Пермеабилизация бислойных липидных мембран, индуцированная пероксидазной активностью цитохрома с тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Фирсов Александр Михайлович

  • Фирсов Александр Михайлович
  • кандидат науккандидат наук
  • 2018, ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»
  • Специальность ВАК РФ03.01.02
  • Количество страниц 105
Фирсов Александр Михайлович. Пермеабилизация бислойных липидных мембран, индуцированная пероксидазной активностью цитохрома с: дис. кандидат наук: 03.01.02 - Биофизика. ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова». 2018. 105 с.

Оглавление диссертации кандидат наук Фирсов Александр Михайлович

2 Обзор литературы

2.1 Структура цитохрома с и его основные функции

2.2 Связывание цитохрома с с липидными мембранами

2.3 Особенности взаимодействия цитохрома с с кардиолипином мембран

2.4 Пермеабилизация мембран под действием цитохрома с

2.5 Взаимодействие пептидов с липидными мембранами: от поверхностного взаимодействия к формированию пор

3 Материалы и методы

3. 1 Используемые реактивы

3. 2 Используемые методы

3.2.1 Липосомы

3.2.1.1 Приготовление липосом, нагруженных красителем

3.2.1.2 Измерение вытекания красителя из липосом по разгоранию флуоресценции

3.2.2 Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (ФКС)

3.2.2.1 Устройство прибора для ФКС

3.2.2.2 Автокорреляционная функция

3.2.2.3 Оценка доли вышедшего из липосом флуорофора (параметр а)

3.2.2.4 Определение размера пор по вытеканию флуоресцирующих красителей

3.2.3 Измерение пероксидазной активности

3.2.3.1 Оценка уровня радикалов по люминесценции люминола

3.2.3.2 Измерение пероксидазной активности с помощью Amplex Red

3.2.4 Определение связывания цитохрома с

3.2.4.1 Калориметрический метод измерения связывания цитохрома с с липосомами

3.2.4.2 Измерение связывания цитохрома с с помощью центрифугирования липосом

3.2.4.3 Измерение связывания цитохрома с по тушению пирен-меченого липида

3.2.5 Измерение тока через плоскую БЛМ

4 Результаты и обсуждение

4.1 Пермеабилизация мембран, вызванная пероксидазной активностью цитохрома с

4.1.1 Вытекание кальцеина из липосом под действием цитохрома с и перекиси водорода

4.1.2 Вытекание карбоксифлуоресцеина из липосом под действием цитохрома с и перекиси водорода

4.1.3 Цитохром с как индуктор выцветания ксантеновых красителей

4.1.4 Измерение пермеабилизации липосом методом ФКС

4.1.5 Влияние липидного состава мембран на пермеабилизацию под действием цитохрома с

4.2 Связывание цитохрома с с мембранами липосом

4.2.1 Измерение связывания цитохрома с с липосомами по тушению флуоресценции пирен-меченого липида

4.2.2 Определение связывания цитохрома с с помощью осаждения липосом центрифугированием

4.2.3 Измерение связывания цитохрома с методом изотермической титрационной калориметрии

4.3 Пероксидазная активность цитохрома с

4.3.1 Измерение пероксидазной активности цитохрома с различными методами

4.4 Ингибирование пермеабилизации липосом, вызванной пероксидазной активностью цитохрома с

4.4.1 Действие антиоксидантов на пермеабилизацию мембран, индуцируемую цитохромом с в присутствии перекиси водорода

4.4.2 Действие цианида на пермеабилизацию мембран, индуцируемую цитохромом с в присутствии перекиси водорода

4.4.3 Сравнение вытекания красителя, индуцированного в системах цитохром с/перекись водорода и железо/аскорбат

4.4.4 Действие миноциклина на пермеабилизацию липосом, вызванную пероксидазной активностью цитохрома с

4.4.5 Подавление пермеабилизации липосом, вызванной пероксидазной активностью цитохрома с, митохондриально-направленными антиоксидантами

4.4.6 Влияние митохондриально-направленных антиоксидантов на связывание цитохрома с с липосомами

4.5 Оценка размера пор, образуемых в мембране в результате пероксидазной активности цитохрома с

4.6 Сравнение действия цитохрома с из сердца лошади и из дрожжей

4.7 Перераспределение цитохрома с между двумя популяциями липосом

4. 8 Обсуждение

5 Выводы

6 Список литературы

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биофизика», 03.01.02 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пермеабилизация бислойных липидных мембран, индуцированная пероксидазной активностью цитохрома с»

1 Введение

В конце ХХ века американским ученым китайского происхождения Xiaodong Wang с коллегами из Университета Эмори в Атланте было сделано неожиданное открытие: было обнаружено, что один из очень хорошо известных и изученных белков - цитохром с, играющий незаменимую роль в функционировании дыхательной цепи митохондрий, выполняет также ключевую функцию в процессе зависимого от митохондрий апоптоза. Цитохром с относится к классу цитохромов, содержащих в своей структуре гем типа с, ковалентно связанный с белком через остатки цистеина, которые входят в состав консервативной последовательности CXXCH (Рис. 1). Это небольшой белок с молекулярной массой 12 кДа, который находится на внешней стороне внутренней мембраны митохондрий.

Апоптоз - это форма запрограммированной гибели клеток, которая играет важную роль в эмбриогенезе животных, иммунном ответе, поддержании гомеостаза тканей. Апоптоз осуществляется внутриклеточными протеазами, названными каспазами, которые активируются при запуске апоптоза по внешнему и внутреннему сигнальным путям. Внутренний (митохондриальный) путь инициируется высвобождением белков, в частности, цитохрома с, из митохондрий в цитозоль, а внешний путь активируется связыванием вызывающих смерть цитокинов, таких как фактор некроза опухоли, с соответствующими рецепторами на поверхности клетки.

Уонгом и соавторами было установлено, что апоптоз, опосредуемый митохондриями, требует высвобождения цитохрома с в цитозоль [1] с помощью процесса, который может включать образование специфических пор или разрывов наружной мембраны [2]. После транслокации в цитозоль цитохром с может инициировать образование апоптосомы и последующую активацию каспаз, которые осуществляют запрограммированную гибель клеток [3].

Предполагается, что выходу цитохрома с из митохондрий способствует появление у него высокой пероксидазной активности в результате взаимодействия с отрицательно заряженными фосфолипидами, такими как кардиолипин и фосфатидилсерин. Считается, что перекисное окисление кардиолипина играет ключевую роль в процессе выхода цитохрома с из митохондрий в цитозоль [4-7].

Исследования проницаемости искусственных мембран могут иметь большое значение для выяснения молекулярного механизма реакций, протекающих в мембранах митохондрий при апоптозе. Действительно, еще в ранних работах на искусственных липидных мембранах - плоских липидных бислоях и липосомах - было установлено, что перекисное окисление липидов приводит к росту проницаемости мембран [8-12]. В недавних работах было показано, что сам по себе цитохром с без участия других белков способен формировать поры в липидной мембране как в отсутствие [13], так и в присутствии перекиси водорода [14, 15]. Оказалось, что важную роль в этом процессе играет наличие в плоских липидных бислойных мембран и мембранах гигантских липосом кардиолипина. Можно предположить, что наблюдаемое увеличение проводимости липидной мембраны под действием цитохрома с может являться одной из стадий высвобождения цитохрома с из митохондрий при апоптозе. При этом важным нерешенным вопросом является оценка размеров пор, образуемых цитохромом с в данных условиях и, соответственно, возможность их использования для выхода данного белка в цитозоль.

С точки зрения возможного применения для защиты клеток от патологий, связанных с окислительным стрессом, актуальной задачей является поиск специфических ингибиторов пермеабилизации мембран, вызванной пероксидазной активностью цитохрома с. Описанные к настоящему моменту ингибиторы пероксидазной активности цитохрома с можно отнести к следующим типам:

1) антиоксиданты - тушители свободных радикалов, такие как тролокс и ионол [16];

2) агенты, взаимодействующие с железом гема, препятствуя связыванию с ним перекиси водорода, такие как цианид [17-20], бифоназол [21] и конъюгаты имидазол-замещенных жирных кислот с трифенилфосфонием [22, 23];

3) агенты, восстанавливающие цитохром с, такие как кверцетин [24];

4) агенты, специфически связывающиеся с цитохромом с, вызывая его конформационные изменения, такие как АТФ [25] и миноциклин [26];

5) вещества, нарушающие связывание цитохромом с с кардиолипином, например хлорид натрия [27-29].

Настоящая работа направлена на детальное изучение образуемых цитохромом с пор в зависимости от липидного состава мембраны, насыщенности входящих в нее липидов, выявление ингибиторов порообразующей активности цитохрома с, а также определение размера таких пор. Наша работа проводилась с использованием модели униламеллярных липосом, которая обладает целым рядом преимуществ по сравнению с плоскими бислойными липидными мембранами или гигантскими липосомами. В частности, такая модель позволяет наиболее полно исследовать усредненные свойства проводимости ионных каналов и пор, а также сопоставить данные по индукции проводимости с данными по связыванию цитохрома с с мембраной и индукцией им пероксидазной активности.

В работе перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Выявить индукцию пермеабилизации мембран липосом под действием цитохрома с в присутствии перекиси водорода и установить условия ее осуществления.

2. Доказать связь пермеабилизации липосом с пероксидазной активностью цитохрома с.

3. Изучить механизмы ингибирования пермеабилизации липосом, вызванной пероксидазной активностью цитохрома с.

4. Определить размер пор, образующихся в липидных мембранах в результате пероксидазной активности цитохрома с.

2 Обзор литературы

2.1 Структура цитохрома с и его основные функции

Цитохром с относят к

классу цитохромов, которые содержат в своей структуре гем типа с, ковалентно связанный с белком через остатки цистеина Cys-14 и Cys-17 (Рис. 1). Это небольшой белок с

молекулярной массой 12 кДа. Находится цитохром с на внешней стороне внутренней

мембраны митохондрий, с

^ Рис. 1 Кристаллическая структура цитохрома

которой он связан. Он является

с [30]

хорошо водорастворимым

белком, предел растворимости составляет 100 г/л.

Молекула цитохрома с состоит из, приблизительно, ста аминокислот [31]. В частности, цитохром с из сердца лошади состоит из 104 аминокислот, цитохром с из дрожжей - из 108. Все цитохромы с содержат характерную последовательность аминокислотных остатков CXXCH (цистеин-любой-любой-цистеин-гистидин), которая связана с гемом [32]. Среди цитохромов с, по Р. Амблеру [33], выделяют четыре класса, представители которых отличаются друг от друга белковой частью, числом гемов, лигандами в пятом и шестом координационных положениях железа в геме и, следовательно, обладают сильно отличающимися свойствами:

• Класс I - Низкоспиновая форма растворимого цитохрома с митохондрий и бактерий, в которых гистидин, связанный с гемом, находится в N-концевой части молекулы белка, а лиганд в 6-ом

положении, метионин, расположен через 40 остатков по направлению к С-концу молекулы

• Класс II - Высокоспиновая форма цитохрома с и ряд низкоспиновых форм, которые имеют центры связывания гема в С-концевой области молекулы белка. Сам белок содержит четыре спиральных участка полипептидной цепи.

• Класс III - Включает мультигемовые цитохромы с с низким редокс-потенциалом и высокомолекулярный цитохром с, в котором на одну молекулу гема приходится 30-40 остатков. Гемы с, координированные двумя гистидинами, неэквивалентны структурно и функционально, характеризуются различными редокс-потенциалами от 0 до -400 мВ.

• Класс IV - Белки данного класса нужны для поддержания сложных белков, имеющих гем и другие простетические группы. Цитохромы данного класса содержат 4 гема, которые в 5-ом и 6-ом координационных положениях имеют или 2 гистидина, или гистидин и метионин. Примером такого белка является цитохром с фотосинтетического реакционного центра бактерий.

Аминокислотные остатки с 1 по 47 находятся на стороне остатка His18, называемой правой стороной цитохрома с, остатки 48-91 находятся на стороне остатка Met80, называемой левой стороной молекулы. Регулярными элементами вторичной структуры являются пять а-спиралей, два коротких 6-листа антипараллельной ориентации и шесть 6-изгибов [34, 35].

Гемы - это комплексные соединения порфиринов с двухвалентным железом, несущие один или два аксиальных лиганда, которые выступают в роли простетических групп (небелковых частей) белков-гемопротеинов. Гем типа с (Рис. 2) удерживается во впадине белка ковалентными связями, которые образуют винильные группы порфиринового кольца с сульфгидрильными группами остатков Cys14 и Cys17. Это отличает цитохромы типа с от цитохромов а- и Ь-типов, где гемы связаны нековалентно. Железо гема имеет координационные связи с остатками His18

и Met80, цепочки пропионовой кислоты гема образуют водородные связи с остатками Туг48, Ткг49, Asn52, Тгр59 апобелка [34, 35].

Единственный триптофановый остаток Тгр59 в молекуле цитохрома с из лошади в нативном белке сближен с гемом, что приводит к практически полному тушению собственной триптофановой флуоресценции [36].

Установлено, что пять молекул воды занимают консервативные позиции в структуре цитохрома с лошади, дрожжей, тунца и риса, причем три из них расположены на поверхности и участвуют в стабилизации структуры молекулы белка, а оставшиеся две - внутри. Одна из этих внутренних молекул воды обеспечивает взаимодействие инвариантного остатка А^38 с пропионатом гема, другая расположена вблизи атома железа гема и образует водородные связи с консервативными остатками Asn52, Туг67 и ТИг78, что говорит о важной роли этой молекулы воды в функционировании цитохрома с [35]. Переход цитохрома с из окисленного в

восстановленное состояние

сопровождается смещением группы гема на 0.15 А в сторону остатка His18, а также удалением второй внутренней молекулы воды от гема на 1 А [37].

Цитохром с имеет сайт связывания жирных кислот [38-40]. При этом связывание жирной кислоты вызывает изменения в спектрах ЯМР, КД, и магнитного КД этого белка, что свидетельствует о конформационных изменениях цитохрома с, включая нарушения S-Fe координации между Ме^ 80 и гемовым железом. Спектр ЭПР восстановленной формы цитохрома с показал, что его взаимодействие с липидом переводит железо гема из низкоспиновой формы в высокоспиновую [40].

Рис. 2 Структура гема типа с

Кратко рассмотрим известные на настоящий момент функции цитохрома с. 1. Цитохром с является компонентом дыхательной цепи митохондрий. Его роль заключается в переносе электронов между комплексом III (цитохром с-редуктаза) и комплексом IV (цитохром с-оксидаза) дыхательной цепи (Рис. 3). Комплекс III катализирует окисление восстановленного убихинона и восстановление цитохрома c согласно уравнению:

QH2 + 2cyt c+3 + 2Н+т ^ Q + 2cyt c+2 + 4H+out

Где in - в матриксе, out - в межмембранном пространстве митохондрий. Перенос электрона в комплексе III сопряжен с переносом протонов из матрикса в межмембранное пространство и генерацией на мембране митохондрий разности электрохимических потенциалов ионов водорода (АцЫ). На каждые 2 электрона, транспортируемые по дыхательной цепи переноса от убихинона до цитохрома с, 2 протона поглощаются из матрикса, и 2 протона высвобождаются в межмембранное пространство. Восстановленный цитохром c перемещается вдоль мембраны в водной фазе, перенося один электрон к следующему дыхательному комплексу -цитохромоксидазе [41, 42]. Суммарная реакция, катализируемая комплексом IV, описывается следующим уравнением:

4cyt c2+ + O2 + 8H+in ^ 4cyt c3+ + 2H2O + 4H+out

В недавней работе [43] показано, что за изменением редокс-состояния при функционировании цитохрома с в дыхательной цепи митохондрий можно следить по рамановским спектрам.

2. Цитохром с принимает активное участие в процессе зависимого от митохондрий апоптоза. Апоптоз - это запрограммированная гибель клетки в ответ на внешние или внутренние сигналы. Вышедший из митохондрий в цитоплазму цитохром с участвует в формировании так называемой апоптосомы вместе с белком Apaf-1 (англ. apoptosis protease activating factor-1 — «фактор активации протеаз апоптоза»). Предварительно, Apaf-1

претерпевает конформационные изменения в результате реакции, протекающей с затратой энергии АТФ. Предполагается, что трансформированный Ара^1 приобретает способность связывать цитохром с. К тому же открывается доступ CARD-домена Ара£1 для прокаспазы-9. В итоге происходит олигомеризация 7 субъединиц трансформированного белка Ара£1 с участием цитохрома с и прокаспазы-9. Так образуется апоптосома, активирующая каспазу-9. Зрелая каспаза-9 связывает и активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3. Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин АШ является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз (Рис. 4) [44]. Однако, сам механизм выхода цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму изучен слабо - до сих пор не известно, как образуется пора, необходимая для его выхода.

Рис. 3 Схема участия цитохрома с в дыхательной цепи митохондрий [45]

Рис. 4 Схема участия цитохрома с в формировании апоптосомы [46]

3. В некоторых условиях цитохром с начинает проявлять пероксидазную активность, которая в общем случае соответствует уравнению:

Н2А + Н2О2 —> А + 2 Н2О. (2)

При пероксидазной реакции происходит восстановление перекиси водорода до воды с участием субстрата А, в качестве которого может выступать фосфолипид или другие молекулы.

Присущая цитохрому с слабая пероксидазная активность была описана еще в ранних работах [18, 20, 47-53]. В ряде лабораторий было обнаружено, что на пероксидазную активность цитохрома с специфическое активирующее действие оказывает связывание с кардиолипином [54]. Кардиолипин, в противоположность неспецифическому анионному детергенту додецилсульфату натрия, осуществляет изменения конформации цитохрома с, что проявляется в активации пероксидазной активности, уже в относительно низких концентрациях. Индукция перекисного окисления липидов под действием цитохрома с также наблюдалась и для других ненасыщенных липидов [19, 20, 55-58].

Пероксидазная активность цитохрома с повышается не только при взаимодействии с кардиолипином [5, 27, 28], но и при частичном протеолизе [48, 59], денатурации [52], димеризации [60], иммобилизации [51, 61], нитрировании тирозина [62], окислении метионина (met80) [63, 64] и мутации в остатках 26 или 41 [26, 65, 66].

4. Цитохром с также может обладать антиоксидантной активностью, заключающейся в окислении супероксидных радикалов [67-70]. Цитохром с с атомом трёхвалентного железа в составе тема способен эффективно окислять супероксид с константой реакции к = 2,4 х 106М-1с-1 (при рН 7,0). Это, однако, на три порядка ниже соответствующей константы для супероксиддисмутазы. Реакция между цитохромом с и О2- описывается уравнением [68]:

З+ч , ^ - ^^ „

Су; с^е) + О2- ^ Су; с ^е2+) + О2

2.2 Связывание цитохрома с с липидными мембранами

Прежде чем перейти к описанию процесса связывания цитохрома с с

липидными мембранами следует остановиться кратко на взаимодействии катионных пептидов с липидами, поскольку понимание особенностей связывания небольших катионных пептидов с фосфолипидными мембранами может помочь понять механизм взаимодействия цитохрома с с мембранами. Можно отметить, что многие мембранные белки имеют кластеры катионных остатков на своей поверхности, расположенные вблизи поверхности цитоплазматической мембраны. Следует отметить также, что связывание с биологическими мембранами и фосфолипидными моделями зависит от наличия в мембране отрицательно заряженного липида, такого как фосфатидилсерина, фосфатидилглицерола, фосфатидной кислоты и кардиолипина. Согласно теории Гуи-Чепмена, в непосредственной близости от межфазной границы противоионы концентрируются за счет электрического поля поверхности. С удалением от межфазной границы напряженность электрического поля ослабевает, поэтому все сильнее проявляется рассеивание противоионов в результате теплового движения. Концентрация противоионов при удалении от межфазной границы падает (или растет) и становится равной концентрации этих ионов в объеме жидкой фазы, возникает так называемый диффузный слой противоионов. Поскольку природные мембраны содержат только отрицательно заряженные липиды, то в диффузном слое происходит концентрирование катионов и снижение концентрации анионов. Этот эффект зависит от ионной силы раствора и описывается следующим уравнением:

[Р]0 = [Р] е [-М°)/кт], (1)

где [Р]0 - концентрация пептида на мембране, [Р] - концентрация пептида в объеме раствора, ъ - валентность ионов, е - заряд электрона, Т - абсолютная температура, у(0) - поверхностный потенциал. Соответственно, концентрация поликатионных пептидов резко возрастает вблизи мембраны, что повышает их способность к связыванию с мембраной. Существенно

отметить, что уравнение выведено в предположении о точечном характере катионов, что в случае поликатионных кластеров в пептидах является явным упрощением. Кроме того, это уравнение не учитывает подвижность заряженных липидов в плоскости мембраны, что также оказывается существенным в случае количественного описания связывания пептидов с мембранами [71].

Анализ связывания цитохрома с с заряженными мембранами из смеси диолеоилфосфатидилглицерол:диолеоилфосфатидилхолин показывает, что его связывание сопровождается перераспределением липидов в плоскости мембраны [72, 73]. Фосфатидилглицерины и фосфатидилхолины с идентичными ацильными цепями, как известно, очень хорошо смешиваются в гидратированных мембранах. Тем не менее, связывание цитохрома с с мембраной из диолеоилфосфатидилглицерол:диолеоилфосфатидилхолин значительно превышало предсказанное для случая однородной смеси липидов.

Цитохром с образует комплексы электростатической природы с кислыми липидами как в растворе, так и на поверхности мембран липосом. Эти комплексы диссоциируют в присутствии солей [74-76]. Предполагается, что при связывании цитохрома с на поверхности липидного бислоя одна из двух ацильных цепей фосфолипида входит в гидрофобную полость внутри молекулы белка [77]. Связывание с кардиолипином изменяет свойства цитохрома с [5, 28]. При этом, как показали данные ЭПР, спектроскопии

31

комбинационного рассеяния и Р-ЯМР, гемовая щель в структуре цитохрома с раскрывается и железо гема переходит из шестикоординационного состояния с низким спином в пятикоординационную форму с высоким спином [78-80]. Данные D-ЯМР [80] также показывают, что изменяется конформация полипептидной цепи и происходит дестабилизация альфа-спиралей. В результате этих структурных изменений происходит нарушение S-Fe координации между Ме^80 и гемовым железом [54, 81] что способствует увеличению реакционной способности гема цитохрома с по

отношению к перекиси водорода. В литературе есть данные о том, что кардиолипин способствует разворачиванию цитохрома с, при этом существует множество степеней раскрытия молекулы белка, что может влиять на его пероксидазную активность [82, 83]. Однако есть противоположные данные, показывающие что значительного изменения структуры цитохрома с при связывании с кардиолипином не происходит [84]. По мнению Ю.А.Владимирова, механизм специфической активации пероксидазной активности цитохрома с кардиолипином заключается в облегчении доступа перекиси водорода к гему [85, 86].

2.3 Особенности взаимодействия цитохрома с с кардиолипином мембран

Кардиолипин - фосфолипид, содержащийся в мембранах митохондрий.

Приставку «кардио» он получил из-за того, что впервые был выделен из митохондрий мышечной ткани бычьих сердец. Он содержится в значительном количестве во внутренней мембране митохондрий (до 20 % всех липидов этой мембраны), и, по некоторым данным, его присутствие очень важно для нормального протекания процесса окислительного фосфорилирования [87, 88]. Он обладает необычной структурой, представляя собой как бы двойной фосфолипид (Рис. 5). Два фосфатидилглицерина в нем соединяются с глицерином в центре с образованием симметричной структуры. Таким образом, он имеет четыре алкильные группы и потенциально несет два отрицательных заряда. При физиологических условиях (рН=7), молекула кардиолипина может нести один или два отрицательных заряда.

о О

о

Рис. 5 Структура кардиолипина [89]

Как отрицательно заряженный фосфолипид, кардиолипин, самостоятельно или в комплексе с цитохром с оксидазой, формирует мембранный сайт для связывания цитохрома с в митохондриях. Цитохром с несет на себе положительный заряд +8 при нейтральном рН и хорошо связывается с отрицательно заряженными мембранами. Однако, согласно большому количеству данных [77] [90], взаимодействие цитохрома с с липидными мембранами не сводится лишь к электростатическому.

В литературе описано нескольких вариантов связывания цитохрома с с кардиолипином. Первый вариант заключается в том, что ацильная цепь фосфолипида входит в гидрофобный канал белка, близкий к расположению остатка аспарагин-52. Согласно другому варианту, введение ацильной цепи происходит в области метионина-80. В статье Sinibaldi [91] было показано, что образование комплекса цитохром с-кардиолипин происходит за счет двух ацильных цепей, погруженных в разные гидрофобные участки белка (Рис. 6).

Рис. 6 Взаимодействие цитохрома с с кардиолипином мембран [91]

Наряду с представлениями о том, что ацильные цепи кардиолипина высовываются из мембраны и входят внутрь белка цитохрома с, расположенного вне мембраны, также существуют работы, описывающие процесс погружения цитохрома с в толщу мембраны [92]. В этом случае структура цитохрома с изменяется так, что с мембраной взаимодействуют спирали С-конца [83]. В литературе описано также полное погружение цитохрома с в мембрану [93, 94]. Это результат был получен методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Можно было бы ожидать, что связывание белка с поверхностью анионного липидного бислоя будет также приводить к появлению глобул белка на такой поверхности, поскольку цитохром c адсорбируется на поверхности нейтрального (незаряженного) бислоя достаточно сильно, чтобы получить изображение АСМ. Однако, при проведении подобных опытов на отрицательно заряженной мембране было замечено, что в условиях низкой ионной силы раствора цитохром с как бы

пропадает из поля зрения. Это может трактоваться как снятие молекул белка зондом для сканирования в процессе самого сканирования. Однако, хотя измерения толщины мембраны показывали лишь незначительные отличия после адсорбции цитохрома с, наблюдалось существенное снижение силы, необходимой для пробоя мембраны после добавления цитохрома с. Было заключено, что цитохром с встраивается в мембрану плоского бислоя, но при этом топография поверхности остается гладкой [93]. С этим опытом перекликается другая серия работ, где было показано, что взаимодействие липида и белка приводят к тому, что мембрана становится более «жидкой» при погружении в нее цитохрома с, приводя к большей скорости тепловых колебаний [92, 95].

С другой стороны есть данные, которые противоречат гипотезе о полном погружении белка в липидную мембрану. Как было показано ранее методом ЭПР на дрожжевом цитохроме с со спиновой меткой [96], цитохром с лишь частично проникает в мембрану из диолеоилфосфатидилглицерина, либо просто связывается с поверхностью как классический периферический белок.

Как было описано ранее, механизм связывания может зависеть от соотношения липид/белок. При низком покрытии поверхности мембраны белком связывание будет периферийным, при соотношении от 18:1 до 12:1 происходит частичное проникновение цитохрома с в мембрану, при более низких коэффициентах - снова будет преобладать переферийное связывание [97]. Метод ферстеровского резонансного переноса энергии с антропоилвинил-меченного фосфатидилхолина на гем цитохрома с показал частичное проникновение белка в липидный бислой на глубину нескольких проксимальных атомов углерода ацильных цепей [98].

Таким образом, описание молекулярного взаимодействия цитохрома с с кардиолипином (как и с другими анионными фосфолипидами) не является полным. На поверхности цитохрома с имеется как минимум два участка, которые могут способствовать связыванию с кардиолипином. Связывание

может идти по-разному в зависимости от условий эксперимента, таких как рН, ионная сила, липидный состав и соотношение липид/белок. На настоящий момент информация о структуре комплекса цитохром с/кардиолипин и об изменении конформации цитохрома с, к которой приводит связывание с кардиолипином, является далеко не полной [7].

2.4 Пермеабилизация мембран под действием цитохрома с

В ряде работ было показано, что добавление цитохрома с к липосомам

может вызывать увеличение их проницаемости для ионов, а также для карбоксифлуоресцеина и других флуоресцентных маркеров [13, 99]. Пермеабилизация наблюдается при нейтральном рН (рН~7,4) при наличии отрицательно заряженных мембран липосом и низкой ионной силы среды. В системе монослоя липида на поверхности раздела вода-воздух было показано, что при поверхностном давлении 24 дин/см цитохром с, в отличие от белка рибонуклеазы, проявляет значительное проникновение в монослой, однако при этом невозможно определить, происходит ли только деформация жирнокислотных цепей или полное проникновение внутрь монослоя [100].

В работе [13] изучалось взаимодействие цитохрома с с гигантскими липосомами (GUV), приготовленными из липида, содержащего кардиолипин. Было показано, что такие флуоресцентные маркеры, как карбоксифлуоресцеин и декстран массой 10 килодальтон, выходили из липосом в присутствии цитохрома с, хотя декстраны большей массы не проходили в тех же условиях. Авторы считают, что выход красителя происходит в результате открытия липидной поры, образованной прочным комплексом цитохром с-кардиолипин. Порообразование значительно уменьшалось в присутствии АТФ. Предложена модель, в которой формирование тороидальной липидной поры связывается с индукцией цитохромом с отрицательной спонтанной кривизны липидов мембраны, что ведет к образованию белково-липидной поры. Результаты этой работы показывают, что взаимодействия кардиолипин-цитохром с может быть достаточно для проникновения цитохрома с через митохондриальную

Похожие диссертационные работы по специальности «Биофизика», 03.01.02 шифр ВАК

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Фирсов Александр Михайлович, 2018 год

и 30 -

20 -

10 -

0 -

Цит c (ФХ/КЛ)

Цит c (ФХ/КЛ) + 100 мкМ миноциклин

7

Цит c (ФХ)

Время, с

Рис. 40 Панель А: Ингибирование пероксидазной активности цитохрома с миноциклином. Кривая 1 - Цит c 1 мкМ, H2O2 1,5 мМ; кривая 2 - Цит c 1 мкМ; кривая 3 - Цит c 1 мкМ, H2O2 1,5 мМ, миноциклин 200 мкМ. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ. Сахарозная среда, 200 мМ сахарозы, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7,4. Панель Б: Влияние миноциклина на связывание цитохрома с с мембраной. Цит c 1 мкМ, миноциклин 100 мкМ. Глюкозная среда, 200 мМ глюкозы, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7,4.

С помощью измерений связывания цитохрома с методом центрифугирования нами обнаружено, что уже в концентрации 100 мкМ миноциклин в значительной степени предотвращает связывание цитохрома с с кардиолипин-содержащими липосомами (Рис. 40Б). По всей вероятности, миноциклин конкурирует с кардиолипином за связывание с белком, что и является причиной ингибирования пероксидазной активности цитохрома с.

4.4.5 Подавление пермеабилизации липосом, вызванной пероксидазной активностью цитохрома с, митохондриально-направленными антиоксидантами

Митохондриально-направленные антиоксиданты - это антиоксиданты,

которые содержат в своей структуре группировку, обеспечивающую их накопление внутри митохондрий, и действие которых в клетках осуществляется преимущественно в митохондриях. Поскольку цитохром с

0

0

находится на внутренней мембране митохондрий и, предположительно, сам способствует образованию поры для своего выхода из митохондрий [5], было важно исследовать, как система цитохром с/перекись водорода, взаимодействующая с кардиолипином мембран, может откликаться на действие митохондриально-направленных антиоксидантов.

SkQ1 М^

Рис. 41 Сравнение структур SkQ1 и MitoQ

Нами были проведены измерения пермеабилизации липосом в присутствии митохондриально-направленных антиоксидантов SkQ1 [132] и MitoQ [133], представляющих собой конъюгаты децилтрифенилфосфония, соответственно, с пластохиноном или убихиноном (Рис. 41), а также в присутствии лишенного хинона додецилтрифенилфосфония (С12ТРР) (Рис. 42).

SkQ1 С12ТРР

Рис. 42 Сравнение структур SkQ1 и С12ТРР

В начале мы посмотрели влияние окисленной и восстановленной форм SkQ1, а также его безхинонового аналога на пермеабилизацию липосом. По полученным данным вышло, что восстановленная форма SkQ1 приводила к большему снижению пермеабилизации, чем окисленная. В то же время, безхиноновый аналог SkQ1, додецилтрифенилфосфоний (С12ТРР), хоть и в меньшей степени, но также снижал процесс пермеабилизации. Сами по себе

SkQ1 и С12ТРР к пермеабилизации липосом не приводили даже в больших концентрациях, равных 1 мкМ. (Рис. 43).

60

0 200 400 600 800

Время, с

Рис. 43 Влияние окисленной и восстановленной форм SkQ1 на вытекание кальцеина из липосом, индуцированное Цит с и Н202. Кривая 1, без добавок; кривая 2, Цит с 400 нМ и 1,5 мМ Н202; кривая 3, Цит с 400 нМ, 1,5 мМ Н202 и 200 нМ SkQ1H2; кривая 4, Цит с 400 нМ, 1,5 мМ Н202 и 200 нМ SkQ1; кривая 5, Цит с 400 нМ, 1,5 мМ Н202 и 200 нМ С12ТРР; кривая 6, 1000 нМ SkQ1H2; кривая 7, 1000 нМ С12ТРР; кривая 8, Цит с 400 нМ, 1,5 мМ Н202 и 100 мкМ Тролокс. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ.

В следующей серии экспериментов нами было показано, что SkQ1 и MitoQ в значительной степени ингибировали пероксидазную активность цитохрома с. Так, в системе с люминолом, SkQ1 сильно ингибировал пероксидазную активность цитохрома с (Рис. 44).

Время, с

Рис. 44. Ингибирование пероксидазной активности цитохрома с митохондриально-направленным антиоксидантом SkQ1. Добавки: Цит с, 1 мкМ; H2O2, 1,5 мМ. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ. Сахарозная среда, 200 мМ сахарозы, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7,4.

Значительное подавление пероксидазной активности цитохрома с под действием SkQ1 и MitoQ было показано нами также с использованием Amplex Red (Рис. 45). Оказалось, что додецилтрифенилфосфоний C12TPP, безхиноновый аналог SkQ1, не имеющий антиоксидантных групп, тоже, хотя и в меньшей степени, вызывал подавление пермеабилизации липосом (Рис. 43) и снижение пероксидазной активности (Рис. 45).

Это дало основание предположить, что митохондриально-направленные антиоксиданты могут в данной системе влиять на какой то другой важный параметр, а не только действовать непосредственно на протекание процесса перекисного окисления липидов, запускаемого цитохромом с.

ф

^

го

I

s

■е

>

Œ

0 СО Ф Œ

К

S ^

1

ф

^

о ф

Œ

О >

с;

е

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

Цит c

Цит c + SkQ1 ^^ Цит c + SkQ1 H

Цит c + C12TPP

Без добавок

Цит c + MitoQ

2

Рис. 45 Влияние митохондриально-направленных антиоксидантов на пероксидазную активность Цит с, измеренную по окислению Amplex Red. Интенсивность флуоресценции резоруфина после 20 минут инкубации с Цит с и H2O2. SkQm2, 200 нM; SkQ1, 200 нM; C12TPP, 200 нM; MitoQ, 200 нM. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ. Измерения проводились в сахарозной среде (200 мM сахарозы, 10 мM Tris, 10 мM MES, pH 7,4). Концентрация липида 10 мкг/мл.

4.4.6 Влияние митохондриально-направленных антиоксидантов на связывание цитохрома с с липосомами

Поскольку безхинонный аналог

SkQ1

Без добавок

т

I 40 н

ск ш

О

20 -

SkQ1

SkQ1Н2

MitoQ

т

также вызывал снижение пероксидазной активности цитохрома с, мы предположили, что митохондриально-направленные антиоксиданты могут влиять на связывание цитохрома с с мембраной. Для подтверждения данной гипотезы были проведены опыты по

связыванию белка с мембранами в Рис 46 Влияние митох°ндриальн°-присутствии и в отсутствие данн^тх напРавленных аНтИоКсИДаНтов на антиоксидантов. Измерения методом центрифугирования обнаружили

снижение связывания цитохрома с в

присутствии SkQ1 почти в 2 раза (Рис. 46). Измерения связывания по тушению флуоресцентной метки также показали снижение связывания цитохрома с с мембраной в присутствии митохондриально-направленныгх антиоксидантов, при этом добавление тролокса не снижало связывание белка. Снижение связывания цитохрома с наблюдалось также и в отсутствие кардиолипина в липосомах. При этом само связывание с такими липосомами быио сильно подавлено (Рис. 47).

связывание. Цит с 1 мкМ, SkQ1Н2 1 мкМ; 8кд1 1 мкМ; С12ТРР 1 мкМ; М^ 1 мкМ. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ.

А

Б

Рис. 47 Влияние митохондриально-направленных антиоксидантов на связывание цитохрома с с липосомами из ФХ/КЛ (A) либо ФХ (Б), измеренное по тушению флуоресценции пирен-меченого фосфатидилхолина (ППГФХ; 1% от массы липида). Сахарозная среда, 200 мМ сахарозы, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7,4. Концентрация липида 10 мкг/мл. Добавки: 450 нМ SkQ1, 450 нМ MitoQ, 450 нМ Ci2TPP, 100 мкМ тролокса. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ.

Кроме того, было изучено влияние SkQ1 на связывание цитохрома с с мембранами липосом методом ИТК. Следует сказать, что использование этого метода требует довольно высоких концентраций белка (300 мкМ) и липида (40 мкМ), поэтому в своих опытах мы использовали достаточно высокую концентрацию SkQ1 - 4 мкМ. Красная кривая на Рис. 48 показывает типичную картину пульсов выделения тепла при череде последовательных добавок цитохрома с. Синяя кривая показывает пульсы выделения тепла в присутствии SkQ1. Из сравнения этих двух кривых становится ясно, что SkQ1 снижает связывание цитохрома с кардиолипин-содержащей мембраной. Наиболее значительный эффект заключался в практически полном исчезновении медленных пульсов выделения тепла, в то время как быстрые пульсы сохраняются. (Рис. 48А). Аппроксимация кривых релаксации выделения тепла моноэкспоненциальной функцией показала, что характерное время падает со 125 с до 24 с, то есть более, чем в 5 раз. Это может означать, что SkQ1 блокирует внедрение белка в мембрану, оставляя

при этом возможность электростатического связывания с поверхностью мембраны. Экспериментальные точки и аппроксимирующие кривые показаны на Рис. 48Б. Были получены следующие параметры (Без SkQ1 и с SkQ1, соответственно): к, 1,89*106 и 7,71*104; АН, -10160 и -1133 кал/моль; ДS, -5,355 и 18,56 кал/(моль*градус); АG, -8563 и -6667 кал/моль. Таким образом, добавление 4 мкМ SkQ1 снижало константу связывания цитохрома с с мембраной в 24,5 раза.

А

В

60 120 Время (мин)

Рис. 48 Изотермическая титрационная калориметрия. Титрование цитохрома с в присутствии ФХ/КЛ липосом в среде в отсутствие SkQ1, красная кривая, и в присутствии SkQ1, синяя кривая. Панель А: Последовательные инъекции Цит с, 2.15 мкМ каждая, с 12-минутными интервалами. Температура 25°C. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ; SkQ1, 4 мкМ (синяя кривая). Концентрация липида 40 мкг/мл. Сахарозная среда, 200 мМ сахарозы, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7,4. Панель Б: Интегрирование тепла для каждой инъекции как функции молярного соотношения Цит c/липид. Фитирующие кривые были рассчитаны, как описано в тексте.

4.5 Оценка размера пор, образуемых в мембране в

результате пероксидазной активности цитохрома с

Для оценки размера поры, образуемой под действием комбинации цитохрома с с перекисью водорода, мы приготовили липосомы, нагруженные различными по размеру маркерами - сульфородамином Б, 3 кДа-декстраном

и 10 кДа-декстраном. Поскольку эти красители имеют большой молекулярный вес, затруднительно приготовить липосомы, нагруженные ими в концентрации самотушения. Поэтому измерения проводились нами методом ФКС. Сульфородамин Б и декстран с молекулярной массой 3 кДа вытекали из липосом за десятки минут, в то время как декстран с молекулярной массой 10 кДа вытекал гораздо медленнее (Рис. 49). Этот результат качественно соответствует данным по размеру пор, образуемых цитохромом с в отсутствие перекиси водорода, полученным в статье [13], где из гигантских липосом (GUV) выходили карбоксифлуоресцеин и декстран с молекулярной массой 10 кДа, но не выходили декстраны с большей молекулярной массой. Поскольку декстран с молекулярной массой 10 кДа выходил из липосом очень плохо, можно сделать вывод, что диаметр поры приблизительно равен или несколько меньше диаметра молекулы такого декстрана, то есть составляет приблизительно 5 нм. Размер молекулы декстрана был нам взят из [134].

Время, мин

Рис. 49 Вытекание сульфородамина Б (красная кривая), 3-кДа декстрана (черная

кривая) и 10- кДа декстрана (синяя кривая) из ФХ/КЛ липосом, индуцированное цитохромом с и H2O2. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ. Эксперименты проводились в сахарозном буфере (200 мМ сахарозы, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7,4). Концентрация липида, 2 мкг/мл.

Мы также оценили размеры поры, формируемой в мембране вследствие пероксидазной активности цитохрома с, по проводимости одиночных каналов, образованных в плоской БЛМ под действием цитохрома с в присутствии перекиси водорода. В наших экспериментах проводимость составляла около 0,8±0,1 нСименс в среде с 5 мМ KCl (Рис. 50). Согласно [135], такое значение проводимости соответствует радиусу поры 0,9±0,1 нм. В работе [14] было получено очень сходное значение радиуса поры, 0,98±0,29 нм. Таким образом, на плоской БЛМ диаметр поры оказался в два раза меньше, чем был получен на липосомах. Это противоречие можно объяснить тем, что цитохром с на самом деле образует каналы разного размера, то есть существует гетерогенность в распределении пор в мембране, есть поры более мелкие и более крупные. Однако, из-за нестабильности БЛМ и особенностей постановки опыта, более крупные каналы сложнее зарегистрировать, поскольку они реже встречаются, и, кроме того, могут приводить к разрыву плоской мембраны. Липосомы же, по сравнению с БЛМ, обладают тем преимуществом, что их суммарная площадь поверхности в опыте гораздо больше площади плоского бислоя, что позволяет включить в рассмотрение и те каналы, которые возникают реже. При этом из-за своего большого размера они могут вносить заметный вклад в общую проводимость мембран.

Время, с

Рис. 50 Цит c в присутствии Н2О2 может вызывать образование одиночных каналов. Мембрана состояла из смеси азолектина и кардиолипина (80%/20% по весу). Цит с, 1 мкМ; Н2О2, 1,5 мМ. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ. Потенциал на мембране -50 мВ. KCl среда - 2.5 мМ KCl, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7,4.

Важно отметить, что полученный нами диаметр пор, образуемых в результате пероксидазной активности цитохрома с, существенно превышает диаметр пор, возникающих в мембране при окислении липидов без участия цитохрома с, который согласно [136] составляет 1,5 нм.

4.6 Сравнение действия цитохрома с из сердца лошади и из дрожжей

Кроме цитохрома с из сердца лошади, который использовался нами во всех вышеописанных экспериментах, нами были поставлены опыты с цитохромом с из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В целом можно сказать, что этот белок по своим свойствам был гораздо активнее цитохрома с из

сердца лошади. При измерении утечки красителя из липосом, дрожжевой цитохром с начинал действовать раньше по времени и приводил к более сильной утечке (Рис. 51А). Кроме того, если мы проводили измерение пермеабилизации в условиях высокой ионной силы буфера, где лошадиный цитохром с практически не давал пермеабилизации, дрожжевой белок сохранял свою способность к образованию каналов (Рис. 51В). У дрожжевого цитохрома с также была обнаружена еще одна особенность - даже в отсутствие перекиси у него сохранялась активность, и он, хотя и в меньшей степени, но приводил к вытеканию красителя в отсутствии перекиси (Рис. 52А). В связи с этим можно предположить, что дрожжевой цитохром с имеет более высокое сродство к имеющимся липидным гидроперекисям, что по-видимому является достаточным для запуска и поддержания перекисного окисления липидов липосом.

A

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Время, с

Время, с

Рис. 51. Сравнение лошадиного и дрожжевого цитохромов с по индукции вытекания кальцеина из липосом. Измерения в буфере с низкой (панель А) и высокой (панель Б) ионной силой. Добавки: Цит c 1 мкМ, Н2О2 1,5 мМ. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ. Концентрация липида 10 мкг/мл. В качестве среды с низкой ионной силой использовалась сахарозная среда (200 мМ сахарозы, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7,4), с высокой ионной силой - KCl среда (100 мМ KCl, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7,4).

Помимо опытов по пермеабилизации липосом нами также были поставлены опыты по образованию пор в плоском бислое. Кроме того, были

Б

0

0

поставлены опыты по измерению его связывания с липосомами методом центрифугирования и измерена его пероксидазная активность при помощи Amplex Red.

А

Б

^ 2.0 -

1.5 -

1.0 -

©

2.5

0.0

Рис. 52 Панель А: Влияние Н2О2 на индуцированное различными цитохромами вытекание сульфородамина Б из липосом, состоящих из азолектина и кардиолипина. Цит с 100 нМ, Н2О2 1,5 мМ. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ. Панель Б: Сравнение пероксидазной активности различных цитохромов. Цит c 400 нМ, H2O2 25 мкМ. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ.

При измерении на БЛМ, дрожжевой цитохром с быстрее вызывал образование каналов, однако их проводимость была примерно в три раза меньше проводимости каналов, образованных лошадиным цитохромом с (Рис. 53А). Средняя амплитуда канала была 9 нСименс, тогда как у белка лошади она была 30 нСименс. Измерение пероксидазной активности при помощи Amplex Red показало, что пероксидазная активность дрожжевого белка слабо отличается от таковой лошадиного цитохрома с (Рис. 52Б). В то же время, измерение связывания показало, что дрожжевой белок связывается с мембраной заметно хуже лошадиного, разница была примерно в полтора раза (Рис. 53Б).

А

Б

2.0 1.5 1.0 G.5 -0.0 -0.5 -1.0 -1.5

+Цит с +Н2О2

I

Дрожжевой Цит с +50 мB

Лошадиный Цит с +50 мB

Без добавок +50 мB +50 jwB +50 мB +50 мB

+Цит с

-50 мB -50 мB -50 мБ

-50 мB

G.G 2.Ge+5 4.Ge+5 6.Ge+5 8.Ge+5 1.Ge+6 1.2e+6 Bремя, с

90 80 70 ^ 60 ai 1 50 ГО со

со 40

гс

ш

о 3020 -10 0

Лошадиный Цит с

Дрожжевой Цит с

Рис. 53 Панель А: Образование каналов лошадиным и дрожжевым Цит с в присутствии Н2О2. Цит с, 1 мкМ; Н2О2, 1,5 мМ. Другие добавки: ЭДТА, 100мкМ. Потенциал на мембране -50 мВ. KCl среда - 2.5 мМ KCl, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7,4.

Панель Б: Сравнение связывания при различных цитохромах с. Цит с 1 мкМ. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ.

Дрожжевой цитохром с длиннее лошадиного цитохрома с на 4 аминокислотных остатка (108), при этом последовательность смещена на 5 аминокислот - первой аминокислоте лошадиного цитохрома с соответствует шестая дрожжевого. Центральная часть, которая, как мы полагаем, наиболее важна для связывания, у лошадиного цитохрома с заряжена более отрицательно, имея, в отличие от дрожжевого, в 62 и 69 положении глутаминовую кислоту, в то время как у дрожжевого цитохрома с в 65 положении, в отличие от лошадиного, находится аспарагиновая кислота. Этим можно объяснить то, что дрожжевой цитохром с хуже связывается с мембраной, поскольку первой стадией связывания является электростатичекое сближение белка с мембраной. Более низкая пероксидазная активность, скорее всего, связана именно с менее эффективным, по сравнению с лошадиным цитохромом с, связыванием с мембраной, при этом последующие стадии процесса пермеабилизации

проходят явно более эффективно по сравнению с лошадиным вариантом белка.

4.7 Перераспределение цитохрома с между двумя популяциями липосом

Использованный нами метод измерения пермеабилизации липосом по разгоранию флуоресценции кальцеина, нагруженного в липосомы, допускает присутствие в системе пустых липосом, не нагруженных красителем и не влияющих на систему измерения вытекания красителя из нагруженных липосом. С другой стороны, добавление таких пустых липосом может приводить к перерастределению белка между этими двумя популяциями липосом, что может приводить к изменению скорости вытекания красителя и, тем самым, дать дополнительную информацию о свойствах данной системы. Оказалось, что действительно добавление пустых липосом оказывало существенное влияние на процесс вытекания красителя, причем данный эффект зависел от количества добавляемых пустых липосом и того, когда они были добавлены - до, между или после добавки цитохрома с и перекиси водорода (Рис. 54). Если пустых липосом добавлялось в 10 раз меньше, чем липосом с кальцеином, то во всех случаях шло усиление пермеабилизации липосом с красителем не зависимо от момента их добавления (Рис. 54А). Этот достаточно неожиданный результат говорит о существовании стадии активации белка в присутствии липосом, причем белок в таком активированном состоянии может переходить с одной популяции липосом на другую. Эту стадию активации естественно связать с приобретением цитохромом с пероксидазной активности. Таким образом, ускорение выхода кальцеина из липосом под действием пустых липосом можно объяснить тем, что цитохром с, после взаимодействия с пустыми липосомами, приобретает пероксидазную активность и далее может перераспределяться с пустых липосом на липосомы с красителем, усиливая выход красителя.

Если пустых липосом добавлялось столько же, сколько и липосом с красителем, то добавление их перед или между цитохромом с и перекисью водорода не приводило к изменениям скорости выхода красителя, в то время как добавление после белка давало стимуляцию выхода красителя (Рис. 54Б). Если пустых липосом добавлялось в 10 раз больше, чем нагруженных красителем, то в случае их добавления после белка это уже не влияло на пермеабилизацию, в то время как добавление между и до белка вызывало ингибирование выхода красителя, но в разной степени. А именно добавление пустых липосом до белка вызывало ингибирование в большей степени (Рис. 54В). Развитие эффекта ингибирования выхода красителя в случае добавления пустых липосом естественным образом может быть связано с тем, что значительная часть белка уже локализуется в липосомах без красителя и тем самым эффективная концентрация белка, связанного с окрашенными липосомами, снижается.

А

Б

В

- + Цит с + Н2О2 + пустые + Цит с +

- + Цит с + Н2О2 + пустые + Цит с + nyi

- Без добавок

- + Цит с + Н2О2

- + пустые липосомы + Цит с + Н2О2 _ + Цит с + пустые липосомы + Н2О2 _ + Цит с + Н2О2 + пустые .

100 200

100 200

Рис. 54 Влияние добавки пустых липосом к липосомам, нагруженным красителем, и цитохрому с с перекисью водорода. Панель А: Пустых липосом в 10 раз меньше чем липосом с красителем. Панель Б: Пустых липосом столько же, сколько и липосом, нагруженных красителем. Панель В: Пустых липосом в 10 раз больше, чем липосом с красителем. Красная кривая, без добавок; зеленая кривая, Цит с; коричневая кривая, Цит с и Н2О2; синяя кривая, добавка пустых липосом до Цит с и Н2О2; розовая кривая, добавка пустых липосом между Цит с и Н2О2; голубая кривая, добавка пустых липосом после Цит с и Н2О2. Цит с, 100 нМ; Н2О2, 1,5 мМ. Другие добавки: ЭДТА, 100 мкМ. Концентрация липида 10 мкг/мл. Сахарозная среда (200 мМ сахарозы, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7,4).

100

4.8 Обсуждение

Роль цитохрома c в апоптозе впервые была обнаружена в экспериментах, где добавление дезоксиаденозинтрифосфата к экстрактам цитозоля вызывало появление активности каспаз, причем без цитохрома с активность не развивалась [1]. Позже была показана связь каспазной активности с митохондриями и роль цитохрома с как главного посредника. Оказалось также, что микроинъекции цитохрома с в клетки млекопитающих вызывают апоптоз [137].

Цитохром c принимает участие в развитии как апоптоза, связанного с внутриклеточными причинами, так и с внешними. Внутренний апоптоз запускается повреждениями ДНК, метаболическим стрессом или присутствием неправильно свёрнутых белков. Важность белок-липидного взаимодействия между цитохромом с и кардиолипином для апоптоза была показана в работе [5]. Ключевой этап в развитии внутреннего апоптоза — пермеабилизация внешней мембраны митохондрий. В работе [138] было установлено, что для пермеабилизации внешней митохондриальной мембраны через взаимодействие с белками семейства Bcl-2 (Bid и Bax) необходим кардиолипин. Однако, ни молекулярные особенности, ни модифицированные формы кардиолипина являются существенными для процесса пермеабилизации. В работе Кагана было показано, что цитохром с обладает гораздо большим сродством к не окисленному кардиолипину чем tBid. Важным также является тот факт, что с гидроперекисями кардиолипина цитохром с связывается хуже, чем с не окисленным кардиолипином. Из этого был сделан вывод, что цитохром с действует как катализатор окисления кардиолипина, а окисленный кардиолипин важен для выхода проапоптотических факторов из митохондрий. В представленной Каганом модели окисление кардиолипина цитохромом с является важным шагом, предшествующим взаимодействию окисленного кардиолипина с белками семейства Bcl-2 в цепочке событий, приводящих к выходу цитохрома с из митохондрий [5]. Эта модель сочитает в себе двухэтапную модель выхода

цитохрома с из митохондрий, где окисление кардиолипина необходимо для десорбции цитохрома с с внутренней мембраны митохондрий и пермеабилизации внешней мембраны с последующим выходом цитохрома с в цитозоль [139]. Однако, сам механизм выхода цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму изучен слабо - до сих пор не известно, как образуется пора, необходимая для его выхода. При активации апоптоза цитохром с выходит из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму и связывается с фактором активации апоптотической протеазы (Ара£1). В итоге выход цитохрома с в цитоплазму инициирует формирование апоптосомы.

В своей работе мы попытались выяснить механизм образования поры, необходимой для выхода цитохрома с в цитоплазму, посредством активации самого цитохрома с. Мы предполагаем, вслед за Каганом, что цитохром с сам участвует в образовании поры, необходимой для своего выхода в цитоплазму. Это предположение согласуется с уже имеющимися в литературе данными о том, что цитохром с способен образовывать поры в кардиолипин-содержащей мембране достаточного размера, чтобы его молекула могла пройти через мембрану [13, 94]. Нами получены данные, показывающие, что цитохром с, при наличии кардиолипина в мембране, приводит к образованию довольно крупной поры, через которую вполне может пройти белок с молекулярной массой цитохрома с [140]. Также наше предположение не противоречит данным литературы о том, что цитохром с сам встраивается в гидрофобную область мембраны при образовании поры [93, 94]. На рисунке (Рис. 55) изображена предполагаемая нами схема процесса пермеабилизации под действием цитохрома с и перекиси водорода, а также показаны факторы, которые могут влиять на формирование поры на разных стадиях этого процесса. Можно проследить несколько этапов формирования поры:

• На первом этапе происходит связывание цитохрома с с мембраной, которое имеет в основном электростатическую природу и может быть уменьшено высокой ионной силой раствора

• На втором этапе идет изменение конформации цитохрома с, приводящее к нарушению координационной связи гемового железа с метионином-80, что приводит к индукции пероксидазной активности белка. Эта стадия ингибируется миноциклином

• На третьей стадии перекись водорода взаимодействует с железом гема. Эта стадия ингибируется цианидом.

• На четвертой стадии протекает перекисное окисление липидов, охватывающее и кардиолипин, эта стадия ингибируется антиоксидантами.

• На пятой стадии образуется белково-липидная пора, стенки которой, по-видимому, включают продукты перекисного окисления липидов, и в частности кардиолипина.

Предложенная нами схема основана как на наших экспериментальных данных, так и на модели разворачивания молекулы цитохрома с при взаимодействии с кардиолипином и встраивании ее в мембрану, описанной в [83]. Цитохром с, согласно этой модели, подходит к кардиолипину мембраны той частью, где сосредоточен больший положительный заряд, чем и обеспечивает электростатическое сближение. Однако мы предполагаем, что встраиваться в мембрану для образования поры в первую очередь будет именно часть с большим положительным зарядом, а не сам С-конец, как это показано у [83], поскольку после сближения именно эта часть первой будет соприкасаться и взаимодействовать с мембраной (Рис. 55). Сформированная белково-липидная пора образует водную полость, размеры которой достаточны для прохождения полимеров с молекулярной массой до ~10 кДа.

Рис. 55. Предполагаемая поэтапная схема процесса пермеабилизации: А) Электростатическое сближение цитохрома с с мембраной. Б) Изменение конформации цитохрома с. В) Взаимодействие перикиси водорода с железом гема. Г) Стадия перекисного окисления липидов. Д) Гипотетическая белково-липидная пора [140]

Нами было изучено влияние насыщенности кардиолипина на образование пор под действием цитохрома с. Согласно полученным нами результатам, увеличение насыщенности кардиолипина снижало образование каналов вплоть до полного их подавления, как это имело место с тетрамиристоил кардиолипином. Эту зависимость можно представить как ТМКЛ << ТОКЛ < КЛиз сердца быка. Эти данные хорошо соотносятся с результатами, описанными в работах Кагана [7], где была получена следующая зависимость повышения пероксидазной активности цитохрома с при взаимодействии с кардиолипином мембраны; ТМКЛ << ТОКЛ < ТЛКЛ <

КЛиз сердца быка. Эта корреляция говорит о том, что для процесса образования поры в мембране необходимо окисление кардиолипина.

5 Выводы

1. Впервые показано, что пероксидазная активность цитохрома с, приобретаемая этим белком при взаимодействии с кардиолипином, вызывает пермеабилизацию мембран липосом. Этот процесс наблюдается при условии, что и кардиолипин, и окружающий его липид содержат ненасыщенные жирнокислотные остатки.

2. Установлено, что агенты, подавляющие пероксидазную активность цитохрома с, такие как связывающийся с железом гема цианид, связывающийся с апобелком миноциклин, а также антиоксиданты (тролокс, ионол, кверцетин), ингибируют индукцию пермеабилизации липосом под действием комбинации цитохрома с с перекисью водорода. Как пероксидазная активность цитохрома с, так и индуцируемая этим белком пермеабилизация липидных мембран подавляются при повышении ионной силы среды.

3. Доказано, что митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1, представляющий собой конъюгат катиона трифенилфосфония с децилпластохиноном, ингибирует оба вышеуказанных процесса посредством нарушения связывания цитохрома с с мембраной.

4. Определен размер пор, образуемых в мембране в результате пероксидазной активности цитохрома с.

6 Список литературы

1. Liu, X.S., C.N. Kim, J. Yang, R. Jemmerson, and X.D. Wang, Induction of apoptotic program in cell-free extracts: Requirement for dATP and cytochrome c. Cell, 1996. 86(1): p. 147-157.

2. Budihardjo, I., H. Oliver, M. Lutter, X. Luo, and X.D. Wang, Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 1999. 15: p. 269-290.

3. Acehan, D., X.J. Jiang, D.G. Morgan, J.E. Heuser, X.D. Wang, and C.W. Akey, Three-dimensional structure of the apoptosome: Implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. Molecular Cell, 2002. 9(2): p. 423-432.

4. Shidoji, Y., K. Hayashi, S. Komura, N. Ohishi, and K. Yagi, Loss of molecular interaction between cytochrome c and cardiolipin due to lipid peroxidation. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999. 264(2): p. 343-347.

5. Kagan, V.E., V.A. Tyurin, J.F. Jiang, Y.Y. Tyurina, V.B. Ritov, A.A. Amoscato, A.N. Osipov, N.A. Belikova, A.A. Kapralov, V. Kini, I.I. Vlasova, Q. Zhao, M.M. Zou, P. Di, D.A. Svistunenko, I.V. Kurnikov, and G.G. Borisenko, Cytochrome c acts as a cardiolipin oxygenase required for release ofproapoptotic factors. Nature Chemical Biology, 2005. 1(4): p. 223-232.

6. Kriska, T., W. Korytowski, and A.W. Girotti, Role of mitochondrial cardiolipin peroxidation in apoptotic photokilling of 5-aminolevulinate-treated tumor cells. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2005. 433(2): p. 435-446.

7. Kagan, V.E., H.A. Bayir, N.A. Belikova, O. Kapralov, Y.Y. Tyurina, V.A. Tyurin, J.F. Jiang, D.A. Stoyanovsky, P. Wipf, P.M. Kochanek, J.S. Greenberger, B. Pitt, A.A. Shvedova, and G. Borisenko, Cytochrome c/cardiolipin relations in mitochondria: a kiss of death. Free Radical Biology and Medicine, 2009. 46(11): p. 1439-1453.

8. Антонов, В.Ф., Ю.А. Владимиров, А.Н. Россельс, Л.Г. Коркина, Е.А. Корепанова, и К.И. Трухманова, Влияние продуктов перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот на транспорт ионов через бимолекулярные фосфолипидные мембраны. Биофизика, 1973. 18: p. 668-673.

9. Соколов, В.С., Т.Д. Чуракова, В.Г. Булгаков, В.Е. Каган, М.В. Биленко, и Л.И. Богуславский, Исследование механизмов действия продуктов перекисного окисления липидов на проницаемость бислойных липидных мембран. Биофизика, 1981. 26: p. 147-149.

10. Лебедев, А.В., Ионные каналы в бислойных липидных мембранах, зависимые от кислорода. Доклады АН СССР, 1981. 260(3): p. 757-761.

11. Lebedev, A.V., D.O. Levitsky, V.A. Loginov, and V.N. Smirnov, The effect ofprimary products of lipid-peroxidation on the transmembrane transport of calcium-ions. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 1982. 14: p. 99103.

12. Kunimoto, M., K. Inoue, and S. Nojima, Effect offerrous ion and ascorbate-induced lipid-peroxidation on liposomal membranes. Biochimica Et Biophysica Acta, 1981. 646(1): p. 169-178.

13. Bergstrom, C.L., P.A. Beales, Y. Lv, T.K. Vanderlick, and J.T. Groves, Cytochrome c causes pore formation in card/ol/p/n-conta/n/ng membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013. 110(16): p. 6269-6274.

14. Antonov, V.F., M.N. Puchkov, E.A. Korepanova, O.Y. Nemchenko, and V. Borodulin, Soft perforation of card/ol/p/n-conta/n/ng planar lipid bilayer membrane by cytochrome c and H2O2. European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 2014. 43(10-11): p. 469-476.

15. Puchkov, M.N., R.A. Vassarais, E.A. Korepanova, and A.N. Osipov, Cytochrome c produces pores in cаrd/ol/p/n-contа/n/ng planar bilayer lipid membranes in the presence of hydrogen peroxide. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 2013. 1828(2): p. 208-212.

16. Vladimirov, Y.A., E.V. Proskurnina, E.M. Demin, N.S. Matveeva, O.B. Lubitskiy, A.A. Novikov, D.Y. Izmailov, A.N. Osipov, V.P. Tikhonov, and V.E. Kagan, Dihydroquercetin (taxzfolin) and other flavonoids as inhibitors offree radical formation at key stages of apoptosis. Biochemistry-Moscow, 2009. 74(3): p. 301-307.

17. Cadenas, E., A. Boveris, and B. Chance, Low-level chemi-luminescence of hydroperoxide-supplemented cytochrome-c. Biochemical Journal, 1980. 187(1): p. 131-140.

18. Cadenas, E., A.I. Varsavsky, A. Boveris, and B. Chance, Low-level chemi-luminescence of the cytochrome c-catalyzed decomposition of hydrogen-peroxide. Febs Letters, 1980. 113(2): p. 141-144.

19. Goni, F.M., M. Ondarroa, I. Azpiazu, and J.M. Macarulla, Phospholipid oxidation catalyzed by cytochrome-c in liposomes. Biochimica Et Biophysica Acta, 1985. 835(3): p. 549-556.

20. Radi, R., J.F. Turrens, and B.A. Freeman, Cytochrome-c-catalyzed membrane lipid-peroxidation by hydrogen-peroxide. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1991. 288(1): p. 118-125.

21. Bakan, A., A.A. Kapralov, H. Bayir, F.Z. Hu, V.E. Kagan, and I. Bahar, Inhibition ofperoxidase activity of cytochrome c: De novo compound discovery and validation. Molecular Pharmacology, 2015. 88(3): p. 421-427.

22. Atkinson, J., A.A. Kapralov, N. Yanamala, Y.Y. Tyurina, A.A. Amoscato, L. Pearce, J. Peterson, Z.T. Huang, J.F. Jiang, A.K. Samhan-Arias, A. Maeda, W.H. Feng, K. Wasserloos, N.A. Belikova, V.A. Tyurin, H. Wang, J. Fletcher, Y.S. Wang, I.I. Vlasova, J. Klein-Seetharaman, D.A. Stoyanovsky, H. Bayir, B.R. Pitt, M.W. Epperly, J.S. Greenberger, and V.E.

Kagan, A mitochondria-targeted inhibitor of cytochrome c peroxidase mitigates radiation-induced death. Nature Communications, 2011. 2.

23. Jiang, J.F., A. Bakan, A.A. Kapralov, K.I. Silva, Z.T. Huang, A.A. Amoscato, J. Peterson, V.K. Garapati, S. Saxena, H. Bayir, J. Atkinson, I. Bahar, and V.E. Kagan, Designing inhibitors of cytochrome c/cardiolipin peroxidase complexes: mitochondria-targeted imidazole-substituted fatty acids. Free Radical Biology and Medicine, 2014. 71: p. 221-230.

24. Lagoa, R., A.K. Samhan-Arias, and C. Gutierrez-Merino, Correlation between the potency offavonoids for cytochrome c reduction and inhibition of cardiolipin-induced peroxidase activity. Biofactors, 2017. 43(3): p. 451468.

25. Patriarca, A., T. Eliseo, F. Sinibaldi, M.C. Piro, R. Melis, M. Paci, D.O. Cicero, F. Polticelli, R. Santucci, and L. Fiorucci, ATP acts as a regulatory effector in modulating structural transitions of cytochrome c: Implications for apoptotic activity. Biochemistry, 2009. 48(15): p. 3279-3287.

26. Patriarca, A., F. Polticelli, M.C. Piro, F. Sinibaldi, G. Mei, M. Bari, R. Santucci, and L. Fiorucci, Conversion of cytochrome c into a peroxidase: Inhibitory mechanisms and implication for neurodegenerative diseases. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2012. 522(1): p. 62-69.

27. Brown, L.R. and K. Wuthrich, Spin label study of lipid oxidation catalyzed by heme proteins. Biochimica Et Biophysica Acta, 1977. 464(2): p. 356-369.

28. Belikova, N.A., Y.A. Vladimirov, A.N. Osipov, A.A. Kapralov, V.A. Tyurin, M.V. Potapovich, L.V. Basova, J. Peterson, I.V. Kurnikov, and V.E. Kagan, Peroxidase activity and structural transitions of cytochrome c bound to cardiolipin-containing membranes. Biochemistry, 2006. 45(15): p. 49985009.

29. Xu, J., T.K. Vanderlick, and P.A. Beales, Lytic and non-lytic permeabilization of cardiolipin-containing lipid bilayers induced by cytochrome c. Plos One, 2013. 8(7).

30. Luo, Y. and G.D. Brayer, High-resolution three-dimensional structure of horse heart cytochrome c.

http://www.rcsb.org/pdb/explore/jmol.do?structureId=1HRC&bionumber=1 (дата обращения: 24.11.2017), 1994.

31. Strahler, A., Science & Earth history1987.

32. Mavridou, D.A.I., S.J. Ferguson, and J.M. Stevens, Cytochrome c assembly. Iubmb Life, 2013. 65(3): p. 209-216.

33. Ambler, R.P., Sequence variability in bacterial cytochromes-c. Biochimica Et Biophysica Acta, 1991. 1058(1): p. 42-47.

34. Banci, L., I. Bertini, J.G. Huber, G.A. Spyroulias, and P. Turano, Solution structure of reduced horse heart cytochrome c. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 1999. 4(1): p. 21-31.

35. Bushnell, G.W., G.V. Louie, and G.D. Brayer, High-resolution 3-dimensional structure of horse heart cytochrome-c. Journal of Molecular Biology, 1990. 214(2): p. 585-595.

36. Stuart, R.A. and W. Neupert, Apocytochrome-c - an exceptional mitochondria/ precursor protein using an exceptional import pathway. Biochimie, 1990. 72(2-3): p. 115-121.

37. Takano, T. and R.E. Dickerson, Redox conformation changes in refined tuna cytochrome-c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences, 1980. 77(11): p. 6371-6375.

38. Stewart, J.M., J.A. Blakely, and M.D. Johnson, The interaction of ferrocytochrome c with long-chain fatty acids and their CoA and carnitine esters. Biochemistry and Cell Biology-Biochimie Et Biologie Cellulaire, 2000. 78(6): p. 675-681.

39. Hardesty, B.A. and H.K. Mitchell, Interaction offatty acids with mammalian cytochrome c. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1963. 100(1): p. 1&.

40. Nantes, I.L., M.R. Zucchi, O.R. Nascimento, and A. Faljoni-Alario, Effect of heme iron valence state on the conformation of cytochrome c and its association witt membrane inter/aces - A CD and EPR investigation. Journal of Biological Chemistry, 2001. 276(1): p. 153-158.

41. Kramer, D.M., A.G. Roberts, F. Muller, J. Cape, and M.K. Bowman, Q-cycle bypass reactions at the Qo site of the cytochrome bc1 (and related) complexes. Methods in enzymology, 2004. 382: p. 21-45.

42. Crofts, A.R., The cytochrome bc(1) complex: Function in the context of structure. Annual Review of Physiology, 2004. 66: p. 689-733.

43. Brazhe, N.A., A.B. Evlyukhin, E.A. Goodilin, A.A. Semenova, S.M. Novikov, S.I. Bozhevolnyi, B.N. Chichkov, A.S. Sarycheva, A.A. Baizhumanov, E.I. Nikelshparg, L.I. Deev, E.G. Maksimov, G.V. Maksimov, and O. Sosnovtseva, Probing cytochrome c in living mitochondria with surface-enhanced Raman spectroscopy. Scientific Reports, 2015. 5.

44. Susin, S.A., H.K. Lorenzo, N. Zamzami, I. Marzo, B.E. Snow, G.M. Brothers, J. Mangion, E. Jacotot, P. Costantini, M. Loeffler, N. Larochette, D.R. Goodlett, R. Aebersold, D.P. Siderovski, J.M. Penninger, and G. Kroemer, Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature, 1999. 397(6718): p. 441-446.

45. Nave, R., The TCA cycle electron transport systems. http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/biology/tca.html (дата обращения: 24.11.2017).

46. Dash, P., Mitochondria apoptosis. http://www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/apoptosis/mito2.jpg (дата обращения: 24.11.2017).

47. Tappel, A.L., The Mechanism of the oxidation of unsaturated fatty acids catalyzed by hematin compounds. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1953. 44(2): p. 378-395.

48. Paleus, S., A. Ehrenberg, and H. Tuppy, Study of a peptic degradation product of cytochrome-c .2. Investigation of the linkage between peptide

moiety and prosthetic group. Acta Chemica Scandinavica, 1955. 9(3): p. 365-374.

49. Tu, A.T., J.A. Reinosa, and Y.Y. Hsiao, Peroxidative activity of hemepeptides from horse heart cytochrome c. Experientia, 1968. 24(3): p. 219-&.

50. Nantes, I.L., A. Faljoni-Alario, A.E. Vercesi, K.E. Santos, and E.J.H. Bechara, Liposome effect on the cytochrome c-catalyzed peroxidation of carbonyl substrates to triplet species. Free Radical Biology and Medicine, 1998. 25(4-5): p. 546-553.

51. Vazquez-Duhalt, R., Cytochrome c as a biocata/yst. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic, 1999. 7(1-4): p. 241-249.

52. Diederix, R.E.M., M. Ubbink, and G.W. Canters, Peroxidase activity as a tool for studying the folding of c-type cytochromes. Biochemistry, 2002. 41(43): p. 13067-13077.

53. Lawrence, A., C.M. Jones, P. Wardman, and M.J. Burkitt, Evidence for the role of a peroxidase compound I-type intermediate in the oxidation of glutathione, NADH, ascorbate, and dichlorofluorescin by cytochrome c/H2O2 - Implications for oxidative stress during apoptosis. Journal of Biological Chemistry, 2003. 278(32): p. 29410-29419.

54. Hannibal, L., F. Tomasina, D.A. Capdevila, V. Demicheli, V. Tortora, D. Alvarez-Paggi, R. Jemmerson, D.H. Murgida, and R. Radi, Alternative conformations of cytochrome c: Structure, function, and detection. Biochemistry, 2016. 55(3): p. 407-428.

55. Kaschnitz, R.M. and Y. Hatefi, Lipid oxidation in biological-membranes -electron-transfer proteins as initiators of lipid autoxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1975. 171(1): p. 292-304.

56. Cadenas, E., A. Boveris, and B. Chance, Chemi-luminescence of lipid vesicles supplemented with cytochrome-c and hydroperoxide. Biochemical Journal, 1980. 188(3): p. 577-583.

57. Radi, R., K.M. Bush, and B.A. Freeman, The role of cytochrome-c and mitochondrial catalase in hydroperoxide-induced heart mitochondrial lipid-peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1993. 300(1): p. 409-415.

58. Tyurina, Y.Y., K. Kawai, V.A. Tyurin, S.X. Liu, V.E. Kagan, and J.P. Fabisiak, The plasma membrane is the site of selective phosphatidylserine oxidation during apoptosis: Role of cytochrome c. Antioxidants & Redox Signaling, 2004. 6(2): p. 209-225.

59. Everse, J., C.J.J. Liu, and P.W. Coates, Physical and catalytic properties of a peroxidase derived from cytochrome c. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease, 2011. 1812(9): p. 1138-1145.

60. Wang, Z.H., T. Matsuo, S. Nagao, and S. Hirota, Peroxidase activity enhancement of horse cytochrome c by dimerization. Organic & Biomolecular Chemistry, 2011. 9(13): p. 4766-4769.

61. Камышный, А.Л., Е.С. Чухрай, и О.М. Полторак, Пероксидазная активность цитохрома с в водном растворе и в адсорбционных слоях.

Вестник Московского университета. Серия 2: Химия, 1973. 14(2): p. 142-145.

62. Abriata, L.A., A. Cassina, V. Tortora, M. Marin, J.M. Souza, L. Castro, A.J. Vila, and R. Radi, Nitration of solvent-exposed tyrosine 74 on cytochrome c triggers heme iron-methionine 80 bond disruption. Nuclear magnetic resonance and optical spectroscopy studies. Journal of Biological Chemistry, 2009. 284(1): p. 17-26.

63. Chen, Y.R., L.J. Deterding, B.E. Sturgeon, K.B. Tomer, and R.P. Mason, Protein oxidation of cytochrome c by reactive halogen species enhances its peroxidase activity. Journal of Biological Chemistry, 2002. 277(33): p. 29781-29791.

64. Aluri, H.S., D.C. Simpson, J.C. Allegood, Y. Hu, K. Szczepanek, S. Gronert, Q. Chen, and E.J. Lesnefsky, Electron flow into cytochrome c coupled with reactive oxygen species from the electron transport chain converts cytochrome c to a cardiolipin peroxidase: role during ischemia-reper/usion. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects, 2014. 1840(11): p. 3199-3207.

65. Rajagopal, B.S., A.N. Edzuma, M.A. Hough, K.L.I.M. Blundell, V.E. Kagan, A.A. Kapralov, L.A. Fraser, J.N. Butt, G.G. Silkstone, M.T. Wilson, D.A. Svistunenko, and J.A.R. Worrall, The hydrogen-peroxide-induced radical behaviour in human cytochrome c-phospholipid complexes: implications for the enhanced pro-apoptotic activity of the G41S mutant. Biochemical Journal, 2013. 456: p. 441-452.

66. Josephs, T.M., I.M. Morison, C.L. Day, S.M. Wilbanks, and E.C. Ledgerwood, Enhancing the peroxidase activity of cytochrome c by mutation of residue 41: implications for the peroxidase mechanism and cytochrome c release. Biochemical Journal, 2014. 458: p. 259-265.

67. Azzi, A., C. Montecucco, and C. Richter, Use of acetylated ferricytochrome-c for detection of superoxide radicals produced in biological-membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1975. 65(2): p. 597-603.

68. Skulachev, V.P., Cytochrome c in the apoptotic and antioxidant cascades. Febs Letters, 1998. 423(3): p. 275-280.

69. Korshunov, S.S., B.F. Krasnikov, M.O. Pereverzev, and V.P. Skulachev, The antioxidant functions of cytochrome c. FEBS Letters, 1999. 462(1-2): p. 192-198.

70. Pepelina, T.Y., R.V. Chertkova, T.V. Ostroverkhova, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov, V.G. Grivennikova, and A.D. Vinogradov, Site-directed mutagenesis of cytochrome c: Reactions with respiratory chain components and superoxide radical. Biochemistry-Moscow, 2009. 74(6): p. 625-632.

71. Kim, J.Y., M. Mosior, L.A. Chung, H. Wu, and S. Mclaughlin, Binding of peptides with basic residues to membranes containing acidic phospholipids. Biophysical Journal, 1991. 60(1): p. 135-148.

72. Heimburg, T., B. Angerstein, and D. Marsh, Binding ofperipheral proteins to mixed lipid membranes: Effect oflipid demixing upon binding. Biophysical Journal, 1999. 76(5): p. 2575-2586.

73. Pataraia, S., Y.G. Liu, R. Lipowsky, and R. Dimova, Effect of cytochrome c on the phase behavior of charged multicomponent lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 2014. 1838(8): p. 20362045.

74. Rytomaa, M., P. Mustonen, and P.K.J. Kinnunen, Reversible, nonionic, and pH-dependent association of cytochrome-c with cardiolipin-phosphatidylcholine liposomes. Journal of Biological Chemistry, 1992. 267(31): p. 22243-22248.

75. Sinibaldi, F., L. Fiorucci, A. Patriarca, R. Lauceri, T. Ferri, M. Coletta, and R. Santucci, Insights into cytochrome c-cardiolipin interaction. Role played by ionic strength. Biochemistry, 2008. 47(26): p. 6928-6935.

76. Sinibaldi, F., E. Droghetti, F. Polticelli, M.C. Piro, D. Di Pierro, T. Ferri, G. Smulevich, and R. Santucci, The effects ofATP and sodium chloride on the cytochrome c-cardiolipin interaction: The contrasting behavior of the horse heart and _yeast proteins. Journal of Inorganic Biochemistry, 2011. 105(11): p. 1365-1372.

77. Rytomaa, M. and P.K.J. Kinnunen, Reversibility of the binding of cytochrome-c to liposomes - Implications for lipid-protein interactions. Journal of Biological Chemistry, 1995. 270(7): p. 3197-3202.

78. Vincent, J.S., H. Kon, and I.W. Levin, Low-temperature electron-paramagnetic resonance study of the ferricytochrome c-cardiolipin complex. Biochemistry, 1987. 26(8): p. 2312-2314.

79. Vincent, J.S. and I.W. Levin, Interaction offerricytochrome-c with zwitterionic phospholipid-bilayers - a raman-spectroscopic study. Biochemistry, 1988. 27(9): p. 3438-3446.

80. Spooner, P.J.R. and A. Watts, Reversible unfolding of cytochrome-c upon interaction with cardiolipin bilayers . 1. Evidence from deuterium NMR measurements. Biochemistry, 1991. 30(16): p. 3871-3879.

81. Milazzo, L., L. Tognaccini, B.D. Howes, F. Sinibaldi, M.C. Piro, M. Fittipaldi, M.C. Baratto, R. Pogni, R. Santucci, and G. Smulevich, Unravelling the non-native low-spin state of the cytochrome c-cardiolipin complex: Evidence of the formation of a His-ligated species only. Biochemistry, 2017. 56(13): p. 1887-1898.

82. Hanske, J., J.R. Toffey, A.M. Morenz, A.J. Bonilla, K.H. Schiavoni, and E.V. Pletneva, Conformational properties of cardiolipin-bound cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012. 109(1): p. 125-130.

83. Muenzner, J. and E.V. Pletneva, Structural transformations of cytochrome c upon interaction with cardiolipin. Chemistry and Physics of Lipids, 2014. 179: p. 57-63.

84. Mandal, A., C.L. Hoop, M. DeLucia, R. Kodali, V.E. Kagan, J. Ahn, and P.C.A. van der Wel, Structural changes and proapoptotic peroxidase

activity of cardio/ipin-bound mitochondria/ cytochrome c. Biophysical Journal, 2015. 109(9): p. 1873-1884.

85. Владимиров, Ю.А., Е.В. Проскурнина, Д.Ю. Измайлов, А.А. Новиков, А.А. Брусничкин, А.Н. Осипов, и В.Е. Каган, Механизм активации пероксидазной активности цитохрома с кардиолипином. Биохимия, 2006. 71(9): p. 1215-1224.

86. Владимиров, Ю.А., Е.В. Проскурнина, Д.Ю. Измайлов, А.А. Новиков, А.В. Брусничкин, А.Н. Осипов, и В.Е. Каган, Кардиолипин активирует пероксидазную активность цитохрома с, потому что увеличивает доступность железа гема для H2O2. Биохимия, 2006. 71(9): p. 12251233.

87. Pangborn, M.C., Isolation and purification of a sero/ogica//y active phospho/ipidfrom beef heart. Journal of Biological Chemistry, 1942. 143(1): p. 247-256.

88. Haiens, T.H. and N.A. Dencher, Cardio/ipin: a proton trap for oxidative phosphory/ation. Febs Letters, 2002. 528(1-3): p. 35-39.

89. AvantiPolarLipids, Heart CA. https://avantilipids.com/product/840012/ (дата обращения: 24.11.2017).

90. Sinibaldi, F., L. Milazzo, B.D. Howes, M.C. Piro, L. Fiorucci, F. Polticelli, P. Ascenzi, M. Coletta, G. Smulevich, and R. Santucci, The key ro/e p/ayed by charge in the interaction of cytochrome c with cardio/ipin. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 2017. 22(1): p. 19-29.

91. Sinibaldi, F., B.D. Howes, M.C. Piro, F. Polticelli, C. Bombelli, T. Ferri, M. Coletta, G. Smulevich, and R. Santucci, Extended cardio/ipin anchorage to cytochrome c: a mode/ for protein-mitochondria/ membrane binding. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 2010. 15(5): p. 689-700.

92. Zuckermann, M.J. and T. Heimburg, Insertion and pore formation driven by adsorption ofproteins onto /ipid bi/ayer membrane-water inter/aces. Biophysical Journal, 2001. 81(5): p. 2458-2472.

93. Choi, E.J. and E.K. Dimitriadis, Cytochrome c adsorption to supported, anionic /ipid bi/ayers studied via atomic force microscopy. Biophysical Journal, 2004. 87(5): p. 3234-3241.

94. Kitt, J.P., D.A. Bryce, S.D. Minteer, and J.M. Harris, Raman spectroscopy revea/s se/ective interactions of cytochrome c with cardio/ipin that corre/ate with membrane permeabi/ity. Journal of the American Chemical Society, 2017. 139(10): p. 3851-3860.

95. Heimburg, T. and D. Marsh, Protein surface-distribution and proteinprotein interactions in the binding ofperiphera/ proteins to charged /ipid-membranes. Biophysical Journal, 1995. 68(2): p. 536-546.

96. Kostrzewa, A., T. Pali, W. Froncisz, and D. Marsh, Membrane /ocation of spin-/abe/ed cytochrome c determined by paramagnetic re/axation agents. Biochemistry, 2000. 39(20): p. 6066-6074.

97. Oellerich, S., S. Lecomte, M. Paternostre, T. Heimburg, and P. Hildebrandt, Periphera/ and integra/ binding of cytochrome c to phospho/ipids vesic/es. Journal of Physical Chemistry B, 2004. 108(12): p. 3871-3878.

98. Gorbenko, G.P., J.G. Molotkovsky, and P.K.J. Kinnunen, Cytochrome c interaction with cardiolipin/phosphatidylcholine model membranes: Effect of cardiolipin protonation. Biophysical Journal, 2006. 90(11): p. 4093-4103.

99. Kimelberg, H.K. and D. Papahadjopoulos, Interactions of basic proteins with phospholipid membranes - binding and changes in sodium permeability ofphosphatidylserine vesicles. Journal of Biological Chemistry, 1971. 246(4): p. 1142-+.

100. Papahadjopoulos, D., M. Moscarello, E.H. Eylar, and T. Isac, Effects of proteins on thermotropic phase-transitions ofphospholipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta, 1975. 401(3): p. 317-335.

101. Vermeer, L.S. and J.A. Mason, Magainin structure. http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=2LSA (дата обращения: 24.11.2017).

102. Matsuzaki, K., Y. Mitani, K. Akada, O. Murase, S. Yoneyama, M. Zasloff, and K. Miyajima, Mechanism of synergism between antimicrobial peptides magainin 2 and PGLa. Biochemistry, 1998. 37(43): p. 15144-15153.

103. Matsuzaki, K., Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 1999. 1462(1-2): p. 1-10.

104. Matsuzaki, K., O. Murase, N. Fujii, and K. Miyajima, An antimicrobial peptide, magainin 2, induced rapid flip-flop ofphospholipids coupled with pore formation and peptide translocation. Biochemistry, 1996. 35(35): p. 11361-11368.

105. Ludtke, S.J., K. He, W.T. Heller, T.A. Harroun, L. Yang, and H.W. Huang, Membrane pores induced by magainin. Biochemistry, 1996. 35(43): p. 13723-13728.

106. Собко, А.А., Белково-липидная пора, образуемая колицином Е1 в бислойных липидных мембранах. Диссертация к.х.н. , 2006: p. 10-16.

107. Valcarcel, C.A., M. Dalla Serra, C. Potrich, I. Bernhart, M. Tejuca, D. Martinez, F. Pazos, M.E. Lanio, and G. Menestrina, Effects of lipid composition on membrane permeabilization by sticholysin I and II, two cytolysins of the sea anemone Stichodactyla helianthus. Biophysical Journal, 2001. 80(6): p. 2761-2774.

108. Yamaguchi, M. and K. Kasamo, Modulation in the activity ofpurzfied tonoplast H+-ATPase by tonoplast glycolipids preparedfrom cultured rice (Oryza sativa L. var. boro) cells. Plant and Cell Physiology, 2001. 42(5): p. 516-523.

109. Chen, R.F. and J.R. Knutson, Mechanism offluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes - energy-transfer to nonfluorescent dimers. Analytical Biochemistry, 1988. 172(1): p. 61-77.

110. Перевощикова, И.В., Е.А. Котова, и Ю.Н. Антоненко, Флуоресцентная корреляционная спектроскопия в биологии, химии и медицине. Биохимия, 2011. 76(5): p. 613-635.

111. Sengupta, P., K. Garai, J. Balaji, N. Periasamy, and S. Maiti, Measuring size distribution in highly heterogeneous systems with fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal, 2003. 84(3): p. 1977-1984.

112. Blicher, A., K. Wodzinska, M. Fidorra, M. Winterhalter, and T. Heimburg, The temperature dependence of lipid membrane permeability, its quantized nature, and the influence of anesthetics. Biophysical Journal, 2009. 96(11): p. 4581-4591.

113. Владимиров, Ю.А. и Е.В. Проскурнина, Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция. Успехи биологической химии, 2009. 49: p. 341-388.

114. Zhao, B.Z., F.A. Summers, and R.P. Mason, Photooxidation ofAmplex red to resorufin: Implications of exposing the Amplex red assay to light. Free Radical Biology and Medicine, 2012. 53(5): p. 1080-1087.

115. Freyer, M.W. and E.A. Lewis, Isothermal titration calorimetry: Experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Biophysical Tools for Biologists: Vol 1 in Vitro Techniques, 2008. 84: p. 79-113.

116. Martinez, J.C., J. Murciano-Calles, E.S. Cobos, M. Iglesias-Bexiga, I. Luque, and J. Ruiz-Sanz, Isothermal titration calorimetry: Thermodynamic analysis of the binding thermograms of molecular recognition events by using equilibrium models, in applications of calorimetry in a wide context— differential scanning calorimetry, isothermal titration calorimetry and microcalorimetry, E.A. A., Editor 2013, InTech.

117. Mustonen, P., J.A. Virtanen, P.J. Somerharju, and P.K.J. Kinnunen, Binding of cytochrome-c to liposomes as revealed by the quenching offluorescence from pyrene-labeled phospholipids. Biochemistry, 1987. 26(11): p. 29912997.

118. Mueller, P., W.C. Wescott, D.O. Rudin, and H.T. Tien, Methods for formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution. Journal of Physical Chemistry, 1963. 67(2): p. 534-&.

119. Singh, A.P., G.A. Chanady, and P. Nicholls, Interactions involving the cyanine dye, Dis-C3-(5), cytochrome-c and liposomes and their implications for estimations of delta-psi in cytochrome-c oxidase-reconstituted proteoliposomes. Journal of Membrane Biology, 1985. 84(2): p. 183-190.

120. Tatsu, Y., S. Yamamura, H. Yamamoto, and S. Yoshikawa, Peroxidase-dependent fluorescence decrease of carboxyfluorescein and its enhancement by liposome encapsulation - application to the enzymatic determination of hydrogen-peroxide. Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 1995. 351(8): p. 782-785.

121. Borisenko, G.G., A.A. Kapralov, V.A. Tyurin, A. Maeda, D.A. Stoyanovsky, and V.E. Kagan, Molecular design of new inhibitors of peroxidase activity of cytochrome c/cardiolipin complexes: Fluorescent oxadiazole-derivatized cardiolipin. Biochemistry, 2008. 47(51): p. 1369913710.

122. Schlamme, M., S. Brody, and K.Y. Hostetler, Mitochondrial cardiolipin in diverse eukaryotes - comparison of biosynthetic reactions and molecular acyl species. European Journal of Biochemistry, 1993. 212(3): p. 727-735.

123. Heimburg, T. and R.L. Biltonen, Thermotropic behavior of dimyristoylphosphatidylglycerol and its interaction with cytochrome-c. Biochemistry, 1994. 33(32): p. 9477-9488.

124. Zhang, F.L. and E.S. Rowe, Calorimetric studies of the interactions of cytochrome-c with dioleoylphosphatidylglycerol extruded vesicles - ionic-strength effects. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 1994. 1193(2): p. 219-225.

125. Capdevila, D.A., S.O. Rouco, F. Tomasina, V. Tortora, V. Demicheli, R. Radi, and D.H. Murgida, Active site structure andperoxidase activity of oxidatively modified cytochrome c species in complexes with cardiolipin. Biochemistry, 2015. 54(51): p. 7491-7504.

126. Florence, T.M., The degradation of cytochrome-c by hydrogen-peroxide. Journal of Inorganic Biochemistry, 1985. 23(2): p. 131-141.

127. Zhu, S., I.G. Stavrovskaya, M. Drozda, B.Y.S. Kim, V. Ona, M.W. Li, S. Sarang, A.S. Liu, D.M. Hartley, C.W. Du, S. Gullans, R.J. Ferrante, S. Przedborski, B.S. Kristal, and R.M. Friedlander, Minocycline inhibits cytochrome c release and delays progression of amyotrophic lateral sclerosis in mice. Nature, 2002. 417(6884): p. 74-78.

128. Wang, X., S. Zhu, M. Drozda, W.H. Zhang, I.G. Stavrovskaya, E. Cattaneo, R.J. Ferrante, B.S. Kristal, and R.M. Friedlander, Minocycline inhibits caspase-independent and -dependent mitochondrial cell death pathways in models of Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003. 100(18): p. 10483-10487.

129. Teng, Y.D., H. Choi, R.C. Onario, S. Zhu, F.C. Desilets, S.M. Lan, E.J. Woodard, E.Y. Snyder, M.E. Eichler, and R.M. Friedlander, Minocycline inhibits contusion-triggered mitochondrial cytochrome c release and mitigates functional deficits after spinal cord injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004. 101(9): p. 3071-3076.

130. Matsuki, S., Y. Iuchi, Y. Ikeda, I. Sasagawa, Y. Tomita, and J. Fujii, Suppression of cytochrome c release and apoptosis in testes with heat stress by minocycline. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003. 312(3): p. 843-849.

131. Antonenko, Y.N., T.I. Rokitskaya, A.J.L. Cooper, and B.F. Krasnikov, Minocycline chelates Ca2+, binds to membranes, and depolarizes mitochondria by formation of Ca2+-dependent ion channels. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2010. 42(2): p. 151-163.

132. Antonenko, Y.N., A.V. Avetisyan, L.E. Bakeeva, B.V. Chernyak, V.A. Chertkov, L.V. Domnina, O.Y. Ivanova, D.S. Izyumov, L.S. Khailova, S.S. Klishin, G.A. Korshunova, K.G. Lyamzaev, M.S. Muntyan, O.K. Nepryakhina, A.A. Pashkovskaya, O.Y. Pletjushkina, A.V. Pustovidko, V.A. Roginsky, T.I. Rokitskaya, E.K. Ruuge, V.B. Saprunova, I.I. Severina, R.A.

Simonyan, I.V. Skulachev, M.V. Skulachev, N.V. Sumbatyan, I.V. Sviryaeva, V.N. Tashlitsky, J.M. Vassiliev, M.Y. Vyssokikh, L.S. Yaguzhinsky, A.A. Zamyatnin, and V.P. Skulachev, Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives as tools to interrupt execution of the aging program. 1. Cationic plastoquinone derivatives: Synthesis and in vitro studies. Biochemistry-Moscow, 2008. 73(12): p. 1273-1287.

133. James, A.M., M.S. Sharpley, A.R.B. Manas, F.E. Frerman, J. Hirst, R.A.J. Smith, and M.P. Murphy, Interaction of the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ with phospholipid bilayers and ubiquinone oxidoreductases. Journal of Biological Chemistry, 2007. 282(20): p. 1470814718.

134. Pharmacosmos, Physical properties ofdextran. https://www.dextran.net/about-dextran/dextran-chemistry/physical-properties.aspx (дата обращения: 24.11.2017).

135. Vodyanoy, I. and S.M. Bezrukov, Sizing of an ion pore by access resistance measurements. Biophysical Journal, 1992. 62(1): p. 10-11.

136. Cwiklik, L. and P. Jungwirth, Massive oxidation ofphospholipid membranes leads to pore creation and bilayer disintegration. Chemical Physics Letters, 2010. 486(4-6): p. 99-103.

137. Zhivotovsky, B., S. Orrenius, O.T. Brustugun, and S.O. Doskeland, Injected cytochrome c induces apoptosis. Nature, 1998. 391(6666): p. 449-450.

138. Kuwana, T., M.R. Mackey, G. Perkins, M.H. Ellisman, M. Latterich, R. Schneiter, D.R. Green, and D.D. Newmeyer, Bid, Bax, and lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. Cell, 2002. 111(3): p. 331-342.

139. Ott, M., J.D. Robertson, V. Gogvadze, B. Zhivotovsky, and S. Orrenius, Cytochrome c release from mitochondria proceeds by a two-step process. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002. 99(3): p. 1259-1263.

140. Firsov, A.M., E.A. Kotova, E.A. Korepanova, A.N. Osipov, and Y.N. Antonenko, Peroxidative permeabilization of liposomes induced by cytochrome c/cardiolipin complex. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 2015. 1848(3): p. 767-774.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.