Получение антигенов Brucella melitensis Rev-1 и Brucella abortus 19 BA и оценка перспективности их использования в качестве основы противобруцеллезной вакцины тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат биологических наук Крыканов, Артем Александрович

• Крыканов, Артем Александрович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Крыканов, Артем Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу в РФ на современном этапе развития животноводства.

1.2. Характеристика антигенной структуры бруцелл.

1.3. Особенности иммунного ответа при бруцеллезе.

1.4. Вакцины, применяемые для специфической профилактики бруцеллеза животных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1.1. Материалы.•.

2.1.2. Методы исследований.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2.1. Получение посевных культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА при культивировании их на плотных и жидких питательных средах.

2.2.2. Культивирование В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор 0,25».

2.2.3. Концентрирование нативных культур изучаемых бруцелл методом ультрафильтрации.

2.2.4. Получение субклеточных фракций культуры штамма

В. melitensis Rev-1.

2.2.5. Получение корпускулярных антигенов культур штаммов В.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А и приготовление комбинированного корпускулярного антигена бруцелл.

2.2.6. Моделирование инфекционного процесса при бруцеллезе на лабораторных животных.

2.2.7. Изучение иммуногенности полученных антигенов в опытах на лабораторных животных.

2.2.8. Результаты изучения иммуногенности комбинированного инактивированного корпускулярного антигена в опытах на овцах.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4. ВЫВОДЫ.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАННОЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение антигенов Brucella melitensis Rev-1 и Brucella abortus 19 BA и оценка перспективности их использования в качестве основы противобруцеллезной вакцины»

Актуальность темы. Совершенствование эпизоотологического надзора за бруцеллезной инфекцией, создание отвечающих современным требованиям средств диагностики и специфической профилактики имеет определяющее значение в борьбе с этой инфекцией. Решение данных проблем невозможно без фундаментальных и прикладных разработок по эпизоотологии, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии, активной научной поддержки практической деятельности по обеспечению санитарно-эпидемического и эпизоотического благополучия населения и животноводства.

Успехи, достигнутые в ликвидации бруцеллеза в Российской Федерации, несмотря на их научную и практическую значимость, не позволяют в настоящее время сделать заключение о том, что проблема ликвидации бруцеллеза животных в стране окончательно-решена. Это подтверждается возникновением новых очагов данного заболевания в различных регионах РФ (10,16,71,73).

По данным Григорьевой Г.И. (26), Склярова О.Д. (69), Сочнева В.В. (72), Юсковец М.К. (77) и др., инфекция наносит значительный ущерб животноводству, который складывается из потери воспроизводительной способности, выбраковки ценных в племенном отношении животных, абортов и рождении слабого, нежизнеспособного потомства.

Современная система профилактики инфекционных заболеваний основывается на проведении общих ветеринарно-санитарных мероприятий, выявлении источников инфекции - больных животных и их удалении, применении средств специфической иммунопрофилактики (1, 32, 98, 112).

Наиболее значимым элементом в системе предупреждения бруцеллезной инфекции является вакцинопрофилактика болезни.

Однако, по мнению Панина А.Н. (55), Девришова Д.А. (33), Джупина г

С.И. (34), Литвинова О.Б. (50) и др. значительные трудности в решении данного вопроса создают циркулирующие измененные варианты возбудителя бруцеллеза: R, RS, SR и клетки с дефектной клеточной стенкой (L- формы), о существовании которых сообщали многие отечественные и зарубежные ученые. Применение антибиотиков, а также появление вышеуказанных атипичных форм, значительно снижают эффективность бактериологического исследования, которое также связано с многообразием плотных питательных сред, необходимых для идентификации бруцелл. •

Измененные формы бруцелл, несмотря на их пониженную патогенность, способны к реверсии в исходные формы и могут вызвать вспышки бруцеллеза. •

В нашей стране и за рубежом проводились и ведутся исследования по разработке и оценке эффективности различных препаратов для специфической профилактики бруцеллеза у животных. Несмотря на это, в РФ до настоящего времени официальное признание имеет живая вакцина на основе аттенуированного штамма В. abortus 19, которая была предложена в 1946 году Вершиловой П.А. (18). С 1952 года данная вакцина широко используется для иммунизации животных.

В то же время многими исследователями (21, 25, 40, 49, 81, 97) напряженность иммунитета, обусловленного введением живой вакцины на основе аттенуированного штамма В. abortus 19, с течением времени быстро снижается. Это определяет сравнительно невысокий ее защитный эффект.

Вершилова П.А. (18) указывает, что через 1, 4 и 12 месяцев после прививки уровень заболеваемости составляет, соответственно, 17,3%, 32,7% и 50,0%. Через 1 год после иммунизации положительные серологические и аллергические реакции обнаруживаются лишь^у 25-50% привитых. При этом в экспериментах на животных было показано, что предлагаемая вакцина защищает от небольших доз возбудителя (1-5 ИД50).

Кроме того, длительная персистенция возбудителя в организме создает значительные трудности в разграничении иммунного и инфекционного процессов.

В качестве альтернативы живым вакцинам неоднократно предпринимались попытки создания химических и инактивированных вакцин против бруцеллеза (36, 45, 65). Одним из достоинств использования их в медицине считается возможность одновременного применения подобных вакцин с антибактериальными препаратами. В основе предлагаемых химических вакцин используются полученные различными методами экстракции растворимые антигены микробных клеток.

Другим решением задачи специфической профилактики бруцеллеза представляется создание инактивированных вакцин на основе убитых культур бруцелл. Подобные препараты в настоящее время находят применение в ветеринарной практике. К их числу можно отнести вакцину 53Н38 - «Абро-лан», которая представляет собой суспензию инактивированных формалином микробных клеток В. melitensis, штамм Н3£ находящихся в S-форме, и полидисперсного адъюванта; вакцину 45/20 - «Абортос», состоящую из суспензии инактивированных формалином микробных клеток В. abortus, штамм 45/20 (R-форма) и полидисперсного адъюванта (53).

В последние годы Шумиловым К.В. и Калмыковым В.В. (76) запатентована «Вакцина против бруцеллеза крупного'рогатого скота». Она содержит в р , своем составе инактивированную формалином с гидратом окиси алюминия бактериальную массу (300-400* 109 микробных клеток в 1 мл B.abortus, штамм № KB 17/100 в R-форме и неполный адъювант Фрейда. По данным авторов, эта вакцина, не индуцирующая образование S-антител, способна обеспечивать защиту от бруцеллеза 69-80% морских свинок при заражении их вирулентными культурами В. abortus через 3 месяца после вакцинации.

В этих условиях современная иммунология стремится к совершенствованию и созданию новых вакцинных препаратов на принципиально новых подходах, основанных на использовании знаний о клеточных и молекулярных механизмах развития иммунитета, точных данных о структуре антигенов и кодирующих их генах, на применении современных методов биотехнологии и компьютерного анализа.

В настоящее время в РФ проводятся исследования по созданию Сплит-вакцины (split - англ. расщеплять), состоящей из антигенов бруцелл, полученных химическими и физическими методами. Сплит-вакцины не являются гомогенными, содержат примесь отдельных органических соединений или комплексы, состоящие из белков, полисахаридов и липидов.

Поиск высокоэффективных и безопасных для человека и животных средств иммунопрофилактики бруцеллеза в последние годы преимущественно направлен на изыскание щадящих способов инактивации микроорганизi мов, а также методов выделения структурных компонентов бруцелл, сохраняющих полноценными их иммуногенные свойства (89, 95, 106).

Поэтому, выбор оптимальной антигенной основы для создания противо-бруцеллезных вакцин для животных является актуальной задачей для ветеринарии.

Цель и задачи исследований.

Цель настоящих исследований - получить различные антигены культур штаммов Brucella melitensis Rev-In Brucella abortus 19 В А и оценить перспективность их использования в качестве основы противобруцеллезной вакцины для мелкого рогатого скота.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить посевные культуры штаммов В. melitensis Rev-1 и В.abortus 19 ВА при культивировании их на плотных и жидких питательных средах.

2. Провести культивирование В. melitensis Rev-1 и В. abortus 19 В А в биореакторах марки «Биор 0,25» и сконцентрировать их биомассу методом ультрафильтрации. ^ А

3. Получить субклеточные фракции культур штамма В. melitensis Rev-1 различной функциональной направленности.

4. Получить корпускулярные антигены культур штаммов В.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А и приготовить комбинированный корпускулярный антиген изучаемых бруцелл.

5. Смоделировать инфекционный процесс при бруцеллезе на лабораторных животных и разработать метод обострения течения инфекции.

6. Изучить иммуногенность приготовленных антигенов бруцелл в опытах на лабораторных животных.

7. Изучить иммуногенность комбинированного инактивированного корпускулярного антигена в опытах на овцах. •

Научная новизна.

1. Впервые получен комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношении 1:2, обладающий иммуногенными свойствами. Титр антител у иммунизированных морских свинок и овец составил не менее 1:50.

2. Применение комбинированного инактивированного корпускулярного антигена для специфической профилактики бруцеллеза у овец позволяет предотвратить заражение бруцеллезом 80.% животных.

•

3. Полученные методом гель-хроматографии белковые фракции В. melitд ensis Rev-1 с молекулярной массой (135±1,5) кД, (50±10) кД и (25±5) кД обладают слабыми иммуногенными свойствами^и являются не перспективными для создания на их основе вакцинных препаратов для специфической профилактики бруцеллеза животных.

4. Впервые установлено, что введение иммунодепрессанта циклофосфаI на в дозе 200 мг/кг веса животного на 21-30 сутки после инфицирования возбудителем бруцеллеза обеспечивает обострение инфекционного процесса и повышает на 20% информативность бактериологического метода обследования искусственно зараженных морских свинок и овец. л •

5. Применение усовершенствованного бактериологического метода выявления больных бруцеллезом животных с обострением инфекционного процесса путем подкожного введения циклофосфана позволило доказать высокую антибактериальную эффективность пефлоксацина в отношении бруцелл у зараженных бруцеллезом морских свинок. Терапевтическая эффективность пефлоксацина в условиях смоделированного инфекционного процесса при бруцеллезе составила 90%.

6. Впервые разработан метод глубинного культивирования культур штаммов В. melitensis Rev-1 и В.abortus 19 ВА с использованием биореакторов марки «Биор-0,25». Выход биомассы при выращивании культуры штамма B.melitensis Rev-1 был выше в 1,3 раза, чем В.abortus 19 ВА.

Практическая значимость.

1. На производственном участке ООО «Агровет» (г. Киров-200) воспроизведена технология глубинного культивирования культур штаммов В. melitensis Rev-1 и В.abortus 19 В А с использованием биореакторов марки «Биор-0,25». Получено по 3 серии культур штаммов бруцелл с высоким выходом бактериальной массы.

2. На базе лицензированной по работе с микроорганизмами I-IV групп патогенности лаборатории НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров) успешно проведено моделирование инфекционного процесса при бруцеллезе морских свинок и овец. Разработан метод обострения инфекционного процесса с использованием иммунодепрессанта циклофосфана.

3. Разработанный комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19

ВА в соотношении 1:2 является перспективным для создания на его основе j вакцинного препарата для специфической профилактики бруцеллеза животных.

4. По результатам исследований составлены и утверждены в установленном порядке 2 отчета о научно-исследовательской работе (промежуточный и заключительный) на тему: «Создание иммунббиологических средств защиты животных на основе корпускулярных коньюгированных и субъединичных компонентов микроорганизмов-возбудителей бактериальных и грибковых (Trichophyton) заболеваний».

5. Разработаны методические рекомендации: «Технология глубинного культивирования вакцинных штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА», «Метод обострения инфекционного процесса при бруцеллезе животных», «Получение растворимых и корпускулярных антигенов бруцелл».

6. Материалы исследований используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ при изучении дисциплин «Иммунология», «Ветеринарная микробиология» и «Биотехнология».

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит непосредственное участие во всех этапах работы, в т.ч. в культивировании бруцелл поверхностным и глубинным методами, в получении различных белковых фракций бруцелл методом гель-хроматографии, создании комплексного корпускулярного инактивированного антигена изучаемых бруцелл, моделировании инфекционного процесса при бруцеллезе на морских свинках и овцах, определении реактогенности и иммуногенности полученных антигенов с использованием лабораторных животных и овец, анализе и обобщении полученных результатов исследований.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с микробиологом производственного участка ООО «Агровет», доктором биологических наук, профессором Кузнецовым С.М., которому выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.

Апробация результатов диссертации: Основные результаты исследований доложены на научно-практической конференции молодых ученых (Москва, 2006); на XV Московском международном ветеринарном конгрессе, на секции «Болезни крупного рогатого скота» (Москва, 2008); на международной конференции «Щука и образование для целей биобезопасности» (Пущино, 2008); на международной научно-практической конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства в России и пути их решения» (г. Дубровицы, 2008).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 статьи, в т.ч. 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК (Ветеринарная медицина, Ветеринария и кормление).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 129 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение полученных результатов, практическое использование полученных научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (121 источник, в т.ч. 39 - иностранных авторов). Работа содержит 25 таблиц, 14 рисунков, 10 страниц прилржений.

Заключение диссертации по теме «Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов», Крыканов, Артем Александрович

4. ВЫВОДЫ

1. Методами гель-хроматографии, ультразвуковой дезинтеграции, «замораживания-оттаивания» и термохимического инактивирования получены растворимые и корпускулярные антигены двух штаммов бруцелл B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА (суммарные белки B.melitensis Rev-1; белковые фракции B.melitensis Rev-1 с молекулярными массами 135±15, 50±10 и 25±5 кД; инактивированные .корпускулярные антигены B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А; комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношении. 1:2), 9бладающие иммуногенными свойствами.

2. Полученные методом гель-хроматографии на сефадексе G-100 белко * * » вые фракции B.melitensis Refv-1 с молекулярными массами 135±15, 50±10 и

25±5 кД содержали от 12;0±0,09% до 25,0±0,2%, белка и от 13,2±0,9 до 31,0 * I *

0,9% нейтральных Сахаров при отсутствии • лйпополисахаридов. Данные фракции вызывали выработку антител у морских свинок в титре 1:10, но не обладали протективными свойствами. "

3. Бруцеллы устойчивы к замораживанию и последующему оттаиванию микробной < суспензии и получение дезинтегрированных культур штамма B.melitensis Rev-1, не.содержащих Лживые клетки бруДелл, возможно только после проведения 10 циклов «замораживания-оттаивания». Концентрация • 1 ф суммарных белков бруцелл при этом составляет 60 мгУмл. \ *«

4. При получении инактивированного корпускулярного антигена добавление в концентрированную микробную суспензию бруцелл формальдегида

Л > ' 0 до конечной концентрации 0,4% и двукратное нагревание суспензии до 48 С I в течение 1 'часа приводит к полной инактивации бруцелл и сохранению це

1 . % лостности клеток. *

• ч *

5. Комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на ос

• к нове культур штаммов В', melitensis Rev-1 и B.abortus 9 ВА в соотношении

1:2 вызывает у иммунизированных морских свинок и овец образование агглютининов в титре 1:50 и является перспективным в качестве основы вакцинного препарата. Применение данного антигена для специфической профилактики бруцеллеза у овец позволяет предотвратить болезнь у 80% животных. 0

6. Применение иммунодепрессанта циклофосфана в дозе 200 мг/кг веса животного на 21-30 сутки после инфицирования возбудителем бруцеллеза обеспечивает обострение инфекционного процесса и повышает на 20% информативность бактериологического метода обследования искусственно заt * • • раженных морских свинок и овец.

7. Применение усовершенствованного бактериологического метода выявления болы£ых бруцеллезом животных с обострением инфекционного про

• * • t цесса при использовании циклофосфана позволило доказать высокую анти> . бактериальную эффективность пефлоксацина в отношении бруцелл у зараженных бруцеллезом морских свинок. Терапевтическая эффективность пефлоксацина в .условиях смоделированного инфекционного процесса при бруцеллезе составила 90%. • < i

8. Технология выращивания культур щтаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор-0,25» при температуре (37±1)°С, давлении (0,10±0,05) МПа, коэффициенте аэрации (0,7±0Д) дм3/мин, частоте ч вращения -мешалки 120 об/мин, продолжительности культивирования 28 ч, в питательной среде на- основе гидролизата мяса с содержанием аминного азота

13 0-1 fit) мг% является воспроизводимой. Получено по 3 серии культур штаммов B.meHtensis Rev-1, и B.abortus 19 В А с высоким выходом биомассы микробный; клеток - (27±7)х109 м.к./см3 и (21±5)х10® м.к./см3 соответственно.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. По результатам проведенных экспериментов составлены 2 отчета:

- «Создание иммунобиологических средств защиты животных на основе корпускулярных коньюгированных и субъединичных компонентов микроорганизмов-возбудителей бактериальных и грибковых (Trichophyton) заболеваний» (промежуточный, утв. в 2007 г);

- «Создание иммунобиологических средств защиты животных на основе корпускулярных коньюгированных и субъединичных компонентов микроор-ганизмов-дозбудителей бактериальньГх и грибковых (Trichophyton) заболеваний» (заключительный, утв. в 2008 г); *

2. Разработанные режимы "глубинного культивирования культур штам

II * • мов В. melitensis Rev-1 и .B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор-0,25» используются на производственном участке ООО «Агровет» (г. Киров-200) для получения биомассы бруцелл с целью приготовления вакцинных препаратов. ' «

3. РазраС&танныи мето!ц обострения инфекционного процесса с испольг зованием иммунодепрессанта циклофосфана применяется лабораторией НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров), лицензированной по работе с микроорганизмами I-JV групп патогенности, при моделировании инфекционных про, ' t цессов при особо опасных болезнях человека и животных.

4. Разработанный комбинированный инактивирд^занный корпускулярный антиген на основе культур штаммов .В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношенйи 1:2 является' основой дця создания вакцинного препарата для специфической профилактики бруцеллеза животных.

5. Разработанные методические рекомендации «Технология глубинного культивирования вакцинных штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19

I '

ВА», «Метрд обострения инфекционного процесс^ при бруцеллезе животных», «Получение растворимых и корпускулярных антигенов бруцелл» используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» при изучении дисциплин «Иммунология», «Ветеринарная, микробиология» и

Биотехнология», f

6. РЕКОМЕНДАЦИЙ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ' ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать научно-производственным учреждениям комбинированный инактивированный корпускулярный антиген йа основе культур штаммор В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношении 1:2 в качестве ь основы для создания вакцинного препарата для' специфической профилактики бруцеллеза животных!.

2. Отработанные технологические параметры и режимы культивирования культур штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА с использованием биореакторов марки «Биор;0,25» рекомендуются' для приготовления бвак-цинных препаратов на основе других микроорганизмов.

3. Методические рекомендации «Технология глубинного культивирования вакцинных штамм9в В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА», «Метод обо» '

• » • > v * стрения инфекционного процесса при бруцеллезе животных», «Получение 1 . . растворимых и корпускулярных антигенов бруцеЛл» рекомендуется использовать в учебном процессе по дисциплинам «Иммунология», «Ветеринарная микробиология» и «Биотехнология».

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Крыканов, Артем Александрович, 2010 год

1. Авилов В.М. Эпизоотологический надзор при бруцеллезе крупного рогатого скота в современных условиях: Автореф. дисс. доктора вет. наук. С-Пб, 1977. - 49 с. ;

2. Авилов В.М., Селиверстов В.В. Бруцеллёз животных и его специфическая профилактика //Ветеринария. 1997.- № 7.- С. 3-13.

3. Артемов Б.Т. Экспериментальное изучение иммуногенных свойств противобруцеллезной вакцины из штамма В-1 //Иммунитет сельскохозяйственных животных. 1973. - С. 178-183.I

4. Ассонов Н.Р. Микррбиология.- М.: Колос.- 2002.- 350 с.

5. Аутоиммунные процессы у больных различными формами хронического бруцеллеза /О. Ц. Мололкина, А.А. Шульдяков, Е.Г. Гладилина и др. //Успехи современного естествознания. 2006. - № 2. - С. 60.

6. Бажин М.А. Иммунологичесь&я память и толерантность у телят прибруцеллезе //Ветеринария. 1'984. - № 1. -С. 29-30.9

7. Базиков И.А., Бондаренко А.И: Ультраструктура L-форм бруцелл и культур-ревертантов Г/ Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.1991.-№ 1.'-С. i7-20.%

8. Белоусов Е.С., Ощепков В.Г. Иммуноферментный метод для диагностики бруцеллеза КРС. //Сельскоозяйственная биология. 1986. - № 11. - С.i *122.132.

9. Богословский С.Н., Григорьева Г.И. Применение многомерного статистического анализа для сравнительного изучения белковых спектров бактеtрий // Биохим. ц биофиз. микроорг. Горький, 1977. -С. 116-119.

10. Бруцеллы и (руцеЗшез. Микробиология, иммунология, биотехнология /Григорьева Г.И., Сочнев В.В., Бацанов Н.П. и др. /Под ред. Чл.-корр. РАСХН Сочнева В.В.- Н.Новгород: НГСХА.- 1998.- 246 с.

11. Бруцеллез. СП 3.1.085-96, ВП 13.3.1302-96 /Сборник санитарных и ветеринарных правил "Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных".

12. Бруцеллез 'собак, вызываемый В.canis— ретроспективный анализ встречаемости по С.-Петербургу за 2006-2007 г. /Яшин А.В., Кузина Т.Б., Климанов А.И. И др. // Ветеринарная практика. 2007.- № 4. - С. 23-26.

13. Буткин Е.И. Бруцеллез! В кн. Эпизоотология с микробиологией под ред. Бакулова И.А.- М.: Колос,- 1981.- С. 145-152.9 .

14. Вагина JI.A. Диагностика бруцеллеза северных рленей методом им-мунофлуоресценции //Ветеринария. 1972. - № 1. - С. 14-17.

15. Вагина JI.A., Никулина В.И., Гоппе А. С Стабильость свойств

16. Br. rangifere В :209 //Диагностика, профилактика и терапия болезней жи«вотных на крайнем Севере: Сб.науч.тр.- Новосибирск: НГУ,- 1983. С. 3-8.

17. Вашкевич Р.Б., Касьянов И.А. Изучение «ротивобруцелленой вакцины из штамма Rev-1 северных оленях //Диагностика, профилактика и терапия болезней животных на крайнем Севере: Сб.науч.тр.- Новосибирск: НГУ.--1983.-С. 13-16. •

18. Векслер И. Г\ Сравнительное изучение влияния некоторых специфических стимуляторов на иммунный ответ организма // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990.-№ 7. - С. 64-67.

19. Воробьев А.А., Яяшенко В.А. Иммунобиологические препараты: настоящее и будущее //Журнал^микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.1995.-№ 6.-С. 105-111. \ ' Л'" «'" ' ' *

20. Выделение,и идентификация культур В. canis /Скляров О.Д., Клима1.V .нов А.И., Шумилов К.В. и др. // Сборник научных трудов ФГУ «ВГНКИ».

21. М.: ВГНКИ.- 2007-Т. 68.- С. 125- 126.

22. Глонти Т.М. Аллерическое состояние овец, привитых разными вакцинами против бруцеллеза.- Тр. ВГНКИ. 1973. -19.- С. 84-88.

23. Глотов Г.Н!, Глотова Г.И. Опыт оздоровления овец от бруцеллеза //Ветеринария.- 2005. № 3.- С.22-25.

24. Григорьева Г.И., Йгнатовч'П.Е. Протективные антигены как факторы патогенности при конструировании вакцин // Сельскохозяйственная биология. 1987. - N 12. - С. 100-104/

25. Григорьева Г.И., .Игнатов П.Е., Федоров А.И. Спороб получения анfтигенов из бактерии рода ВпюеИа // А.с. 1631786 СССР. 15.09.88. Опубл.oi.ii.9o. . ' ;1.■

26. Григорьева Г.И., Сочнев В.В. Тихомирова Е.А-.'Способ определенияУпротивобруцеллезных антител в биологических жидкостях //А.с. 1387661

27. СССР. 07.г08.86.-'Опубл, 08.12.87. 'f

28. Григорьева Г.И., Сочнев В.В., Игнатов П.Е. Оптимизация биотехнологии получения антигенов бруцелл //Всесоюзн. иммунолог, съезд. Сочи, 1989. - С. 147.

29. Григорьева Г.И., Улицкая А.А. Применение иммуноферментного анализа для определения противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого • скота'//• Вестник сельскохоз.науки. 1990, № 2. -С. 8691. . -'/■ • ■

30. Демина Т.А., < Сочнев В'.В., Григорьева Г.И. Изучение гостальности1 * возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота-/Профил. и лечен, заболев.сельскохоз. животн. в Нечерноз. зоне РСФСР: Сб.нйуч.тр. Горький:1. ГСХИ.- 1985.-С. 13-14.

31. Девришов Д.А., Янышев А.А. Результаты эпизоотологического анализа по бруцеллёзу животных //Ветеринария. 2006. - №. 6 - С. 30.г

32. Деврйшов Д.Д., Янышев А.А. Эпизоотическая обстановка по бруцел' *лёзу животных в Российской Федерации и Республике Дагестан //Ветери• * * • •нарная медицина. 2007. - С. , 16-17.•9 *

33. Драновская Е.А.* Биологические свойства бруцелл и получениедиагностического и профилактического антивена: Автореф. дисс. докт.* »мед. наук. М., 1'97'6. - 44 с.• *• « «

34. Драновская Е.А.,-Вершилова П.А., Чернышева М.И. К вопросу о1. С- * *структуре и биологических свойствах антигенов, выделенных из бруцелл• ••• 1 1

35. Желудкбв fM.M., Павлова И.П., Курманова К.Б. Определение специфических, циркулирующих в крови иммуннщх комплексов при бруцеллезной инфекции // Журнал микробиол., иммунол. и эпидемиол. 1988. - N 8.i 1 ' . , . . -С. 59-62. • ' 't- V

36. Захарова И.Я., Косенко JI.B. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: АН УССР. - 1982. - 165 с.

37. Зинова А.А. Диагностика бруцеллеза собак, вызываемого В. canis. //Ветеринарная патология. 2006.- № 3 (18) - С. 11-14.

38. Игнатов П.Е. Перспективы конструирования вакцин против бруцеллеза на основе их протективного антигена //Бюллетень.ВИЭВ. 1983. - Вып. 50.-С. 3-6.

39. Игнатов П.Е. Обоснование разработки иммуноактивных препаратов для лечения профилактики инфекционных болезней: Автореф. дисс. докт.биол. наук.'- С-Пб. 1994.*- 36 с.• *

40. Игнатов П.Е., Федоров А.И. Способ получения бруцеллезного антигена: А.с. N 1256258 (СССР). 1984.I

41. Климаноь' А.И.', Малахова Т. И., Шумилов К. В. Результаты изучения биологических свойств. штамма Br. abortus 82 // Сборник научных трудов1. ВГНКИ. 1983.- С: 14-19. •

42. Колычев Н.М., ГоСманов Р.Г. Ветеринарная микробиология и иммунология.-М.: Колос.- 2003.- 432 с. .f

43. Косилов И.А., Новицкий А.А. Меры борьбы с бруцеллёзом и туберкулёзом крупного рогатого скота //Ветеринария.- 1987.- № 7.- С. 6-8.1

44. Клинико-лабораторная эффективность циклоферона в комплексном лечении больных Хроническим бруцеллезом /О.Н. Мололкина, А.А. Шульдяг"

45. Костюкова Н.И., Езепчук Ю.В. Методические подходы к конструированию химических вакцин против бактериальных инфекций //Журнал мик-робиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1984. N 8. - С.3-8.

46. Литвинов О.Б:, Девришов Д.А., Янышев А.А. Бруцеллёз в России //Ветеринарная жизнь. 2007. - № 2 - С. 14.

47. Малйков В.Е. Роль липополисахарида бруцелл в формировании ги>перчувствительности замедленного типа //Журнал микробиол., эпидемиол. ииммунобиол. 1986. - № 2. - С. 112-114.♦ *

48. Малышева Л.А. Система противоэпизооТических ' мероприятий при бруцеллезе крупного рогатого скота в зоне интенсивного ведения животноводства: Айтореф. дисс. докт. вет. наук.- С-Пб., 1995. 36 с.' i

49. Механизм действия и применение циклоферона в клинике инфекционных болезней /Е.П. Ляпина, О.Г. Шульдякова, О.Н. Мололкина и др. //Вестник. Санкт-Петербургской государственной академии им. И.И. Мечникова.- 2005,- № 1.- С. 182-185.f

50. Методические рекомендации по диагностике бруцеллеза собак, вызываемого B.canis: ут'вёрждены директором ФГУ «ВГНКИ» Паниным А.Н.

51. М.: ВГНКИ.-2009.-46 с. ' •' •

52. Перспективные вакцины против бруцеллёза крупного рогатого скотаI

53. К.В.Шумилов, О.Д.Скляров, А.И.Климанов и др. // Ветеринария Кубани. -№ 4. 2008. - С. 2-Ч:1.! «

54. Перспективы изучения цитокинового статуса при хроническом бруцеллезе / Е.П. Ляпина, О.Н. Мололкина, И.А. Бережнова и др. //Успехи современного естествознания. — 2004. № 12. - С. 55-56.

55. Прогнозирование рецидивов заболевания у больных хроническим бруцеллезом /Е.Г. Гладилина, Е.П. Ляпина, А.А. Шульдяков т др. //Успехи современного естествознания. 2006. - № 1. - С. 53.

56. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей.- ГТСВ РФ: Методические указания.- утверждены 30.01.2003.- № МУ 3.1.7.1189-03.

57. Показатели цитокинового профиля у больных различными формами хронического бруцеллеза /Е.Г. Гладилина, А.А. Шульдяков, Е.П. Ляпина идр. //Успехи современного естествознания. 2006. - № 1. - С. 54.

58. Показатели интерфероногенеза у больных различными формами хронического бруцеллеза /О.Н. Мололкина, Е.Г. Гладилина, А.А. Шульдяков и др. // Успехи современное естествознания. 2006. - № 2. - С. 60-61.г

59. Рачкова О.Ф., Григорьева Г.И., Лазовская А.Л. Экспресс-идентификация бруцелл Методом газо-жидкостной хроматографии жирных кислот //Актуальн. вопр. профил: бруцеллеза: Сб.науч.тр. Нрвосбирск: НГУ.- 1989.-с. 129-130. '

60. Рягузов В.П., Потатуркин П.М. Изучение на овцах иммуногенности жидкой и сухой вакцины из штамма Br. abortus 21 //Сборник научных трудов Донского СХИ. 1976. - 711. - Вып. 2. - С. 105-109.

61. Ряплова И.В. Современные эпидемиологические особенности бруцеллеза в Оренбургской области //Здоровье наоелени^ и среда обитания. — 2007.-№ 9.'-С. 39-43.- х

62. Ряплова И.В., Скачков М.В. Эпидемиологическая характеристикаф * ' iвспышек бруцеллёза в Оренбургской области за 1990 2006 гг. //Здоровьенаселения и среда обитания. 2007. - № 11. - С. 37 - 39.-

63. Ряплова И.В. Заболеваемость бруцеллезом городского населения Оренбургской области //Материалы IX съезда Всерос. -науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и'паразитологов. М.: Санэпидмедиа.- 2007. -Т. 1.-С. 191. . ' '

64. Ряплова И.В., Скачков М.В. Вспышки бруцеллеза в Оренбургской области //Организация противоэпидемических мероприятий по профилактике геморрагической лихорадки с почечным синдромом: Материалы Всерос. на-уч.-практ. конф. Оренбург,'2007. - С. 138 - 140.

65. Самыгин В.М., Зыкин Л.Ф., Степанов В.М. Газохроматографиче-ский анализ жирнокислотного состава бактерий //Журнал микробиол,, эпидемиол. и иммунобиол. 1994.- № 4.- С. 10-12.

66. Скляров О.Д., Логинов Й.А., Серегин И.Г. Бруцеллез животных. Диагностика, профилактика, меры борьбы и ветеринарно-санитарная экспертиза.-М.: МГУПБ.-2008.-256 с."

67. Синдром эндотоксикоза у больных различными формами хронического бруцеллеза / Е.Г. Гладилина, О. Н. Мололкина, А.А. Шульдяков и др.

68. Успехи современного естествознания. 2006. - № 1. - С. 54-55.1.'

69. Совершенствование дйагностики хронического бруцеллеза: Информационное письмо'.- Утв. МЗ Сарат. обл. /сост: А.А. Шульдяков, О.Н. Мололкина, Е.Г. Гладилина! Саратов: Агро.- 2006. - 6 е.

70. Сочнев В'.В. Проявление бруцеллеза крупного рЬгатого скота в свежем эпизоотическом очаге //Методы профилактики и лечения инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных в Нечерноземье.- Горький: НИВИ.- 1984. -С.'21-27.1.'

71. Сочнев В.В.' Григорьева Г.И., Горчакова Н.Г. Нетрадиционные методы исследований при дифференциальной диагностике бруцеллеза живот' * * . •ных.- Н.Новгород: ДСХА.- 1997. 96 с.

72. Таран И.Ф., Лямкин- Г.И. Бруцеллез (Микробиология, иммунология, эпидемиологияj"профилактика). Ставрополь, 1996. - 176 с.

73. Шевкопляс В.Н. Обеспечение эпизоотического благополучия и безопасности в ветеринарно-санитарном отношении продукции животного происхождения российского производства в Краснодарском крае // Ветеринария Кубани.-№5.-2008.-С. 2-5. ,г

74. Юсковец М.К. Бруцеллез сельскохозяйственных животных.- М.: Колос. 1960. - 228 с.'.' "• *

75. Юсковец М.К., Комсова Д-.И. Данные по испытанию вакцины противбруцеллеза из штамма Br. abortus 68 // Труды ГНКИ вет. препаратов. 1955. 5.-С. 84-93..

76. Янышев А.А. Бруцеллёз крупного и мелкого рогатого скота в Южном федеральном округе: эпизоотологичекий мониторинг и совершенствование против9эпи-зо-отичеСких мероприятий.// Автореф. дисс. канд. вет. наук. -Москва. 2007. -21 с.

77. Янышев А-А. Эффективности вакцинопрофилактики против бруцеллёза сельскохозяйственных животных в Южном Федеральном округе //Деп. в

78. ВИНИТИ 25.04.2007 № 472-В 2007. . * ;1.. • • •

79. Яременко. Н.А. Эпи5осГгическая ситуация в мире и Российской Федерации. М.: Знание. - 200li ^ 48 с.

80. Яковлев • А.Г. Эп'изоотолого-эпидемиологическая характеристика бруцеллеза в Оренбургской области //Актуальные -проблемы здоровья населения Сибири: Сб.науч.тр. Ом.ск: ОГУ.- 2004. - Т. 1. - С. .382 - 385.• • *

81. Afzai М., Brodie S.J.,Tengerdy R.P. Isolation and antigenic activity of

82. Brucella ovis outer membrane proteins //J. Clin. Microbiol., .1987.-25. - P. 2132* . f *2137. ' ' '

83. Aldret-Servent A., Bourg G., Ramus M. DNA polymorphism in strains of the genus Brucella //J.Bacterid. 1989. - 170. - № 10 - P. 4603-4607.

84. Antczak D.F., Winter A.J. Evaluation of lymphocyte blastogenesis for diagnosis of bovine brucellosis // 3rd Inter. Symp. on Brucellosis. Algiers, Algeria., 1983. Envelop, biol.- Standard. - 1984. - V.56. - P.357-370.1. V *

85. Baldwin C.L.y Verstreate D.R., Winter A.J. Immune response of cattle to

86. Brucella abortus outer membrane proteins measured by lymphocyte blastogenesis //Vet. Immun. Immunopathol. 1985. -9. - P.383-388.

87. Bertram A.F., Eter C., Canning J.A. et al. Preferential inhibition of primary granule release from bovine neutrophilis by a brucella abortus extract // Inf. Imm. 1986. -V.52. - No.l. - P.285 - 292.

88. Berman D.T., Kurtz R.S. Relationship of biological activities to structures of brucella abortus endotoxin and LPS // Ann. Inst. Pasteur. Microbiol 1987. -138. -№ 1. P. 98-101."

89. Berman D.T., Wilson Ei.L, Moreno E. Characterization of Brucella abortus soluble antigen employed in immunoassay // J. Of Clinical Microbiol. 1980. -№ 11.-P. 355-362.'

90. Bosseray-N. Infection du placenta de la souris par Brucella pathogenie etimmunite // 3rd Inter. Symp. on Brucellosis. Algiers, Algeria., 1983. Develop, biol

91. Standard.- 1984. -V.56.- P!- 283-293.i

92. Canning P.C,., Roth J.A.,' Deyoe B.L Release of 5-guanosin monophos*»phate and adenin by B. abortus and their role in the intracellular survival of bacteria // J. Infeqt. Dis. 1986. - ,154.'. p 414. ' ^

93. Chen I.M., Thoen CQ.5jPietz D.E. Application often enzyme-linked im%munosorbent assay for detection of Brucella antigenes in vaginal discharge of cows //Amer. J. Vet. Res. 1984.- V. 45. - № 1 - P. 32-34.

94. Chukwu ,C.C. Comparison .of the brucellin skin test with the lymphocytef' • . ' . ;transformation test in bovine brucellosis // J. Hyg. 1986.- 96. - № 3. - P. 403-413.

95. Corbel M. J. Brucella phages : advances in the development of A reliable phage typing system smooth and non-smooth brucella isolates //2rd Forum in Microbiology Brucella and brucellosis Ann. Inst. Pasteuer Microbiol. 1987. - V. 138 .-№ l.-P. 70-75.

96. Corbel M. J. Brucellosis: An Overview // Emerg. Infect. Dis. 1997.

97. Apr; 3. P. 213-22 12. Lang R., Banai M., Lishner M., Rubinstein E. Brucellosis //1.ternational J. of Antimicrobial Agents. 1995. - 5. - N 4. - P.203-208

98. Dubray G Proective antigens in brucellosis // 2 rd Forum in Microbiology Brucella and brucellosis: Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 1987. - V. 138 .- № 1.- P. 84-87.•t *

99. Frenchick P.J., Markham R.J., Cochrane A.M. Inhibition of phagosome-lysosome fusion in macrophages by soluble extracts of virulent Brucella abortus //1. У t ' • . •

100. Am. J. Vet. Res. 1985. - 46 3^2-338.i .

101. Juszczyk J. Brucella abortus infection as a-clinical problem // Hexagon1. F • % щ

102. Roche. 1984.- 12.- № 6. - P. 11-16. * • *i t * ,

103. Isbert R.R., Voorchis'D.L., Falkow S. Identification of invasin a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian Cells // Cell.- 1987.50. P. 769-775. •• ' , f ' •

104. Lord V.R., Rolo M.R., Cherwonogrodzky J. W. Evaluation of humoral immunity to Brucella spp. in cattle by use of an agar-gel immunodiffusion test containing a polysaccharide antigen // Amer. j. Veter. Res. 1989.,- V. 50. - № 11. - p. 1813-1816. ; .r

105. Lubani M., Sharda D., Helin T. Probable transmission of brucellosis from breast milk to a newborn // Trop. Geogr. Med. 1988. - 40. - P. 151-152.

106. Marx A., Jonescu J., Pop A. Immunochemical studies on Brucella abortus lipopolysaccarides //Zbl. Bakt.'; I. Abt. Orig. 1983. - 253. - P.544-553.к• r •

107. Meyer M.E. Inter and'intra-strains variants in the genus Brucella // 3rd Inter. Symp. on Brucellosis , Algiers, Algeria., 1983. - Develop, biol Standard .1984. V. 56".-P.79-83.

108. Montaraz J'.A., Winter A.J., Hunter D.M . Protection against Brucella abortus m mice with O-polysaccharide-specific monoclonal antibodies I I Infect. Immun. 1986. - 51.- P. '961-963. Jt » •л . "

109. Morgan W.J.B. Brucella classification and regional distribution // 3rdi1.ter. Symp. On Brucellosis , Algiers, Algeria., 1983. Develop, biol Standard . -1984. - V. 56. - P.45-53.

110. Nielsen K„ Wright P. F., Cherwonogrodzky J., Duncan J. R. Enzyme immunoassay for diagnosis of bovine brucellosis // 2rd Forum in Microbiology Brucella and brucellosis: Ann. Inst! Pasteur Microbiol. 1987. - V. 138 .- № 1.-P.75-79. - ' * •; ' T

111. Plommet M. Brucellosis and immunity : Humoral .and cellular compoTnents in mice// 2rd Forum in Microbiology Brucella and'brucellosis: Ann. Inst. Pasteur Microbiol-. 1987. - V. 138 .- № 1 . P.105-110.1

112. Riley L,'Robertson D. Ingestion and intracellular survival of Brucellaabortus in human and bovine, polymorphonuclear leukocytes // Infect, and Immun.- 1984. 46. - № 1. - P-224-230. i

113. Ryter A., Chastelli.er C. Phagocyte Pathogenic Microbe Interactions

114. Anternat. Review of Cytology, 1983. - 85. - P. 287-327.

115. Santos J. М.м Verstreate D. R., Perera V. V., Winter A. J. Outer membrane proteins from rough strains of four Brucella species // Infect. Immun. 1984. -46. -P. 188-194:

116. Smith L. D., Ficht T. A. Pathogenesis of Brucella // Crit. Rev. In Microbiology. 1990. - 17. -№ 3. - P. 209-230.

117. Tabatabai'L В., Deyoe B.L Specific Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detection of Bowine Antibody to Brucella abortus // J. Ctin. Microbiol. -1984. 20. - № 2. - P. 209-213.'

118. Verstreate D.R. Creasy M.T., Caveney N.T. Outer membrane proteins of Brucella abortus isolation and characterization // Infect. Immun. 1992. - 35. -P. 979-984. . ' \

119. Winter A.J-., Rowe G.E., Duncan J.R. Effectivenes of natural and syn?thetic complexes of porin arid О polysaccharide as vaccines against Brucella abortus in mice // Infect, and Immun: -2002.- 56.- № 11.- P. 2808-2817.•

120. Worthington R., Weddelt A.,'Penrose M. Comparision three serologica.l methods for , detecting B.ovis infected ovises // New Zeland Vet. J. 1994. - 32. -P. 58-60.