Основы аттенуации вируса гриппа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, доктор биологических наук Киселева, Ирина Васильевна

• Киселева, Ирина Васильевна
• доктор биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации доктор биологических наук Киселева, Ирина Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ЖИВЫЕ ГРИППОЗНЫЕ ВАКЦИНЫ

1.1. История создания живой гриппозной вакцины. Вакцины прошлых лет

1.2. Современная реассортантная ЖГВ. Требования, предъявляемые к вакцинным штаммам. ЖГВ для разных групп населения.

1.3. «Гриппозные вакцины будущего»

1.3.1. Расширение спектра потенциальных вакцинных штаммов

1.3.2. Вирус гриппа как вектор

1.3.3. ДНК-вакцины.

1.3.4. РНК-иммунизация

1.3.5. «Универсальные» вакцины

1.4. Субстраты для культивирования гриппозных вакцин

1.4.1. Экспериментальные животные

1.4.2. Развивающиеся куриные эмбрионы

1.4.3. Клеточные культуры

ГЛАВА 2. АТТЕНУАЦИЯ ВИРУСОВ ПРИ КОНСТРУИРОВАНИИ

ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ДЛЯ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ

2.1. Традиционные пассажные методы аттенуации путем переадаптации от основного хозяина в гетерологичной системе культивирования получение Ьг мутантов)

2.1.1. Адаптация вируса гриппа к репродукции в легких мышей и хорьков

2.1.2. Адаптация вируса гриппа к репродукции в РКЭ при оптимальной температуре

2.1.3. Пассирование при пониженной температуре холодовая адаптация)

2.2. Аттенуация вируса гриппа с помощью метода генетической рекомбинации

2.3. Характеристика существующих доноров аттенуации

2.3.1. Мутанты с измененным кругом хозяев (Лг)

2.3.2. Температурочувствительные (&) мутанты

2.3.3. Холодоадаптированные доноры аттенуации

2.4. Маркеры аттенуации вакцинных штаммов вируса гриппа

2.4.1. Маркеры аттенуации холодоадаптированных вакцинных штаммов

ГЛАВА 3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ПАТОГЕННОСТИ

И АТТЕНУАЦИИ ВИРУСА ГРИППА

3.1. Функциональная роль отдельных генов в проявлении биологических свойств вируса гриппа

3.1.1. Гемагглютинин и вирулентность

3.1.2. Роль нейраминидазы в определении круга чувствительных клеток

3.1.3. Роль белков полимеразного комплекса в вирулентности

3.1.4. Участие гена, кодирующего белок МР, в проявлении вирулентности

3.1.5. М ген и биологические свойства вируса гриппа

3.1.6. Вклад неструктурных белков N81 и N82 ^ЕР) в проявление биологических свойств вируса гриппа

3.2. Роль отдельных генов в аттенуации вируса гриппа

3.2.1. Роль N8 гена в аттенуации

3.2.2. Роль М гена в аттенуации

3.2.3. Роль NP гена в аттенуации

3.2.4. Роль РА гена в аттенуации

3.2.5. Роль РВ1 гена в аттенуации

3.2.6. Роль РВ2 гена в аттенуации

3.2.7. Роль комбинации внутренних генов в аттенуации

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Основы аттенуации вируса гриппа»

Актуальность проблемы. Грипп и другие острые респираторные заболевания (ОРЗ) по своей социальной значимости, огромному ущербу, наносимому здоровью населения и экономике страны, находятся на первом месте среди всех болезней человека. Заболеваемость гриппом и ОРЗ превышает суммарную заболеваемость всеми остальными инфекциями. Массовый характер ежегодно повторяющихся эпидемий гриппа, резкое повышение смертности от ОРЗ (особенно среди детей и стариков), тяжелые осложнения - все эти причины определяют социально-экономическое значение эпидемий гриппа, а, следовательно, и актуальность разработки средств защиты от гриппа.

Двумя основными направлениями защиты населения от гриппа являются химио- и вакцинопрофилактика. Как и при многих других вирусных инфекциях, вакцинопрофилактика остается основным средством борьбы с гриппом. Короткий инкубационный период, острое начало болезни, высокая восприимчивость населения в период эпидемий способствуют быстрому распространению вируса в человеческом коллективе, что резко снижает перспективность других средств защиты, в том числе и химиопрофилактики.

Для специфической профилактики гриппа используют инактивированную (ИГВ) и живую гриппозную (ЖГВ) вакцины. Разработка живой вакцины против гриппа началась вскоре после выделения в 1937 году А.А.Смородинцевым и сотрудниками первых штаммов возбудителя гриппа [71, 388]. Вначале для подготовки вакцинных штаммов ЖГВ использовался классический «пастеровский» принцип переадаптации возбудителя в организме гетерологичного хозяина. В настоящее время для получения вакцинных штаммов ЖГВ применяют метод рекомбинации (реассортации) эпидемических («диких») вирусов с холодоадаптированными (ХА) донорами аттенуации. Это стало возможным после открытия уникальной особенности генома вируса гриппа - его фрагментированности, что обеспечивает возможность пересортировки генов при одновременном размножении генетически удаленных друг от друга штаммов - актуальных эпидемических штаммов с безвредными для людей донорами аттенуации устаревшей антигенной структуры, в результате чего образуются так называемые реассортантные штаммы, имеющие смешанный геном.

Существенной трудностью работы с ЖГВ, отличающей ее от других профилактических препаратов, является нестабильность состава вакцинных 8 штаммов, обусловленная непрерывным процессом эволюции вируса гриппа. Постоянное изменение антигенных свойств возбудителя гриппа диктует необходимость постоянного обновления состава гриппозных вакцин и подготовки новых актуальных вакцинных штаммов.

Начиная с 1977 года в нашей стране накоплен большой пионерский опыт конструирования и внедрения в практику здравоохранения рекомбинантных ЖГВ типа А для взрослых людей на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2М2) (Лен/17), полученного в результате холодовой адаптации эпидемического вируса А/Ленинград/134/57 (Н2Ы2) (ЛенЛлЛ). В процессе последовательных пассажей при 25°С происходило постепенное накопление мутаций в геноме вируса «дикого» типа ЛенЛлЛ, сопровождаемое повышением степени его аттенуации. Для получения рекомбинантных штаммов, пригодных для иммунизации детей, был подготовлен донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (Н2М2) (Лен/47), который был получен из вируса Лен/17 путем его дополнительного 30-кратного пассирования при низкой температуре [19]. Для подготовки реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ типа В для взрослых и детей используется единый донор аттенуации В/СССР/60/69 [88]. Современная коммерческая ЖГВ представляет собой трехкомпонентный препарат, включающий в себя ХА реассортантные штаммы А (НЗМ2) + А (Н1ГМ1) + В.

Многолетние исследования холодоадаптированной реассортантной ЖГВ подтвердили ее безвредность и эпидемиологическую эффективность [65-67, 88, 89, 225, 373, 374], однако оставался нерешенным ряд вопросов, в том числе:

1. Не существовало единой концепции молекулярных механизмов аттенуации ХА штаммов вируса гриппа А. Весьма ограничены данные о роли мутаций в отдельных генах или их комбинаций в аттенуации ХА вирусов - доноров аттенуации и полученных на их основе реассортантных вакцинных штаммов.

2. До сих пор лабораторный контроль реассортантных вакцинных штаммов включал в себя только определение их температурочувствительности (& фенотип) и холодоадаптированности (са фенотип) в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). В то же время для более полного контроля биологических свойств кандидатов в вакцинные штаммы ЖГВ представляется целесообразным расширить спектр используемых маркеров аттенуации.

3. Существующий метод РС!Ч-рестрикционного анализа состава генома реассортантных штаммов, подготовленных на основе доноров аттенуации Лен/17 и Лен/47 (КПтоу, Сох, 1995), ограничен изучением только части мутаций и не позволяет оценить сохранность всех кодирующих мутаций в геноме ХА вирусов, в 9 частности, при подготовке вакцинных штаммов или изучении генетической стабильности изолятов от лиц, привитых ЖГВ.

4. В настоящее время производство ЖГВ у нас в стране и за рубежом основано на общеупотребительном, но экономически неоправданном использовании РКЭ в качестве сырья для выделения и последующего выращивания вируса. Практический интерес представляет разработка адекватных культуральных клеточных систем, достаточно чувствительных к циркулирующим штаммам вируса гриппа и способных обеспечить накопление больших количеств вирусной биомассы.

Все вышеизложенное определило актуальность и своевременность данного исследования. Основной целью настоящей работы явилось установление генетических основ аттенуации холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А.

Для решения поставленной цели в задачи исследования входило:

1. Изучение степени участия отдельных мутантных генов и их комбинаций в процессе аттенуации ХА вирусов - донора аттенуации Лен/17 и реассортантных вакцинных штаммов, полученных на его основе.

2. Модификация метода РС1Ч-рестрикционного анализа ДНК-копий генов вируса гриппа, позволяющая определять не только структуру генома исследуемых ХА реассортантных вирусов, но и наличие в нем всех значащих мутаций, известных для внутренних генов ХА вирусов Лен/17 и Лен/47.

3. Изучение генетической стабильности мутаций в геноме ХА вирусов.

4. Поиск новых маркеров аттенуации для первичного скрининга ХА реассортантных вакцинных штаммов.

5. Разработка новых вариантов ХА реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ в соответствии с рекомендациями ВОЗ при появлении в циркуляции актуальных эпидемических вариантов вируса гриппа.

6. Поиск нового субстрата (клеточных культур) для получения и культивирования ХА реассортантных вакцинных штаммов.

Научная новизна и теоретическое значение работы. Основным итогом выполненной работы является обоснование нового научного направления, заключающегося во всестороннем изучении механизмов аттенуации вируса гриппа А. Полученные результаты позволили сформулировать концепцию, определяющую молекулярно-генетические основы формирования температуроустойчивости, холодоадаптированности и аттенуации для лабораторных животных реассортантных вакцинных штаммов, полученных на основе ХА доноров аттенуации и современных эпидемических вирусов.

10

Обоснование нового научного направления и формулировка концепции, раскрывающей молекулярные механизмы аттенуации вируса гриппа А, базируются на следующих положениях, характеризующих новизну полученных данных:

1. Впервые изучен механизм аттенуации ХА вирусов гриппа А на модели реассортантных штаммов, полученных при рекомбинации ХА донора аттенуации Лен/17 с генетически удаленными эпидемическими вирусами А (Н1М1) и А (НЗЫ2) (одно- или полигенные реассортанты) или с родственным штаммом «дикого» типа ЛенЛлД (одно- или полигенные мутанты). Впервые получена уникальная коллекция одногенных (ОГМ) и полигенных мутантов (ПГМ) вируса гриппа при реассортации генетически родственных вирусов - вируса «дикого» типа ЛенЛлЛ и его ХА варианта Лен/17. Показана высокая генетическая стабильность одногенных мутантов в процессе репродукции в организме лабораторных животных.

2. На модели ОГМ впервые показано, что замена \/а1-478-1еи в РВ2 гене, также как замены 1у8-265-Азп и \/а1-591-11е в РВ1 гене независимо друг от друга приводят к формированию фенотипа и аттенуации для хорьков. Мутации 1еи-28-Рго и \/а1-341 -1еи в РА гене, так же как мутация \/а1-478-1еи в РВ2 гене, ответственны за проявление са фенотипа. При этом мутации в РА гене не приводят к реализации аттенуирующего фенотипа, что позволяет предположить наличие коррелятивной связи между аттенуацией и ¡в, но не между аттенуацией и са фенотипом ХА вирусов.

3. Впервые показано, что комбинация двух полимеразных генов РВ2 + РВ1 в геноме ПГМ обеспечивает статистически достоверное усиление их фенотипа, сочетание же двух полимеразных генов РВ2 + РА углубляет са фенотип. Это свидетельствует о том, что в аттенуации ХА вируса Лен/17 решающее значение имеют не только сами гены полимеразного комплекса, но и их констелляция.

4. Изучение значимости отдельных мутантных генов в аттенуации реассортантов между генетически удаленными родительскими вирусами (ХА донорами аттенуации и современными эпидемическими вирусами) показало, что решающую роль играет мутация в РВ2 гене. Замена мутантного РВ2 гена на ген от эпидемического родителя регулярно приводила к потере реассортантами & фенотипа, а, возможно, и аттенуации.

5. Изучение генетической стабильности мутаций в геноме изолятов от детей 3-6 лет, привитых ЖГВ для взрослых, впервые показало (а) сохранность семи из восьми кодирующих мутаций во внутренних генах РВ2 (\/а1-478-1еи), РВ1 (Ьув

11

265-Авп, \/а1-591-11е), РА (1еи-28-Рго, Уа1-341-1еи), М1 (Не-15Л/а1), и N82 (МеМОО-Ие); (б) у трети изученных изолятов выявлена дополнительная мутация вег-490-Агд в РВ2 гене, известная для более аттенуированного ХА вируса Лен/47; (в) одна мутация, кодирующая замену А1а-86-ТЬг в белке М2, не была выявлена у половины изолятов. Т.о., в процессе репродукции в организме детей ЖГВ, приготовленной на основе ХА донора Лен/17, не только не происходит утраты какой-либо из мутаций в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса, но в ряде случаев обнаруживается мутация, обеспечивающая дополнительную генетическую стабильность ЖГВ.

Практическая значимость работы. Работа имеет большое народнохозяйственное значение, открывая новый этап в получении и быстром лабораторном контроле холодоадаптированных реассортантных вакцинных штаммов для производства живой гриппозной вакцины для взрослых и детей. Усовершенствована система первичного скрининга кандидатов в вакцинные штаммы ЖГВ. Разработаны новые маркеры, коррелирующие с аттенуацией.

Подготовленные автором холодоадаптированные реассортантные вакцинные штаммы А/17/Нанчанг/95/20 (НЗМ2), А/47/Нанчанг/95/13 (НЗМ2), А/17/Перт/95/29 (Н1М), А/17/Пекин/95/25 (Н11Ч1), А/47/Пекин/95/35 (Н11\11), В/60/Петербург/95/20, А/47/Иоганнесбург/96/7/7 (Н11Ч1), А/17/Сидней/97/76 (НЗМ2), А/47/Сидней/97/14 (НЗН2), А/17/Новая Каледония/99/145 (Н1Ы1), А/47/Новая Каледония/99/156 (Н11\И) запатентованы и использовались в промышленном производстве интраназальной ЖГВ для детей и для взрослых с 1996 года по настоящее время.

Обоснована возможность применения клеточной культуры МОСК для всех этапов подготовки и культивирования вакцинных штаммов ЖГВ. Показано, что культура клеток МйСК не требует присутствия трипсина в культуральной среде и поддерживает активную репродукцию неадаптированных к ней аллантоисных культур холодоадаптированных реассортантных вакцинных штаммов, доноров аттенуации и эпидемических вирусов.

Основные положения, выносимые на защиту. Показана ведущая роль генов полимеразного комплекса в формировании и са фенотипа ХА вируса Лен/17. Мутации в генах РВ2 и РВ1 приводят к приобретению вирусом температурочувстви-тельности, а мутации в генах РВ2 и РА - к холодоадаптированности. Установлена корреляция между аттенуацией и & фенотипом ХА вируса Лен/17. Комбинация двух полимеразных генов РВ2 + РВ1 в геноме реассортантов между ЛенАлД и Лен/17

12 обеспечивает статистически достоверное усиление фенотипа, сочетание же двух полимеразных генов РВ2 + РА углубляет са фенотип.

Анализ ¿в фенотипа реассортантов, содержащих в составе генома от двух до шести мутантных генов от ХА донора аттенуации, а остальные гены - от генетически удаленного современного эпидемического вируса, показал, что включение мутантного РВ2 гена в комплексе с любым другим полимеразным геном (РВ1 и/или РА) ХА донора аттенуации в геном таких реассортантов регулярно приводит к приобретению ¿в фенотипа. Включение в геном реассортантного вируса РВ2 гена от эпидемического родителя приводит к потере температурочувствительности.

Установлена высокая генетическая стабильность мутаций в геноме ХА вирусов - доноров аттенуации и реассортантных вакцинных штаммов, полученных на их основе. Показана высокая генетическая стабильность кодирующих мутаций во внутренних генах генома изолятов от детей дошкольного возраста, привитых ЖГВ, приготовленной на основе ХА донора аттенуации Лен/17.

Установлена принципиальная возможность использования культуры клеток МРСК в качестве альтернативного куриным эмбрионам субстрата для всех этапов подготовки и культивирования ХА реассортантных вакцинных штаммов.

13

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛА В А 1. ЖИВЫЕ ГРИППОЗНЫЕ ВАКЦИНЫ

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Киселева, Ирина Васильевна

ВЫВОДЫ

1. Доказана ведущая роль мутаций в полимеразных генах в аттенуации холодоадаптированных вакцинных штаммов вируса гриппа А. Рассогласование генов полимеразного комплекса холодоадаптированного штамма с включением в него РВ2 гена вирулентного родителя приводит к потере реассортантами ts свойств, а, возможно, и аттенуирующего фенотипа.

2. Впервые получена уникальная коллекция одногенных и полигенных мутантов путем реассортации близкородственных вирусов гриппа: эпидемического штамма А/Ленинград/134/57 (Н2М2) и его холодоадаптированного варианта А/Ленин-град/134/17/57 (Н2М2). Показана высокая генетическая стабильность одногенных мутантов при их репродукции в организме лабораторных животных.

3. На модели одногенных мутантов впервые установлена роль отдельных мутантных генов в аттенуации холодоадаптированного вируса А/Ленин-град/134/17/57 (Н2М2). Показано, что мутации в РВ2 и РВ1 генах обеспечивают формирование & фенотипа и аттенуацию для лабораторных животных. Мутации в РВ2 и РА генах ответственны за проявление са фенотипа. При этом феномен аттенуации более тесно коррелирует с ts фенотипом холодоадаптированных вирусов, чем с их са фенотипом.

4. На модели полигенных мутантов впервые показано, что присутствие в геноме вируса двух мутантных полимеразных генов РВ2 + РВ1 приводит к статистически достоверному усилению ^ фенотипа, сочетание двух мутантных полимеразных генов РВ2 + РА усиливает са фенотип.

5. Впервые показана высокая генетическая стабильность кодирующих мутаций в генах РВ2, РВ1, РА, М1 и N82 в геноме изолятов от детей дошкольного возраста, привитых ЖГВ, приготовленной на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2М2).

6. Модифицирован метод РСР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов вируса гриппа, что впервые позволило определять не только структуру генома исследуемых холодоадаптированных реассортантных вирусов гриппа А, но и наличие в нем всех значащих мутаций, известных для холодоадаптированных доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ы2) и А/Ленинград/134/47/57 (Н2М2).

7. Усовершенствована система первичного скрининга кандидатов в вакцинные штаммы. Разработаны новые маркеры, коррелирующие с аттенуацией: степень

194 цитопатического действия вируса гриппа в культуре клеток MDCK при 40°С и уровень его токсичности для мышей.

8. В период с 1995 по 2000 год подготовлены одиннадцать холодоадаптированных реассортантных вакцинных штаммов типа А и В. Все штаммы запатентованы и переданы для промышленного производства живой гриппозной вакцины.

9. Впервые установлена принципиальная возможность использования культуры клеток MDCK в качестве альтернативного развивающимся куриным эмбрионам субстрата для всех этапов подготовки и культивирования холодоадаптированных реассортантных вакцинных штаммов для ЖГВ.

Заключение

Установлена возможность использования культуры клеток МОСК в качестве субстрата для подготовки и культивирования реассортантных штаммов. Культура клеток МОСК не требует присутствия трипсина в культуральной среде и поддерживает репродукцию аллантоисных культур «куриных» ХА доноров аттенуации и реассортантных вакцинных штаммов, полученных на их основе, на высоком уровне. Кроме того, доказана возможность получения вакцинных штаммов в культуре клеток МОСК на основе всесторонне охарактеризованных безвредных для людей аттенуированных «куриных» ХА доноров аттенуации, которые активно размножаются в ней и могут быть успешно использованы для рекомбинации. Поэтому для получения реассортантных вакцинных штаммов в клеточной системе МОСК не потребуется создания нового, адаптированного к культуре клеток «тканевого» донора аттенуации. Реассортанты, полученные в клеточной системе, сохраняли & и са фенотип, характерный для реассортантов, полученных в РКЭ.

175

Г Л А В А 10. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Массовый характер эпидемий гриппа, резкое повышение смертности от ОРЗ (особенно среди детей и стариков), тяжелые осложнения определяют социально-экономическое значение эпидемий гриппа, а, следовательно, и актуальность разработки средств защиты от гриппа. Существуют два направления специфической профилактики гриппа - вакцинация живой и инактивированной гриппозными вакцинами. Современная коммерческая ЖГВ представляет собой трехкомпонентный препарат, состоящий из ХА реассортантных штаммов A (H3N2) + A (H1N1) + В. В настоящее время в России для получения реассортантных вакцинных штаммов вируса гриппа типа А ЖГВ для взрослых и для детей применяют разные доноры аттенуации, полученные в результате холодовой адаптации вируса Лен/wt - Лен/17 и Лен/47 соответственно [8, 19]. Для В компонента современной тривалентной вакцины используется единый донор аттенуации В/СССР/60/69 для детской и взрослой вакцины [88]. В США разработаны свои доноры аттенуации А/АА и В/АА, которые также применяют для получения как взрослой, так и детской вакцины [116, 254, 298, 299].

Существенной трудностью работы с ЖГВ, отличающей ее от других профилактических препаратов, является необходимость постоянного обновления состава гриппозных вакцин, обусловленная непрерывным процессом эволюции вируса гриппа.

Многолетние исследования подтвердили безусловную безвредность и эпидемиологическую эффективность как отечественной [4, 5, 8, 12, 65-67, 88, 225, 373, 374, 349-352 и другие], так и зарубежной ХА реассортантной ЖГВ [96, 97, 116, 117, 118, 129, 132, 134, 150, 209, 213, 219, 220, 234, 258, 261, 262, 290, 293-307, 357, 358, 376, 419, 446, 450, 451], однако ряд вопросов оставался невыясненным:

- Не существовало единой концепции молекулярных механизмов аттенуации ХА штаммов вируса гриппа. Весьма ограничены данные о роли мутаций в отдельных генах или их комбинаций в аттенуации ХА вирусов - доноров аттенуации и полученных на их основе реассортантных вакцинных штаммов.

- До настоящего времени лабораторный контроль реассортантных вакцинных штаммов для ЖГВ включал в себя только определение их ts и са фенотипа в РКЭ. В то же время для первичного скрининга кандидатов в вакцинные штаммы ЖГВ необходимо иметь набор маркеров аттенуации, гарантирующий их безвредность для людей. В этой связи представляется необходимым расширить спектр методов

176 первичного скрининга, используемых в качестве маркеров аттенуации для более полного контроля биологических свойств кандидатов в вакцинные штаммы.

- Существующий метод РСР-рестрикционного анализа состава генома реассортантных штаммов, подготовленных на основе доноров аттенуации Лен/17 и Лен/47 [236, 237], ограничен изучением только части мутаций и не позволяет оценить сохранность в геноме ХА вирусов всех кодирующих мутаций, что имеет исключительно важное значение при анализе генетической стабильности ХА реасортантных вакцинных штаммов.

- Современная ЖГВ производится с использованием РКЭ. Однако в последнее время широко обсуждается перспектива замены РКЭ как единственного субстрата для выделения и последующего выращивания вируса гриппа и наработки гриппозных вакцин на альтернативную, более простую и экономичную клеточную систему культивирования. На западе уже сейчас производство ИГВ переводится в культуру клеток МйСК, живая же гриппозная вакцина пока сильно отстает в этом отношении.

Все вышеизложенное определило актуальность и своевременность данного исследования. Основной целью настоящей работы явилось установление генетических основ аттенуации ХА штаммов вируса гриппа типа А. Для решения поставленной цели в задачи исследования входило: (1) Изучение степени участия отдельных мутантных генов и их комбинаций в процессе аттенуации ХА вирусов -донора аттенуации Лен/17 и реассортантных вакцинных штаммов, полученных на его основе. (2) Модификация метода РС!Ч-рестрикционного анализа ДНК-копий генов вируса гриппа, позволяющая определять не только структуру генома исследуемых ХА реассортантных вирусов, но и наличие в нем всех значащих мутаций, известных для внутренних генов ХА вирусов Лен/17 и Лен/47. (3) Изучение генетической стабильности мутаций в геноме ХА вирусов. (4) Поиск новых маркеров аттенуации для первичного скрининга ХА реассортантных вакцинных штаммов. (4) Разработка новых вариантов ХА реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ в соответствии с рекомендациями ВОЗ при появлении в циркуляции актуальных эпидемических вариантов вируса гриппа. (5) Поиск нового субстрата (клеточных культур) для получения и культивирования ХА реассортантных вакцинных штаммов.

Приказами №150/40 Минздрава СССР [61] и №156/29 Минздрава РФ «О подготовке новых вакцинных производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрении в производство вакцинных и диагностических препаратов» [62] ответственность за своевременную подготовку вакцинных штаммов для ЖГВ в

177 течение ряда лет возложена на НИИЭМ РАМН. Поэтому одним из направлений нашей работы являлось регулярное обновление состава живой гриппозной вакцины. В течение 1995-2000 гг. было подготовлено одиннадцать ХА реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ типа А и В - А/17/Нанчанг/95/20 (H3N2), А/47/Нанчанг/95/13 (H3N2), А/17/Перт/95/29 (H1N1), А/17/Пекин/95/25 (H1N1), А/47/Пекин/95/35 (H1N1), В/60/Петербург/95/20, А/47/Иоганнесбург/96/7/7 (H1N1), А/17/Сидней/97/76 (H3N2), А/47/Сидней/97/14 (H3N2), A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1) и A/47/Новая Каледония/99/156 (H1N1).

Для подготовки реассортантов были использованы традиционные методы совместного культивирования в РКЭ вновь появляющихся эпидемических вирусов с ХА донорами аттенуации Лен/17, Лен/47 и В/СССР/60/69 с последующей низкотемпературной селекцией в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. В результате совместного культивирования эпидемического вируса и ХА донора аттенуации получается большое количество клонов. В этой связи особую актуальность приобретает разработка надежных маркеров аттенуации. Только после первичного отбора реассортантных клонов с определенными биологическими свойствами целесообразно приступать к следующему этапу скрининга -определению состава их генома, с целью отбора вариантов с генетической формулой 6/2 (гены, кодирующие НА и NA - от эпидемического вируса, шесть внутренних генов - от ХА донора аттенуации).

Кандидаты в вакцинные штаммы должны удовлетворять ряду признаков, и в том числе характеризоваться температурочувствительностью репродукции (ts фенотип), т.е. не размножаться при 40°С, и репродуцироваться при субоптимальной температуре 25°С (са фенотип). Как правило, проверка этих признаков осуществляется путем параллельного титрования кандидата в вакцинные штаммы при оптимальной (33°С), субоптимальной (25°С) и непермиссивной (40°С) температуре в РКЭ.

Эпидемические вирусы гриппа типа А, циркулировавшие до 1976 года, были нечувствительны ни к пониженной (поп-са фенотип), ни к повышенной температуре (non-ts фенотип) [26, 60]. Вирусы, получившие распространение после 1976 года, характеризовались измененным диапазоном температурочувствительности. Эти штаммы, подобно ХА вариантам, пассированным при 25°С, не были способны к репродукции при 40°С, т.е. имели ts фенотип. Однако, независимо от ts признака, они слабо размножались при низкой температуре, т.е. не имели са фенотипа, отличаясь от ХА доноров аттенуации. Отсутствие са фенотипа у эпидемических

178 вирусов способствовало быстрому и надежному скринингу вакцинных штаммов, которые этим фенотипом должны обладать.

Однако, многие современные эпидемические вирусы, такие, как А/Перт/13/95 (H1N1), А/Пекин/262/95 (H1N1), А/Иоганнесбург/82/96 (H1N1), А/Сидней/5/97 (H3N2), в той или иной степени способны к репродукции при пониженной температуре. При использовании для реассортации эпидемических вирусов, обладающих са фенотипом, в стандартной схеме подготовки реассортантных вакцинных штаммов остается только один селектирующий фактор - антисыворотка к донору аттенуации, и, как следствие этого - получается набор ХА реассортантных штаммов с разнообразной комбинацией мутантных и немутантных генов, что существенно осложняет процесс первичного скрининга кандидатов в вакцинные штаммы.

В связи с тем, что са маркер становится малоинформативным, а также потому, что наиболее важное свойство ХА реассортантного вакцинного штамма -его ts фенотип, коррелирующий с отсутствием способности к репродукции в нижних отделах респираторного тракта [72, 445], при отборе вакцинных штаммов вируса гриппа все большее значение приобретают ts маркеры. В связи с этим возникла настоятельная необходимость расширения спектра именно ts критериев отбора реассортантов-кандидатов в вакцинные штаммы. В нашей работе для определения ts фенотипа родительских вирусов и их рекомбинантов мы использовали новый ts маркер, предусматривающий определение уровня ЦПД различных штаммов вируса гриппа на перевиваемую культуру клеток MDCK при температуре инкубации 40°С. Было показано, что все ХА реассортанты, имеющие формулу генома 6/2, оказывают ЦПД, сходное с таковым доноров аттенуации Лен/17 и Лен/47, и значительно отличаются по этому признаку от «диких» вирусов.

В качестве еще одного нового критерия оценки ХА рекомбинантных вакцинных штаммов предложено использовать определение степени их токсичности для белых мышей, т.е. способности неразведенных аллантоисных культур неадаптированных к мышам вирусов гриппа вызывать развитие острого отека легких при отсутствии видимой репродукции вируса в легких. Штамм считали токсичным, если в течение первых 3-4 дней после интраназального заражения наступала гибель 60-100% подопытных животных от развития острого геморрагического отека легких. Изучение этой характеристики весьма актуально в свете того, что современные эпидемические штаммы характеризуются более высокой токсичностью по сравнению со штаммами прежних лет выделения.

179

Так, если штаммы вируса гриппа типа А (НЗМ2), выделенные в 1970-1980 гг., за редким исключением обладали умеренной токсичностью, вызывая развитие острого токсикоза и гибель 10-40% зараженных животных от геморрагического отека легких, а штаммы А (Н1 N1) были слабо или совсем нетоксичными, то современные эпидемические штаммы, независимо от их антигенной структуры, обладают более высокой токсичностью для мышей.

В этой связи в стандартную схему отбора вирусов-кандидатов в вакцинные штаммы для ЖГВ была дополнительно включена оценка уровня их токсичности. Было показано, что ни реассортанты с формулой генома 6/2, ни доноры аттенуации не обладали токсичностью для мышей, в то время как штаммы, оказывающие выраженное ЦПД в культуре клеток при температуре инкубации 40°С, вызывали у мышей развитие острого отека легких. Мы полагаем, что установленная корреляция уровня токсичности вирусов для мышей со степенью их цитопатической активности на клетках МРСК при температуре инкубации 40°С позволяет отнести маркер токсичности к группе маркеров.

Свойство различных штаммов вируса гриппа вызывать у мышей развитие острого отека легких непосредственным образом связана и с их способностью преодолевать трансплацентарный барьер. При развитии у экспериментальных животных острого вирусного токсикоза происходит резкое нарушение проницаемости кровеносных сосудов, приводящее к выраженной виремии [41]. При этом наблюдается занос вируса с кровотоком во внутренние органы животных, и в том числе вирус проникает и в плоды беременных самок [27]. Для изучения поведения ХА вирусов гриппа в организме беременных животных были проведены ограниченные эксперименты с тремя штаммами вируса гриппа. Беременных самок белых мышей заражали интраназально высокотоксичным эпидемическим вирусом гриппа А/Сидней/5/97 (НЗМ2), ХА донором аттенуации Лен/17 и ХА реассортантным вакцинным штаммом А/17/Сидней/97/76 (НЗМ2).

Было показано, что, в отличие от эпидемического вируса, донор аттенуации и вакцинный штамм не были способны проникать в кровь, диссеминировать по внутренним органам и преодолевать трансплацентарный барьер. Эпидемический вирус удавалось регулярно выделять из крови, легких и плодов беременных самок. Эти данные хорошо согласуются с результатами других авторов [27].

Данный показатель может быть в дальнейшем использован в качестве еще одного критерия отбора ХА реассортантных вирусов - маркера виремии у беременных самок. Полученные результаты являются дополнительным аргументом

180 в пользу расширения показаний применения ЖГВ у беременных женщин, которые, как известно, относятся к группе «высокого риска» заболеваемости гриппом.

Лабораторный анализ подготовленных нами современных реассортантных вакцинных штаммов для ЖГВ, проведенный на основании классических и предложенных нами маркеров аттенуации, показал, что все вакцинные штаммы характеризовались следующими показателями: (а) обладали признаком высокой репродуктивное™ в опытах на РКЭ, т.е. активно размножались при оптимальной температуре инкубации 33°С; (б) обладали признаком холодоустойчивости в опытах на РКЭ, активно репродуцируясь при температуре 25°С; (в) температурочувствительными в опытах на РКЭ, плохо размножаясь при повышенной до 40°С температуре инкубации; (г) обладали ts признаком в опытах на клетках MDCK, оказывая незначительное цитопатическое действие на клетки при повышенной до 40°С температуре инкубации; (д) были полностью нетоксичными для мышей при интраназальном введении массивных доз вируса.

Клинические испытания на волонтерах показали, что все изученные рекомбинанты были аттенуированы для людей, т.е. не вызывали средних и сильных лихорадочных и системных вакцинальных реакций. Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) во всех случаях составил 0%. Слабые реакции, отмеченные у ограниченного числа привитых, носили транзиторный характер. Т.о. все отобранные нами реассортантные штаммы соответствовали требованиям, предъявляемым к кандидатам в вакцинные штаммы ЖГВ и были внедрены в практику здравоохранения. Всего в 1996-2001 гг. было выпущено около 40 млн доз живой интраназальной гриппозной тривалентной вакцины, подготовленной из одиннадцати перечисленных выше штаммов.

Любое исследование молекулярно-генетических механизмов должно проводиться на модели генетически чистых линий. Это в полной мере относится и к изучению механизмов аттенуации ХА доноров и реассортантных вакцинных штаммов. Свойства ХА аттенуированных реассортантных штаммов в значительной степени определяются гомогенностью популяции вируса и ее генетической стабильностью. Генетическая стабильность ХА донора аттенуации для детской вакцины (Лен/47) была показана ранее. Эти исследования были начаты в 1990 году с использованием популярного тогда теста рекомбинации с ts мутантами ВЧП [53], а в 1995 году завершились экспериментами с применением высокочувствительного метода секвенирования [239]. В наблюдениях за детьми 7-10 лет, привитых ЖГВ,

181 подготовленной на основе ХА вируса Лен/47, была продемонстрирована высокая стабильность мутаций в геноме реизолятов [239]. Что же касается донора аттенуации для взрослой вакцины, в литературе имеются данные о том, что часть реизолятов от детей, привитых реассортантами вируса Лен/17, утрачивала мутацию А1а-86-ТИг в М2 гене. Было высказано предположение о том, что это скорее результат гетерогенности самой популяции вируса Лен/17, чем нестабильности мутаций в его геноме [243]. К сожалению, изучению генетической стабильности отечественной ЖГВ для взрослых до настоящего времени была посвящена только одна работа [243]. Поэтому перед нами стояла задача изучения генетической стабильности как реассортантных вакцинных штаммов, полученных на основе ХА донора аттенуации Лен/17, так и популяции самого вируса Лен/17, изоляция из нее клонов, изучение их генетической структуры и биологических свойств.

Такое пристальное внимание было уделено вирусу Лен/17 и еще по одной причине - как уже упоминалось выше (см. раздел 1.2, глава 1), в настоящее время ведется изучение возможности использования взрослого варианта ЖГВ для всех возрастных групп [155, 192]. Поэтому всестороннее изучение Лен/17 имеет первостепенное значение для принятия окончательного решения об использовании этого вируса в качестве единого донора аттенуации.

При анализе генетической стабильности вирусов гриппа решающую роль играет правильный подбор адекватной методики исследования. В 1995 году КПтоу и Сох [236, 237] разработали для ХА доноров аттенуации Лен/17 и Лен/47 высокочувствительный метод РСР-рестрикционного анализа амплифицированных ДНК-копий генов, позволяющий в кратчайшие сроки определять состав генома реассортантов-кандидатов в вакцинные штаммы. До 1995 года для этой цели использовали менее точный и более трудоемкий метод электрофореза одноцепочечных [16, 343, 360] или двуцепочечных [44, 182, 183, 200] РНК в ПААГ. Однако, до настоящего времени РСР-рестрикционный метод позволял определить наличие в геноме ХА вирусов Лен/17 и Лен/47 только нескольких мутаций. Этого было достаточно для быстрой идентификации происхождения генов реассортанта между донором аттенуации и современным эпидемическим вирусом, однако установить с его помощью наличие или отсутствие всех значащих мутаций в генах, кодирующих негликозилированные белки ХА штаммов вируса гриппа, не представлялось возможным. Расширение возможностей РСР-рестрикционного метода имеет первостепенное значение для выяснения роли отдельных мутаций в аттенуации ХА вирусов, для углубленного изучения состава генома реассортантов,

182 используемых для подготовки вакцинных штаммов для ЖГВ, а также для изучения их генетической стабильности после репликации в организме привитых людей, когда необходимо отслеживать сохранение каждой кодирующей мутации в геноме реизолятов. Поэтому нашей задачей явилось усовершенствование метода РСР-рестрикционного анализа для анализа всех кодирующих мутаций во внутренних генах ХА вирусов Лен/17 и Лен/47.

На основе данных секвенирования вирусов ЛенАлД, Лен/17 и Лен/47 [238] были сконструированы четыре дополнительных пары праймеров для идентификации следующих мутаций во внутренних генах доноров аттенуации: \/а1-591-11е и Ме1-317-Ие в РВ1 гене, \/а1-341-1еи в РА гене и Ие-15-\/а1 в М1 гене. Для рестрикционного анализа РСР-амплифицированных ДНК фрагментов РВ1 (нуклеотиды 740-1044 и 1767-1986), РА (нуклеотиды 900-1077) и М1 (нуклеотиды 39-249) генов были использованы эндонуклеазы Муп I, Рок I, XI и Аэп I соответственно. Этот подход в сочетании с оригинальной методикой [236, 237] позволяет проследить за сохранностью в составе генома иследуемого вируса всех кодирующих мутаций, известных для внутренних генов доноров аттенуации.

Изучение генетической стабильности донора аттенуации Лен/17 проводилось в двух направлениях - во-первых, было осуществлено определение стабильности мутаций у реизолятов, выделенных от лиц, привитых реассортантами, полученными на основе вируса Лен/17, и, во-вторых, был проведен ретроспективный анализ состава мутаций во внутренних генах реассортантных вакцинных штаммов, подготовленных на основе донора аттенуации Лен/17 и входивших в разные годы в состав коммерческой ЖГВ для взрослых.

Изучение генетической стабильности реизолятов проводили в наблюдениях за детьми в возрасте 3-6 лет, однократно привитыми ЖГВ для взрослых, в состав которой входили реассортанты, подготовленные на основе рекомендованных ВОЗ на эпидемический сезон 1999-2000 гг. штаммов А/Сидней/5/97 (НЗМ2), А/Пекин/262/95 (Н11Ч1) и В/Петербург/2/95 (В/Пекин/184/93-Пке). Использование модифицированного метода РС!Ч-рестрикции позволило впервые проследить за сохранением каждой кодирующей мутации в геноме реизолятов после репликации вакцинных штаммов в организме привитых лиц. Анализ изолятов типа А показал, что все они сохранили семь из восьми мутаций во внутренних генах. Лишь одна из мутаций, кодирующая аминокислотную замену аланина на треонин в белке М2, не была выявлена примерно у половины изолятов. Так как и в нашем, и в описываемом ранее опыте [243] изоляты, утратившие мутацию в М2 гене, были выделены от

183 здоровых детей, можно предположить, что мутация Ala-86-Thr несущественна для аттенуации ХА донора Лен/17 и реассортантов, полученных на его основе. Это же подтверждают и экспериментальные данные, полученные с клонами Лен/17/7 и Лен/17/28, которые, утратив мутацию Ala-86-Thr в М2 гене, сохранили са, ts и att фенотипы, присущие оригинальному неклонированному вирусу Лен/17.

Так как мутации в полимеразных генах РВ2 и РВ1 играют решающую роль в аттенуации донора Лен/17, очень важным являлось подтверждение их сохранности во всех изолятах. В этой связи интересно отметить, что у трети изученных изолятов выявлена дополнительная мутация, кодирующая аминокислотную замену Ser-490-Arg в положении 490 белка РВ2. Известно, что эта мутация существует в геноме более аттенуированного ХА донора аттенуации Лен/47, используемого для получения штаммов ЖГВ для детей [238]. Обнаружение этой мутации в геноме некоторых изолятов свидетельствует о том, что в процессе репродукции вакцинного вируса в организме детей, привитых ЖГВ для взрослых, не только не происходит утраты какой-либо из мутаций в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса, но, в ряде случаев в РВ2 гене обнаруживается мутация Ser-490-Arg. Это является важным фактором, обеспечивающим дополнительную гарантию безвредности и генетической стабильности живой гриппозной вакцины.

В связи с упоминавшимися выше данными о том, что после репродукции вакцинного штамма в ВДП лиц, привитых отечественной ЖГВ, утрачивается мутация Ala-86-Thr в М2 гене [243], возникает еще один важный вопрос - каков же набор мутаций во внутренних генах реассортантных вакцинных штаммов, подготовленных на основе донора аттенуации Лен/17, и входивших в разные годы в состав коммерческой ЖГВ для взрослых? До настоящего времени для анализа состава генома реассортантных вакцинных штаммов использовали метод электрофореза одноцепочечных РНК в ПААГ [16, 422], метод РНК-РНК гибридизации [200] или оригинальный PCR-рестрикционный метод [236, 237]. Этого было вполне достаточно для быстрой идентификации происхождения генов реассортанта между донором аттенуации и современным эпидемическим вирусом, т.е. для того, чтобы определить, соответствует ли состав генома исследуемого штамма искомой формуле генома 6/2, или нет.

В результате анализа восьми реассортантных вакцинных штаммов модифицированным методом PCR-рестрикции было установлено, что три из них -А/17/Шангдонг/93/3/5 (H3N2), А/17/Сидней/97/76 (H3N2) и А/17/Пекин/95/25 (H1N1) -имели структуру внутренних генов, соответствующую оригинальному донору Лен/17.

184

У трех других штаммов - А/17Лехас/91/1/3 (H1N1), А/17/Нанчанг/95/20 (H3N2) и А/17/Иоганнесбург/94/1 (H3N2) - появилась дополнительная мутация в РВ1 гене в позиции нуклеотида 975 (Met-317-lle), характерная для более аттенуированного донора Лен/47. При этом у вируса А/17Яехас/91/1/3 (H1N1) была утеряна мутация в М2 гене в позиции нуклеотида 969 (Ala-86-Thr). Эта же мутация отсутствовала и у двух других вакцинных штаммов - А/17/Перт/95/29 (H1N1) и A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1).

Поскольку указанные штаммы были одобрены Комиссией по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам Минздрава РФ и по показателям реактогенности соответствовали требованиям, предъявляемым Фармакопейной статьей ФС 42-35669-98 к вакцинным штаммам для живой гриппозной вакцины для интраназального применения для взрослых, можно предположить, что ни утеря одной мутации в М2 гене, ни появление дополнительной мутации в РВ1 гене не оказывают влияния на аттенуацию реассортантных вакцинных штаммов.

В связи с предполагаемой гетерогенностью популяции ХА донор аттенуации Лен/17 дважды клонировали в РКЭ методом предельных разведений при оптимальной температуре 33°С. Все гены полученных клонов были обследованы на наличие/отсутствие в них специфических аттенуирующих мутаций с использованием модифицированного PCR-рестрикционного метода. Показано, что около 50% популяции вируса Лен/17 содержали клоны, имеющие восемь кодирующих специфических мутаций во внутренних генах, соответствующих описанному в литературе набору мутаций [238], характерному для вируса Лен/17. Однако, в составе популяции оригинального вируса Лен/17 присутствовали также клоны, отличающиеся от него мутациями в некоторых генах. Было отобрано четыре варианта модифицированных клонов:

1. два клона, не содержащих мутации в М2 гене в позиции нуклеотида 969 (Лен/17/7 и Лен/17/28);

2. клон, содержащий мутацию в М2 гене в позиции нуклеотида 969 и имеющий дополнительную мутацию в гене РВ1 в позиции нуклеотида 975 (Лен/17/44);

3. клон, не содержащий мутации в М2 гене в позиции нуклеотида 969, но имеющий мутацию в гене РВ1 в позиции нуклеотида 975, характерную для более аттенуированного донора аттенуации Лен/47 (Лен/17/22);

4. клон, не содержащий мутации в М2 гене в позиции нуклеотида 969, но имеющий две мутации, характерные для донора аттенуации Лен/47 - в гене РВ1 в позиции нуклеотида 975 и в NP гене в позиции нуклеотида 1066 (Лен/17/33).

185

Т.о., в результате клонирования были получены уникальные штаммы, по составу мутаций занимающие промежуточное положение между вирусами Лен/17 и Лен/47. Поскольку модифицированные варианты отличались от базовых доноров Лен/17 и Лен/47 набором кодирующих мутаций во внутренних генах, было проведено изучение их ts, са и att фенотипа с использованием традиционных и новых маркеров аттенуации. Полученные результаты свидетельствуют о том, что, несмотря на выявленные отличия в наборе кодирующих мутаций эти варианты сохранили ts, са и att фенотипы, характерные для оригинального ХА вируса Лен/17.

Как уже говорилось выше, роль отдельных мутантных генов в проявлении ts, са и att фенотипов ХА вируса Лен/17 была неизвестна. Для решения этой задачи нами была подготовлена коллекция реассортантных вирусов, полученных при реассортации вируса «дикого» типа Лен/wt и его ХА варианта Лен/17 (вернее, его клона Лен/17/28) и унаследовавших различные комбинации внутренних генов от ХА вируса Лен/17/28 и от «дикого» родителя Лен/wt. Всего было отобрано 63 варианта, в том числе 11 четырехгенных, 15 трехгенных, 19 двугенных и 18 одногенных мутантов, унаследовавших по одному ХА гену от Лен/17/28: три РВ2-ОГМ, три РВ1-ОГМ, пять РА-ОГМ, шесть М-ОГМ и один NS-ОГМ (как было показано Klimov с соавт. [238], Лен/17 не имеет значащих мутаций в NP гене). Все 63 вируса были подвергнуты углубленному изучению состава их генома расширенным методом PCR-рестрикции.

Нами предложен термин «одногенные или полигенные мутанты» (ОГМ, ПГМ) для обозначения реассортантов между генетически близкородственными вирусами: ХА вирусом Лен/17/28 и его «диким» предшественником Лен/wt. В литературе одногенными реассортантами (ОГР) принято обозначать вирусы, полученные при реассортации генетически удаленных штаммов [30, 52, 158, 323, 389, 421, 436 и другие]. Ранее одногенный по РА мутантный вирус был получен только Mitchell и DeBorde [284] при работе с вирусом гриппа В.

Как уже говорилось выше, до недавних пор у вирусологов не было такого мощного инструмента исследований, как PCR-рестрикционный анализ ДНК-амплифицированных копий генов вируса гриппа. Метод, исключительно простой в исполнении, позволяет дифференцировать отдельные точечные мутации в геноме исследуемых вирусов, не прибегая к сложному, дорогостоящему и трудоемкому секвенированию. Авторы, изучающие роль отдельных «ХА» генов в становлении аттенуирующего фенотипа вируса гриппа на модели ОГР, использовали другие методы анализа генома, которые позволяли установить только субтиповую

186 принадлежность изучаемого гена, например, отдифференцировать РВ2 ген вируса А/Аляска/6/77 от РВ2 гена вируса А/АА [201, 323, 331].

В нашей работе был использована полная модификация высокочувствительной методики РСР-рестрикционного анализа, выявляющая все мутации во внутренних генах ХА мутантов Лен/17 и Лен/47. Это позволило исследовать одногенные мутанты, что, по нашему мнению, исключало влияние окружения чужеродных генов на биологические свойства реассортантных вирусов. Возможно, что именно оно привело в свое время к разноречивым данным о роли мутантных генов американского ХА донора аттенуации А/АА [323, 331, 389, 421, 436 и другие].

На модели одногенных мутантов было установлено, что мутации в генах полимеразного комплекса играют решающую роль в аттенуации ХА вируса Лен/17. Замена \/а1-478-1еи в РВ2 гене, также как замены 1у8-265-Азп и \/а1-591-11е в РВ1 гене независимо друг от друга приводят к формированию ts фенотипа. Мутации 1еи-28-Рго и Уа1-341-1еи в РА гене, так же как мутация \/а1-478-1еи в РВ2 гене ответственны за проявление са фенотипа. Очень важно, что замена \/а1-478-1еи в РВ2 гене, как и замены 1уз-265-А8п и \/а1-591-11е в РВ1 гене приводят не только к формированию ¿в фенотипа, но и к аттенуации соответствующих ОГМ для хорьков. Хотя мутации 1еи-280-Рго апс! \/а1-341-1еи в РА гене и ответственны за проявление са фенотипа, они не приводили к манифестации аИ фенотипа у соответствующих одногенных мутантов. Эти результаты позволяют предположить наличие более тесной связи между аттенуацией и фенотипом, чем между аттенуацией и са фенотипом ХА вирусов. Несмотря на то, что в процессе холодовой адаптации вирус Лен/\лД приобрел мутации не только в генах полимеразного комплекса, но и в генах, кодирующих мембранный (М) и неструктурные (N8) белки, нами не было выявлено видимого влияния этих мутантных генов на формирование & и са фенотипа ХА вируса Лен/17.

Полигенные мутанты, унаследовавшие разные комбинации генов вируса Лен/17/28, ответственных за ¿в фенотип (РВ2 и/или РВ1), также обладали признаком температурочувствительности в опытах на развивающихся куриных эмбрионах, т.е. плохо размножались при 40°С. Мутанты, унаследовавшие разные комбинации генов вируса Лен/17/28, ответственных за проявление са фенотипа (РВ2 и/или РА), обладали признаком холодоустойчивости в опытах на РКЭ, т.е. активно репродуцировались при 25°С.

187

Показано, что комбинация двух полимеразных генов РВ2 + РВ1 обеспечивала статистически достоверное усиление ts фенотипа реассортантов, сочетание же в геноме реассортантов двух полимеразных генов РВ2 + РА углубляло их са фенотип. Это свидетельствует о том, что в аттенуации ХА штаммов решающее значение имеют не только сами гены полимеразного комплекса, входящие в состав данного индивидуального генома, но и их констелляция.

Установлена высокая генетическая стабильность мутаций в геноме одногенных мутантов и сохранение их ts и са фенотипа после репликации в хорьках. Показано, что все реизоляты сохранили типичный для исходных (не пассированных в организме хорьков) вариантов ts и са фенотип. Ни в одном случае не происходило утраты или появления нехарактерных для исходного вируса фенотипических признаков.

Из данных литературы известно, что ХА вирусы в носовых ходах таких экспериментальных животных, как мыши [325, 421], новорожденные крысы [270], хомяки [57, 201, 389] и хорьки [201, 203, 263] размножаются несколько хуже, чем «дикие» вирусы. Однако, при изучении att фенотипа базовых и модифицированных доноров (Лен/17, Лен/47, Лен/17/28, Лен/17/44) и одногенных мутантов (РВ2-ОГМ, РВ1-ОГМ, РА-ОГМ) было установлено, что они одинаково активно размножались в носовых ходах хорьков. При этом уровень их репродукции в носовых ходах соответствовал, а в случае клона Лен/17/28 даже превышал таковой вируса «дикого» типа Лен/wt. Следует отметить, что температура верхних дыхательных путей теплокровных животных, в частности, носовых ходов, составляет не 25°С и не 28°С, а приближается к температуре 34-35°С, являющейся оптимальной для репродукции вируса гриппа. Т.о. теоретически все вирусы, как «дикие», так и холодоадаптированные, должны хорошо размножаться в ВДП. Поэтому нас не удивляет такая же активная репродукция в носу хорьков ХА вирусов Лен/17, Лен/47, Лен/17/28, Лен/17/44, РА-ОГМ, РВ2-ОГМ, как и вируса дикого типа Лен/wt или не обладающего са фенотипом РВ1-ОГМ.

Выяснение ведущей роли полимеразных генов в аттенуации ХА вируса Лен/17 явилось первым шагом к пониманию их роли в аттенуации ХА реассортантных вакцинных штаммов. Следует учитывать, однако, что получив ответы на вопрос о роли отдельных мутаций в аттенуации ХА донора Лен/17, мы не можем быть уверенными в том, что те же закономерности сохранятся и при изучении роли отдельных мутантных генов в аттенуации реассортантов между ХА донорами H2N2 и генетически удаленными от них эпидемическими вирусами подтипов H3N2 и H1N1.

188

Об этом свидетельствуют противоречивые результаты исследований, проводимых разными авторами на различных экспериментальных моделях [30, 52, 323, 331, 389, 421, 436]. Между тем вопрос о роли мутантных генов в обеспечении аттенуации ХА реассортантов имеет первостепеное значение при получении вакцинных штаммов для ЖГВ. Мы должны быть абсолютно уверены в том, что какой бы новый эпидемический вирус не пришел на смену старому вирусу, наши доноры имеют достаточный «запас прочности», чтобы превратить его в безвредный для человека актуальный вакцинный штамм. Дальнейшие исследования позволили нам убедиться в существовании у используемых нами доноров аттенуации подобной гарантии.

Изучение роли отдельных мутантных генов в становлении аттенуирующего фенотипа ХА вирусов гриппа началось в 80-е годы на модели одногенных реассортантов, у которых в геном одного родительского вируса включались отдельные мутантные гены генетически удаленного вируса [30, 52, 201, 277, 323, 331, 389, 390, 421, 436 и другие]. Исследователи справедливо полагали, что, встраивая в геном эпидемического вируса отдельные мутантные гены от ХА донора (реассортанты с формулой генома 1/7), или замещая в геноме донора аттенуации отдельные мутантные гены на гены эпидемического штамма (7/1 реассортанты), можно изучать вклад отдельных мутантных генов в реализацию таких важных биологических свойств реассортантов, как их ts, са и аттенуирующий фенотип.

Однако, семь генов эпидемического вируса, окружающих единичный мутантный ген ХА штамма, могут существенно исказить общую картину. Кроме того, описанные в литературе эксперименты проводились на ограниченном числе реассортантов определенного типа - одном-двум [30, 201, 277, 323, 325, 403, 421, 437, 438 и другие], значительно реже - трем-четырем [52, 390]. Сравнение свойств только нескольких штаммов может внести элемент случайности в полученные результаты. Поэтому, для получения достоверных результатов было проведено изучение биологических свойств большого числа реассортантов с различной структурой генома, полученных на основе базовых или модифицированных доноров аттенуации и современных эпидемических вирусов гриппа. Всего было исследовано около ста пятидесяти реассортантов с различной комбинацией мутантных и немутантных генов (с формулой генома 7/1, 6/2, 5/3, 4/4, 3/5, 2/6 и 1/7).

В связи с вниманием, которое в настоящее время уделяется в литературе роли NS гена в ослаблении болезнетворных свойств вируса гриппа, представляло интерес более глубокое изучение этого вопроса. Мнения авторов о его роли расходятся от полного отрицания [389], до придания ему важного [30, 52], и даже

189 решающего [341] значения в формировании аттенуирующего фенотипа вируса гриппа. Изучение свойств одногенных по N8 реассортантов между ХА вирусами Лен/17 или Лен/47 и «дикими» вирусами А/Панама/2007/99 (НЗМ2) и А/Аичи/2/68 (ЬШ2) показало, что при наличии в геноме реассортанта семи других внутренних генов от донора аттенуации, происхождение гена N8 не имеет существенного значения в проявлении аттенуирующего фенотипа реассортанта. И наоборот, включение в состав «дикого» вируса мутантного N8 гена от ХА родителя не изменяло его фенотипических свойств.

Сравнительное изучение фенотипических характеристик 1/7 РВ2-ОГР, полученных на основе ХА вирусов Лен/17 или Лен/47 и двух «диких» вирусов А/Панама/2007/99 (НЗМ2) и А/Сидней/5/97 (НЗМ2), показало, что в зависимости от донора «диких» генов одногенные по РВ2 реассортанты приобретают различный уровень чувствительности к повышенной температуре инкубации. Аналогичный разброс в результатах наблюдался и в работах других исследователей. Так, РВ2-ОГР между А/АА и А/Аляска/6/77 обладал са, но поп^э фенотипом [323, 331]. РВ2-ОГР между А/АА и А/Корея/1/82, потеряв са фенотип [389], стал температурочувствительным [389, 421, 436].

Т.о., изучение одногенных реассортантов между генетически удаленными родительскими вирусами, на которое многие исследователи [30, 52, 201, 277, 306, 323, 331, 389, 390, 421, 436 и другие] возлагали большие надежды, оказалось малоинформативным. Слишком много неучтенных факторов влияет на формирование фенотипа одногенного реассортанта - генетическая удаленность родительских вирусов, ¿в и са фенотип «дикого» родителя, уровень его патогенности для животных, рассогласование констелляции генов, а также многое другое.

При анализе свойств ОГР и ПГР создается впечатление, что далеко не всегда удается выявить роль конкретных генов в аттенуации, которую регулярно обеспечивает только какой-то определенный минимальный набор мутантных генов, два из которых должны кодировать белки полимеразного комплекса, причем присутствие мутантного РВ2 гена является обязательным условием. При анализе температурочувствительности полигенных реассортантов, содержащих в составе своего генома от двух до шести мутантных генов от ХА родителя (формула генома 2/6, 3/5, 4/4, 5/3, 6/2), было показано, что включение мутантного РВ2 гена в комплексе с любым другим полимеразным геном ХА донора (РВ1 и/или РА) в геном таких реассортантов регулярно приводило к формированию & фенотипа. При рассогласовании генов полимеразного комплекса ХА вируса с включением в него

190

РВ2 гена «дикого» родятеля у реассортантов всегда снижался уровень температурочувствительности.

Т.о. была четко установлена ведущая роль в формировании ts фенотипа у реассортантных штаммов вируса гриппа одного из генов полимеразного комплекса -РВ2 гена. При этом полученные результаты указывают на важную роль всех мутантных генов, кодирующих белки транскриптазно активного РНП-комплекса, в проявлении ts свойств. В формировании са фенотипа определяющую роль, по-видимому, играют мутационные изменения в РВ2 и РА гене.

Полученные результаты отнюдь не призывают нас к тому, чтобы мы попытались перейти в качестве доноров аттенуации на вирусы, несущие мутации только, например, в генах полимеразного комплекса. Надо четко помнить, что все наши данные о роли в аттенуации РВ2 и РВ1 генов получены на исключительно лабораторных моделях (РКЭ, культура клеток, мыши, хорьки). Вакцина для хорьков, возможно, и могла бы иметь формулу 1/7 или 2/6 - включения только РВ2 и/или РВ1 гена в состав такой вакцины вполне могло быть достаточным для ее полной аттенуации для этих животных. Что же касается людей, то в литературе описаны ts мутантные доноры [296, 298, 300], имеющие только по одной мутации в РВ1 и РВ2 генах, которые были аттенуированы для людей, но оказались генетически нестабильными. Наконец, мы не можем исключить, что и другие гены (М, NS) играют какую-то роль, которую мы пока, к сожалению, не знаем. Совокупность имеющихся в настоящий момент данных позволяет заключить, что в основе молекулярных механизмов аттенуации ХА штаммов вируса гриппа А лежат множественные мутации в большинстве генов, кодирующих негликозилированные белки. Присутствие в составе вакцинного штамма всех внутренних мутантных генов от ХА донора аттенуации придает ему своеобразный «запас прочности», что является гарантией того, что каким бы ни был новый эпидемический вирус, реассортантная вакцина, приготовленная на его основе, всегда будет высоко аттенуирована для человека.

Известно, что параллельное выделение (и последующее выращивание) вируса из одного и того же клинического образца в РКЭ и клетках MDCK приводит к получению штаммов, несущих антигенно и структурно отличающиеся молекулы гемагглютинина. Существенным является то, что штаммы вирусов гриппа, выращенные в клетках MDCK, выявляют в сыворотках переболевших людей нейтрализующие и ингибирующие гемагглютинацию антитела чаще и в более высоких титрах, чем штаммы, выращенные в РКЭ [337, 355, 391]. Эти данные

191 позволяют думать, что варианты вируса гриппа, выращенные в клетках млекопитающих, антигенно больше, чем Е-варианты, соответствуют штаммам, циркулирующим среди людей, и стимулируют более полноценный иммунный ответ, чем Е-вариант. Это ставит вопрос о правомочности использования РКЭ для приготовления вакцин, поскольку при этом происходит селекция из природной вирусной популяции вариантов, которые могут не отражать реальных свойств эпидемических штаммов. Этот вопрос тесно смыкается с вопросом повышения иммуногенности живой гриппозной вакцины.

Есть и еще одна серьезная причина, заставляющая ведущих ученых мира заниматься разработкой культуральных вакцин. Дело в том, что между моментом, когда ВОЗ объявляет свои рекомендации о смене вакцинных штаммов на ближайший эпидемический сезон, и тем сроком, когда должна быть полностью готова биомасса вакцины (не вакцинный штамм, а именно наработанный в производственных масштабах препарат), лежит промежуток времени, составляющий всего шесть месяцев, за который практически нереально сконструировать вакцинный штамм, испытать его и выпустить в производство, если производство базируется на куриных эмбрионах.

Основное преимущество линий перевиваемых клеток по сравнению с любой первичной культурой состоит в способности неограниченного размножения in vitro и относительной автономности. Однако, в этом кроется и потенциальная опасность их туморогенности, которой лишены первично-трипсинизированные линии клеток. В качестве субстрата для культивирования ХА вирусов, альтернативного куриным эмбрионам, гриппа были рассмотрены первичная культура фибробластных клеток птичьего происхождения (CEF) и перевиваемая линия клеток млекопитающих (MDCK).

Хотя в литературе и имеются упоминания о невысокой чувствительности первичной клеточной культуры CEF к вирусу гриппа [15, 69, 269, 369], мы провели ограниченные эксперименты по изучению репродукции двух ХА вакцинных штаммов вируса гриппа - А/17/Сидней/97/76 (H3N2) и А/17/Пекин/95/25 (H1N1) в клетках CEF, так как они привлекают возможностью получения значительно больших объемов клеточной массы по сравнению, например, с такой высокочувствительной ко всем подтипам вируса гриппа первичной клеточной культуры, как клетки эмбриональной цыплячьей почки (РСК). Показано, что доноры аттенуации и вакцинные штаммы, полученные на их основе, не размножаются в культуре клеток CEF в отсутствии трипсина. Параллельное титрование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах и

192 на CEF выявило отставание результатов на CEF приблизительно на 1-2 Ig. Кроме того, при последовательных пассажах в культуре клеток CEF вакцинных штаммов, которые были получены в РКЭ, происходит прогрессивное угасание их инфекционной активности даже в присутствии трипсина. Т.о. было показано, что первичная культура CEF не пригодна в качестве субстрата для подготовки вакцинных штаммов и производства ЖГВ.

Более перспективным представляется переход на культуру клеток MDCK, которая, как было установлено, даже не требует присутствия трипсина в культуральной среде и поддерживает репродукцию неадаптированных к ней аллантоисных культур «куриных» ХА реассортантных вакцинных штаммов на высоком уровне. Кроме того, доказана возможность получения вакцинных штаммов в культуре клеток MDCK на основе всесторонне охарактеризованных безвредных для людей аттенуированных «куриных» доноров аттенуации, которые активно размножаются в этой культуре и могут быть успешно использованы для рекомбинации, поэтому для получения вакцинных штаммов в клеточной системе MDCK не требуется создания нового, адаптированного к культуре клеток «тканевого» донора аттенуации. Очень важно, что реассортанты, полученные в клеточной системе, сохраняли ts и са фенотип, характерный для реассортантов, полученных в РКЭ. Т.о., было показано, что существует реальная возможность перевода всех этапов получения и культивирования реассортантных вакцинных штаммов в культуру клеток MDCK.

193

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Киселева, Ирина Васильевна, 2001 год

1. Аксенов O.A., Гвоздилова Д.А., Руденко В.И., Смородинцев Ал.А. Метод количественной гемадсорбции для титрования интерферона в организме мышей и человека // В кн.: Проблемы патогенеза и иммунологии острых респираторных инфекций. Л., 1969.- С.156-163.

2. Аксенов O.A., Маркина O.A. Способ определения интерферона в крови детей. Патент РФ №2129275 от 20.04.99,- Опубл. БИ №9.

3. Акопова И.И., Климов А.И., Унанов С.С. и др. Геномный и антигенный анализ штаммов вируса гриппа А (H1N1) 1982-1983 гг. выделения: подходы к выбору оптимального вакцинного штамма // Вопр. вирусол,- 1986.- №3.- С.288-292.

4. Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. вирусол.- 1977.- №4.-С.387-395.

5. Александрова Г.И. Живая гриппозная вакцина в СССР: разработка, изучение и практическое использование // В кн.: Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Сб.научн. трудов НИИЭМ АМН СССР. Л., 1986.- С.66-84.

6. Александрова Г.И., Гармашова Л.М., Голубев Д.Б. Опыт селекции безвредных термочувствительных рекомбинантов вируса гриппа А// Вопр. вирусол.- 1979.-№4.- С.342-345.

7. Александрова Г.И., Жилова Г.П., Разумовский В.И. и др. Обоснование необходимости применения живой гриппозной вакцины в неразведенном виде // В кн.: Иммунология и специфическая профилактика гриппа у детей.- Л., 1971а,-С.58-68.

8. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб:Наука.-1994,- 151с.

9. Александрова Г.И., Кугель С.К. Материалы к конструированию ареактогенной живой противогриппозной вакцины для иммунизации детей дошкольного возраста // В кн.: Проблемы гриппа. Тезисы докл.научн.конф.по гриппу. Л., 1961,- С.29.

10. Александрова Г.И., Микуцкая Б.А., Сиротенко Е.А. и др. Итоги изучения специального варианта живой гриппозной вакцины для иммунизации детей дошкольного и младшего школьного возраста // Вестник АМН СССР.- 1968.-№9.- С.41-45.

11. Александрова Г.И., Шапошникова Р.П., Смородинцев A.A. Живая гриппозная вакцина для детей. (Итоги лабораторных и эпидемиологических испытаний в 1961-70гг // Иммунология и специфическая профилактика гриппа у детей.-Л.,1971b.- С.21-45.

12. Ветласенин А.В., Фураева В.А. К вопросу о молекулярно-генетической детерминации патогенности и вирулентности вируса гриппа // В кн.: Молекулярная биология и генетика вирусов гриппа. П., 1983.- С.31-38.

13. Вирусы гриппа и грипп. Под ред. Э.Д.Кильбурна: Пер. с англ.- М.:Медицина,-1978,- 585с.

14. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул: Пер. с англ.- М.: Мир.- 1982.- С.368-389.

15. Гаврилов В.И. Изменчивость вируса гриппа А при проведении через организм иммунизированных мышей.-Автореф.дисс. . канд.мед.наук,- М.,1954,- Юс.

16. Гармашова Л.М., Гущина М.И., Егоров А.Ю., Александрова Г.И. Различия в температурном диапазоне репродукции вирулентных и аттенуированных холодоадаптированных вирусов гриппа А // Вопр. вирусол,- 1989.- №4.- С.411-415.

17. Гармашова Л.М., Полежаев Ф.И., Александрова Г.И. Холодоадаптированный штамм А/Ленин град/134/47/57 (Н2М2) специальный донор аттенуации живой гриппозной вакцины для детей и полученные на его основе рекомбинанты // Вопр. вирусол,-1984.- №1,- С.28-31.

18. Гендон Ю.З. // Генетика вирусов человека и животных. М.:Наука, 1967.- 356с.

19. Гендон Ю.З. // Молекулярная генетика вирусов человека и животных. М.:Медицина, 1977,-304с.

20. Губарева Л.В., Маркушин С.Г., Варич Н.Л., Каверин Н.В. Роль полимеразных генов вируса гриппа А в переходе от ранней к поздней стадии репликации // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол,-1991.-Т.5.-С.23-26.

21. Губарева Л.В., Маркушин С.Г., Варич Н.Л., Каверин Н.В. Роль N8 гена в регуляции синтеза РНК вируса гриппа А // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол.- 1988,- Т. 12,- С.38-42.

22. Гущина М.И. Получение холодоадаптированных рекомбинантных штаммов для живой гриппозной вакцины типа А для детей. Автореф.дисс. . канд. биол. наук,-Л.,1989,-20с.

23. Дорошенко Е.М. Влияние гриппозной инфекции матери на развитие плода и здоровье новорожденного ребенка. Автореф.дисс. . канд. мед. наук,- Л.,1986.-17с.

24. Достижения в разработке вакцин против гриппа: Меморандум совещания ВОЗ // Бюлл. ВОЗ,- 1987,- Т.65,- №3,- С. 11-17.

25. Дубровина Т.Я., Гармашова Л.М., Леонтьева Г.Ф. и др. Экспрессия генома мутанта вируса гриппа в условиях разрешающей и неразрешающей температур // В кн.: Этиология и специфическая профилактика гриппа. Л., 1982.- С.38-41.197

26. Егоров А.Ю., Гармашова Л.М., Лукашок И.В. и др. Ген NS вероятная детерминанта апатогенности холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) и его реассортантов // Вопр. вирусол.-1994а.-Т.39.- №5.- С.201-205.

27. Егоров А.Ю., Гармашова Л.М., Неведомская Г.Н. и др. Иммуногенность для мышей аттенуированных реассортантов вируса гриппа А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) в зависимости от состава их генома // Вопр. вирусол.-1994b.- Т.39.- №5.-С. 198-201.

28. Егоров А.Ю., Лисовская К.В. Высокорепродуктивные температурочувстви-тельные рекомбинанты вируса гриппа А // В кн.: Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986.-С.117-124.

29. Егоров А.Ю., Медведева Т.Е., Полежаев Ф.И. и др. Особенности получения и характеристика холодоадаптированного варианта вируса гриппа A/PR/8/34 // Acta Virologica.-1984,-Т.28.- Вып. 1.-С. 19-25.

30. Жданов В.М., Николаев И.И. К итогам изучения гриппозных вакцин // ЖМЭИ,-1953,- №10.- С.3-11.

31. Жданов В.М., Соловьев В.Д. О принципах вакцинации против гриппа // ЖМЭИ,-1952.- №1,- С.36-41.

32. Жданов В.М., Соловьев В.Д., Эпштейн Ф.Г. Учение о гриппе. М.:Медгиз, 1958.-582с.

33. Жилинская И.Н., Козлов Ю.В., Курманова А.Г. и др. Изменения в структуре М- и NS-генов в процессе аттенуации вируса гриппа // Доклады АН СССР.-1982,-Т.267.- №5.- С. 1240-1243.

34. Жилова Г.П. Актуальные задачи вакцинопрофилактики гриппа с помощью живой гриппозной вакцины // В кн.: Вакцины и вакцинация против гриппа. Л., 1985.- С.5-14.

35. Жихарева И.В., Медведева Т.Е., Александрова Г.И., Климов А.И. ts-мутации в геноме холодоадаптированных вариантов вирусов гриппа А/Гонконг/1/68 (H3N2) и А/Виктория/35/72 (H3N2) // Генетика,- 1993,- Т.29.- №5,- С.853-861.

36. Зазимко Л.А. Вирулентность вируса гриппа А для человека: генетические аспекты ее наследования при реассортации эпидемических и аттенуированных вариантов: Автореф.дисс. . д-ра мед.наук,- М.,1987.-41с.

37. Закстельская Л.Я. Токсичность вируса гриппа.- М.:изд-во АМН СССР, 1953.-84с.

38. Инфекционные вирусы и канцерогенез (под общей редакцией д.м.н.

39. B.И.Струка). Киев:Наукова Думка, 1987,-256с.

40. Каверин Н.В., Варич Т.Л., Руднева И.А., Губарева Л.В. Анализ генома реассортантных клонов вируса гриппа: данные в пользу упорядоченного подбора РНК-сегментов // Молек. генетика, микробиол. и вирусол,- 1991.- №2,1. C.16-19.

41. Климов А.И., Гендон Ю.З. Электрофорез двухцепочечных РНК вируса гриппа в пластинчатом геле как метод анализа состава генома рекомбинатов // В кн.: Вирусные инфекции: энтеровирусные, респираторные, арбовирусные.-Свердловск, 1979.-С. 15-17.

42. Климов А.И., Гендон Ю.З., Zavadova Н. и др. Высокая репродуктивная способность рекомбинантов вирусов гриппа человека H3N2 и вируса чумы птиц определяется геном, кодирующим М белок // Acta Virol.- 1983.- Т.27,- Вып.5,-С.434-438.

43. Климов А.И., Йотов B.B. Особенности мутационных изменений геномной РНК холодоадаптированных и hr-вариантов вируса гриппа А, выявляемые методом РНК:РНК-гибридизации // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол.- 1990.-№11.- С. 18-21.

44. Климов А.И., Медведева Т.Е., Лисовская К.В. и др. Генетические основы апатогенности ХА гриппозных вакцин //ЖМЭИ,- 1988.- №.12,- С.48-52.

45. Лисовская К.В., Гендон Ю.З. Анализ температурочувствительных мутаций в геноме ХА штамма А/Энн Арбор/6/60 донора аттенуации для ЖГВ // В кн.: Проблема конструирования гриппозных вакцин. Л., 1988.- С.61-69.

46. Лузянина Т.Я. Изменение биологических свойств мышиного штамма вируса гриппа при пассировании через организм белых крыс// В кн.: Грипп. Труды АМН СССР,- 1953.- С.28-38.

47. Маркушин С.Г. Функции и взаимодействия генов вируса гриппа: Автореф.дисс. . д-ра мед.наук.- М.,1985.- 36с.

48. Медведева Т.Е., Иванова H.A. Анализ температурочувствительных мутаций в геноме эпидемических штаммов вируса гриппа А // В кн.: Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986.-С.34-44.

49. Медведева Т.Е., Романова Ю.Р., Гущина М.И. и др. ts-фенотип реизолятов от детей, привитых живой холодоадаптированной гриппозной вакциной типа А // Вопр. вирусол,- 1990.- №2,- С101 (13)-105(17).

50. Медведева Т.Е., Шапошникова Р.П., Коляк Л.И. и др. Реактогенные и иммуногенные свойства вируса гриппа А/Ленинград/538/74 на разных этапах пассирования при пониженной температуре // В кн.: Проблемы гриппа и ОРЗ.-1977.- Т. 19.- С.128-137.

51. Методические указания к работе опорных баз Всесоюзного Центра по гриппу и ОРЗ.-Л,- 1986.-С.40-42.

52. Неведомская Г.Н., Кудрявцева В.К., Егоров А.Ю. и др. Особенности формирования гриппозных инфекций у мышей, зараженных исходным или ts вариантами вируса A/PR/8/34 // В кн.: Стратегия возбудителя в организме хозяина. Л., 1987,- С.146-150.

53. Неведомская Г.Н., Медведева Т.Е., Жихарева И.В. и др. Оценка степени аттенуации холодоадаптированных штаммов вируса гриппа на моделях мышей линии СВА и сирийских хомячков // Вопр. вирусол,- 1992,- №1.- С.37-40.

54. Оксфорд Дж.С., Коркоран Т., Нотт Р. и др. Серологические исследования с вирусами гриппа A (H1N1), выращенными на куриных эмбрионах или линии почечных клеток собаки (MDCK) // Бюллетень ВОЗ: Пер. с англ.- 1987,- Т.65.-№2,- С.25-31.

55. Полежаев Ф.И. Живая рекомбинантная вакцина против гриппа. Автореф.дисс. . д-ра мед. наук.- Л., 1983.- 35с.

56. Приказ №150/40 Министерства Здравоохранения СССР от 11.04.1990 «О подготовке новых вакцинных производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрении в производство вакцинных и диагностических препаратов».-1990.

57. Приказ №156/29 Министерства Здравоохранения Российской Федерации от 07.05.1998 «О подготовке новых вакцинных производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрении в производство вакцинных и диагностических препаратов».- 1998.

58. Пустыльник Е.И. Статистические методы анализа и обработки наблюдений.-М.:Наука.-1968.-288с.

59. Романова Ю.Р., Егоров А.Ю., Лисовская К.В. и др. Эффект усиления репродукции вируса гриппа в легких мышей при одновременном инфицировании двумя холодоадаптированными штаммами // Вопр. вирусол,-1989,- №5.- С.547-553.

60. Руденко Л.Г. Пути повышения эффективности вакцинопрофилактики в СССР: Автореф.дисс. . д-ра мед.наук,- Л.,1984.- 20с.

61. Руденко Л.Г., Григорьева Е.П., Дриневский В.П. и др. Итоги изучения живой гриппозной интраназальной вакцины при иммунизации детей 3-15 лет // ЖМЭИ,- 1988,- № 5,- С.41-46.

62. Руденко Л.Г., Шварцман Я.С., Исполатова Л.В. и др. Основные характеристики живой гриппозной вакцины для детей из штаммов вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) при раздельном и совместном применении // Вопр. вирусол.- 1989.- № 1,- С.29-34.

63. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней (под.ред. П.Д.Здродовского и М.И.Соколова). М.:Медицина.-1965.- С.208-216.

64. Санто Я. Титрация вируса гриппа в тканевых культурах // Фолиабиологика.-1956.- №2.- С.79.

65. Сковородка В.В., Фарошян В.В., Подчерняева В.Я., Жданов В.М. Роль отдельных генов в проявлении патогенности вируса гриппа // Вопр. вирусол.-1983,- №6,- С.719-722.

66. Смородинцев A.A. Роль вируса в этиологии эпидемического гриппа // Военно-санитарное дело,-1937,- №2,- С.32.

67. Смородинцев A.A. Грипп и его профилактика. Л.:Медицина, 1984,- 383с.

68. Смородинцев A.A., Жилова Г.П. Актуальные вопросы иммунологии и вакцинопрофилактики гриппа // В кн.: Этиология, лечение, профилактика и вакцинопрофилактика гриппа и других респираторных заболеваний. Л., 1978,-С.95-104.

69. Смородинцев A.A., Коровин A.A. Грипп. Л.:Медгиз, 1961.- 372с.

70. Смородинцев A.A., Чалкина О.М. Итоги специфической профилактики гриппа живой вакциной // В кн.: Вирусные инфекции.- Л., 1953.- T.XIII.- С.129-141.

71. Смородинцев A.A., Чалкина О.М. Активная иммунизация против гриппа вакциной из живого ослабленного вируса // В кн.: Советский врач,- 1949,- №15.-С. 16-29.

72. Смородинцев A.A., Чалкина О.М. Основные принципы конструирования живой вакцины против гриппа // В кн.: Вопросы патогенеза и иммунологии вирусных инфекций. Л., 1955.- С.329-344.

73. Смородинцев A.A., Чалкина О.М., Аншелес И.М. Опыт применения живой вакцины против гриппа //ЖМЭИ,- 1953.- №10.- С.52-57.

74. Соколов M.И. Активная иммунизация против гриппа. М., 1954.- 180с.

75. Соколов М.И., Куликова К.С., Самвелова С.А. Специфическая профилактика гриппа. Сообщение IV. Интраназальная иммунизация живой противогриппозной вакциной // ЖМЭИ,-1951.-Т.9.- С.28-32.

76. Соколов М.И., Лозинская Т.М. Направленная изменчивость вируса гриппа, возникшая под влиянием температуры. Сообщение I. Изменчивость инфекционной активности вируса гриппа при адаптации к пониженным температурам // Вопр. вирусол.- 1963.- №6.- С.692-696.

77. Сюрин В.Н. Псевдочума птиц.- М.:Медгиз, 1963,- 324с.

78. Фармакопейная статья ФС 42-3353-97 на вакцину гриппозную интраназальную живую сухую для детей 3-14 лет. Утверждена 11 марта 1997 года Начальником Инспекции государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники Р.У.Хабриевым.-1997.- 5с.

79. Фармакопейная статья ФС 42-35669-98 на вакцину гриппозную интраназальную живую сухую для взрослых. Утверждена 10 июня 1998 года Начальником Инспекции государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники Р.У.Хабриевым.- 1997.-5с.

80. Яхно М.А. Изменение свойств вируса гриппа А2/57 при длительном культивировании на мышах и куриных эмбрионах// Вопр. вирусол.- 1963.- №1.-С.116.

81. Abou-Donia H., Jennings R., Potter C.W. Growth of influenza A viruses in hamsters //Arch. Virol.- 1970,-Vol.65.- P.99-107.

82. Alexandrova G.I. Basic trends in vaccination of children against influenza by use of live vaccines // Proceedings of the Symposium of live influenza vaccine.- Copyright by the Yugoslav Academy of Sciences and Arts, Zagreb. 1971,- P.121-127.

83. Alexandrova G.I. Live influenza vaccine in Russia // Options for the control of influenza III. Proceedings of the third International Conference on Options for the Control of Influenza, 4-9 May, 1996.- Cairns, Australia, 1996,- P. 123-128.

84. Alexandrova G.I., Budilovsky G.N., Koval T.A. et al. Study of live recombinant cold-adapted influenza bivalent vaccine of type A for use in children: an epidemiological trial//Vaccine.- 1986.-Vol.4.- P.114-118.

85. Alexandrova G.I., Smorodintsev A.A. Obtaining of an additionally attenuated vaccinating cryophilic influenza strain // Rev. Roum. Inframicrobiol.- 1965. Vol.2.-P.179-189.

86. Ali M., Maassab H.F., Jennings R., Potter C.W. Infant rat model of attenuation for recombinant influenza viruses prepared from cold-adapted attenuated A/Ann Arbor/6/60 // Infect. Immun.-1982.- Vol.38.- №2,- P.610-619.

87. Alluwaimi A.M., Smith H., Sweet C. Role of surface glycoproteins in influenza virus pathogenicity // J. Gen. Virol.- 1994.- Vol.74.- P.2835-2840.201

88. Al-Molish M.I., Dubes G.R. The kinetics of the DEAE-dextran-induced cell sensitization to transfection // J. Gen. Virol.- 1973.- Vol. 18.- P. 189-193.

89. Anderson E.L., Belshe R.B., Burk B. et al. Evaluation of cold-recombinant influenza A/Korea (CR-59) virus vaccine in infants // J. Clin. Microbiol.- 1989.- Vol.27.- №5.-P.909-914.

90. Anderson E.L., Newman F.K., Maassab H.F., Belshe R.B. Evaluation of a cold-adapted influenza B/Texas/84 reassortant virus (CRB-87) vaccine in young children //J. Clin. Microbiol.- 1992.-Vol.30.- № 9,- P.2230-2234.

91. Anonyme. A revised system of nomenclature for influenza viruses // Bulletin of the WHO.-1971.- Vol.45.- №1.- P.119.

92. Austin M.A., Monto A.S., Maassab H.F. Growth characteristics of influenza virus type C in avian hosts. Brief report //Arch. Virol.-1978.- Vol.58.- №4.- P.349-353.

93. Baarsch M.J., Wannenuehler M.J., Molitor T.W., Murtaugh M.P. Detection of tumor necrosis factor a from porcine alveolar macrophages using an L929 fibroblast bioassay // J. Immunol. Methods.-1990.-Vol.140.- P.15-22.

94. Baez M., Palese P., Kilbourne E.D. Gene composition of high-yielding influenza virus strains obtained by recombination//J. Infect. Dis.- 1980.-Vol.141.- P.362-365.

95. Barber W.H., Small P.A. Jr. Local and syètemic immunity to influenza infections in ferrets // Infect. Immun.- 1978,- Vol.21.- №1,- P.221-228.

96. Basler C.F., Garcia-Sastre A., Palese P. Mutation of neuraminidase cysteine residues yields temperature-sensitive influenza viruses // J. Virol.- 1999.- Vol.73.-№10.- P.8095-8103.

97. Bean W.J. Correlation of influenza A virus nucleoprotein genes with host-species // Virology.- 1984,-Vol.133.- P.438-442.

98. Bean W.J. Jr., Cox N.J., Kendal A.P. Recombination of human influenza A viruses in nature // Nature.- 1980.- Vol.284.- №5757.- P.638-640.

99. Bean W.J. Jr., Webster R.G. Phenotypic properties associated with influenza genome segments // In: Negative Strand Viruses and the Host Cell (B.W.J.Mahy and R.D.Barry eds). London: Academic Press.- 1978.- P.685-692.

100. Beare A.S. Laboratory characteristics of attenuated influenza viruses // Bulletin of the WHO.-1969,- Vol.41.- №3-5,- P.595-598.

101. Beare A.S., Bynoe M.L. Attenuation of human influenza A viruses // Brit. Med. J-1969.-Vol.4.- P. 198-201.

102. Beare A.S., Bynoe M.L., Tyrrell D.A.J. Investigation of the attenuation of influenza viruses by serial passage // Brit. Med. J.- 1968,- Vol.24.- №4,- P.482-484.

103. Beare A.S., Hall T.S. recombinant influenza A viruses as live vaccines for man // Lancet.-1971,- №2,- P. 1271-1273.

104. Beare A.S., Hobson D., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. A comparison of live and killed influenza virus vaccines // Lancet.-1965,- Vol.2.- №7565,- P.418-420.

105. Beare A.S., Maassab H.F., Tyrrell D.A.J, et al. A comparative study of attenuated influenza viruses // Bulletin of the WHO.-1971,- Vol.44.- №5,- P.593-598.

106. Beare A.S., Schild G.C., Craige Y.W. Trials in man with live recombinants from A/PR/8/34 (H1N1) and wild H3N2 influenza viruses // Lancet.- 1975.- Vol.2.- P.729-732.

107. Beare A.S., Tyrrell D.A.J., Hobson D. et al. Live influenza B vaccine in volunteers // J. Hyg. Camb.- 1969,- Vol.67.- №1.- P. 1 -11.

108. Belshe R.B. Efficacy and effectiveness of live, attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children and adults // Abstract book of the202

109. Options for the control of influenza IV. 23-28 September, 2000.- Hersonissos, Crete, Greece, 2000,- P.8.- S6-3.

110. Belshe R.B., Swierkosz E.M., Anderson E.L. et al. Immunization of infants and young children with live attenuated trivalent cold-recombinant influenza A H1N1, H3N2, and B vaccine // J. Infect. Dis.- 1992,- Vol.165.- №4,- P.727-732.

111. Boyce T.G., Gruber W.C., Coleman-Dockery S.D. et al. Mucosal immune response to trivalent live attenuated intranasal influenza vaccine in children //Vaccine.- 1999.-Vol.18.- №1-2,- P.82-88.

112. Brand C., Palese P. Sequential passage of influenza virus in embryonated eggs or tissue culture: emergence of mutants //Virology.- 1980.- Vol.107.- P.424-433.

113. Buckler-White A.J., Naeve C.W., Murphy B.R. Characterization of a gene coding for M proteins which is involved in host-range restriction of an avian influenza virus in monkeys // J. Virol.- 1986,- Vol.57.- P.697-700.

114. Buonagurio D.A., Krystal M., Palese P. et al. Analysis of an influenza A virus mutant with a deletion in the NS segment//J. Virol.- 1984,- Vol.49.- №2,- P.418-425.

115. Burnet F.M. Influenza virus on the developing egg // Brit. J. Exp. Pathol.- 1936,-Vol.17.- P.282.

116. Burnet F., Lind P. Recombination of characters between two influenza virus strains // Austral. J. Sci.- 1949,-Vol.12.- №1,- P. 109-110.

117. Camilleri J.J., Maassab H.F. Characteristics of a persistent infection in Madin-Darby canine kidney cells with influenza C virus // Intervirology.- 1988.- Vol.29.- №3.-P.178-184.

118. Campbell D., Sweet G., Smith H. Comparisons of virulence of influenza virus recombinants in ferrets in relation to their behavior in man and their genetic constitution // J. Gen. Virol.- 1979,- Vol.44.- P.37-44.

119. Cell culture as a substrate for the production of influenza vaccines: Memorandum from WHO meeting // Bulletin of the WHO.- 1995,- Vol.73.- №4,- P.431-435.

120. Chanock R.M., Murphy B.R. Use of temperature-sensitive and cold-adapted mutant viruses in immunoprophylaxis of acute respiratory tract disease // Rev. Infect. Dis-1980,-Vol.2.- №3,- P.421-432.

121. Chanock R.M., Murphy B.R., Collins PL. et al. Live viral vaccines for respiratory and enteric tract diseases //Vaccine.- 1988,- Vol.6.- №2.- P. 129-133.

122. Chen Z., Li Y., Krug R.M. Influenza virus NS1 protein targets poly (A)-binding protein II of the cellular 3-end processing machinery // EMBO J.- 1999.- Vol.18.- P.2273-2283.

123. Clavo A.C., Maassab H.F., Shaw M.W. A persistent infection in MDCK cells by an influenza type B virus //Virus Research.- 1993.- Vol.29.- №1.- P.21-31.

124. Clements M.L., Betts R.F., Maassab H.F., Murphy B.R. Dose response of influenza A/Washington/897/80 (H3N2) cold-adapted reassortant virus in adult volunteers // J. Infect. Dis.-1984,- Vol.149.- №5,- P.814-815.

125. Clements M.L., Betts R.F., Tierney E.L., Murphy B.R. Serum and nasal wash antibodies associated with resistance to experimental challenge with influenza A wild-type virus // J. Clin. Microbiol.- 1986.- Vol.24.- №1.- P.157-160.

126. Clements M.L., Snyder M.H., Sears S.D. et al. Evaluation of the infectivity, immunogenicity, and efficacy of live cold-adapted influenza B/Ann Arbor/1/86 reassortant virus vaccine in adult volunteers // J. Infect. Dis.- 1990.- Vol.161.- №5,-P.869-877.

127. Coates D.M., Sweet C., Quarles J.M. et al. Severity of fever in influenza: studies on the relation between viral surface antigens, pyrexia, level of nasal virus and inflammatory response in the ferrets // J. Gen. Virol.- 1985.- Vol.66.- P. 1627-1631.

128. Conn C.A., McClellan J.L., Maassab H.F. et al. Cytokines and the acute phase response to influenza virus in mice // Am. J. Physiol.- 1995.- Vol.268.- №1,- Pt 2.-P.R78-84.

129. Cox N.J. Progress and limitations in understanding the genetic basis for attenuation of live attenuated influenza vaccines // In: Options for the Control of Influenza (Eds. A.P.Kendall and P.Patriarca), NY:Alan R.Liss, 1986.- P.207-221.

130. Cox N.J., Connecke I., Kendal A.P., Maassab H.F. Genetic and biochemical analysis of the A/An Arbor/6/60 cold-adapted mutant // In: Genetic variation among influenza viruses (ed. D.P.Nayak), NY: Academic Press, 1981a.- P.639-652.

131. Cox N.J., Kitame F., Kendal A.P. et al. Identification of sequence changes in the cold-adapted, live attenuated influenza vaccine strain, A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) // Virology.-1988,-Vol.167.-№2.- P.554-567.

132. Crecelius D.M., Deom C.M., Schulze I.T. Biological properties of a hemagglutinin mutant of influenza virus selected by host cells // Virology.- 1984,- Vol.139.- №1.-P.164-177.

133. Daniels R.S., Douglas A.R., Skehel J.J. et al. Antigenic analysis of influenza virus haemagglutinins with different receptor-binding specifies //Virology.-1984.-Vol. 138.-№1,-P. 174-177.

134. Davenport F.M., Hennessy A.V., Maassab H.F. et al. Pilot studies on recombinant cold-adapted live type A and B influenza virus vaccines // J. Infect. Dis.-1977.-Vol.136.- №1,- P. 17-25.

135. DeBorde D.C., Donabedian A.M., Herlocher M.L. et al. Sequence comparison of wild-type and cold-adapted B/Ann Arbor/1/66 influenza virus genes // Virology.-1988.- Vol.163.- №2.- P.429-443.

136. DeBorde D.C., Naeve C.W., Herlocher M.L., Maassab H.F. Nucleotide sequences of the PA and PB1 genes of B/Ann Arbor/1/66 virus: comparison with genes of B/Lee/40 and type A influenza viruses // Virus Research.- 1987,- Vol.8.- № 1,- P.33-41.

137. DeBorde D.C., Naeve C.W., Herlocher M.L., Maassab H.F. Resolution of a common RNA sequencing ambiguity by terminal deoxynucleotidyl transferase // Analytical Biochemistry.- 1986.-Vol.157.- №2,- P.275-82.

138. Deshmukh D.R., Kao W., Mason M. et al. Serum enzyme alterations in arginine-deficient, influenza-infected ferrets: a potential animal model of Reye's syndrome // Enzyme.- 1982,- Vol.27.- №1,- P.52-57.

139. Digard P., Blok V.C., Inglis S.C. Complex formation between influenza virus polymerase proteins expressed in Xenopus oocytes //Virology.- 1989 Vol.171.- №1,-P.162-169.

140. Donnelly J.J., Ulmer J.B., Liu M.A. DNA vaccines//Dev. Biol. Stand.- 1998.-Vol.95.-P.43-53.

141. Dubes G.R., Chapin M. Cold-adapted genetic variants of polio viruses // Science.-1956,- Vol.124.- №3222,- P.586-588.

142. Egorov A., Brandt S., Sereinig S. et al. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vera cells // J. Virol.- 1998.- Vol.72.-№8,- P.6437-6441.

143. Egorov A.Y., Medvedeva T.E., Polezhaev F.I. et al. Peculiarities of obtaining and characterization of a cold-adapted A/PR/8/34 influenza virus variant // Acta Virol.-1984,-Vol.28.- P. 19-25.

144. Enami M., Palese P. High-efficiency formation of influenza virus transfectants // J. Virol.-1991,-Vol.65.- P.2711-2713.

145. Florent G., Lobmann B., Bear A.S., Zygraich N. RNAs of influenza virus recombinants derived from parents of known virulence for man //Arch. Virol.- 1977,-Vol.54.- №1-2,-P. 19-38.

146. Florent G. Gene constellation of live influenza A vaccines // Arch. Virol.- 1980.-Vol.64.- P.171-173.

147. Fodor E., Devenish L., Engelhardt O.G. et al. Rescue of influenza A virus from recombinant DNA // J. Virol.- 1999,- Vol.73.- №11.- P.9679-9682.

148. Frace A.M., Klimov A.I., Rowe T. et al. Modified M2 proteins produce heterotypic immunity against influenza A virus // Vaccine.- 1999.- Vol.17.- P.2237-2244.206

149. Fodor E., Palese P., Brownlee G.G., Garcia-Sastre A. Attenuation of influenza A virus mRNA levels by promoter mutations // J. Virol.- 1998.- Vol.72.- №8.- P.6283-6290.

150. Garcia-Sastre A. NS1-mediated inhibition of the type I interferon system during influenza A virus infection // Abstract book of the Options for the control of influenza IV. 23-28 September, 2000,- Hersonissos, Crete, Greece, 2000.- P.38.- Abstr.W42-2.

151. Garcia-Sastre A., Durbin R.K., Zheng H. et al. The role of interferon in influenza virus tissue tropism // J. Virol.-1998a.- Vol.72.- №11.- P.8550-8558.

152. Garcia-Sastre A., Egorov A., Matassov D. et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems // Virology.- 1998b.- Vol.252.- №2,-P.324-330.

153. Garmashova L.M., Leontieva G.F., Dubrovina T.Ya., Aleksandrova G.I. Partial change of the ts-phenotype of cold-adapted influenza virus strain growth in canine kidney cells in the presence of trypsin // Acta Virol.-1982.- Vol.26.- P.234-240.

154. Ghendon Yu.Z. Molecular characteristics and biological properties (genetic markers) of candidate strains for preparation of live influenza virus vaccine // Bulletin of the WHO.- 1984,-Vol.62.- №3,- P.493-499.

155. Ghendon Y. The immune response to influenza vaccines //Acta Virol.-1990. Vol.34.-№3,- P.295-304.

156. Ghendon Y.Z., Klimov A.I., Blagoveshenskaya O.V. et al. Investigation of recombinants of human influenza and fowl plaque viruses // J. Gen. Virol.- 1979,-Vol.43.- P.183-191.

157. Ghendon Y.Z., Klimov A.I., Alexandrova G.I., Polezhaev F.I. Analysis of genome composition and reactogenicity of recombinants of cold-adapted and virulent virus strains//J. Gen.Virol.-1981.-Vol.53.-P.215-224.

158. Ghenkina D.B., Ghendon Y.Z. Genetic and nongenetic interactions between ortomyxoviruses in conditions of abortive infection //Acta Virol.- 1979.- Vol.23.- P.97-106.

159. Ginzburg V.P., Markushin S.G., Ghendon Y.Z. Studies of biological properties of the recombinants between human influenza and fowl plaque viruses as related to genome composition //Acta Virol.- 1982,- Vol.26.- P.432-437.

160. Gomes-Guerrero C., Lopez-Armada M.J., Gonzales E., Egido J. Soluble IgA and IgG aggregates are catabolized by cultured rat mesangial cells and induce production of TNF-a and IL-6, and proliferation //J. Immunol.-1994,-Vol.153.- P.5247-5254.

161. Gonzalo R.M., Rodriguez D., Garcia-Sastre A. et al. Enhanced CD8+ T cell response to HIV-1 by combined immunization with influenza and vaccinia virus recombinants // Vaccine.- 1999.-Vol.17.- № 7-8.- P.887-892.

162. Gorman O.T., Beah W.J., Kawaoka Y., Webster R.G. Evolution of the nucleoprotein gene of influenza A virus // J. Virol.- 1990,- Vol.64.- P.1487-1497.

163. Govorkova E.A., Kodihalli S., Alymova I.V. et al. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs // Dev. Biol. Stand.- 1999.- Vol.98.- P.39-51; discussion 73-4.

164. Grassauer A., Egorov A.Yu., Ferko B. et al. A host restriction-based selection system for influenza hemagglutinin transfectant viruses // J. Gen. Virol.- 1998.- Vol.79,-P.1405-1409.

165. Groman N., Woff A.L., Woff M.L. Recherches sur un variant dit "froid" du virus de la poliomyélite//Ann. Inst. Pasteur.- 1960,-Vol.98.- №3.- P.351-359.

166. Gruber W.C., Belshe R.B., Treanor J. et al. Efficacy of trivalent live attenuated intranasal influenza vaccine against monovalent influenza H1N1 challenge in children // Pediatric Research.- 1999,- Vol.45.- №4.- Part 2,- P.162A.

167. Gruber W.C., Gruber W.C., Darden P.M. et al. Evaluation of bivalent live attenuated influenza A vaccines in children 2 months to 3 years of age: safety, immunogenicity and dose-response//Vaccine.- 1997.-Vol.17.- №12-13,- P. 1379-1384.

168. Halperin S.A., Nestruck A.C., Eastwood B.J. Safety and immunogenicity of a new influenza vaccine grown in mammalian cell culture //Vaccine.- 1998.- Vol.16.- №13.-P.1331-1334.

169. Hara K., Beare A.S., Tyrrell D.A.J. Growth and pathogenicity of influenza viruses in organ cultures of ciliated epithelium //Arch. Ges.Virusforsch.- 1974.- Vol.44.- P.227-236.

170. Hay A.J., Bellany H.C., Abraham G. et al. Procedures for characterization of the genetic material of candidate vaccine strains // Dev. Biol. Stand.-1977,- Vol.2.- N39.-P. 15-24.

171. Heath A.W., Maassab H.F., Odagiri T. et al. Cold-adapted reassortants of influenza A virus: pathogenicity of A/Ann Arbor/6/60 X A/Alaska/6/77 reassortant viruses in vivo and in vitro II Arch. Virol.-1986,- Vol.91.- №1-2,- P.53-60.

172. Herlocher M.L., Clavo A.C., Maassab H.F. Sequence comparisons of A/AA/6/60 influenza viruses: mutations which may contribute to attenuation // Virus Research.-1996a.- Vol.42.-№1-2.- P.11-25.

173. Herlocher M.L., Maassab H.F., Webster R.G. Molecular and biological changes in the cold-adapted "master strain" A/AA/6/60 (H2N2) influenza virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993.-Vol.90,- №13,- P.6032-6036.

174. Hirst G.K. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus // Science.-1941,- Vol.94.- P.22.

175. Hirst G.K. Genetic recombination with Newcastle disease virus, polioviruses, and influenza // Cold Spr. Harb. Sym. Quant. Biol.- 1962.- Vol.27.- P.303-309.

176. Hoffmann E., Webster R.G. Eight-plasmid rescue system for influenza A virus. // Abstract book of the Options for the control of influenza IV. 23-28 September, 2000,-Hersonissos, Crete, Greece, 2000.- P.70.-Abstr.W82-1.

177. Hornickova Z. Different progress of MDCK cell death after infection by two different influenza virus isolates. Cell Biochem. Function.- 1997,- Vol.15.- №2,- P.87-93.

178. Jennings B.R., Potter C.V., Teh C.Z., Mahmud M.I.A. The replication of type A influenza viruses in the infant rat: a marker for virus attenuation // J. Gen.Virol.-1980,- Vol.49.- P. 343-354.

179. Karron R.A., Steinhoff M.C., Subbarao E.K. et al. Safety and immunogenicity of a cold-adapted influenza A (H1N1) reassortant virus vaccine administered to infants less than six months of age// Pediatr. Infect. Dis. J.- 1995,- Vol.14.- №1.- P.10-16.

180. Katz J.M., Lu X., Renshaw M. et al. Vaccines against influenza A (H9N2) viruses. // Abstract book of the Options for the control of influenza IV. 23-28 September, 2000.-Hersonissos, Crete, Greece, 2000.- P.52.- Abstr.W62-6.

181. Katz J.M., Naeve C.W., Webster R.G. Host cell-mediated variation in H3N2 influenza viruses//Virology.- 1987,-Vol.156.- P.386-395.

182. Katz J.M., Webster R.G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs // J. Infect. Dis.- 1989.- Vol. 160,-№2,- P.191-198.

183. Katz J.M., Webster R.G. Amino acid sequence identity between the HA1 of influenza A (H3N2) viruses grown in mammalian and primary chick kidney cells // J. Gen. Virol.- 1992,-Vol.73.- P.1159-1165.

184. Kaverin N.V., Finskaya N.N., Rudneva I.A. et al. Studies on the genetic basis of human influenza A virus adaptation to mice: degrees of virulence of reassortants with defined genetic content//Arch.Virol.- 1989,-Vol.105.- №1-2.- P.29-37.

185. Keitel W.A., Couch R.B., Cate T.R., Maassab H.F. Variability in infectivity of cold-adapted recombinant influenza virus vaccines in humans // J. Infect. Dis.- 1994,-Vol.169.- №2.- P.477.

186. Keitel W.A., Couch R.B., Quarles J.M. et al. Trivalent attenuated cold-adapted influenza virus vaccine: reduced viral shedding and serum antibody responses in susceptible adults//J. Infect. Dis.- 1993.-Vol.167.- №2,- P.305-311.

187. Kendal A.P., Maassab H.F., Alexandrova G.I., Ghendon Y.Z. Development of cold-adapted recombinant live, attenuated influenza vaccines in USA and USSR // Antiviral Res.-1981.-Vol.1.- P.339-365.

188. Khan A.S., Polezhaev F.I., Vasilijeva R.I. et al. Comparison of US inactivated split-virus and Russian live attenuated, cold-adapted trivalent influenza vaccines in Russian schoolchildren // J. Inf. Dis.- 1996,- Vol.173.- P.453-456.

189. Kilbourne E.D. Future in influenza vaccines and the use of genetic recombination // Bulletin of the WHO.- 1969,- Vol.41.- №3-5.- P.643-645.

190. Kilbourne E.D. The control of influenza // In: Influenza. Plenum.New York, 1987,-P.291-332.

191. Kilbourne E.D. What are the prospects for a universal influenza vaccine? // Nature Medicine.- 1999,-Vol.5.- №10,- P.1119-1120.

192. Kilbourne E.D. et al. Influenza A virus N2 neuraminidase vaccine is immunigenic and nontoxic in humans//Vaccine.- 1995,-Vol.13.- P. 1799-1803.

193. Kilbourne E.D., Schulman J.L., Schild G.C. et al. Correlated studies of a recombinant influenza virus vaccine. I. Derivation and characterization of virus and vaccine // J. Infect. Dis.-1971,- Vol.124.- №5.- P.449-462.

194. Kilbourne E.D., Couch R.B., Kasel J.A. et al. Influenza A virus N2 neuraminidase vaccine is immunigenic and nontoxic in humans // Vaccine.- 1995.- Vol.13.- №18.-P. 1799-1803.

195. Kistner O., Barrett P.N., Mundt W. et al. A novel mammalian cell (Vero) derived influenza virus vaccine: Development, characterization and industrial scale production //Wien. Klin. Worchenschr.-1999,-Vol.111.- №5,- P.207-214.210

196. Klimov A.I., Cox N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J. Virol. Methods.- 1995a.-Vol.52.-№1-2,- P.41-49.

197. Klimov A.I., Cox N.J. Erratum to PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J. Virol. Methods.-1995b.-Vol.55.- P.445-446.

198. Klimov A.I., Cox N.J., Yotov W.V. et al. Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A/Leningrad/134/57 (H2N2) virus // Virology.-1992,- Vol.86.- P.795-797.

199. Klimov A.I., Ghendon Yu.Z., Medvedeva T.E. High reproduction capacity of recombinants between H3N2 human influenza and fowl plaque viruses is due to the gene coding for M protein //Acta Virol.- 1983.- Vol.27.- P.434-438.

200. Klimov A.I., Romanova J.R., Egorov A.Y. et al. Nucleotide sequences of the neuraminidase genes of influenza A/Leningrad/124/57 (H2N2) virus and two of its live, attenuated, cold-adapted variants //Virus Genes.- 1995d.-.Vol.10.- №11.- P.95-98.

201. Krug R.M. Unique functions of the NS1 protein // In: Texbook of influenza (Eds. K.G.Nicholson, R.G.Webster and A.J.Hay). Blackwell, Oxford.-1999,- P.82-92.

202. Lamb R.A., Krug R.M. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication // In: Virology, 3rd ed. (Eds. B.N.Fields, D.M.Knipe and P.M.Howley). Lippincott-Raven, Philadelphia.- 1996,- P.1353-1395.

203. Lawson C.M., Subbarao E.K., Murphy B.R. Nucleotide sequence changes in the polymerase basic protein 2 gene of temperature-sensitive mutants of influenza A virus//Virology.- 1992.-Vol.191,- №1,- P.506-510.

204. Li S., Liu C., Klimov A. et al. Recombinant influenza A virus vaccines for the pathogenic human A/Hong Kong/97 (H5N1) viruses // J. Infect. Diseases.- 1999.-Vol.179. №5.- P.1132-1138.

205. Li S., Xu M., Coelingh K. Electroporation of influenza virus ribonucleoprotein complexes for rescue of the nucleoprotein and matrix genes // Virus Res.- 1995.-Vol.37.- P. 153-161.211

206. Lindemann J. Viruses as immunological adjuvants in cancer //Biochimica et Biophysica Acta.-1974,- Vol. 355,- P.49-75.

207. Luo M., Harris A., Lommer B. The role of the matrix protein in the assembly of influenza virus // Abstract book of the Options for the control of influenza IV. 23-28 September, 2000.- Hersonissos, Crete, Greece, 2000.- P.38.- Abstr.W42-3.

208. Luyties W., Krystal M., Enami et al. Amplification, expression and packaging of a foreign gene by influenza virus//Cell.-1989,-Vol.57.- P. 1107-1113.

209. Maassab H.F. Adaptation and growth characteristic of influenza virus at 25 degrees C // Nature.- 1967,-Vol.213.- P.612-614.

210. Maassab H.F. Biologic and immunologic characteristics of cold-adapted influenza virus//J. Immunol.-1969,-Vol.102.- №3,- P.728-732.

211. Maassab H.F. Properties of influenza virus "cold-recombinants" // In: Negative Strand Viruses and the Host Cell (B.W.J.Mahy and R.D.Barry eds). London: Academic Press.-1978,- P.755-763.

212. Maassab H.F., Bryant M.L. The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans // Rev. Med. Virol.- 1999,- Vol.9.- №4.- P.237-244.

213. Maassab H.F., Cox N.J., Murphy B.R., Kendal A.P. Biological, genetic and biochemical characterization of a cold-adapted recombinant A/Victoria/3/75 virus and its evaluation in volunteers // Dev. Biol. Stand.- 1977a.- Vol.39.- P.25-31.

214. Maassab H.F., DeBorde D.C. Characterization of an influenza A host range mutant // Virology.-1983.- Vol.130.- №2,- P.342-350.

215. Maassab H.F., DeBorde D.C. Development and characterization of cold-adapted viruses for use as live virus vaccines //Vaccine.-1985.- Vol.3.- №5.- P.355-369.

216. Maassab H.F., Francis T. Jr., Davenport F.M. et al. Laboratory and clinical characteristics of attenuated strains of influenza virus // Bulletin of the WHO.- 1969.-Vol.41.- №3,- P.589-594.

217. Maassab H.F., Heilman C.A., Herlocher M.L. Cold-adapted influenza viruses for use as live vaccines for man // Advances in Biotechnological Processes.-1990.- Vol. 14,-P.203-242.

218. Maassab H.F., Kendal A.P., Abrams G.D., Monto A.S. Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets // J. Infect. Dis.- 1982.- Vol.146.- №6.-P.780-790.

219. Maassab H.F., Kendal A.P., Davenport F.M. Hybrid formation of influenza virus at 25°C // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1972,- Vol.139.- P.768-771.

220. Maassab H.F., LaMontagne J.R., DeBorde D.C. Live influenza vaccine // In "Vaccines" (Eds. S.A.PIotkin and E.A.Mortimer). New York, 1988,- P.435-457.

221. Maassab H.F., Monto A.S., DeBorde D.P. et al. Development of cold recombinants of influenza virus as live virus vaccines. // In "Genetic Variation Among Influenza Viruses" (Ed. D.P.Nayak). Acad. Press, New York.-1981,- P.617-638.

222. Maassab H.F., Soltysiak R.M. The effect of cyclic nucleotides on virus infection // Annals of the New York Academy of Sciences.- 1977b.- Vol.284.- P.375-388.

223. Mackenzie J.S. Virulence of temperature-sensitive mutants of influenza virus // Brit. Med. J.- 1969,- №3,- P.757-762.212

224. Magil TP., Francis T. Studies with human influenza virus cultivated in artificial medium //J. Exp. Med.- 1936,-Vol.63.- №3.- P.803.

225. Mahmud M.I., Maassab H.F., Jennings R., Potter C.W. Influenza virus infection of a newborn rats: virulence of recombinant strains prepared from a cold-adapted, attenuated parent//Arch. Virol.- 1979,-Vol.61.- №3.- P.207-216.

226. Mandler J., Gorman O.T., Ludwig S. et al. Derivation of the nucleoproteins (NP) of influenza viruses isolated from matine mammals // Virology.- 1990.- Vol.176.- №1.-P.255-261.

227. Marion R.M., Fortes P., Beloso A et al. A human sequence homologue of Staufen is an RNA-binding protein that is associated with polysomes and localizes to the rough endoplasmic reticulum // Mol. Cell Biol.- 1999.- Vol.19.- P.2212-2219.

228. Mills J., Chanock R.M. Temperature-sensitive mutants of influenza virus. I. Behavior in tissue culture and in experimental animals // J. Inf. Dis.- 1971,- V.123.- №2.-P.145-157.

229. Majde J.A., Brown R.K., Jones M.W. et al. Detection of toxic viral-associated double-stranded RNA (dsRNA) in influenza-infected lung // Microb. Pathogen.- 1991.-Vol.10.- №2,- P. 105-115.

230. Maloy M.L., Whitaker-Dowling P., Youngner J.S. Dominance of cold-adapted influenza A virus over wild-type viruses is at the level of RNA synthesis // Virology.-1994.-Vol.205.- №1,- P.44-50.

231. Marschall M., Meier-Ewert H., Herrler G. et al. The cell receptor level is reduced during persistent infection with influenza C virus //Arch. Virol.- 1997,- Vol.142.- №6,-P.1155-1164.

232. Maurizi C.P. Why was the 1918 influenza pandemic so lethal? The possible role of a neurovirulent neuraminidase // Med. Hypotheses.- 1985.- Vol.16.- №1.- P. 1-5.

233. Medvedeva T.E., Alexandrova G.I., Smorodintsev A.A. Differentiation of temperature variants of influenza A2 viruses on the basis of plaque formation // J. Virol.- 1968.-Vol.2.- №5,- P.456-460.

234. Medvedeva T.E., Lisovskaya K.V., Polezhaev F.I. et al. Location of the ts defects in the genome of cold-adapted recombinant influenza A virus vaccine strains // Acta Virol.-1984,- Vol.28.- P.204-211.

235. Meyer W.J., Wood J.M., Major D. et al. Influence of host cell-mediated variation on the international surveillance of influenza A (H3N2) viruses // Virology.- 1993.-Vol.96.- №1.-130-137.

236. Michaels R.H., Mahmud M.I., Coup A.J. et al. Influenza virus infection in newborn rats: a possible marker of attenuation for man // J. Med. Virol.- 1978,- Vol.2.- №3.253-264.

237. Mills J., Chanock V., Chanock R.M. Temperature-sensitive mutants of influenza virus. I. Behavior in tissue culture and in experimental animals // J. Infect. Dis.-1971,- Vol.123.- №2,- P.145-157.

238. Mitchell B.M., DeBorde D.C. A procedure for the isolation of specific point mutants of influenza virus//J. Virol. Methods.- 1993,- Vol.42.- №2-3.- P.181-191.

239. Monto A.S., Maassab H.F. Use of influenza vaccine in non-high risk populations // Dev. Biol. Stand.- 1977.-Vol.39.- P.329-335.213

240. Monto A.S., Maassab H.F. Serologic responses to nonprevalent influenza A viruses during intercyclic periods //Am. J. Epidemiol.-1981,-Vol.113.- №3,- P.236-244.

241. Monto A.S., Maassab H.F., Bryan E.R. Relative efficacy of embryonated eggs and cell culture for isolation of contemporary influenza viruses // J. Clin. Microbiol.-1981 .Vol.13.- №1.- P.233-235.

242. Monto A.S., Miller F.D., Maassab H.F. Evaluation of an attenuated, cold-recombinant influenza В virus vaccine // J. Infect. Dis.- 1982,- Vol.145.- №1,- P.57-64.

243. Morris C.A., Freestone D.S., Stealey V.M. et al. Comparison of antibody responses and reactivity of Alice and WRL 105 strain live influenza vaccine // Lancet.- 1975.-Vol.1.- №7969,- P. 196-199.

244. Mortiz A.J., Kunz C., Hofman H. et al. Studies with a cold-recombinant A/Victoria/3/75 (H3N2) virus. II. Evaluation in adult volunteers//J. Infect. Dis.- 1980.-Vol.142.- №6,- P.857-860.

245. Mostow S.R., Flatauer S., Martinko J. An 'in vitro' marker of attenuation for live influenza virus vaccine candidates // Dev. Biol. Stand.- 1975.- Vol.28.- P.354-362.

246. Mostow S.R., Hoskins J.A., Wright P.F. Behavior of vaccine revertants of temperature-sensitive mutants of influenza virus in ferret tracheal organ culture // Infect. Immun.- 1979,-Vol.26.-№1,- P.193-196.

247. Murphy B.R. Use of live attenuated cold-adapted influenza A reassortant virus vaccines in infants, children, young adults, and elderly adults // Infect. Dis. Clin. Practic.- 1993,- Vol.2.- P. 174-181.

248. Murphy B.R., Buckler-White A.J., London W.T., Snyder M.H. Characterization of the M protein and nucleoprotein genes of an avian influenza A virus which are involved in host range restriction in monkeys // Vaccine.- 1989.- Vol.7.- № 6.- P.557-561.

249. Murphy B.R., Chalnub E.G., Nussinoff S.R. et al. Temperature-sensitive mutants of influenza virus. II. Attenuation of ts recombinants for man // J. Inf. Dis.- 1972,-Vol.123.- P.170-178.

250. Murphy B.R., Chalnub E.G., Nusinoff S.R. et al. Temperature-sensitive mutants of influenza virus. III. Further characterisation of the ts-1E. influenza A recombinants (H3N2) virus in man // J. Inf. Dis.- 1973,- Vol.2.- P.479-487.

251. Murphy B.R., Chanock R.M. Genetic approaches to the prevention of influenza A virus infection // In "Genetic Variations Among Influenza Viruses" (Ed. D.P.Nayak). New York, 1981.- P.601-615.

252. Murphy B.R., Clements M.L., Madore H.P. et al. Dose response of cold-adapted, reassortant influenza A/California/10/78 virus (H1N1) in adult volunteers // J. Infect. Dis.- 1984b.- Vol.149.- №5,- P.816.214

253. Murphy B.R., Hinshaw V.S., Sly D.L. et al. Virulence of avian influenza A viruses for squirrel monkeys// Infect. Immun.- 1982a.-Vol.37.- P.1119-1126.

254. Murphy B.R., Maassab H.F., Wood F.T. Jr., Chanock R.M. Characterization of the temperature sensitive phenotype of the A/Ann Arbor/6/60 cold-adapted virus and its recombinants // Infect. Immun.- 1981b.- Vol.32.- №2,- P.960-963.

255. Murphy B.R., Markoff L.J., Chanock R.M. et al. Genetic approaches to attenuation of influenza A viruses for man // In: Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B: Biological Sciences.- 1980a.- Vol.288.- №1029.- P.401-415.

256. Murphy B.R., Rennels M.B., Douglas R.G. Jr. et al. Evaluation of influenza A/Hong Kong/123/77 (H1N1) ts-1A2 and cold-adapted recombinant viruses in seronegative adult volunteers // Infect. Immun.- 1980b.- Vol.29.- №2.- P.348-355.

257. Murphy B.R., Sly D.L., Tirney E.L. et al. Influenza A reassortant virus derived from avian and human influenza A viruses is attenuated and immunogenic in monkeys // Science.- 1982b.-Vol.218.- P.1330-1332.

258. Muster T., Ferko B., Garsia-Sastre A. et al. Influenza virus as a vector for mucosal immunization // Abstract book of the Xth International Congress of Virology. 11-16 August, 1996.- Jerusalem, Israel, 1996,- P.178.- PW27-16.

259. Muster T., Ferko B, Klima A. et al. Mucosal model of immunization against human immunodeficiency virus type 1 with a chimeric influenza virus // J. Virol.- 1995.-Vol.69.- P.6678-6686.

260. Naeve C.W., Hinshaw V.S., Webster R.G. Mutations in the hemagglutinin receptor-binding site can change the biological properties of an influenza virus // J. Virol.-1984,-Vol.51.- №2,- P.567-569.

261. Naeve C.W., Webster R.G., Hinshaw V.S. Phenotype variation in influenza virus reassortants with identical gene constellation // Virology.- 1983.- Vol.128.- №2.-P.331-340.

262. Nakajima S., Sugiura A. Neurovirulence of influenza virus in mice. II. Mechanism of virulence as studied in a neuroblastoma cell line // Virology.- 1980,- Vol.101.- №2,-P.450-457.

263. Neirynck S., Deroo T., Saelens X. et al. A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein // Nature Medicine.- 1999.- Vol.5.- №1 O.P.1157-1163.215

264. Nerome K., Kumihashi H., Nerome R. et al. Evaluation of immune responses to inactivated influenza vaccines prepared in embryonated chicken eggs and MDCK cells in a mouse model // Dev. Biol. Stand.- 1999.- Vol.98.- P.53-63.

265. Neumann G., Watanabe T., Ito H. et al. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1999,- Vol.96.- №16,- P.9345-9350.

266. Nicholson K.G., Tyrrell D.A.J., Oxford J.S. et al. Infectivity and reactogenicity of reassortant cold-adapted influenza A/Korea/1/82 vaccines obtained from the USA and USSR // Bulletin of the WHO.- 1987,- Vol.65.- №3,- P.295-301.

267. Odagiri T. Reverse misreading of a GC doublet by the modified T7 DNA polymerase, Sequenase //Virus Genes.- 1994,- Vol.8.- №3,- P.271-274.

268. Odagiri T. Functions of the segment-specific noncoding regions of influenza virus genome RNA // Nippon Rinsho Japanese J. Clin. Med.- 1997,- Vol.55.- №10.-P.2547-2554.

269. Odagiri T., DeBorde D.C., Maassab H.F. Cold-adapted recombinants of influenza A virus in MDCK cells. I. Development and characterization of A/Ann Arbor/6/60 X A/Alaska/6/77 recombinant viruses//Virology.- 1982,- Vol.119.- №1,- P.82-95.

270. Odagiri T., Hong J., Ohara Y. The BM2 protein of influenza B virus is synthesized in the late phase of infection and incorporated into virions as a subviral component // J. Gen. Virol.- 1999,-Vol.80.- Pt 10,- P.2573-2581.

271. Odagiri T., Smitka C.W., Maassab H.F. Cold-adapted reassortants of influenza A virus in MDCK cells. II. Role of the temperature-sensitive property of cold-adapted reassortants in mice // Microbiol. Immun.- 1983.- Vol.27.- №2.- P.203-206.

272. Odagiri T., Tobita K., Tashiro M. Synthesis of the NS 2 nonstructural protein messenger RNA of influenza A viruses occurs in the absence of viral protein synthesis //Arch. Virol.-1991,-Vol.120.- №3-4,- P.281-288.

273. Odagiri T., Tosaka A., Ishida N., Maassab H.F. Biological characteristics of a cold-adapted influenza A virus mutation residing on a polymerase gene // Archives of Virology.- 1986,-Vol.88.- №1-2,- P.91-104.

274. Offringa D.P., Tyson-Medlock V., Ye Z., Levandowski R.A. A comprehensive systematic approach to identification of influenza A virus genotype using RT-PCR and RFLP // J. Virol. Methods.- 2000a.- Vol.88.- P. 15-24.

275. Ogra P.L., Chow T., Beutner K.R. et al. Clinical and immunological evaluation of neuraminidase-specific influenza A virus vaccine in humans // J. Infect. Diseases.1977,- Vol.135.- №4,- P.499-506.

276. O'Hagan D.T. Recent advances in vaccine adjuvants for systemic and mucosal administration //J. Pharm. Pharmacol.- 1998.-Vol.50.- №1.- P.1-10.

277. O'Neill R.E., Talon J., Palese P. The influenza virus NEP (NS2 protein) mediates the nuclear export of viral ribonucleoproteins // EMBO J.- 1998.- Vol.17.- №1.- P.288-296.

278. Oxford J.S., Corcoran T., Knott R. et al. Serological studies with influenza A (H1N1) viruses cultivated in eggs or in a canine kidney cell line (MDCK) // Bulletin of the WHO.- 1987,-Vol.65.- P.181-187.

279. Oxford J.S., McGeoch D.J., Child G.L., Beare A.S. Analysis of virion RNA segments and polypeptides of influenza A virus recombinants of defined virulence // Nature.1978,-Vol.273. №5665,- P.778-779.

280. Palache A.M., Brands R., van Scharrenburg G.J. Immunogenicity and reactogenicity of influenza subunit vaccines produced in MDCK cells or fertilized chicken eggs // J. Infect. Dis.- 1997,-Vol.176.- Suppl.1.-P.S20-23.

281. Palese P. The genes of influenza virus // Cell.-1977,- Vol.10.- №1.- P.1-10.

282. Palese P., Muster T., Zheng H. et al. Learning from our foes: a novel vaccine concept for influenza virus //Arch. Virol. Suppl.- 1999,- Vol.15.- P.131-138.

283. Palese P., Ritchey M.B. Live attenuated influenza virus vaccine strains with temperature-sensitive defects in P3 protein and nucleoprotein // Virology.- 1977.-Vol.78.- №1,- P. 183-191.

284. Palese P., Schulman J.L. Mapping of the influenza virus genome: identification of the hemagglutinin and neuraminidase genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1976.-Vol.73.- P.2142-2146.

285. Palese P., Zavala F., Muster T. et al. Development of novel influenza virus vaccines and vectors // J. Infect. Dis.- 1997,- Vol.176.- Suppl.1.- P.S45-49.

286. Parkin N.T., Chiu P., Coelingh K. Genetically engineered live attenuated influenza A virus vaccine candidates // J. Virol.- 1997,- Vol.71.- №4 P.2772-2778.

287. Percy N., Barclay S., Garsia-Sastre A., Palese P. Expression of a foreign protein by influenza A virus // J. Virol.- 1994,- Vol.68.- №7.- P.4486-4492.217

288. Piazza F.M., Carson J.L., Hu S.S., Leigh M. Attachment of influenza A virus to ferret tracheal epithelium at different maturational stages // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.-1991.-Vol.4.-P.82-97.

289. Polezhaev F.I., Garmashova L.M., Alexandrova G.I. et al. Obtaining of "cold" recombinants of influenza virus, possessing properties of attenuated strains // Acta Virol.-1974,- Vol.18.- P.364.

290. Polezhaev F.I., Garmashova L.M., Koval N.A. et al. Attenuated ts recombinants of influenza A/USSR/77 (H1N1) virus obtained by crossing with the cold-adapted donor A/Leningrad/134/57 (H2N2) virus //Acta Virol.- 1982,- Vol.26.- P.221.

291. Polezhaev F.I., Garmashova L.M., Polyakov Yu.M. et al. Conditions for production of thermosensitive attenuated influenza virus recombinants // Acta Virol.- 1978.-Vol.22.- P.363.

292. Polezhaev F.I., Garmashova L.M., Rumovsky V.I. et al. Peculiarities of obtaining attenuated thermosensitive recombinants of influenza A virus at the end of the H3N2 cycle //Acta Virol.- 1980,- Vol.24.- P.273.

293. Potter C.W., Shore S.L., McLaren C., Stuart-Harris C. Immunity to influenza in ferrets. II. Influence of adjuvants on immunization // Br. J. Exp. Path.- 1972,- Vol.53.-P.168-179.

294. Potter C.W., Oxford J.S., Shore S.L. et al. Immunity to influenza in ferrets. I. Response to live and killed virus // Br. J. Exp. Path.-1972.- Vol.53.- P.153-167.

295. Pyhala R., Pyhala L., Vaile M., Aho K. Egg-grown and tissue-culture-grown variants of influenza A (H3N2) virus with special attenuation to their use as antigens in seroepidemiology// Epidemiol. Infect.- 1987.-Vol.99.- P.745-753.

296. Reed L., Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints // Amer. J. Hyg.- 1938,-Vol.27.- P.483-856.

297. Reeve P., Almond J.W., Felsenreich V. et al. Studies with a cold-recombinant A/Victoria/3/75 (H3N2) virus. I. Biologic, genetic, and biochemical characterization // J. Infect. Dis.- 1980a.-Vol.142.- №6,- P.850-856.

298. Reeve P., Gerendas B., Moritz A. et al. Studies in man with cold-recombinant influenza virus (H1N1) live vaccines // J. Med. Virol.- 1980b.- Vol.6.- №1.- P.75-83.

299. Riser B.L., Maassab H.F. Differential interaction of virulent and attenuated influenza virus strains with ferret alveolar macrophages: possible role in pathogenicity // J. Infect. Dis.- 1990,- Vol. 161.- №4,- P.699-705.

300. Ritchey M.B., Palese P., Schulman J.L. Mapping of the influenza virus genome: identification of genes coding for nucleoproteins, membrane protein, and nonstructural protein //J. Virol.- 1976,-Vol.20.- P.307-313.

301. Revised requirements for influenza vaccine (inactivated). Requirements for influenza vaccine (live). WHO Expert Committee on biological standartization. Thirtieth report. Annex 3 // WHO, Geneva.-1979.- 194c.

302. Robertson J.S., Bootman J.S., Newman R. et al. Structural changes in the haemagglutinin which accompany egg adaptation of an influenza A (H1N1) virus // Virology.- 1987,- Vol.160.- P. 181-187.

303. Robertson J.S., Cook P., Attwell A.M., Williams S.P. Replicative advantage in tissue culture of egg-adapted influenza virus over tissue-culture derived virus: implications for vaccine manufacture //Vaccine.-1995.- Vol.13.- №16.- P. 1583-1588.

304. Robertson J.S., Naeve C.W., Webster R.G. et al. Alterations in the haemagglutinin associated with adaptation of influenza B virus to growth in eggs // Virology.- 1985,-Vol.143.- P.166-174.218

305. Rogers G.N., Paulson J.C. Receptor determinants of human and animal influenza virus isolates: differences in receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on species of origin //Virology.- 1983,-Vol.127.- №2.- P.361-373.

306. Rota P.A., Shaw M.W., Kendal A.P. Comparison of the immune response to variant influenza type B hemagglutinins expressed in vaccinia virus // Virology.- 1987.-Vol.6.- P.269-275.

307. Rott R. Molecular basis of infectivity and pathogenicity of myxovirus. Brief review //Arch. Virol.- 1979a.-Vol.59.- №4.- P.285-298.

308. Rott R. In vitro differenzierung von pathogenen und apathogenen aviarian influenzaviren // Berlin, und munch tierarztl. Wachenschr.- 1985.- Vol.98.- P.37-39.

309. Rott R., Orlich M., Scholtissek C. Correlation of pathogenicity and gene constellation of influenza A viruses. III. Non-pathogenic recombinants derived from highly pathogenic parent strains // J. Gen. Virol.- 1979b.- Vol.44.- P.471-477.

310. Rott R., Orlich M., Klenk H.D. et al. Studies on the adaptation of influenza viruses to MDCK cells // EMBO J.- 1984,- Vol.3.- №13,- P.3329-3332.

311. Rott R., Orlich M., Scholtissek C. Differences in the multiplication at elevated temperature of influenza virus recombinants pathogenic and non-pathogenic for chicken //Virology.- 1982.-Vol.20.- №1,- P.215-224.

312. Rudenko L.G., Lonskaya N.I., Klimov A.I. et al. Clinical and epidemiological evaluation of a live, cold-adapted influenza vaccine for 3-14 years-olds// Bulletin of the WHO.- 1996,-Vol.74.- №.1- P.77-84.

313. Rudenko L.G., Slepushkin A.N., Monto A.S. Efficacy of live attenuated and inactivated influenza vaccines in schoolchildren and their unvaccinated contacts in Novgorod, Russia //J. Infect. Dis.-1993,-Vol.168.- P.881-887.

314. Sabin A.B., Lwoff R. Relation between reproductive capacity of polio viruses at different temperatures in tissue culture and neurovirulence // Science.- 1959,-Vol.129.- №3358,- P. 1287-1288.

315. Sears S.D., Clements M.L., Betts R.F. et al. Comparison of live, attenuated H1N1 and H3N2 cold-adapted and avian-human influenza A reassortant viruses and inactivated virus vaccine in adults // J. Infect. Dis.- 1988,- Vol.158.- №6.- P.1209-1219.

316. Schiff O.M., Linneman C.C., Shea L. et al. Evaluation of a live, attenuated recombinant influenza vaccine in high school children // Infect. Immun.- 1975.-Vol.11,- P.754-757.

317. Schild G.C., Oxford J.S., de Jong J.C., Webster R.G. Evidence for host-cell selection of influenza virus antigenic variants // Nature.- 1983,- Vol.303.- №5919,- P.706-709.

318. Schulman J.L. Virus-determined differences in the pathogenesis of influenza virus infection // In: Genetics of influenza viruses (Eds. P.Palese and D.W. Kingsbury), NY, Springer-Verlag, 1983,- P.305-320.

319. Schulman J.L., Palese P. Virulence factors of influenza A viruses: WSN virus neuraminidase required for plaque production in MDBK cells // J. Virol.- 1977.-Vol.24.- №1,- P.170-176.

320. Shaw M.W., Arden N.H., Maassab H.F. New aspects of influenza viruses // Clin. Microbiol. Rev.-1992,-Vol.5.- №1,- P.74-92.

321. Small P.A. Jr., Waldman R.H., Bruno J.C., Gifford G.E. Influenza infection in ferrets: role of serum antibody in protection and recovery // Infect. Immun.- 1976.- Vol. 13.-№2,- P.417-424.

322. Smith W.S., Andrewes C.H., Laidlaw P.P. A virus obtained from influenza patients // Lancet.- 1933,-Vol.11.- №11,- P.66-68.

323. Smith H., Sweet C. Lessons for human influenza from pathogenicity studies with ferrets // Rev. Infect. Dis.- 1988,- Vol.10.- №1,- P.56-75.

324. Smorodintsev A.A., Alexandrova G.I. Live influenza vaccine and the methods of enhancing it // Proceedings of the Symposium of live influenza vaccine.- Copyright by the Yugoslav Academy of Sciences and Arts, Zagreb. 1971,- P.31-34.

325. Smorodintseff A.A., Tushinsky M.D., Drobyshevskaya A.I. et al. Investigation on volunteers infected with influenza virus // Amer. J. Med. Sci.- 1937.- Vol.194.- №2.-P. 159-170.

326. Snyder M.H., Betts R.F., DeBorde D. et al. Four viral genes independently contribute to attenuation of live influenza A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) cold-adapted reassortant virus vaccines // J. Virol.- 1988.- Vol.62.- №2.- P.488-495.

327. Snyder M.N., Clements M.L. Betts R.F. et al. Evaluation of live avian-human influenza A H3N2 and H1N1 virus vaccine in seronegative adult volunteers // J. Clin. Microbiol.- 1986a.-Vol.23.- P.852-857.

328. Snyder M.H., London W.T. Attenuation and phenotypic stability of influenza B/Texas/1/84 cold-adapted reassortant virus: studies in hamsters and chimpanzees //J. Infect. Dis.- 1989,-Vol.160.- №4,- P.604-610.

329. Snyder M.H., London W.T., Maassab H.F., Murphy B.R. Attenuation and phenotypic stability of influenza ВЯехаэ/1/84 cold-adapted reassortant virus: studies in hamsters and chimpanzees // J. Infect. Dis.- 1989.- Vol.160.- №4,- P.604-610.

330. Snyder M.H., London W.T., Tierney E.L. et al. Restricted replication of a cold-adapted reassortant influenza A virus in the lower respiratory tract of chimpanzees // J. Infect. Dis.- 1986c.-Vol.154.- №2,- P.370-371.

331. Spencer I.R., Cherry I.D., Powell K.K. et al. Clinical trials with Alice strain, live, attenuated, serum inhibitor-resistant intranasal influenza A vaccine // J. Infect. Dis. 1975,-Vol.132.- P.415-424.

332. Subbarao E.K., Kawaoka Y., Murphy B.R. Rescue of an influenza A virus wild-type PB2 gene and a mutant derivative bearing a site-specific temperature-sensitive and attenuating mutation // J. Virol.- 1993a.- Vol.67.- №12,- P.7223-7228.

333. Subbarao E.K., London W., Murphy B.R. A single amino acid in the PB2 gene of influenza A virus is a determinant of host range // J. Virol.- 1993b.- Vol.67.- №4,-P.1761-1764.

334. Subbarao K., Webster R.G., Kawaoka Y., Murphy B.R. Are there alternative avian influenza viruses for generation of stable attenuated avian-human influenza A reassortant viruses? // Virus Research.- 1995b.- Vol.39.- №2-3.- P. 105-118.

335. Sukeno N., Otsuki Y., Konno J. et al. Anti-nucleoprotein antibody response in influenza A infection // Tohoku J. Exp. Med.- 1979.- Vol.128.- №3,- P.241-249.

336. Suzuki Y., Kato H., Naeve C.W., Webster R.G. Single-amino-acid substitution in an antigenic site of influenza virus hemagglutinin can alter the specificity of binding to cell membrane-associated gangliosedes // J. Virol.- 1989.- Vol.63.- P.4298-4302.

337. Sweet T.M., Maassab H.F., Coelingh K., Herlocher M.L. Creation of amantadine resistant clones of influenza type A virus using a new transfection procedure // J. Virol. Methods.- 1997,-Vol.69.- №1-2.-P. 103-111.

338. Sweet T.M., Smith H. Pathogenicity of influenza virus // Microbiol. Rev.- 1980.-Vol.44.- №2,- P.303-330.

339. Tanaka T., Odagiri T., Tobita K. Biological functions of the NS1 protein of an influenza В virus mutant which has a long carboxyl terminal deletion // Arch. Virol.-1988,- Vol.102.- №3-4.- P. 173-185.

340. Tannock G.A., Bryce D.A., Paul J.A. Evaluation of chicken kidney and chicken embryo kidney cultures for the large-scale growth of attenuated influenza virus master strain A/Ann/Arbor/6/60-ca //Vaccine.- 1985.- Vol.3.- P.333-339.

341. Terajima M., Jameson J., Norman J.E. et al. High-yield reassortant influenza vaccine production virus has a mutation at an HLA-A 2.1-restricted CD8(+) CTL epitope on the NS1 protein //Virology.- 1999,-Vol.259.- №1,- P. 135-140.

342. Tobita K., Odagiri T., Tanaka T. Isolation of a novel type of interfering influenza B virus defective in the function of M gene //Arch. Virol.- 1986,- Vol.90.- №3-4,- P.223-236.

343. Tolpin M.D., Massicot J.G., Mullinix M.G. et al. Genetic factors associated with loss of the temperature-sensitive phenotype of the influenza A/Alaska/77-ts-1A2 recombinant during growth in vivo//Virology.-1981.-Vol.112.- P.505-517.

344. Treanor J.J., Buja R., Murphy B.R. Intragenic suppression of a deletion mutation of the nonstructural gene of an influenza A virus // J. Virol.- 1991a.- Vol.65.- №8.-P.4204-4210.

345. Treanor J., Perkins M., Battaglia R., Murphy B.R. Evaluation of the genetic stability of the temperature-sensitive PB2 gene mutation of the influenza A/Ann Arbor/6/60 cold-adapted vaccine virus // J. Virol.-1994,- Vol.68.- №12,- P.7684-7688.

346. Treanor J.J., Snyder M.H., London W.T., Murphy B.R. The B allele of the NS gene of avian influenza viruses, but not the A allele, attenuates a human influenza A virus for squirrel monkeys//Virology.- 1989,-Vol.171.-№1.- P.1-9.

347. Urabe M., Tanaka T., Odagiri T. et al. Persistence of viral genes in a variant of MDBK cell after productive replication of a mutant of influenza virus A/WSN // Arch. Virol.-1993,- Vol.128.- №1-2.- P.97-110.

348. Voeten J.T.M., Brands R., Palache A.M. et al. Characterization of high-growth reassortant influenza A viruses generated in MDCK cells cultured in serum-free medium // Vaccine.- 1999,- Vol. 17,- №15-16,- P. 1942-1950.

349. Wang M., Katz J.M., Webster R.G. Extensive heterogenicity in the hemagglutinin of egg-grown influenza viruses from different patients // Virology.-1989.- Vol.171.- №1 .-P.275-279.

350. Wang P., Palese P., O'Neill R.E. The NPI-1/NPI-3 (karyopherin alpha) binding site on the influenza a virus nucleoprotein NP is a nonconventional nuclear localization signal // J. Virol.- 1997.- Vol.71.- №3,- P. 1850-1856.

351. Webster R.G. Potential advantages of DNA immunization for influenza epidemic and pandemic planning // Clin. Infect. Dis.- 1999.- Vol.28.- №2,- P.225-229.

352. Webster R.G., Cambell C.H., Granoff A. The "in vivo" production of "new" influenza A viruses. I. Genetic recombination between avian and mammalian influenza viruses // Virol.-1971,- Vol.44.- №2,- P.317.

353. Webster R.G., Guan Y., Krauss S. et al. Influenza an emerging pathogen // Abstract book of the 11th International Conference on Negative Strand Viruses. 2429 June, 2000.- Quebec City, Canada, 2000,- P. 1022.- Abst.165.

354. Whitaker-Dowling P., Lucas W., Youngner J.S. Cold-adapted vaccine strains of influenza A virus act as dominant negative mutants in mixed infections with wild-type influenza A virus //Virology.- 1990,- Vol.175.- №2,- P.358-364.

355. Whitaker-Dowling P., Zvolenski R., Youngner J.S. The genes associated with trans-dominance of the influenza A cold-adapted live virus vaccine // Virology.- 1991b.-Vol.180.- №1,- P.81-87.

356. Wiley D.C., Skehel J.J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus //Ann. Rev. Biochem.- 1987,- Vol.56.- P.365-394.

357. Williams M.S., Wood J.M. A brief history of inactivated influenza virus vaccine // In: Options for the control of influenza II (Eds. C.Hannoun et al.). Amsterdam, Excerpta Medica.- 1993.- P. 169-170.

358. Wolff T., O'Neill R.E., Palese P. Interaction cloning of NS1-I, a human protein that binds to the nonstructural NS1 proteins of influenza A and В viruses // J. Virol.-1996.- Vol.70.- №5,- P.363-372.

359. Wolff T., O'Neill R.E., Palese P. NS1-Binding protein (NS1-BP): a novel human protein that interacts with the influenza A virus nonstructural NS1 protein is relocated in the nuclei of infected cells // J. Virol.- 1998.- Vol.72.- №9,- P.7170-7180.

360. Wood J.M., Nicholson K.G., Zambon M. et al. Developing vaccines against potential pandemic influenza viruses. // Abstract book of the Options for the control of influenza IV. 23-28 September, 2000.- Hersonissos, Crete, Greece, 2000.- P.8.-Abstr.S6-5.

361. Wood J.M., Oxford J.S., Dunleavy U. et al. Influenza A (H1N1) vaccine efficacy IN animal models is influenced by two amino acid substitutions in the haemagglutinin molecule//Virology.- 1989,-Vol.171.- P.214-221.

362. Wright P.F., Karzon D.T. Live attenuated influenza vaccines // Prog. Med. Virol.-1987,-Vol.34.- P.70-88.

363. Wright P.F., Okabe N., McKee K.T, Jr. et al. Cold-adapted recombinant influenza A virus vaccines in seronegative young children // J. Infect. Dis.- 1982,- Vol.146.- №1.-P.71-79.

364. Wright P.F., Sell S.H., Shinozaki T. et al. Safety and antigenicity of influenza A/Hong Kong/68-ts-1E. (H3N2) vaccine in young seronegative children // J. Pediatr.- 1975.-Vol.87.- P.1109-1116.

365. Yamada Y., Shimokata K., Yamada Y. et al. Inhibition of influenza A virus replication by a kanamycin derivative //Antiviral Research.-1991.-Vol.15.- №3.- P.171-182.

366. Yamane N., Arikawa J., Odagiri T. et al. Isolation of three different influenza A viruses from an individual after probable double infection with H3N2 and H1N1 viruses//Japanese J. Med. Sci. Biol.-1978,-Vol.31.- №5-6.- P.431-434.

367. Yamane N., Hiratsuka M., Arikawa J. et al. Antibody responses after repeated influenza A virus immunizations among schoolchildren in Japan // J. Hyg.- 1981a.-Vol.87.- №3,- P.383-392.

368. Yamane N., Nakamura Y., Yuki M. et al. Serological evaluation of an influenza A virus cold-adapted reassortant live vaccine, CR-37 (H1N1), in Japanese adult volunteers // J. Hyg.- 1984,- Vol.92.- №2,- P.231-242.

369. Yamane N., Odagiri T., Arikawa J., Ishida N. Reversed single-radial-immunodiffusion test: the method for the assay of the antibody to influenza A nucleoprotein // Tohoku J. Exp. Med.- 1981a.-Vol.133.- №3,- P.245-255.

370. Yamane N., Odagiri T., Arikawa J. et al. Effect of specific immunity to viral neuraminidase on subsequent influenza virus infection in man // Microbiol. Immunol.-1991,-Vol.23.- №6,- P.565-567.

371. Zaky D.A., Douglas R.G., Betts R.F. et al. Safety and efficacy of "Alice" influenza virus vaccine in normal healthy adults // J. Infect. Dis.- 1976,- Vol.133.- P.669-675.

372. Zebedee S.L., Lamb R.A. Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions // J. Virol.- 1988.- Vol.62.-P.2762-2772.

373. Zhdanov V.M. Live influenza vaccines in USSR. Development of studies and practical approaches // In: Options for the Control of Influenza (Eds. A.P.Kendall and P.Patriarca), NY:Alan R.Liss, 1986.-P. 193-205.

374. Zheng H.Y., Lee H.A., Palese P., Garcia-Sastre A. Influenza A virus RNA polymerase has the ability to stutter at the polyadenylation site of a viral RNA template during RNA replication // J. Virol.- 1999.- Vol.73.- №6,- P.5240-5243.