p53-зависимые сигнальные пути в опухолевых клетках с диким типом p53 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Разорёнова, Ольга Валериевна

• Разорёнова, Ольга Валериевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Разорёнова, Ольга Валериевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

У I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Введение г* < 1.1 Онкогены и опухолевые супрессоры

1.2 р53 - центральный компонент сигнальных путей, ограничивающих злокачественный рост клеток

1.2.1 Последствия инактивации гена р

1.2.2 Биологическая роль гена р

1.2.3 Функции, строение молекулы и активация белка р

1.2.4 Транскрипционные мишени белка р

1.2.5 Латентное и активированное состояние белка р

1.2.6 Активация р53 в ответ на стрессы

1.3 Белки, физически взаимодействующие с белком р53 и модулирующие его функции

1.3.1 Н1Р-1-зависимый сигнальный путь

1.3.1.1 Структура белка НПМа - главного регулятора кислородного гомеостаза

1.3.1.2 Ог-зависимая регуляция активности НПМа

1.3.1.3 Транскрипционные мишени Н1К

1.3.1.4 Роль р53 в ответе клетки на действие гипоксии

1.3.1.5 Роль р53 в регуляции активности НПМ

С 1.3.2 НБР-зависимый сигнальный путь и белки теплового шока

1 1.3.2.1 Регуляция экспрессии НБР

V 1 * 1.3.2.2 Локализация НБР

1.3.2.3 Экспрессия НБР в раковых клетках

1.3.2.4 НБР и р

1.3.2.5 Возможные механизмы стабилизации белка р

1.3.2.6 Стабилизация мут-р53 за счет ассоциации с НБР

1.3.2.7 Стабилизация мут-р53 за счет ассоциации с НБР

1.3.2.8 Взаимодействие р53 с морталинами

1.4 Репортерные конструкции для изучения динамики активности белков различных сигнальных путей

1.4.1 Технология репортерных генов

1.4.2 Репортерные гены

1.4.3 Применение репортерной технологии

1.4.3.1 Введение экзогенного генетического материала в клетки и экспрессия генов

1.4.3.1.1 Анализ промоторов

1.4.3.1.2 Мониторинг эффективности трансфекции (доставки трансгенов внутрь клеток)

1.4.3.1.3 Визуализация генной экспрессии

1.4.3.2 Биологические скрининги и открытие химических соединений

1.4.3.2.1 Характеристика рецепторов и их лигандов

1 1.4.3.2.2 Изучение сигнальных путей

1 1.4.3.2.3 Применение репортерной технологии в токсикологии

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

И.1 Клеточные линии и их культивирование

И.2 Обработки клеточных линий химическими соединениями и тепловым шоком

11.3 Векторы и плазмидные конструкции

II.3.1 HIF-la-чувствительные репортерные плазмиды

0 II.3.2 HSF-1-чувствительные репортерные плазмиды

11.3.3 р53-чувствительные репортерные плазмиды

11.3.4 Плазмиды, экспрессирующие siRNA

11.3.5 Получение конструкций, экспрессирующих р53 с FLAG 68 последовательностью аминокислот на С или N конце

11.4 Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами, киназой, 69 щелочной фосфатазой и ферментом Кленова

11.5 Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей

11.6 Лигирование фрагментов ДНК

11.7 Получение компетентных клеток E.coli и трансформация

11.8 Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК

II.9 Получение ретровирусных и лентивирусных вирионов, заражение ими клеток-мишеней и отбор инфицированных клеток на антибиотике

11.10 Окраска клеток на р-галактозидазу

11.10.1 X-gal окрашивание

11.10.2 ONPG окрашивание

11.11 Вестерн-анализ

11.12 Иммунопреципитация

11.13 Выделение ядерных и цитоплазматических экстрактов

11.14 Иммунофлуоресценция

11.15 Коиммунофлуоресценция

11.16 Определение субклеточной локализации белка

11.17 Норзерн-анализ

11.18 ОТ-ПЦР-анализ и секвенирование кДНК р

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

111.1 Вирусные системы экспрессии генов в культивируемых 80 клетках млекопитающих

111.2 Получение и оптимизация работы ретро/лентивирусных 81 репортерных конструкций для оценки транскрипционной активности белка р

III.3 Получение и оптимизация работы ретро/лентивирусных репортерных конструкций для оценки транскрипционной активности белков HIF-1 и HSF

111.4 Определение субклеточной локализации и уровня экспрессии 92 белка р53 в различных опухолевых линиях клеток

111.5 Выяснение природы гранулярного цитоплазматического 95 окрашивания антителами DO-1 в некоторых меланомных клеточных линиях

111.6 Измерение транскрипционной активности белка р53 в 102 различных клеточных линиях в ответ на обработку клеток рядом химических соединений

111.7 Определение степени р53-зависимости действия камптотецина 110 на экспрессию генов-мишеней белка р

IV. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «p53-зависимые сигнальные пути в опухолевых клетках с диким типом p53»

Ген р53 является центральным компонентом механизма, обеспечивающего удаление из организма патологических клеток. Многочисленные сигнальные пути отслеживают состояние клетки и в случае возникновения повреждений или сбоев, угрожающих приобретением наследуемых изменений генетического материала, вызывают активацию белка р53. В результате клетки либо временно задерживаются в сверочных точках клеточного цикла, где они имеют возможность исправить возникшие повреждения в процессе репарации ДНК, либо полностью выключаются из дальнейших делений, подвергаясь клеточной смерти по типу апоптоза или клеточному старению, ведущему в конечном итоге к смерти по типу некроза. Утрата гена р53 приводит к накоплению генетических повреждений, приводящих к потере контроля над отдельными клетками со стороны целого организма, злокачественному росту и смерти.Интактность р53-зависимого сигнального пути важна при использовании химио- и радиотерапии для лечения раковых заболеваний. Многие химические соединения, используемые для предотвращения злокачественного роста опухолей, приводят к повреждениям ДНК, которые активируют белок р53. Известно, что р53 может активироваться в ответ на целый ряд стрессовых воздействий, включающих гипоксию (кислородное голодание) и тепловой шок. Также известна связь р53-зависимого сигнального пути с такими путями стрессового ответа как сигнальные пути, центральными компонентами которых являются индуцируемый гипоксией фактор 1 (HIF-1) и фактор теплового шока 1 (HSF-1). Таким образом, изучение взаимосвязей между р53, HIF-1 и HSF-1 активностями может пролить свет на многие аспекты клеточного реагирования на стресс, особенно в контексте опухолевого роста. Изучение механизмов клеточного реагирования на вышеперечисленные стрессы является областью активных научных исследований и обещает возникновение в будущем новых подходов к предотвращению и лечению рака и многих других патологических заболеваний.Основной целью данной работы являлось исследование состояния р53-зависимого сигнального пути в клеточных линиях различного происхождения.В ходе исследования бьши поставлены следующие задачи: 1. Создание дизайна индивидуальных для каждого транскрипционного фактора (р53, HIF-1 и HSF-1) репортерных кассет, включающих в себя а) множественные палиндромные последовательности, узнаваемые и связываемые данными транскрипционными факторами; б) минимальный промотор гена белка теплового шока 70 или минимальный ранний промотор из генома цитомегаловируса; в) репортерный ген зеленого флуоресцентного белка или р-галактозидазы.2. Получение и оптимизация работы репортерных кассет в ретровирусной и лентивирусной системах доставки репортера. Проверка адекватности количественной оценки активностей белков р53 и HIF-1 по экспрессии репортерного белка в различных клеточных системах.3. Анализ уровня экспрессии и локализации белка р53 в ряде опухолевых клеточных линий, большинство из которых характеризуется экспрессией гена р53 дикого типа.4. Проверка гипотезы о заякоривании белка р53 в цитолазме ряда меланомных клеточных линий.5. Изучение влияния различных стрессовых воздействий, главным образом обработок повреждающими ДНК агентами, на транскрипционную функцию белка р53 в меланомных клеточных линиях с различным статусом гена р53 по сравнению с нормальными меланоцитами. I.l Онкогены и опухолевые супрессоры Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза связан с открытием сначала онкогенов и протоонкогенов, а затем - опухолевых супрессоров и мутаторных генов. Онкогены - это клеточные или вирусные (привнесенные вирусом в клетку) гены, экспрессия которых может привести к развитию опухолевого новообразования. Протоонкогены - это нормальные клеточные гены, усиление или модификация функции которых превращает их в онкогены. Опухолевые супрессоры (антионкогены, рецессивные опухолевые гены) - клеточные гены, инактивация которых резко увеличивает вероятность возникновения новообразований, а восстановление функции, наоборот, может подавить рост опухолевых клеток. Следует заметить, что причисляемые к опухолевым супрессорам так называемые «мутаторные» гены, т.е. гены, нарушение функции которых тем или иным способом увеличивает темп возникновения мутаций и/или других генетических изменений, могут и не влиять на рост неопластических клеток. Однако их инактивация столь сильно увеличивает вероятность появления различных онкогенных мутаций, что образование опухоли становится лишь делом времени.Принадлежность к онкогенам или опухолевым супрессорам определяется несколькими критериями: а) закономерным характером изменений структуры и/или экспрессии данного гена в клетках определенных или различных новообразований; б) возникновением в юном или молодом возрасте определенных форм опухолей у индивидов с передающимися по наследству мутациями данного гена; в) резким повышением частоты появления опухолей у трансгенных животньи, либо экспрессирующих активированную форму данного гена - в случае онкогенов, либо несущих инактивирующие мутации данного гена - в случае опухолевых супрессоров; г) способностью вызывать в культивируемых in vitro клетках морфологическую трансформацию и/или неограниченный рост (онкогены), либо подавление клеточного роста и/или выраженности признаков трансформации (опухолевые супрессоры).Два последних десятилетия характеризовались бурным открыгием новых онкогенов и опухолевых супрессоров. К настоящему времени известно около сотни потенциальных онкогенов (клеточных и вирусных) и около двух десятков опухолевых супрессоров. Были описаны генетические события, приводящие к активации протоонкогенов или инактивации опухолевых супрессоров [1-4]. Обнаружено, что механизм действия вирусных онкогенов связан с активацией клеточных протоонкогенов (ретровирусы) или инактивацией опухолевых супрессоров (ДНК-содержащие вирусы) [5, 6]. Выявлены характерные для тех или иных форм новообразований человека изменения онкогенов и опухолевых супрессоров, в том числе высокоспецифичные аномалии, используемые для постановки диагноза.Однако долгое время знания о каждом из онкогенов или опухолевых супрессоров представлялись дискретными, в значительной мере не связанными между собой. И лишь в самые последние годы стала вырисовываться общая картина, показывающая, что подавляющее большинство известных протоонкогенов и опухолевых супрессоров являются компонентами нескольких общих сигнальньк путей, контролирующих клеточный цикл, апоптоз, целостность генома, морфогенетические реакции и дифференцировку клеток. Очевидно, изменения именно в этих сигнальных путях, в конце концов, и приводят к развитию злокачественных новообразований.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Разорёнова, Ольга Валериевна

IV. ВЫВОДЫ

1. Получены три вирусные репортерные системы, позволяющие оценивать изменение транскрипционной активности белков р53, Н1Р-1 и Н8Р-1 в практически любых клеточных линиях в ответ на специфические «активирующие» или «инактивирующие» эти транскрипционные факторы воздействия.

2. Изменение экспрессии репортерного гена в репортерных клеточных линиях коррелирует с изменением экспрессии эндогенных генов-мишеней соответствующего транскрипционного фактора (р53 или НИМ), что позволяет проводить количественную оценку активности изучаемых транскрипционных факторов в динамике.

3. Опухолевые клеточные линии с диким типом гена р53 меланомного происхождения характеризуются ядерной локализацией белка р53 при высоком уровне его экспрессии и цитоплазматической - при низком уровне его экспрессии в клетке.

4. В цитоплазме на/в эндосомах ряда меланомных клеточных линий, включая нормальные меланоциты, экспрессируется белок с молекулярной массой около 250 кДа, имеющий БО-1 эпитоп. Экспрессия БО-1 эпитопа в этом белке (или самого белка) падает в ответ на обработку определенным для каждой клеточной линии химическим соединением.

5. В большинстве исследованных клеточных линий с диким типом гена р53, р53-зависимая транскрипция в ответ на обработку классическими р53-активирующими химическими соединениями не нарушена. Исключение составляют линии АСНЫ и Ме12, в которых активация р53-зависимой транскрипции подавлена. Набор химических соединений, активирующих р53-зависимую транскрипцию, является специфической характеристикой для каждой из проанализированных клеточных линий.

6. Для некоторых меланомных клеточных линий характерен сайленсинг индукции репортерного гена в р53-чувствительных конструкциях при пассировании клеток. Этот эффект можно преодолеть при транзиентном введении репортеров в клетки.

7. Камптотецин является стабилизатором и активатором белка р53 за счет снижения экспрессии его белка-ингибитора НБМ2 на уровне мРНК. Этот механизм действия камптотецина является специфичным для опухолевых клеток меланомного происхождения, поскольку экспрессия НИМ2 при обработке камптотецином повышается в нормальных меланоцитах.

V. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разоренова О.В., Агапова J1.C., Буданов А.В., Иванов А.В., Струнина С.М. и Чумаков П.М. Ретровируеные репортерные системы для оценки активности стрессовых сигнальных путей, контролируемых факторами транскрипции р53, HIF-1 И HSF-1. Молекулярная биология. 2005; 39(2): с. 286-293.

2. Razorenova О.У., Ivanov A.V., Budanov A.V. and Chumakov P.M. Virus-based reporter systems for monitoring transcriptional activity of hypoxia-inducible factor 1. Gene. 2005; 350(1): p. 89-98.

3. Разоренова О.В. Агапова J1.C. и Чумаков П.М. Экспрессия гена р53 и активация р53-зависимой транскрипции в линиях клеток меланом. Молекулярная биология. 2005; 39(3): с. 445-456.

4. Gurova К.V., Hill J.E., Razorenova O.V., Chumakov P.M., Gudkov A.V. p53 pathway in renal cell carcinoma is repressed by a dominant mechanism. Cancer Research. 2004; 64(6): p. 1951-1958.

5. Razorenova O.V. Ivanov A.V., Budanov A.V., Byzova T.V., Chumakov P.M. Development of readout system for monitoring HIF-1 transcriptional activity. IUBMB/ASBMB "A Molecular Exploration of the Cell". Boston, Massachusetts, June 12-16, 2004; Late Breaking Abstracts: p. 39.

6. Boiko A.D., Porteous S., Razorenova O.V., Krivokrysenko V.I., Chumakov P.M., Williams В., Gudkov A.V. Human candidate tumor suppressor genes identified by Ras cooperation assay. SKCC "Genomics, Signaling and Tumor Targeting". San Diego, California, March 1-5,2004; p. 51.

7. Boiko A.D., Porteous S., Razorenova O.V., Krivokrysenko V.I., Chumakov P.M., Williams В., Gudkov A.V. Human candidate tumor suppressor genes identified by Ras cooperation assay. CSHL "Cancer Genetics and Tumor Suppressor Genes". Cold Spring Harbor, New York, August 18-22, 2004; p. 35.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Разорёнова, Ольга Валериевна, 2005 год

1. Hooper M.L. 1998. Tumour suppressor gene mutations in humans and mice: parallels and contrasts. Embo J. 17, 6783-6789.

2. Hunter T. 1997. Oncoprotein networks. Cell. 88, 333-346.

3. Levine A.J. 1993. The tumor suppressor genes. Annu Rev Biochem. 62, 623-651.

4. Weinberg R.A. 1995. The molecular basis of oncogenes and tumor suppressor genes. Ann N YAcadSci. 758, 331-338.

5. Scarpa A., Tognon M. 1998. Molecular approach in human tumor investigation: oncogenes, tumor suppressor genes and DNA tumor polyomaviruses (review). Int J Mol Med. 1, 1011-1023.

6. Flint J., Shenk T. 1997. Viral transactivating proteins. Annu Rev Genet. 31, 177-212.

7. Donehower L.A., Harvey M., Slagle B.L., McArthur M.J., Montgomery C.A., Jr., Butel J.S., Bradley A. 1992. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours. Nature. 356,215-221.

8. Tsukada Т., Tomooka Y., Takai S., Ueda Y., Nishikawa S., Yagi Т., Tokunaga Т., Takeda N., Suda Y., Abe S., et al. 1993. Enhanced proliferative potential in culture of cells from p53-deficient mice. Oncogene. 8,3313-3322.

9. Levine A.J., Momand J., Finlay C.A. 1991. The p53 tumour suppressor gene. Nature. 351, 453-456.

10. Lane D.P. 1992. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358, 15-16.

11. El-Deiry W.S. 2003. The role of p53 in chemosensitivity and radiosensitivity. Oncogene. 22, 7486-7495.12. el-Deiry W.S. 1998. Regulation of p53 downstream genes. Semin Cancer Biol. 8, 345357.

12. Agarwal M.L., Taylor W.R., Chernov M.V., Chemova O.B., Stark G.R. 1998. The p53 network.JBiolChem. 273, 1-4.

13. Prives C. 1998. Signaling to p53: breaking the MDM2-p53 circuit. Cell. 95, 5-8.

14. Sherr C.J. 1998. Tumor surveillance via the ARF-p53 pathway. Genes Dev. 12, 29842991.

15. Ichihara A., Tanaka K. 1995. Roles of proteasomes in cell growth. Mol Biol Rep. 21, 4952.

16. Chowdary D.R., Dermody J.J., Jha K.K., Ozer H.L. 1994. Accumulation of p53 in a mutant cell line defective in the ubiquitin pathway. Mol Cell Biol. 14, 1997-2003.

17. Ginsberg D., Mechta F., Yaniv M., Oren M. 1991. Wild-type p53 can down-modulate the activity of various promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 88, 9979-9983.

18. Ewen M.E., Miller S.J. 1996. p53 and translational control. Biochim Biophys Acta. 1242, 181-184.

19. Mummenbrauer T., Janus F., Muller B., Wiesmuller L., Deppert W., Grosse F. 1996. p53 Protein exhibits 3'-to-5' exonuclease activity. Cell. 85, 1089-1099.

20. Jayaraman J., Prives C. 1995. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by short single strands of DNA requires the p53 C-terminus. Cell. 81, 1021-1029.

21. Bakalkin G., Yakovleva T., Selivanova G., Magnusson K.P., Szekely L., Kiseleva E., Klein G., Terenius L., Wiman K.G. 1994. p53 binds single-stranded DNA ends and catalyzes DNA renaturation and strand transfer. Proc Natl Acad Sci USA. 91,413-417.

22. Lee S., Elenbaas B., Levine A., Griffith J. 1995. p53 and its 14 kDa C-terminal domain recognize primary DNA damage in the form of insertion/deletion mismatches. Cell. 81, 1013-1020.

23. Reed M., Woelker B., Wang P., Wang Y., Anderson M.E., Tegtmeyer P. 1995. The C-terminal domain of p53 recognizes DNA damaged by ionizing radiation. Proc Natl Acad Sci US A. 92, 9455-9459.

24. Raycroft L., Wu H.Y., Lozano G. 1990. Transcriptional activation by wild-type but not transforming mutants ofthep53 anti-oncogene. Science. 249, 1049-1051.

25. Kern S.E., Kinzler K.W., Bruskin A., Jarosz D., Friedman P., Prives C., Vogelstein B. 1991. Identification of p53 as a sequence-specific DNA-binding protein. Science. 252, 1708-1711.

26. Wu X., Bayle J.H., Olson D., Levine A.J. 1993. The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop. Genes Dev. 7, 1126-1132.

27. Lozano G., Montes de Oca Luna R. 1998. MDM2 function. Biochim Biophys Acta. 1377, M55-59.

28. Meek D.W. 1999. Mechanisms of switching on p53: a role for covalent modification? Oncogene. 18,7666-7675.

29. Kussie P.H., Gorina S., Marechal V., Elenbaas B., Moreau J., Levine A.J., Pavletich N.P. 1996. Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor suppressor transactivation domain. Science. 21 A, 948-953.

30. Venot C., Maratrat M., Sierra V., Conseiller E., Debussche L. 1999. Definition of a p53 transactivation function-deficient mutant and characterization of two independent p53 transactivation subdomains. Oncogene. 18,2405-2410.

31. Walker K.K., Levine A.J. 1996. Identification of a novel p53 functional domain that is necessary for efficient growth suppression. Proc Natl Acad Sci U SA. 93, 15335-15340.

32. Sakamuro D., Sabbatini P., White E., Prendergast G.C. 1997. The polyproline region of p53 is required to activate apoptosis but not growth arrest. Oncogene. 15, 887-898.

33. Cho Y., Gorina S., Jeffrey P.D., Pavletich N.P. 1994. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265,346-355.

34. Milner J. 1994. Forms and functions of p53. Semin Cancer Biol. 5, 211-219.

35. Shaulsky G., Ben-Ze'ev A., Rotter V. 1990. Subcellular distribution of the p53 protein during the cell cycle of Balb/c 3T3 cells. Oncogene. 5, 1707-1711.

36. Sturzbecher H.W., Brain R., Addison C., Rudge K., Remm M., Grimaldi M., Keenan E., Jenkins J.R. 1992. A C-terminal alpha-helix plus basic region motif is the major structural determinant of p53 tetramerization. Oncogene. 7, 1513-1523.

37. Levine A.J. 1990. Tumor suppressor genes. Bioessays. 12, 60-66.

38. Fukasawa K., Choi T., Kuriyama R., Rulong S., Vande Woude G.F. 1996. Abnormal centrosome amplification in the absence of p53. Science. 271,1744-1747.

39. Dameron K.M., Volpert O.V., Tainsky M.A., Bouck N. 1994. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1. Science. 265, 1582-1584.

40. Komarova E.A., Diatchenko L., Rokhlin O.W., Hill J.E., Wang Z.J., Krivokrysenko V.I., Feinstein E., Gudkov A.V. 1998. Stress-induced secretion of growth inhibitors: a novel tumor suppressor function of p53. Oncogene. 17, 1089-1096.

41. Shaulian E., Haviv I., Shaul Y., Oren M. 1995. Transcriptional repression by the C-terminal domain of p53. Oncogene. 10, 671-680.

42. Liu X., Miller C.W., Koeffler P.H., Berk A.J. 1993. The p53 activation domain binds the TATA box-binding polypeptide in Holo-TFIID, and a neighboring p53 domain inhibits transcription. Mol Cell Biol. 13, 3291-3300.

43. Cairns C.A., White R.J. 1998. p53 is a general repressor of RNA polymerase III transcription. Embo J. 17,3112-3123.47. el-Deiry W.S. 1998. p21/p53, cellular growth control and genomic integrity. Curr Top Microbiol Immunol. 121, 121-137.

44. Waldman T., Kinzler K.W., Vogelstein B. 1995. p21 is necessary for the p53-mediated G1 arrest in human cancer cells. Cancer Res. 55, 5187-5190.

45. Brugarolas J., Chandrasekaran C., Gordon J.I., Beach D., Jacks T., Hannon G.J. 1995. Radiation-induced cell cycle arrest compromised by p21 deficiency. Nature. 377, 552557.

46. Waga S., Hannon G.J., Beach D., Stillman B. 1994. The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA. Nature. 369, 574-578.

47. Smith M.L., Chen I.T., Zhan Q., Bae I., Chen C.Y., Gilmer T.M., Kastan M.B., O'Connor P.M., Fornace A.J., Jr. 1994. Interaction of the p53-regulated protein Gadd45 with proliferating cell nuclear antigen. Science. 266, 1376-1380.

48. Zhan Q., Kontny U., Iglesias M., Alamo I., Jr., Yu K., Hollander M.C., Woodworth

49. C.D., Fornace A.J., Jr. 1999. Inhibitory effect of Bcl-2 on p53-mediated transactivation following genotoxic stress. Oncogene. 18,297-304.

50. Hermeking H., Lengauer C., Polyak К., He T.C., Zhang L., Thiagalingam S., Kinzler K.W., Vogelstein B. 1997. 14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression. Mol Cell. 1,3-11.

51. Miyashita Т., Reed J.C. 1995. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell. 80,293-299.

52. Oltvai Z.N., Korsmeyer S.J. 1994. Checkpoints of dueling dimers foil death wishes. Cell. 79, 189-192.

53. Srinivasula S.M., Ahmad M., Fernandes-Alnemri Т., Alnemri E.S. 1998. Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-1-mediated oligomerization. Mol Cell. 1, 949-957.

54. Wu G.S., Burns T.F., McDonald E.R., 3rd, Jiang W., Meng R., Krantz I.D., Kao G., Gan

55. D.D., Zhou J.Y., Muschel R., Hamilton S.R., Spinner N.B., Markowitz S., Wu G., el-Deiry W.S. 1997. KILLER/DR5 is a DNA damage-inducible p53-regulated death receptor gene. Nat Genet. 17, 141-143.

56. Ashkenazi A., Dixit V.M. 1998. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281,1305-1308.

57. Prisco M., Hongo A., Rizzo M.G., Sacchi A., Baserga R. 1997. The insulin-like growth factor I receptor as a physiologically relevant target of p53 in apoptosis caused by interleukin-3 withdrawal. Mol Cell Biol 17,1084-1092.

58. Yin Y., Terauchi Y., Solomon G.G., Aizawa S., Rangarajan P.N., Yazaki Y., Kadowaki T., Barrett J.C. 1998. Involvement of p85 in p53-dependent apoptotic response to oxidative stress. Nature. 391, 707-710.

59. Okamoto K., Beach D. 1994. Cyclin G is a transcriptional target of the p53 tumor suppressor protein. Embo J. 13,4816-4822.

60. Okamoto K., Prives C. 1999. A role of cyclin G in the process of apoptosis. Oncogene. 18,4606-4615.

61. Van Meir E.G., Polverini P.J., Chazin V.R., Su Huang H.J., de Tribolet N., Cavenee W.K. 1994. Release of an inhibitor of angiogenesis upon induction of wild type p53 expression in glioblastoma cells. Nat Genet. 8,171-176.

62. Janus F., Albrechtsen N., Knippschild U., Wiesmuller L., Grosse F., Deppert W. 1999. Different regulation of the p53 core domain activities 3'-to-5' exonuclease and sequence-specific DNA binding. Mol Cell Biol. 19, 2155-2168.

63. Janus F., Albrechtsen N., Dornreiter I., Wiesmuller L., Grosse F., Deppert W. 1999. The dual role model for p53 in maintaining genomic integrity. Cell Mol Life Sci. 55, 12-27.

64. Reisman D., Loging W.T. 1998. Transcriptional regulation of the p53 tumor suppressor gene. Semin Cancer Biol. 8,317-324.

65. Reisman D., Elkind N.B., Roy B., Beamon J., Rotter V. 1993. c-Myc trans-activates the p53 promoter through a required downstream CACGTG motif. Cell Growth Differ. 4, 57-65.

66. Sun X., Shimizu H., Yamamoto K. 1995. Identification of a novel p53 promoter element involved in genotoxic stress-inducible p53 gene expression. Mol Cell Biol. 15, 44894496.

67. Albrechtsen N., Dornreiter I., Grosse F., Kim E., Wiesmuller L., Deppert W. 1999. Maintenance of genomic integrity by p53: complementary roles for activated and non-activated p53. Oncogene. 18,7706-7717.

68. Maltzman W., Czyzyk L. 1984. UV irradiation stimulates levels of p53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells. Mol Cell Biol. 4,1689-1694.

69. Reich N.C., Oren M., Levine A.J. 1983. Two distinct mechanisms regulate the levels of a cellular tumor antigen, p53. Mol Cell Biol. 3,2143-2150.

70. Caelles C., Helmberg A., Karin M. 1994. p53-dependent apoptosis in the absence of transcriptional activation of p53-target genes. Nature. 370,220-223.

71. Mosner J., Mummenbrauer T., Bauer C., Sczakiel G., Grosse F., Deppert W. 1995. Negative feedback regulation of wild-type p53 biosynthesis. Embo J. 14,4442-4449.

72. Lu H., Levine A.J. 1995. Human TAFII31 protein is a transcriptional coactivator of the p53 protein. Proc Natl Acad Sci USA. 92, 5154-5158.

73. Thut C.J., Chen J.L., Klemm R., Tjian R. 1995. p53 transcriptional activation mediated by coactivators TAFII40 andTAFII60. Science. 267,100-104.

74. Truant R., Xiao H., Ingles C.J., Greenblatt J. 1993. Direct interaction between the transcriptional activation domain of human p53 and the TATA box-binding protein. J Biol Chem. 268,2284-2287.

75. Grunstein M. 1997. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389, 349-352.

76. Mizzen C.A., Allis C.D. 1998. Linking histone acetylation to transcriptional regulation. Cell Mol Life Sci. 54, 6-20.

77. Struhl K. 1998. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. Genes Dev. 12, 599-606.

78. Gu W., Shi X.L., Roeder R.G. 1997. Synergistic activation of transcription by CBP and p53. Nature. 387, 819-823.

79. Wadgaonkar R., Collins T. 1999. Murine double minute (MDM2) blocks p53-coactivator interaction, a new mechanism for inhibition of p53-dependent gene expression. J Biol Chem. 21 A, 13760-13767.

80. Janknecht R., Hunter T. 1996. Transcription. A growing coactivator network. Nature. 383, 22-23.

81. Sakaguchi K., Herrera J.E., Saito S., Miki T., Bustin M., Vassilev A., Anderson C.W., Appella E. 1998. DNA damage activates p53 through a phosphorylation-acetylation cascade. Genes Dev. 12, 2831-2841.

82. Gu W., Roeder R.G. 1997. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell. 90, 595-606.

83. Liu L., Scolnick D.M., Trievel R.C., Zhang H.B., Marmorstein R., Halazonetis T.D., Berger S.L. 1999. p53 sites acetylated in vitro by PCAF and p300 are acetylated in vivo in response to DNA damage. Mol Cell Biol. 19, 1202-1209.

84. Chen C.Y., Oliner J.D., Zhan Q., Fornace A.J., Jr., Vogelstein B., Kastan M.B. 1994. Interactions between p53 and MDM2 in a mammalian cell cycle checkpoint pathway. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 2684-2688.

85. Kubbutat M.H., Jones S.N., Vousden K.H. 1997. Regulation of p53 stability by Mdm2. Nature. 387,299-303.

86. Blaydes J.P., Gire V., Rowson J.M., Wynford-Thomas D. 1997. Tolerance of high levels of wild-type p53 in transformed epithelial cells dependent on auto-regulation by mdm-2. Oncogene. 14,1859-1868.

87. Bottger A., Bottger V., Sparks A., Liu W.L., Howard S.F., Lane D.P. 1997. Design of a synthetic Mdm2-binding mini protein that activates the p53 response in vivo. Curr Biol. 7, 860-869.

88. Shieh S.Y., Ikeda M., Taya Y., Prives C. 1997. DNA damage-induced phosphorylation ofp53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91, 325-334.

89. Siliciano J.D., Canman C.E., Taya Y., Sakaguchi K., Appella E., Kastan M.B. 1997. DNA damage induces phosphorylation of the amino terminus of p53. Genes Dev. 11, 3471-3481.

90. Fiscella M., Zambrano N., Ullrich S.J., Unger T., Lin D., Cho B., Mercer W.E., Anderson C.W., Appella E. 1994. The carboxy-terminal serine 392 phosphorylation site of human p53 is not required for wild-type activities. Oncogene. 9, 3249-3257.

91. Woo R.A., McLure K.G., Lees-Miller S.P., Rancourt D.E., Lee P.W. 1998. DNA-dependent protein kinase acts upstream of p53 in response to DNA damage. Nature. 394, 700-704.

92. Mayo L.D., Turchi J.J., Berberich S.J. 1997. Mdm-2 phosphorylation by DNA-dependent protein kinase prevents interaction with p53. Cancer Res. 57, 5013-5016.

93. Canman C.E., Lim D.S., Cimprich K.A., Taya Y., Tamai K., Sakaguchi K., Appella E., Kastan M.B., Siliciano J.D. 1998. Activation of the ATM kinase by ionizing radiation and phosphorylation of p53. Science. 281, 1677-1679.

94. Lavin M.F., Shiloh Y. 1997. The genetic defect in ataxia-telangiectasia. Annu Rev Immunol. 15,177-202.

95. Kastan M.B., Zhan Q., el-Deiry W.S., Carrier F., Jacks T., Walsh W.V., Plunkett B.S., Vogelstein B., Fornace A.J., Jr. 1992. A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia. Cell. 71, 587-597.

96. Khanna K.K., Lavin M.F. 1993. Ionizing radiation and UV induction of p53 protein by different pathways in ataxia-telangiectasia cells. Oncogene. 8, 3307-3312.

97. Xu Y., Baltimore D. 1996. Dual roles of ATM in the cellular response to radiation and in cell growth control. Genes Dev. 10, 2401-2410.

98. Cliby W.A., Roberts C.J., Cimprich K.A., Stringer C.M., Lamb J.R., Schreiber S.L., Friend S.H. 1998. Overexpression of a kinase-inactive ATR protein causes sensitivity to DNA-damaging agents and defects in cell cycle checkpoints. Embo J. 17, 159-169.

99. Lakin N.D., Jackson S.P. 1999. Regulation of p53 in response to DNA damage. Oncogene. 18,7644-7655.

100. Lu H., Taya Y., Ikeda M., Levine A.J. 1998. Ultraviolet radiation, but not gamma radiation or etoposide-induced DNA damage, results in the phosphorylation of the murine p53 protein at serine-389. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 6399-6402.

101. Meek D.W. 1998. Multisite phosphorylation and the integration of stress signals at p53. Cell Signal. 10, 159-166.

102. Wang Y., Prives C. 1995. Increased and altered DNA binding of human p53 by S and G2/M but not Gl cyclin-dependent kinases. Nature. 376, 88-91.

103. Ashcroft M., Kubbutat M.H., Vousden K.H. 1999. Regulation of p53 function and stability by phosphorylation. Mol Cell Biol. 19, 1751 -1758.

104. Waterman M.J., Stavridi E.S., Waterman J.L., Halazonetis T.D. 1998. ATM-dependent activation of p53 involves dephosphorylation and association with 14-3-3 proteins. Nat Genet. 19,175-178.

105. Hupp T.R., Lane D.P. 1994. Allosteric activation of latent p53 tetramers. Curr Biol. 4, 865-875.

106. Chernov M.V., Ramana C.V., Adler V.V., Stark G.R. 1998. Stabilization and activation of p53 are regulated independently by different phosphorylation events. Proc Natl Acad Sei US A. 95,2284-2289.

107. Lambert P.F., Kashanchi F., Radonovich M.F., Shiekhattar R., Brady J.N. 1998. Phosphorylation of p53 serine 15 increases interaction with CBP. J Biol Chem. 273, 33048-33053.

108. Goga A., Liu X., Hambuch T.M., Senechal K., Major E., Berk A.J., Witte O.N., Sawyers C.L. 1995. p53 dependent growth suppression by the c-Abl nuclear tyrosine kinase. Oncogene. 11,791-799.

109. Sionov R.V., Moallem E., Berger M., Kazaz A., Gerlitz O., Ben-Neriah Y., Oren M., Haupt Y. 1999. c-Abl neutralizes the inhibitory effect of Mdm2 on p53. J Biol Chem. 274, 8371-8374.

110. Yuan Z.M., Huang Y., Whang Y., Sawyers C., Weichselbaum R., Kharbanda S., Kufe D. 1996. Role for c-Abl tyrosine kinase in growth arrest response to DNA damage. Nature. 382, 272-274.

111. Kamijo T., Zindy F., Roussel M.F., Quelle D.E., Downing J.R., Ashmun R.A., Grosveld G., Sherr C.J. 1997. Tumor suppression at the mouse INK4a locus mediated by the alternative reading frame product pi9ARF. Cell. 91, 649-659.

112. Kamijo T., Weber J.D., Zambetti G., Zindy F., Roussel M.F., Sherr C.J. 1998. Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2. Proc Natl AcadSci USA. 95, 8292-8297.

113. Kamijo T., Bodner S., van de Kamp E., Randle D.H., Sherr C.J. 1999. Tumor spectrum in ARF-deficient mice. Cancer Res. 59,2217-2222.

114. Leveillard T., Wasylyk B. 1997. The MDM2 C-terminal region binds to TAFII250 and is required for MDM2 regulation of the cyclin A promoter. J Biol Chem. Ill, 3065130661.

115. Zhang Y., Xiong Y. 1999. Mutations in human ARF exon 2 disrupt its nucleolar localization and impair its ability to block nuclear export of MDM2 and p53. Mol Cell. 3, 579-591.

116. Zindy F., Eischen C.M., Randle D.H., Kamijo T., Cleveland J.L., Sherr C.J., Roussel M.F. 1998. Myc signaling via the ARF tumor suppressor regulates p53-dependent apoptosis and immortalization. Genes Dev. 12,2424-2433.

117. Serrano M., Lin A.W., McCurrach M.E., Beach D., Lowe S.W. 1997. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a. Cell. 88, 593-602.

118. Palmero I., Pantoja C., Serrano M. 1998. pl9ARF links the tumour suppressor p53 to Ras. Nature. 395, 125-126.

119. Calabro V., Parisi T., Di Cristofano A., La Mantia G. 1999. Suppression of Ras-mediated NIH3T3 transformation by pl9ARF does not involve alterations of cell growth properties. Oncogene. 18, 2157-2162.

120. Ruas M., Peters G. 1998. The pl6INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives. Biochim BiophysActa. 1378, F115-177.

121. Graeber T.G., Osmanian C., Jacks T., Housman D.E., Koch C.J., Lowe S.W., Giaccia A.J. 1996. Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumours. Nature. 379, 88-91.

122. Valenzuela M.T., Nunez M.I., Villalobos M., Siles E., McMillan T.J., Pedraza V., Ruiz de Almodovar J.M. 1997. A comparison of p53 and pl6 expression in human tumor cells treated with hyperthermia or ionizing radiation. Int J Cancer. 72, 307-312.

123. Tishler R.B., Lamppu D.M., Park S., Price B.D. 1995. Microtubule-active drugs taxol, vinblastine, and nocodazole increase the levels of transcriptionally active p53. Cancer Res. 55, 6021-6025.

124. Sablina A.A., Ilyinskaya G.V., Rubtsova S.N., Agapova L.S., Chumakov P.M., Kopnin B.P. 1998. Activation of p53-mediated cell cycle checkpoint in response to micronuclei formation. J Cell Sci. Ill ( Pt 7), 977-984.

125. Nikiforov M.A., Hagen K., Ossovskaya V.S., Connor T.M., Lowe S.W., Deichman G.I., Gudkov A.V. 1996. p53 modulation of anchorage independent growth and experimental metastasis. Oncogene. 13, 1709-1719.

126. An W.G., Kanekal M., Simon M.C., Maltepe E., Blagosklonny M.V., Neckers L.M. 1998. Stabilization of wild-type p53 by hypoxia-inducible factor 1 alpha. Nature. 392, 405-408.

127. Semenza G.L., Wang G.L. 1992. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol Cell Biol. 12, 5447-5454.

128. Wang G.L., Semenza G.L. 1995. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1 .J Biol Chem. 270, 1230-1237.

129. Wang G.L., Jiang B.H., Rue E.A., Semenza G.L. 1995. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular 02 tension. Proc Natl Acad Sci USA. 92, 5510-5514.

130. Forsythe J.A., Jiang B.H., Iyer N.V., Agani F., Leung S.W., Koos R.D., Semenza G.L. 1996. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Mol Cell Biol. 16,4604-4613.

131. Camenisch G., Stroka D.M., Gassmann M., Wenger R.H. 2001. Attenuation of HIF-1 DNA-binding activity limits hypoxia-inducible endothelin-1 expression. Pflugers Arch. 443,240-249.

132. Feldser D., Agani F., Iyer N.V., Pak B., Ferreira G., Semenza G.L. 1999. Reciprocal positive regulation of hypoxia-inducible factor lalpha and insulin-like growth factor 2. Cancer Res. 59, 3915-3918.

133. Semenza G.L. 2003. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 3, 721-732.

134. Jiang B.H., Zheng J.Z., Leung S.W., Roe R., Semenza G.L. 1997. Transactivation and inhibitory domains of hypoxia-inducible factor 1 alpha. Modulation of transcriptional activity by oxygen tension. J Biol Chem. 272, 19253-19260.

135. Semenza G.L. 1999. Regulation of mammalian 02 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. AnnuRev Cell Dev Biol. 15, 551-578.

136. Semenza G.L. 2001. HIF-1, 0(2), and the 3 PHDs: how animal cells signal hypoxia to the nucleus. Cell. 107,1-3.

137. Kaelin W.G., Jr. 2002. How oxygen makes its presence felt. Genes Dev. 16, 1441-1445.

138. Ivan M., Kondo K., Yang H., Kim W., Valiando J., Ohh M., Salic A., Asara J.M., Lane W.S., Kaelin W.G., Jr. 2001. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for 02 sensing. Science. 292, 464-468.

139. Gu J., Milligan J., Huang L.E. 2001. Molecular mechanism of hypoxia-inducible factor lalpha -p300 interaction. A leucine-rich interface regulated by a single cysteine. J Biol Chem. 276, 3550-3554.

140. Kung A.L., Wang S., Klco J.M., Kaelin W.G., Livingston D.M. 2000. Suppression of tumor growth through disruption of hypoxia-inducible transcription. Nat Med. 6, 13351340.

141. Bruick R.K., McKnight S.L. 2002. Transcription. Oxygen sensing gets a second wind. Science. 295,807-808.

142. Lando D., Peet D.J., Gorman J.J., Whelan D.A., Whitelaw M.L., Bruick R.K. 2002. FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the transcriptional activity of hypoxia-inducible factor. Genes Dev. 16, 1466-1471.

143. McNeill L.A., Hewitson K.S., Claridge T.D., Seibel J.F., Horsfall L.E., Schofield C.J. 2002. Hypoxia-inducible factor asparaginyl hydroxylase (FIH-1) catalyses hydroxylation at the beta-carbon of asparagine-803. Biochem J. 367, 571-575.

144. Mahon P.C., Hirota K., Semenza G.L. 2001. FIH-1: a novel protein that interacts with HIF-1 alpha and VHL to mediate repression of HIF-1 transcriptional activity. Genes Dev. 15,2675-2686.

145. Ryan H.E., Lo J., Johnson R.S. 1998. HIF-1 alpha is required for solid tumor formation and embryonic vascularization. Embo J. 17,3005-3015.

146. Krishnamachary B., Berg-Dixon S., Kelly B., Agani F., Feldser D., Ferreira G., Iyer N., LaRusch J., Pak B., Taghavi P., Semenza G.L. 2003. Regulation of colon carcinoma cell invasion by hypoxia-inducible factor 1. Cancer Res. 63, 1138-1143.

147. Tian H., McKnight S.L., Russell D.W. 1997. Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a transcription factor selectively expressed in endothelial cells. Genes Dev. 11, 72-82.

148. Brusselmans K., Bono F., Maxwell P., Dor Y., Dewerchin M., Collen D., Herbert J.M., Carmeliet P. 2001. Hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is involved in the apoptotic response to hypoglycemia but not to hypoxia. J Biol Chem. 276,39192-39196.

149. Makino Y., Kanopka A., Wilson W.J., Tanaka H., Poellinger L. 2002. Inhibitory PAS domain protein (IPAS) is a hypoxia-inducible splicing variant of the hypoxia-inducible factor-3 alpha locus. J Biol Chem. 211,32405-32408.

150. Jewell U.R., Kvietikova I., Scheid A., Bauer C., Wenger R.H., Gassmann M. 2001. Induction of HIF-1 alpha in response to hypoxia is instantaneous. Faseb J. 15, 13121314.

151. Wenger R.H., Camenisch G., Desbaillets I., Chilov D., Gassmann M. 1998. Up-regulation of hypoxia-inducible factor-1 alpha is not sufficient for hypoxic/anoxic p53 induction. Cancer Res. 58, 5678-5680.

152. Hammond E.M., Denko N.C., Dorie M.J., Abraham R.T., Giaccia A.J. 2002. Hypoxia links ATR and p53 through replication arrest. Mol Cell Biol. 22, 1834-1843.

153. Ashcroft M., Taya Y., Vousden K.H. 2000. Stress signals utilize multiple pathways to stabilize p53. Mol Cell Biol. 20,3224-3233.

154. Piret J.P., Mottet D„ Raes M., Michiels C. 2002. Is HIF-lalpha a pro- or an anti-apoptotic protein? Biochem Pharmacol. 64, 889-892.

155. Denko N.C., Green S.L., Edwards D., Giaccia A.J. 2000. p53 checkpoint-defective cells are sensitive to X rays, but not hypoxia. Exp Cell Res. 258, 82-91.

156. Halterman M.W., Federoff H.J. 1999. HIF-lalpha and p53 promote hypoxia-induced delayed neuronal death in models of CNS ischemia. Exp Neurol. 159, 65-72.

157. Crumrine R.C., Thomas A.L., Morgan P.F. 1994. Attenuation of p53 expression protects against focal ischemic damage in transgenic mice. J Cereb Blood Flow Metab. 14, 887891.

158. Sansome C., Zaika A., Marchenko N.D., Moll U.M. 2001. Hypoxia death stimulus induces translocation of p53 protein to mitochondria. Detection by immunofluorescence on whole cells. FEBSLett. 488, 110-115.

159. Blagosklonny M.V., An W.G., Romanova L.Y., Trepel J., Fojo T., Neckers L. 1998. p53 inhibits hypoxia-inducible factor-stimulated transcription. J Biol Chem. 273, 1199511998.

160. Arany Z., Huang L.E., Eckner R., Bhattacharya S., Jiang C., Goldberg M.A., Bunn H.F., Livingston D.M. 1996. An essential role for p300/CBP in the cellular response to hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 12969-12973.

161. Avantaggiati M.L., Ogryzko V., Gardner K., Giordano A., Levine A.S., Kelly K. 1997. Recruitment of p300/CBP in p53-dependent signal pathways. Cell. 89,1175-1184.

162. Ravi R., Mookeijee B., Bhujwalla Z.M., Sutter C.H., Artemov D., Zeng Q., Dillehay L.E., Madan A., Semenza G.L., Bedi A. 2000. Regulation of tumor angiogenesis by p53-induced degradation of hypoxia-inducible factor lalpha. Genes Dev. 14, 34-44.

163. Maxwell P.H., Pugh C.W., Ratcliffe P.J. 2001. Activation of the HIF pathway in cancer. Curr Opin Genet Dev. 11, 293-299.

164. Zhong H., De Marzo A.M., Laughner E., Lim M., Hilton D.A., Zagzag D., Buechler P., Isaacs W.B., Semenza G.L., Simons J.W. 1999. Overexpression of hypoxia-inducible factor 1 alpha in common human cancers and their metastases. Cancer Res. 59, 58305835.

165. Fatyol K., Szalay A.A. 2001. The pl4ARF tumor suppressor protein facilitates nucleolar sequestration of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1 alpha ) and inhibits HIF-1-mediated transcription. J Biol Chem. 276, 28421-28429.

166. Margulis B.A., Guzhova I.V. 2000. Stress proteins in eukaryotic cells. Tsitologiia. 42, 323-342.

167. Morimoto R.I., Sarge K.D., Abravaya K. 1992. Transcriptional regulation of heat shock genes. A paradigm for inducible genomic responses. J Biol Chem. 267,21987-21990.

168. Wadhwa R., Kaul S.C., Mitsui Y. 1994. Cellular mortality to immortalization: mortalin. Cell Struct Funct. 19, 1-10.

169. Margulis B.A., Zhivotovski B.D., Pospelova T.V., Smagina L.V. 1991. Patterns of protein synthesis in various cells after extreme heat shock. Exp Cell Res. 193,219-222.

170. Bush K.T., Goldberg A.L., Nigam S.K. 1997. Proteasome inhibition leads to a heat-shock response, induction of endoplasmic reticulum chaperones, and thermotolerance. J Biol Chem. 272, 9086-9092.

171. Sorger P.K. 1991. Heat shock factor and the heat shock response. Cell. 65,363-366.

172. Morimoto R.I., Kline M.P., Bimston D.N., Cotto J.J. 1997. The heat-shock response: regulation and function of heat-shock proteins and molecular chaperones. Essays Biochem. 32,17-29.

173. Mathew A., Mathur S.K., Morimoto R.I. 1998. Heat shock response and protein degradation: regulation of HSF2 by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol Cell Biol. 18,5091-5098.

174. Wu C. 1995. Heat shock transcription factors: structure and regulation. Annu Rev Cell Dev Biol. 11,441-469.

175. Nakai A., Kawazoe Y., Tanabe M., Nagata K., Morimoto R.I. 1995. The DNA-binding properties of two heat shock factors, HSF1 and HSF3, are induced in the avian erythroblast cell line HD6. Mol Cell Biol. 15, 5268-5278.

176. Nakai A., Tanabe M., Kawazoe Y., Inazawa J., Morimoto R.I., Nagata K. 1997. HSF4, a new member of the human heat shock factor family which lacks properties of a transcriptional activator. Mol Cell Biol. 17, 469-481.

177. Tanabe M., Kawazoe Y„ Takeda S., Morimoto R.I., Nagata K., Nakai A. 1998. Disruption of the HSF3 gene results in the severe reduction of heat shock gene expression and loss of thermotolerance. Embo J. 17, 1750-1758.

178. Sarto C., Binz P.A., Mocarelli P. 2000. Heat shock proteins in human cancer. Electrophoresis. 21, 1218-1226.

179. Jolly C., Morimoto R.I. 2000. Role of the heat shock response and molecular chaperones in oncogenesis and cell death. J Natl Cancer Inst. 92, 1564-1572.

180. Kastan M.B., Onyekwere O., Sidransky D., Vogelstein B., Craig R.W. 1991. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res. 51, 6304-6311.

181. Fritsche M., Haessler C., Brandner G. 1993. Induction of nuclear accumulation of the tumor-suppressor protein p53 by DNA-damaging agents. Oncogene. 8, 307-318.

182. Scheffner M., Huibregtse J.M., Vierstra R.D., Howley P.M. 1993. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75,495-505.

183. Soussi T. 1996. The p53 tumour suppressor gene: a model for molecular epidemiology of human cancer. Mol Med Today. 2, 32-37.

184. Zambetti G.P., Levine A.J. 1993. A comparison of the biological activities of wild-type and mutant p53. Faseb J. 7, 855-865.

185. Landers J.E., Cassel S.L., George D.L. 1997. Translational enhancement of mdm2 oncogene expression in human tumor cells containing a stabilized wild-type p53 protein. Cancer Res. 57, 3562-3568.

186. Cordon-Cardo C., Latres E., Drobnjak M., Oliva M.R., Pollack D., Woodruff J.M., Marechal V., Chen J., Brennan M.F., Levine A.J. 1994. Molecular abnormalities of mdm2 and p53 genes in adult soft tissue sarcomas. Cancer Res. 54, 794-799.

187. Gannon J.V., Greaves R., Iggo R., Lane D.P. 1990. Activating mutations in p53 produce a common conformational effect. A monoclonal antibody specific for the mutant form. EmboJ. 9, 1595-1602.

188. Milner J., Watson J.V. 1990. Addition of fresh medium induces cell cycle and conformation changes in p53, a tumour suppressor protein. Oncogene. 5,1683-1690.

189. Zhang W., Hu G., Estey E., Hester J., Deisseroth A. 1992. Altered conformation of the p53 protein in myeloid leukemia cells and mitogen-stimulated normal blood cells. Oncogene. 7,1645-1647.

190. Ryan J J., Clarke M.F. 1994. Alteration of p53 conformation and induction of apoptosis in a murine erythroleukemia cell line by dimethylsulfoxide. LeukRes. 18, 617-621.

191. Blagosklonny M.V., Toretsky J., Neckers L. 1995. Geldanamycin selectively destabilizes and conformationally alters mutated p53. Oncogene. 11, 933-939.

192. Whitesell L., Sutphin P.D., Pulcini E.J., Martinez J.D., Cook P.H. 1998. The physical association of multiple molecular chaperone proteins with mutant p53 is altered by geldanamycin, an hsp90-binding agent. Mol Cell Biol. 18, 1517-1524.

193. Coux O., Tanaka K., Goldberg A.L. 1996. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu Rev Biochem. 65, 801-847.

194. Pagano M. 1997. Cell cycle regulation by the ubiquitin pathway. Faseb J. 11, 10671075.

195. Prodromou C., Roe S.M., O'Brien R., Ladbury J.E., Piper P.W., Pearl L.H. 1997. Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone. Cell. 90, 65-75.

196. Stebbins C.E., Russo A.A., Schneider C., Rosen N. Hartl F.U., Pavletich N.P. 1997. Crystal structure of an Hsp90-geldanamycin complex: targeting of a protein chaperone by an antitumor agent. Cell. 89,239-250.

197. Wiech H., Buchner J., Zimmermann R., Jakob U. 1992. Hsp90 chaperones protein folding in vitro. Nature. 358, 169-170.

198. Miyata Y., Yahara I. 1992. The 90-kDa heat shock protein, HSP90, binds and protects casein kinase II from self-aggregation and enhances its kinase activity. J Biol Chem. 267, 7042-7047.

199. Blagosklonny M.V., Toretsky J., Bohen S., Neckers L. 1996. Mutant conformation of p53 translated in vitro or in vivo requires functional HSP90. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8379-8383.

200. Pinhasi-Kimhi O., Michalovitz D., Ben-Zeev A., Oren M. 1986. Specific interaction between the p53 cellular tumour antigen and major heat shock proteins. Nature. 320, 182-184.

201. Hinds P.W., Finlay C.A., Frey A.B., Levine A.J. 1987. Immunological evidence for the association of p53 with a heat shock protein, hsc70, in p53-plus-ras-transformed cell lines. Mol Cell Biol. 7,2863-2869.

202. Finlay C.A., Hinds P.W., Tan T.H., Eliyahu D., Oren M., Levine A.J. 1988. Activating mutations for transformation by p53 produce a gene product that forms an hsc70-p53 complex with an altered half-life. Mol Cell Biol. 8, 531-539.

203. Sturzbecher H.W., Chumakov P., Welch W.J., Jenkins J.R. 1987. Mutant p53 proteins bind hsp 72/73 cellular heat shock-related proteins in SV40-transformed monkey cells. Oncogene. 1,201-211.

204. Sturzbecher H.W., Addison C., Jenkins J.R. 1988. Characterization of mutant p53-hsp72/73 protein-protein complexes by transient expression in monkey COS cells. Mol Cell Biol. 8,3740-3747.

205. Hainaut P., Milner J. 1992. Interaction of heat-shock protein 70 with p53 translated in vitro: evidence for interaction with dimeric p53 and for a role in the regulation of p53 conformation. Embo J. 11,3513-3520.

206. Chernov M.V., Stark G.R. 1997. The p53 activation and apoptosis induced by DNA damage are reversibly inhibited by salicylate. Oncogene. 14,2503-2510.

207. Wadhwa R., Kaul S.C., Sugimoto Y., Mitsui Y. 1993. Induction of cellular senescence by transfection of cytosolic mortalin cDNA in NIH 3T3 cells. J Biol Chem. 268, 2223922242.

208. Wadhwa R., Kaul S.C., Mitsui Y., Sugimoto Y. 1993. Differential subcellular distribution of mortalin in mortal and immortal mouse and human fibroblasts. Exp Cell Res. 207,442-448.

209. Wadhwa R., Kaul S.C., Ikawa Y., Sugimoto Y. 1993. Identification of a novel member of mouse hsp70 family. Its association with cellular mortal phenotype. J Biol Chem. 268, 6615-6621.

210. Wadhwa R., Akiyama S., Sugihara T., Reddel R.R., Mitsui Y., Kaul S.C. 1996. Genetic differences between the pancytosolic and perinuclear forms of murine mortalin. Exp Cell Res. 226, 381-386.

211. Wadhwa R., Takano S., Robert M., Yoshida A., Nomura H., Reddel R.R., Mitsui Y., Kaul S.C. 1998. Inactivation of tumor suppressor p53 by mot-2, a hsp70 family member. J Biol Chem. 273, 29586-29591.

212. Kaul S.C., Duncan E.L., Englezou A., Takano S., Reddel R.R., Mitsui Y., Wadhwa R. 1998. Malignant transformation of NIH3T3 cells by overexpression of mot-2 protein. Oncogene. 17, 907-911.

213. Kaul S.C., Takano S., Reddel R.R., Mitsui Y., Wadhwa R. 2000. Transcriptional inactivation of p53 by deletions and single amino acid changes in mouse mot-1 protein. Biochem Biophys Res Commun. 279, 602-606.

214. Kaul S.C., Duncan E., Sugihara T., Reddel R.R., Mitsui Y., Wadhwa R. 2000. Structurally and functionally distinct mouse hsp70 family members Mot-1 and Mot-2 proteins are encoded by two alleles. DNA Res. 7,229-231.

215. Alam J., Cook J.L. 1990. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal Biochem. 188,245-254.

216. Wood K.V. 1995. Marker proteins for gene expression. Curr Opin Biotechnol. 6, 50-58.

217. Karin M. 1994. Signal transduction from the cell surface to the nucleus through the phosphorylation of transcription factors. Curr Opin Cell Biol. 6,415-424.

218. Misteli T., Spector D.L. 1997. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nat Biotechnol. 15, 961-964.

219. Broach J.R., Thorner J. 1996. High-throughput screening for drug discovery. Nature. 384, 14-16.

220. Welsh S., Kay S.A. 1997. Reporter gene expression for monitoring gene transfer. Curr Opin Biotechnol. 8,617-622.

221. Thompson J.F., Geoghegan K.F., Lloyd D.B., Lanzetti A.J., Magyar R.A., Anderson S.M., Branchini B.R. 1997. Mutation of a protease-sensitive region in firefly luciferase alters light emission properties. J Biol Chem. 272, 18766-18771.

222. Siemering K.R., Golbik R., Sever R., Haseloff J. 1996. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Curr Biol. 6,1653-1663.

223. Heim R., Tsien R.Y. 1996. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol. 6, 178-182.

224. Crameri A., Whitehorn E.A., Tate E., Stemmer W.P. 1996. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nat Biotechnol. 14, 315-319.

225. Naylor L.H. 1999. Reporter gene technology: the future looks bright. Biochem Pharmacol. 58, 749-757.

226. Tsien R.Y. 1998. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544.

227. Llopis J., McCaffery J.M., Miyawaki A., Farquhar M.G., Tsien R.Y. 1998. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 6803-6808.

228. Miesenböck G., De Angelis D.A., Rothman J.E. 1998. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394,192-195.

229. Levitzki A. 1996. Targeting signal transduction for disease therapy. Curr Opin Cell Biol. 8,239-244.

230. Schafer H., Schafer A., Kiderlen A.F., Masihi K.N., Burger R. 1997. A highly sensitive cytotoxicity assay based on the release of reporter enzymes, from stably transfected cell lines. J Immunol Methods. 204, 89-98.

231. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Strategies for cloning in plasmid vectors, in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, C. Nolan, Editor. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York. p. 1.53-51.73.

232. Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. 2002. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553.

233. Inoue H., Nojima H., Okayama H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28.

234. Chen J.Y., Funk W.D., Wright W.E., Shay J.W., Minna J.D. 1993. Heterogeneity of transcriptional activity of mutant p53 proteins and p53 DNA target sequences. Oncogene. 8,2159-2166.

235. Pietenpol J.A., Tokino T., Thiagalingam S., el-Deiry W.S., Kinzler K.W., Vogelstein B. 1994. Sequence-specific transcriptional activation is essential for growth suppression by p53. Proc Natl Acad Sei USA. 91, 1998-2002.

236. Park D.J., Chumakov A.M., Miller C.W., Pham E.Y., Koeffler H.P. 1996. p53 transactivation through various p53-responsive elements. Mol Carcinog. 16, 101-108.

237. Keller D.M., Zeng X., Wang Y., Zhang Q.H., Kapoor M., Shu H., Goodman R., Lozano G., Zhao Y., Lu H. 2001. A DNA damage-induced p53 serine 392 kinase complex contains CK2, hSptl6, and SSRP1. Mol Cell. 7,283-292.

238. Renzing J., Lane D.P. 1995. p53-dependent growth arrest following calcium phosphatemediated transfection of murine fibroblasts. Oncogene. 10,1865-1868.

239. Струнина C.M., Иванов A.B., Чумаков П.М. 2003. Разработка репортерной системы для тонкой количественной оценки активности белка р53 в культурах клеток. Молекулярная биология. 31,1007-1018.

240. Wang G.L., Semenza G.L. 1996. Oxygen sensing and response to hypoxia by mammalian cells. Redox Report. 2, 89-96.

241. Koshikawa N., Takenaga K., Tagawa M., Sakiyama S. 2000. Therapeutic efficacy of the suicide gene driven by the promoter of vascular endothelial growth factor gene against hypoxic tumor cells. Cancer Res. 60, 2936-2941.

242. Su H., Arakawa-Hoyt J., Kan Y.W. 2002. Adeno-associated viral vector-mediated hypoxia response element-regulated gene expression in mouse ischemic heart model. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 9480-9485.

243. Hanze J., Eul B.G., Savai R., Krick S., Goyal P., Grimminger F., Seeger W., Rose F. 2003. RNA interference for HIF-lalpha inhibits its downstream signalling and affects cellular proliferation. Biochem Biophys Res Commun. 312, 571-577.

244. Linden T., Katschinski D.M., Eckhardt K., Scheid A., Pagel H., Wenger R.H. 2003. The antimycotic ciclopirox olamine induces HIF-1 alpha stability, VEGF expression, and angiogenesis. Faseb J. 17, 761-763.

245. Shibata T., Giaccia A. J., Brown J.M. 2000. Development of a hypoxia-responsive vector for tumor-specific gene therapy. Gene Ther. 7,493-498.

246. Rapisarda A., Uranchimeg B., Scudiero D.A., Selby M., Sausville E.A., Shoemaker R.H., Melillo G. 2002. Identification of small molecule inhibitors of hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activation pathway. Cancer Res. 62,4316-4324.

247. Post D.E., Van Meir E.G. 2001. Generation of bidirectional hypoxia/HIF-responsive expression vectors to target gene expression to hypoxic cells. Gene Ther. 8,1801-1807.

248. Firth J.D., Ebert B.L., Pugh C.W., Ratcliffe P.J. 1994. Oxygen-regulated control elements in the phosphoglycerate kinase 1 and lactate dehydrogenase A genes: similarities with the erythropoietin 3' enhancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 64966500.

249. Dachs G.U., Patterson A.V., Firth J.D., Ratcliffe P.J., Townsend K.M., Stratford I.J., Harris A.L. 1997. Targeting gene expression to hypoxic tumor cells. Nat Med. 3, 515520.

250. Wadhwa R., Takano S., Mitsui Y., Kaul S.C. 1999. NIH 3T3 cells malignantly transformed by mot-2 show inactivation and cytoplasmic sequestration of the p53 protein. Cell Res. 9,261-269.

251. Wadhwa R., Taira K., Kaul S.C. 2002. An Hsp70 family chaperone, mortalin/mthsp70/PBP74/Grp75: what, when, and where? Cell Stress Chaperones. 7, 309-316.

252. Li G., Bush J.A., Ho V.C. 2000. p53-dependent apoptosis in melanoma cells after treatment with camptothecin. J Invest Dermatol 114, 514-519.

253. Koh H.K. 1991. Cutaneous melanoma. N Engl J Med. 325, 171-182.

254. Hartmann A., Blaszyk H., Cunningham J.S., McGovern R.M., Schroeder J.S., Helander S.D., Pittelkow M.R., Sommer S.S., Kovach J.S. 1996. Overexpression and mutations of p53 in metastatic malignant melanomas. Int J Cancer. 67, 313-317.

255. Cristofolini M., Boi S., Girlando S., Zumiani G., Cristofolini P., Dalla Palma P., Doglioni C., Barbareschi M. 1993. p53 Protein expression in nevi and melanomas. Arch Dermatol. 129, 739-743.

256. Sparrow L.E., Soong R., Dawkins H.J., Iacopetta B.J., Heenan P.J. 1995. p53 gene mutation and expression in naevi and melanomas. Melanoma Res. 5, 93-100.

257. Lowe S.W., Schmitt E.M., Smith S.W., Osborne B.A., Jacks T. 1993. p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature. 362, 847-849.

258. Tron V.A., Trotter M.J., Tang L., Krajewska M., Reed J.C., Ho V.C., Li G. 1998. p53-regulated apoptosis is differentiation dependent in ultraviolet B-irradiated mouse keratinocytes. Am J Pathol. 153, 579-585.

259. Lowe S.W., Ruley H.E., Jacks T., Housman D.E. 1993. p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents. Cell. 74,957-967.

260. Miyake H., Hara I., Gohji K., Yamanaka K., Arakawa S., Kamidono S. 1998. Enhancement of chemosensitivity in human bladder cancer cells by adenoviral-mediated p53 gene transfer. Anticancer Res. 18, 3087-3092.

261. Petty R., Evans A., Duncan I., Kurbacher C., Cree I. 1998. Drug resistance in ovarian cancer the role of p53. Pathol Oncol Res. 4,97-102.

262. Nitiss J.L. 2002. DNA topoisomerases in cancer chemotherapy: using enzymes to generate selective DNA damage. Curr Opin Investig Drugs. 3, 1512-1516.

263. Ellerhorst J.A., Bedikian A.Y., Smith T.M., Papadopoulos N.E., Plager C., Eton 0.2002. Phase II trial of 9-nitrocamptothecin (RFS 2000) for patients with metastatic cutaneous or uveal melanoma. Anticancer Drugs. 13, 169-172.

264. Rich T.A., Shepard R.C., Mosley S.T. 2004. Four decades of continuing innovation with i fluorouracil: current and future approaches to fluorouracil chemoradiation therapy. J Clinf Oncol. 22,2214-2232.

265. Seo Y.R., Fishel M.L., Amundson S., Kelley M.R., Smith M.L. 2002. Implication of p53 in base excision DNA repair: in vivo evidence. Oncogene. 21, 731-737.

266. Rothenberg M.L. 1997. Topoisomerase I inhibitors: review and update. Ann Oncol. 8,837.855.

267. Cheung K.J., Jr., Li G. 2002. The tumour suppressor p33INGl does not enhance camptothecin-induced cell death in melanoma cells. Int J Oncol. 20,1319-1322.

268. Wang F., Cao Y., Liu H.Y., Xu S.F., Han R. 2003. Anti-invasion and anti-angiogenesis » effect of taxol and camptothecin on melanoma cells. J Asian Nat Prod Res. 5, 121-129.1. O i>