Получение ферментных субстанций из поджелудочной железы крупного рогатого скота тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Заболоцкая Елена Романовна

• Заболоцкая Елена Романовна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Заболоцкая Елена Романовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Применение ДНКазы

1.2. Применение РНКазы

1.3. Применение протеолитических ферментов трипсина и химот-рипсина

1.4. Способы фракционирования

1.5. Ферментативная активность

1.6. Методы идентификации ферментов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

2.2. Измерения

2.2.1. Методики количественного определения содержания белка

в экстракте и получаемых элюатах

2.2.2. Методики определения ферментативной активности в экстракте и получаемых элюатах

2.2.3. Качественный анализ содержания белков в экстракте

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Подготовка экстракта поджелудочной железы КРС

3.2. Стадия ионообменной хроматографии

3.3. Стадия гидрофобной хроматографии

3.3.1. Разделение трипсиногена и химотрипсиногена

3.3.2. Разделение рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы

3.4. Обессоливание и концентрирование ферментов

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 85 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 90 БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ТЕРМИНОВ И СОКРАЩЕНИЙ

ЛИТЕРАТУРА

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение ферментных субстанций из поджелудочной железы крупного рогатого скота»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений современной биотехнологии. Ферментные препараты широко используются во многих отраслях промышленности: медицинской, микробиологической, парфюмерной, сельскохозяйственной и других. Особое значение в настоящее время приобретает получение лекарственных средств на основе ферментов из животного сырья, которые могут успешно заменить препараты аналогичного действия, производимые химическим и микробиологическим синтезом. Гидролитические ферменты имеют ряд особенностей, выгодно отличающих их от другого вида сырья: высокая эффективность в микроколичествах, высокая специфичность, быстрое достижение желаемого результата, возможность создания на их основе продукта с заданными свойствами [1].

В настоящее время не теряют своей актуальности препараты высокоочи-щенных протеаз поджелудочной железы - трипсин и химотрипсин. Оба фермента обладают высокой протеолитической активностью, воздействуют только на некротическую ткань, не оказывая литического действия на живые клетки вследствие наличия в них специфических ингибиторов. Нуклеазы поджелудочной железы -РНКаза и ДНКаза, обладают в первую очередь противовирусным, противовоспалительным эффектом. Оба фермента могут применятся для лечения вирусных инфекций, таких как герпес, энцефалит, лихорадка Эбола, вирусный конъюктивит. РНКазы различных типов широко используются в биохимических лабораториях, поскольку каждый тип имеет специфичность к своему типу реакции расщепления РНК. Использование гидролитических ферментов в медицинской практике в виде внутримышечных и, в особенности, внутривенных инъекций предполагает высокую степень очистки.

Ужесточение требований к качеству лекарственных препаратов требует создания новых подходов к технологии их выделения и очистки.

Потребность в ферментных препаратах определяет необходимость совершенствования технологии их выделения с целью получения высокоочищенных ферментов. В настоящее время при получении высокоочищенных ферментных препаратов значительную роль играют сорбционные методы, которые, однако, недостаточно широко используются в промышленности. Особенности физико-химических свойств белковых макромолекул, а именно: большая молекулярная масса, лабильность молекулы, с одной стороны, и многокомпонентность растворов, содержащих помимо целевых компонентов большое количество примесных соединений различной природы, с другой стороны, свидетельствуют о том, что выделение и очистка ферментов представляет определенные трудности.

Наиболее эффективным является комплекс технологических операций, с помощью которых на одном и том же оборудовании можно получать несколько препаратов в едином технологическом цикле.

В этой связи перспективным является разработка сорбционно-хроматографического метода выделения и очистки панкреатической ДНКазы, РНКазы, ТС и ХТС, выделенных из поджелудочной железы крупного рогатого скота (КРС).

Степень разработанности темы. Существенный вклад в развитие технологий получения ферментных препаратов медицинского, технического и ветеринарного назначения внесли такие отечественные и зарубежные ученые, как Глазова Н.В., Беленький Н.Г., Полонская Л.Б., Чамин Н.Н, Царенко О.В., Рудометова Н.В., Османов В.К., Бирюкова О.В., Борисова А.В. Mccarty М., Kanayass Sh., Itayan M., Asgeirsson I B., Fox J. W., Bjarnason J. B. и другие.

Существующие технологии предназначены для получения одного или двух продуктов в рамках единой технологической схемы, а применяемые методы выделения и очистки ферментных систем основаны на их высаливании, что, в отличие от гидрофобной хроматографии, не позволяет сократить количество и объем посторонних электролитов. Конечный этап очистки ферментов предполагает использование диализа, который, в отличие от ультрафильтрации, не позволяет по-

лучить концентраты и даже разбавляет полученные субстанции, что приводит к увеличению затрат на их последующую лиофилизацию.

Все вышесказанное обусловливает необходимость изучения и разработки процессов экстракции, выделения, фракционирования, очистки, и хранения панкреатических ферментов, а также новых технологических процессов и замкнутых технологических циклов производства ферментных препаратов, с учетом вопросов охраны окружающей среды.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлась разработка новой технологии получения четырех панкреатических ферментов в рамках единой схемы с применением современных приемов выделения и очистки.

Для достижения цели решались следующие задачи:

- провести исследования условий предварительной подготовки экстракта поджелудочной железы, включающей его осветление, для снижения вязкости и удаления балластных жировых компонентов;

- модифицировать методики идентификации и определения активности исследуемых ферментов в полученном экстракте поджелудочной железы и выделенных фракциях;

- изучить влияние сорбентов и условий фракционирования подготовленного экстракта с использованием препаративной ионообменной и гидрофобной хроматографии;

- экспериментально обосновать режимы обеспечения селективной сорбции и элюции исследуемых ферментов;

- разработать технологию получения целевых ферментных субстанций из поджелудочной железы КРС.

Научная новизна. Разработан способ предварительной подготовки экстракта поджелудочной железы КРС, включающий его осветление путем использования приемов криоденатурации и изменения кислотно-основного равновесия. Впервые разработаны методики разделения и очистки фракций протеолитических ферментов (ТС и ХТС) и нуклеаз (РНКазы и ДНКазы) с использованием препаративной ионообменной и гидрофобной хроматографии.

Экспериментально доказана возможность получения ферментных субстанций протеолитических ферментов (ТС и ХТС) и нуклеаз (РНКазы и ДНКазы) из экстракта поджелудочной железы КРС в едином технологическом цикле.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основании проведенных теоретических и экспериментальных исследований предложен эффективный способ разделения фракций и последующей очистки панкреатических ферментов ТС, ХТС, РНКазы и ДНКазы), выделенных из поджелудочной железы КРС, исключающий недостатки традиционной схемы очистки и позволяющий увеличить выход целевых ферментных субстанций, сократить время технологического цикла за счет последовательного использования ионообменной и гидрофобной хроматографии и повысить удельную активность полученных ферментных субстанций. Подобраны условия фракционирования панкреатических ферментов, которые рекомендованы к применению для промышленного производства препаратов медицинского и ветеринарного назначения. Предложены модифицированные экспресс-методики определения активности панкреатических ферментов в полученных фракциях экстракта поджелудочной железы.

Методология и методы исследования. В работе использованы современные, физическо-химические, биохимические методы исследования ферментов, модифицированная методика анализа ферментативной активности в пробах полупродуктов, а также методы математической статистики и планирования эксперимента.

Основные положения, выносимые на защиту:

- способ предварительной подготовки экстракта поджелудочной железы КРС и режимы его осветления для последующего фракционирования;

- методика фракционирования и очистки панкреатических ферментов поджелудочной железы КРС с использованием ионообменной и гидрофобной хроматографии;

- технология получения ферментных субстанций из поджелудочной железы

КРС;

- результаты исследований активности и выхода полученных ферментных субстанций.

Степень достоверности и апробация результатов. Научные результаты выполненной работы обладают высокой степенью достоверности и воспроизводимостью экспериментальных данных, что подтверждается применением современных методов математической обработки экспериментальных данных и сопоставимостью результатов эксперимента. Материалы диссертации доложены на третьем национальном конгрессе с международным участием «Здоровые дети — будущее страны» (ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет», Санкт-Петербург, 2019 г.).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 4 печатные работы в изданиях, рекомендованных ВАК.

1. Заболоцкая, Е. Р., Виноходов Д. О. Современные методы выделения и очистки ферментов. Отделение нуклеаз от протеолитических ферментов в экстракте поджелудочной железы крупного рогатого скота. // Известия СПБГТУ (ТИ). - 2018. - № 47 (73). - С. 62-68.

2. Заболоцкая, Е. Р., Виноходов Д. О. Осветление экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота. // Известия СПБГТУ (ТИ). - 2018. - № 47 (73). - С. 69-72.

3. Заболоцкая, Е. Р., Виноходов Д.О. Применение протеолитических ферментов и нуклеаз в биомедицине и биотехнологии. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. - 2018. - № 4. - Т. 14. -С. 71-74

4. Заболоцкая, Е. Р., Виноходов Д.О. Современные методы выделения и очистки ферментов. Разделение трипсиногена и химотрипсиногена. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. - 2020. -№ 1. - Т. 16. - С. 27-34

5. Заболоцкая, Е. Р., Сазанов А. А. Современные методы выделения и очистки ферментов. // Ветеринария, Зоотехния и Биотехнология. - 2018. - № 12. -С. 106-111.

6. Заболоцкая, Е. Р., Виноходов Д. О. Отделение нуклеаз от протеоли-тических ферментов в экстракте поджелудочной железы КРС //Рецензируемый научно-практический журнал «Медицина: теория и практика». Сборник трудов третьего национального конгресса с международным участием «Здоровые дети — будущее страны». Под редакцией Д.О. Иванова, Ю.С. Александровича, Р.А. На-сырова, В.И. Орла, Ю.В. Петренко. - СПб. - 2019. - Т. 4. - № S. - С. 213-214.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных данных и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 114 источников отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 111 страницах, содержит 8 таблиц, 22 рисунка.

Декларация личного участия автора. Диссертация содержит фактический материал, непосредственно полученный автором в период с 2013 по 2018 гг. Работа проведена в лаборатории Кафедры молекулярной биотехнологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)», а также в лаборатории Микробиологической Защиты № 6 Всероссийского Института Защиты Растений (ВИЗР, г. Пушкин).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Из всех многочисленных процессов, протекающих в живой клетке, едва ли имеется хотя бы один, который не был бы связан с ферментативным катализом [3, 4]. Вследствие этого ферменты имеют очень большое значение в медицине [5, 6]. В последние годы изучается возможность применения ферментных препаратов в комплексной терапии многих заболеваний в различных отраслях медицины [7, 8, 9, 10, 11].

Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, ДНКаза, РНКаза) относятся к препаратам, разрывающим полимеры секрета, обладают прямым действием в ряде мукоактивных препаратов [12].

1. 1 Применение ДНКазы

Еще в исследованиях 1950-1960-х гг. было выявлено большое содержание ДНК в инфицированном легочном экссудате больных кистозным фиброзом (му-ковисцидозом) и было показано, что применение бычьей панкреатической ДНКа-зы приводило к снижению вязкости секрета легких. Были проведены клинические исследования, в которых показали, что применение ДНКазы в виде аэрозоля у пациентов с пневмонией и муковисцидозом эффективно. Хотя в ряде случаев и вызывает побочные аллергические реакции, которых можно избежать применением рекомбинантной ДНКазы [13]. Вообще все протеолитические ферменты (РНКаза, трипсин, химотрипсин) уменьшают как вязкость, так и эластичность мокроты, обладают противоотечным и противовоспалительным действием. Но применяются в пульмонологии редко в связи с возможным повреждением легочного матрикса и риском развития тяжелых побочных эффектов. Исключение составляет ДНКаза, которую назначают больным с муковисцидозом [14]. Был показан положительный эффект от применения рекомбинантной ДНКазы на улучшение легочной функции у больных муковисцидозом в фазе обострения респираторных симптомов. При-

менение данного препарата хорошо переносится пациентами, не приводит к анафилактическому шоку и аллергическим реакциям [15].

Также было показано, что рекомбинантная ДНКаза эффективна, безопасна и экономически выгодна при использовании у детей, находящихся на механической вентиляции легких после кардиохирургического вмешательства. Согласно полученным данным, дорназа альфа способствует сокращению времени вентиляции, уменьшению риска образования ателектазов и времени нахождения в отделении детской интенсивной терапии [16]. В ряде работ показана эффективность применения рекомбинантной ДНКазы в комплексной терапии больных муковисцидо-зом. Препарат увеличивает активность эластазы лейкоцитов человека и лейкоцитарный катепсин человека в бронхиальном секрете пациентов с муковисцидозом [17]. И поскольку применение рекомбинантной ДНКазы является безопасным, хорошо переносится, то должно быть включено в стандартную схему лечения больных муковисцидозом [18]. Необходимо отметить и другие свойства этого уникального фермента, в частности ДНКаза обеспечивает уменьшение вязкости крови, восстановление реологических свойств, нормализацию клеточного состава, тем самым стимулируя регенеративные процессы в области ишемического некроза тканей [19]. А также использование ДНКазы с различными антибиотиками повышает результативность антибактериальной терапии. Применение данного фермента можно считать целесообразным для эффективного лечения одонтогенных воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области [20].

Возможно применение данного фермента в других биологических биомедицинских исследованиях. Так, например, описано использование протеолитических ферментов в исследовании морфологии вируса герпеса. При этом применение 0,1% трипсина, химотрипсина и пепсина не вызывало деградации белков вирусного капсида и скоплений вирусной ДНК, тогда как применение ДНКазы в концентрации 0,005% полностью разрушило связующие нити между белками капсида и ДНК [21]. А также выявлено, что ДНКаза, продуцируемая вирусом Эпп-штейна-Барра, обладает уникальными биологическими функциями, помимо расщепления ДНК, и может быть использована в качестве маркера вируса Эппштей-

на-Барра [22]. ДНКаза - уникальный фермент, который обладает свойствами белка и собственно ДНК и потенциально лучший биохимический маркер в диагностической практике. По изменению активности ДНКазы возможна ранняя диагностика инфаркта миокарда и ишемических состояний [23]. И конечно, нельзя не отметить противовирусную активность этого фермента: применение ДНКазы в качестве противовирусного препарата показано в комплексной терапии при лечении опоясывающего герпеса [24].

1. 2 Применение РНКазы

Не менее интересен фермент рибонуклеаза. Установлено, что бактериальная РНКаза снижает гемагглютинирующую и цитопатическую активность реовируса серотипа I в клеточной культуре. Фермент оказывает максимальный эффект на снижение размножения реовируса на ранних стадиях его репродукции [25]. Также в будущем возможно применение препаратов на основе РНКазы в онкологической практике, поскольку уже выявлено токсичекое действие бактериальной РНК-азы на линии клеток острого лимфобластного лейкоза человека. Она вызывает гибель этих клеток, индуцируя в них апоптоз, но этот эффект не проявляется в лимфоцитах здоровых доноров, что свидетельствует об ее селективности по отношению к лейкозным клеткам [26]. Комбинация РНКазы и ДНКазы обладает выраженным противовирусным действием, что может быть использовано при лечении различных форм герпеса.

1. 3 Применение протеолитических ферментов трипсина и химотрипси-

на

В современной медицине одной из серьезнейших проблем является образование пролежней у тяжелых больных, что в конечном итоге негативно влияет на общее течение болезни и на возможность выздоровления в целом. Поэтому кроме антибактериальных препаратов для местного лечения пролежней применяют не-

политические препараты (коллагеназа, ДНКаза, трипсин, химотрипсин) [27]. В настоящее время установлено, что процесс репарации раны является ферментативным с необходимым присутствием влажной среды. Поэтому целесообразно использовать при лечении многих кожных заболеваний гидрогелевые покрытия с иммобилизованными протеолитическими ферментами, например трипсином, которые способны размягчать и лизировать некротичиские ткани, обладают антимикробной активностью и охлаждающим действием [28]. Также было отмечено, что фермент трипсин обладает сродством к денатурированным белкам, образующимся в процессе воспаления, благодаря чему их пептидные связи становятся более доступными для гидролитического расщепления [29]. Эти свойства ферментов обусловливают их применение в пульмонологии и оториноларингологии. Изучено, что эндобронхиальное введение протеолитических ферментов трипсина и хи-мотрипсина способствует быстрому разжижению вязкого гнойного секрета, уменьшению воспалительной инфильтрации, очищению очагов деструкции от некротических масс и казеоза, что способствует повышению эффективности лечения больных неспецифическими заболеваниями легких и туберкулеза легких [30]. А также отмечена эффективность использования химотрипсина в комплексном лечении острого верхнечелюстного синусита и экссудативного среднего отита [31]. В то же время протеолитические ферменты трипсин и химотрипсин получили широкое применение в офтальмологии, поскольку именно в этой области медицины образование спаек и шварт, небольшие кровоизлияния могут приводить к тяжелым последствиям, вплоть до потери зрения. Сегодня применение протеолитических ферментов наряду с новейшими антибактериальными, гормональными, антиглаукомными и антигистаминными препаратами способно повысить эффективность лечения многих глазных болезней [32].

Получены результаты, что in vitro трипсин увеличивает скорость свертывания крови, фибринолиза, АДФ- и адреналин инициируемой агрегации тромбоцитов, а также замедляет скорость гемолиза эритроцитов в гемолитической системе в присутствии комплемента (трипсин разрушает белковые факторы системы комплемента на стадии прединкубации), эти результаты свидетельствуют, что проте-

кающие в организме высокоспецифические протеолитические процессы могут регулироваться протеазами и ингибиторами протеаз [33].

Таким образом применение системной энзимотерапии (в т.ч. трипсина и химотрипсина) оказывает как патогенетическое воздействие на развитие патологического процесса, так и повышает биодоступность традиционно назначаемых лекарственных препаратов с одновременным улучшением их переносимости, уменьшением дозировки и длительности приема. Применение ферментных препаратов также является абсолютно безопасным, оправданным методом лечения и способствует уменьшению манифестных клинических проявлений и ускорению сроков выздоровления, в том числе в гинекологии [34].

Также необходимо отметить возможность применения протеолитических ферментов в пищевой промышленности, поскольку уже изучено их применение, в т.ч. трипсина, для гидролиза белков молока с целью получения гипоаллергенных продуктов для детского и специализированного питания, а также для получения компонентов питательных сред в микробиологии [35].

Полученные сведения говорят о том, что в современной медицине применение ферментных препаратов остается необходимым и актуальным. Следовательно, актуальной остается задача по получению чистых субстанций, по созданию пролонгированных и иммобилизованных ферментных препаратов, а также новых лекарственных форм на основе этих препаратов [36, 37, 38, 39].

1. 4 Способы фракционирования

Ферменты представляют собой белковые вещества, катализирующие биохимические реакции в организме. Под их влиянием сложные органические вещества расщепляются на более простые [40]. В настоящее время наука о ферментах -энзимология - превратилась в обширную отрасль, тесно связанную со многими другими науками: биохимией, физической химией, микробиологией, генетикой, сельским хозяйством, медициной и химической технологией [41]. Связь энзимо-логии с таким большим числом отраслей других наук предполагает и широкое

применение ферментов в пищевой и легкой промышленностях, косметологии, генной инженерии, в борьбе с вредителями и в качестве медицинских препаратов [42, 43, 44, 45, 46]. Получение ферментов является задачей биотехнологии, которая заключается в поиске оптимального источника фермента и его дальнейших выделения и очистки [47, 48, 49, 50]. Ферментные препараты трудно или невозможно получить химическим синтезом [51, 52, 53, 54].

Для промышленного производства ферментных препаратов и субстанций из сырья животного, микробного и растительного происхождения не так давно еще применяли схему, состоящую из: твердофазной экстракции с последующим освобождением от твердой фазы, концентрирования солями и органическими растворителями и дополнительной очистки методами гель-фильтрации или с применением природных молекулярных сорбентов. В настоящее время у предприятий есть возмоджность осуществления технологического процесса поэтапно с применением сорбционно-хроматографических и мембранных технологий. Они позволяют сократить производственный цикл, увеличить выход и качество целевых ферментных продуктов. Результат от применения сорбционно-хроматографических и мембранных технологий зависит от масштабов промышленного их использования.

В последнее время сорбционно-хроматографические и мембранные технологии перешли в основное направление развития биофармацевтических производственных процессов. Несмотря на относительно высокую стоимость аппаратурного оснащения процессов, использование этих технологий на фоне традиционных методов является очень эффективным.

Выделение и очистка ферментов представляет собой сложную задачу. Процесс выделения состоит в основном из стадий измельчения исходного сырья, экстракции, отделения экстракта от сырья, удаления и регенерации остатков экстра-гента, окончательной очистки продукта с использованием инновационного оборудования [55].

Экстракцию природных веществ из сырья различной природы осуществляют либо извлечением комплекса соединений с последующим разделением на отдельные компоненты, либо полседовательной экстракцией отдельных молекул.

Сложность очистки ферментов заключается в возможности потери активности последних под влиянием экстрагента, температуры, условий проведения экстракции, а также воздействия балластных активных соединений, содержащихся в сырье.

Для удаления сопутствующих примесей в химико-фармацевтической промышленности применяют различные способы проведения экстракции (непрерывная, полунепрерывная, реэкстракция, многократное фракционное экстрагирование, противоточное экстрагирование), а также электрофорез и диализ для разделения смесей высокомолекулярных веществ. Существенным недостаток всех этих процессов является возможная деактивация природных соединений из-за их низкой стабильности, длительности процессов, а также необходимость регенерации или обезвреживания отходов.

Львиную долю балластных веществ в экстрактах животного, микробного и растительного сырья являются соединения белковой природы. Препараты, предназначенные для внутреннего применения, очищаются в основном методами осаждения. Эти методы основаны на различной растворимости веществ в водной фазе в зависимости от температуры, рН, ионной силы раствора, добавления смешивающихся с водой растворителе (этанол, ацетон, диоксан), некоторых полимеров. Также для фракционирования применяют насыщенные растворы сульфата аммония (метод высаливания). На количество осаждаемых балластных веществ большое влияние оказывают не только природа и концентрация соли, но и валентность ионов, рН среды и температура. Основным недостатком метода высаливания является трудность освобождения от солей.

Осаждение целевых ферментов и балластных примесей органическими растворителями органичено опасностью легкого воспламенения, токсическим действием паров и влиянием на качество готового продукта. Помимо этого, необходимо учитывать конструкционные особенности цехов соответсвующего класса. В

требованиях к проектированию нового производства часто заложено отсутвсие применения органических растворителей.

Для выделения, разделения и очистки от примесей солей, органических молекул и балластных веществ различной природы применяют всевозможные виды хроматографии и мембранные процессы.

Эти методы для производства ферментов из животного, растительного и микробного сырья обладают целым рядом преимуществ, благодаря которым их можно отнести к прорывнм технологиям для промышленного производства ферментов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Заболоцкая Елена Романовна, 2021 год

ЛИТЕРАТУРА:

1. Царенко О.В. Хроматографическая очистка гидролитических ферментов из поджелудочной железы // Дисс. канд. хим.наук.03.00.23/ Царенко Ольга Викторовна - СПХФА. - 2000.-143.

2. Соловьева Н.А., Кулакова Г.А., Курмаева Е.А. Мукоактивная терапия при лечении острых респираторных инфекций у детей. // Практическая Медицина № 6 (75). - 2013. - с. 191-198.

3. Успехи биоорганического катализа. // Под ред. И. В. Березина, К- Мартине-ка. - М.: Изд-во МГУ. - 1979. - 284 с.

4. Дженкс В. Катализ в химии и энзимологии. // М.: Мир. - 1972.- 318.

5. Вольф М., Рансбергер К. Лечение ферментами. // М.: Мир. - 1976.- 254.

6. Швядас В. К., Клёсов А. А. Проблемы ферментативной модификации антибиотиков. // Биологическая химия. - Т. 1. Инженерная энзимология и биоорганический катализ. (Под ред. В. Л. Кретовича и И. В. Березина). Итоги науки и техника. - М.: Изд-во ВИНИТИ. - 1978. -С. 209-237.

7. Taylor N. R., Smith R. The World Wide Web as a graphical user interface to program macros for molecular graphics, molecular modeling, and structure-based drug design. // J Mol Graph. - 1996. - № 14(5). - P. 291-296, 280-282.

8. Lesyng B., McCammon J. A. Molecular modeling methods. Basic techniques and challenging problems. // Pharmacol Ther. - 1993. - V. 60(2). - P. 149-167.

9. Wodak S. J. Computer-aided design in protein engineering. // Ann N. Y. Acad Sci. - 1987. - V. 501. - P. 1-13.

10. Nixon A. E., Ostermeier M., Benkovic S. J. Hybrid enzymes: manipulating enzyme design. // Trends Biotechnol. - 1998. - V. 16(6). - P. 258-264.

11. Arnold F. H. Optimizing industrial enzymes by directed evolution. // Advances in biochemical engineering/biotechnology. New enzymes for organic synthesis. (Scheper Th., Ed.). - Verlag; Berlin, Heidelberg; New York: Springer. - 1997. - V. 58. - р. 1-14.

12. Aitken M., Burke W., Mcdonald G., Shak S., Montgomery A., Smith A. Recombinant human DNAse inhalation in normal subjects and patients with cystic fibrosis. // A Phase 1 Study. Jama. 267. - 1992. - р. 1947-1951.

13. Анаев Э.Х. Муколитическая терапия: рациональный выбор. // Эффективная Фармакотерапия, Медфорум. - Москва 2010. - с. 25-28

14. Chalumeau M., Cheron G., Assathiany R. and etc. Mucolitic agents for acute respiratory tract infections in infants: a pharmacoepidemiologic problem? // Arch. Pe-diat. - № 9. - 2002. - р. 1128-1136.

15. Riethmueller J., Borth-Bruhns Th., Kumpf M., Vonthein R., and etc. Рекомби-нантная человеческая дезоксирибонуклеаза уменьшает время механической вентиляции легких у новорожденных, детей грудного и раннего возраста. // Pediatric Pulmonology. - 41:61-66. - 2006. - с. 1-6.

16. Liao Th. Deoxyribonuclease I and its clinical applications. // J. Formos. Med. Assoc. 96 (7). - 1997. - р. 481-487.

17. Fuchs Hj., Borowitz Ds., Christiansen Dh., Morris Em., Nash Ml., Ramsey Bw., Rosenstein Bj., Smith Al., Wohl Me. Effect of aerosolized recombinant human DNAse on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. // N. Engl. J. Med. 331. - 1994. - р. 637-642.

18. Меламед Д. Е. Применение Дезоксирибонуклеазы в качестве средства для снижения вязкости крови, лечения и профилактики заболеваний, связанных с ишемическим некрозом тканей. // Патент № Ru 2 357 752 C2 от 27.02.2007.10.06.2009. - Бюл. № 16.

19. Соловьев М. М., Тец В. В., Бобров А. П., Артеменко К. Л., Мошкевич И. Р., Тец Г. В. Применение фермента дезоксирибонуклеазы у больных с абсцессами и флегмонами челюстно-лицевой области. // Стоматология. - 2006. - с. 9-11.

20. Harms Hk., Matouk E., Tournier G., Von Der Hardt H. and etc. Multicenter, open-label study of recombinant human DNAse in cystic fibrosis patients with moderate lung disease. DNAse international study group. // Pediatr Pulmonol. 26. - 1998. -р. 155-161.

21. Kendall S. O. Physical and biological observations on herpesvirus. // J. Bacteriol.

- Vol. 86. - № 5. - 1963. - р. 999-1009.

22. Rochat T., Pastore Fd., Schlegel-Hauter S., Filthuth I., Auckenthaler R., Belli D., Suter S. Aerosolized rhDNAse in cystic fibrosis: effect on leucocyte proteases in sputum. // Eur. Respir. J .- 9. - 1996. - р. 2200-2206.

23. Таха Т.В. Опоясывающий герпес: клиника, диагностика, принципы терапии. // Острые и неотложные состояния в практике врача. - № 2-3. - 2013. - с. 61-64.

24. Ефимова М.А., Махмуд Р.Ш., Зеленихин П.В., Сабирова М.И., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Экзогенная РНКаза Bacillus Pumilus (биназа) подавляет репродукцию реовируса серотипа 1. // Молекулярная Биология. - Т. 51.- № 1. -2017. - с. 111-117.

25. Бурнышева К.М., Петрушанко И.Ю., Спирин П.В., Прасолов В.С., Макаров А.А., Митькевич В.А.. Рибонуклеаза биназа вызывает гибель клеток острого Т-лимфобластного лейкоза, индуцируя в них апоптоз. // Молекулярная Биология.

- Т. 50. - № 2. - 2016. - с. 347-352.

26. Дибиров М.Д. Пролежни: профилактика и лечение. // Стационарозамещаю-щие Технологии / Амбулаторная Хирургия. - № 1-2 (61-62). - 2016. - с.55-63.

27. Романовская И.И. Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-Ы-винилпирролидон. // Доповщ Нащонально! Академп Наук Украши, Бiохiмiя. - № 9. - 2009. - с. 182-187.

28. Безгина Ю.А., Волосова Е.В.. Создание биоактивных полимерных материалов при включении протеолитических ферментов. // Вестник АПК Ставрополья. -№ 2 (10). - 2013. - с. 198-200.

29. Шпак О.И., Венгерова О.А., Евтушенко О.А., Яцына М.Ф. Применение про-теолитических ферментов трипсина и химотрипсина в бронхологической практике. // Пульмонологический Журнал Ру. - № 3. - 2004. - с. 44-45.

30. Глазников Л.А., Пониделко С.Н. Опыт применения химотрипсина в комплексном лечении экссудативного среднего отита и верхнечелюстного синусита // Оториноларингология. - № 2. - 2006. - с. 29-31.

31. Жабоедова Е.Г., Пархоменко О.Г. Применение трипсина и химотрипсина при лечении заболеваний глаз. - Health UA. com. Специализированный медицинский портал - 2015.

32. Памирский И.Э., Штарберг М.А., Белоглазова И.Г., Бородин Е.А. Влияние трипсина и ингибитора трипсина соевых бобов на свертывание крови, фибрино-лиз, агрегацию тромбоцитов и гемолитическую активность комплемента In Vitro. // Дальневосточный Медицинский Журнал. - 2008. - с.98-100.

33. Ходжаева З.С., Сидельникова В.М., Кирющенков П.А., Ходжаева А.С. Применение системной энзимотерапии в акушерстве и гинекологии. // Гинекология. -№ 6. - Т. 5. - 2003. - с. 2-7.

34. Курченко В.П., Головач Т.Н. Гидролиз Белков молока ферментными препаратами и протеолитическими системами молочнокислых бактерий. // Труды БГУ. - Т. 7 ч. 1-2. - 2012. - с. 106-126.

35. Беленький Н.Г., Полонская Л.Б., Чамин Н.Н. Новое в производстве ферментов и ферментных препаратов из животного сырья. // Малоярославец. - 1966.-105.

36. Клёсов А.А. Технологические процессы с применением иммобилизованных ферментов. // В кн.: Введение в прикладную энзимологию. - М.: Изд-во МГУ. -1982. - С. 353-379.

37. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы. // Под ред. И. В. Березина, В. К. Антонова, К. Мартинека./ М: Изд-во МГУ. -1976. -Т. 1. - 296 с. - Т. 2. - 358 с.

38. Применение иммобилизованных ферментов. //Под ред. И. В. Березина. Итоги науки и техники. Сер. «Биотехнология». / М.: Изд-во ВИНИТИ. - 1986. - Т. 6. -300 с.

39. Кулис Ю. Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов. // Вильнюс: Мокслал. - 1981.- 315 с.

40. Диксон М., Уэбб Э.. Ферменты // Под ред. и с предисловием А.И. Опарина. / М.:Изд-во «Мир». - 1966.- 816 с.

41. Ковалева Т.А., Сливкин А.И., Беленова А.С., Суслина С.Н. Биотехнология: Учебное Пособие.Ч.1. Микробная биотехнология. Химическая энзимология //Воронеж: ИЦП ВГУ. - 2011. - С.90.

42. Wilkins M. R., Williams K. L., Appel R. D., Hochstrasser D. F., еds. Proteome Research: New frontiers in functional genomics. // Verlag; Berlin. Heidelberg. New York: Springer. - 1997.- р. 1-14.

43. Синглер М., Берн Л. Гены - геномы: В 2 т. // М.: Мир. - 1998. - 376 с.

44. Березин И. В., Клесов А. А., Швядас В. К. и др. Инженерная энзимология. // М.: Высш. шк. - 1987. - 143 с.

45. Введение в прикладную энзимологию // Под ред. И. В. Березина, К. Мар-тинека. / М.: МГУ. - 1982. -215 с.

46. Клесов А. А. Инженерная энзимология на промышленном уровне. Биотехнология. Итоги науки и техники. // М.: ВИНИТИ. - 1989.- 157 с.

47. Биотехнология. // Под ред. А. А. Баева. / М.: Наука. - 1984. - 318 с.

48. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии: В 2 кн. // М.: Мир. - 1989.- 692 с.

49. Варфоломеев С.Д., Калюжный С. В. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов. // М.: Высш. шк. - 1990.- 296 с.

50. Rubingh D. N. Protein engineering from a bioindustrial point of view // Current Opinion in biotechnology. - 1997. - № 8. - P. 417-422.

51. Варфоломеев С. Д. Химическая энзимология. // М. Издательский центр «Академия». - 2005. - 480 с.

52. Химическая энзимология. // Под ред. И. В. Березина. / М.: Изд-во МГУ. -1983. - 250 с.

53. Введение в прикладную энзимологию. // Под ред. И. В. Березина, К. Мар-тинека. / М.: Изд-во МГУ. - 1982.- 312 с.

54. Sasaki S., Karube I. The development of microfabricated biocatalytic fuel cells. // Trends Biotechnol. - 1999. - V. 17(2). - P. 50-52.

55. Глазова Н. В., Кучеренко (Серкова) А. Н., Омельянова А. П. Современные технологии выделения, очистки и модификации биотехнологических АФС (ферментов). // М.: Кнорус. - 2020. - 150 с.

56. Рудометова Н. В. Сорбционные методы выделения и очистки панкреатических ферментов: рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, трипсина и химотрипсина. // дис. канд. хим. наук:03.00.23. - СПб.: СПбТИ. - 1994. - 136 с.

57. Дмитренко Л. В., Глазова Н. В., Рудометова Н. В., Говорова Н. Ф., Ежакова Г. П., Попова Ю. М., Прорешная Н. А., Шенгер А. А., Чайка О. В. Способ получения гидролитических ферментов. // Патент РФ № 2021372. - 15.10. -1994.

58. Глазова Н. В., Быченкова О. В., Писарев О. А., Рудометова Н. В., Чайка О.

B., Шенгер А. А., Попова Ю. М. Способ очистки рибонуклеазы. // Патент РФ № 2152995. - 20.07.2000.

59. Сальникова С. А. Сорбционно-хроматографическая очистка ДНК-азы и ци-тохрома С в технологии получения фармацевтической композиции // дис. канд. фарм. наук: 14.04.01. - СПб.: СПХФА. - 2014.- 132 с.

60. Гусаров Д.А. Даунстрим-процесс очистки биофармацевтических белков //Разработка и регистрация лекарственных средств. - №3 (16). - 2016. - С. 88-99.

61. Шуваева Г.П., Сучилин С.С., Усачева Е.В.. Современные методы очистки медицинских препаратов, полученных микробным синтезом // Актуальная Биотехнология. - №1 (16). -2016. - С. 41-44.

62. Mccarty М. Purification and properties of Desoxyribonuclease isolated from beef pancreas // The Journal of general physiology. - 1946. - Р. 123-139.

63. Kunitz М. Crystalline Ribonuclease // The Journal Of General Physiology. -1940. - Р. 15-32.

64. Ибрагимов А.Н., Бикмуллин А.Г., Сатаева Д.А., Лопухов Л.В. и др. Хрома-тографические методы анализа белков // Казань:ФГАОУ ВПО КФУ. - 2013. -

C.48.

65. Конюхов В.Ю. Хроматография // СПб.: Изд-во «Лань». - 2012. - 224 с.

66. Дудкина Е.В.,.Ульянова В.И. и др. Получение новой секретируемой Рибо-нуклеазы Bacillus Sp. на основе рекомбинантного штамма Bacillus Megaterium. // Вестник Казанского Технологического Университета. - № 4 - 2013. - С. 51-58.

67. Siekevitz Ph., Palade G.E. A Cytochemical Study On The Pancreas Of The Guinea Pig V. In vivo Incorporation Of Leucine-L-C 14 into the Chymotrypsinogen оf Various Cell Fractions //. J. Biophysic. and Biochem. Cy:Rol. - 1960. - Vol. 7. - № 4. - Р. 619-634.

68. Kanayass Sh., Itayan M. Expression, purification, а^ characterization of a recombinant Ribonuclease H from Thermus Thermophilus Hb8 // The Journal of Biological ^emistry. - 1992. - Ш. 267. - № 14. - P. 10184-10192.

69. Becerra S. P., Clore G. M. and etc. Purification and characterization of the Reverse Transcriptase expressed in recombinant Rnase H domain Of Hiv-L Escherichia coli // Febs Letters. - 1990. - Vol. 270. - № 1,2. - Р. 76-80.

70. Fausnaugh J. L., Kennedy L. A., Regnier F. E. Comparison Of Hydrophobic-Interaction And Reversed phase Chromatography of proteins // Journal оf Chromatography. - 1984. - Vol.3. - № 1. - Р. 141-155.

71. Arfmann H. A., Shaltiel S. Resolution and purification of histones on homologous series of hydrocarboncoated agaroses. // Eur. J. Biochem. - 1976. - № 70. - Р. 269.

72. Queiroz J.A., Tomaz C.T., Cabral J.M.S. Hydrophobic interaction Chromatography of proteins. // Journal оf Biotechnology. - 2001. - Vol.87. - Р. 143-159.

73. Shaltiel Sh., Er-El Z. Hydrophobic Chromatography: use for purification of Glycogen Synthetase. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1973. - Vol. 70. - №. 3. - Р. 778781.

74. Османов В.К., Бирюкова О.В., Борисова А.В. Методы выделения и очистки продуктов биотехнологических производств. // Н. Новгород. - 2005. - С.125.

75. Lazarus L.H., Lee C.-Y., Wermuth B. Application of general ligand affinity Chromatography for the mutual separation of Deoxyribonuclease and Ribonuclease free of protease contamination // Analytical Biochemistry. - 1976. - р. 21-35.

76. Asgeirsson I B., Fox J. W., Bjarnason J. B. Purification and characterization of Trypsin from the poikilotherm Gadus Morhua // Eur. J. Biochem. - 1989. - № 180. - р. 85-94.

77. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. // М.: Изд-во «Наука». - 1985. -536 с.

78. Ladenstein R., Antranikan G. Proteins from hypertermophiles: stabilty and enzymatic catalysis close to the boiling point of water. // Advances in biochemical engineering/biotechnology. (Scheper Th., Ed.). Verlag; Berlin, Heidelberg; New York: Springer. - 1998. - V. 61. - р. 62-70.

79. Эмануэль Н. М., Кнорре Д. Г. Курс химической кинетики. // М.: Высш шк. -1962. - 287 с.

80. Березин И. В., Колесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. // М.: Изд-во МГУ. -1970. - 418 с.

81. Дамаскин Б. Б., Летрий О.А. Введение в электрохимическую кинетику. // М.: Высш. шк. - 1975. - 316 с.

82. Введение в прикладную энзимологию. // Под ред. И. В. Березина, К. Марти-нека. / М.: Изд-во МГУ. - 1982. - 386 с.

83. Семак И. В. Инженерная энзимология: курс лекций. // Мн.: 2007. - с. 124.

84. Варфоломеев С.Д., Гуревич К. Г. Биокинетика. // М.: ФАИ Р-ПРЕСС. -1999. - 195 с.

85. Ферментные электроды. Биотехнология. Итоги науки и техники. // М.: ВИНИТИ. - 1988. - 218 с.

86. Варфоломеев С.Д., Зайцев С. В. Кинетические методы в биохимических исследованиях. // М.: Изд-во МГУ. - 1982. - 263 с.

87. Shapira R., Doherty D.G. Hydrolysis of carbon-carbon bond by trypsin // Fed. Proc. - Vol.15. - 1956. - Р.352.

88. Neurath H., Schwert G.W. The mode of action of the crystalline pancreatic proteolytic enzymes // Chemical reviews. - Vol.46. - 1950. - P.69.

89. Doherty D.G. The hydrolysis of carbon-carbon bonds by a-chymotrypsin // Journal of the American Chemical Society. - Vol.77. - 1955. - P. 4887.

90. Foster R.J., Niemann C. Re-evaluation of the Kinetic Constants of Previously Investigated Specific Substrates of a-Chymotrypsin // Journal of the American Chemical Society. - Vol. 77. - 1955. - P. 1886.

91. Kaufman S., Neurath H. The specific peptidase and esterase activities of chymo-trypsin // Journal of Biological. - Vol. 21. - 1949. - P.437.

92. Segal H.L., Kachmar J.F., Boyer P.D. Kinetic analysis of enzyme reactions. I. Further considerations of enzyme inhibition and analysis of enzyme activation. // En-zymologia. - Vol. 15. - 1952. - P. 187.

93. Anson M. The estimation of pepsin, trypsin, papainand cathepsin with hemoglobin. // J. Gen. Physiol. - V. 22. - 1938.- P. 79-83.

94. Нортроп Д., Кунитц М., Херриотт Р. Кристаллические ферменты. // Пер. с англ. / М.: Наука. - 1950. - 425 с.

95. Стан Е.Я., Черников М.П.. Изучение триптического и химотриптического гидролиза казеина и его компонентов. // Вопросы питания.- М.: Изд-во" Медицина". - 1970. - С. 32-41.

96. Schwert G.W., Takenaka J. A spectrophotometry determination of tripsin and chymotrypsin // Biochem. Biophys. Acta. - 1955. - Vol. 16. - № 47. - P. 570-575.

97. Кнорре В. Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. // М.: Высш. шк. - 1992.

98. Ленинджер Д. Основы биохимии: В 3 т. // М.: Мир. - 1985. - 1056 с.

99. Мецлер Д. Биохимия: В 3 т. // М.: Мир. - 1980. - 1072 с.

100. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. // М.: Просвещение. - 1987. -816 с.

101. Laemmli K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. - Vol. 227. - № 1. - 1972. - P. 680-685.

102. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. // М.: Мир. -1976.513 с.

103. Colowick S. P., Kaplan N. O., eds. Methods in Enzymology. // New York. Academic press. - 1955-1963.

104. Kawasaki T., Kobayashi W., eds. High-perfomance liquid chromatography using spherical aggregates of hydroxyapatite micro-crystals as adsorbent. // Eur. J. Biochem. -V. 157. - 1986. - P. 291-295.

105. Стаскин Е.Л., Ицинсон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. // М. - 1986. - 420 с.

106. Орлов В. И., Аратсков А.А.. Жидкостная хроматография. Теоретические основы. // Дзержинск. - 1997. - 378 с.

107. Садек П.С. Как избежать ошибок в высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Лабораторное пособие. / Пер. с англ. И. Дубинского. - Киев. «Алси». -1999. - 432 с.

108. Северин С. Е. и др. Практикум по биохимии. // М. - 1989. - 518 с.

109. ОФС.1.2.3.0012.15 Определение белка. // Фармакопея РФ. - С. 930-948.

110. Степанченко Н.С., Новикова Г.В., Мошков И.Е. Количественное определение содержания белка. // Физиология растений. - 2011. - 176 с.

111. Логинова О. О., Холявка М. Г., Артюхов В. Г., Беленова А. С. Подбор методики количественного определения трипсина, иммобилизованного на матрице хи-тозана, и его каталитической активности. // Вестник ВГУ. - Серия: Химия. Биология. Фармация. - № 2. - 2013.- С. 116-119.

112. Lowry O.H., eds. Protein measurement with the Folin-Phenol reagents. // J. Bi-ol.Chem. - Vol. 193. - 1951. - P. 265-275.

113. Folin O., Ciocalteau V. On tyrosine and tryptophane determinations in proteins. // J. Biol. Chem. - Vol. 73. - 1929. - P. 627.

114. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. // Anal. Biochem. - Vol. 72. - 1976. - P. 248-254.

ПРИЛОЖЕНИЯ Приложение 1

Specification Sheet

SJGMA-AiXJFHO-T

Product Name

Product Number Product Brand CAS Number Molecular Weight Storage Temp

№>Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride, s98%

B4875

SIGMA

911-77-3

434.88

-20=C

TEST

APPEARANCE (COLOR) APPEARANCE (FORM) PURITY (TLC AREA %) SOLUBILITY (COLOR) SOLUBILITY (TURBIDITY) SOLUBILITY (METHOD) CARBON CONTENT NITROGEN CONTENT INFRARED SPECTRUM

TEST BY UV SPECTROSCOPY

SUITABILITY ASSAY

SPECIFICATION

White to Light Brown Powder

s 98 %

Colorless to Very Dark Brown-Yellow Clear

50MG/ML IN DIMETHYL SULFOXIDE

51.7-53.2%

19 0- 19 6 %

CONFORMS TO STRUCTURE

A(405 NM) s 0.2 AT 1.5MM IN 0 04% (V/V) DMSO, 0.067MM HCL, 0.12M TRIETHANOLAMINE - 0.012M CACL2 PH 7 8 SUITABLE AS A SUBSTRATE FOR TRYPSIN

RECOMMENDED RETEST PERIOD 48 MONTHS

Specification Sheet

5K3MA-ALDFtHZH

Product Name Product Number Product Brand CAS Number Molecular Weight Storage Temp

W-Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester

B6125

SIGMA

3483-82-7

313.35

-20'C

TEST

APPEARANCE

SOLUBILITY

IR SPECTRUM SPECIFIC ROTATION CARBON NITROGEN

PURITY BY THIN LAYER CHROMATOGRAPHY PRODUCT CROSS REFERENCE INFORMATION DOCUMENT #

SPECIFICATION

WHITE TO OFF-WHITE POWDER

CLEAR COLORLESS TO FAINT YELLOW SOLUTION AT 50 MG/ML

OF CHLOROFORM

CONSISTENT WITH STRUCTURE

-23 TO -28 (C = 3.7 IN ETHANOL AT 25 DEG C)

67 3 TO 70 7%

4.1 TO 4.8%

> = 98%

REPLACEMENT FOR ALDRICH #856584 B6125/02/2&07/1

5/GMA -ALDRIOH

irg (71 d -4 Idnth. co w

3050 Sprue« Street, Saint Louis, MO 63103, USA Website: www.sigmaaldrich.cDm Emai USA: [e-mail] Outside USA: [e-mail]

Product Specification

Froduct Name:

Sibomidt ase A from bovine pañerías - far molttutar bial o^y, s70 Kurtitr uniti/m^ protei [yí>phi¡Í2t d

Product Nuimter:

GAS Number: MDL

RG513

9001-99^

MrcDooi32iei

Storage Temperature:

-20 -C

TEST

Specification

Appearance -iColcj

Whte

Appearance (Form) DNAse, EjDnuclease Detection NICKase.Endonuclease Detection Suitability

Suitable 'or the removal of RNA from a crude pBR322 plasmid prep % Protein

by UV AbsDrbance (Report Result) Kun tz u-its'mg p'otsn Recommended Retest Ferod 3 years

Lyophilized Few der None Detected None Detected £u 1able

1 70 Complete

Specification FRD.2.ZQ5.10aODD3S123

Sigma-Aldrich warrants, that at the lime Df the quality release or subsequent retest date th-s product conformed tc the information contained n this publication. The current Specification sheet may be available at SigmiAldrich.coin. Far further inquiries, please contact Technical Service. Rjrchasei must determine the suitability of the product for its particula use. See reverse side of invoice or packng si 0 for additional terms and conditions of sale.

SIGMA-ALDRICH

3050 Spruce Stieet, Saint Louis, MO 63103, USA Website: www.sigma3ldrich.CDm &nail LISA: [e-mail] Cutside USA: [e-mail]

Product Specification

Froduct Name:

Dtüxyribütiu deist i from bovine pancreas - Sy&phil zed powder, Pratein iSS K, t^OO Kunitz unita/m^ protein

Product Nuirilier:

CAS Number: MDL

DN25

9003-98-9 MFCD0013091S

Storage Temperature:

-20 T.

TEST

Specification

Appearance iCdof) Appearance ¿Form) Protein by Biuret Kunitz u - its-'mg protein

White to Light Yellow tn Light BfDwn Powder

> E5 * i- 400

One Kunitz unit will produce a change in A26Q nf 0.QD1 per minute per ml 4 pH 5.D at 25 deg C using DNA Type I or III, as the substrain.

•Ü, RNase < D.02

Recommended Retest Period --------------

A years

SpeciTication: FRD.2.ZQ5.10ÜÜDD2152D

Sigma-Aldrich warrants, that at the 1 me Df the quality release o< subsequent retest date th-s product conforrried tc the information contained n this publication. The current Specification sheet may be available at SigmiAldrich.com. Fof further inquiries, please contact Technical Service. Rjrchaser must determine the suitability of the product for its particula use. See reverse side of invoice or packng sip for additional terms and conditions of sale.

S/GMA-ALDRIOH

arg (71 d -fl tdriih, «j m

3050 Spruce Street, Saint Louis, MO 63103, USA Website: www.sigmaaldrioh.CDm Bnail USA: [e-mail] Outside USA: [e-mail]

Product Specification

Froduct Name:

Trypsin fmm bavint pinereas - TPCKTrta:ttf, csserniaiy sals Irci, lyophi i^ctf piwvrifc-, ^10,000 BA£E ■.imti/mi} protein

Product N writer: T1426

CAS Number: 9002-07-7

MDL MFCDO0D&2094

Storage Temperature:

-20 12

TEST

Specification

Appearance (Color)

Wh 1 e

Appearance (Form) Powder

unitsj'mg protein > 10000

One 3AEE un t will produce a delta A253 of 0.001 per minute vjith 3AEE as substrate at pH 7.6 at 26 deg C. Reaclion volume = 3.2 ml (1 cm light path).

ETEE units/mg protein < 0.'

Chymotrypsin Impurity.

% Protein (UV) SD - 1 DO

Specification FfiD.D .ZQ5.100 C D D 170 6 E

Sigma-Aldrich warrants, that at the 1 me Df the quality release or subsequent retest date th-s product conformed to the information contained n this publication. The current Specification sheet may be availableat SigmarAldrich.com. For further inquiries, please contact Technical Service. Rjrchaser must determine the suitability of the product for its particula use. See reverse side Df invoice or packng sip for additional terms and conditions of sale.