Поиск эндогенных эффекторов ангиотензин-превращающего фермента человека в плазме крови человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Крюкова, Ольга Владимировна

• Крюкова, Ольга Владимировна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Крюкова, Ольга Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕМ ФЕРМЕНТЕ

2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ИЗМЕНЕНИЙ ПОВЕРХНОСТИ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

3. ЭНДОГЕННЫЕ ЭФФЕКТОРЫ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

3.1. Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, способные поступать в организм человека с

продуктами питания

3.2. Эндогенные ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента

3.3. Эндогенные активаторы ангиотензин-превращающего фермента

3.4. Эффектор, способный связываться с ангиотензин-превращающим ферментом, но не обладающий ингибирующим или активирующим действием на фермент

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Материалы

4.2. Методы исследования

4.2.1. Синтез аффинного сорбента

4.2.2. Выделение и очистка соматического ангиотензин-превращающего фермента

4.2.3. Определение активности соматического ангиотензин-превращающего фермента

4.2.5. Определение концентрации активных молекул выделенных соматических ангаотензин-превращающих ферментов из разных источников

4.2.6. Иммобилизация соматического ангиотензин-превращающего фермента быка

4.2.7. Определение связывания моноклональных антител c ангиотензин-превращающим ферментом

4.2.8. Диализ плазмы крови человека и раствора рекомбинантного соматического ангиотензин-превращающего фермента человека

4.2.9. Определение влияния разбавления плазмы крови и тушения компонентами плазмы на активность АПФ человека

4.2.10. Ультрацентрифугирование образцов плазмы крови человека на фильтрах с различным диаметром пор мембраны

4.2.11. Ингибирование активности очищенного ангиотензин-превращающего фермента и отдельных доменов фермента под действием фильтратов плазмы

4.2.12. Ингибирование активности очищенного гиотензин-превращающего фермента эналаприлатом и тепротидом

4.2.13. Хроматография 3 кДа фильтратов плазмы крови человека на колонке PeptideSuperdex 10/300

4.2.14. Оценка площади поверхности фермента, покрываемой олигосахаридом

4.2.15. Десиалилирование ангиотензин превращающего фермента

4.2.16. Протеолиз ангиотензин превращающего фермента и масс-спектрометрия

4.2.17. Определение возможности ингибирования АПФ быка билирубином

4.2.18. Статистическая обработка результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

5. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПУЛА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ОЧИЩЕННЫХ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКОВ

5.1 Подготовка пула плазмы крови

5.2. Выделение и очистка ангиотензин-превращающего фермента из разных источников

6. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРИРОДЫ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА НА ЕГО КАТАЛИТИЧЕСКИЕ И КОНФОРМАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

6.1. Активность и ингибирование ангиотензин-превращающего фермента из семенной жидкости и из

легких

6.2. Иммунологическая характеристика ангиотензин-превращающего фермента из легких и семенной жидкости человека

6.3. Определение сайтов Ы-гликозилирования в ангиотензин-превращающем ферменте из легких и из семенной жидкости

6.4 Сравнительная оценка влияния компонентов биологических жидкостей на конформацию поверхности ангиотензин-превращающего фермента из легких и семенной жидкости

7. ПОИСК ЭНДОГЕННЫХ ИНГИБИТОРОВ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

7.1 Влияние разбавления плазмы крови человека на определяемую активность ангиотензин-

превращающего фермента

7.2. Влияние диализа на активность ангиотензин-превращающего фермента в плазме крови человека

7.3. Влияние фильтрования на мембранах с различной пропускной способностью на активность ангиотензин-превращающего фермента в составе плазмы крови человека

7.4. Ингибирование отдельных доменов ангиотензин-превращающего фермента 3кДа фильтратом плазмы крови человека

8. ПОИСК ЭНДОГЕННЫХ ЭФФЕКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА КОНФОРМАЦИЮ ПОВЕРХНОСТИ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

8.1. Определение влияния разбавления плазмы крови на эффективность связывания моноклональных

антител с ангиотензин-превращающим ферментом в составе плазмы крови человека

8.2. Определение влияния очистки ангиотензин-превращающего фермента из плазмы крови на связывание моноклональных антител

8.3. Проверка возможной видовой специфичности эндогенного эффектора, содержащегося в плазме крови человека

8.4. Влияние диализа на связывание моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом в составе плазмы крови человека

8.5. Влияние ультрафильтрации плазмы крови на фильтрах с различной пропускной способностью мембран на эффективность связывания моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом в составе плазмы

8.6. Влияние фильтратов плазмы на связывание моноклональных антител с очищенным ангиотензин-превращающим ферментом человека

8.7. Определение связывания моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом при добавлении фильтратов и экзогенных ингибиторов к плазме крови

9. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭФФЕКТОРОВ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

9. Характеристика низкомолекулярного эффектора в плазме крови человека

9.2 Разделение компонентов 3 кДа фильтрата плазмы крови методом гель-фильтрацией

9.4. Анализ фракций

9.5. Определение возможности ингибирования ангиотензин-превращающего фермента быка билирубином

9.6. Разделение смеси билирубина, эналаприлата и тепротида методом гель-фильтрацией

9.7. Влияния билирубина на связывание панели мАт с ангиотензин-превращающим ферментом

9.8. Высокомолекулярныйэффектор ангиотензин-превращающего фермента в плазме крови человека

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПФ - ангиотензинЛ-превращающий фермент; СНО - клетки яичников китайского хомячка;

Хепес (Hepes) - 4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазинэтансульфоновая кислота;

FA-Phe-Gly-Gly (FPGG) - Na-3-(2-фурил)-акрилоил-L-фенилаланил-L-глицил-L-глицин;

Cbz-Phe-His-Leu (ZPHL)-карбобензокси-L-фенилаланил-L-гистидил-L-лейцин;

Hip-His-Leu (HHL) - гиппурил-L-гистидил-L-лейцин;

His-Leu (КЬ)-Ь-гистидил-Ь-лейцин;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ЧСА - человеческий сывороточный альбумин;

мАт- моноклональные антитела;

Ds-Na - додецилсульфат натрия;

wtД - рекомбинантный фермент, без якоря;

Ds-Na - додецилсульфат натрия

Лизиноприл - (8)-Ма-(1-карбокси-3-фенилиропил)-Ь-лизил-Ь-пролин Эналаприлат - (25)-1 -[(25)-2-{[(18)-1 -карбокси-3 -фенилпропил] амино }пропаноил] -пирролидин-2-карбоновая кислота Тепротид - <Glp-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro

Буфер А - 50мМ фосфатный буфер, содержащий 0,15 М ШО, 1 мкМ ZnCl2,рН 7,5; Буфер Б - 50мМ боратный буфер, pH 9,5;

Буфер В - 50 мM Hepes-буфер, содержащий 150 мМ NaCl и 1 мкМ ZnCl2, pH 7,5; Буфер Г - 100мМ фосфатный буфер, содержащий 0,3 М ШО и 1мкМ ZnСl2, рН 8,3; Буфер Д - 100 мM Hepes-буфер, содержащий 150 мМ ШО и 1 мкМ ZnCl2, pH 7,5;

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск эндогенных эффекторов ангиотензин-превращающего фермента человека в плазме крови человека»

ВВЕДЕНИЕ

Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидаза А, КФ 3.4.15.1) является одним из важнейших составляющих и связующим звеном ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем. Его тщательное и многолетнее исследование вызвано участием этого фермента в многочисленных процессах, связанных с регуляцией кровяного давления, кроветворением, репродукцией, нейромедиаторной функцией и т.д. Сегодня фармацевтическая промышленность выпускает в огромном количестве ингибиторы АПФ в качестве эффективных лекарственных гипотензивных средств.

Экзогенные ингибиторы АПФ поступают в организм человека в различных вариантах (как в виде специально принимаемых лекарств, так и с пищей), однако имеются сведения о существовании и эндогенных ингибиторов, которые для некоторых млекопитающих были даже выделены. Можно предполагать, что они служат для того, чтобы часть активности АПФ в организме была «непроявленной», а смещение равновесия «фермент-ингибитор» протекало при физиологической необходимости или в случае патологий. Не исключено также, что, помимо влияния на собственно активность фермента, при связывании эндогенных ингибиторов могут изменяться и физиологические функции АПФ, напрямую не связанные с пептидазной активностью. Более того, вероятно, что АПФ в различных тканях, а также в составе биологических жидкостей, способен образовывать комплексы с другими белками и низкомолекулярными соединениями не являющиеся ингибиторами, которые тем не менее способны модулировать физиологические функции фермента.

Поэтому проблема доказательства существования эндогенных ингибиторов и эффекторов АПФ в организме человека, определение их природы для подробного исследования является чрезвычайно актуальной. Именно в рамках этой проблемы и проведена данная работа.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕМ ФЕРМЕНТЕ

Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидаза А, КФ 3.4.15.1) -цинк-металлопептидаза, относящаяся к классу глюцинкинов, интегральный мембранный белок типа I, располагающийся на мембране с помощью трансмембранного якоря с С-конца полипептидной цепи. АПФ функционирует в организме в основном как пептидил-дипептидаза, отщепляя С-концевые дипептиды у ангиотензина I и брадикинина, являющихся компонентами ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем, соответственно. Отщепление С-концевого дипептида от вазонеактивного ангиотензина I приводит к образованию октапептида ангиотензина II, который является одним из наиболее важных констрикторов-то есть вызывающих спазмы кровеносных сосудов. Катализируемое АПФ последовательное удаление двух С-концевых дипептидов приводит к деградации вазоактивного нонапептида брадикинина, который вызывает расслабление стенок кровеносных сосудов и увеличение проницаемости капилляров. Таким образом, основная и наиболее известная функция АПФ в организме заключается в регуляции кровяного давления, как общего, так и местного [1,2]. Физиологическая значимость АПФ определяет широкое применение его ингибиторов в терапевтической практике для лечения гипертонии и сердечно-сосудистой недостаточности [3].

Помимо регуляции артериального давления АПФ принимает участие и в других физиологических процессах. АПФ расщепляет такие пептиды, как вещество Р [4], нейротензин [4], люлиберин [5], отрицательный регулятор гемопоэза (АсББКР) [6], бета-амилоидный пептид [7] и др. Таким образом, АПФ вовлечен в работу центральной нервной системы, в регуляцию эмоций, передачу болевого сигнала, в течение воспалительных, иммунных процессов и др.

В организме синтезируются две изоформы фермента. Соматическая форма с молекулярной массой от 150 до 180 кДа, состоящая из двух гомологичных доменов (рис 1) экспрессирована в эндотелиальных, эпителиальных и нервных клетках [8-9], выполняет основные физиологические функции АПФ в организме. Также в организме синтезируется и более легкая тестикулярная изоформа с молекулярной массой от 90 до 110 кДа, найденная в сперматозоидах и семенниках (рис 1) [10-11]. Тестикулярный АПФ необходим для репродуктивных функций. Механизмы участия тестикулярного АПФ в оплодотворении пока не выяснены окончательно. Было показано, что у мышей с нокаутом каталитической функции тестикулярного АПФ, но с сохранением его как белка с содержанием,

соответствующим содержанию у нормальных особей, репродуктивная функция резко снижалась, их потомство составляло лишь 4 % от потомства нормы [12].

Рис. 1. Схематическое представление различных форм ангиотензин-превращающего фермента.

Однако, с другой стороны, не было получено никаких доказательств действия ингибиторов АПФ на репродуктивную функцию у пациентов [13], что может быть связано и с неспособностью полностью ингибировать тестикулярный АПФ взятой в исследовании дозой ингибитора АПФ. Кроме того, была выдвинута гипотеза, что роль тестикулярного фермента в репродуктивной функции может заключаться не в его дипептидазной активности, а другой специфической, а именно, его способности гидролизовать и "слущивать с поверхности" мембранные белки, закрепленные на мембране с помощью гликозилфосфатидилинозитольного (GPI-) якоря [14]. Однако, эта гипотеза была оспорена другими исследованиями [12,15]. Таким образом, точная роль тестикулярного АПФ в репродуктивной функции мужчин остается неизвестной.

Гомология доменов в молекуле АПФ составляет 67-73% (в зависимости от вида), а в центральной части доменов, содержащей цинк-связывающий мотив HEMGH (рис. 1),

идентичность аминокислотных остатков достигает 89%. Полагают, что эта особенность структуры АПФ является результатом дупликации гена, кодировавшего однодоменный фермент [16]. У человека ген АПФ локализован в длинном плече 17 хромосомы [17], он имеет длину порядка 21 тысячи пар нуклеотидов и состоит из 25 интронов и 26 экзонов [18]. Ген кодирует обе изоформы АПФ, как соматическую, так и тестикулярную, при этом транскрипция каждой инициируется разными промоторами. Соматическая изоформа транскрибируется с 5'-конца первого экзона, при этом зрелая мРНК содержит все экзоны с 1 по 26, кроме 13, который удаляется при сплайсинге [18]. Тестикулярный АПФ начинает транскрибироваться с промотора длиной в 91 пару нуклеотидов, находящегося в 12 интроне гена АПФ; его зрелая мРНК содержит экзоны гена АПФ с 13 по 26 [19]. Это позволяет заключить, что в 13 экзоне закодирована уникальная для тестикулярного АПФ последовательность вплоть до 36 аминокислотного остатка, а экзоны с 14 по 26 содержат совпадающую у обеих изоформ последовательность С-домена АПФ. Экзоны 4-11 и 17-24, которые кодируют области N и С-доменов соответственно, очень близки как по размеру, так и по нуклеотидной последовательности [18].

У АПФ человека в процессе посттрансляционной модификации с №конца фермента отщепляется сигнальный гидрофобный пептид, состоящий из 29 аминокислот. Оставшиеся аминокислоты подразделяются на следующие участки: С-концевые 30 аминокислот располагаются внутриклеточно и составляют цитоплазматический домен, далее идет гидрофобная трансмембранная последовательность из 19 аминокислот, прикрепляющая верхнюю основную часть белка к поверхности клетки. Верхняя основная часть фермента содержит два гомологичных структурных домена, названных N и С-доменами и отделенных друг от друга пептидной перемычкой [20]. Между С-доменом и трансмембранным участком, в непосредственной близости от клеточной мембраны, располагается так называемый стебельковый участок (рис 1). Характерной особенностью АПФ является зависимость его активности от присутствия в среде анионов хлора [21-22]. В своем составе С-домен имеет два потенциальных сайта связывания ионов хлора, в то время, как №домен содержит только один такой сайт. Оба домена содержат три дисульфидных мостика и свободный цистеин [2].

Форма АПФ представляющая собой №домен белка (рис 1), была обнаружена в значительных количествах в кишечной жидкости больных при хирургических операциях [23]. Вероятно, индивидуальный №домен АПФ, продуцируется в организме под действием ограниченного протеолиза соматической формы фермента [24-25].

Свои основные физиологические функции АПФ исполняет, будучи закрепленным на клеточной мембране [1]. Однако, при помощи специальной секретазы возможен переход

1С

его из мембраносвязанного состояния в растворимое путем расщепления полипептидной цепи в примембранной области, называемый шеддингом [26-27]. Шеддинг может зависеть от множества причин, таких, например, как связывание фермента на мембране с антителом [28-29] или наличия мутаций АПФ в примембранной области[30-31].

АПФ, находящийся в растворенной форме, присутствует в организме в биологических жидкостях: плазме крови и семенной жидкости [1], лимфе и спинно-мозговой жидкости [32]. Концентрация АПФ в биологических жидкостях является весьма важным клиническим параметром; ее повышение или понижение может сопровождать различные заболевания; так, у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких, раком легких, туберкулезом и муковисцидозом был значительно снижен уровень АПФ в сыворотке крови по сравнению с контролем [33], а у пациентов с системными заболеваниями, такими, как саркоидоз [33-34] или болезнь Гоше [35-36] уровень АПФ был сильно повышен.

Кроме того, изменение концентрации АПФ в биологических жидкостях, связанное с нарушением экспрессии гена АПФ, наблюдается при его полиморфизме [37] - наличии или отсутствии Alu-повтора в 16 интроне гена АПФ ([/О полиморфизм). Поскольку этот отрезок расположен в интроне, он удаляется при сплайсинге и не может прямо влиять на активность секретируемого АПФ; тем не менее, средний уровень АПФ в плазме крови у носителей гомозиготного по делеции (ОО) генотипа приблизительно на 60% больше, чем у носителей генотипа, гомозиготного по (II) [37]. Носители гетерозиготного типа имеют промежуточные уровни активности АПФ в крови. Следствием этих наблюдений стало множество работ, связывающих [/О полиморфизм с риском сердечно-сосудистых заболеваний, развитием патологий или осложнением системных заболеваний [38].

Соматический АПФ представляет собой характерный №гликозилированный гликопротеин, на поверхности белковой глобулы которого расположены олигосахаридные цепи, структура и состав которых, скорее всего, отличаются в АПФ, синтезируемых в разных тканях и у разных видов животных. Последовательность соматического АПФ человека содержит 17 потенциальных сайтов №гликозилирования, десять - на №домене и семь - на С-домене [8]. В литературе еще мало сведений о структуре и точных позициях гликанов в соматическом АПФ человека из разных тканей. Сообщалось, что в АПФ в составе семенной жидкости семь из 17 потенциальных участков гликозилированы (в частности Asn9). Гликаны в двух сайтах гликозилирования представляли собой высокоманнозные цепи, а пять участков содержали №гликаны комплексного типа, большинство из которых имели биантенную структуру [39]. Кроме того, для соматического АПФ из почек человека было показано, что из 17 потенциальных возможных сайтов

гликозилирования 6 сайтов (Абп9, Абп25, Абп82, Абп117, Абп480 и Абп913) точно гликозилированы, при этом все эти сайты гликозилирования располагаются на №домене, кроме Абп913, располагающегося на С-домене АПФ [40]. Кроме того, сайт Абп1196 на С-домене АПФ оказался негликозилированным. Данных по оставшимся десяти потенциальным сайтам гликозилирования не было получено. Для АПФ плазмы крови человека известно, что три сайта Абп 480, 666 и 685 действительно гликозилированы [41]. Основным поставщиком АПФ в кровь - по-видимому до 75% [42] - являются капилляры легких, что делает возможным предположение о том, что и в АПФ лёгких человека эти три сайта гликозилированы.

Микрогетерогенность гликозилирования по типу и интенсивности гликозилирования, характерная для гликопротеинов, мешала получению кристаллов АПФ и определению их 3Б структуры. К настоящему времени получены кристаллические структуры только отдельных доменов АПФ после того, как были экспрессированы рекомбинантные формы однодоменных АПФ с однородными гликанами [43,44].

Показано, что молекула С-домена АПФ имеет эллипсоидную форму с размерами 72х57х48А. Структура С-домена АПФ содержит 27 спиралей. Лишь 4% аминокислотных остатков составляют 6 относительно коротких Р-листов, два из которых находятся около активного центра. В центральной части белка находится туннель, вытянутый приблизительно на 30А, который разделяет фермент на две части (на два субдомена). В этом туннеле, сформированном четырьмя а-спиралями и одним Р-листом, располагается активный центр. В структуре С-домена были идентифицированы 504 молекулы воды [43]. Ион цинка является необходимым для катализа компонентом АПФ. Как и ожидалось, этот ион, имеющий тетраэдрическое окружение, был обнаружен в активном центре С-домена [43]. Он играет важную роль в связывании субстрата с ферментом, координируя карбонильную группу при гидролизе пептидной связи субстрата под действием фермента. Ион 2п2+ координационно связан с двумя остатками гистидина (рКа боковых групп равно 6,04) и остатком глютаминовой кислоты. Четвертым лигандом иона цинка принято считать молекулу воды из растворителя, однако, в кристаллической структуре С-домена четвертым лигандом оказался ацетат-анион из кристаллизационной среды [43].

Активный центр №домена так же, как у С-домена, находится внутри глубокого канала [44]. При этом ион цинка активного центра у обоих доменов расположен в наиболее узкой части канала. Данное сужение разделяет канал на две части: в меньшей части (длиною около 8А) связывается отщепляемый С-концевой дипептид субстрата, в более длинной части (длиною около 17А) связывается оставшаяся ^концевая часть субстрата. Возможно, именно длина канала является лимитирующим фактором при связывании и гидролизе длинных

10

пептидов. Кроме того, расположение канонической последовательности His-Glu-Xaa-Xaa-His консервативно в обоих доменах.

Так же как и С-домен, N-домен имеет эллипсоидную форму, посредине глобулы проходит туннель, который делит белок на два субдомена [44]. Структура N-домена состоит из 21 а-спирали, шести 3ю-спиралей и шести антипараллельных Р-листов.

Оба домена в составе соматического АПФ каталитически активны, но неравноценны. Отдельный N-домен обладает более высокой стабильностью при высоких температурах, чем отдельный С-домен или двудоменная форма АПФ [45-46]. Важно, что различная термостабильность доменов позволяет избирательно проводить денатурацию только одного из них (С-) с получением каталитически активного индивидуального N-домена (после протеолиза) или N-домена в составе полноразмерного фермента с денатурированным С-доменом, причем присутствие денатурированного С-домена не оказывало влияния ни на стабильность, ни на каталитические функции N-домена [45]. Таким образом, можно утверждать, что домены в составе молекулы соматического АПФ денатурируют независимо, что свидетельствует об их независимом фолдинге. О независимом фолдинге двух доменов также свидетельствует возможность расщепления пептидной перемычки между доменами без их денатурации [24].

Оба активных центра АПФ гидролизуют широкий круг синтетических и природных пептидных субстратов [1-2,20,46-49]. Как правило, фермент отщепляет дипептид (-ы) с С-конца гидролизуемого субстрата, однако в ряде случаев АПФ способен отщеплять и трипептиды, а также проявлять эндопептидазную активность, как, например, при гидролизе люлиберина, от молекулы которого АПФ отщепляет N-концевой трипептид [5].

Природные субстраты декапептид ангиотензин I и нонапептид брадикинин гидролизуются обоими активными центрами фермента in vitro со сравнимыми скоростями. АПФ способен также расщеплять гемопоэтический пептид N-AcSDKP, являющийся фактором регуляции пролиферации стволовых клеток и стимулирующий ангиогенез [50-51]. Оба домена АПФ человека гидролизуютAcSDKP со значениями Км 31 и 39 мкМ, соответственно. Тем не менее, N-домен гидролизует данный пептид в 50 раз быстрее по сравнению с C-доменом, с kcat значениями 0,5 и 0,01 с-1 соответственно [50]. Также показано, что бета-амилоид, накапливающийся при болезни Альцгеймера, преимущественно расщепляется под действием именно N-домена АПФ [52-53].

В настоящее время считают, что активный центр, расположенный на С-домене АПФ, является основным местом превращения ангиотензина1 в организме, т.е. именно он участвует в регуляции кровяного давления, поскольку специфичный для С-домена ингибитор в низких концентрациях полностью блокировал вазоконстрикцию, вызываемую

11

ангиотензином II [54], а использование специфичного ингибитора №домена не приводило к такому эффекту. Роль №домена, судя по всему, менее связана с функцией ренин-ангиотензиновой системы, а больше связана с гидролизом других биологически активных пептидов, таких как АсББКР [50-51], бета-амилоидный пептид [52-53], ангиотензин 1-7, являющийся антагонистом ангиотензина II [55].

Существование в составе молекулы АПФ тандема из двух активных центров, гидролизующих широкий круг пептидных субстратов и контролирующихся содержанием в среде хлорид-анионов [1], по-видимому, обеспечивает высокую чувствительность фермента на изменение условий функционирования и может существенно влиять на проявляемую ферментом активность в определенных тканях и органах, в том числе при развитии патологии. Ситуацию еще более осложняет тот факт, что функционирование активных центров фермента может быть взаимосвязано. Если при гидролизе ангиотензина! оба центра работают независимо как два отдельных фермента [1 -2,20], то при гидролизе трипептидных субстратов два центра АПФ проявляют ярко выраженную отрицательную кооперативность [47-48]. Таким образом, связывание субстрата на одном из активных центров АПФ приводит к существенному ухудшению связывания второй молекулы субстрата на втором активном центре. Аналогичные данные были получены и для связывания с АПФ обычных коммерческих ингибиторов, применяемых в клинике, таких как каптоприл, лизиноприл, эналаприлат [47]. Несмотря на то, что в работе [46] показано, что фолдинг доменов при синтезе АПФ идет независимо, эти домены при функционировании фермента явно связаны, т.к. именно связывание лиганда глубоко внутри одного из доменов может приводить к изменению функционального состояния активного центра на другом домене.

Поскольку пока не удалось получить кристаллы двух-доменного соматического АПФ, его структура не известна. Поэтому многими лабораториями были предприняты попытки построения модели двудоменного АПФ.

В 2007 году была предложена модель двудоменного АПФ, базирующаяся на данных о топологии поверхности АПФ, полученных с помощью анализа связывания моноклональных антител (мАт) к разным эпитопам на поверхности фермента [56]. К этому времени было завершено картирование всех эпитопов мАт против АПФ, имеющихся в наличии - 8 мАт к N домену и 8 мАт к С-домену АПФ. Эпитопы связывания мАт 1Е10 и 4Е3 к С-домену располагаются в области контакта доменов в структуре полноразмерного АПФ [56-57]. Эпитоп связывания антитела Ш12 расположен в С-концевой области №домена, а эпитоп связывания 1Е10 на С-домене, причем связывание обоих мАт отдельными доменами гораздо эффективнее, чем полноразмерным АПФ, что свидетельствует об экранировании эпитопов связывания этих мАт соседними доменами [56,58]. Кроме того, в работе [56] была

протестирована способность мАт, специфичных к К-домену, конкурировать за связывание ферментом мАт, специфичных к С-домену, и наоборот. Таким образом были выявлены пары мАт направленные к разным доменам АПФ, но конкурирующие между собой за связывание с двудоменным ферментом. В результате была предложена модель структуры АПФ, представленная на рис 2.

С-с1ошаш >Мотат

Рис. 2.Модель двудоменного АПФ, построенная на основе анализа связывания мАт с однодоменными и двудоменной формами АПФ, а также конкуренции мАт к разным доменам фермента за связывание с двудоменной формой АПФ [56]. Стрелками указаны эпитопы связывания мАт. Розовым цветом указан эпитоп связывания мАт 3Б11, желтым - мАт 1Е10, фиолетовым - мАт 9В9/308, синим - мАт Ш12/6А12. Зеленым цветом отмечены потенциальные сайты гликозилирования.

Затем была получена электронная микрофотография двудоменного АПФ почки свиньи [59] и построена модель соматического АПФ человека [60]. Построение модели было основано на: 1) аминокислотной последовательности АПФ свиньи и человека; 2) знаниях о трехмерных кристаллических структурах К-домена, С-домена АПФ и однодоменного фермента АПФ2, который является гомологом С-домена АПФ; 3) трехмерной электронно-микроскопической фотографии АПФ из почки свиньи [43-44, 59-62]. Все эти исследования позволяют представить АПФ человека, как показано на рис. 3. К-домен молекулы начинается с аминокислотного остатка Ье^ и продолжается до Pro601 [44], связывание

1_еи1

АБр612^

Ы-домен

Рго602

юА

С-домен

Агд1203 \/а11228

ап1194

¿секретаза

5ег1248" Зег1277

Рис. 3. Двудоменная модель соматического АПФ человека [60].

цинка осуществляется на этом домене аминокислотами н361Емаи365 и Ии389. Междоменный линкер составляет около 11 аминокислот от Рго602 до Лвр612, за которым следует С-концевой домен, который начинается с Ьеи613 и продолжается до Рго1193 (последней аминокислоты, наблюдаемой в кристаллической структуре С-домена) [43,61]. В этом домене за координацию цинка отвечают аминокислоты Н959ЕМОН963 и Ии987. Следом за С-доменом следует примембранный стебель приблизительно от 01и1194 до Лг§1227, гидрофобный трансмембранный домен от Уа11228 до Бег1248 и внутриклеточная С-концевая последовательность от Ип1249 до Бег1277 в конце молекулы. При ограниченном гидролизе АПФ эндопротеиназой Лвр-К расщепление пептидных связей происходит между ТЬг615-Лвр616 и Ьеи1219-Лвр1220 с генерацией двух каталитических доменов в активной форме, которые могут быть разделены с помощью афинной хроматографии на колонке со специфическим ингибитором АПФ лизиноприлом [24].

2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ИЗМЕНЕНИЙ ПОВЕРХНОСТИ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

Моноклональные антитела (мАт) благодаря их селективности и чувствительности являются чрезвычайно важным инструментом при исследовании структурно-функциональных особенностей белков. В фундаментальных исследованиях мАт используются для идентификации и локализации белков, для дифференциации клеток различных типов, для очистки белка или для исследования экспрессии белков [63-64]. Для получения моноклональных антител обычно используется слияние миеломных клеток с клетками селезенки иммунизированного животного. Полученные гибридные клетки (гибридомы) наследуют от опухолевых клеток способность неограниченно размножаться, а от клеток селезенки - синтезировать антитела предполагаемой специфичности - это общий принцип [64]. Эпитопное картирование - определение областей на поверхности белковой глобулы, к которым специфичны различные мАт - является важным шагом для характеристики взаимодействия антиген-антитело [64-65].

Несмотря на интенсивное и успешное изучение механизмов катализа и ингибирования АПФ, его первичной структуры, иммунохимическая, антигенная структура АПФ долго была практически не исследована. Преимущества, присущие мАт, обусловлены их гомогенностью, стандартностью, абсолютной специфичностью и единообразием, что позволяет изучать тонкую антигенную структуру белков наиболее точно. Ограниченная и небольшая поверхность "отпечатка" моноклональных антител (мАт) на белковой молекуле (640-750 А2) [66] позволяет предполагать, что мАт могут быть очень чувствительным инструментом для изучения функциональной значимости разных эпитопов молекулы АПФ. В первых исследованиях полученные мАт к АПФ из легких крысы не обладали антикаталитической активностью, но взаимодействовали с АПФ эндотелия мыши, быка и человека [67]. мАт, полученные к АПФ легких крысы в другой лаборатории, не имели перекрестной реакции с ферментом человека и быка и также не проявляли антикаталитическую активность [68]. Другие мАт к АПФ легких крысы [69] использовали в основном для визуализации АПФ в тканях головного мозга. Меченые антитела взаимодействовали с АПФ практически всех отделов мозга, однако не взаимодействовали с АПФ из других органов.

Первые мАт к АПФ человека были получены более 20 лет назад, причем все первые

мАт были получены к N-домену АПФ [70]. Для выяснения антигенных детерминант на

обоих АПФ была получена панель, состоящая из 14 мАт. Для первичного скрининга

гибридом использовали метод ELISA с очищенными препаратами фермента из легких

15

человека. Вторичный скрининг проводился с помощью метода иммуносорбции, при котором фермент связывается с антителами, иммобилизованными на планшете, и образование комплекса детектируется с помощью определения активности связавшегося фермента. Используя этот метод, исследовали [70] видовую специфичность полученной панели мАт к АПФ. Было определено, с АПФ каких видов животных взаимодействуют мАт против АПФ человека (из 14 исследованных). Оказалось, что по способности узнавать АПФ из разных животных 14 полученных мАт разбиваются на 6 групп: (1) 9В9; (2) 505, 3А5, 1С7; (3) 5Б1; (4) ПА8, 7Б5, 308 и 1В1; (5) 12Н5, 1012 и 206, (6) 6А12и 4Н4. При этом ни одно из полученных антител не взаимодействовало с АПФ козла, собаки, быка и мыши. мАт 9В9 и антитела из второй группы (505, 3А5, 1С7) узнают наиболее консервативные антигенные детерминанты (то есть детерминанты, присущие ферментам из разных видов, например, АПФ приматов, человека, кроликов, быка, морских свинок), тогда как антитела из пятой группы связывают только АПФ человека. Таким образом, консервативность антигенных детерминант, узнаваемых антителами, растет от пятой группы к первой. Все полученные антитела относятся к классу иммуноглобулинов 0 и подклассу 1§02 и 1§03, также были обнаружен и тип 1§М с молекулярной массой около 160 кДа, и характеризуются достаточно высокими константами связывания (10 -8 - 10-10 М) [70].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Крюкова, Ольга Владимировна, 2018 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

I. Bernstein K.E., Ong F.S., Blackwell W.L., Shah K.H., Giani J.F^Gonzalez-Villalobos R.A., Shen X.Z., Fuchs S., Touyz R.M. A Modern understanding of the traditional and nontraditional biological functions of angiotensin-converting enzyme (2013) Pharmacol. Rev.^65, 1-46.

2 Sturrock E.D., Colin A.S., Danilov S.M. Peptidyl-Dipeptidase A / Angiotensin I-Converting Enzyme. In: Handbook of Proteolytic Enzymes (Barrett, A.J.; Rawlings, N.D.; Woessner, F.J., Eds.), Elsevier Academic Press, London, 2012, 480-494.

3. Menard J., Patchett A.A. (2001) Angiotensin-converting enzyme inhibitors (2001) Adv.

Protein Chem,. 56, 13-75.

4. Skidgel R.A., Engelbrecht S., Johnson A.R., Erdos, E.G. Hydrolysis of substance P and neurotensin by converting enzyme and neutral endopeptidase (1984) Peptides, 5, 769-776.

5. Skidgel, R.A., Erdos, E.G. Novel activity of human angiotensin I converting enzyme: release of the NH2- and COOH-terminal tripeptides from the luteinizing hormone-releasing hormone (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82, 1025-1029.

6. Azizi M., Junot C., Ezan E., Menard, J. Angiotensin I-converting enzyme and metabolism of the haematological peptide N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (2001) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 28, 1066-1069.

7. Hu J., Igarashi A., Kamata M., Nakagawa H. Angiotensin-converting enzyme degrades Alzheimer amyloid P-peptide (AP); retards Ap aggregation, deposition, fibril formation; and inhibits cytotoxicity (2001) J. Biol. Chem., 276, 47863-47868.

8. Soubrier F., Alhenc-Gelas F., Hubert C., Allegrini J., John M. Two putative active centers in human angiotensin I-converting enzyme revealed by molecular cloning (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 9386-9390.

9. Defendini R., Zimmerman E.A., Weare J.A., Alhenc-Gelas F., Erdos E.G. Angiotensin-converting enzyme in epithelial and neuroepithelial cells (1983) Neuroendocrinology 37, 3240.

10. Velletri P.A. Testicular angiotensin I-converting enzyme (E.C. 3.4.15.1). (1985), Life Sci., 36, 1597-1608.

II. Ehlers M.R., Fox E.A., Strydom D.J., Riordan J.F. Molecular cloning of human testicular angiotensin-converting enzyme: the testis isozyme is identical to the C-terminal half of endothelial angiotensin-converting enzyme (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 86, 77417745.

12 Bernstein K.E., Xiao H.D., Frenzel K., Li P., Shen X.Z., Adams J.W., Fuchs S. Six truisms concerning ACE and the renin-angiotensin system educed from the genetic analysis of mice (2005) Circ. Res.,96,1135-1144.

13. Manolis A., Doumas M. Sexual dysfunction: the 'prima ballerina' of hypertension-related quality-of-life complications (2008) J. Hypertens., 26, 2074-2084.

14. Kondoh G., Tojo H., Nakatani Y., Komazawa N., Murata C., Yamagata K., Maeda Y., Kinoshita T., Okabe M., Taguchi R., Takeda J. Angiotensin-converting enzyme is a GPI-anchored protein releasing factor crucial for fertilization (2005) Nat. Med., 11, 160-166.

15. Leisle L., Parkin E.T., Turner A.J., Hooper N.M. Angiotensin-converting enzyme as a GPIase: a critical reevaluation (2005) Nat. Med.^11, 1139-1140.

16. Cornell M.J., Williams T.A., Lamango N.S., Coates D., Corvol P., Soubrier F., Hoheisel J., Lehrach H., Isaac R.E. Cloning and expression of an evolutionary conserved single-domain angiotensin converting enzyme from Drosophila melanogaster (1995) J. Biol.Chem., 270, 13613-13619.

17. Sayed-Tabatabaei F.A., Oostra B.A., Isaacs A., van Duijn C.M., Witteman J.C. ACE polymorphisms (2006) Circ. Res., 98, 1123-1133.

18. Hubert C., Houot A.M., Corvol P., Soubrier F. Structure of the angiotensin I-converting enzyme gene. Two alternate promoters correspond to evolutionary steps of a duplicated gene (1991) J. Biol. Chem.J.66, 15377-15383.

19. Howard T.E., Shai S.Y., Langford KG., Martin B.M., Bernstein K.E. Transcription of testicular angiotensin-converting enzyme (ACE) is initiated within the 12th intron of the somatic ACE gene (1990) Mol. Cell. Biol.^10, 4294-4302.

20. Riordan J.F. Angiotensin-I-converting enzyme and its relatives (2003) Genome Biol., 4, 225-229.

21. Moiseeva N.A., Binevski P.V., Baskin I.I., Palyulin V.A., Kost O.A. Role of two chloride-binding sites in functioning of testicular angiotensin-converting enzyme (2005) Biochemistry., 70, 1167-1172.

22 Masuyer G., Yates C.J., Sturrock E.D., Acharya K.R. Angiotensin-I converting enzyme (ACE): structure, biological roles, and molecular basis for chloride ion dependence (2014) Biol. Chem., 395, 1135-1149.

23. Deddish P.A., Wang J., Michel B., Morris P.W., Davidson N.O., Skidgel R.A., Erdos E.G. Naturally occurring active N-domain of human angiotensin I-converting enzyme (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 7807-7811.

24. Sturrock E.D., Danilov S.M., Riordan J.F^Limited proteolysis of human kidney angiotensin-converting enzyme and generation of catalytically active N- and C-terminal domains (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun.J236, 16-19.

25. Binevski P.V., Nikolskaya I.I., Pozdnev V.F., KostO.A. Isolation and characterization of the N-domain of bovine angiotensin-converting enzyme (2000) Biochemistry (Mosc), 65, 651658.

26. Hooper N.M., Keen J., Pappin D.J., Turner A.J. Pig kidney angiotensin converting enzyme. Purification and characterization of amphipathic and hydrophilic forms of the enzyme establishes C-terminal anchorage to the plasma membrane (1987) Biochem. J., 247, 85-93.

27. Ramchandran R., Sen G.C., Misono K., Sen I. Regulated cleavage-secretion of the membrane-bound angiotensin-converting enzyme (1994) J. Biol. Chem., 269, 2125-2130.

28. Balyasnikova I.V., Karran E.H., Albrecht R.F. 2nd, Danilov S.M. Epitope-specific antibody-induced cleavage of angiotensin-converting enzyme from the cell surface (2002) Biochem J.., 362, 585-595.

29. Parkin E.T., Turner A.J., Hooper N.M. Secretase-mediated cell surface shedding of the angiotensin-converting enzyme (2004) Prot. Pept. Lett., 11, 423-432.

30. Alfalah M., Parkin E.T., Jacob R., Sturrock E.D., Mentele R., Turner A.J., Hooper N.M., Naim H.Y. A point mutation in the juxtamembrane stalk of human angiotensin I-converting enzyme invokes the action of a distinct secretase (2001) J. Biol. Chem., 276, 22105-9.

31. Kramers C., Danilov S.M., Deinum J., Balyasnikova I.V., Scharenborg N., Looman M., Boomsma F., de Keijzer M.H., van Duijn C., Martin S., Soubrier F., Adema G.A. Point mutation in the stalk of angiotensin-converting enzyme causes a dramatic increase in serum angiotensin-converting enzyme but no cardiovascular disease (2001) Circulation, 104, 12361240.

32 Schweisfurth H., Schiöberg-Schiegnitz S. Assay and biochemical characterization of angiotensin-I-converting enzyme in cerebrospinal fluid (1984) Enzyme, 32, 12-19.

33. Lieberman J. Elevation of serum angiotensin-converting-enzyme (ACE) level in sarcoidosis. (1975) Am. J. Med, 59, 365-372.

34. Rohrbach M.S., Deremee R.A. Pulmonary sarcoidosis and serum angiotensin-converting enzyme (1982)Mayo. Clin. Proc., 57, 64-68.

35. Lieberman, J., and Beutler, E. Elevation of angiotensin-converting enzyme in Gaucher's disease (1976) N. Engl. J. Med. 294, 1442-1444.

36. Sylverstein, E., Friedland, J. Elevated serum and spleen angiotensin-converting enzyme and serum lysozyme in Gaucher's disease (1977) Clin. Chim. Acta, 74, 21-25.

37. Кост О.А., Савельев М.И. Ангиотензин-превращающий фермент: структура, функции, полиморфизм. В: Постгеномные исследования и технологии (Ред. Варфоломеев С.Д.), (2011), Москва., Маск Пресс, 565-603.

38. Tiret L, Rigat B, Visvikis S, Breda C, Corvol P, et al. Evidence, from combined segregation and linkage analysis, that a variant of the angiotensin I-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels (1992) Am J Hum Genet., 51, 197-205.

39. Ripka J.E., Ryan J.W., Valido F.A., Chung A.Y.K., Peterson C.M., Urry R.L. N-glycosylation of forms of angiotensin converting enzyme from four mammalian species (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun, 196, 503-508.

40. Yu X. C., Sturrock E. D., Wu Z., Biemann K., Ehlers M. R., Riordan J. F^Identification of N-linked glycosylation sites in human testis angiotensin-converting enzyme and expression of an active deglycosylated form (1997) J. Biol. Chem.^272, 3511-3519.

41. Lui T., Qian W-J., Gritsenko M.A., Camp D.G. II., Monroe M.E., Moore RJ., Smith R.D. Human plasma N-gycoproteome analysis by immunoaffinity subtraction, hydrazide Chemistry, and mass spectroscopy (2005) J. Proteome. Res., 4, 2070-2080.

42 Metzger R., Franke F.F., Bohle R.M., Alhenc-Gelas F., Danilov S.M. Heterogeneous distribution of Angiotensin I-converting enzyme (CD143) in the human and rat vascular systems: vessels, organs and species specificity (2011)Microvasc. Res., 81, 206-215.

43. Natesh R., Schwager S.L.U., Sturrock E.D., Acharya K.R. Crystal structure of the human angiotensin-converting enzyme-lisinopril complex (2003) Nature, 421, 551-554.

44. Corradi H.R., Schwager S.L.U., Nchinda A.T., Sturrock E.D., Acharya K.R. Crystal structure of the N domain of human angiotensin I-converting enzyme provides a structural basis for domain-specific inhibitor design (2006) J. Mol. Biol., 357, 964-974.

45. Marcic B., Deddish P.A., Jackman H.L., Erdos E.G., and Tan F. Effects of the N-terminal sequence of ACE on the properties of its C-domain (2000) Hypertension, 36, 116-121.

46. Voronov S., Zueva N., Orlov V., Arutyunyan A., Kost OA. Temperature-induced selective death of the C-domain within angiotensin-converting enzyme molecule (2002) FEBS Lett., 522, 77-82.

47. Binevski P.V., Sizova E.A., Pozdnev V.F., Kost O.A. Evidence for the negative cooperativity of the two active sites within bovine somatic angiotensin-converting enzyme (2002) FEBS Lett, 550, 84-88.

48. Skirgello O.E., Binevski P.V., Pozdnev V.F., Kost O.A. Kinetic probes for inter-domain cooperation in human somatic angiotensin-converting enzyme (2005) BioChem. J., 391, 641647.

49. Jaspard E., Wei L., Alhenc-Gelas F. Differences in the properties and enzymatic specificities of the two active sites of angiotensin I-converting enzyme (kininase II) (1993) J. Biol. Chem, 268, 9496-9503.

50. Rousseau A., Michaud A., Chauvet M.T., Lenfant M., Corvol P. The hemoregulatory peptide N-acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro is a natural and specific substrate of the N-terminal active site of human angiotensin-converting enzyme (1995) J. Biol. Chem., 270, 3656-3661.

51. Rousseau-Plasse A, Lenfant M, Potier P. Catabolism of the hemoregulatory peptide N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro: a new insight into the physiological role of the angiotensin-I-converting enzyme N-active site. (1996) BioorgMed Chem., 4, 1113-1119.

52 Oba R., Igarashi A., Kamata M., Nagata K., Takano S., Nakagawa H. The N-terminal active center of human angiotensin-converting enzyme degrades Alzheimer amyloid beta-peptide (2005) Eur. J. Neurosci, 21, 733-740.

53. Kugaevskaya E.,V, Veselovsky A.,V, Indeykina M.I., Solovyeva N.I,, Zharkova M.S., Popov I.,A, Nikolaev E.,N, Mantsyzov A.B., Makarov, A.A., Kozin S.A. N-domain of angiotensin-converting enzyme hydrolyzes human and rat amyloid-ß(1-16) peptides as arginine specific endopeptidase potentially enhancing risk of Alzheimer's disease (2018) Sci Rep. 8, 298.

54. van Esch J.H., Tom B., Dive V., Batenburg W.W., Georgiadis D., Yiotakis A., van Gool J.M., de Bruijn R.J., de Vries R., Danser A.H. Selective angiotensin-converting enzyme C-domain inhibition is sufficient to prevent angiotensin I-induced vasoconstriction (2005) Hypertension, 45, 120-12.

55. Deddish P.A., Marcic B., Jackman H.L., Wang H.Z., Skidgel R.A. Erdös E.G. N-domain-specific substrate and C-domain inhibitors of angiotensin-converting enzyme: angiotensin-(1-7) and keto-ACE (1998) Hypertension, 31, 912-917

56. Naperova I.A., Balyasnikova I.V., Schwartz D.E., Watermeyer J., Sturrock E.D., Kost O.A., Danilov S.M. Mapping of conformational mAb epitopes to the C domain of human angiotensin I-converting enzyme (ACE) (2008) J. Proteome Res., 7, 3396-3411.

57. Наперова И.А., Балясникова И.В., Петров М.Н., Вахитова В.В., Данилов С.М., Кост О.А. Характеристика связывания моноклональных антител с С-доменом ангиотензин-превращающего фермента человека (2008), Биоорганическая химия, 3, 358-364.

58. Balyasnikova I.V., Skirgello O.E., Binevski P.V., Nesterovich A.B., Albrecht R.F.II, Kost

O.A., Danilov S.M. Monoclonal antibodies 1G12 and 6A12 to N domain of human

133

angiotensin-converting enzyme: fine epitope mapping and antibody-based method for relevation and quantification of ACE inhibitors in the human blood (2007) J. Proteome. Res, 6, 1580-1594.

59. Chen H.L., Lünsdorf H., Hecht H.J., Tsai H. Porcine pulmonary angiotensin Iconverting enzyme—biochemical characterization and spatial arrangement of the N- and C-domains by three-dimensional electron microscopic reconstruction (2010)Micron,41, 674-685.

60. Danilov S.M., Gordon K., Nesterovitch A.B., Lünsdorf H., Chen Z., Castellon M., Popova I.A., Kalinin S., Mendonca E., Petukhov P.A., Schwartz D.E., Minshall R.D., Sturrock ED. An angiotensin I-converting enzyme mutation (Y465D) causes a dramatic increase in blood ACE via accelerated ACE shedding (2011) PLoS One, 6, 25952.

61. Natesh R., Schwager S.L., Evans H.R., Sturrock E.D., Acharya K.R. Structural details on the binding of antihypertensive drugs captopril and enalaprilat to human testicular angiotensin I-converting enzyme (2004) Biochemistry, 43, 8718-8724.

62 Towler P., Staker B., Prasad S.G., Menon S., Tang J., Parsons T., Ryan D., Fisher M., Williams D., Dales N.A., Patane M.A., Pantoliano M.W.J. ACE2 X-ray structures reveal a large hinge-bending motion important for inhibitor binding and catalysis (2004) Biol. Chem, 279, 17996-8007.

63. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология, (2000), Мир:Москва.

64. Zola H. Monoclonal antibodies; (1987), Springer-Verlag: New York.

65. Perrin R.J., Payton J.E., Barnett D.H., Wraight C.L., Woods W.S., Ye, L., George J.M. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines (2003) Neurosci. Lett., 349, 133-135.

66. Skirgello O.E., Balyasnikova I.V., Binevski P.V., Zhu-Li S., Baskin I.I., Palyulin V.A., Nesterovich A.B., Albrecht R.F., II, Kost O.A., Danilov S.M. Inhibitory antibodies to human angiotensin-converting enzyme: fine epitope mapping and mechanism of action (2006) Biochemistry, 45, 4831-4847.

67. Auerbach R., Alby L., Grieves J., Joseph J., Lindgren C., Morrissey L.W., Sidky Y.A., Watt S.L. Monoclonal antibody against ACE: its use as a marker for murine, bovine, and human endothelial cells (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7891-7895.

68. Moore M.G., Chrzanowski R.R., McCormick J.R., Cieplinski W., Schwinte A. Production of monoclonal antibodies to rat lung ACE (1984) Clin. Immunol. Immunopath., 33, 301-312.

69. Lo M., Tsong T., Conrad M., Strittmatter S., Hester L., Snyder S. Monoclonal antibody production by receptor-mediated electrically induced cell fusion (1984) Nature, 310, 792794.

70. Danilov S., Jaspard E., Churakova T., Wei L., Alhenc-Gelas F. Structure-function analysis of angiotensin I - converting enzyme using monoclonal antibodies. Selective inhibition of the amino-terminal active site (1994) J. Biol. Chem, 269, 26806-26814.

71. Gordon K., Balyasnikova I.V., Nesterovitch A.B., Schwartz D.E., Sturrock E.D., Danilov S.M. Fine epitope mapping of monoclonal antibodies 9B9 and 3G8 to the N-domain of angiotensin converting enzyme (CD143) defines a region involved in regulating angiotensin-converting enzyme dimerization and shedding (2010) Tissue Antigens, 75,136150.

72. Danilov S.M., Watermeyer J.M., Balyasnikova I.V., Gordon K., Kugaevskaya E.V., Eliseeva J.E., Albrecht R.F.II, Sturrock E.D. Fine epitope mapping of monoclonal antibody 5F1 reveals anticatalytic activity toward the N domain of human angiotensin-converting enzyme (2007) Biochemistry, 46, 9019-9031.

73. Jokubaitis V.J., Sinka L., Driessen R., Whitty G., Haylock D.N., Bertoncello I., Smith I., Peault B., Tavian M., Simmons P.J., Angiotensin-converting enzyme (CD143) marks hematopoietic stem cells in human embryonic, fetal, and adult hematopoietic tissues (2008) Blood, 111, 4055-4063.

74. Ramshaw H.S., Haylock D., Swart B., Gronthos S., Horsfall M.J., Niutta S., Simmons P.J. Monoclonal antibody BB9 raised against bone marrow stromal cells identifies a cell-surface glycoprotein expressed by primitive human hemopoietic progenitors (2001) Exp. Hematol., 29, 981-992.

75. Balyasnikova I.V., Zhu-Li S., Franke F.E., Berestetskaya Y.V., Chubb A.J., Albrecht R.F., II, Sturrock E.D., Danilov S.M. Monoclonal antibodies 1B3 and 5C8 as probes for monitoring the integrity of the C-terminal end of soluble angiotensin-converting enzyme (2005) Hybridoma, 24, 14-26.

76. Danilov S.M., Deinum J., Balyasnikova I.V., Sun Z-L., Kramers C., Hollak C.E., Albrecht, R.F. Detection of mutated angiotensin I-converting enzyme by serum/plasma analysis using a pair of monoclonal antibodies (2005) Clin. Chem., 51, 1040-1043.

77. Silverstein E., Friedland J., Lyons H.A., Gourin A. Elevation of angiotensin-converting enzyme in granulomatous lymph nodes and serum in sarcoidosis: clinical and possible pathogenic significance (1976) Ann. N. Y. Acad. Sci., 278, 498-513.

78. Silverstein, E., Friedland, J., Akkerman, T. Elevation of granulomatous lymph-node and serum lysozyme in sarcoidosis andcorrelation with angiotensin-converting enzyme (1977) Am. J. Clin. Pathol.,68, 219-224

79. Petrov M.N., Shilo V.Y., Tarasov A.V., Schwartz D.E., Garcia J.G., Kost O.A., Danilov S.M. Conformational changes of blood ACE in chronic uremia (2012) PloS One, 7, 49290.

135

80. Данюкова Т.Н., Биневский П.В., Шрам С.И., Кост О.А., Ингибирование ангиотензин-превращающего фермента короткими гидроксипролин-содержащими пептидами. Материалы V Российского симпозиума "Белки и пептиды", Петрозаводск, (2011), 365.

81. Ryan J. T., Ross R. P., Bolton D., Fitzgerald G. F., Stanton C. Bioactive peptides from Muscle Sources: Meat and Fish (2011) Nutrients, 3, 765-791.

82. Terashima M., Baba T., Ikemoto N., Katayama M., Morimoto T., Matsumura S. Novel angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides derived from boneless chicken leg meat (2010) J. Agric. FoodChem., 58, 7432-7436.

83. Kohama Y., Matsumoto S., Oka H., Teramoto T., Okabe M., Mimura T. Isolation of angiotensin-converting enzyme inhibitor from tuna muscle (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun., 155, 332-337.

84. Hong F., Ming L., Yi S., Zhanxia L., Yongquan W., Chi L. The antihypertensive effect of peptides:A novel alternative to drugs? (2008) Peptides, 29, 1062-1071.

85. Elavarasan K., Shamasundar B.A., Badii F., Howell N. Angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity and structural properties of oven- and freeze-dried protein hydrolysate from fresh water fish (Cirrhinus mrigala) (2016) Food Chem., 206, 210-2166.

86. Pan D., Guo H., Zhao B., Cao J. The molecular mechanisms of interactions between bioactive peptides and angiotensin-converting enzyme (2011) Bioorg. Med. Chem. Lett., 21, 3898-3904.

87. Jakala P., Pere E., Lehtinen R., Turpeinen A., Korpela R., Vapaatalo H. Cardiovascular activity of milk casein-derived tripeptides and plant sterols in spontaneously hypertensive rats (2009) J. Physiol. Pharmacol, 60, 11-20.

88. Ibrahim H.R., Ahmed A.S., Miyata T. Novel angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides from caseins and whey proteins of goat milk (2017) J. Adv.Res., 8, 63-71.

89. Nahariah N., Legowo A.M., Abustam E., Hintono A.Angiotensin I-converting enzyme inhibitor activity on egg albumen fermentation (2015) Asian-Australas J. Anim. Sci., 28, 855-861.

90. Nakano D., Ogura K., Miyakoshi M., Ishii F., Kawanishi H., Kurumazuka D., Kwak C.J. , Ikemura K., Takaoka M., Moriguchi S., Iino T., Kusumoto A., Asami S., Shibata H., Kiso Y., Matsumura Y. Antihypertensive effect of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from a sesame protein hydrolysate in spontaneously hypertensive rats (2006) Biosci.Biotechnol. Biochem., 70, 1118-1126.

91. Rudolph S., Lunow D., Kaiser S., Henle T. Identification and quantification ofACE-inhibiting peptides in enzymatic hydrolysates of plant proteins (2017) Food Chem., 224, 1925.

92 Garcia-Mora P., Peñas E., Frias J., Zielinski H., Wiczkowski W., Zielinska D. High-pressure-assisted enzymatic release of peptides and phenolics increases angiotensin converting enzymel inhibitory and antioxidant activities of pinto bean hydrolysates (2016) Food Chem., 64, 1730-1740.

93. Mokni Ghribi A., Sila A., Maklouf Gafsi I., Blecker C., Danthine S., Attia H., Bougatef A., Besbes S. Structural, functional, and ACE inhibitory properties of water-soluble polysaccharides from chickpea flours (2015) Int. J. Biol. Macromol., 75, 276-282.

94. Alhenc-Gelas F., Richard J., Courbon D., Warnet, J.M., Corvol P. Distribution of plasma angiotensin I-converting enzyme levels in healthy men: relationship to environmental and hormonal parameters (1991) J. Lab. Clin. Med., 117, 33-39

95. Danilov S.M., Savoie F., Lenoir B., Jeunemaitre X., Azizi M., Tarnow L., Alhenc-Gelas F. Development of enzyme-linked immunoassays for human angiotensin I-converting enzyme suitable for large-scale studies. (1996) J. Hypertens., 14, 719-727.

96. Zaman, M.A., Oparil, S., and Calhoun, D.A. Drugs targeting the renin angiotensin-aldosterone system (2002) Nat. Rev. Drug Discov., 1, 621-636.

97. Yang H.Y.T., Erdös, E.G., Lewin Y. Characterization of a dipeptide hydrolase (kininase II: angiotensin I converting enzyme) (1971) J. Pharmacol. Exp. Ther., 177, 291-300.

98. Ryan J.W., Martin L.C., Chung A., Pena G.A. Mammalian inhibitors of angiotensin-converting enzyme (kininase II). In: Advances in Experimental Medicine and Biology. KininsII; 120B; Fuji S., Moriya M., Suzuki T., Eds.; Plenum: New York (1979), 599-606.

99. Hazato T., Kase R. Isolation of inhibitor from porcine plasma (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun., 139, 52-55.

100. Ondetti M, A., Rubin B., Cushman D.W. Design of specific inhibitors of angiotensin-converting enzyme: new class of orally active antihypertensive agents (1977) Science, 196, 441-444.

101. Kohama Y, Kuroda T, Iida K, Itoh S, Mimura T., Inhibitory effect of tuna peptide on endothelin production in cultured endothelial cells (1994), Biol Pharm Bull., 17, 886-888.

102. Козлова Н.И., Павлихина Л.В., Елисеева Ю.Е. Эндогенные ингибиторы карбоксикатепсина (ангиотензин-1-превращающего фермента) сыворотки крови быка (1988) Доклады Академии Наук СССР, 298, 1481-1485.

103. Janitha P. K., Wanasundara P. D., Rossa R. S.,. Amarowicz R, Ambrose S. J., Ronald B. Pegg, Shand P. J. Peptides with angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity from defibrinated, hydrolyzed bovine plasma (2002) J. Agric. Food Chem., 50, 6981-6988.

104. Zhang T., Nie S., Liu B., Yu Y., Zhang Y., Liu J. Activity prediction and molecular mechanism of bovine blood derived angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides (2015) PLoS One, 10, 0119598.

105. Ikemoto F., Song G.B., Tominaga M., Yamamoto K., Endogenous inhibitor of angiotensin converting enzyme in the rat heart (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 10931099.

106. Lieberman J., Sastre A. An angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor in human serum. Increased sensitivity of the serum ACE assay for detecting active sarcoidosis (1986) Chest., 90, 869-875

107. Ryan J.W. in: Bergmeyer (Ed.), Methods of Enzymatic Analysis (3rd Ed.), vol.5 Verlag Chemie, Weinheim (1984), 20-34.

108. Danilov S.M., Balyasnikova I.V., Albrecht R.F. 2nd, Kost O.A. Simultaneous determination of ACE activity with 2 substrates provides information on the status of somatic ACE and allows detection of inhibitors in human blood (2008) J. Cardiovasc. Pharmacol., 52, 90103.

109. Fagyas M., Uri K., Siket I.M, Darago A., Boczan J., Banyai E., Edes I., Papp Z., Toth A. New perspectives in the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) I: endogenous angiotensin converting enzyme (ACE) inhibition (2014) PLoS One, 9, 87843.

110. Fagyas M., Uri K., Siket I.M., Darago A., Boczan J., Banyai E., Edes I., Papp Z., Toth А. New perspectives in the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) II: albumin suppresses angiotensin converting enzyme (ACE) Activity in human (2014) PloS One; 9, 87844.

111. Елисеева Ю.Е., Барсукова И.С. Обнаружение ингибиторов карбоксикатепсина (ангиотензин-Ьпревращающего фермента) в лейкоцитах человека (1988) Доклады Академии Наук СССР, 302, 992-994.

112. Локшина Л.А., Гуреева Т.А., Елисеева Ю.Е., Голубева Н.В., Кугаевская Е.В., Лубкова О.Н., Самойлова Р.С. Протеолитические ферменты в лейкозных лимфойдных клетках человека. III. Аминопептидазы, ангиотензин-превращающий фермент и его ингибитор в клетках с разным иммунологическим фенотипом (1999) Биохимия, 64, 533-542.

113. Erdös E.G. Inhibitor of kininases (1979) Fed. Proc, 38, 2774-2777.

114. Arregui A., Iversen L.L. Beta-lipotropin inhibits a purified converting enzyme from human brain (1979) Biochemical. Pharmacology, 28, 2693-2696.

115. Farias S.L., Sabantini R.A., Sampario T.C., Hirata I.Y., Cezari M.H.S., Juliano M.A., Sturrock E.D., Carmona A.K., Juliano L.. Angiotensin-I-converting enzyme inhibitor

peptides derived from the endostatin-containing NC1 fragment of human collagen XVIII (2006) Biol. Chem, 387, 611-616.

116. Elisseeva Yu.E., Sinanjan E.S., Kugaevskaja E.V. The presence of angiotensin- converting enzyme activator in bovine tissues (1994) Biochem. Mol. Biol. Int.; 32, 173-180.

117. Elisseeva Yu.E., Pavlikhina L.V., Shavghulidze T.V., Messina E., Giacomello A., Salerno C., Perricone R. Angiotensin-converting enzyme activator from purified human neutrophils (1993) Biochem. Mol. Biol. Int., 30, 665-673.

118. Thevananther S., Brecher A.S. Isolation of angiotensin converting enzyme (ACE) binding protein from human serum with an ACE affinity column (1999) Can. J. Physiol. Pharmacol., 77, 216-223.

119. Bull H.G., Thornberry N.A., Cordes E.H. Purification of angiotensin-converting enzyme from rabbit lung and human plasma by affinity chromatography (1985) J. Biol. Chem., 260, 2963-2972.

120. Sundberg L., Porath J. Preparation of adsorbents for biospecific affinity chromatography. Attachment of group-containing ligands to insoluble polymers by means of bifunctional oxiranes (1974) J. Chromatogr., 90, 87-98.

121. Кост О.А., Гринштейн С.В., Никольская И.И., Шевченко А.А., Биневский П.В. Выделение солюбилизированной и мембранной форм соматического ангиотензин-превращающего фермента каскадной аффинной хроматографией (1997) Биохимия, 62, 375-383.

122 Hooper N.M., Turner A.J.Isolation of two differentially glycosylated forms of peptidyl-dipeptidase A (angiotensin-convertingenzyme) from pig brain: are-evaluation of their role in neuropeptide metabolism (1987) Biochem. J., 241, 625-633.

123. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика (1991) Мир, Москва, с. 461-466.

124. Holmquist B., Bunning P., Riordan J.F. A continuous spectrophotometry assay for angiotensin-converting enzyme (1979) Anal. Biochem., 95, 540-548.

125. Piquilloud Y., Reinharz A., Roth M. Studies on the angiotensin converting enzyme with different substrates (1970) Biochim. Biophys.Acta, 206, 136-142.

126. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 (1970) Nature, 227, 668-672.

127. Bieth J.G. Theoretical and practical aspects of proteinase inhibition kinetics (1995) Methods. Enzymol, 248, 59-84.

128. Danilov S.M., Balyasnikova I.V., Danilova A.S., Naperova I.A., Arablinskaya N.E., Borisov S.E., Metzger R., Franke F.E., Schwartz D.E., Gachok I.V., TrakhtI.N., Kost O.A.,

139

Garcia J.G. Conformational fingerprintingof the angiotensin I-converting enzyme (ACE). 1. Applicationin sarcoidosis (2010) J. Proteome Res., 9, 5782-5793.

129. Christensen B., Nielsen M.S., Haselmann K.F., Petersen T.E., Sorensen E.S. Post-translationally modified residued of native osteoponin are located in clusters: identification of 36 phosphorylation and five O-glycosylation sites and their biological implications (2005) J. Biochem., 390, 285-292.

130. Brogren Sihlbom C., Wallmark K., Lonn M., Deinum J. Heterogeneous glycosylation patterns of human PAI-1 may reveal its cellular origin (2008) Thrombosis Res., 122, 271276

131. West M.B., Segu Z.M, Feasley C.L., Kang P., Klouckova I. Analysis of site-specific glycosylation of renal and hepatic y-glutamyltranspeptidase from normal human tissue (2010) J. Biol.Chem., 285, 29511-29524

132 Liddy K.A., White M.Y., Cordwell S.J. Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics (2013) Genome Medicine, 5, 20.

133. Snider N.T., Omary M.B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions (2014) Nature Reviews Mol. Cell Biol., 15, 163-177.

134. Kohlstedt K., hoghi F., Muller-Esterl W., Busse R., Fleming I. CK2 Phosphorylates the angiotensin-converting enzyme and regulates its retention in the endothelial cell plasma membrane (2002) Circ Res., 91, 749-756.

135. Bhide G.P., Colley K.J. Sialylation of N-glycans: mechanism, cellular compartmentalization and function (2017) Histochem Cell Biol., 147, 149-174.

136. Erdös EG, Schulz WW, Gafford JT, Defendini R. Neutral metalloendopeptidase in human male genital tract. Comparison to angiotensin I-converting enzyme (1985) Lab Invest., 52, 437-47.

137. Krassnigg F., Niederhauser H., Fink E., Frick J., Schill WB. Angiotensin converting enzyme in human seminal plasma is synthesized by the testis, epididymis and prostate (1989) Int. J. Androl, 12, 22-28.

138. Elzanaty S., Erenpreis J., Becker C. Seminal plasma albumin: origin and relation to the male reproductive parameters (2007) Andrology, 39, 60-65.

139. Наперова И.А., Букина Т.М., Яровая Е.Б., Данилов С.М., Кост О.А онформационная характеристика ангиотензин-превращающего фермента крови в норме и при болезни Гоше. Материалы V Московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития" (2009) Москва, часть 1, 181-182

140

140. Alpert A.J., Shukla A.K. Precipitation of large, high-abundance proteins from serum with organic solvents. The 8th Annual Meeting of the Association for Biomedical Resource Facilities (ABRF-2003), Denver, CO, USA, Poster P111-W (2013).

141. Elisseeva YE, Orekhovich VN, Pavlikhina LV, Alexeenko LP. Carboxycathepsin--a key regulatory component of two physiological systems involved in regulation of blood pressure (1971) Clin Chim Acta, 31, 413-419.

142. Wishart D. S.HMDB 3.0-The Human Metabolome Database in 2013 (2013) Nucleic Acid Research, 41, 801-807.

143. Danilov S.M., Luensdorf H., Akinbi H.T., Nesterovitch A.B., Epshstein Y., Letsiou E., Kryukova O.V., Piegeler T., Golukhova E.Z., Schwartz D.E., Dull R.O., Minshall R.D., Kost O.K., Garcia J.G.N. Lysozyme and bilirubin bind to ACE and regulates ACE conformation and shedding (2016) Sci Rep., 6, 34913.

144. Saxe AW, Hollinger MA, Essam T. Effect of bilirubin on the spectrophotometry and radionuclide assay for serum angiotensin-converting enzyme (1986) Res Commun Chem. Pathol. Pharmacol., 51, 129-136.

145. Plepper, R. The human serum proteome: display of nearly 3700 chromatographically separated protein spot on twodimensional electrophoresis gels and identification of 325 distinct proteins (2003) Proteomics, 3, 1345-1364.

146. Boomsma, F., de Bruyn, J.H., Derkx, F.H. & Schalekamp, M.A. Opposite effects of captopril on angiotensin I-converting enzyme 'activity' and 'concentration'; relation between enzyme inhibition and long-term blood pressure response (1981) Clin. Sci. (Lond) 60, 491498.

147. Fyhrquist F, Forslund T, Tikkanen I, Gronhagen-Riska C. Induction of angiotensin I-converting enzyme rat lung with Captopril (SQ 14225) (1980) Eur J Pharmacol., 67, 473-5.

148. Fusayasu E., Kowa H., Takeshima T., Nakaso K., Nakashima K. Increased plasma substance P and CGRP levels, and high ACE activity in migraineurs during headache-free periods (2007) Pain 128, 209-214.