Организация нейронных ансамблей: гломерулярные модули обонятельной луковицы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, доктор биологических наук Карнуп, Сергей Викторович

• Карнуп, Сергей Викторович
• доктор биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации доктор биологических наук Карнуп, Сергей Викторович

Страница

ВВЕДЕНИЕ и ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10 Кодирование запахов а) Гипотеза пространственного кодирования запахов в) Временной аспект кодирования запахов

Морфология обонятельной луковицы

Морфология нейронов MOB

Физиология нейронов MOB

Межнейронные взаимодействия

Неоднородность структуры клубочка

Межгломерулярные связи

Нейрогенез в MOB

Популяционная активность в MOB

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Приготовление срезов

Электрофизиология

Фармакологические агенты

Гистология

Инъекции трейсеров

Оптическая регистрация

Анализ данных

Компьютерное моделирование

РЕЗУЛЬТАТЫ

1) Физиологические и морфологические характеристики нейронов в гломерулярном слое

Внешние пучковые клетки

Коротко-аксонные клетки

Волосатые перигломерулярные клетки

Классические перигломерулярные клетки

Характерные физиологические параметры JG нейронов

Классификационные критерии

2) ЕТ клетки генерируют пачки спайков

Морфология пачкующихся ЕТ нейронов

ЕТ клетки пачкуются ритмически

Частота и регулярность пачкования

Пачкование - это внутреннее свойство ЕТ клеток

Токи, лежащие в основе спонтанной импульсной активности

Ритмический сигнал из обонятельного нерва модулирует пачкование ЕТ клеток

3) ЕТ клетки являются интрагломерулярными синхронизаторами

Спонтанные ЕРБР/ЕРБС в 10 клетках

Синаптический вход обонятельного нерва к 10 клеткам

ЕТ клетки обеспечивают внутригломерулярный глутаматэргический возбудительный вход к РО и Б А клеткам

ЕТ клетки одного и того же клубочка имеют скоррелированнуюактивность

4) БА клетки обеспечивают межгломерулярные связи

Обширные межгломерулярные связи

Межгломерулярные связи формируются Б А клетками

Межгломерулярные связи являются возбудительными

Контрастирующее торможение между клубочками

5) Спонтанные гломерулярные полевые потенциалы генерируются преимущественно 10 клетками

Гломерулярные полевые потенциалы

Морфометрия связанных с клубочком элементов

Моделирование бОРР бОРР является результатом возвратного возбуждения

Соотношение бОРР и ЫЛЭ

Межгломерулярные взаимодействия

ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологические типы JG нейронов

Электрофизиологические характеристики JG клеток

Функциональное значение свойств JG нейронов

Пачки спайков генерируются ЕТ клетками

ЕТ клетки пачкуются ритмически

Механизм спонтанной генерации пачек

Функциональное значение пачкования

Синхронизация ET нейронов

Джакстагломерулярные нейроны и гломерулярная нейрональная сеть

ET клетки являются основными возбудительными элементами в гломерулярной сети

ET клетки координируют гломерулярную активность

Синхронизация в клубочке и кодирование обонятельной информации

SA клетки и латеральное торможение

Споптанные гломерулярные полевые потенциалы

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Организация нейронных ансамблей: гломерулярные модули обонятельной луковицы»

Главная обонятельная луковица (main olfactory bulb, MOB) является первой структурой мозга, которая получает обонятельную информацию от рецепторных клеток носового эпителия и участвует в первой стадии обработки информации. Она расположена впереди мозга непосредственно за перфорирующей костью, отделяющей мозг от носовых полостей (Рис.0 А,В). MOB имеет слоистую структуру, где каждый слой включает в себя определенные типы клеток и, очевидно, играет специфическую роль в анализе информации. Самым первым слоем MOB, где заканчиваются все аксоны обонятельного нерва (olfactory nerve, ON), является гломерулярный слой (glomerular layer, GL), состоящий из сферических структур ~ 100|im в диаметре, называющихся клубочками (glomeruli).

Аксоны обонятельного нерва, исходящие из обонятельных рецепторных нейронов и экспрессирующие один и тот же запаховый рецептор, конвергируют в один или несколько клубочков в каждой обонятельной луковице. Внутри клубочка волокна ON синаптически заканчиваются на апикальных дендритах митральных/пучковых (М/Т) клеток и локальных джакстагломерулярных (juxtaglomerular, JG) нейронов (Xu et al., 2000). Таким образом, индивидуальный клубочек (glomerulus) представляет собой пространственную координату запаха, благодаря иннервации однородной когортой ольфакторных рецепторных нейронов, экспрессирующих один и тот же рецептор. Индивидуальные запахи возбуждают специфические пространственные паттерны гломерулярной активности и различные запахи активируют различные паттерны клубочков (Jourdan et al., 1980; Cinelli et al., 1995; Johnson and Leon, 2000a,b; Belluscio and Katz, 2001). Соответственно, каждый клубочек является функциональной единицей для переработки сенсорного входа. Более того, он объединяет различные типы нейронов в функциональный модуль с отчетливо разделенными входными и выходными отделами: все входные элементы (дендритные пучки) сконцентрированы внутри гломерулярного нейропиля, а клеточные тела локализованы либо на периферии клубочка, либо в других слоях обонятельной луковицы. MOB включает в себя пять основных слоев (от поверхности к более глубоким слоям): слой обонятельного нерва (olfactory nerve layer, ONL), гломерулярный или клубочковый слой (glomerular layer, GL), внешний плексиформный слой (external plexiform layer, EPL), слой митральных клеток (mitral cell layer, MCL) и слой гранулярных клеток (granule cell layer, GCL) (Рис. 0 С). Единственным слоем, где обонятельный нерв (ON) образует синаптические контакты, является клубочковый слой (ОЬ). Тела локальных интернейронов СЬ, так называемые джакстагломерулярные клетки (ГС), окружают клубочек и направляют свои дендриты внутрь сердцевины клубочка, что указывает на их непосредственное участие в самой первой стадии обработки обонятельной информации.

Рис.0 Главная обонятельная луковица (main olfactory bulb, MOB) мозга крысы: (А) -вид сбоку с медиальной стороны, (В) - вил сверху. Стрелки указывают на MOB. (С) -стандартный горизонтальный срез MOB крысы. ONL - слой обонятельного нерва (olfactory nerve layer; GL - клубочковый (= гломерулярный) слой (glomerular layer); ЕРГ - внешний плексиформный слой (external plexiform layer); MCI, - слой митральных клеток (mitral cell layer); GCL - слой гранулярных клеток (granule cell layer); LOT - латеральный обонятельный тракт (lateral olfactory tract); CFF - центрифугальные волокна (centrifugal fibers); параллельные проволочки - биполярный стимулирующий электрод; острые треугольники обозначают регистрирующие электроды; кружочки - обозначают клубочки.

До недавних пор JG клетки характеризовались в основном морфологически, в то время как данные об их физиологии очень немногочисленны и противоречивы.

Таким образом, нашей первой целью было получение ясного представления о соответствии морфологических ифизиологических характеристик JG клеток для лучшего понимания их функциональной роли. Клубочки являются начальным этапом синаптической интеграции в обонятельном тракте. Эта интеграция внутри клубочков включает в себя мультинейрональные цепи, где нейронные взаимодействия происходят исключительно через дендро-дендритные синаптические контакты и, возможно, щелевые контакты. Классические Гольджи и электронно-микроскопические исследования (Pinching and Powell, 1971а,b) описывают по-крайней мере три популяции JG нейронов: (1) внешние пучковые клетки (external tufted cells, ET), (2) перигломерулярные (periglomerular, PG), и (3) короткоаксонные (short axon, SA) клетки, тем не менее, очень мало известно о физиологических характеристиках JG клеток и об их синаптических партнерах. В MOB крысы каждый клубочек in vivo не включает в себя тела нейронов, но состоит исключительно из пучков апикальных дендритов 13-25 митральных (mitral, М) клеток, примерно 25 - 50 средних и глубоких пучковых (medium and deep tufted, T) клеток и дендритов 1500-2000 JG клеток (Allison, 1953; Frazier and Brunjes, 1988; Meisami and Safari, 1981; Royet et al., 1988; Royet et al., 1998; Shipley et al., 1996); у мыши каждый клубочек включает в себя 35-40 М/Т клеток (Zou et al., 2001). Несмотря на большое число и стратегическую локализацию JG клеток, представления об их функциональных ролях в обработке обонятельной информации пока очень слабы. Из-за трудности физиологических исследований на JG клетках они рассматривались до сих пор как гомогенный пул модуляторных тормозных элементов, предотвращающих перевозбуждение выходных нейронов (М/Т клеток) сильным входным сигналом, поступающим от обонятельного эпителия. Однако, наши недавние исследования указывают на то, что JG клетки могут выполнять более сложные функции в обработке обонятельной информации.

Предполагается, что обонятельная информация кодируется, по-крайней мере частично, специфическими паттернами импульсации (например, пачкованием) или колебаниями возбуждения в нейрональных ансамблях (Wehr and Laurent, 1996; Kauer, 1998; Kay and Laurent, 1999; Laurent, 2002). Предыдущие внутриклеточные записи in vivo указывают на то, что ON и запаховая стимуляция приводят к возникновению пачек потенциалов действия в некоторых JG клетках (Getchell and Shepherd, 1975; Wellis and Scott, 1990). Более того, записи в режиме «whole-cell» in vitro указывают на то, что некоторые JG клетки генерируют пачки спайков в ответ на деполяризующие инъекции токов (McQuiston and Katz, 2001), но не было показано, генерирует ли какой либо подтип JG нейронов спонтанные пачки (т.е., без стимуляции или инъекции тока). В наших экспериментах мы охарактеризовали все типа JG клеток (ET, PG и SA) физиологически, сравнили спонтанную и вызванную активность и установили соответствие между их физиологическими свойствами и морфологией. Оказалось, что только ЕТ клетки были способны к спонтанной генерации ритмических пачек потенциалов действия (Hayar et al., 2002а).

Таким образом, второй целью нашей работы было получение физиологических характеристик морфологически идентифицированных ЕТ клеток в срезах обонятельной луковицы крысы, а также выяснение того, могут ли эти клетки генерировать спонтанные пачки спайков, и исследовать механизм спонтанной генерации пачек. Электронно-микроскопические исследования показали, что окончания ON формируют возбудительные синапсы на митральных и пучковых клетках, а так же на неизвестной популяции PG клеток (Kosaka et al., 1998); до сих пор неизвестно, получают ли SA клетки синаптический вход из ON. ЕМ исследования также указывают на то, что между PG и, предположительно, митральными и пучковыми клетками, имеются обильные внутригломерулярные дендро-дендритные синапсы, но до настоящего времени остается невозможным различить депдриты митральных и пучковых клеток на уровне ЕМ. Таким образом, неизвестно, получают ли ЕТ клетки синаптический вход из ON и контактируют ли синаптически ЕТ клетки с PG и SA клетками.

В связи с этим третьей целью наших экспериментов было определить, получают ли ЕТ клетки моносинаптический вход из ON и являются ли ЕТ клетки пресинаптическими по отношению к другим JG нейронам. Помимо этого, были исследованы взаимосвязи среди нейронов и преобразования сенсорного входа в GL. Единичные и парные регистрации в режиме «whole-cell patch-clamp», а также внеклеточные записи в срезах обонятельной коры крысы показали следущее. (1) Спонтанная активность PG и SA клеток характеризуется перемежающимися пачками EPSCs. (2) ЕТ клетки получают моносинаптический вход из ON; большинство SA и PG клеток отвечают дисинаптически или полисинаптически на ON стимуляцию. (3) ЕТ клетки обеспечивают возбудительный моносинаптический вход на PG и SA клетки и, кроме того, часть ЕТ клеток пачкуется с высокой корреляцией. На основании этих данных мы делаем заключение, что ЕТ клетки обеспечивают основную возбуждающую связь входа из ON на PG и SA клетки. Эти результаты позволяют предположить, что скоррелированпое пачковапие ЕТ клеток в одном и том же клубочке может усиливать сенсорный вход и координировать гломерулярный выход.

Четвертой целью нашего исследования было определение анатомических основ и функционального значения межклубочковых связей, которые были обнаружены в наших экспериментах. Поскольку каждый клубочек иннервируется обонятельными рецепторными иейронами (ORN), экспрессирующими один и тот же обонятельный рецептор (Ressler et al., 1993; Mombaerts et al., 1996; Vassar et al., 1994; Potter et al., 2001; Treloar et al., 2002), различные запахи возбуждают уникальный паттерн мультигломерулярной активации (Greer et al., 1981; Halasz & Greer, 1993; Jastreboff et al., 1984; Johnson & Leon, 2000; Rubin & Katz, 1999; Xu et al., 2000; Yang et al., 1998; Rubin & Katz, 2001). Поэтому, восприятие запаха требует наличия информации о пространственно-временных паттернах гломерулярной активности. Современные гипотезы о функции MOB предполагают, что латеральные взаимодействия между митральными/пучковыми выходными клетками, опосредованные тормозными гранулярными клетками, являются определяющими в обработке пространственно-временных паттернов гломерулярной активности (Mori et al., 1999; Yokoi et al., 1995). Сильно активированные митральные/пучковые клетки тормозят слабо активированные М клетки через дендро-дендритные синапсы с гранулярными клетками и создают эффект латерального торможения, причем все эти синапсы находятся в EPL вне гломерулярного слоя. Предполагается, что это усиливает дискриминацию запаха на уровне выхода MOB. Латеральные взаимодействия могут также возникать на уровне входа обонятельного нерва посредством связи между клубочками (Pinching & Powell, 1972). Хотя межгломерулярные связи были предположены на основании классических Гольджи и ЕМ исследований (Pinching & Powell, 1971а, 1971b), величина и пространственное распространение этих связей неизвестны, а физиологические доказательства межгломерулярных взаимодействий отсутствуют. Нам удалось установить наличие специализированной нейрональной сети обеспечивающей межклубочковые связи.

Пятой целью работы являлось получение интегральных характеристик гломерулярной активности и обнаружение возможной корреляции с активностью единичных клеток. Электрофизиологические записи популяционных событий в нервной ткани являются индикаторами синхронизованной активности многих нейронов, обычно организованных в нейрональные ансамбли или модули. Модульная организация усиливает надежность передачи информации и является обычным типом организации нейронов в подкорковых (ядра) структурах. Клубочек обычно рассматривается как нейрональный модуль. Однако, считается, что полевые потенциалы, регистрируемые в GL, являются результатом активности больших дипольных клеток с телами, расположенными вне GL (Aroniadou-Anderjaska et al, 1997, 1999). Таким образом, общепринятой точкой зрения является то, что сток тока в GL генерируется исключительно синхронной деполяризацией пучков М и Т клеток, в то время как вклад JG клеток является незначительным, поскольку последние не имеют больших допольных моментов и не ориентированы параллельно друг другу (Mori, 1987; Shipley et al., 1996). Следовательно, считается маловероятным, что синаптические токи JG нейронов создают существенный вклад в полевые потенциалы (Rail & Shepherd,

1968). Несмотря на этот теоретический взгляд, до сих пор неясно, является ли периодическое синхронное возбуждение М/Т пучков единственным механизмом, создающим волны полевых потенциалов в MOB. В нашем исследовании мы показываем, что в нормальных условиях in vitro в отсутствие афферентного входного сигнала (т.е. без стимуляции ON в срезе MOB) можно регистрировать спонтанные полевые потенциалы, генерируемые внутри гломерулярного слоя. Более того, спонтанные полевые потенциалы сравнимой амплитуды и длительности регистрируются и в изолированном GL. Эти данные указывают на то, что М/Т клетки не являются единственными генераторами полевых потенциалов, регистрируемых в GL. Вместо этого, мы предполагаем, что существенную часть этих полевых потенциалов генерируют ансамбли джакстагломерулярных клеток. Эта гипотеза была подтверждена с помощью компьютерного моделирования. Мы построили электростатическую модель, основанную на анатомии обонятельной луковицы и на предположении о том, что внеклеточный полевой потенциал в GL возникает при суммации одновременных деполяризаций большинства дендритов внутри нейропиля клубочка. Модель состоит из набора нейронов, каждый из которых воспроизводит электростатическое поле, генерируемое одним из клеточных типов. Модель подтвердила преобладающий вклад JG клеток в общее поле клубочка, по сравнению с M и Т клетками.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обонятельная луковица (main olfactory bulb, MOB) является первым этапом обработки обонятельной информации в мозгу млекопитающих (Shepherd and Greer, 1990). Она является выростом переднего мозга, который специализируется на первичном кодировании информации о тех молекулярных сигналах, которые позволяют чувствовать запахи. В настоящее время предполагается, что она функционирует как комбинаторный детектор свойств запаха, в котором различные части молекулы запаха активируют специфические наборы выходных нейронов луковицы. Этот код затем посылается в более высокие корковые центры (пириформпая кора), вовлеченные в интегрирование этой информации в образы восприятия (запаховые объекты), обусловливающие сенсорную дискриминацию и память (Wilson and Stevenson, 2003).

Существует два взгляда на комбинаторное кодирование в обонятельной луковице. Во-первых, клубочки и соответствующие им митральпые/пучковые клетки отвечают предпочтительно на группы молекулярпо сходных запахов (Uchida et al., 2000; Leon and Johnson, 2003), что приводит к возникновению запахо-специфических паттернов гломерулярной активности и ассоциированного с нею выходного сигнала митральных/пучковых клеток. Предполагается, что с помощью механизмов, таких как возвратное и латеральное торможение перигломерулярными и гранулярными клетками, тормозные иитернейроны могут формировать пространственно-временной паттерн активности для усиления контраста между специфическими чертами сходных запахов, а так же начинать процесс синтеза этих черт для последующего создания однозначного образа запаха. Второй из предлагаемых механизмов кодирования рассматривает совпадающую импульсацию в группах митральных/пучковых клеток, точно синхронизированную с колебаниями локальных полевых потенциалов (local field potentials, LFPs). Колебательная активность была обнаружена в обонятельной системе многих видов животных (Adrian, 1950; Bressler and Freeman, 1980; Laurent and Davidowitz, 1994; Lam et al., 2000). У некоторых насекомых различение запахов, как полагают, основано на точной синхронизации колебаний активности в динамических ансамблях обонятельной луковицы, в которых совпадающая импульсация проекционных клеток может формировать основу для синтеза черт запаха и кодирования запаха (Laurent, 2002), хотя другие исследования показали, что синхронизация проекционных клеток не зависит от этих осцилляций (Christensen et al., 2003). В этой модели роль тормозных интернейронов в формировании настроечных кривых индивидуальной проекционной клетки менее важна, чем их роль в точном синхронизировании групп активных клеток с глобальной колебательной динамикой луковицы (Laurent, 1999). В обоих подходах паттерны нейрональной активности и межнейрональные взаимодействия среди клеток в индивидуальных ансамблях и в целой сети луковицы имеют критическое значение для дискриминации запахов. Поэтому, детальное знание свойств каждого типа нейронов, его синаптических связей с другими нейронами, организации нейронных ансамблей в MOB и координации активности среди ансамблей является необходимой предпосылкой для понимания этой первой стадии кодирования обонятельной информации. Ниже мы рассмотрим более детально современные представления о механизмах кодирования запахов на уровне обонятельной луковицы.

Кодирование запахов а) Гипотеза пространственного кодирования запахов Обонятельные сенсорные нейроны (olfactory sensory neurons, OSNs) различают запахи благодаря семи запаховым рецепторам (odorant receptors, ORs), находящимся в волосках, расположенных у основания дендритов этих клеток (Firestein, 2001). Аксоны OSN проецируются в MOB, где они синаптически контактируют с дендритами митральных/пучковых клеток в сферических образованиях нейропиля, т.е. в клубочках. Соответственно, возбуждение нейроналыюго ансамбля данного клубочка является следствием реакции определенных OSNs на связывание их OR с молекулой одоранта. Данные многих исследований сходятся к тому, что клубочки являются основными функциональными единицами MOB и что паттерны гломерулярной активности являются основой кодирования запахов (Levetau and MacLeod, 1966; Shepherd, 1981; Guthrie et al., 1993; Rubin and Kaz, 1999; Uchida et al., 2000).

Основополагающее открытие, сделанное менее чем десять лет назад лауреатами Нобелевской премии 2004 года L. Buck и R. Axel (1991) и заключающееся в идентификации генов обонятельных рецепторов, положило начало пониманию кодирования информации в обонятельной системе млекопитающих. Существует более 1,000 различных генов обонятельных рецепторов, причем каждый OSN, как оказалось, экспрессирует только один аллель единственного рецепторного гена (Chess et al., 1994; Malnic et al., 1999). Следующим важным продвижением в понимании организации обработки обонятельной информации было открытие того, что аксоны всех 10,00020,000 OSN, которые экспрессируют один и тот же OR геи, конвергируют в два или несколько специфических клубочков, имеющих стереотипичную локализацию в MOB, хотя каждый данный OR экспрессируется нейронами, рассыпанными в широкой зоне по обонятельному эпителию (Ressler et al., 1993,1994; Vassar et al., 1993, 1994; Mombaerts et al., 1996; Strotmann et al., 2000). Аксоны обонятельных нейронов могут быть визуализированы, и иннервация клубочков может изучаться с помощью помещения флуоресцентных маркеров taulacZ или tauGFP под контролем специфичного OR гена (Mombaerts et al., 1996; Potter et al., 2001). Используя трансгенную мышь, у которой зеленый флуоресцирующий протеин (green fluorescent protein, tauGFP) экспрессировался вместе со специфическим OR, группа Момбаерца показала, что аксоны, экспрессирующие GFP, довольно слабо агрегированы во внешнем ONL; однако, далее они входят во внутренний ONL, и, перед тем как войти в гломерулярный нейропиль, большинство аксонов собирается в пучки вместе с другими GFP-экспрессирующими аксонами (Treloar et al., 2002). Более того, хотя некоторые аксоны следовали извилистыми путями через и/или вокруг соседних клубочков, они в конце концов оканчивались в клубочках-мишенях вместе с другими GFP-положительиыми волокнами.

Таким образом, вызванная запахом активность рецепторных нейронов, распределенных по обонятельному эпителию, трансформируется в пространственно организованный паттерн входов в клубочки обонятельной луковицы. Эта карта входов, вероятно, далее трансформируется синаптическими преобразованиями внутри и между клубочками, поскольку обонятельная информация передается к нейронам второго порядка (выходным) MOB (Yokoi et al., 1995). Каждый данный запах может активировать много клубочков, а один клубочек может быть активирован многими запахами, что согласуется с молекулярными, клеточными и физиологическими исследованиями ответов обонятельных рецепторных нейронов (Bozza and Kauer, 1998; Malnic et al., 1999; Zhao et al., 1998; Araneda et al., 2000; Ma and Shepherd, 2000). Сильно активированные клубочки часто собираются в группы, формируя модуль второго порядка, или фокус, домен (Xu et al., 2000; Uchida et al., 2000; Johnson et al., 1999; Kida et al., 2002). Картирование с помощью 2-деоксиглюкозы (2-deoxyglucose, 2-DG), которая захватывается и накапливается только активно функционирующими нейронами, показало, что домены имеют тенденцию возникать симметричными парами в медиальной и латеральной областях MOB (Johnson et al., 2002) подобно парному проецированию рецепторных аксонов в клубочках (Ressler et al., 1993; Vassar et al., 1994; Mombaerts et al., 1996); кроме того, большинство этих доменов может группироваться в кластеры, являющимися уже модулями третьего порядка (Johnson and Leon, 2000а). Гипотеза о том, что гломерулярпые паттерны вовлечены в кодирование обонятельной информации (Stewart et al., 1979) подтверждается многочисленными исследованиями, показывающими, что расположение активированных клубочков или целых групп клубочков (доменов) смещается по поверхности MOB соответственно различиям в химической структуре молекулы запаха (Rubin and Kaz, 1999; Johnson et al., 2002; Meister and Bonhoeffer, 2001; Uchida et al., 2000; Wachowiak and Cohen, 2001; Fried et al., 2002; Johnson and Leon, 2000a,b; Xu et al., 2003). Уникальные комбинации доменов активировались каждым одорантом, демонстрируя, что эти комбинации могли бы быть частью нейроналыюго кода запахов. Однако, молекулярная структура органических одорантов (прямо-цепочечные, ветвистые, циклические и т.д.) не отражалась прямо в специфическом гломерулярном паттерне. Единственное молекулярное свойство, которое сильно коррелировало с локализацией активированных модулей второго порядка была длина молекулы, позволяя предположить, что эта особенность молекулы является основным детерминантом хемотопической организации клубочков внутри домена (Johnson and Leon, 2000b). Кроме того, различные углеводородные структуры приводили к образованию сильно различающихся пространственных паттернов захвата 2-DG в задней части луковицы. Даже слабо различающиеся структурные изомеры приводили к ответам, которые сильно отличались друг от друга. Это позволяет предположить, что задняя часть MOB может кодировать специфические стерические особенности запаховых молекул и что внутренняя организация сети MOB может не быть однородной по всему своему объему.

Функциональные образы с помощью потенциал-чувствительных и Са2+-чувствительпых красителей могут выявить динамический и концентрационный диапазон паттернов активации так же как и скоррелировать картирование запахов с их специфичностью. Загрузка рецепторных нейронов кальций-чувствительпым красителем позволяет наблюдать образы вызванных одорантами ответов в виде временного возбуждения их аксонных терминалей в соответствующих данному запаху клубочках. М. Wachowiak и L. Cohen (2001) обнаружили в экспериментах такого типа, что карты входов, активированных различными запахами, были хемотопически организованы при около-пороговых концентрациях, но уже при умеренных концентрациях вовлекалось много широко распределенных по GL клубочков. Динамический диапазон входов к клубочку был шире, чем диапазон индивидуальных рецепторных нейронов; вдобавок скорость нарастания активации при предъявлении запаха могла различаться между клубочками, а также могла быть разной для различных запахов, активирующих один и тот же клубочек. Эти результаты демонстрируют высокую степень сложности пространсвенпо-времеппой организации поступающей информации в представительстве запахов уже на уровне входов в обонятельную луковицу, так что понятие "один запах - один паттерн на карте GL" становится очевидным упрощением реального кодирования запахов. По-видимому, во время обработки обонятельной информации имеет место не только взаимодействие между индивидуальными гломерулярными модулями, но следует принимать во внимание также временной компонент восприятия и анализа запаха на уровне MOB. б) Временной аспект кодирования запахов

Считается, что как пространственные, так и временные свойства паттернов вызванной запахом активности вносят вклад в обработку запаховой информации (Buck, 2000; Laurent et al., 2001). Относительная важность пространственного и временного узора вызванной запахом активности в обонятельной луковице является противоречивой. В то время как пространственное кодирование становится доминирующей догмой, временной аспект восприятия запахов до сих пор еще не имеет твердой основы и широко не воспринят. Потенциал-чувствительные красители недавно были использованы для того, чтобы продемонстрировать тот факт, что вызванные запахом гломерулярные паттерны развиваются во времени запахо-специфическим образом (Spots and Grinvald, 2002; Kauer et al., 1987; Cinelli et al., 1995; Lam et al., 2000). Такая специфичность динамики возникновения паттерна активированных клубочков позволяет предположить, что запаховая информация содержится в комбинации пространственной и временной составляющих ответа. Образующиеся временные паттерны включают в себя различные компоненты. Некоторые из них наложены на запаховые стимулы динамикой приносящей запах среды и активным сбором обонятельной информации (при дыхании, обнюхивании), в то время как другие генерируются нейрональной динамикой внутри MOB. Образы, создаваемые потенциал-чувствительными красителями, выявили различия в латентности временного хода ответов среди клубочков. Следовательно, индивидуальные клубочки в гломерулярном паттерне отвечают последовательно и паттерн активности развивается постепенно когда запах вдыхается впервые. Во время выдоха паттерн активности также динамичен: ответы отдельных клубочков угасают, продолжаются или даже усиливаются. Это удивительно, но последовательность мгновенных паттернов не является просто повторяющейся в последующем цикле дыхания, особенно при высоких концентрациях запаха. Наоборот, паттерны во втором дыхательном цикле могут быть совершенно отличными. Некоторые клубочки отвечают менее сильно во время второго цикла, позволяя предположить, что возникает адаптация. Однако, другие клубочки отвечают более сильно или с другим временным ходом во втором цикле, указывая на то, что и другие процессы вносят также вклад в наблюдаемые динамики. Эти результаты демонстрируют, что паттерны активности в MOB не являются статическими, но развиваются по ходу дыхательного цикла и от одного цикла к следующему. Поэтому паттерны активности должны рассматриваться ещё и как функция времени, а не только пространства.

Нейропальная активность в МОВ имеет временную структуру со многими временными шкалами, включая медленный, ведомый дыханием ритм (~2Hz в неапестезированных крысах) и быстрые колебания, генерируемые обратной связью между митральными и гранулярными клетками (40-80 Hz) у млекопитающих (Eckman and Freeman, 1990). Оба типа колебаний модулируют мембранные потенциалы некоторого набора М/Т клеток (Luo and Kaz, 2001; Friedrich and Laurent, 2001; Margie, 2001). Такие осцилляции могут служить в качестве опорных точек для временного кодирования. Экспериментальные результаты указывают на то, что появление спайка М клетки инвариантно по отношению к быстрым колебаниям, а это, в свою очередь, свидетельствует о том, что последние не несут информации о запахе (Laurent et al., 2001; Friedrich and Laurent, 2001; Eckman and Freeman, 1990 ; Kashiwadani et al., 1999). Быстрые колебания таким образом могут обслуживать другие функции (Peres-Orive et al., 2002). Однако, фазовое кодирование может иметь отношение к медленным, связанным с дыханием осцилляциям (Margie, 2001). Медленные осцилляции важны, поскольку они могут индуцировать ответы митральных клеток, которые связаны с одним и тем же клубочком в динамическом режиме, присущем либо мембранам М/Т клеток, либо динамике кооперативной активности опосредованной выбросом нейротрансмиттеров (Carlson et al., 2001; Schoppa and Westbrook, 2001). В других зонах мозга колебательные процессы, которые являются важными для нормального функционирования структуры, поддерживаются множественными механизмами. Например, в гиппокампе тета ритм является хорошо оркестрованной комбинацией а) подпороговых колебаний мембранного потенциала (membrane potential oscillations, MPOs) на 0-частоте, b) свойства мембранного резонанса, настроенного на 0-частоту, с) взаимодействий среди возбудительных и тормозных нейронов в сети с временным ходом цикла EPSP-IPSP, обеспечивающим длительность цикла в 200-300 ms (3-5 Hz) и, наконец, d) ритмического входа из септума в 0-диапазоне (for review see Karnup, 2004). Поэтому, если тот или другой вид сетевых колебаний в МОВ является критически важным для ее функционирования, можно ожидать наличия нескольких механизмов, поддерживающих такие колебания, например, настройки нейрональных MPOs на ритм дыхания или динамического обмена EPSP-IPSP, следующего в том же частотном диапазоне. В такой сложной системе как МОВ, где морфо-физиологические характеристики как отдельных элементов, так и их ансамблей должны быть настроены на режим, обеспечивающий надежную работу всей сети, подробные знания об анатомических и физиологических свойствах одиночных нейронов и их связей, а так же знание принципов построения каждого уровня этой системы совершенно необходимы для понимания ее функционирования.

Морфология обонятельной луковицы

Общая анатомия и физиология MOB к настоящему времени достаточно хорошо изучены (см. обзоры: Brunjes and Greer, 2003; Leon and Johnson, 2003; Shepherd and Greer,1998; Shipley and Ennis, 1996; Shipley et al., 1996). MOB получает афферентные входы от обонятельных сенсорных нейронов из носового эпителия и посылает выходные волокна прямо к обонятельной коре. Эта система приема и передачи обонятельной информации присутствует почти у всех позвоночных. Сама MOB -характерная слоистая структура, содержащая четко дифференцированные клеточные типы. На поперечном срезе MOB видны шесть главных слоев от поверхности до центра: 1) слой обонятельного нерва (olfactory nerve layer - ONL), 2) гломерулярный слой (glomerular layer - GL), в котором расположены специфические сфероидные структуры - клубочки или гломерулы, 3) наружный плексиформный слой (external plexiform layer - EPL), 4) слой митральных клеток (mitral cell layer - MCL), 5) внутренний плексиформный слой (internal plexiform layer - IPL) и 6) гранулярный клеточный слой (granule cell layer - GRL). Несколько основных клеточных типов характеризуют каждый из слоев: джакстагломерулярные клетки (juxtaglomerular cells -JG) располагаются в GL, пучковые клетки (tufted cells - Т) в EPL, митральные клетки (mitral cells - М) в MCL и гранулярные клетки (granule cells - GR) в GRL. JG клетки, в свою очередь, включают в себя три известных морфологическмх типа нейронов: перигломерулярные клетки (periglomerular cells - PG), внешние пучковые клетки (external tufted cells — ET) и коротко-аксонные клетки (short-axon cells SA). M и T клетки получают сенсорный вход с обонятельного нерва, контактирующего с ветвлениями их апикальных дендритов (в GL), и дают начало бульбарному выходному сигналу от своих клеточных тел (в MCL). Поэтому, две главных функции: обработка входного сигнала и контроль выходного сигнала разделяются в двух четких уровнях относительно проекционных (т.е. выходных) М и Т клеток. В GL сипаптический вход от ON контролируется локальными для этого слоя JG нейронами, а в EPL и MCL степень возбуждения М и Т клеток находится под контролем GR клеток, отростки которых не проникают в GL. Таким образом, обработка входящих сигналов происходит исключительно в GL с участием JG нейронов, тогда как контроль выхода происходит только в EPL и MCL благодаря GR клеткам. Есть основания полагать, что ансамбль нейронов, чьи отростки ветвятся в одном и том же клубочке, может действовать как функциональная единица, подобная колонке неокортекса (Leveteau and MacLeod, 1966; Sharp et al., 1977; Benson et al., 1985; Mori and Yoshihara,1995; Mombaerts et al., 1996b).

Морфологически типы нейронов в MOB были охарактеризованы многими авторами (Pinching and Powell, 1971b; Macrides and Schneider, 1982; Toida et al., 2000). Самыми большими нейронами в MOB являются митральные (М) клетки. Они являются главными нейронами обонятельной луковицы и посылают свои аксоны в нижние слои пириформной коры. Единственный главный (апикальный, первичный) дендрит M клетки проходит от MCL до GL, где ветвится пучком в единственном (очень редко в двух) клубочке. Несколько (3-5) почти не ветвящихся латеральных (вторичных) дендритов расходятся во все стороны от проксимального участка апикального дендрита и могут достигать длины 500-1000 цт внутри EPL. Другой тип нейронов, пучковые (Т) клетки, также проецируют свои аксоны из MOB в пириформную кору, но в верхние слои (for review see Mori, 1987; Shipley and Ennis, 1996). Пучковые клетки, тела которых расположены в EPL, подразделяют на 3 подтипа: поверхностные (сома чуть ниже границы GL/EPL), срединные (сома в среднем EPL) и глубинные ( сома в нижней трети EPL) (Macrides and Schneider, 1982). Т клетка тоже имеет единственный первичный дендрит, проецирующийся в один из клубочков, где он заканчивается пучковым ветвлением. Слабо ветвящиеся вторичные дендриты Т клеток, как и латеральные дендриты M клеток, могут достигать значительной длины (500-800 цт) располагаясь исключительно внутри EPL параллельно или наискосок по отношению к слоям MOB. Как М, так и Т клетки являются возбудительными глутаматэргическими нейронами. Они получают возбуждающий вход из волокон обонятельного нерва через обычные аксонные терминали, оканчивающиеся на дистальных пучках первичных дендритов этих клеток, расположенных в единичном клубочке. Как М, так и Т клетки получают большое число тормозных синаптических входов преимущественно на свои латеральные/вторичные дендриты, которые распространяются па большие расстояния внутри EPL. Эти тормозные контакты образуются большими дендритными шипиками безаксонных локальных ГАМК-эргических гранулярных (GR) клеток. Тела GR клеток располагаются ниже MCL, а их дендриты пронизывают MCL и образуют несколько веточек второго и третьего порядка в EPL, где они образуют синаптические дендро-дендритные (см. ниже) контакты с вторичными дендритами M и Т нейронов. Все вместе митральные, пучковые и гранулярные клетки образуют выходную подсеть MOB.

Строение синаптических контактов в MOB существенно отличается от такового в остальных отделах мозга. Наиболее значимой особенностью нейрональных контактов в MOB является то, что все типы нейронов устанавливают дендро-дендритные синапсы, где дендриты образуют и пресинаптические, и постсинаптические структуры. На основании того, что световая микроскопия выявила присутствие шипиков только на PG и GR клетках, а электронная микроскопия показала наличие уплощенных везикул пресинаптических зонах у обладающих шипиками клеток (в безшипиковых дендритах везикулы круглые) было сделано заключение о том, что PG и GR клетки являются ГАМК-ергическими, тогда как М и Т клетки - глютаматергическими (Pinching and Powell, 1971а; Büffler et al., 1992; Halasz and Shepherd, 1983; Ribak et al., 1977; Trombley and Shepherd, 1993). Ни дендриты M и T клеток, ни их синаптические дендро-дендритные контакты с PG клетками в гломерулярном нейропиле не могут быть отличены друг от друга на уровне ЕМ (Pinching and Powell, 1971b), поэтому при рассмотрении внутренней архитектуры GL они обычно называются дендритами М/Т клеток совокупно. Было предположено, что только дистальные тонкие участки дендритных пучков М/Т клеток контактируют и образуют синапсы с терминалями ON (Kasowski et al., 1999). Однако, другая группа авторов показала, что толстые, предположительно проксимальные ветви М/Т клеток в гломерулярном нейропиле также получают асимметричные синапсы от терминалей ON (Kosaka et al., 2001). Возбуждающие М/Т клетки не образуют дендро-дендритных химических синаптических контактов друг на друге (Pinching and Powell, 1971b), в то время как нечастые тормозные контакты среди PG клеток были обнаружены на ЕМ, так же как и в физиологических исследованиях (Puopolo andBelluzzi, 1998; White, 1973). Электронно-микроскопические данные указывают на то, что дендриты М/Т клеток содержат круглые синаптические везикулы, образующие кластеры около активных зон, а дендриты PG и GR клеток содержат уплощенные везикулы около своих пресинаптических зон (Rail et al., 1966; Price and Powell, 1970a, 1970b). Электронно-микроскопические исследования также ясно показывают, что PG клетки внутри гломерулярного нейропиля и GR клетки в EPL устанавливают реципрокпые дендро-дендритные химические контакты на М/Т клетках (Price and Powell, 1970; Pinching and Powell, 1971a; Pinching and Powell,1971b; Orona et al., 1983). Кроме того, короткие аксоны (100-200 мкм) PG клеток образуют тормозные синапсы как на М/Т, так и на PG дендритах в межгломерулярном пространстве.

В EPL гранулярные клетки контактируют с митральными и пучковыми клетками посредством больших, содержащих уплощенные везикулы шипиков, которые являются как пре-, так и постсинаптическими образованиями по отношению к дендритам М/Т клеток. Как правило, в непосредственной близости от пресипаптического участка мембраны GR клетки и соответствующего постсинаптического участка дендрита М/Т клетки, т.е. около тормозного синапса, на этом же шипике расположен и возбудительный синапс с пресинаптическим участком этого же дендрита М/Т клетки и соответствующим постсинаптическим участком GR клетки. Такая синаптическая организация, как полагают, формирует основу для реципрокного дендро-дендритного торможения М/Т клеток (Rail et al., 1966; Rail and Shepherd, 1968). Основные физиологические свойства этой дендро-дендритной цепи были вначале описаны в обонятельной луковице кролика (Phillips et. al., 1963; Nicoll, 1969), а затем подтверждены на черепахе (Jahr and Nicoll, 1980,1982а, 1982b; Nowycky et al., 1981) и саламандре (Wellis and Kauer, 1993, 1994). В этом реципрокном синаптическом устройстве глутамат, выделенный из дендритов М/Т клетки, возбуждает дендриты гранулярных клеток, которые в свою очередь выделяют тормозный медиатор ГАМК (=GABA, ГАМК - гамма-аминомасляная кислота; GABA - gamma-aminobutiric acid), таким образом, опосредуя возвратное дендро-дендритное торможение обратно на М/Т дендрит. В этом случае генерация спайков в GR клетке не требуется, и все взаимодействие может быть локализовано в данном дендритном участке без вовлечения сомы. Было показано, что, как и в случае с аксонными синапсами, выделение GABA из дендрита GR клетки требует вовлечения NMDA рецептора и входа кальция через каналы N- и P/Q-типа (Isaacson and Strowbridge, 1998; Chen et al., 2000; Schoppa et al., 1998; Christie et al., 2001). К настоящему времени наше понимание функционирования обонятельной луковицы в основном базируется на исследованиях митральных клеток и дендро-дендритных синапсов между митральными и гранулярными клетками, однако пучковые клетки, как было показано, имеют сходную морфологию реципрокных контактов (Shepherd and Greer, 1998) и механизм локального возвратного торможения (Christie et al., 2001).

Похожая, но не совершенно такая же организация реципрокных дендро-дендритных контактов была обнаружена между пучками М/Т клеток и перигломерулярными (PG) клетками в GL. Поскольку PG клетки являются ГАМК-эргическими (Ribak et al., 1977; Pinching and Powell, 1971a), они осуществляют тормозное воздействие на постсинаптическую клетку. Сериальные реконструкции показали, что в GL только 8% пресинаптических дендритных сегментов получают возвратный синапс противоположной полярности от постсипаптического дендритного сегмента (White, 1972,1973). В клубочке число не реципрокных синапсов намного превышает число реципрокных синапсов, и даже если такие возвратные синапсы существуют, они обычно расположены по крайней мере на расстоянии 10 цш от первого синапса. Другими словами, если М/Т дендритный сегмент является пресинаптическим по отношению к дендриту PG клетки, последний обычно образует свой ближайший пресинапс на другой М/Т клетке. У крысы, мыши и кролика соотношение М/Т-к-PG и PG-к-М/Т синапсов почти одинаково, поэтому М/Т дендриты как группа реципрокно соотносится с PG дендритами (White, 1973). Таким образом, в противоположность M/T-GR реципрокпым синаптическим контактам в EPL, где дендритные участки могут взаимодействовать локально, M/T-PG синаптические взаимодействия в GL являются морфологической основой для популяционпого реципрокного торможения в клубочке, где возбуждение одного или нескольких дендритных участков М/Т клетки может тормозить дендритные участки нескольких других М/Т клеток через промежуточные PG клетки. Важно, что участие сомы или других удаленных дендритных участков может также не требоваться.

Морфология нейронов MOB

Специфические сфероидные структуры гломерулярного слоя - клубочки -имеют стереотипное строение. Их сердцевина (у крыс -100-120 цт в диаметре) образована исключительно дендритными ветвлениями и не содержит тел нейронов. Основной вектор дендритного ветвления у JG клеток всегда направлен к центру клубочка. В то же время, периферия, т.е. граница клубочка, сформирована плотно упакованными телами клеток. Морфологические определения и критерии различения нейронных типов в гломерулярном слое MOB берут начало от фундаментальной гистологической работы A. Pinching and Т. Powell, где использовалась импрегнация по Гольджи в сочетании с электронной микроскопией JG клеток (Pinching and Powell, 1971a,b,c, 1972). В последующие годы очень немногие исследователи пытались детально рассматривать архитектуру и физиологию гломерулярного слоя. С начала 70х годов была в основном воспринята и использована номенклатура и критерии различения нейронов, предложенные Пинчингом и Пауэлом (Pinching&Powell, 1971а), где эти авторы впервые описали перигломерулярные клетки как отдельный тип джакстагломерулярных клеток. Согласно их данным PG клетки являются единственными нейронами, обладающими дендритными шипиками. Один или несколько первичных дендритов PG клетки ветвятся в гломерулярном нейропиле, а если имеются вторичные дендриты, они располагаются в близлежащей перигломерулярной области. Большие уплощенные, предположительно содержащие ГАМК везикулы, как обнаружилось, коррелировали с шипиковыми дендритами, таким образом, PG клетки рассматривались как ГАМК-эргические тормозные иптернейроны. Было обнаружено, что PG клетки либо не имеют аксона, или имеют только короткий (~100 цт) аксон, простирающийся до соседнего клубочка.

Коротко-аксонные (SA) клетки также могут иметь редкие шипики и маленькие уплощенные везикулы, но у них нет пучков, и они не ветвятся в клубочках. По определению Пинчинга и Пауэла тела SA клеток расположены в межклубочковом пространстве GL, а их длинные слабо ветвящиеся дендриты произвольно располагаются в межгломерулярном пространстве, распространяясь до 200-300 цт, но не проникают в нейропиль клубочков (Pinching&Powell, 1971а). Аксоны SA клеток были найдены только на расстоянии 1-2 клубочков от сомы, поэтому эти клетки получили название коротко-аксоиных клеток. В своих электронно-микроскопических исследованиях GL нейропиля Pinching и Powell приписали гладкие дендриты с небольшими уплощенными везикулами SA клеткам и предположили, что SA клетки являются ГАМК-эргическими тормозными интерпейронами. Как мы можем теперь показать, как анатомические, так и физиологические черты SA клеток оказались отличающимися от тех, которые им приписывались до сих пор. Во-первых, аксоны SA клеток являются самыми длинными в GL и распространяются более чем наЮОО цт, во-вторых, SA клетки являются возбудительными глутамат-эргическими нейронами и, в-третьих, как дендриты, так и аксоны SA клеток могут пронизывать нейропиль клубочков (Глава 4 диссертации).

Внешние пучковые клетки (ET), как общепринято считать, совершенно не имеют шипиков и содержат круглые везикулы, поэтому они считаются возбудительными глутаматэргическими нейронами. Они являются выходными нейронами MOB, проецирующими аксоны в обонятельную кору, а некоторые их коллатерали образуют интрабульбарную ассоциативную систему (Liu and Shipley, 1994). Только внешние и поверхностные пучковые клетки, но не средние и глубокие пучковые клетки участвуют в организации этой интрабульбарной ассоциативной системы, в которой ET нейроны образуют точка-к-точке реципрокные проекции между противоположными областями медиальной и латеральной MOB (Schoenfeld et al., 1985). Тела ET клеток, как было показано, расположены по периферии клубочка внутри GL или на границе GL/EPL. Обильное ветвление первичного дендритного пучка в одиночном клубочке сходно с таковым М/Т клеток; вторичные дендриты, если они присутствуют, нисходят в EPL. F. Macrides провел тщательное морфологическое исследование всех пучковых клеток, включая ET. Он разделил ET клетки на три категории в зависимости от наличия и/или степени ветвления вторичных дендритов (Macrides and Schneider, 1982).

Таким образом, до сих пор шипики принято рассматривать как решающий критерий различия между перигломерулярными и внешними пучковыми клетками. В некоторых случаях, когда мелкие детали клеток не выявляются, авторы различают эти два типа JG клеток только по их морфометрии, такой как размер сомы, толщина первичного дендрита и характер ветвления (Crespo et.al., 1997), или по смешанным морфо-физиологическим характеристикам, таким как паттерн импульсации и постоянная времени мембраны при условии, что дендриты группируются в нейропиле клубочка (Puopolo and Belluzzi, 1998; Castillo et. al., 1999). В наших исследованиях in vitro с внутриклеточным окрашиванием зарегистрированных клеток с помощью биоцитина, мы обнаружили, что шипики могут быть найдены на заведомо внешних пучковых клетках с сохранившимися вторичными дендритами в EPL и аксоном, проецирующимся в EPL. С другой стороны, некоторые не пучковые нейроны со всеми дендритами внутри одного клубочка могли не иметь шипиков. В противоположность рисункам Пинчинга и Пауэла, на наших препаратах шипики были довольно редкими и имели длинные (1-2 цш) шейки. Поскольку, как известно, дендритные шипики способны изменять свою форму и число в течение часов или даже минут (Deller et. al., 2000), мы предполагаем, что во время переживания in vitro шипики могут возникать (на некоторых пучковых клетках) или исчезать (на некоторых PG клетках), т.е. они не могут являться однозначным критерием различия ET и PG нейронов. Ситуация с типологией джакстагломерулярных нейронов усложнилась еще более в связи с тем, что недавнее использование электронно-микроскопической иммуно-цитохимии выявило гетерогенность перигломерулярных нейронов не только по их химическим и морфологическим свойствам, но также по их синаптической организации в обонятельных клубочках (Kosaka et. al., 1997; Toida К., et.al, 2000).

В противоположность значительному количеству гистологических работ, электрофизиологические исследования JG клеток были не такими систематическими и пока не обеспечивают ясного соответствия между морфологией и физиологией JG клеток. Например, Пуополо и Беллуци установили различие между перигломерулярными (PG) и внешними пучковыми (ET) клетками на основе исключительно двух критериев: 1) значительно меньшей мембранной емкости у PG по сравнению с ET клетками и 2) по тому факту, что PG клетки отвечали только единичным спайком в ответ на деполяризационпую ступеньку тока, в то время как ET клетки отвечали регулярной неаккомодирующей импульсацией (Puopolo and Beluzzi, 1996; Puopolo and Belluzzi, 1998). Как мы увидим позднее (Глава 1 этой диссертации), только часть PG клеток и часть ET клеток обладают этими характеристиками. Третий тип известных JG клеток, а именно, коротко -аксонные клетки (SAc), был недавно охарактеризован электрофизиологически, но только в смысле паттерна разрядов в ответ на деполяризационпую ступеньку тока (McQuiston and Katz , 2001). Такие черты как характеристики мембраны, спонтанная активность и вызванные ответы на стимуляцию не рассматривались. Наши данные восполняют это упущение. Мы провели «whole-cell» регистрации от всех известных морфологически типов JG клеток, а затем сопоставили их типичные электрофизиологические характеристики с индивидуальными реконструированными нейронами. Более того, вдобавок к ранее определенным клеточным типам мы обнаружили новый морфологический тип JG клеток, а именно, волосатые перигломерулярнные клетки (hairy periglomerular cells, HPGc), с отличающимися внешностью и поведением.

Физиология нейронов MOB

В отличие от морфологии, данные о физиологии нейронов MOB пока еще являются неполными и противоречивыми. Большие по размерам M и Т клетки были подробно охарактеризованы в электрофизиологических экспериментах (Mori, 1987; Mori et al., 1981; Desmaisons, 1999; Cassidy and Frisén 2001; Schoppa and Westbrook, 2001; Heyward et al., 2001), тогда как еще совсем недавно физиология маленьких, по чрезвычайно важных, PG и GR клеток была неизвестна. В течение последних четырех лет был проведен детальный анализ спонтанной и вызванной активности PG клеток, а так же их мембранных характеристик, активных токов, типичных межнейрональных связей (Hayar et al., 2004а, 2004b; Karnup et al., 2001; McQuiston and Katz, 2001; Egger et al., 2003; Pinato and Midtgaard, 2003; Halabisky and Strowbridge, 2003). Также были изучены вызванные ответы в MOB на популяционном уровне (Aroniadou-Anderjaska et al., 1997,1999b, 2000).

Первые электрофизиологические эксперименты с внеклеточной и внутриклеточной регистрацией от идентифицированных нейронов в MOB млекопитающих были проведен в в условиях in vivo и данные в основном были получены от митральных клеток во время предъявления запаха. Эти эксперименты привели к пониманию того, что динамические характеристики М/Т клеток, включенных в сеть всей MOB, являются гетерогенными. Тем не менее, в общем виде форма паттерна активности коррелировала с индивидуальными запахами, позволяя предположить, что молекулярные характеристики конкретного одоранта в смеси запахов могут быть одновременно кодироваться разными запахо-специфическими временными распределениями активности (Yu et al., 1993; Giraudet et al., 2002). Поскольку М/Т клетки обладают запаховыми рецептивными полями (odorant receptive fields, ORFs) -молекулярными рецептивными областями в пространстве длин углеродных цепей в молекулах органических запахов - их ответы могут быть количественно оценены по реакции на различные запахи (Imamura et al., 1992; Mori and Yoshihara, 1995). Вызванные запахом возбудительные ответы М/Т клеток обычно состоят из пачек потенциалов действия, ассоциирующихся с ~ с 2 Гц дыхательным ритмом. Вызванное запахом ритмическое возбуждение М/Т клетки постоянно во время предъявления запаха (2-4 s); и наоборот, как возбудительные ответы гранулярных клеток так и латеральное торможение М/Т клетки быстро адаптируется после первого дыхательного цикла в присутствии одорантов. Было обнаружено, что амплитуда и начальный наклон (скорость нарастания) вызванного запахом синаптического возбуждения играет важную роль в регулировании времени возникновения М/Т спайков. Более того, различия в концентрации запаха изменяют форму вызванных запахом возбудительных синаптических ответов, латентность спайков и время латерального торможения в М/Т клетках (Cang and Isaakson, 2003). Количественный анализ возбудительных ORFs М/Т клеток показал, что в ответ на новые запахи ширина среднего ORF распространяется на 3-4 углерода, в основном с единственным наиболее возбуждающим одорантом. Экспозиция в течение 50 сек либо наиболее возбуждающего одоранта (ON-PEAK), или одоранта, который был длиннее на два углеродных атома (OFF-PEAK), приводило к подавлению всего ORF немедленно после конца продолжительной экспозиции, при этом ON-PEAK экспозиция приводила к самому сильному подавлению (Fletcher and Wilson, 2003). Эти результаты согласуются с функцией М/Т клеток как детекторов характеристик запаха. Исходя из того, что М/Т клетки получают исключительно возбудительный вход от нейронов обонятельных рецепторов, экспессирующих идентичные рецепторные белки (Vissar et al., 1994; Tsuboi et al., 1999), была высказана гипотеза, что индуцированные длительной экспозицией одорантов изменения ORF М/Т клетки отражают модуляцию латеральных и центрофугальных цепей обонятельной луковицы (Fletcher and Wilson, 2003).

Первые и единственные эксперименты с внутриклеточной регистрацией in vivo от тормозных иитернейронов MOB были проведепы D. Wellis and J. Scott (1990), где они получили ответы этих нейронов на электрическую стимуляцию и стимуляцию запахами. В этих экспериментах сообщалось о результатах, полученных только от 28 гранулярных клеток и от 6 JG клеток из-за чрезвычайной трудности регистрации от интернейронов MOB. Нейроны заполнялись биоцитином и позже рекогструировались для идентификации. Большинство гранулярных клеток проявляли возбудительные ответы в ответ на запаховую стимуляцию. Запахи могли приводить к импульсным ответам, которые либо не проявляли привыкания (ответ на каждое принюхивание), либо проявляли быстрое привыкание (ответ только на первое принюхивание). Другие гранулярные клетки, несмотря на то, что импульсировали в ответ на электрическую стимуляцию, показывали деполяризацию, которая не вызывала спайков в ответ на запаховую стимуляцию. Эти деполяризации были временными, совпадающими с каждым принюхиванием, или постоянными на протяжении серии принюхиваний. Такие физиологические различия на запаховую стимуляцию коррелировали с глубиной расположения GR клетки относительно MCL, позволяя предположить, что морфологические подтипы GR клеток могут иметь физиологические различия. Из 6 зарегистрированных JG клеток, как мы теперь понимаем, обладая лучшим знанием о характеристиках JG клеток, только 4 были PG клетками, а две другие были ET клетками, хотя авторы не разделяли их и рассматривали все клетки как PG. В четырех (PG) нейронах ортодромная стимуляция в ONL приводила к коротколатентной (~3 ms) спайк/деполяризации, за которой следовала длительная деполяризация, продолжающаяся в среднем ~27 ms. Эти клетки не генерировали добавочных потенциалов действия на вершине деполяризации. В двух других клетках (ET) эта деполяризация приводила к пачке спайков. В то же время, запаховая стимуляция вызывала появление пачек спайков во всех JG клетках, позволяя предположить, что импульсные разряды могут просто следовать за входным сигналом из ON.

Как известно, нейроны ЦНС показывают широкое разнообразие ответов на изменение мембранного потенциала (Llinas, 1988). Специфические свойства мембраны могут наделять индивидуальные нейроны различными порогами генерации спайка, уровнями возбуждения и видами колебательного поведения. Таким образом, собственные свойства нейронов являются основными детерминантами их синаптической интеграции в нейронную сеть (см. также Johnston et al., 1996). Однако, хотя недавние исследования расширили наше знание о синаптических взаимодействиях в MOB между М/Т и GR клетками, относительно мало известно о мембранных свойствах нейронов MOB.

Физиология отдельных клеток, их мембранные ионные токи и детали синаптической передачи начали в последнее время исследоваться на срезах MOB. Большинство имеющейся литературы посвящено митральным клеткам, регистрируемым в срезах MOB, причем много внимания было уделено активному распространению спайков в дендритах M клеток. Неугасающий потенциал действия (action potential, АР) распространяется по апикальному дендриту митральной клетки с высокой надежностью благодаря дендритным потенциал-зависимым Ыа+-каналам, поддерживающим активное распространение АР от сомы, а так же дендритным К+-каналам, которые опосредуют быструю ре-поляризацию этого АР в дендритах (Bischofberger and Jonas, 1997; Chen et al., 1997). Кроме того, при некоторых условиях бифуркация первичного дендрита в пучке может быть местом инициации потенциала действия в ответ на входной сигнал из ON (Chen et al., 1997), т.е. вызванное таким АР высвобождение глутамата не требует вовлечения тела нейрона. Латеральные дендриты М клетки, по-видимому, имеют другой набор ионных каналов, поскольку АР в этих дендритах ослабляется. Это ослабление зависит от калиевого тока А-типа (Christie and Westbrook, 2003) и может модулироваться гранулярными клетками, контактирующими с латеральным дендритом (Lowe, 2002). Степень пространственного распространения АР в латеральных дендритах, динамически регулируемая тормозными синапсами, распределенными вдоль дендрита, определяет пространственный паттерн втекающего Са+2 и, таким образом, паттерн и число дендродендритных синапсов, которые должны быть активированы (Xiong and Chen, 2002). Поэтому, при ответах на различные запахи сетевой контроль распространения спайка в латеральных дендритах М клетки может обусловливать динамическое взаимодействие гломерулярных модулей, вносящих различные вклады в конечный ответ. До недавних пор активные свойства соматической мембраны М клетки не принимались во внимание, хотя они могут влиять на синаптическую интеграцию и играть роль в многофазных ответах на вход ON (Ennis et al., 1996; Jiang et al., 1996; Aroniadou-Anderjaska et al., 1997; Ciombor et al., 1999). Мембранные свойства митральной клетки могут также влиять на момент появления выходного спайка в ответ на стимуляцию ON (Desmaisons et al., 1999), в то время как мембранные свойства гранулярной клетки могут регулировать время появления тормозного синаптического выхода, генерируемого в ответ на разряд М клетки (Schoppa and Westbrook, 1999). Недавно наша группа обнаружила, что мембрана митральной клетки является бистабилыюй, поддерживая два уровня мембранного потенциала с различными способностями к ответам на вход из ON (Heyward et al., 2001). Активные свойства мембраны М клетки, действующие при подпороговых для генерации спайков потенциалах, могут усиливать и удлинять влияние как деполяризующих, так и гиперполяризующих входов. Например, в комбинации с синаптически опосредованной долговременной деполяризацией (long-lasting depolarization, LLD) (Carlson et al., 2000), мембранная бистабильность M клетки может существенно удлинить ее деполяризационную фазу и, следовательно, число выходных спайков. Эти два механизма могут существенно влиять на ответы митральной клетки на синаптический вход ON.

О мембранных свойствах пучковых клеток до сих пор не сообщалось, так что наши исследования собственных свойств ЕТ клеток являются пионерскими (см. Главы 1-3).

Физиологически JG нейроны вначале были описаны как пачкующиеся клетки (т.е. клетки, разряжающиеся пачками потенциалов действия) (Shepherd et al., 1963), некоторые из которых, вероятно, должны быть тормозными (Duchamp-Viret et al., 1993; Getchell and Shepherd, 1975). Другие авторы, однако, предполагали, что JG нейроны могут быть все возбудительными (Freeman 1974a,b) и что GABA-эргическая синаптическая передача в клубочках может быть деполяризующей (Siklos et al., 1995). Хотя пачкующееся поведение JG нейронов наблюдалось in vivo (Wellis and Scott, 1990), некоторые эксперименты с использованием «whole cell patch-clamping» в срезах обонятельной луковицы не смогли обнаружить пачкующихся нейронов в гломерулярной области. В этих экспериментах JG нейроны (включая анатомически идентифицированные PG клетки) описывались как генерирующие одиночный потенциал действия или несколько потенциалов действия в ответ на деполяризующую инъекцию тока (Bardoni et. al., 1995; Büffler et al., 1992; Puopolo and Belluzzi 1996, 1998). В противоположность этому, PG нейроны в срезах обонятельной луковицы очень молодых кроликов (Р4) были описаны как вообще не импульсирующие, в то время как другие JG нейроны генерировали поток спайков в ответ на деполяризующую инъекцию тока (Büffler et al., 1992). Таким образом, имеется множество несоответствий в описаниях физиологических свойств JG нейронов обонятельной луковицы, которые должны быть рассмотрены для того, чтобы физиологическая природа JG нейронов была полностью понятна.

Достаточно тщательные исследования собственных свойств идентифицированных JG клеток млекопитающих in vitro проводились в конфигурации «whole cell» лишь тремя группами исследователей, включая нашу (Puopolo and Belluzzi, 1996, 1998а, 1998b; McQuiston and Katz, 2001; Karnup et al., 2001; Hayar et al., 2004a,b). Первая группа различала PG клетки от ET клеток по мембранной емкости и ответу на деполяризующую инъекцию тока. Ими было выявлено, что PG клетки имели почти в 3 раза более низкую мембранную емкость (~7 pF), чем ET клетки (~20 pF). На инъекцию тока PG клетки отвечали одиночным потенциалом действия, в то время как ET клетки отвечали рядом спайков. Вторая группа авторов классифицировала JG нейроны только по их импульсным разрядам в ответ на деполяризующую инъекцию тока. Они различали два основных типа импульсации: 1) устойчивая импульсация и 2) пачки спайков. Первый тип включал четыре подтипа импульсации: а) регулярная без аккомодации, Ь) устойчивая с аккомодацией, включая клетки, которые отвечали одиночным спайком независимо от степени деполяризации, с) спорадические нерегулярные разряды и d) паттерн с медленно развивающимся подъемом Vm, достигающим порога генерации спайка, после чего следовал поток импульсации. Способность к пачкованию во второй группе клеток была обусловлена потенциал-зависимым развитием низкопорогового кальциевого спайка (LTS, low threshold Са2+ spike). Более того, поскольку большинство пачкующихся нейронов обладали выраженным входным током, активируемым при гиперполяризации (Ih), они иногда показывали медленные осцилляции (~4 Hz) мембранного потенциала, возможно благодаря взаимодействию LTS и Ih. Морфологическая классификация зарегистрированных JG клеток второй группой авторов и корреляция типов клеток с их физиологическими свойствами показали, что LTS мог генерироваться как ET так и PG клетками, и даже некоторыми SA клетками. Авторы и не пытались коррелировать другие типы импульсации с клеточной морфологией, но общим результатом было то, что существует значительная гетерогенность как морфологии, так и физиологии нейронов, и что морфологические особенности клеток с одним типом импульсации накладываются на таковые других типов. Следовательно, общим заключением было то, что физиологические свойства слабо коррелируют или не коррелируют вообще с морфологическими типами. Тем не менее, в наших исследованиях нам удалось произвести мультипараметрическое разделение JG клеток на ET, PG и SA типы и установить характерные физиологические отличия каждого из типов с большой вероятностью, хотя остается некоторая неопределенность из-за частичного перекрывания параметров между PG и ET клетками (см. Глава 1 Диссертации).

Мсжнейропныс взаимодействия

Поскольку известно, что М/Т клетки не имеют химических синаптических контактов друг с другом (Price and Powell, 1970, 1970а), было бы естественно предположить, что внутригломерулярная синхронизация опосредована возвратным торможением от PG клеток. Однако мы обнаружили, что в гломерулярном ансамбле ET клетки хорошо синхронизированы и эта синхронизация становится даже лучше выраженной после блокады ГАМК рецепторов (Hayar 2004b; Hayar et al, 2005b). Таким образом, должны существовать другие способы нейрональных взаимодействий, например, электрические щелевые контакты на депдритах (Kosaka Т, Kosaka, 2003, 2004) или «разливание» глутамата после его высвобождения из пресинапса (Isaacson, 1999). Поэтому подтверждение существования щелевых контактов, как и подтверждение наличия значительных всплесков внесинаптической концентрации глутамата, стало критически важным для объяснения синхронизации активности в нейрональных ансамблях MOB.

В течение последнего года существование щелевых контактов между главными нейронами MOB было подтверждено (Christie et al., 2005; Kosaka et al., 2005) Более того, одновременная регистрация активности митральных клеток в срезах MOB показала, что пары, проецирующиеся в один и тот же клубочек, проявляют высоко синхронизированную импульсную активность, в то время как пары, проецирующиеся в разные клубочки, этого не показывают (Carlson et al., 2000; Schoppa and Westbrook, 2002). Недавно группа (Christie et al., 2005) сосредоточилась на изучении молекулярного механизма, лежащего в основе такой синхронности. Поскольку коннексинЗб (СхЗб), по-видимому, является основным коннексином, отвечающим за формирование межнейрональных щелевых контактов (Bennet and Zukin, 2004), авторы использовали СхЗб нокаутную мышь в физиологических экспериментах на срезах а также в электронно-микроскопических исследованиях. Они обнаружили явную утерю скоррелированной импульсации в ответ на деполяризующую инъекцию тока в одной из двух митральных клеток, проецирующихся в один и тот же клубочек мыши, у которой был удален ген СхЗб. Анатомия апикальных дендритов митральных клеток в отсутствие СхЗб была нормальной, что исключало изменение в проекционном паттерне дендритов М клеток. Затем авторы прямо измеряли электрическую связь между парами М клеток, проецирующимися в один и тот же клубочек, и обнаружили, что пары М клеток из мыши с отсутствующим СхЗб не были электрически связаны, т.е. тест «деполяризация Ml импульсация М2» был негативным, а это находилось в резком контрасте со свойствами таких же клеток в срезах от мыши дикого типа. Следовательно, экспрессия СхЗб необходима для гломеруло-специфической электрической связи митральных клеток, так же как для их скоррелированной импульсации. Ультраструктурный анализ, проведенный теми же авторами с использованием immunogold электронной микроскопии показал, что соединение, сформированное СхЗб, локализовано на дистальных дендритах М клеток в гломерулярном нейропиле. Последнее очень важно, поскольку хотя скоррелированная импульсация М-М клеток является гломеруло-специфической, общепринятый тест с помощью инъекции тока в одну из контактирующих клеток не показывает одновременного ослабленного сдвига потенциалов другой клетки. Из-за большого расстояния между клубочком и телом клетки (~ 200 ц) слабые сигналы, распространяющиеся электротонически, полностью затухают. Отсутствие такого сдвига было также продемонстрировано в наших экспериментах на внешних пучковых клетках (Hayar et al., 2004b). Этот факт может быть легко объяснен при электротонически удаленной локализации щелевых контактов от места соматической регистрации, и поэтому следовало бы ожидать, что коннексины, отвечающие за электрические контакты, должны экспрессироваться на дистальных дендритах. Второй важной находкой Christie et al. (2005) является то, что между дендритами пары митральных клеток, проецирующихся в один и тот же клубочек, синаптическое взаимодействие, опосредованное активацией АМРА-рецептора, в СхЗб-дефицитной мыши отсутствует. Ранее было показано, что потенциалы действия в М клетках вызывают выделение глутамата из дендритов, которые, в свою очередь, активируют возбудительные АМРА ауторецепторы на апикальном пучке того же самого дендрита (Schoppa and Westbrook, 2002). Активность соседних дендритов, исходящих от других нейронов, могла бы тоже изменяться под влиянием либо механических контактов при таких АМРА ответах, либо при разливе глутамата. Тот факт, что ответы на возбуждение АМРА ауторецепторов присутствуют в М клетках, но ответ не может быть вызван в соседнем дендрите, проецирующемся в тот же самый клубочек в СхЗб дефицитной мыши, подтверждает точку зрения о том, что эти клеточные контакты являются электрическими и критическим образом зависят от наличия СхЗб. Интересно, что СхЗб не требуется для всех видов синхронизированных ответов в парах митральных клеток, проецирующихся в один и тот же клубочек. Более медленная синхронизация может быть вызвана аппликацией фармакологического блокатора обратного захвата глутамата, и эти синхронные ответы не устраняются в СхЗб нокаутной мыши. По-видимому, основой синхронизации в этом случае является разлив глутамата (Christie et. al., 2005). Совершенно ясно, что экспрессия СхЗб не ограничена митральными клетками в обонятельной луковице и присутствует среди других клеток и других частей обонятельной системы, таких как ET клетки в наших экспериментах (Hayar et al., 2004b), обонятельном эпителии и вспомогательной (accessory) обонятельной системы (Zhang and Restrepo, 2003).

Систематические электронно-микроскопические исследования щелевых контактов (gap junctions) в MOB были проведены Т. Kosaka и К. Kosaka в недавней серии публикаций (2003,2004,2005а, 2005b, 2005с, 2005d; Kosaka et al., 2005). Они тщательно исследовали все слои MOB и обнаружили, что щелевые контакты присутствуют как в гломерулярной, так и в экстрагломерулярной областях. В экстрагломерулярных областях тела М/Т клеток, дендриты и начальные сегменты аксонов имели щелевые контакты и реципрокные синапсы с отростками иптернейронов, некоторые их которых были ГАМК- положительными. В клубочках щелевые контакты встречались в основном между дендритами М/Т клеток и различными типами отростков, небольшая популяция которых была идентифицирована как дендриты перигломерулярных клеток. Отростки, формирующие щелевые контакты, часто получали синапсы от окончаний обонятельного нерва, позволяя предположить, что они могут принадлежать PG клеткам 1 типа (см. ниже). Однако, большинство отростков были ГАМК-негативными и ни один из них не был ТН (tyrosine hydroxylase) позитивным; более того, анализ с помощью сериальных секций показал, что большинство тех отростков, которые формируют щелевые контакты с митральными/пучковыми дендритами, были гладкими цилиндрическими и имели очень немного пресинаптических участков, что указывает на то, что они отличались от ранее описанных (Toida et al., 1998,2000) PG клеток. Другими словами, М/Т клетки создают щелевые контакты с различными типами нейронов; мы можем только предположить, что гладкие цилиндрические дендриты принадлежат SA клеткам. Среди 30 щелевых контактов, исследованных в сериальных секциях, авторы встретили всего лишь 3 щелевых контакта между дендритами М/Т клеток одного и того же клубочка (Kosaka and Kosaka, 2004). Следовательно, следует принимать во внимание как прямое электрическое взаимодействие между дендритами М/Т клеток через щелевые контакты, так и непрямое взаимодействие между М/Т клетками через промежуточные интерпейрональные отростки. Эти авторы обнаружили, что СхЗб экспрессировался в M и Т клетках, в некоторых JG клетках и в некоторых предположительно гранулярных клетках. Множественное иммунофлуоресцентное маркирование выявило, что предположительные иптернейроны, экспрессирующие коннексин-36 в перигломеруляриой области, редко экспрессируют калбиндин, калретинин или тирозин гидроксилазу и, скорее всего, составляют химически неохарактеризованный класс нейронов. Подобным же образом нейроны, экспрессирующие коннексин-36 в слое гранулярных клеток, редко содержали калретинин, который экспрессировался во множестве предположительных GR клеток в MOB мыши (Kosaka et al., 2005).

Другим средством прямой коммуникации среди возбудительных глутаматергических М/Т клеток является так называемое разливание (spillover) глутамата. Тесно переплетенные дендриты JG клеток в гломерулярном нейропиле создают благоприятные условия для ненаправленного связывания трансмиттера с соответствующими рецепторами на любых дендритах, локализованных в непосредственной близости от места выделения. В мозгу глутамат является наиболее распространенным возбудительным трансмиттером, который опосредует сипаптическую передачу связываясь с высокоактивными NMDA (Ы-метил-О-аспортат) -рецепторами и низкоактивными АМРА (а-амипо-3-гидроесил-5-метил-4-изоксазолепропиоповая кислота) -рецепторами (Collingridge and Lester, 1989; Patneau and Mayer, 1990; Jonas and Sakmann, 1992). Было предположено, что излишек глутамата, диффундирующего из синаптической щели, может также активировать NMDA-рецепторы на соседних синапсах (Kullann and Siegelbaum, 1995; Kullann et al., 1996; Asztely et al., 1997; Barbour and Hausser, 1997; Rusakov and Kullmann, 1998). Однако, до недавнего времени имелись лишь непрямые указания на разлив глутамата достигающего внесинаптических NMDA-рецепторов. Они приводились в работах, связанных с исследованием возбудительных постсипаптических токов, вызванных возбуждением нерва (EPSCs в гиппокампе); при этом была не ясна степень, до которой разлив глутамата влияет на возбудительную передачу, поскольку вызванные раздражением нерва EPSCs в гиппокампе в основном представляют собой локальные синаптические потенциалы и характеризуют внутрисинаптическое действие глутамата. Isaakson (1999) был первым, кто открыл существенный вклад разлива глутамата М/Т клетками в активность нейронной сети MOB, где высвобождение глутамата, вызванное инъекцией тока в одной М клетке, всегда вызывало EPSC в соседней М клетке опосредованный NMDA-рецептором (но не АМРА- рецептором).

Было обнаружено, что взаимодействие между М/Т клетками, опосредованное разливанием глутамата в EPL, увеличивает возбудимость М/Т клеток, принадлежащих к различным функциональным модулям (каждый нейрональный модуль объединен единичным клубочком) (Friedman and Strawbridge, 2000; Isaacson, 1999; Nicoll and Jahr, 1982). В клубочке М/Т клетки также могут взаимодействовать посредством разлива глутамата. Одновременное возбуждение многих М/Т клеток в одном и том же клубочке приводит к возникновению долговременных деполяризаций (long lasting depolarization, LLD), регистрируемых впутриклеточно в митральных клетках (Carlson et al., 2000). Предпосылкой к открытию явления разлива глутамата было обнаружение самовозбуждения М клеток, когда выделение трансмиттера из дендритов митральной клетки могло вызывать локальную активацию глутаматных рецепторов на этой же клетке (Isaakson, 1999). В присутствии тетродотоксипа (ТТХ, блокатор Na-каналов) и бикукуллина (блокатор ОАВАд-рецептора) и в конфигурации «voltage-clamp» высвобождение глутамата вызывалось короткой (10-50 ms) ступенькой потенциала от-50 до 0 mV для того, чтобы инициировать вход ионов Са2+ через потенциалл I чувствительные Ca каналы. Медленный входной ток длительностью около 200-300 ms, который выявлялся после того, как вычитался Са2+-спайк, устранялся при аппликации APV (блокатор NMDA-рецептора), но не NBQX (специфический блокатор АМРА-рецептора), таким образом позволяя предположить, выделение глутамата этой клеткой на свои собственные экстрасинаптические NMDA рецепторы. Одновременная регистрация от двух смежных М клеток и деполяризующая ступенька тока в одной из них продемонстрировали наличие NMDA-R зависимого входного тока в другой, указывая на то, что концентрация разлитого глутамата из депдро-дендритных синапсов первой М клетки достаточна для того, чтобы активировать NMDA рецепторы на близкорасположенной второй митральной клетке. В подобных экспериментах с двойными записями от М клеток, дополненными биоцитиновыми метками регистрируемых нейронов Е. Schoppa and G. Westbrook (2001) показали, что такой опосредованный NMDA-R рецептором входной ток во второй М клетке возникает только тогда, когда обе клетки проецируют свои первичные дендриты в один и тот же клубочек. Более того, такие пары, принадлежащие одному и тому же гломерулярному модулю, показывали наличие высоко синхронизироанных колебаний мембранных потенциалов на частотах ~1 Hz при аппликации низких концентраций NMDA, а также угасающие синхронные колебания на частоте ~2 Hz после сильной стимуляции обонятельного нерва. Отсутствие подобной синхронизации между клетками, проецирующимися в разные клубочки, является хорошим доказательством того, что разлив глутамата возникает в пучках первичных дендритов митральной клетки внутри гломерулярного нейропиля, но не в EPL между смежными латеральными /вторичными дендритами. Кроме того, при увеличении внешней концентрации калия ([К+]=12шМ) в присутствии APV PG клетки демонстрировали залпы EPSC, сиихронные с колебаниями Vm в М клетках. По-видимому эти залпы EPSC отражают активацию AMPA-R на PG клетках, опосредованную одновременными разрядами многих М/Т клеток и сопутствующим разливом глутамата.

Подобным же образом, PG клетки способны к самоторможению или торможению других соседних PG клеток благодаря частичному разливу GABA (rAMK)(Smith and Jahr, 2002). Более того, в срезах MOB in vitro было показано, что несмотря на отсутствие обычных синапсов, GABA выделяемая PG клетками активирует GABAb рецепторы на ON терминалях и тормозит выделение глутамата как тонически, так и в ответ на стимуляцию ON (Aroniadou-Andrejaska et al., 2000). В этом случае вызванные раздражением обонятельного нерва EPSCs в перигломерулярных нейронах уменьшались по амплитуде на ~30%, когда стимуляции ON предшествовала постсинаптическая деполяризующая ступенька потенциала, и это уменьшение устранялось антагоиистом GABAu-рецептора (Murphy et al., 2005). То есть даже единичный импульс, приходящий по ON, приводит к выделению такого количества GABA, которого было достаточно для диффузии к ON-термииалям и активации GABAb рецепторов. В то же время, GABAb антагонисты усиливали вызванные стимуляцией ON популяционные ответы, позволяя предположить существованние тонического торможения выделения глутамата из ON постоянной фоновой активацией GABAb рецепторов непрерывно выделяемой PG клетками экстрасинаптической GABA.

Таким образом, имеется три способа коммуникации среди нейронов в одном и том же модуле в сердцевине клубочка: с помощью 1) М/Т-к-PG и PG-k-M/T глутаматных и GABA-ергических химических синапсов, 2) щелевых контактов между дендритами и 3) разлива трансмиттеров. По-видимому, все три пути взаимодействия могут быть активированы одновременно, хотя их относительный вклад может зависеть от внутриклубочковых модулирующих механизмов, включающих другие трансмиттеры гормоны так же как зависеть от уровня локального (в клубочке) или глобального (в целой MOB) возбуждения. В недавно опубликованной работе A.Hayar et al.(2005) доказано одновременное сосуществование и функционирование всех трех механизмов коммуникации нейронов в нейропиле клубочка, обусловливающие синхронизацию гломерулярного ансамбля.

Неоднородность струкруры клубочка

В сериях иммуноцитохимических исследований MOB крысы на уровне ЕМ (Kosaka et al., 1995, 1997, 1998; Toida et al., 1998,2000) было показано, что организация гломерулярного нейропиля не является однородной. Каждый клубочек состоит из двух перемежающихся зон: зоны содержащей окончания ON и зоны не содержащей ON. ON зона занята в основном ON претерминалями и терминалями, а также дендритными отростками нейронов, указывая на то, что ON зона является основным участком, где обонятельные рецепторные клетки образуют свои синапсы на своих мишенях. Дендритные отростки нейронов MOB занимают также не-ON зону, где в основном происходят дендро-дендритные взаимодействия между ними. Подобное разделение клубочка на два подпространства было также предложено другими группами исследователей. По-видимому, ON и не-ON зоны соответствуют сенсорной и центрально синаптической подобластям (Chao et al., 1997) и аксональному или дендритному отделам (Kasowski et al., 1999) соответственно. Во-вторых, перигломерулярные клетки гетерогенны как по своей структуре, так и по химическим свойствам. Было предложено (Kosaka et al., 1998; Toida et al., 1998,2000), что перигломерулярные клетки следует классифицировать на два типа, тип 1 и тип 2. PG клетки 1-го типа посылают свои внутригломерулярные дендриты как в ON, так и в не-ON зону, в то время как PG клетки 2-го типа посылают свои дендриты только в не-ON зону; таким образом, они либо не получают, либо получают очень мало синапсов от терминален ON. PG клетки 1 типа могут включать в себя GABA (y-aminobutiric acid) -иммунореактивные и ТН (tyrosine hydroxilase) -иммунореактивные нейроны. PG клетки 2 типа очевидно включают в себя calbindin (СВ) и calretinin (CR) -иммунореактивные нейроны. Другими словами, в случае, когда PG клетки определены химически, различные группы PG клеток имеют разные дендритные ветвления и синаптические контакты с ON терминалями. Возникает вопрос: каковы их взаимоотношения с М/Т клетками? В тщательном исследовании ЕМ Kosaka et al. (2001) продемонстрировали, что внутригломерулярные дендриты М/Т распределены равномерно как в ON-содержащих, так и в не-ON зонах, и что контакты между PG и М/Т клетками распределены по обеим зонам в более или менее мозаичном порядке.

Таким образом, комбинация недавно проведенных структурных и физиологических исследований на клеточном уровне начала выявлять тот факт, что нейрональная организация GL и MOB в целом может быть более сложной, нежели это ранее считалось. Суммируя свои результаты Т. Kosaka и К. Kosaka сформулировали шесть пунктов структурной организации клубочка у мыши, крысы и других млекопитающих, а именно: (1) химическая гетерогенность PG клеток; (2) блочная организация клубочка, при которой каждый клубочек состоит из двух подпространств, ON зоны и не-ON зоны; (3) гетерогенность PG клеток в смысле их структурных и синаптических особенностей, где PG клетки 1-го типа посылают свои внутригломерулярные дендриты как в ON, так и в не-ON зоны, в то время как тип PG клетки 2-го типа посылают свои внутриклубочковые дендриты только в не-ON зону, таким образом получая либо несколько синапсов от окончаний 0N, либо вообще не получая их; (4) пространственное взаимоотношение дендритных отростков М/Т с окончаниями 0N и дендритами PG клеток; (5) комплексные нейронные взаимодействия через химические сииапсы и щелевые контакты в клубочке; и (6) сравнительные аспекты организации в MOB у разных видов животных.

Кроме того, что клубочек разделен на два подпрстранства, таких как зона, содержащая 0N и зона, не содержащая 0N внутри нейроналыюго нейропиля, он еще покрыт лепестками отростков глиальных клеток, а следовательно защищен от быстрой диффузии химических веществ через границу клубочка (Chao et al., 1997). Нейропиль также включает в себя обернутые глиальными клетками подотделы, которые содержат пучки ветвей, исходящих из первичного дендрита М/Т клеток (Kasowsky et al., 1999). Такой тип блочного устройства, с одной стороны, обеспечивает ограничение распространения трансмиттера между дендритами после того, как он был разлит из места выделения, и, с другой стороны, под держивает высокую концентрацию трансмиттера в таких подотделах. Таким образом, кажется маловероятным, что временное увеличение концентрации глутамата внутри клубочка является гомогенным; скорее можно предположить, что разлитый глутамат присутствует в некоторых локальных пулах (Schoppa and Westbrook, 2001). Регенеративные выделения трансмиттера обеспечивают механизм для того, чтобы вызывать появление высоких локальных концентраций внутри каждого изолированного подотдела, причем возбуждение может переходить на другие подотделы благодаря электротоническому распространению деполяризации в дендрите митральной клетки и цепной рекции добавочного выделения трансмиттера . Таким образом, распространение возбуждения через весь клубочек может быть усилено, потому что каждый подотдел содержит дендриты от нескольких М/Т клеток. По сравнению с GL в EPL содержится меньше глиальных складок, которые окружают вторичные дендриты М/Т клеток, поэтому эффективность М/Т-на-М/Т взаимодействий в EPL должна быть намного слабее. Это подчеркивает роль клубочка как главной структуры объединяющей и синхронизирующей возбудительные нейроны посредством разлива глутамата.

Мсжгломсрулярные связи

Было известно, что возбуждающие взаимодействия внутри таких слоев MOB как EPL, MCL и GRL обеспечиваются также аксонными коллатералями М/Т клеток (Kishi et al., 1984; Orona et al., 1984). В то же время считалось, что нейрональные ансамбли отдельных клубочков никак не взаимодействуют друг с другом внутри гломерулярного слоя. В противоположность этому взгляду, мы показали, что локализованные в GL иптернейроны, так называемые "коротко-аксонные клетки", имеют длинные аксоны исключительно в пределах GL и при этом являются глутаматэргическими; было предположено, что эти аксоны SA клеток (длиной более 1000 мкм) обеспечивают возбудительные межгломерулярпые связи, идущие через половину MOB по ее продольной оси (Глава 4 диссертации) (Karnup et al., 2001; Aungst et al., 2003; Puche et al., 2002,2003). Нами была впервые показана спонтанная синхронизация между гломерулярными ансамблями в срезах MOB, обеспечиваемая, по-видимому, сохранившейся частью сети SA нейронов (Глава 5 диссертации).

Нсйрогенез в MOB

Важное различие между проекционными М/Т нейронами и локальными (PG и GR) интернейронами, заключается в том, что PG и GR клетки генерируются в течение всей взрослой жизни, в то время как M и Т клетки дифференцируются препатально. Клетки -предшественники, из которых в дальнейшем разовьются PG и GR нейроны, постоянно образуются при делении стволовых клеток эпендимы латеральных желудочков (subventricular zone, SVZ). Затем они продвигаются по ростральному миграционному пути, идущему от желудочка к центру ипсилатеральной обонятельной луковицы, а достигнув MOB двигаются перпендикулярно ее оси достигая EPL (90%) и GL (10%), где останавливаются и дифференцируются, превращаясь в гранулярные, перигломерулярные и глиальные клетки (Kishi et al., 1984; Luskin, 1993; Lois et al., 1996). Продолжающийся генез и миграция этих нейронов предполагают, что реконструкция в локальной синаптической сети MOB происходит непрерывно и сопровождается реконструкцией синаптических контактов между сенсорными нейронами и нейронами MOB внутри клубочка. Поскольку слаженная работа всех подсистем в MOB чрезвычайно важна для ее нормального функционирования, дисбаланс тормозных PG/GR и возбуждающих М/Т популяций может приводить к патологической активности и к утере способности различения запахов. Такая разбалансировка возможна, например, при попадании в MOB вредоносных агентов, приводящих к повреждению или разрушению нервной сети. В связи с этим нами высказана гипотеза о барьерной роли MOB и функциональном значении непрерывного иейрогенеза в ней (Лосева и Карнуп, 2004).

Знание нормальной физиологии как зрелых, так и вновь образуемых PG и GR нейронов является необходимым для понимания функциональной значимости MOB, поскольку это те два клеточных типа, которые 1) обеспечивают возвратное торможение в MOB, модулируя входные сигналы, и 2) участвуют в продолжающемся процессе замещения погибающих нейронов вновь дифференцированными нейронами, которые развились из мигрировавших клеток-предшественников субэпендималыюй зоны. Процесс встраивания новых элементов в непрерывно функционирующую нейронную сеть MOB начал недавно интенсивно исследоваться (Gheusi et al., 2000; Beluzzi et al., 2003; Carleton et al., 2003; Kato et al., 2000; Lledo and Gheusi, 2003; Ledo and Saghatelyan, 2005; Lledo et al., 2004; Lledo et al., 2005).

Как было показано, среда, обогащенная запахами, увеличивает число вновь образованных нейронов в MOB взрослых животных и улучшает память на запахи (Rochefort et al., 2002). Инъекция бромодиоксиуридина (BrdU), захватываемого только митотически делящимися клетками, проводилась в двух группах мышей для того, чтобы обнаружить пролиферацию среди клеток-предшественников в суб-вентрикулярной зоне и для того, чтобы проследить их выживание в MOB. Через 4 часа после единичной инъекции число меченных BrdU нейронов было одинаковым как у контрольных животных, так и у мышей, содержавшихся в обогащенной среде. Напротив, число выживших прогениторных клеток через 3 недели после инъекции BrdU было значительно увеличенным у животных, живших в обогащенной среде. Этот эффект был специфическим, поскольку обогащенная запахами среда не влияла на гиппокампальный иейрогеиез. В добавок к этому, взрослые мыши, содержавшиеся в клетках, обогащенных запахами, показывали улучшенную обонятельную память без изменения пространственного обучения. Таким образом, посредством поддержания постоянного обмена гранулярных и перигломерулярных клеток, подвергающегося модуляции со стороны окружающей среды, бульбарный нейрогенез может быть связан с улучшением обонятельной памяти. В экспериментах с противоположным подходом, а именно, с ограничением сенсорных входов к обонятельной луковице, смертность клеток увеличивалась, а пролиферация стволовых клеток в субвентрикулярной зоне взрослых мышей усиливалась (Mandairon et al., 2003). Последнее позволяет предположить, что обонятельные входы необходимы для выживания вновь образованных нейрональных предшественников. Для того, чтобы изучить вопрос о функциональных последствиях постоянной генерации, дифференциации и интеграции новых нейронов в существующие цепи MOB группа Р.-М. LIedo использовала нокаутную мышь с удаленным геном адгезии нервных клеток; у этих мышей имелся выраженный дефицит миграции предшественников ольфакторных нейронов, приводящий к -40% уменьшению размера этой структуры (Gheusi et al., 2000). Они продемонстрировали, что это уменьшение ограничено исключительно слоем гранулярных клеток. В поведенческих экспериментах эти мутантные мыши показали, что специфическое уменьшение популяции вновь образованных GR клеток приводило к ухудшению различеиия между запахами. И наоборот, как порог детекции запахов, так и кратковременная память были неизменными, показывая, что критическое количество бульбарных гранулярных клеток является решающим только для дискриминации запахов, но не для общей обонятельной функции.

В настоящее время известны две зоны зрелого мозга, содержащие стволовые клетки : субвентрикулярная зона (subventricular zone, SVZ) и зубчатая фасция гиппокампа (dentate gyrus, DG). В экспериментах с пространственным (т.е. зависящим от гиппокампа) обучением и высокой физической активностью было показано, что увеличенная пролиферация в той или другой зоне является специфичной и зависит от характера задания (Brown et al., 2003). Маркирование BrdU делящихся клеток не обнаружило какой-либо разницы ни в числе вновь образованных предшественников в стенке латерального желудочка, ни в числе генерируемых гранулярных клеток в обонятельной луковице. Однако, произвольные пробежки или пространственно обогащенная среда приводила к удвоению числа вновь образованных гиппокампальных гранулярных клеток. Такая зависимость усиления нейрогенеза в обонятельной луковицей или зубчатой фасции от специфики функциональной нагрузки позволяет предположить, что условия жизни запускают локально либо в SVZ, либо в DG какой-то еще не идентифицированный механизм, приводящий к появлению нейрогенных сигналов "по требованию ". Было предположено, что не только нейрогенез зависит от степени сенсорной нагрузки, но также что новые нейроны вносят уникальные черты в действующую нейрональную сеть, позволяя осуществлять постоянную настройку обработки информации в ответ на все время изменяющийся внешний мир (Lledo and Saghatelyan, 2005).

Популяционная активность в MOB

Межнейрональные взаимодействия во время нормальной или экспериментально вызванной активности обонятельной системы приводят к нескольким различающимся паттернам популяционной активности в MOB. Низкочастотная ритмическая импульсация характерна для вызванных запахом ответов в обонятельной системе большого числа видов животных (Adrian, 1950; Gelperin and Tank, 1990; Delaney and Hall, 1996; Friedrich and Laurent, 2001; Vickers et al., 2001). В MOB млекопитающих запах в основном возбуждает медленные ~2 Hz колебательные ответы в М клетках (Chaput and Holley, 1980,1985; Sobel and Tank, 1993; Kay and Laurent, 1999; Rubin and Kata, 1999; Margrie et al., 2001) с характеристиками ответов, зависящими от глубины наркоза экспериментального животного. Интерпретация факторов, которые влияют на низкочастотные паттерны активности у млекопитающих до сих пор остаются противоречивыми. В то время, как флуктуации концентрации запаха в обонятельном эпителии во время дыхательного цикла должны вносить вклад в создание этой ритмики, внутренние механизмы MOB также, скорее всего, должны быть вовлечены. Например, потенциалы действия в отвечающих на запах митральных клетках подавляются во время фазы выдоха во время дыхания (Chaput and Holley, 1980), что лучше всего может быть объяснено гиперполяризацией митральных клеток. В добавок к этому, во время одиночного дыхательного цикла могут возникать две фазы возбуждения митральной клетки (Onoda and Mori, 1980; Meredith, 1986; Buonviso et al., 1992). Такой паттерн можно было бы ожидать, если существуют собственные колебания клеток, которые в основном настроены на фазный сенсорный выход. Медленные (~2 Hz) деполяризации М-клетки, которые вызваются сильной электрической стимуляцией соответствующего клубочка (Schoppa and Westbrook, 2001), могут быть аналогичны вызванным запахом осциллирующим ответам, регистрируемым в клубочках MOB кролика (Leventeau and MacLeod, 1966).

Кроме медленных оссциляций, MOB млекопитающих также отвечает на запахи быстрыми ß- (15-35 Hz) и у- (40-75 Hz) колебаниями (Adrian, 1950; Bressler and Freeman, 1980; Chabaud et al., 2000; Neville and Haberly, 2003). Было предположено, что эти частоты генерируются активностью локальных дендро-дендритных цепей между митральными и гранулярными клетками в EPL (Rail and Shepherd, 1968). Натриевые проводимости клеточной мембраны также могут вызывать быстрые спонтанные колебания в митральной клетке (Desmaisons et al., 1999). Неясно, могут ли синхронные медленные колебания работать вместе с наложенными на них быстрыми колебаниями. В этом случае такое наложение может делать максимальным постсинаптический ответ на вход от митральных клеток в обонятельной коре. Например, медленные колебания могут служить для того, чтобы группировать спайки во время ~100 ms пика деполяризации, в то время как быстрые колебания могли бы синхронизировать спайки более точно. С другой стороны, р-у-колебания в MOB могут отражать качество кодирования запаха (Nusser et al., 2001) или они могут также быть связаны с памятью (Ravel et al., 2003) и зависящими от опыта явлениями, такими как ожидание (Kay et al., 1996). В последнем случае тормозные нейроны, такие как гранулярные клетки, служили бы в качестве мишени корковой обратной связи для того, чтобы модифицировать активность луковицы на основании изменений ожидания и состояния (Freeman, 1978). Тогда следует ожидать, что исчезновение нормальной тормозной функции интернейрона не окажет сильного эффекта на различение простых запахов. В самом деле, в экспериментах на молодых (~7 дней) крысах со слабо развитой интернейронной популяцией в MOB (Rosselli-Austin and Altman, 1979; Mair et al., 1982) локальные полевые потенциалы показали отсутствие заметных у-колебаний, вызванных запахом, которые наблюдались у взрослых животных (Fletcher et al., 2005). Однако, при этом запаховые рецептивные поля М/Т клеток и поведенческое различение запахов значительно не менялось, несмотря на известные существенные изменения в локальных цепях и нейронных популяциях. Это позволяет предположить, что высокочастотные колебания локальных полевых потенциалов, т.е. быстрая колебательная популяционная активность, не отражает процессов, критичных для дискриминации простых запахов. Это также подтверждает предположение о том, что генерация полевых потенциалов р-у-частот является внутренним свойством обонятельной луковицы и критическим образом зависит от созревания интернейрональной популяции.

В срезах MOB крысы V. Aroniadou-Anderjaska et al. (1997) показала, что в GL полевой потенциал, вызванный стимуляцией ON, состоит из раннего компонента, опосредованного каинатпыми/АМРА рецепторами и позднего, пролонгированного компонента, опосредованного NMDA рецепторами. Хирургическая изоляция GL от более глубоких слоев MOB не влияла на NMDA компонент, в то же время, она приводила к небольшому изменению амплитуды и укорачивала продолжительность каинатного/АМРА компонента. Эти результаты позволили авторам предположить, что NMDA компонент генерировался исключительно гломерулярными токами, в то время как на каинатный/АМРА компонент до некоторой степени влияли токи гранулярных клеток в EPL. В своей следующей работе, используя CSD-анализ (current-source density analysis) во время стимуляции ONL V. Aroniadou-Anderjaska et al. (1999b) показала, что нейрональными элементами, генерирующими гломерулярные синаптические токи, являются апикальные дендритные пучки М/Т клеток. Это заключение основывалось на

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА 41 том наблюдении, что как AMPA-R так и NMDA-R опосредованные токи гломерулярного стока (зона активной деполяризации/возбуждения) претерпевала реверсию в EPL и MCL, где расположены проксимальные дендриты и сома М/Т клеток.

Такое же заключение об М/Т дендритной активности, создающей продолжительный гломерулярный сток в MOB кролика, был сделан в экспериментах in vivo (Martinez and

Freeman, 1984). Однако, обе группы авторов основывали свои заключения па предположении, что гломерулярный сток может генерироваться только нейронами, которые получают фокальный синаптический вход в GL и их отростки распространяются в EPL и MCL, другими словами, только нейронами, создающими длинные электрические диполи, способными к обращению фазы генерируемого полевого потенциала. Также постулировалось, что JG клетки не способны вносить заметный вклад в регистрируемые полевые потенциалы GL, поскольку они не проецируют свои дендриты в EPL и поэтому не имеют достаточных допольных моментов, а следовательно маловероятно, чтобы генерируемые JG клетками синаптические токи вносили значительный вклад в полевой потенциал (Mori, 1987;

Shipley et al., 1996; Rail and Shepherd, 1968). Наши данные доказали, что эти заключения неправильны и что JG клетки одиночного клубочка способны генерировать значительное внеклеточное поле внутри сердцевины клубочка (Глава 5 диссертации; рукопись статьи о спонтанных гломерулярных полевых потенциалах послана в Journal of Neurophysiology). Более того, наше компьютерное моделирование полевого потенциала, генерируемого в гломерулярном нейропиле одиночным гломерулярным модулем, оценивает вклад митральных клеток в общее поле как всего лишь ~10%, в то время как вклад JG клеток оценивается как ~50%. Таким образом, общепринятый взгляд на М/Т клетки как на основных участников регистрируемой в GL популяционпой активности оказался лишь частным случаем, проявляющимся благодаря одновременному появлению параллельных слоев множественных стоков (GL) и источников (EPL/MCL), синхронизированных вызванного стимуляцией одновременного возбуждения большого числа клубочков.

В виду вышеизложенного, изучение функциональных особенностей GL, как системо-образующего слоя обонятельной луковицы организующего нейроны разных типов в четко очерченные структурные модули, представляется ключевым для понимания самого первого этапа обработки обонятельной информации в ЦНС. Предпринятый нами цикл работ был направлен на комплексное исследование нейроналыюй организации GL, включающее детали морфологии и их корреляцию с физиологическими характеристиками нейронов, взаимодействие нейронов в ансамблях, а также взаимодействие ансамблей в срезах MOB in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Приготовление срезов

Крысы линии Sprague Dawley (возраст 21-29 дней) обоего пола анастезировались с помощью хлорал гидрата и декапитировались в соответствии с Правилами Заботы о Животных Национального Института Здоровья (NIH, USA). Обонятельная луковица извлекалась и погружалась в холодную (4°С), искусственную церебро-спинальпую жидкость (sucrose-aCSF), уравновешенную газовой смесью 95% 02-5% С02, pH 7.38. Caxapo3a-aCSF имела следущий состав (в шМ): 26 NaHCOj, 1 NaH2P04, 2 KCl, 5 MgS04,0.5 СаС12, 10 глюкозы, и 248 сахарозы. Горизонтальные срезы (400 цт толщиной) нарезались микрослайсером (Ted Pella, Redding, CA). После периода восстановления при 30°С в течении 15 мин, срезы затем инкубировались при комнатной температуре (22°С) в aCSF, насыщенной газовой смесью (95% Ог-5% СОг, состав aCSF (в шМ): 124 NaCl, 26 NaHC03, 3 KCl, 1.25 NaH2P04, 2 MgS04, 2 СаС12, и 10 глюкозы) до тех пор, пока срез не был использован. Для записи нейронов в режиме «whole cell» единичный срез помещался в регистрационную камеру, где он поддерживался в погруженном состоянии и непрерывно перфузировался при скорости протока 1.5 ml/мин нормальной aCSF, насыщенной карбогеном (95% 02 и 5% СОг). Все записи выполнялись при 30°С. Нейроны визуализировались с помощью микроскопа (BX50WI; Olympus Optical, Tokyo, Japan), оборудованным для эпифлуоресценции и инфракрасного дифференциально интерференционного контраста (DIC).

При изучении популяционных событий были использованы три типа срезов. 1) Контрольные срезы были общепринятыми 400 цт горизонтальными срезами, параллельными основанию MOB (Рис. 1В). 2) Изолированные сегменты гломерулярного слоя вырезались из 400-цт или 200-цт горизонтального среза (Рис. 1С); как вариация изолированного GL в нескольких горизонтальных срезах был сделан продольный срез в EPL между GL и MCL. 3) Тангенциальные 400-цтсрезы делались из медиальной стороны MOB, при этом они содержали слой обонятельного нерва и гломерулярный слой (Рис.Ш). Немедленно после приготовления срезы помещались на 15-20 мин в нормальную aCSF при 30°С для восстановления; aCSF была насыщена газовой смесью (95% 02 - 5% С02) и имела состав в гаМ: 124 NaCl, 26 NaHCOj, 3 KCl, 1.25 NaH2P04,2 СаС12, 1.7 MgS04, и 10 глюкозы. Затем все срезы перемещались на сетку в регистрационную камеру интерфейсного типа, где они содержались на протяжении всего эксперимента при t° = 32°С, скорости протока ACSF 3 ml/мии и постоянному протоку увлажненного карбогена над срезами.

МС1 во.

В <£—

ОМ

--

Л-» " ] М Ь о <£-\

Рис. \.А Схема слоев обонятельной луковицы ОЫ - обонятельный нерв. вЬ - гломеруляриый слой. ЕРЬ - внешний плексиформный слой. МСЬ -слой митральных клеток. вСЬ - слой гранулярных клеток. Пунктирные круги в вЬ обозначают границу между гломерулярным нейропилем и окружающими его телами Ю клеток. В левом клубочке показаны только дендриты JG клеток, ветвящиеся внутри клубочка. В центалыюм клубочке показаны только дендритные ветвления М/Т клеток. Вторичные дендриты Т клеток и латеральные дендриты М клеток в ЕРЬ усечены. В - /) Препараты срезов обонятельной луковицы. В -горизонтальный срез МОВ. (ЖЬ - слой обонятельного нерва. вЬ -гломеруляриый слой. ЕРЬ - внешний плексиформный слой. МСЬ - слой митральных клеток. вСЬ - слой гранулярных клеток. С— изолированный сегмент гломерулярного слоя из горизонтального среза. Ь -Тангенциальный срез СЬ+(ЖЬ, сделанный из медиальной поверхности МОВ (вЬ сверху с подлежащим (Ж). Записи производились от мест, не имеющих остатков ЕРЬ.

Электрофизиология

Для изучения свойств JG клеток и межнейрональных взаимодействий мы использовали методы «current-clump» и «voltage-clamp» при конфигурации «whole cell». Микроэлектроды изготовлялись из капилляров боросиликатного стекла с внутренним филаментом (внешний диаметр 1.5 mm; Clark Electromedical Instruments, Kent, UK) на пуллере (P-97; Sutter Instruments, Novato, CA). Для регистрации «voltage-clump» микроэлектроды заполнялись раствором следующего состава (в mM): 114 K-gluconate, 17.5 KCl, 4 NaCl, 4 MgCl2,10 HEPES, 0.2 EGTA, 3 Mg2ATP, 0.3 Na2GTP, 0.02% Lucifer желтый, и 0.2% биоцитин (Molecular Probes, Eugene, OR). Микроэлектроды для «current-clump» записей заполнялись внутриклеточным раствором, содержащим (гаМ): 144 К-глюконат, 2 NaCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, 0.2 EGTA, 3 Mg2-ATP, 0.3 Na2-GTP и 0.2% биоцитин гидрохлорид (270 mOsm, pH 7.3), что давало 5-8 MQ DC-сопротивление в растворе. Внеклеточные регистрации проводились с помощью таких же микроэлектродов, заполненных aCSF. В этом случае сопротивление микроэлектрода было также 5-8 МО.Запись в режиме «whole-cell voltage clamp» проводились с помощью усилителя Axopatch-200B amplifier (Axon Instruments, Foster City, CA). Двойные записи выполнялись с использованием двух таких усилителей. Жидкостной контактный потенциал, составлявший 9-10 mV, не вычитался из всех измерений потенциалов. В наших исследованиях учитывались только нейроны с последовательным . сопротивлением не более -30 MQ, компенсация последовательного сопротивления микроэлектрода не выполнялась. Входное сопротивление регистрируемых нейронов измерялось при -60 и -70 mV. Электрическая стимуляция (Grass S8800 stimulator; Astro-Med, West Warwick, RI) выполнялась с помощью биполярного электрода, состоящего из двух стальных проволочек (50 цт в диаметре; А-М Systems, Everett, WA), изолированных вплоть до кончиков. Для стимуляции использовались импульсы постоянного тока 10-200 цА и длительностью 100 jisec. Для сравнения латентностей ответов различных JG клеток на стимуляцию ON, стимулирующий электрод располагался в слое ON на100-150 цт каудальнее регистрируемого клубочка. При изучении межгломерулярных взаимодействий JG клетки регистрировались в горизонтальных MOB срезах при стимуляции гломерулярного слоя (ЮО-300/iA) на расстоянии 3-4 клубочка от точки регистрации; ONL между точками стимуляции и регистрации был рассечен перпендикулярно гломерулярному слою. Для регистрации митральных клеток мыши горизонтальные срезы мышинных MOB (350цМ) готовились с двумя разрезами, перпендикулярному гломерулярному слою, проходящими через

ONL и через все глубокие слои (от EPL до гранулярного слоя), оставляя интактным только гломерулярный слой (Рис. 34а). Митральные клетки с ростральной стороны разрезов регистрировались в режиме «whole-cell current clamp» (Vm = 70mV для предотвращения генерации спайка). ONL стимулировался ростральнее разрезов, а межгломерулярные связи стимулировались вторым электродом, расположенным в GL каудальнее этих разрезов. Обонятельный нерв стимулировался с или без последующей стимуляции (задержка 200 ms) в удаленном клубочковом слое. Этот интервал позволял изучать межклубочковые цепи без учета пресинаптических эффектов, вызванных стимуляцией обонятельного нерва (Aroniadou-Andeijaska, V., Zhou, F. М., Priest, С. А., Ennis, М. & Shipley, М. Т., 2000). Интенсивность стимуляции обонятельного нерва была минимальной для того, чтобы активировать LLD в 100% случаев (80-300jiA, 0.1ms, 0.2 Hz). Интенсивность стимуляции гломерулярного слоя была 300-500|дА. Ответы на, по-крайпей мере, 20 стимулов в каждом состоянии усреднялись и измерялась область под кривыми потенциалов (интегральный ответ). Статистическая значимость проверялась по критерию Стыодента (все значения представлены как средние ± s.e.m.(стандартная ошибка)). После регистрации биоцитин визуализировался с помощью стрептавидина-СуЗ (Jackson) или полнота разрезов проверялась с помощью липофильных трейсеров. DiA, Dil и DiD инъецировались в ONL, клубочковый слой и EPL соответственно, и инкубировались при 30°С в течении недели.

Для изучения популяционных событий мы использовали регистрацию полевого потенциала из нескольких точек с комбинацией «whole-cell» регистрацией от митральной клетки в срезах, помещенных в интерфейсную камеру. Перед регистрацией срезы помещались в интерфейсную камеру и оставлялись там на 1 час для адаптации при 32°С, и скорости суперфузии 3 ml/мин (ACSF насыщена карбогеном).Поверх срезов постоянно поддерживался поток увлажненного карбогена. Пипетки для внеклеточных и «whole-cell» микроэлектродов вытягивались из боросиликатных капилляров с внутренним филамептом (1.5 mm внешний диаметр., Clark, Kent, UK) на пуллере (Р-97, Sutter Instrument Company, Novato, CA). Пипетки для регистрации полевых потенциалов имели размер кончика 2 цт, заполнялись ACSF и имели DC-сопротивление около 3-5 MÍ2 в растворе. Полевые потенциалы регистрировались с помощью DP-301 усилителей (Warner Instrument Corp.); полоса пропускания усилителей во время регистрации была установлена 0.1 Hz - 1 kHz. Вызванные полевые потенциалы вызывались с помощью стимулятора GRASS S8800 (Astro-Med, West Warwick, RI) и биполярного вольфрамового электрода (размер копчика 20 Jim). Место стимуляции располагалось на 100-200 цт ростральнее регистрируемого клубочка.

Как и во всех исследованиях на срезах, возможно, что некоторые электрофизиологические свойства JG клеток отличаются от таковых in vivo из-за различий в температуре, сенсорном входе и нерохимическом составе.

Фармакологические агенты

Нейротропные реагенты, а также растворы различного ионного состава подавались в перфузионную камеру переключением трех ходовой электронной системы. Блокаторы натриевых каналов тетродоксин (ТТХ) и А'-этил бромид четвертичная соль (QX-314), блокаторы ОАВАд-рецептора бикукуллин-метохлорид (BIC) и габазип (SR95531), блокатор АМРА-рецептора 6-циано-7 нитроквиноксалин-2,3-дион (CNQX), блокатор NMDA-рецептора (±)-2-амипо-5-фосфопентаиоик кислота (APV) или 0-(-)-2-амино-5-фосфопентаноик кислота (D-AP5) приобретались в Research Biochemicals (Natick, MA). 2-Метил-6 (фенилетинил) перидин гидрохлорид (МРЕР), 7 (гидроксиимуно) циклопропа[Ь]хромен-лакарбоксилат этил эстер (CPCCOEt), и (2S)-2-aMHiio-2-[(lS,2S)-2- карбоксициклопроп-1-ил]-3 (ксан-9-ил) пропаноик кислота (LY 341495) приобретались в Tocris Cookson (Ellisville, МО).

Гистология

После извлечения электрода из клеток срезы фиксировались в 4% парафармальдегиде и сохранялись для гистологической обработки. Выявление заполненных биоцитином нейронов было описано ранее (Hayar et al. 2004а, 2004b; Karnup and Stelzer, 1999). Вкратце, фиксированные срезы заключались в 10% желатин и на вибротоме из них изготавливались 80 цш секции. Свободно плавающие секции обрабатывались 1% Н2О2, 0.5% Тритоном X 100, комплексом ABC и Ni-DAB хромагеном. После дегидрадации секции заключались в DPX (смесь дистирена, трикрезил фосфата и ксилепа). Двухмерная реконструкция заполненных нейронов производилась с помощью пакета программ Neurolucida (MicroBrightField, Colchester, VT).

Для того, чтобы оценить, сколько JG и Т клеток связаны всреднем с одним клубочком, было зафиксировано 5 срезов после 1-2 часовой инкубации, затем каждый срез был порезан на 60 цш секции и зрелые нейроны были выявлены с помощью антитела NeuN. В определенных сегментах медиальной стороны MOB (Рис.397) (приблизительно 2/3 длины ОВ) все хорошо окрашенные клетки подсчитывались в GL и ЕРЦбледно окрашенные клетки не учитывались, поскольку они могли быть либо погибающими в процессе инкубации или незрелыми нейронами, развивающимися из предшественников, мигрирующих в GL через EPL из рострального миграционного потока. После ЗО-реконструкции сегмента подсчитывалось число JG и Т клеток, приходящихся на один клубочек в данном срезе, затем было подсчитано среднее число клеток по всем срезам.

Инъекции трейсеров

Для изготовления меток в целом мозге с помощью липофильного красителя Dil, взрослые (5 недель) мыши (CD-I и трансгенные GAD65-GFP) и крысы (Sprague-Dawley) наркотизировались (150 мг/кг Нембутала) и транскардиально перфузировались 4% парафармальдегидом в 0.1 M фосфатном буфере (PFA; pH 7.4). Затем мозг вынимался и в единичный клубочек каждой MOB ионофоретически инъецировалось Dil (1мг/мл в этаноле, 0.5-2.0цА, диаметр кончика 1.5цт). Мозг инкубировался при 23°С в PFA в течение 2 недель, далее изготовлялись сериальные коронарные секции (бОцгп), они инкубировались в 20 nM Sytox Green (Molecular Probes) в PBS в течение 30 мин (CD1 и крысы) и заключались в среду DABco, накрывались покровным стеклом. Для окрашиваия Dil в парасагитальных поверхностных срезах, мозг взрослых мышей удалялся, рассекался пополам и помещался в агарозу медиальной поверхностью параллельно плоскости вибротома. Единичная 350цш секция срезалась с медиальной поверхности каждой MOB и помещалась в регистрационную камеру, перфузируемую искусственной церебро- спинальной жидкостью (ACSF), содержащей 120mMNaCl, 8mM KCl, 1.3mM CaCl2,1.3mM MgS04, lOmM глюкозы, 25mM NaHC03 и 5mM BES, и насыщенной 95% Ог/5% СО2. Этот «поверхностный срез» содержал целиком медиальную стенку ONL, гломерулярный слой и часть EPL. Dil ионофоретически инъецировалась в единичный клубочек, срез инкубировался при 23°С в PFA в течение 2 недель, далее нарезался на секции (50цш в саггитальной плоскости) и окрашивался с помощью Sytox. При окрашивании микробусинами в целом мозге взрослая CD-I мышь анастезировалась и 10-20 ni меченных родамином микробусипок (Lumafluor; 1:2 разведение в солевом растворе) инъецировались в медиальный гломерулярный слой левой MOB (стереотаксические координаты 4.28mm Bregma, 1.02mm глубина, 0.12mm латералыю). Инъекционная пипетка располагалась 4.8mm латералыю и 55° над правой MOB и продвигалась через правую MOB в гломерулярный слой левой MOB (1.25mm от поверхности правой MOB). Через одну неделю мыши были транскардиально перфузированы парафармальдегидом и мозг нарезался на сериальные секции (40цт в коронарной плоскости) и окрашивался с помощью Sytox.

Секции визуализировались при высоком увеличении и расположение тел помеченных JG клеток отмечалось с помощью камеры Lucida. Рострокаудальное расстояние (ось z) каждой клетки измерялась как номер секции, а дорзовентральная (ось х) и медиолатеральная (ось у) координаты автоматичкски измерялись с помощью Image Processing Toolkit (Reindeer Graphics). Эти координаты были исползованы для построения графиков обратной кумулятивной вероятности нахождения клетки в зависимости от расстояния до точки инъекции с помощью пакета программ Excel. Статистическая значимость проверялась с помощью анализа дисперсии (ANOVA; Scheffe's post hoc test; все значения представлены как среднее ± s.e.m.). Поверхность каждой MOB была представлена как открытый лист с помощью прослеживания клубочкового слоя каждой секции и раскрывания его в уплощенном листе.

Оптическая регистрация

Для того, чтобы обнаружить распространение популяционной активности в срезе мы использовали оптическую регистрацию и потенциал-чувствительные зонды. Изменения мембранных потенциалов визуализировались с помощью потенциал-чувствительного красителя RH414 (Molecular Probes) (Kauer, J.S., Senseman, D.M. & Cohen, L.B., 1987; Kauer, J.S., 1988).

Поверхностные срезы готовились из 5-6-недельных мышей. Обонятельный нерв был заранее необратимо разрушен нанесением на носовой эпителий ZnSÛ4 (Kawano, T. & Margolis, F.L., 1982) за 8-12 дней перед изготовлением срезов. Для того, чтобы подтвердить полноту разрушения носового эпителия, несколько мышей были трапскардиалыю перфузированы 4% фармальдегидом, и носовые полости орошены 5mg/ml DiD в этаноле, проинкубированы при 30°С в течении 2 недель, нарезаны на секции и использованы для гистологических препаратов.

Поверхностные срезы инкубировались при постоянном протоке ACSF в течении 30 мин при 30°С, а затем в течении ЗОмин при 23°С в 200цМ RH414 в ACSF, и далее перенесены в регистрационную камеру при 23°С. Цифровые снимки делались с частотой 2 kHz с помощью х10 водно эммерсионного объектива, камеры NeuroCCD и анализировались с помощью пакета программ NeuroPlex (RedShirtlmaging). Срезы освещались стабилизированной 150W Xenon лампой (Opti-Quip) с выдержкой, регулируемой электронным затвором (Uniblitz, Vincent Associates). Стимулы постоянного тока (ЮО-ЗООцА) подавались через биполярный стимулирующий электрод.

Анализ данных

Аналоговые сигналы в полосе пропускания 0- 2 kHz (Axopatch 200В), с частотой опроса 5-10 kHz записывались на жесткий диск компьютера. Обнаружение событий (впеклеточно регистрируемые спайки и внутриклеточно регистрируемые EPSCs) выполнялись «offline», используя программу MiniAnalysis (Synaptosoft, Decatur, GA). Время появления событий записывалось в American Standard Code for Information Interchange (ASCII) файлы и импортировалось в пакет программ Origin 7.0 (Microcal Software, Northampton, MA) для дальнейшего анализа с использованием алгоритмов, написанных в LabTalk. Коэффициент вариации (CV) беспачечных интервалов и автокоррелограммы импульсного потока (bin, 1 или 2 msec) были получены с использованием 5-10 мин сегментов данных.

Вычисление кросс-коррелограмм для потока событий (bin = 1 или 2 msec) проводилось по фрагментам записей длительностью 5-10 мин. Для того, чтобы сравнить степень корреляции в различных парах нейронов, или в одной и той же паре при различных состояниях, кросс-коррелограммы нормировались на частоту импульсации обеих клеток, ширину шага квантования и длительность записи (Мапп-Metzer and Yarom, 1999). Таким образом, корреляционный коэффициент (С) указывает на вероятность того, насколько часто одна из клеток разряжается синхронно с другой клеткой по сравнению со случайным совпадением спайков (С=1). Кросс-коррелограммы нормировались делением числа событий в каждом бине (шаге квантования) на коэффициент (/V), которое является числом событий, случайно появляющихся в одном бине: N= wl Xw2 х Р х В, где wl и w2 это средние частоты событий (в Hertz) в первой и второй клетках, соответственно, Р - период регистрации (в секундах), использованный для анализа и В - длительность (в секундах) одного бина. Для автокоррелограмм, wl равно w2. Коэффициент корреляции (С) >1 + 3 х о (т.е., уровень значимости >99.97%) указывает на значимую положительную корреляцию, где о - стандартное отклонение (SD) кросс-корреляции в потоке спайков с временными задержками 1.5 и 2 сек (метод предсказания сдвига) (Gerstein and Perkel, 1972). Этот метод основан на идее о том, что большинство нейронных взаимодействий происходят в короткие периоды времени и в предположении о том, что временной сдвиг (1.5-2 сек) намного больше, чем задержка, которая обычно присутствует в межнейронных взаимодействиях (Aertsen et al., 1989). Данные, выраженные как среднее значение ± стандартная ошибка (М ± SE), были статистически проанализированы с использованием пакета Origin-7 и парным t-тестом. Кросс-коррелограммы колебаний мембранных потенциалов строились по 10 сек одновременным записям, полученным для пар клеток. Из значений мембранных потенциалов вычиталось среднее, а появляющиеся спайки были отфильтрованы. Далее записи сглаживались, что в результате давало одну точку в 5 msec. Кросс-коррелограммы таких фрагментов нормировались на квадратный корень из произведений значений автокоррелограмм в обоих трейсах при нулевой задержке. Поскольку спайки были отфильтрованы из записей, коэффициент корреляции (теоретический максимум =1) оценивалась степень скоррелированности изменений мембранных потенциалов в обеих клетках. Коэффициент корреляции мембранных потенциалов (Ст) считался значимым, если он был по-крайней мере в три раза больше, чем стандартное отклонение ст значений Ст от перемешенных величин мембранных потенциалов («shuffled» метод) (уровень значимости >99.97%). Данные, выраженные как среднее ± SEM, статистически анализировались с применеием пакета Origin 7.0, используя парный t тест.

Амплитуда спонтанных гломерулярных полевых потенциалов (sGFP) измерялась от момента возникновения до пика; длительность на половине высоты амплитуды была названа полушириной sGFP; время возрастания измерялось от 10% до 90% от максимума, и время спада от 90% до 10% экстраполировалось одной экспоненциальной кривой. Данные, выраженные как среднее ± SD, статистически анализировались с использованием One-Way ANOVA теста и уровенем значимости q=0.05. Кросс-корреляция между парными записями полевых потенциалов подсчитывались с использованием программы, написанной А. Грозным и А. Гальченко, по фрагментам записей длительностью 4 сек. Далее подсчитанные кросс-коррелограммы нормировались на квадратный корень из произведения значений автокоррелограмм в обоих фрагментах при нулевой временной задержке, так что кросс-корреляционная функция (CCF) была независима от действительных амплитуд записи. 95% уровень значимости усредненной CCF (avgCCF) подсчитывался как 2ст , деленное на квадратный корень из числа усреднений, где ст - стандартное отклонение avgCCF.

Компьютерное моделирование

Для того, чтобы реконструировать пространственное распределение полевых потенциалов, генерируемых единичным структурным модулем, была построена математическая модель, включающая 280(= 230 РО + 50 ЕТ) клеток, 50 Тклеток и 10 М клеток,что было основано на подсчетах нейронов, меченых Вычисления основывались на предположении о том, что во время деполяризации внутриклубочковый иейропиль содержит равномерно распределенный внеклеточный отрицательный заряд, в то время как тела всех клеток совместно со вторичными (у Т клеток) или латеральными (у М клеток) дендритами создает равный по величине положительный внеклеточный заряд. Заряды каждой клетки были разделены на 200 (произвольно выбранное число фрагмента и унитарного заряда) и распределены по соответствующим компонентам клеток. Синаптическая плотность и степень синаптической активации внутри нейропиля предполагались постоянными для всех клеток. Было предположено, что весь негативный заряд JG клетки сосредоточен в клубочке на ветвлении главного дендрита, а весь положительный заряд сконцентрирован на соме (вторичные дендриты JG клеток не рассматривались). Было также предположено, что М, Т и ET клетки обладают в два раза более обширным внутриклубочковым дендритным ветвлением, чем PG клетки (Таблицы 1, 5). Таким образом, отрицательный внутриклубочковый заряд, приходящийся на М, Т или ET клетку, был в два раза больше, нежели для PG клетки, а вторичные дендриты Т клеток и латеральные дендриты М клеток, а также сома ET клетки обладали позитивным зарядом, в два раза большим, чем сома PG клетки. Объединенный негативный заряд внутриклубочковых дендритов от всех нейронов был равномерно распределен внутри нейропиля, что давло в результате локальный сток модуля. Объединенный положительный заряд всех тел PG клеток был равномерно распределен по оболочке клубочка. Объединенный позитивный заряд ET клеток был распределен по нижней полусфере оболочки клубочка. Совместный положительный заряд Т клеток был распределен в верхней половине EPL внутри пластины 400x400x100 цт в направлениях (X, Y, Z) соответственно, что в результате давало рассыпаппый источник Т клеток; здесь мы установили толщину верхнего EPL как 100 цш (полная толщина EPL = 200 |im, ось Z), вторичные дендриты были случайно ориентированы в пределах 400 цт вокруг центральной точки и гломерулярная сфера находилась в центре и на вершине пластины. Объединенный положительный заряд М клеток был распределен в аналогичной пластине, занимающей нижнюю половину EPL измерениями 1000x1000x100 цт, что давало в результате рассыпанный источник М клеток; преимущественная локализация латеральных дендритов в нижней части EPL основана на анатомических данных (Macrides and Schneider, 1982). Размеры М пластины превосходили толщину среза в направлении оси Y ( Рис.405), по эта переоценка позволяет лучше оценить вклад М клеток в условиях in vivo. Смена знака заряда с негативного на позитивный располагалась на границе нейропиль/оболочка клубочка. Электростатический потенциал V(r) в точке пространства г вне клетки ведет себя в соответствии с законом Кулона в диэлектрической среде с диэлектрической константой с, равной таковой в растворе физиологического электролита: м>кеге / = (1)

Г-ГА

В уравнении (1) д1 это электростатический заряд в точке пространства 71, которая является точкой на клеточной мембране, |г - /;| это расстояние от точки 7{ до точки 7 , в которой измерялся потенциал. Суммирование проходит по всем точкам 7, всех нейронов, представленных в модели и, таким образом, аккумулирует полное электростатическое поле, генерируемое всеми нейронами в точке 7. Мы подсчитывали все потенциалы в произвольных единицах и затем нормировали их на максимальное значение общего полевого потенциала, т.е. на полное значение полевого потенциала в центре клубочка. Смоделированные полевые потенциалы рассчитывались вдоль линии, которая соединяет центр клубочка в ОЬ в плоскости, параллельной слоям обонятельной луковицы, начиная от центра клубочка.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Заключение диссертации по теме «Физиология», Карнуп, Сергей Викторович

ВЫВОДЫ

Совокупность определенных качественных и количественных свойств Ю клеток позволяет с большой вероятностью определить принадлежность нейрона к тому или иному типу. Качественными характеристиками являются: 1) анатомическое описание, 2) тип паттерна разряда при деполяризующей инъекции тока, 3) тип ответа на стимуляцию СМ и характер спонтанной активности. Количественными характеристиками являются: 1) входное сопротивление Ящ 2) ГАНР и 3)степень аккомодации. а) Нейрон является внешней пучковой клеткой (ЕТ), если он обладает одной или двумя основными чертами. 1) Его отростки нисходят в ЕРЬ (вторичные дендриты или аксон) и обильно ветвящийся дендритный пучок распределен в одном или (редко) в двух клубочках. 2) У него обнаруживаются потенциал-зависимые колебания мембранного потенциала и пачки/группы спайков, возникающие спонтанно или при инъекции деполяризующего тока. Если ни одна из этих двух черт не очевидна, то нужно рассматривать набор физиологических свойств, которые должны быть в следующих диапазонах: а) ^п < 500 МО, Ь) АссСО.З (для ББЕТ), с) 0<£АНР<15 тУ, ё) на стимуляцию СМ клетка отвечает единичным ЕРБР/С с постоянной латентностыо. b) Нейрон является коротко-аксонной клеткой (БА), если он обладает произволно ориентированными дендритами и длинным аксоном исключительно внутри вЬ. Морфологически БА очень отличается от других Ю клеток. Кроме того, она должна показывать а) регулярные или слабо адаптирующиеся единичные разряды, б) залпы спонтанных и/или вызванных ЕР8Р/С, с) глубокую £АНР (>10 тУ). c) Нейрон является волосатой перигломерулярной клеткой (НРО), если он обладает тонкими волосоподобными очень короткими и слабо ветвящимися дендритами, преимущественно направленными внутрь гломерулярного нейропиля и не имеет аксона. С большой вероятностью эта клетка генерирует плато-потенциал. Кроме этого, такой нейрон либо вообще не генерирует быстрых спайков, либо разряжается одним - двумя спайками при инъекции тока или в начале спонтанного плато-потенциала. Быстрая АНР после единичного начального или спонтанного спайка мала

10 mV), Rin около 1GQ и более, спонтанные и вызванные EPSP/C залпы хорошо выражены. d) Перигломерулярные клетки классического типа (CPG) характеризуются неупорядоченной дендритной морфологией. Они имеют от одного до трех дендритных стволов без древо-подобного ветвления, характерного для ET, Т и M нейронов. Вместо этого дендритные ветви произвольно расположены в части клубочка, никогда не занимая весь его объем. Клетка либо не имеет аксона, либо имеет короткий аксон, иногда проникающий в соседний клубочек. В основном CPG обладают высоким Rjn>400 MQ, глубокой fAHP (>13 mV) и характеризуются залпами EPSC/P в спонтанной и вызванной активности. Аккомодация спайков либо слабо выражена, либо отсутствует.

Генерация ритмических колебаний мембранного потенциала, а также пачкования или группирования спайков в ET клетках не зависит от синаптического входного сигнала, а является внутренним свойством этих клеток. Тем не менее, синаптическая активность модулирует спонтанное пачкование/группирование без изменения среднего значения его частоты.

Периодические колебания мембранного потенциала ET клеток являются потенциал-зависимыми. В их генерации участвуют как кальциевые (LTS), так и натриевые (1ыар) ионные проводимости. Частота колебаний является характерной для данного нейрона, но для разных ET клеток частоты различаются и находятся в диапазоне 1-10 Гц (5 - 0 диапазон).

Ритмическое пачкование может модулироваться ритмическим афферентным сигналом из обонятельного нерва, так что значительная популяция ET нейронов усваивает его частоту и, таким образом, синхронизирует циклы возбуждения по множеству гломерулярных модулей.

Все ET клетки получают моносинаптический входной сигнал от ON-терминалей, тогда как SA клетки и большинство (~80%) PG клеток имеют дисинаптические или полисинаптические ответы на ON-вход.

JG клетки в одном и том же клубочке имеют высоко скоррелированную спонтанную активность. a) Скоррелированная активность среди ЕТ клеток не требует активации глутаматэргических или ОАВА-эргических ионотропных рецепторов. Возможно, что принадлежащие одному гломерулярному модулю ЕТ клетки взаимодействуют через щелевые контакты. b) Вовлечение РО клеток в синхронизованную активность внутри клубочка опосредована моносинаптическим глутаматергическим возбудительным входом от ЕТ клеток. Моносинаптический вход от ЕТ на РО/БА клетки опосредован АМРА рецепторами.

БА клетки обеспечивают координацию гломерулярпых модулей. Межгломерулярные аксоны БА клеток распространяются во всех направлениях с наибольшей плотностью в диапазоне 500 - 600 цт и с максимальным радиусом протяженности 2 мм.

Межгломерулярные связи являются возбудительными, опосредованными глутаматергическими АМРА рецепторами. Они обеспечивают латеральное торможение внутри гломерулярного слоя, а также частичную синхронизацию популяционной активности между отдельными клубочками.

Спонтанные полевые потенциалы (зСРР) генерируются непосредственно в клубочковом слое и отражают одновременое возбуждение нейронов, обьединеных в гломерулярные модули. зОИР индивидуальных модулей в основном асинхронны. По длительности и амплитуде они соизмеримы с поздней фазой вызванного ответа и по-видимому, обусловлены активацией части тех нейронов, которые активируются и при вызванном ответе. звРР сильно варьируют по амплитуде и длительности; кроме того, эти параметры слабо скоррелированы, что указывает на большой разброс как числа вовлекаемых клеток, так и моментов их активации.

Распространение зОИР пространственно ограничено размерами клубочка таким образом, что за пределами клубочка регистрируется не более 20% от максимальной амплитуды зСИР. Поле закрытого типа создается в каждом отдельном клубочке его Ю клетками, обусловливающими около 50% его величины внутри нейропиля, в то время как поле за пределами клубочка генерируется М/Т клетками. Таким образом, вОРР характеризует локальное синхронное возбуждение некоторой части элементов гломерулярного модуля. sGFP возникают вследствие глутаматэргического возвратного возбуждения, охватывающего часть нейронов гломерулярного ансамбля. Блокада синаптического торможения приводит к облегчению sGFP, а блокада АМРА-рецепторов полиостью подавляет sGFP.

Митральные клетки не участвуют в инициации sGFP, но лишь вовлекаются в него со значительной задержкой (~20 ms). Потенциалы действия в М клетках отстают на ~100 мс от начала sGFP.

Спонтанная активность модулей в GL может быть скоррелироваппой. Такая корреляция опосредована полисипаптическими возбудительными связями и в срезах MOB in vitro возможна лишь на небольших расстояниях (1-3 клубочка).

Сложная система нейропальных взаимодействий как внутри отдельных гломерулярных модулей, так и между модулями в пределах гломерулярного слоя, позволяет констатировать наличие ранее не идентифицированной подсистемы MOB на уровне GL, являющейся первым звеном анализа обонятельной информации.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Карнуп, Сергей Викторович, 2005 год

1. Лосева ЕВ и Карнуп СВ (2004) Нейрогенез в зрелой обонятельной луковице и еговозможное функциональное предназначение. Успехи Физиол. Наук, 35(4): 11-18.

2. Adrian ED (1950) The electrical activity of the olfactory bulb. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 2: 377-388.

3. Aertsen AM, Gerstein GL, Habib MK, PalmG (1989) Dynamics of neuronal firingcorrelation: modulation of "effective connectivity." J Neurophysiol 61:900-917.

4. Allison AC (1953) The structure of the olfactory bulb and its relationship to the olfactory pathways in the rabbit and the rat. J. Сотр. Neurol., 98: 3009-353.

5. Alonso JM, Usrey WM, Reid RC (1996) Precisely correlated firing in cells of the lateral geniculate nucleus. Nature 383:815-819.

6. Alreja M, Aghajanian GK (1995) Use of the whole-cell patch-clamp method in studies on the role of cAMP in regulating the spontaneous firing of locus coeruleus neurons. J Neurosci Methods 59:67-75.

7. Alvarez VA, Chow CC, Van Bockstaele EJ, Williams JT (2002) Frequencydependent synchrony in locus ceruleus: role of electrotonic coupling. Proc Natl Acad Sci USA 99:4032^036.

8. Amzica F. and Steriade M. (2000) Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J. Neurosci. 20:6648-6665.

9. Araneda R.C., Kini A.D. and Firestein S. (2000) The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature Neurosci., 3: 1248-1255.

10. Aroniadou V and Keller A (1993) The pattern and synaptic properties of horizontalintracortical connectionsin the rat motor cortex. J Neurophysiol. 70: 1493-1553.

11. Aroniadou-Anderjaska V, Ennis M, Shipley MT (1999) Dendrodendritic recurrentexcitation in mitral cells of the rat olfactory bulb. J Neurophysiol. 82:489-494.

12. Aroniadou-Anderjaska V, Ennis M and Shipley MT (1997) Glomerular synaptic responses to olfactory nerve input in rat olfactory bulb slices. Neuroscience 79(2): 425-434.

13. Aroniadou-Anderjaska V, Ennis M and Shipley MT (1999) Current-source density analysis in the rat olfactory bulb: laminar distribution of kainite/AMPA- and NMDA-receptor-mediated currents. J Neurophysiol 81: 15-28.

14. Aroniadou-Anderjaska V,Zhou FM, Priest CA, Ennis M, Shipley MT (2000) Tonicand synaptically evoked presynaptic inhibition of sensory input to the rat olfactory bulb via GABA(B) heteroreceptors. J Neurophysiol 84:1194-1203.

15. Astic, L. & Cattarelli, M. (1982) Metabolic mapping of functional activity in the rat olfactory system after a bilateral transection of the lateral olfactory tract. Brain Res. 245,17-25.

16. Aungst JL, Heyward PM, Puche AC, Karnup SV, Hayar A, Szabo G, Shipley MT (2003) Center-surround inhibition among olfactory bulb glomeruli. Nature 426:623-629.

17. Azouz R., Jensen M. S., Yaari Y. (1996) Ionic basis of spike after-depolarization and burst generation in rat hippocampal CA1 pyramidal cells. J. Physiol. 492:211-223.

18. Azstely F., Erdemli G. and Kullmann D.M. (1997) Extrasynaptic glutamate spillover in the hippocampus; dependence on temperature and role of active glutamate uptake. Neuron, 18:281-293.

19. Baker H, Margolis F.L. (2002) Mechanisms of differentiation and migration of the olfactory progenitors: an overview. Chem. Senses 27(6): 567.

20. Barbour B. and Hausser M. (1997) Intersynaptic diffusion of neurotransmitter. Trends Neurosci., 20: 377-384.

21. Bardoni R, Magherini PC, Belluzzi O (1995) Sodium current in periglomerular cells of frog olfactory bulb in vitro. Brain Res 703:19-25.

22. Belluzzi O., Benedusi M., Ackman J., LoTurco J.J. (2003) Electrophysiological differentiation of new neurons in the olfactory bulb. J. Neurosci., 23: 10411-10418.

23. Belluscio L, Katz LC (2001) Symmetry, stereotypy, and topography of odorant representations in mouse olfactory bulbs. J Neurosci 21:2113-2122.

24. Bennett B.D., Callaway J.C. and Wilson C.J. (2000) Intrinsic membrane properties underlying spontaneous tonic firing in neostriatal cholinergic intemeurons. J. Neurosci. 20:84938503.

25. Benson, T. E., Burd, G. D., Greer, C. A., Landis, D. M. & Shepherd, G. M. (1985) High resolution 2-deoxyglucose autoradiography in quick-frozen slabs of neonatal rat olfactory bulb. Brain Res. 339, 67-78.

26. Berkowicz DA, Trombley PQ (2000) Dopaminergic modulation at the olfactory nerve synapse. Brain Res 855:90-99.

27. Bischofberger J. and Jonas P. (1997) Action potential propagation into the presynaptic dendrites of rat mitral cells. J. Physiol., 504(2): 359-365.

28. Bokil H., Laaris N., Blinder K., Ennis M. and Keller A. (2001) Ephaptic interactions in the mammalian olfactory system. J Neurosci., 21(20):RC173.

29. Bozza T.C. and Kauer J.S. (1998) Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J.Neurosci. 18: 4560-4569.

30. Bressler SL, Freeman WJ (1980) Frequency analysis of olfactory system EEG in cat, rabbit, and rat. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol., 50:19-24.

31. Brown P, Kupsch A, Magill PJ, Sharott A, Harnack D and Meissner W (2002) Oscillatory local field potentials recorded from the subthalamic nucleus of the alert rat. Exp. Neurology, 177: 581-585.

32. Brown J., Cooper-Kuhn C.M., Kempermann G., Van Praag H., Winkler J., Gage F.H., Kuhn H.G. (2003) Enriched environment and physical activity stimulate hippocampal but not olfactory bulb neurogenesis. Eur. J. Neurosci., 17(10): 2042-2046.

33. Brumberg JC, Nowak LG, McCormick DA (2000) Ionic mechanisms underlying repetitive high-frequency burst firing in supragranular cortical neurons. J Neurosci 20:4829^4843.

34. Brunjes P.C. and Greer C.A. (2003) Progress and directions in olfactory development. Neuron, 38(3): 371-374.

35. Buck L.B. (2000) The molecular architecture of odor and pheromone sensing in mammals. Cell 100:611-618.

36. Bufler J., Zufal. F., Franke C., Hatt H. (1992) Patch-clamp recordings of spiking and nonspiking interneurons from rabbit olfactory bulb slices: membrane properties and ionic currents. J. Comp. Physiol. A., 170:145-152.

37. Buhl E. H., Halasy K. and Somogyi P. (1995) Diverse sources of hippocampal unitarypostsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature 368:823-828.

38. Buonviso N., Chaput M.A. and Berthommier F. (1992) Temporal pattern analyses in pairs of neghbouring mitral cells. J.Neurophysiol., 68: 417-424.

39. Buresh Ya, Petan M, and Zakhar I (1962) Electrophysiological methods of studies in Russian. Moscow:, Inostrannaya Literatura,.

40. Cajal, R. S. (1911) Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des Vertebres (Maloine, Paris,.

41. Cang J. and Isaakson J.S. (2003) In vivo whole-cell recording of odor-evoked synaptic transmission in the rat olfactory bulb. J.Neurosci., 23(10): 4108-4116.

42. Carleton A., Petreanu L.T., Lansford R., Alvarez-Buylla A., Lledo P.M. (2003) Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb. Nat. Neurosci., 6: 507-518.

43. Carlson G.C, Shipley M.T., and Keller A. (2000) Long-Lasting Depolarizations in Mitral Cells of the Rat Olfactory Bulb. J. Neurosci. 20(5):2011-2021.

44. Cassidy R., Frisen J. (2001) Stem cells on the brain. Nature, 412: 690-691.

45. Castillo P.E., Carleton A., Vincent J.-D., Lledo P. M. (1999) Multiple and opposing roles of cholinergic transmission in the main olfactory bulb. J. Neurosci. 19:9180-9191.

46. Chao T.I., Kasa P., Wolff L.R. (1997) Distribution of astroglia in glomeruli of the rat mainolfactory bulb: exclusion from the sensory compartment of neuropil. J. Comp. Neurol., 388: 191-210.

47. Chapman CA, Xu Y, Haykin S, and Racine RJ (1998) Beta-frequency (15-35 Hz)electroencephalogram activities elicited by toluene and electrical stimulation in the behaving rat. Neuroscience 86(4): 1307-1319.

48. Chaput M.A. and Holley A., (1980) Single unit responses of olfactory bulb neurons to odor presentation in awake rabbits. J. Physiol. Paris, 76: 551-558.

49. Chaput M.A. and Holley A., (1985) Responses of olfactory bulb neurons to repeated odor stimulations in awake freely-breathing rabbits. Physiol. Behav., 34: 249-258.

50. Chen W.R., Midtgaard J., Shepherd G.M. (1997) Forward and backward propagation of dendritic impilses and their synaptic control in mitral cells. Science, 278: 463-476.

51. Chen, W. R., Shen, G. Y., Shepherd, G. M., Hines, M. L. & Midtgaard, J. Multiple modes of action potential initiation and propagation in mitral cell primary dendrite. J. Neurophysiol. 88,2755-2764 (2002).

52. Chen,W. R., Xiong,W. & Shepherd, G.M. Analysis of relations between NMDA receptors and GABA release at olfactory bulb reciprocal synapses. Neuron 25, 625-633 (2000).

53. Chess A., Simon I., Cedar H and Axel R. (1994) Allelic inactivation regulates olfactory receptor gene expression. Cell 78: 823-834.

54. Christensen TA, Lei H, Hildebrand JG (2003) Coordination of central odor representationsthrough transient, non-oscillatory synchronization of glomerular output neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:11076-11081.

55. Christie JM, Bark C, Hormuzdi SG, Helbig I., Monyer H, and Westbrook GL (2005)

56. Connexin36 mediates spike synchrony in olfactory bulb glomeruli. Neuron, 46: 761772.

57. Christie J.M. and Westbrook G.L. (2003) Regulation of backpropagating action potentials in mitral cell lateral dendrites by A-type potassium currents. J. Neurophysiol., 89(5): 2466-2472.

58. Christie J. M., Schoppa N. E. and Westbrook G. I. (2001) Tufted cell dendrodendritic inhibition in the olfactory bulb is dependent on NMDA receptor activity. J. Neurophysiol. 85:169-173.

59. Christodoulou C, BugmannG (2001) Coefficient of variation (CV) vs meaninterspike interval (ISI) curves: what do they tell us about the brain? Neurocomputing 38-40:1141-1149.

60. Cinelli AR, Hamilton KA, Kauer JS (1995) Salamander olfactory bulb neuronal activity observed by video rate, voltage-sensitive dye imaging. III. Spatial and temporal properties of responses evoked by odorant stimulation. J Neurophysiol 73:2053-2071.

61. Ciombor K.J., Ennis M., Shipley M.T. (1999) Norepinephrine increases rat mitral cell excitatory responses to weak olfactory nerve input via alpha-1 receptors in vitro. Neuroscience 90: 595-606.

62. Cooper A. J. and Stanford I. M. (2000) Electrophysiological and morphological characteristics of three subtypes of rat globus pallidus neurons in vitro. J. Physiol. 527: 291-304.

63. Collingridge G.L. and Lester R.A. (1989) Excitatory amino acid receptors in the vertebrate central nervous system., Pharmacol. Rev., 41:143-210.

64. Connors B. W., Gutnick M. J., Prince D. A. (1982) Electrophysiological properties of neocortical neurons in vitro. J. Neurophysiol. 48:1302-1320.

65. Connors B. W. and Gutnick M. J. (1990) Intrinsic firing patterns of diverse neocortical neurons. Trends Neurosci. 13: 365-366.

66. Cornwall, J. & Phillipson, O. T. (1988) Quantitative analysis of axonal branching using the retrograde transport of fluorescent latex microspheres. J. Neurosci. Methods 24, 1-9.

67. Coskun V, Luskin M.B. (2002) Intrinsic and extrinsic regulation of the proliferation anddifferentiation of cells in the rodent rostral migratory stream. J Neurosci. Res., 69(6): 795-802.

68. Courtemanche R, Fujii N and Graybiel AM (2003) Synchronous, focally modulated b-bandoscillations characterize local field potential activity in the striatum of awake behaving monkeys. J. Neurosci. 23: 11741-11752.

69. Crespo C., Jorge R. J., Alonso J. R., Brinon J. G., Arevalo R., Aijon J. (1997) segregated distribution of TH-immunoreactivity in olfactory glomeruli. NeuroReport 8: 23112316.

70. Delaney K.R. and Hall B.J. (1996) An in vitro preparation of frog nose and brain for study of odour-evoked oscillatory activity. J. Neurosci. Methods, 68: 193-202.

71. Deller T., Mundel P., Frotcher M. (2000) Potential role of synaptopodin in spine motility by coupling actin to the spine apparatus. Hippocampus. 10:569-581.

72. Del Negro CA, Koshiya N, Butera Jr RJ, Smith JC (2002) Persistent sodium current,membrane properties and bursting behavior of pre-botzinger complex inspiratory neurons in vitro. J Neurophysiol 88:2242-2250.

73. Desmaisons D., Vincent J.-D. and Lledo P.-M. (1990) Control of action potential timing by intrinsic subthreshold oscillations in olfactory bulb output neurons. J. Neurosci. 19:10725-10737.

74. Dickson C. T., Magistretti J., Shalinsky M. H., Fransen E., Hasselmo M.E. and Alonso A. (2000) Properties and Role of Ih in the Pacing of Subthreshold Oscillations in Entorhinal Cortex Layer II Neurons. J. Neurophys. 83:2562-2579.

75. DiFrancesco D (1993) Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol 55:455472.

76. Doyle MW, Andresen MC (2001) Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol 85:2213-2223.

77. Duchamp-Viret P., Duchamp A. and Chaput M. (1993) GABA-ergic control of odor-induced activity in the frog olfactory bulb: electrophysiological study with picrotoxin and bicuculline. Neuroscience, 53:111-120.

78. Eeckman FH, FreemanWJ (1990) Correlations between unit firing and EEG in the rat olfactory system. Brain Res 528:238-244.

79. Egger V., Svoboda K., Mainen Z.F. (2003) Mechanisms of lateral inhibition in the olfactory bulb: efficiency and modulation of spike-evoked calcium influx into granule cells. J Neurosci., 23(20): 7551-7558.

80. Ennis M, Zimmer L.A. and Shipley M.T. (1996) Olfactory nerve stimulation activates rat mitral cells via NMDA and non-NMDA receptors in vitro. NeuroReport 7: 989-992.

81. Ennis M, Zhou FM, Ciombor KJ, Aroniadou-Anderjaska V, Hayar A, Borrelli E, Zimmer LA, Margolis F, Shipley MT (2001) Dopamine D2 receptormediated presynaptic inhibition of olfactory nerve terminals. J Neurophysiol. 86:2986-2997.

82. Ezeh P. I., Wellis D. P., Scott J. W. (1993) Organization of inhibition in the rat olfactory bulb external plexiform layer. J. Neurophys. 70:263-274.

83. Farries M. and Perkel D. (2000) Electrophysiological properties of avian basal ganglia neurons recorded in vitro. J. Neurophysiol., 84: 2502-2513.

84. Feldmeyer D, Egger V, Lubke J, Sakmann B (1999) Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single "barrel" of developing rat somatosensory cortex. J Physiol (Lond) 521:169-190.

85. Firestein S. (2001) How the olfactory system makes sense of scents. Nature 413: 211-218.

86. Fitzakerley J. I., Schaefer K. L., kitko R. A., Manis P. B. (1997) Properties of cochlear nucleus neurons in primary culture. Hear Res. 114:148-168.

87. Fletcher M.L. and Wilson D.A. (2003) Olfactory bulb mitral-tufted cell plasticity: odorant-specific tuning reflects previous odorant exposure. J.Neurosci., 23(17): 6946-6955.

88. Fletcher ML, Smith AM, Best AR and Wilson DA (2005) High-frequency oscillations are not necessary for simple olfactory discrimination in young rats. J. Neurosci., 25(4):792-798.

89. Fox AP, Nowycky MC, Tsien RW (1987) Kinetic and pharmacological properties distinguishingthree types of calcium currents in chick sensory neurones. J Physiol (Lond) 394:149-172.

90. Frazier LL and Brunjes PC. (1988) Unilateral odor deprivation: early postnatal changes in olfactory bulb cell density and number. J Comp. Neurol., 269: 355-370.

91. Freeman W.J. (1974a) Stability characteristics of positive feedback in a neural population. IEEE Trans Biomed Eng 21: 358-364.

92. Freeman W.J. (1974b) Relation of glomerular neuronal activity to glomerular transmission attenuation. Brain Res. 65: 91-107.

93. Freeman W.J. (1978) Spatial properties of an EEG event in the olfactory bulb and cortex. EEG and Clin. Neurophysiol., 44: 586-605.

94. Freund TF, Buzsaki G. (1996) Interneurons of the hippocampus. Hippocampus, 6(4):347-470.

95. Fried H.U., Fuss S.H. and Korsching S.I. (2002) Selective imaging of presynaptic activity in the mouse olfactory bulb shows concentration and structure dependence of odor responses in identified glomeruli. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 99: 3222-3227.

96. Friedman D, Strowbridge BW (2000) Functional role of NMDA autoreceptors in olfactory mitral cells. J Neurophysiol 84:39-50.

97. Friedman A. and Gutnick M.J. (1987) Low-threshold calcium electrogenesis in neocortical neurons. Neurosci. Letters 81:117-122.

98. Friedman D. and Strowbridge B. W. (2000) Synchronized population activity in the olfactory bulb in vitro. Soc. Neurosci. Abstr. 27.609.7.

99. Friedman D, Strowbridge B (2000) Functional role ofNMDAautoreceptors in olfactory mitral cells. J Neurophysiol 84:39-50.

100. Friedrich RW (2002) Real time odor representation. TINS 25(10): 487-489.

101. Friedrich RW and Laurent G (2001) Dynamic optimization of odor representation by slow temporal patterning of mitral cell activity. Science, 291: 889-894.

102. Friedman D and Strowbridge B (2000) Functional role of NMDA autoreceptors in olfactory mitral cells. J Neurophysiol 84: 39-50.

103. Friedman D and Strowbridge B (2003) Both elecrical and chemical synapses mediate fast network oscillations in the olfactory bulb. J Neurophysiol 89: 2601-2610.

104. Friedrich R (2002) Real time odor representations. Trends Neurosci 25:487- 489.

105. Fukushima N, Yokouchi K, Kawagishi K, Moriizumi T. (2002) Differential neurogenesis and gliogenesis by local and migrating neural stem cells in the olfactory bulb. Neurosci Res., 44(4):467-73.

106. Gelperin A. and Tank D.W. (1990) Odour-modulated collective network oscillations of olfactory interneurons in a terrestrial mollusk. Nature, 345: 437-440.

107. Gerstein GL, Perkel DH (1972) Mutual temporal relationships among neuronal spike trains.

108. Statistical techniques for display and analysis. Biophys J 12:453-473.

109. Getchell TV, Shepherd GM (1975) Synaptic actions on mitral and tufted cells elicited by olfactory nerve volleys in the rabbit. J Physiol (Lond) 251:497-522.

110. Getchell T.V. and Shepherd G.M. (1975) Short-axon cells in the olfactory bulb:dendro-dendritic synaptic interactions. J.Physiol. (Lond) 251: 523-548.

111. Gheushi G„ Cremer H., McLean H., Chazal G., Vincent J.-D. and Ledo P.-M. (2000) Importance of newly generated neurons in the adult olfactory bulb for odor discrimination. PNAS, 97(4): 1823-1828.

112. Giraudet P., Berthommier F., Chaput M. (2002) Mitral cell temporal response patterns evoked by odor mixtures in the rat olfactory bulb. J.Neurophysiol., 88(2): 829-838.

113. Golgi, C. (1875) Sulla Fina Struttura dei Bulbi Olfattorii (Reggio-Emilia, Rome).

114. Goto Y and O'Donnell P (2001) Network synchrony in the nucleus accumblens in vivo. J. Neurosci. 21:4498-4504.

115. Greer, C. A., Stewart,W. B., Kauer, J. S. & Shepherd, G.M. (1981) Topographical and laminar localization of 2-deoxyglucose uptake in rat olfactory bulb induced by electrical stimulation of olfactory nerves. Brain Res. 217, 279-293.

116. Grossberg, S. (1970) Neural pattern discrimination. J. Theor. Biol. 27, 291-337.

117. Grossberg, S. (1976) Adaptive pattern classification and universal recoding: I. Parallel development and coding of neural feature detectors. Biol. Cybem. 23, 121-134.

118. Guselnikov VI (1976) Electrophysiology of the Brain in Russian. Moscow: Vysshaya Shkola.

119. Guthrie, K. M. & Gall, C. M. (1995) Functional mapping of odor-activated neurons in the olfactory bulb. Chem. Senses 20, 271-282.

120. Guthrie K.M., Anderson A.I., Leon M., Gall C. (1993) Odor-induced increases in c-fosmRNA expression reveal an anatomical "unit" for odor processing in olfactory bulb. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 90: 3329-3333.

121. Halabisky B., Strowbridge B.W. (2003) Gamma-frequency excitatory input to granule cells facilitates dendrodendritic inhibition in the rat olfactory bulb. J Neurophysiol., 90(2): 644-654.

122. Halasz N., Shepherd G.M. (1983) Neurochemistry of the vertebrate olfactory bulb. Neuroscience, 10: 579-619.

123. Halasz, N. & Greer, C. A. (1993) Terminal arborizations of olfactory nerve fibers in the glomeruli of the olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 337, 307-316.

124. Hayar A., Karnup S., Ennis M. and Shipley M.T. (2004a) External tufted cells: a majorexcitatory element that coordinates glomerular activity. J.Neurosci., 24(30): 66766685.

125. Hayar A., Karnup S., Shipley M.T., and Ennis M. (2004b) Olfactory bulb glomeruli: External tufted cells intrinsically burst at theta frequency and are entrained by patterned olfactory input. J. Neurosci., 24(5): 1190-1199.

126. Hayar A., Shipley M. and Ennis M. (2005) Olfactory bulb external tufted cells aresynchronized by multiple intraglomerular mechanisms. J.Neurosci., 25(36): 8197-8208

127. Heyward P, Ennis M, Keller A, Shipley MT (2001) Membrane bistability in olfactory bulb mitral cells. J Neurosci 21:5311-5320.

128. Hsia AY, Vincent JD, LledoPM (1999) Dopamine depresses synaptic inputs into the olfactory bulb. J Neurophysiol 82:1082-1085.

129. Jahnsen H. & Llinas R. (1984) Ionic basis for electroresponsiveness and oscillatory properties of guinea-pig thalamic neurons in vitro. J. Physiol. 349: 227-247.

130. Jahr C.E. and Nicoll R.A. (1980) Dendrodendritic inhibition: demonstration with intracellular recording. Science 207:1473-1475.

131. Jahr C.E. and Nicoll R.A. (1982a) An intracellular analysis of dendro-dendritic inhibition in the turtle in vitro olfactory bulb. J.Physiol. 326:213-234.

132. Jahr C.E. and Nicoll R.A. (1982b) Noradrenergic modulation of dendrodendritic inhibition in the olfactory bulb. Nature 297:227-229.

133. Jastreboff P. J., Pedersen P.E., Greer S.A., Stewart W.B., Kauer J.S., Benson Т.Е., Shepherd G.M. (1984) Specific olfactory receptor populations projecting to identified glomeruli in the rat olfactory bulb. Proc. Natl Acad. Sci. USA 81(16): 5250-5254.

134. Jiang M., Griff E.R., Ennis M., Shipley M.T. (1996) Activation of locus coeruleus enhances response of olfactory bulb mitral cells to weak olfactory nerve input. J.Neurosci., 16: 6319-6329

135. Johnson, B. A. & Leon, M. (1996) Spatial distribution of 14C.2-deoxyglucose uptake in the glomerular layer of the rat olfactory bulb following early odor preference learning. J. Сотр. Neurol. 376: 557-566.

136. Johnson, B. A., Woo, С. C. & Leon, M. (1998) Spatial coding of odorant features in the glomerular layer of the rat olfactory bulb. J. Сотр. Neurol. 393: 457-471.

137. Johnson В A, and Leon M (2000a) Modular Representation of Odorants in the Glomerular Layer of the Rat Olfactory Bulb and the Effects of Stimulus Concentration. J Comp Neurology 422: 496-509.

138. Johnston В A, and Leon M (2000b) Odorant Molecular Length: One Aspect of the Olfactory Code. J Comp Neurology 426: 330-338.

139. Johnson B.A., Woo C.C., Hingco E.E., Pham K.L. and Leon M. (1999) Multidimensional chemotopic responses to n-aliphatic acid odorants in the rat olfactory bulb. J. Сотр. Neurol., 409: 529-548.

140. Johnson B.A., Ho S.L., Xu Z., Yihan J.S., Yip S., Hingco E.E. and Leon M. J. (2002)

141. Functional mapping of the rat olfactory bulb using diverse odorants reveals modular responses to functional groups and hydrocarbon structural features. J. Сотр. Neurol., 449: 180-194.

142. Johnston D., Magee J.C., Colbert C.M., Cristie B.R. (1996) Active properties of neuronal dendrites. Annual Rev. Neurosci., 19: 165-186.

143. Jonas P. and Sakmann B. (1992) Glutamate receptor channels in isolated patches from CA1 and CA3 pyramidal cells of rat hyppocampal slices. J. Physiol., 455:143-171.

144. Jourdan F, Duveau A, Astic L, Holley A (1980) Spatial distribution of 14C.2-deoxyglucose uptake in the olfactory bulbs of rats stimulated with two different odours. Brain Res 188:139-154.

145. Jung H., Staff N.P. and Spruston N. (2001) Action potential bursting in subicular pyramidal neurons is driven by a calcium tail current. J.Neurosci. 21:3312-3321.

146. Kandel A, Buzsaki G (1997) Cellular-synaptic generation of sleep spindles, spike-and-wave discharges, and evoked thalamocortical responses in the neocortex of the rat. J Neurosci 17(17): 6783-6797.

147. Karnup SV (1980) Comparative analysis of statistical relations between spontaneous cortical unit activity and the EEG in different states of the brain function in Russian. Zhurn Vyssh Nervn Deyat 30: 105-112.

148. Karnup SV (1982) Comparative analysis of statistical relations between spontaneous cortical unit activity and the EEG in different states of the brain function translation into English. Neurosci and Behav Physiology 12: 213-219.

149. Karnup S, StelzerA (1999) Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells. J Physiol (Lond) 516:485-504.

150. Karnup S,V. (2004) Membrane and NetworkTheta-Rhythm Generation in Hippocampal Slices. Жури. Высш. Нервн. Деят. (Engl.) 54(1): 30-41.

151. Karnup S.V., Hayar A., Ennis M., Shipley M.T. (2001) Morphology and physiology ofjuxstaglomerular cells in rat main olfactory bulb. SFN Abstracts, 31st Annual Meeting, San Diego, Calif., November 10-15, p.623.8.

152. Kashivadani H, Sasaki YF, Uchida N, and Mori К (1999) Synchronized oscillatorydischarges of mitral/tufted cells with different molecular receptive ranges in the rabbit olfactory bulb. J Neurophysiol 82: 1786-1792.

153. Kasowsky H.J., Kim H. and Greer C.A. (1999) Odor and context-dependent modulation of mitral cell activity in behaving rats. Nat.Neurosci., 2: 1003-1009.

154. Kasowski H. J., Kim H. and Greer C. A. (1999) Compartmental organization of the olfactory bulb glomerulus. J. Сотр. Neurol. 407:261-274.

155. Kato Т., Yokouchi K., Kawagushi K., Fukushima N., Miwa T. and Morizumi T. (2000) Fate of newly formed periglomerular cells in the olfactory bulb. Acta Otolaringol., 120: 876-879.

156. Kauer JS (1998) Olfactory processing: a time and place for everything. Curr Biol 8:R282-R283.

157. Kauer, J. S., Senseman, D. M. & Cohen, L. B. (1987) Odor-elicited activity monitoredsimultaneously from 124 regions of the salamander olfactory bulb using a voltage sensitive dye. Brain Res. 418,255-261.

158. Kauer, J. S. (1988) Real-time imaging of evoked activity in local circuits of the salamander olfactory bulb. Nature 331,166-168.

159. Kay LM (2003) A challenge to chaotic intinerancy from brain dynamics. Chaos 13:10571066.

160. Kay LM, Laurent G (1999) Odor- and context-dependent modulation of mitral cell activity in behaving rats. Nat Neurosci 2:1003-1009.

161. Kay L.M., Lancaster L.R., Freeman W.J. (1996) Reafference and attractors in the olfactory system during odor recognition., Int. J. Neural. Syst., 7: 489-495.

162. Kawano, T. & Margolis, F. L. Transsynaptic regulation of olfactory bulb catecholamines in mice and rats. J. Neurochem. 39,342-348 (1982).

163. Keller A, Yagodin S, Aroniadou-Anderjaska V, Zimmer LA, Ennis M, Shepard NFJr and Shipley MT (1998) Functional Organization of Rat Olfactory Bulb Glomeruli Revealed by Optical Imaging. J Neurosci 18 (7): 2602-2612.

164. Ketchum KL, Haberly LB (1993) Synaptic events that generate fast oscillations in piriform cortex. J Neurosci 13(9): 3980-3985.

165. Kida I., Xu F., Shulman R.G. and Hyder F. (2002) Mapping at glomerular resolution: fMRI of rat olfactory bulb. Magn. Reson. Med. 48: 570-576.

166. Killian K.A., Bollins J. P., Govind C. K. (2000) Anatomy and physiology of neuronscomprising the commissura ring nerve of the cricket, Acheta domesticus. J. Exp. Zool. 286:350-366.

167. King A. E., Lopes-Garsia J. A. (1994) Intracellular analysis of cutaneous afferent-induced excitation and inhibition in rat dorsal horn neurons in vitro. J. Neurosci. Methods 52:61-68.

168. Kinzie JM, Shinohara MM, van den Pol AN, Westbrook GL, Segerson TP (1997)1.munolocalization of metabotropic glutamate receptor 7 in therat olfactory bulb. J Comp Neurol 385:372-384.

169. Kirov SA, Petrak LJ, Fiala JC, Harris KM (2004) Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience, 127: 69-80.

170. Kishi K., Mori K., Ojima H. (1984) Distribution of local axon collateralsof mitral, displaced mitral and tufted cells in the rabbit olfactory bulb. J. Comp. Neurol., 258:112-124.

171. Komisaruk BR (1970) Synchrony between limbic system theta activity and rhythmical behavior in rats. J Comp Physiol Psychol 70:482-492.

172. Konig P, Engel AK, Singer W (1996) Integrator or coincidence detector? The role of the cortical neuron revisited. Trends Neurosci 19:130-137.

173. Kosaka K, Toida K, Aika Y, Kosaka T (1998) How simple is the organization of the olfactory glomerulus?: the heterogeneity of so-called periglomerular cells. Neurosci Res 30:101110.

174. Kosaka T, Kosaka K (2004) Neuronal gap-junctions between intraglomerular mitral/tufted cell dendrites in the mouse main olfactory bulb. Neurosci Res., 49(4): 373-378.

175. Kosaka K., Aika Y., Toida K., Kosaka T. (2001) Structure of intraglomerular dendritic tufts of mitral cells and their contacts with olfactory nerve terminals and calbindin-immunoreactive type 2 periglomerular neurons. J. Comp. Neurology, 440: 219-235.

176. Kosaka T, Kosaka K. (2003) Neuronal gap junctions in the rat main olfactory bulb, with special reference to intraglomerular gap junctions. Neurosci. Res., 45(2): 189-209.

177. Kosaka T, Deans MR, Paul DL and Kosaka K. (2005) Neuronal gap junctions in the mouse main olfactory bulb: morphological analyses on transgenic mice. Neuroscience, 134(3): 757-69.

178. Kosaka K, Kosaka T. (2005a) Synaptic organization of the glomerulus in the main olfactory bulb: compartments of the glomerulus and heterogeneity of the periglomerular cells. Anat.Sci.Int. 80(2): 80-90.

179. Kosaka T, Kosaka K. (2005b) Structural organization of the glomerulus in the main olfactory bulb. Chem. Senses. Suppl 1: il07-il08.

180. Kosaka T, Kosaka K. (2005c) Intraglomerular dendritic link connected by gap junctions and chemical synapses in the mouse main olfactory bulb: electron microscopic serial section analyses. Neuroscience. 131(3): 611-625.

181. Kosaka T, Kosaka K. (2005d) Organization of the main olfactory bulb of some mammals: musk shrew, moles, hedgehogs, tree shrews, bats, mice and rats. J.Comp.Neurol. 485(3): 266.

182. Kozloski J., Hamzei-Sichani F., Yuste R. (2001) Stereotyped position of local synaptic targets in neocortex. Science, 293: 868-872.

183. Kullmann D.M.and Siegelbaum S.A. (1995) The site of expression of NMDA-receptor dependent LTP: new fuel for an old fire. Neuron, 15: 997-1002.

184. Ma M. and Shepherd G.M. (2000) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 97: 12869-12874.

185. Macrides F. and Schneider S. P. (1982) Laminar Organization of Mitral and Tufted Cells in the Main Olfactory Bulb of the Adult Hamster. J. Comp. Neurol 208:419-430.

186. Macrides F, Eichenbaum HB, ForbesWB (1982) Temporal relarionship between sniffing and the limbic rhythm during odor discrimination and reversal learning. J Neurosci 2:1705-1717.

187. Macrides F, Chorover SL (1972) Olfactory bulb units: activity correlated with inhalation cycles and odor quality. Science 175:84—87.

188. Mair R.G., Gellman R.L., Gesteland R.C. (1982) Postnatal proliferation and maturation of olfactory bulb neurons in the rat. Neuroscience, 7:3105-3116.

189. Malnic B., Hirono J., Sato T., and Buck L.B. (1999) Combinatorial receptor code to odors. Cell 96:713-723.

190. Mandairon N., Jourdan F. and Didier A. (2003) Deprivation of sensory inputs to the olfactory bulb up-regulates cell death and proliferation in the subventricular zone of adult mice. Neuroscience, 119(2): 507-516.

191. Mann-Metzer P, Yarom Y (1999) Electrotonic coupling interacts with intrinsic properties to generate synchronized activity in cerebellar networks of inhibitory interneurons. J Neurosci 19:3298-3306.

192. Margie T.W. (2001) Activity-dependent action-potential timing in mitral cells of the mammalian olfactory bulb. Soc. Neurosci. Abstr., 29,1208.

193. Margrie T.W., Sakmann B. and Urban N.N., (2001) Action potential propagation in mitral cell lateral dendrites is decremental and controls recurrent and lateral inhibition in the mammalian olfactory bulb. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 98: 319-324.

194. Martinez, D. P. & Freeman,W. J. (1984) Periglomerular cell action on mitral cells in olfactory bulb shown by current source density analysis. Brain Res. 308, 223-233.

195. Mattia D., Kawasaki H., Avoli M. (1997) Repetitive firing and oscillatory activity ofpyramidal-like bursting neurons in the rat subiculum. Exp. Brain Res., 114:507-517.

196. McCormick D. A. and Bal T. (1997) Sleep and arousal: thalamocortical mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 20:185-215.

197. McCormick D. A. and Pape H. C. (1990) Properties of hyperpolarization-activated cationcurrent and its role in rhythmic oscillations in thalamic relay neurons. J. Physiol. Lond. 431:291-318.

198. McQuiston R.A and L.C. Katz (2001) Electrophysiology of Interneurons in the Glomerular Layer of the Rat Olfactory Bulb. J. Neurophysiol., 86:1899-1907.

199. Meisami E, safari L (1981) A quantitative study of the effects of early unilateral olfactorydeprivation on the number and distribution of mitral and tufted cells and of glomeruli in the rat olfactory bulb. Brain Res. 221: 81-107.

200. Meister M. and Bonhoeffer T. (2001) Tuning and topography in an odor map on the rat olfactory bulb. J. Neurosci., 21: 1351-1360.

201. Meredith M. (1986) Patterned response to odor in mammalian olfactory bulb: the influence of intensity. J.Neurophysiol., 56: 572-597.

202. Migliore M., Hines ML, Shepherd GM (2005) The role of distal dendritic gap-junctions in synchronization of mitral cell axonal output. J Comput Neurosci., 18(2): 151-161.

203. Mitzdorf U (1985) Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena. Physiol Rev 65: 37-100.

204. Mombaerts, P. et al. (1996a)The molecular biology of olfactory perception. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 61, 135-145.

205. Mombaerts P., Wang F., Dulac C. et al. (1996b) Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87: 675-686.

206. Mori K (1987) Membrane and synaptic properties of identified neurons in the olfactory bulb. Prog. Neurobiol 29:275-320.

207. Mori, K., Nagao, H. & Yoshihara, Y. (1999) The olfactory bulb: coding and processing of odor molecule information. Science 286, 711-715.

208. Mori K., Yoshihara Y. (1995) Molecular recognition and olfactory processing in the mammalian olfactory system. Prog. Neurobiol. 45: 585-619.

209. Mugnaini, E., Oertel,W. H. &Wouterlood, F. F. (1984) Immunocytochemical localization of GABA neurons and dopamine neurons in the rat main and accessory olfactory bulbs. Neurosci. Lett. 47,221-226.

210. Murphy GJ, Darcy DP and Isaacson JS (2005) Intraglomerular inhibition: signaling mechanisms of an olfactory microcircuit. Nature Neurosci. 8(3): On-line.

211. Neville KR and Haberly LB (2003) Beta and Gamma oscillations in the Olfactory System of the Uretane-Anesthetized Rat. J Neurophysiol 90(6): 3921-3930.

212. Nicoll R.A. (1969) Inhibitory mechanisms in the rabbit olfactory bulb:dendrodendritic mechanisms. Brain Res., 14:157-172.

213. Nicoll R.A. and Jahr C.E. (1982) Self-excitation of olfactory bulb neurons. Nature, 296:441444.

214. Nowicky M.C., Mori K. and Shepherd G.M. (1981) GABAergic mechanisms ofdendrodendritic synapses in isolated turtle olfactory bulb. J. Neurophysiol., 46:639648.

215. Nusser Z., Kay L.M., Laurent G., Homanics G.E., Mody I. (2001) Disruption of GABA(A) receptors on GABAergic interneurons leads to increased oscillatory power in the olfactory bulb network., J.Neurophysiol., 86: 2823-2833.

216. Ohishi H, Akazawa C, Shigemoto R, Nakanishi S, Mizuno N (1995) Distributions of the mRNAs for L-2-amino-4-phosphonobutyrate-sensitive metabotropic glutamate receptors, mGluR4 and mGluR7, in the rat brain J Comp Neurol 360:555-570.

217. Onoda, N. Odor-induced fos-like immunoreactivity in the rat olfactory bulb. Neurosci. Lett. 137,157-160(1992).

218. Onoda M. and Mori K., (1980) Depth distribution of temporal firing patterns in olfactory bulb related to air-intake cycles. J.Neurophysiol. 44: 29-39.

219. Orona E., Scott J., Rainer E. (1983) Different granule cell populations innervate superficial and deep regions of the external plexiform layer in the rat olfactory bulb. J. Comp. Neurol., 217: 227-237.

220. Orona E., Rainer E., Scott J. (1984) Dendritic and axonal organization of mitral and tufted cells in the rat olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 226: 346-356.

221. Pape HC (1996) Queer current and pacemaker: the hyperpolarizationactivated cation current in neurons. Annu Rev Physiol 58:299-327.

222. Patneau D.K. and Mayer M.L. (1990) Structure-activity relationship for amino acidtransmitter candidate acting at N-methyl-D-aspartate and quisquilate receptors. J .Neurosci., 10:2385-2399.

223. Peres-Orive J., et al.(2002) Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science 297: 359-365.

224. Perkel DH, Gerstein GL, Moore GP (1967) Neuronal spike trains and stochastic point processes. I. The single spike train. Biophys J 7:391-418.

225. Peruzzi D., Simaravakrishnan S., Oliver D. L. (2000) Identification of cell types in brain slices of the inferior colliculus. Neuroscience 101:403-416.

226. Phillips C.G, Powell T.P.S. and Shepherd G.M. (1963) responses of mitral cells to stinulation of the lateral olfactory tract in the rabbit. J. Physiol., 168:65-88.

227. Philpot B.D., Lyders E.M., Brunjes P.C. (1998) The NMDA receptor participates in respiration-related mitral cell synchrony. Exp. Brain Res., 118: 205-209.

228. Pinato G., Midtgaard J. (2003) Regulation of granule cells excitability by a low-threshold calcium spike in turtle olfactory bulb. J Neurophysiol., 90(5): 3341-3351.

229. Pinching A.J. and Powell T.P.S. (1971a) The neuron types of the glomerular layer of the olfactory bulb. J. Cell. Sci. 9:305-345.

230. Pinching A.J. and Powell T.P.S. (1971b) The neuropil of the glomeruli of the olfactory bulb. J.Cell.Sci. 9:347-377.

231. Pinching, A. J. & Powell, T. P. The neuropil of the peri glomerular region of the olfactory bulb. J. Cell Sci. 9,379-409 (1971c).

232. Pinching, A. J. & Powell, T. P. Experimental studies on the axons intrinsic to the glomerular layer of the olfactory bulb. J. Cell Sci. 10, 637-655 (1972).

233. Potter S. M., Zheng C., Koos D., Feinstein P., Fraser S., Mombaerts P. (2001) Structure and emergence of specific olfactory glomeruli in the mouse. J. Neurosci. 21: 9713-9723.

234. Price JL, and Powel TPS (1970a) The synaptology of the granule cells in the olfactory bulb. J Cell Sci 7: 125-155.

235. Price J.L., and Powell T.P.S. (1970b) The mitral and short axon cells of the olfactory bulb. J.Cell. Sci. 7: 631-651.

236. Puche A.C., Aungst J.L.,Heyward P. et al. (2003) Neuronal basis for interglomerular circuits in the main olfactory bulb. AchemS XXV Annual Meeting, Sarasota, FL, April 25-29, P. 26

237. Puche A.C., Karnup S.V., Aungst J. et al. (2002) Neural basis for interglomerular circuits. FENS Forum. Paris, France. V. 185. № 20. P. 320.

238. Puopolo M, Belluzzi O (1996) Sodium current in periglomerular cells of rat olfactory bulb in vitro. NeuroReport 7:1846-1850.

239. Puopolo M, Belluzzi O (1998) Inhibitory synapses among interneurons in the glomerular layer of rat and frog olfactory bulbs. J Neurophysiol 80:344-349.

240. Puopolo M. and Belluzzi O. (1998) Functional heterogeneity of periglomerular cells in the rat olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 10:1073-1083.

241. Puopolo M., Belluzzi O. (2001) NMDA-dependent, network-driven oscillatory activityinduced bicuculline or removal Mg2+ in rat olfactory bulb neurons. Eur. J. Neurosci. 13:92-102.

242. Rail W, Shepherd G.M., Reese T.S. and Brightman M.W. (1966) Dendrodendritic synaptic pathway for inhibition in the olfactrory bulb. Exp.Neurol., 14:44-56.

243. Rail W and Shepherd GM (1968) Theoretical reconstruction of field potentials anddendrodendritic synaptic interactions in olfactory bulb. Exp. Neurol. 14: 44-56.

244. Ressler, K. J., Sullivan, S. L. & Buck, L. B. (1993) A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell 73, 597-609.

245. Ribak C.E., Vaughn J.E., Saito K., Barber R. and Roberts E. (1977) Glutamate decarboxilase localization in neurons of the olfactory bulb. Brain Res. 126:1-18.

246. Rochefort C., Gheusi G., Vincent J.-D. and Lledo P.-M. (2002) Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory. J.Neurosci., 22(7): 2679-2689.

247. Rochel S, Margolis FL (1982) Carnosine release from olfactory bulb synaptosomes is calcium-dependent and depolarization-stimulated. J Neurochem 38:1505-1514.

248. Rosselli-Austin L. and Altman J., (1979) The postnatal development of the main olfactory bulb of the rat. J. Dev. Physiol., 1: 295-313.

249. Roy SA, AllowayKD (2001) Coincidence detection or temporal integration? What the neurons in somatosensory cortex are doing. J Neurosci 21:2462-2473.

250. Royet JP, Souchier C, Jourdan F, Ploye H (1988) Morphometric study of the glomerularpopulation in the mouse olfactory bulb: numerical density and size distribution along the rostrocaudal axis. J Comp Neurol (270: 559-568.

251. Royet JP, Distel H, Hudson R, Gervais R. (1998) A re-estimation of the number of glomeruli and mitral cells in the olfactory bulb of rabbit. Brain Res. 788: 35-42.

252. Rubin, B. D. & Katz, L. C. (1999) Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb. Neuron 23:499-511.

253. Rubin, B. D. & Katz, L. C. (2001) Spatial coding of enantiomers in the rat olfactory bulb. Nature Neurosci. 4,355-356.

254. RusakovD.A. and Kullmann D.M. (1998) Extrasynaptic glutamate diffusion in thehippocampus: ultrastructural constraints, uptake and receptor activation. J.Neurosci., 18:3159-3170.

255. Sahara Y, Kubota T, Ichikawa M (2001) Cellular localization of metabotropic glutamate receptors mGluRl, 2/3, 5 and 7 in the main and accessoryolfactory bulb of the rat. Neurosci Lett 312:59-62.

256. Salin PA, Lledo PM, Vincent JD, Charpak S (2001) Dendritic glutamate autoreceptors modulate signal processing in rat mitral cells. J Neurophysiol 85:1275-1282.

257. Sassoe-Pognetto M, Cantino D, Panzanelli P, Verdun di Cantogno L, Giustetto M, Margolis FL, De Biasi S, Fasolo A (1993) Presynaptic colocalization of carnosine and glutamate in olfactory neurones. NeuroReport 5:7-10.

258. Schoenfeld T.A., Marchand J.E. and Macrides F. (1985) Topographic organization of tufted cell axonal projections in the hamster main olfactory bulb: an intrabulbar associational system. J. Comp. Neurol., 235: 503-518.

259. Schoppa N.E. and Westbrook G.L. (1999) Regulation of synaptic timing in the olfactory bulb by an A-type potassium current. Nature Neurosci., 2: 1106-1113.

260. Schoppa NE, Westbrook GL (2001) Glomerulus-specific synchronization of mitral cells in the olfactory bulb. Neuron 31:639-651.

261. Schoppa NE, Westbrook GL (2002) AMPA autoreceptors drive correlated spiking in olfactory bulb glomeruli. Nat Neurosci 5:1194-1202.

262. Schoppa NE, Kinzie JM, Sahara Y, Segerson TP and Westbrook GL (1998) Dendrodendritic inhibition in the olfactory bulb is driven by NMDA receptors. J Neurosci 18: 67906802.

263. Sharp F.R., Kauer J.S., Shepherd G.M. (1977) Laminar analysis of 2-deoxyglucose uptake in olfactory bulb and olfactory cortex of rabbit and rat. J. Neurophysiol. 40: 800-813.

264. Sheikh, S. N., Martin, S. B. & Martin, D. L. Regional distribution and relative amounts of glutamate decarboxylase isoforms in rat and mouse brain. Neurochem. Int. 35, 73-80 (1999).

265. Shepherd G.M. (1963) Neuronal systems controlling mitral cell excitability. J.Physiol. (Lond) 168: 101-117.

266. Shepherd G.M. (1981) The olfactory glomerulus: its significance for sensory processing. In: Brain mechanisms of sensation (Katsuki Y., Norgren S., eds.), New York: Willey, pp. 209-223.

267. Shepherd, G. M. (1990) The Synaptic Organization of the Brain (Oxford Univ. Press, New York).

268. Shepherd GM and Greer C.A. (1990) Olfactory bulb. In: The Synaptic Organization of the Brain (New York: Oxford University Press), pp. 133-169.

269. Shepherd GM and Greer C.A. (1998) Olfactory bulb. In: The Synaptic Organization of the Brain (ed. Shepherd G.M.) (Oxford: Oxford University Press), pp. 159-203.

270. Shipley MT, Mclean JH, Zimmer LA, EnnisM (1996) The olfactory system. In: Handbook of chemical neuroanatomy, Vol 12, Integrated systems of the CNS, Pt III (Bjo'rklund A, Ho"kfelt T, Swanson LW, eds), pp 469-573. Amsterdam: Elsevier.

271. Shipley M.T. and Ennis M. (1996) Functional organization of olfactory system. J. Neurobiol. 30: 123-176.

272. Sik A., Penttonen M., Ylinen A. and Buzsaki G. (1995) Hippocampal CA1 interneurons: An in vivo intracellular labeling study. J. Neurosci. 15:6651-6665.

273. Siklos L., Rickmann M., Joo F., Freeman W.J. and Wolf R. (1995) Chloride is preferentially accumulated in a subpopulation od dendrites and periglomerular cells of the main olfactory bulb in adult rats. Neuroscience. 64: 165-172.

274. Sivaramakrishnan S. and Oliver D. (2001) Distinct K current results in physiologically distinct cell types in the interior colliculus of the rat. J. Neurosci. 21:2861-2877.

275. Smith T.C. and Jahr C.E. (2002) Self-inhibition of olfactory bulb neurons. Nature Neuroscience, 5(8): 760-766.

276. Sobel E.S. and Tank D.W., (1993) Timing of odor stimulation does not alter patterning of olfactory bulb unit activity in freely-breathing rats. J. Neurophysiol., 69: 1331-1337.

277. Spors H and Grinvald A (2002) Spatio-temporal dynamics of odor representation in the mammalian olfactory bulb. Neuron 34: 301-315.

278. Stewart W.B., Kauer J.S. ans Shepherd G.M. (1979) Functional organization of rat olfactory bulb analysed by the 2-deoxyglucose method. J. Comp. Neurol., 185: 715-734.

279. Storch A, Lester HA, Boehm BO, Schwarz J. (2003) Functional characterization ofdopaminergic neurons derived from rodent mesencephalic progenitor cells. J Chem Neuroanat., 26(2): 133-42.

280. Strotmann J., Conzelmann S., Beck A., Feinstein P., Breer H., and Mombaerts P. (2000) Local permutations in the glomerular array in the mouse olfactory bulb. J,Neurosci., 20: 6927-6938.

281. Su H, Alroy G, Kirson ED, Yaari Y (2001) Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. J Neurosci 21:4173— 4182.

282. Takahata M., NagayamaT, Hisada M. (1981) Physiological and morphologicalcharacterization of anaxonic non-spiking interneurons in the crayfish motor control systaem. Brain res. 226:309-314.

283. Treloar, H. B., Feinstein, P., Mombaerts, P. & Greer, C. A. Specificity of glomerular targeting by olfactory sensory axons. J. Neurosci. 22,2469-2477 (2002).

284. Trombley P.Q., Shepherd G.M. (1993) Synaptic transmission and modulation in the olfactory bulb. Curr. Opin. Neurobiol. 3: 540-547.

285. Uchida N., Takahashi Y.K., Tanifuji M., Mori K. (2000) Odor maps in the mammalianolfactory bulb: domain organization and odorant structural features. Nature Neurosci., 3: 1035-1043.

286. Uchida N, Mainen ZF (2003) Speed and accuracy of olfactory discrimination in the rat. Nat Neurosci 6:1224-1229.

287. Urban NN, Sakmann B (2002) Reciprocal intraglomerular excitation and intra- and interglomerular lateral inhibition between mouse olfactory bulb mitral cells. J Physiol (Lond) 542:355-367.

288. Vassar R., Ngai J., Axel R. (1993) Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell 74: 309-318.

289. Vassar R., Chao S.K., Sirtcheran R., Nunez J.M., Vosshall L.B., Axel R. (1994).Topographic organization of sensory projections to the olfactory bulb. Cell 79: 981-991.

290. Vickers N.J., Christinsen T.A., Baker T.C. and Hildebrand J.G. (2001) Odour-prime dynamics influence the brain's olfactory code. Nature, 410: 466-470.

291. Wachowiak M, Cohen LB (1999) Presynaptic inhibition of primary olfactory afferentsmediated by different mechanisms in lobster and turtle. J Neurosci 19:8808-8817.

292. Wachowiak, M. & Cohen, L. B. (1998) Presynaptic afferent inhibition of lobster olfactory receptor cells: reduced action-potential propagation into axon terminals. J. Neurophysiol. 80,1011-1015.

293. Wachowiak M and Cohen LB (2001) Representation of Odorants by Receptor Neuron Input to the Mouse Olfactory Bulb. Neuron 32: 723-735.

294. Walz W. (2000) Role of astrocytes in the clearance of excess extracellular potassium. Neurochem. Int. 36:291-300.

295. Wang DD, Krueger DD, Bordey A. (2003) Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J Neurophysiol., 90(4):2291-302.

296. Wehr M, LaurentG (1996) Odour encoding by temporal sequences of firing in oscillating neural assemblies. Nature 384:162-166.

297. Welker WI (1964) Analysis of sniffing of the albino rat. Behaviour 22:223-244.

298. Wellis D.P. and Kauer J.S. (1993) GABAa and glutamate receptor involvement indendrodendritic synaptic interactions from salamander olfactory bulb. J.Physiol., 469:315-339.

299. Wellis D.P. and Kauer J.S. (1994) GABAergic and glutamatergic synaptic input to identified granule cells in salamander olfactory bulb.

300. Wellis DP, Scott JW (1990) Intracellular responses of identified rat olfactory bulb interneurons to electrical and odor stimulation. J Neurophysiol 64:932-947.

301. Westerlund U, Moe MC, Varghese M, Berg-Johnsen J, Ohlsson M, Langmoen IA, Svensson M. (2003) Stem cells from the adult human brain develop into functional neurons in culture. Exp Cell Res., 289(2):378-83.

302. Wilson DA, Stevenson RJ (2003) The fundamental role of memory in olfactory perception. Trends Neurosci., 26:243-247.

303. White E. (1972) Synaptic organization of the olfactory glomerulus in the mouse. Brain Res., 37:69-80.

304. White E. (1973) Synaptic organization of the mammalian olfactory glomerulus: new findings including an intraspecific variations. Brain Res. 60:299-313.

305. Wilkens L. A. (1988) Hyperpolarizing photoreceptors in the eyes of the giant calm tridacna: physiological evidence for both spiking and non-spiking cell types. J. Comp. Physiol. A. 163:73-84.

306. Wong R.K.S. and D.A Prince (1978) Participation of calcium spikes during intrinsic burst firing in hippocampal neurons. Brain Res. 159:385-390.

307. Xiong W. and Chen W. (2002) Dynamic gating of spike propagation in the mitral cell lateral dendrites. Neuron 34: 115-126.

308. Xu F, Greer CA, Shepherd GM (2000) Odor maps in the olfactory bulb.J Comp Neurol 422:489-495.

309. Xu, F., Kida, I., Hyder, F. & Shulman, R.G. (2000) Assessment and discrimination of odor stimuli in rat olfactory bulb by dynamic functional MRI. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97:10601-10606.

310. Xu F., Liu N., Kida I., Rothman D.L. Hyder F. and Shepherd G.M. (2003) Odor maps ofaldehydes and esters revealed by functional MRI in the glomerular layer of the mouse olfactory bulb. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 100: 11029-11034.

311. Yang, X. et al. (1998) Dynamicmapping at the laminar level of odor-elicited responses in rat olfactory bulb by functional MRI. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95,7715-7720.

312. Yokoi M., Mori K. & Nakanishi S. (1995) Refinement of odor molecule tuning bydendrodendritic synaptic inhibition in the olfactory bulb. Proc. Natl Acad. Sci. USA 92,3371-3375.

313. Young TA, Wilson DA (1999) Frequency-dependent modulation of inhibition in the rat olfactory bulb. Neurosci Lett 276:65-67.

314. Yu G.Z., Kaba H., Saito H. and Seto K. (1993) Heterogenous characteristics of mitral cells in the rat olfactory bulb. Brain Res. Bull., 31: 701-706.

315. Zou Z, Horowitz LF, Montmayeur J-P, Snapper S and Buck LB (2001) Genetic tracing reveals a stereotyped sensory map in the olfactory cortex. Nature 414: 173-179.

316. Zhang C and Restrepo D (2003) Heterogeneous expression of connexin 36 in the olfactoryepithelium and glomerular layer of the olfactory bulb. J. Comp. Neurol., 459: 426-439.

317. Zhao H., Ivic L., Otaki J.M., Hashimoto M., Micoshiba K. and Firestein S. (1998) Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science 279: 237-242.