, M.E. Torija, J.J. Gimenez, I. Rodriguez. Identification of Fatty Acids in Edible Wild Plants by Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1996. 719. P. 229-235.

43. I. Brondz, I. Olsen. Determination of Bound Cellular Fatty Acids in Actinobacillus Actinomycetemcomitans and Haemophilus Aphrophilus by Gas Chromatography and Gas Chromatography Mass Spectrometry // J. Chromatogr. 1984. 308. P. 282-288.

44. О. Daglioglu, М. Tasan, В. Tunccl. Determination of Fatty Acid Composition and Total Trans Fatty Acids of Turkish Biscuits by Capillary Gas-Liquid Chromatography// Eur. Food Res. Technol. 2000. 211. P. 41-44.

45. I. Brondz, II. Nordbo, А.Л. Schcic. Detection of Microbial-Derived Fatty Acids in Carious Dentin by Gas Chromatography and Gas Chromatography Mass Spectrometry//J. Chromatogr. B. 1997. 700. P. 255-260.

46. A.G. Casado, E.J.A. Hernandez, P. Espinosa, J.L. Vilchcz. Determination of Total Fatty Acids (Cg С2г) in Sludges by Gas Chromatography - Mass Spectrometry//J. Chromatogr. A. 1998. 826. P. 49-56.

47. A.L. Henderson, W.-W. Cao, R.-F. Wang, M.-II. Lu, C.E. Cemiglia. The Effect of Food Restriction on the Composition of Intestinal Microflora in Rats // Exp. Gerontol. 1998. 33. 3. P. 239-247.

48. J. Vclasco, O. Berdeaux, G. Marquez-Ruiz, M.C. Dobarganes. Sensitive and Accurate Quantitation of Monocpoxy Fatty Acids in Thermoxidized Oils by Gas-Liquid Chromatography//J. Chromatogr. A. 2002. 982. P. 145-152.

49. H.G. Wahl, A. Chrzanowski, C. Muller, H.M. Liebich, A. Hoffmann. Identification of Furan Fatty Acids in Human Blood Cells and Plasma by Multidimensional Gas Chromatography Mass Spectrometry // J. Chromatogr. A. 1995. 697. P. 453-459.

50. M.-J. Paik, K.-O. Lee, II.-S. Shin. Determination of Very-Long-Chain Fatty Acids in Serum by Gas Chromatography Nitrogen-Phosphorous Detection Following Cyanomethylation //J. Chromatogr. B. 1999. 721. P. 3-11.

51. J. Giacometti, С. Milin, N. Wolf. Monitoring the Estcrification of Sorbitol and Fatty Acids by Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1995. 704. P. 535-539.

52. T.P. McGinnis. Quantitative Determination of Fatty and Resin Acids in Kraft: Black Liquors as their Trimcthylsilyl Derivatives by Gas Chromatography // J. Chromatogr. A. 1998. 829. P. 235-249.

53. Y. Ghoos, B. Geypcns, M. Hide, P. Rutgeerts, G. Vantrappen. Analysis for Short-Chain Carboxylic Acids in Feces by Gas Chromatography with an Ion-Trap Detector//Anal. Chim. Acta. 1991. 247. P. 223-227.

54. Y.J. Yang, M.H. Choi, M.-J. Paik, II.-R. Yoon, B.C. Chung. Gas Chromatographic Mass Spcctromctric Determination of Plasma Saturated Fatty Acids Using Pentafluorophenyldimcthylsilyl Derivatization // J. Chromatogr. B. 2000. 742. P. 37-76.

55. K.S. Docherty, P.J. Ziemann. On-Line, Inlet-Based Trimethylsilyl Derivatization for Gas Chromatography of Mono- and Dicarboxylic Acids // J. Chromatogr. A. 2001. 921. P. 265-275.

56. J. Giacometti. Determination of Aliphatic Alcohols, Squalene, a-Tocopherol and Sterols in Olive Oils: Direct Method Involving Gas Chromatography of the Unsaponifiable Fraction Following Silylation//Analyst. 2001. 126. P. 472-475.

57. D.L. Chance, K.O. Gerhardt, T.P. Mawhinney. Gas-Liquid Chromatography -Mass Spectrometry of Primary and Secondary Fatty Alcohols and Diols as their tert. -Butyldimethylsilyl Derivatives//J. Chromatogr. A. 1997. 771. P. 191-201.

58. К. Komarck, V. Pitthard, E. Kostrubani£ova, S. Skvarcnina, J. Hoffmann. Capillary Gas Chromatography Mass Spectrometry of Lower Oxycthylenated Aliphatic Alcohols//J. Chromatogr. A. 1997. 773. P. 219-226.

59. B.M. Matthew, C. Anastasio. Determination of Halogenatcd Mono-Alcohols and Diols in Water by Gas Chromatography with Electron Capture Detection // J. Chromatogr. A. 2000. 866. P. 65-77.

60. M. Morvai, I. Molnar-Perl. Simultaneous Determination of Organic Acids and Sugars in Apples by Gas-Liquid Chromatography // J. Chromatogr. 1990. 520. P. 201-207.

61. M. Morvai, I. Molnar-Perl, D. Knausz. Simultaneous Gas-Liquid Chromatographic Determination of Sugars and Organic Acids as Trimethylsilyl Derivatives in Vegetables and Strawberries // J. Chromatogr. 1991. 552. P. 337344.

62. M. Morvai, I. Molnar-Perl. Simultaneous Gas Chromatographic Quantitation of Sugars and Acids in Citrus Fruits, Pears, Bananas, Grapes, Apples and Tomatoes //Chromatographia. 1992. 34. 9/10. P. 502-504.

63. I. Boldizsar, K. Horvath, Gy. Szcdlay, I. Molnar-Perl. Simultaneous GS-MS Quantitation of Acids and Sugars in the Hydrolyzates of Immunostimulant, Watcr-Soluble Polysaccharides of Basidiomycetes // Chromatographia. 1998. 47. 7/8. P. 413-419.

64. I. Molnar-Perl. Role of Chromatography in the Analysis of Sugars, Carboxylic Acids and Amino Acids in Food // J. Chromatogr. A. 2000. 891. P. 1-32.

65. F. Bartolozzi, G. Bertazza, D. Bassi, G. Cristoferi. Simultaneous Determination of Soluble Sugars and Organic Acids as their Trimcthylsilyl Derivatives in Apricot Fruits by Gas-Liquid Chromatography // J. Chromatogr. A. 1997. 758. P. 99-107.

66. M.A. Adams, Z.-L. Chen, P. Landman, T.D. Colmer. Simultaneous Determination by Capillary Gas Chromatography of Organic Acids, Sugars and Sugar Alcohols in Plant Tissue Extracts as their Trimcthylsilyl Derivatives // Anal. Biochcm. 1999. 266. P. 77-84.

67. K.-R. Kim, J.-II. Kim, D.-II. Jeong, D.-J. Раек, H.M. Liebich. Gas Chromatographic Profiling Analysis of Urinary Organic Acids from Nonsmokers and Smokers //J. Chromatogr. B. 1997. 701. P. 1-8.

68. G.E. Black, A. Fox. Recent Progress in the Analysis of Sugar Monomers from Complex Matrices Using Chromatography in Conjunction with Mass Spectrometry or Stand-Alone Tandem Mass Spectrometry // J. Chromatogr. A. 1996. 720. P. 51-60.

69. J. Blcton, P. Mejanclle, J. Sansoulet, S. Goursaud, A. Tchapla. Characterization of Neutral Sugars and Uronic Acids after Methanolysis and Trimethylsilylation fro Recognition of Plant Gums //J. Chromatogr. A. 1996. 720. P. 27-49.

70. M. Tetsuo, C. Zhang, H. Matsumoto, I. Matsumoto. Gas Chromatographic -Mass Spectrometric Analysis of Urinary Sugar and Sugar Alcohols During Pregnancy//J. Chromatogr. B. 1999. 731. P. 111-120.

71. W. Amelung, M.V. Cheshire, G. Guggenberger. Determination of Neutral and Acidic Sugars in Soil by Capillary Gas-Liquid Chromatography after Trifluoroacctic Acid Hydrolysis // Soil Biol. Biochem. 1996. 28. 12. P. 16311639.

72. M.-C. Larrc-Larrouy, C. Feller. Determination of Carbohydrates in Two Fcrralitic Soils: Analysis by Capillary Gas Chromatography after Dcrivatization by Silylation// Soil Biol. Biochem. 1997. 29.9/10. P. 1585-1589.

73. H.J. Chaves das Neves, A.M.V. Riscado, H. Frank. Single Derivatives for GC-MS Assay of Reducing Sugars and Selective Detection by the Nitrogen-Phosphorous Detector (NPD) // J. High. Rcsolut. Chromatogr. & Chromatogr. Commun. 1986. 9. P. 662-666.

74. D.L. Chance, K.O. Gcrhardt, T.P. Mavvhinney. Gas-Liquid Chromatography -Mass Spectrometry of Hydroxy Fatty Acids as their Methyl Esters tert.-Butyldimcthylsilyl Ethers//J. Chromatogr. A. 1998. 793. P. 91-98.

75. P. Husek, P. Matucha. Simple Approach for Analysis of Plasma Oxo-, Hydroxy-and Dicarboxylic Acids//J. Chromatogr. B. 1997. 693. P. 499-502.

76. NIST/EPA/NIII Mass Spectral Library. 1998. Gaithersburg, MD, USA.

77. F.W. McLafferty. Interpretation of Mass Spectra / University Science Books: California, 1980.