Получение и некоторые свойства менингококковой IgAl-протеазы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Теймуразов, Марат Георгиевич

• Теймуразов, Марат Георгиевич
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Теймуразов, Марат Георгиевич

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика IgA-протеаз

1.1.1 Открытие IgA-протеаз

1.1.2 Секреторный иммунитет. Структура сывороточного и секреторного IgA

1.1.3 Структура генов IgA-протеаз и экспрессия их продуктов в грамотрицательных бактериях

1.1.4 Методы обнаружения IgA-протеаз и определение активности

1.1.5 Очистка IgA 1 -протеаз и IgA

1.1.6 Гидролиз IgAl и специфичность IgA-протеаз

1.1.7 IgAl-протеазы как фактор вирулентности

1.2 Проблема вакцинации против менингита и менингококковая IgAl-протеаза

1.3 Факторы патогенности и вирулентности N.meningitidis

1.4 Питательные среды для культивирования менингококков

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36 2.1 Микроорганизмы, задействованные в работе и методики по работе с ними

2.1.1 Проверка биохимических, морфологических и серологических свойств N. meningitidis

2.1.2 Определение чувствительности штаммов N.meningitidis к антибактериальным препаратам

2.1.3 Подбор питательной среды для штаммов N. meningitidis

2.1.4 Подготовка посевного материала

2.1.5 Глубинное культивирование штаммов N. meningitidis

2.2 Определение ферментативной активности IgAl-протеазы

2.2.1 Выделение иммунохимически чистых IgAl и IgA

2.2.2 Иммунизация животных

2.2.3 Выделение IgG из кроличьей антисыворотки

2.2.4 Получение конъюгата антител к IgA с пероксидазой хрена

2.2.5 Определение разведения конъюгата

2.2.6 Качественный метод определения ферментативной активности IgAl-протеазы методом ИФА

2.2.7 Количественный метод определения ферментативной активности IgAl-протеазы

2.3 Выделение и очистка IgA-иротеазы

2.3.1 Предварительная обработка культуральной жидкости и концентрирование

2.3.2 Очистка на высокопористом силохроме

2.3.3 Очистка на фенилсефарозе

2.3.4 Гель-фильтрация

2.4 Свойства IgAl-протеазы

2.4.1 Определение изоэлектрической точки IgAl-протеазы

2.4.2 Определение констант ингибирования IgAl-протеазы 53 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3 Культивирование N. meningitidis

3.1 Проверка морфологических, биохимических и серологических свойств штаммов N. meningitidis

3.2 Определение чувствительности штаммов N. meningitidis к антибактериальным препаратам

3.3 Подбор плотной питательной среды для штаммов

N. meningitidis

3.4 Подбор жидкой питательной среды для штаммов

N. meningitidis

3.5 Выбор штамма N. meningitidis для культивирования

3.6 Подготовка посевного материала

3.7 Глубинное культивирование штаммов N. meningitidis

4 Определение ферментативной активности IgAl- 68 протеазы

4.1 Качественный метод определения ферментативной активности IgA 1 -протеазы

4.2 Количественный метод определения ферментативной активности IgAl-протеазы

5 Выделение и очистка IgAl-протеазы

5.1 Предварительная обработка культуральной жидкости

5.2 Очистка на высокопористом силохроме

5.3 Гидрофобная хроматография на фенилсефарозе

5.4 Гель-фильтрация на сефарозе CL-6B

5.5 Схема очистки и данные по выходу фермента

6 Свойства IgAl-протеазы 85 6.1 Определение молекулярной массы IgAl - протеазы

6.2 Определение изоэлектрической точки IgAl - протеазы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и некоторые свойства менингококковой IgAl-протеазы»

Актуальность проблемы

В течение нескольких последних лет активно изучаются IgAl-протеазы - ферменты, секретируемые некоторыми патогенными микроорганизмами и расщепляющие в IgAl (подкласс IgA человека), единственную пептидную связь Pro - X в шарнирной области[1 - 3].

Менингококковая IgAl-протеаза представляет значимый научный интерес, являясь фактором вирулентности и наряду с ЛПС, считается ответственной за заболевание менингококковым менингитом [4 - 7]. Известно, что в защите организма человека от менингококковой инфекции основную роль играет система комплемента, а также IgA [8]. Для изучения значения IgA в иммунной защите от микроорганизмов (в частности N. meningitidis) при аллергических и аутоиммунных заболеваниях необходимы детальные исследования механизмов действия сывороточных и секреторных IgA, а также Fab- и Fc - фрагментов, на которые расщепляются сывороточный и секреторный IgAl при ферментативном действии IgAl-протеазы. Для решения этих задач необходим очищенный фермент [8, 9].

Кроме того, на основе действия IgAl-протеазы может быть предложен иммуноферментный метод, позволяющий выявлять больных, инфицированных менингококками, а также носителей, уже на ранних стадиях заболевания в больших массах населения, что в настоящее время при бактериологическом определении [10 - 12] не представляется возможным.

Наконец, если IgAl-протеаза действительно играет одну из основных ролей в развитии менингита, то возможно, что она нужна, естественно в ферментативно неактивном виде для получения эффективной антименингококковой вакцины (или в качестве компонента существующей полисахаридной вакцины) [15, 17, 18].

Получать IgAl-протеазу можно двумя способами: либо генно-инженерным, либо очисткой из культуральной жидкости N. meningitidis. К началу нашей работы были попытки получения рекомбинантного фермента. Однако активность IgAl-протеаз, выделенных из телец включения Е. coli, составляла около 2% от активности фермента, секретируемого клетками менингококка [15]. Вероятно, должны быть созданы другие конструкции, работающие под контролем сильных промоторов. Для секреции IgAl-протеазы - белка с молекулярной массой более 100 кДа- перспективны системы, позволяющие включать в состав плазмид гены крупных белков, например, бакуловирусная, хотя последняя используется чаще для получения эукариотных белков[17,18].

Выделение и очистка IgAl-протеазы из культуральной жидкости N. meningitidis биохимическим путем, несмотря на очевидные трудности работы с патогенной культурой, представляется более плодотворной. Так, холерный токсин очищали из культуральной жидкости Cholera vibriae для получения вакцины в биореакторе объемом до 1000 л [19]. Даже если впоследствии окажется, что получение генно-инженерного белка более перспективно, приемы и методы очистки, использованные в данной работе, можно будет применять для выделения рекомбинантного фермента. Кроме того, фермент, полученный этим путем, можно использовать для определения биохимических свойств и создания на его основе вакцины.

Цель работы. Выделение, очистка IgAl-протеазы, секретируемой клетками N.meningitidis, и изучение ее биохимических свойств.

Задачи исследования:

- отобрать штамм N. meningitidis с хорошей секрецией IgAl-протеазы;

- подобрать оптимальную питательную среду для глубинного культивирования N. meningitidis;

- разработать схему очистки IgAl-протеазы из культуральной жидкости N. meningitidis;

- разработать метод определения ферментативной активности IgAl-протеазы;

- изучить некоторые свойства IgAl-протеазы (определить изоэлекрическую точку, константы ингибирования активности фермента, молекулярную массу).

Научная новизна. Получена электрофоретически чистая менингококковая IgAl-протеаза, обладающая ферментативной активностью в отношении IgAl человека. Охарактеризованы некоторые физико-химические и биохимические свойства (молекулярная масса, pi, К(). Разработан метод очистки белков на высокопористом силохроме (кремнеземный сорбент). Разработан метод ИФА для определения ферментативной активности IgAl-протеазы.

Практическая значимость. Разработана питательная среда на основе гидролизата Хоттингера для глубинного культивирования N. meningitidis, обеспечивающая максимальный рост биомассы и максимальный выход IgAl-протеазы.

Высоко чувствительный метод ИФА для определения ферментативной активности позволяет качественно и количественно определять активность IgAl-протеазы (подана заявка на патент - JI.B. Козлов, С.В. Романов, B.JI. Дьяков, В.И. Суровцев, М.Г. Теймуразов MKH7G 01 N33/53).

Предложенный метод выделения и очистки IgAl-протеазы может быть использован для выделения и очистки IgAl-протеаз, секретируемых другими микроорганизмами. Очистка на силохроме может быть использована для широкого ряда белков, особенно на первой стадии, и в условиях большого объема культуральной жидкости.

IgAl-протеаза может быть применена для создания иммуноферментного метода для выявления больных и носителей менингококков, а также решения вопроса о ее использовании в антименингококковой вакцине и изучения ее роли в патогенезе заболевания.

Положения, выносимые на защиту.

1. Глубинное культивирование N. meningitidis на питательной среде на основе гидролизата Хоттингера способствует максимальному выходу биомассы и секреции IgAl-протеазы.

2. Разработанный метод ИФА является оптимальным для определения активности IgAl-протеазы.

3. Выход электрофоретически чистой IgAl-протеазы достигается проведением ее очистки на высокопористом силохроме с последующей гидрофобной хроматографией и гель-фильтрацией.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, февраль 2005), межлабораторном научном семинаре ГНЦПМ (Оболенск, май 2005). По результатам работы готовится к публикации статья -В.И. Суровцев, М.Г. Теймуразов, JI.B. Козлов, Ю.И. Хатюшин, Т.В. Федоров, В.Л. Дьяков, М.С. Христин. Получение менингококковой IgAl-протеазы. Журнал «Биотехнология» 2006, 3, с. 37-41.

Публикации:

Всего опубликовано семь научных работ, по результатам диссертации опубликовано три научные работы.

1. В.В. Гусев, Э.А. Светоч, Н.К. Глазков, М.Г. Теймуразов, С.И. Павлов/ Мониторинг бактериальных инфекций в промышленном свиноводстве.// Ветеринария, 2004, №2, с. 7-8.

2. М.Г. Теймуразов, В.И. Суровцев, Т.В. Федоров, Ю.И. Хатюшин. Питательная среда для культивирования менингококков с целью выделения и очистки IgAl-протеазы. -материалы XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, февраль 2005).

3. М.Г. Теймуразов, В.И. Суровцев, Т.В. Федоров, В.М. Борзенков. Выделение и очистка менингококковой IgAl-протеазы. - материалы XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, февраль 2005).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах. Текст содержит 12 таблиц и 20 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, четырех глав с изложением результатов собственных, заключения, выводов. Библиографический указатель содержит 40 отечественных и 110 иностранных работ.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Теймуразов, Марат Георгиевич

ВЫВОДЫ

1. Показано, что глубинное культивирование N.meningitidis на предложенной питательной среде на основе гидролизата Хоттингера обеспечивает хорошее накопление биомассы и оптимальный выход IgAl-протеазы;

2. С помощью разработанного метода ИФА для качественного и количественного определения ферментативной активности отобран штамм N. meningitidis с высокой секрецией IgAl-протеазы;

3. Предложенная схема очистки IgAl-протеазы, включающая хроматографические методы - очистку на высокопористом силохроме, гидрофобную хроматографию на фенилсефарозе и гель-фильтрацию на сефарозе CL-6B, а также ультрафильтрацию, позволяет получить электрофоретически чистый продукт с выходом фермента в количестве 37% от начального, определяемого в культуральной жидкости;

4. При использовании физико-химических и иммунологических методов, включающих белковый электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, ИФА определены свойства IgAl-протеазы - молекулярная масса, изоэлектрическая точка и константы ингибирования активности фермента.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для обильного накопления биомассы N. meningitidis и наибольшей секреции IgAl-протеазы при глубинном культивировании целесообразно использовать бульон на основе гидролизата Хоттингера.

2. Для выявления больных менингококковой инфекцией и носителей рекомендован метод ИФА для определения активности IgAl-протеазы вместо (или наряду) используемого в настоящее время бактериологического метода.

3. Предложенная схема выделения IgAl-протеазы из культуральной жидкости может быть использована для дальнейшего изучения свойств самой IgAl-протеазы, изучения ее роли в патогенезе менингококковой инфекции, а также возможности использования ее в качестве эффективного компонента разрабатываемых менингококковых вакцин.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Теймуразов, Марат Георгиевич, 2006 год

1. Molecular polymorphism and epidemiology of Neisseria meningitidis immunoglobulin A1 proteases. HLomholt H., Poulsen K., Caugant D.A., Kilian M. / Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1992. -Vol. 89,-P. 2120-2124.

2. Plaut,A.G. & Bachovchin, W. W. IgA-specific prolyl endopeptidases: serine type. // Methods Enzymol. 1994. - Vol. 244, - P. 137 - 151.

3. Humoral immune response to gonococcal infections. / Burton J., WoodS.G., Lynch M., Plaut A.G. //J.Med. Chem.- 1988. -Vol. 31,-P. 1647-1651.

4. Hauck C.R. & Meyer,T.F. II The lysosomal / phagosomal membrane protein h-lamp-1 is a target of the IgAl protease of Neisseria gonorrhoeae.// FEBS Lett. 1997. - P. 405, 86 - 90.

5. Binscheck Т., Bartels F., Bergel H. Antibodies against IgAl protease are stimulated both by clinical disease and asymptomatic carriage of serogroup A Neisseria meningitidis. II J.Biol. Chem. -1995. Vol. 270, - P. 1770 - 1774.

6. Чернохвостова E.B. IIЖМЭИ. 1987. - № 6. - C.104 - 112.

7. Клиника, лабораторная диагностика и эпидемиология менингококковой инфекции. / Ю.С. Альфельд, В.В. Дударева, В.П. Зубехин и др. И Военно-медицинский журнал, 1972, № 2. -С. 51-54.

8. Венгеров П.А., Чернышева М.И. Менингококковая инфекция и грипп. Клиника-эпидемиологические параллели. // Журн. микробиол. 1974. № 4, 5 - С. 57 - 60.

9. Дранкин Д.И., Иванов Н.Р., Годлевская М.В. Менингококковая инфекция. Саратов, 1975.-С. 43-49.

10. An ELISA method to measure total and specific human secretory IgA subclasses based on selective degradation by IgAl-protease. / Hocini H., Iscaki S., Bouvet J.P., Kazatchkine M.D. & Belec L. I I J. Immunol Methods. 2000. - P. 235, 53 - 60.

11. Pohlner J. Mosaic-like organization of IgA protease genes in Neisseria gonorrhoeae generated by horizontal genetic exchange in vivo. // Nature. 1987. - Vol. 125, - P. 987 - 995.

12. Achtman M., Moreau M. II Igal protease fragment as carrier peptides // Darby & Darby P.C. -New York, NY, US Patent Application Claims // Patent Application Description, 2004.

13. Cleavage of a recombinant human immunoglobulin A2 (IgA2)-IgAl hybrid antibody by certain bacterial IgAl proteases. IILassiter M.O., Kindle J.C., Hobbs L.C., Gregory R.L. / J.Immun. Methods. 1989. - Vol. 123, -P. 63 - 69.

14. A Neisseria gonorrhoeae immunoglobulin A1 protease mutant is infectious in the human challenge model of urethral infection.// Johannsen D.B., Johnston D.M., Koymen И.О., Cohen M.S. & Cannon J.G. II Infect. Immun. 1999.- P. 67, 3009 - 3013.

15. The lysosomal/phagosomal membrane protein h-lamp-1 is a target of the IgAl protease of Neisseria gonorrhoeae. И Gilbert J. V., Plaut A.G., Fishman Y., Wright A. //Infect. Immun. 1988. -Vol. 56,-P. 1961 - 1966.

16. Tayot J-L, Holmgren J. Крупномаштабная очистка холерного токсина на силикагельных пластинках с Liso Gml ганглиозидом.// Europ. J. Biochem., 113, №2, 249-258 (1981).

17. Суровцев В.И., Федоров Т.В., Гусев В.В. (2001) Вестник РАМН, №5,39 42.

18. Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия: Учеб. для вузов. М.: Дрофа, 2004. - 638 с.

19. Plaut A.G., Genco R.J., Tomasi T.B. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. // J. Clin. Invest. 1974. - Vol. 54, - P. 1295 -1300.

20. Plaut A.G., Gilbert J.V., Wistar Jr.W. Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis: extracellular enzyme cleaves human immunoglobulin A. // Infect. Immun. 1977. - Vol. 17, - P. 130- 135.

21. Leib S. L. and Tauber M. G. Pathogenesis of bacterial meningitis. // Infect. Dis. Clin. North. Am. 1999. - Vol. 13, - P. 527 - 548.

22. The Neisseria type 2 IgAl protease cleaves LAMP1 and promotes survival of bacteria within epithelial cells. // Lin L., Ayla P., Larson J., Mulks M., Fukuda M., Carsson S.R., Enn, C„ So, IM. Mol. Microb.- 1997. Vol. 24, - P. 1083 - 1094.

23. Cassell D. J. and R. H. Schwartz. A quantitative analysis of APC function: activated В cells stimulate naive CD4 T cells but are inferior to dendritic cells in providing costimulation. // J. Exp. Med.-1994.-Vol. 180,-P. 1829- 1834.

24. Devoe I. W. and Gilchrist J. E. Release of endotoxin in the form of cell wall blebs during in vitro growth of Neisseria meningitidis. // J. Exp. Med. 1973. - Vol. 138, - P. 1156 - 1167.

25. Галактионов В.Г. Графические модели в иммунологии. М.: Медицина, 1986. - 264 с

26. МещерД. Биохимия: В 3-х т. // Пер. с англ. М.: Мир, 1980.

27. Фримель X., Брок Й. Основы иммунологии. М.: Мир, 1986. - 292 с.

28. Qiu J. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, - P. 933 - 937.

29. Pohlner J., Langenberg U. Uptake and nuclear transport of Neisseria IgAl protease -associated alpha proteins in human cells. // Mol Microbiol. - 1995 Sep. 17,- Vol. 6, -P. 1073-83.

30. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease. // Pohlner J., Halter R„ Beyreuther K., Meyer T.F. / Nature. 1987. - Vol. 325, - P. 458 - 462.

31. Lomholt H., Poulsen К. & Kilian M. II Comparative characterization of the iga gene encoding IgAl protease in Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae and Haemophilus influenzae./ Mol Microbiol. 1995. - Vol. 15, - P. 495 - 506.

32. Lomholt H., Kilian M. Comparative characterization of the iga gene encoding IgAl protease in Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae and Haemophilus influenzae. И M. Infect. Immun. 1994. - Vol. 62, - P. 3178 - 3183.

33. Klauser T. Characterization of the Neisseria Iga beta-core. The essential unit for outer membrane targeting and extracellular protein secretion. // Bocassays. -1993. -Vol. 15, P. 799 -805.

34. Slaten P.E., Roitman M., Costin C. Cleavage of the hormone human chorionic gonadotropin, by the type 1 IgAl protease of Neisseria gonorrhoeae, and its implications. // J.Med.Sci. 1989. -Vol. 25,-P. 41 -42.

35. Wood S.G., Burton J. Synthetic peptide substrates for the immunoglobulin A1 protease from Neisseria gonorrhoeae (type 2). / Infect. Immun. -1991.- Vol. 59, P. 1818 - 1822.

36. Achtman M. The immunopathogenesis of meningococcal disease. // Rev. Med. Microbiol. -1990.-Vol. 1,-P. 29-38.

37. Mulks M.H., Shoberg R. J. Bacterial immunoglobulin A1 proteases. // Meth. Enzym. 1994. -Vol. 235,-P. 543-554.

38. Lassiter И.О., Kindle J.C., Hobbs L.C., Gregory, R.L. II J.Immun. Methods. -1989. -Vol.123.-P.63-69.

39. Reinholdt J., Kilian M. Comparative analysis of immunoglobulin A1 protease activity among bacteria representing different genera, species, and strains. // J. Immun. Methods. 1983. -Vol. 63,-P. 367-376.

40. Reinholdt J. A sensitive enzyme linked immunosorbent assay for IgA protease activity. // Adv. Exp. Med. Biol. 1995. - Vol. 371, - P. 605 - 608.

41. Mortensen S.B., Kilian M. Proteolysis of bacterial membrane proteins by Neisseria gonorrhoeae type 2 immunoglobulin A1 protease. // J.Chromat. 1984. - Vol. 296, -P. 257-262.

42. Blake M.S., Eastby C. / Studies on the gonococcal IgAl protease II. // J. of Immun. Methods, 1991, Vol. 144, P. 215-221

43. Варламова Е.Ю., Герман Г.П. Получение преципитирующих антисывороток к субкласс-специфическим детерминантам иммуноглобулина А // Труды МНИИЭМ. 1989. -С. 58-61.

44. New Generation Vaccines. // Zollinger W.D. Ed. by Levin M.M., Woodrow G. C., Kaper J.B., Gobon G.S. 1996. 131 p.

45. Henderson I. R. and Nataro J. P. Virulence Functions of Autotransporter Proteins // Infect. Immun.-2001 March 1. P. 1231 - 1243.

46. Meger Т.Е. Immunoglobulin A1 protease, an exoenzyme of pathogenic Neisseriae, is a potent inducer of proinflammatory cytokines. // Curr. Top. Microbial. Immunol. 1994. - Vol. 192, -P. 283-317.

47. Induction of inflammatory mediator release (12-hydroxyeicosatetraenoic acid) from human platelets by Pseudomonas aeruginosa. II Tettelin H., Saunders N.J., Heidelberg J., Jeffries A.C.,

48. Nelson K.E., Eisen J.A., Ketchum K.A., Hood D. W. et al. / Science. 2000. - Vol. 287, - P. 1809 -1815.

49. Hedges S.R. Cytokine and antibody responses in women infected with Neisseria gonorrhoeae: effects of contomitant infections. // Infect. Immun. 1998. - Vol. 69, -P. 5826 -5832.

50. Biological significance of IgAl proteases in bacterial colonization and pathogenesis: critical evaluation of experimental evidence. // Wood S.G., Lynch M„ Plaut A.G., Burton J. / J.Med. Chem. 1989. - Vol. 32, - P. 2407 - 2411.

51. Zagyansky Y.A., Gavrilova E.M. II Immunochemistry. 1974. - Vol. 11, - P. 681 -682.

52. PilP, a pilus biogenesis lipoprotein in Neisseria gonorrhoeae, affects expression of PilQ as a high molecular mass multimer. / W.W.Bachovchin, A.G. Plaut, G.R.Flentke, M.Lynch, C.A.Kettner II J. Biol. Chem. I990.-Vol. 265, - P. 3738 - 3743.

53. Immunoglobulin Al protease, an exoenzyme of pathogenic neisseriae, is a potent inducer of proinflammatory cytokines. // Lorenzen D. R., Dux F., Wolk U., Tsipouchtsidis A., Haas G. and Meyer T.F.J J. Exp. Med. 1999. - Vol. 190, - P. 1049 - 1058.

54. Tumor necrosis factor, its receptors and the connection with interleukin 1 and interleukin 6 // Brouckaert P., Libert C., Everaerdt В., Takahashi N., Cauwels A. and Fiers WJ. Immunobiology -1993. Vol. 187,-P. 317-329.

55. WoodS.G., Lynch M., Plaut A.G., Burton J. //J.Med. Chem. -1989. -Vol.32. -P2407-2411.

56. Viney J. L. Immune fate decided by dendritic cell provocateurs. // Trends Immunol. 2001. -Vol. 22,-P. 8-10.

57. Regulation of toll-like receptors in human monocytes and dendritic cells. // Visintin A., MazzoniA., Spitzer J. H„ Wyllie D. #., DowerS. K. and Segal D. M. / J. Immunol. 2001.-Vol. -166,-P. 249-255.

58. Strauss A. Acylation of Escherichia coli hemolysin: a unique protein lipidation mechanism underlying toxin function. // FEMS Microbiol. Lett. — 1995. Vol. 127, - P. 249 - 254.

59. Vogel U. and Frosch M. Mechanisms of neisserial serum resistance. // Mol. Microbiol. -1999. Vol. 32, - P. 1133 - 1139.

60. The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells. // Virji M., Kayhty H., Ferguson D. J. P., Heckels J. E. and Moxon E. R. / Mol. Microbiol. -1991.-Vol. 5,-P. 1831-1841.

61. Gram-negative bacteria induce proinflammatory cytokine production by monocytes in the absence of lipopolysaccharide. / Uronen H., Williams A. J., Dixon G., Andersen S. R, Van Der Ley P., VanDeurenM., CallardR. E. and Klein N.- 2000.

62. Peltola, H. Meningococcal disease: still with us. / Rev. Infect. Dis. 1983. - Vol. 5, -P. 71-91.

63. Nontypeable Haemophilus influenzae in Carriage and Disease: A Difference in IgAl Protease Activity Levels / Vitovski S„ Dunkin К. Т., Howard A. J. and Sayers J. R. II JAMA. 2002 April 3,-P. 1699-1705.

64. Clonal groupings associated with successive waves of serogroup A meningococcal disease from 1969 to 1997 in Moscow, Russia. IIAchtman M, van der Ende A, Zhu P, Koroleva IS, Kusecek

65. B, Morelli G, Schuurman IGA, Brieske N, Zurth K, Kostyukova NN, PlatonovAE. II Emerging Infectious Diseases. 2001. - Vol.7.

66. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. - С. 285 - 290.

67. Покровский В.И., Фаворова Л.А., Костюкова Н.Н. Менингококковая инфекция. М., Медицина, 1976. - 112 с.

68. Чибирас П.П., Эйгминене В.К., Ленкайскайте Ч.Л. К вопросу о лабораторной диагностике менингококковой инфекции. // Вопр. охр. мат. и дет. 1974. - № 8.1. C. 66-68.

69. Gamma delta Т lymphocytes and proinflammatory cytokines in bacterial meningitis. // Pizza M., Scarlato V., Ginliani M.M., Arico В., Comanducci M., Jennings G.T., Baldi L., Bartolini E. et al. / Science. 2000. - Vol. 287, - P. 1816 - 1820.

70. Connoly M., Noah N. Surveillance of bacterial meningitidis in Europe. / King's college. London, 1996.-92 p.

71. IgA protease production as a characteristic distinguishing pathogenic from harmless neisseriaceae. // Mulks M.H., Plaut A.G., Feldman H.A., Frangione B. J. / Exp. Med. 1980. - Vol. 152,-P. 1442-1447.

72. Gruffiss J.Mc.L. Defense mechanisms involving Fc-dependent functions of immunoglobulin A and their subversion by bacterial immunoglobulin A proteases. // Rev. Infect. Dis. 1982. - Vol. 4,-P. 159-172.

73. Greenwood B.M. The epidemiology of acute bacterial meningitidis in tropical Africa. In: Bacterial meningitidis. /London: Acad. Press. 1987.

74. Waage A., Halstensen A. and Espevik T. Association between tumour necrosis factor in serum and fatal outcome in patients with meningococcal disease. I I Lancet. 1987. -P. 355-357.

75. Stgeme J.W., Delamorena M.L., Falkow S. Structural determinants of processing and secretion of the Haemophilus influenzae Hap protein.// Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 14, -P. 217-233.

76. Kilian M. Biological significance of IgAl proteases in bacterial colonization and pathogenesis: critical evaluation of experimental evidence. // APMIS. 1996. - Vol. 104, - P. 321 -338.

77. Медуницип H.B. Вакцинология. M.: «Триада-Х», 1999. - С. 181 -185.

78. Al'Aldeen A. A. and Cartwright K. A. Neisseria meningitidis: vaccines and vaccine candidates. // J. Infect. -1996. Vol. 33, - P. 153 - 157.

79. Brandtzaeg P., Ovsteboo R. and Kierulf P. Compartmentalization of lipopolysaccharide production correlates with clinical presentation in meningococcal disease. // Infect. Dis. -- 1992. Vol. 166, - P. 650 - 652.

80. Gates R. Infectious disease secrets. / Philadelphia: Hanley & Belfas. -1998. P. 39 - 41.

81. Jones D. M. Meningococcal vaccines. // J. Med. Microbiol. 1993. - Vol. 38, - P. 77 - 78.

82. Reise Sous a C„ Sher A. and Kaye P. The role of dendritic cells in the induction and regulation of immunity to microbial infection. // Curr. Opin. Immunol. 1999. - Vol. 11, -P. 392-396.

83. Филатова Т.Н. / Вакцина против менингита. // ЖМЭИ, 1998,-№3, С-23-28.

84. Koomey,J.M. & Falkow,S. Nucleotide sequence homology between the immunoglobulin A1 protease genes of Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, and Haemophilus influenzae. // Infect. Immun. 1984. - Vol. 43, P. 101 - 107.

85. Analysis of the PilQ Secretin from Neisseria meningitidis by Transmission Electron Microscopy Reveals a Dodecameric Quaternary Structure. // Richard F. Collins, Davidsen L., Jeremy P., FordR.C. / J Bacteriol. 2001 July. - P. 3825 - 3832.

86. Vitovski S., Read R.C. and Sayers JR. Invasive isolates of Neisseria meningitidis possess enhanced immunoglobulin A1 protease activity compared to colonizing strains / The FASEB Journal. 1999. - Vol. 13, - P. 331 -337.

87. Type V Protein Secretion Pathway: the Autotransporter Story Microbiol. // Henderson R., Navarro-Garcia F., Desvaux M., Fernandez R. C. and D. Ala'Aldeen. / Mol. Biol. Rev., 2004. Dec. 1,-P. 692-744.

88. Transcriptome Analysis of Neisseria meningitidis during Infection // Dietrich G., Kurz S., Hubner C., Aepinus C., Theiss S., Guckenberger M., Panzner U., Weber J. and Frosch M. /J. Bacteriol. -2003 January 1. P. 155 - 164.

89. Parsons H.K., Vitovski S. and J.R. Sayers. Immunoglobulin A1 proteases: a structure-function update // Research Colloquia at Bioscience, 2004.

90. Cloning and sequencing of the immunoglobulin A1 protease gene (iga) of Haemophilus influenzae serotype b. HPoulsen K., Brandt J., Hjorth J.P., Thogersen H.C., Kilian M. / Infect. Immun. 1989. - Vol. 57, - P. 3097 -3105.

91. Poulsen К. A comprehensive genetic study of streptococcal immunoglobulin A1 proteases: evidence for recombination within and between species. // Infect. Immun. 1996. - Vol.64, - P. 3957-3966.

92. Cleavage of a recombinant human immunoglobulin A2 (IgA2)-IgAl hybrid antibody by certain bacterial IgAl proteases.// Senior B.W., Dunlop J.I., Batten M.R., Kilian M. & Woof J.M. / Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, - P. 463 -469.

93. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. / Под ред. Борисова Л.Б. и Смирновой A.M. М.: Медицина, 1994. - С. 143 - 146.

94. Методические указания по клинике, диагностике, лечению и профилактике менингококковой инфекции. М.: «Медицина», 1972. - 52 с.

95. Смирнова A.M., Подлевский А.Ф. Факторы вирулентности менингококков JL: «Медицина», 1979. - С. 89 - 94.

96. Туманян А.А. Эпидемиологическая оценка некоторых серологических исследований при менингококковой инфекции: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1967. - 124 с.

97. Woods G.L., Gutierrez Y. Diagnostic Patology of Infectious Diseases. Philadelphia -London: Lea & Febiger. -1993. P. 231 - 234.

98. Neisserial Immunoglobulin Al Protease Induces Specific T Cell Responses in Humans // Tsirpouchtsidis A., Hurwitz R., Brinkmann V., Meyer T. F. and Haas G. / Infect. Immun. - 2002 January 1.-P. 335-344.

99. WA.Buecmyp У.Э., Шмите И.А., Жилевич A.B. Биотехнология. Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. Рига: Зинатне, 1987. - 263 с.1 \5.Тимаков В.Д., Левашев B.C., Борисов Л.Б. Микробиология. М.: Медицина, 1983. - С. 216-217.

100. Приказ МЗ РФ № 375 от 23.12.1998. О мерах по усилению эпидемологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов //-Москва, 1998. С. 1-57.

101. Практическое руководство по биологической безопасности в лабораторных условиях. /Женева, ВОЗ, 1994.

102. Санитарные правила СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов I-IV групп патогенности" // ГКСЭН России, Москва, 1996.

103. Санитарные правила СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами" // Минздрав России, Москва, 1999.

104. Микробиологические исследования при инфекционных заболеваниях. Под редакцией Сипая Г.Я., Биргера О.Г. -М: Медгиз 1947, 343 с.

105. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition. Baltimore. Williams & Wilkins, -1994 (перевод. Определитель бактерий Берджи, т. 1 и т. 2. М.: Мир, 1997. С. 187 -205).

106. Глик Б., Пастернак Дою. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. // Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 631 с.

107. Скоупс Р.К. Методы очистки белков / М. Изд-во «Мир». 1985. 358 с.

108. Остерман JIA. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983. 304 с.

109. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. // Пер. с англ. М.: Мир, 1985.

110. Павлова И.С., Любавина И.А., Лунин Ю.В. Определение 2,4-дихлорфенолуксусной кислоты с использованием моноклональных антител и биотин-стрептавидиновой системы детекции.// Биоорганическая химия. 1996. - № 4. - С. 269 - 272.

111. Козлов Л.В., Лахтин В.М., Скороходова Т.Г., Баталова Т.Н., Шойбонов Б.Б., Дьяков В.Л., Гузова В.А., Матвеевская Н.С. И Биоорган, химия. 2000. Т. 25. С. 817-820.

112. Возможность участия зимогенных форм фактора В и D в активации альтернативного пути системы комплемента человека / Л.В. Козлов, В.М. Лахтин, Т.Г. Скороходова и др. II Биоорган, химия 2000. - Т. 25. - С. 817 -820.

113. Ъ2.Ленинджер А. Биохимия: Молекулярные основы структуры и функций клетки. // Пер. с англ. М.: Мир, 1974 - 1976 г.г.

114. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. -247 с.3A.Stepanov V.M., Rudenskaya G.N. Proteinase affinity chromatography on bacitracin-Sepharose. // J.AppI. Biochem. 1983 Dec. - Vol. 5(6), - P. 420 - 428.

115. Cationic inhibitors of serine proteinases from buckwheat seeds. II Tsybina T.A., Dunaevsky Y.E., Musolyamov A.K., Egorov T.A., Belozersky M.A. / Biochemistry. Moscow 2001. - P. 941 -947.

116. Cartwright K. A. and Ala'Aldeen D. A. Neisseria meningitidis: clinical aspects. // J. Infect. -1997.-Vol. 34,-P. 15-19.

117. Recombinant bactericida 1 permeability-increasing protein (rBPI21) as adjunctive treatment for children with severe meningococcal sepsis: a randomised trial. rBPI21 Meningococcal Sepsis

118. Study Group. // Levin M., Quint P. A., Goldstein В., Barton P., Bradley J. S.,. Shemie S. D, Yeh Т., Kim S. S., Cafaro D. P., Scannon P. J. and Giroir B. P. / Lancet. 2000. - Vol. 356, - P. 961 - 967.

119. Early events in dendritic cell maturation induced by LPS. // Granucci F., Ferrero E., Foti M., Aggujaro D., Vettoretto K. and Ricciardi-Castagnoli P. / Microbes Infect. 1999. - Vol. 1, -P. 1079-1084.

120. McNeil G., Virji M. and Moxon E. R. Interactions of Neisseria meningitidis with human monocytes. // Microb. Pathog. 1994. - Vol. 16, - P. 153 - 163.

121. Федоров T.B., Суровцев В.И., Плетнев B.3., Бороздина М.А. II Биохимия. 2003. Т. 68, С. 50 53.

122. Branden С., Tooze J. Introduction to Protein Structure. // Garland Publishing Inc., New York,-1991.-202 p.

123. Ward W.H.J. //Diphteri a toxin: a novel cytocidal enzyme. /Trends Biochem. Sci. (TIBS), -Vol. 12, №1, P. 21 -31