Получение направленных мутаций в гене устойчивости к тетрациклину плазмиды pBR322 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Мазин, Александр Владимирович

• Мазин, Александр Владимирович
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мазин, Александр Владимирович

Введение.

Глава I. Обзор литературных данных

1.1. Методы направленного мутагенеза in vitro

1.1.1. Получение локализованных мутаций в результате рекомбинации фрагментов ДНК.

1.1.2. Индукция локализованных мутаций путем химической модификации однонитевых участков ДНК

1.1.3. Индукция локализованных мутаций цутем введения модифицированных нуклеотидов.

1.1.4. Индукция локализованных мутаций с помощью неполностью комплементарных ДНК-матрице олигонуклеотидных затравок.

1.1.5. Индукция направленных мутаций с помощью комплементарных полинуклеотидов, несущих алкилирующие группы.

1.1.6. Направленный мутагенез in vivo. Подходы и перспективы.

1.2. Ген, ответственный за устойчивость к тетрациклину плазмиды pBR322 - экспериментальная мишень для направленного мутагенеза.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение направленных мутаций в гене устойчивости к тетрациклину плазмиды pBR322»

Получение ген-направленных мутаций является одной из актуальных задач современной генетики. Разработка методов индукции мутаций в избранных участках генома открывает возможности для исследования функции генов и генетических регулирующих элементов, позволяет значительно ускорить получение мутантных вакцинирующих штаммов вирусов промнпленных микроорганизмов, высокопродуктивных сортов растений.

В последние годы было разработано несколько методов направленного мутагенеза in vitro с использованием различных принципов локализации предмутационных повреждений (Shortle et al,1981) •

В нашей лаборатории бык разработан метод, позволяющий получать направленные мутации в заранее избранных участках генома in vitro. Для этого было предложено использовать комплементарные этим участкам генома молекулы РНК, несущие управляемые алки-лирующие группы (Салганик и др., 1978). Предложенный метод был успешно использован для получения мутаций в избранных заранее генах бактериофага Т7 (Salganik et а1,1980).

Однако использование молекул РНК в качестве носителей алки-лирующих групп имеет ряд ограничений. В частности, при этом исключается возможность получения мутаций в нетранскрибируемых районах генома (промоторы, спейсеры, большинство псевдогенов). Кроме того, вцделение мРНК, транскрибированных с индивидуальных генов в большинстве случаев представляет собой весьма сложцую задачу. С другой стороны, набор известных в настоящее время эндонук-леаз рестрикции позволяет получать фрагменты ДНК практически из любого участка генома. Эти фрагменты могут быть затем встроены в плазмиды, амплифицированы и вццелены в больших количествах.

Короткие фрагменты ДНК, комплементарные любому избранноцу участку генома могут быть получены и путем химического синтеза. Поэтому весьма привлекательно в качестве носителей алкилирующих групп для получения направленных мутаций использовать молекулы ДНК. Настоящая работа посвящена исследованию этой возможности. В качестве модельной мишени для направленного мутагенеза был выбран участок ДНК плазмиды pBR322, являющейся универсальным вектором для клонирования про- и эукариотических генов. Разработка метода направленной модификации избранного участка ДНК плазмид, в принципе, позволит в дальнейшем получать направленные мутации практически в любом гене или регуляторном участке ДНК, встроенном в плазмиду, и изучать таким способом их структуру и функции.

Имеются данные, подтверждающие возможность использования ДНК, несущих алкилирующие группы,для химической модификации комплементарных им нуклеиновых кислот в клетках эукариот (Karpova et al, 1980; Грязнова и др., 1984). Следовательно,разработка метода модификации нуклеиновых кислот в комплементарном комплексе с помощью полиалвотирующих ДНК открывает подход для решения такой важной задачи как получение направленных мутаций in vivo, непосредственно в клетке.*

Изложенные выше соображения явились основанием для выполнения настоящего исследования*

- 7

Заключение диссертации по теме «Генетика», Мазин, Александр Владимирович

выводы

1.Разработан метод ген-направленного идетагенеза, основанный на химической модификации ДНК в ее заранее избранных участках. Для этого предложено использовать несущие множество алкилирующих группировок однонитевые ДНК, комплементарные избранному участку генома, которые при гибридизации обеспечивают строго локальное алкилирование ДНК. Метод обеспечивает возможность индукции мутаций в нетранскрибируемых участках генома.

2.Разработаны условия присоединения к молекуле ДНК множества остатков полифункционального алкилирующего реагента N , N , N

-три( р -хлорэтил)- ц'-(п формилфенил)пропилендиамина 1,3 (ТФП) с управляемой алкилирующей группировкой. Показано, что продукт алкилирования стабилен в условиях эксперимента.

3.Установлено, что при присоединении остатков ТФП к 4-5% оснований ДНК модифицированные молекулы сохраняют способность к гибридизации с комплементарными участками интактной ДНК.

Показано, что фрагмент рестрикции Т7 ДНК, в котором модифицировано реагентом ТФП 4-5% оснований гибридизуется лишь с комплементарной ему Т7 ДНК, но не гибридизуется с некомплементарной ДНК из куриных эритроцитов; фрагменты ДНК, к 4-5% оснований которых присоединили остатки ТФП, способны алкилировать комплементарный участок генома.

4.Разработан метод гибридизации полиалкилирующих однонитевых фрагментов ДНК с суперспирализованной ДНК плазмиды в щадящих условиях, при которых не происходит существенного выщепления алкилированных оснований из ДНК и снижения трансформирующей активности ДНК плазмиды.

5.С помощью разработанного метода модификации ДНК получены направленные мутации в гене устойчивости к тетрациклину (Тсг)

- но плазмиды pBR322. При этом частота возникновения мутантов составляла г* 0,4% и не отличалась при .трансформации штаммов E.eoli С600 (RecA*) и HBIOI (RecA") . Показано, что служивший контролем ген Арг плазмиды pBR322 не вовлекается в мутационный процесс.

6.Определен характер индуцированных мутаций. Было показано, что при использовании разработанного метода ген-направленного мутагенеза в ДНК плазмиды с высокой частотой возникают короткие прямые повторы (7-8 пн). Во всех случаях мутации этого типа были локализованы в участке ДНК, примыкающем к палиндрому.

7.Предложено объяснение механизма индукции строго локализованных тандемных повторов. Предполагается, что такие мутации возникают при участии "шпилечных11 структур, образующихся в полиалкилирующих однонитевых ДНК за счет имеющихся в них палиндромов.

8.Высказано предположение, что аналогичный описанному механизм возникновения повторяющихся последовательностей может вести к появлению множественных повторов в ДНК в естественных условиях и участвовать в эволюции геномов.

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные результаты подтверждают возможность использования полиалкилирующих производных ДНК для получения направленных мутаций. Так, молекулы ДНК, несущие множество остатков алкилирующих реагентов ТФП, весьма стабильны в условиях, используемых в экспериментах по направленному мутагенезу. При ограниченной степени модификации (до 3-5% оснований) такие молекулы ДНК сохраняют способность гибридизоваться с комплементарным участком ДНК-мишени и могут алкилировать его.

Предложенный в настоящей работе метод позволяет осуществлять направленную модификацию любого избранного заранее участка плазмид, а равно и клонированных в них генов и регуляторных генетических элементов; соответственно в этих районах генома могут быть получены мутации, представляющие практический или теоретический интерес.

При анализе характера мутаций, индуцированных в гене Тсг плазмиды pBR322, было установлено, что преобладающим типом мутаций в этом случае являются короткие тандемные повторы. Такие мутации возникали во всех случаях в районе гена Тсг, примыкающем к палиндромной последовательности ДНК. Предполагается, что главную роль в образовании тандемных повторов играет кова-лентно сшитая "шпилечная" структура, формируемая палиндромом в однонитевой ДНК, используемой в качестве носителя алкилирующих Г]?упп. Аналогичный предложенному в настоящей работе механизм возникновения повторяющихся последовательностей, по-видимому, может вести к появлению множественных повторов в ДНК в естественных условиях и участвовать в эволюции геномов. Роль аналогичную ковалентным сшивкам в этом случае могут играть белки, сходные с RecA белком E.eoli.

ПЛАВА б. ОТ АВТОРА

Выражаю глубокую благодарность сотрудникам Института цитологии и генетики Г.Л.Дианову за помощь в проведении ряда экспериментов, полезные советы и обсуждение полученных результатов и Л.П.Овчинниковой за помощь в выполнении микробиологической части работы. Особую признательность выражаю руководителю диссертационной работы Рудольфу Иосифовичу Салганику за постоянную и всестороннюю помощь и поддержку, оказанную при выполнении настоящей работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мазин, Александр Владимирович, 1984 год

1. Бойер Г., Бетлах М., Боливар Ф., Родригес Р., Хейне -кер Г., Шайн Дж., Гудмен Г. Создание векторов для молекулярного клонирования. В кн.: Рекомбинантные молекулы: значение для науки и практики. М., Мир,1980, с.20-35.

2. Воронина Е.Н., Кокоза Е.Б., Дианов Г.Л., Салганик Р.И. Получение направленных мутаций у фага Т7 путем трансфекции Escherichia coli с помощью локально ажилированной Т7 ДНК.-Генетика,1980,т.16, N° 9, с.1527-1534.

3. Воронина Е.Н., Пословина А.С., Салганик Р.И. Регуляция спектра мутаций E.eoli путем воздействия химическими мутагенами в различные периоды репликации ДНК. Генетика,1968,т.1. N2 7, с.89-94.

4. Галль А.А., Курбатов В.А., Мустаев А.А., Шишкин Г.В. Алкилирующие реагенты для направленной модификации биополимеров. Изв.Сиб.отд. АН СССР,сер.химич.наук,1979,№ 4,вып.2,с.99-104.

5. Грачев М.А., Зайчиков Е.ф., Кравченко В.В., Плетнёв А.Г. Выделение промоторных и терминаторных фрагментов ДНК фага Т7 из гидролизата, полученного действием эндонуклеазы рестрикции BsuR . Докл.АН СССР,1978,т.239, N2 2,с.475-478.

6. Грин М., фудайнага К., Пина М. Применение ДНК-РНК гибридизации на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах при изучении вирусов. В кн.: Методы вирусологии и молекулярной биологии. М.,Мир,1972, с.383-394.

7. Гринева Н.И. Химическое алкилирование в специфичных комплексах как метод исследования структуры и функции нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов. Биохимия, 1977, т.42,вып. 2, с.370-374.

8. Гринева Н.Й., Карпова Г.Г. Комплементарно адресованное алкилирование рибосомальной РНК алкилирующими производными олигонуклеотидов. Молекуляр.биология,1974,т.8,вып.6,с.832-834.

9. Гринева Н.И., Мызина С.Д. Кинетические характеристики алкилирования ДНК хлорэтиламинами и элиминация алкилирован -ных оснований из ДНК. Молекуляр.биология,1975,т.9, !вып.4, с.502-508.

10. Гринева Н.И., Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г. Синтез ури-дил-Сз'-з*)^1,3f-0- 4-(N- 2-хлорэтил-1Г-метиламино)-бензили-ден -уридина. Изв.Сиб.отд.АН СССР,сер.химич.наук,1968,N2 12, вып.5,с.118-124.

11. Гринева Н.Й., Кнорре Д.Г., Сенженко Л.П., Теплова Н.М. Модификация тРНК 2,3-0- 4(it-2 -хлорэтил-1Т-метиамино)-бвнзи-лиден -уридин 5-метилфосфатом. Молекуляр.биология,1970,т.4,вып.3,с.307-312.

12. Гринева Н.И., Кнорре Д.Г., Кобец Н.Д., Курбатов В.А., Ломакина Т.О. Электростатические эффекты при алкилировании тРНК алифатическими 2-хлорэтиламинами. Молекуляр.биология, 1972,т.6,вып.5, с.767-772.

13. Гринева Н.И., Карпова Е.Г., Мызина С.Д., Чемисова

14. A.Н. Комплементарно адресованное алкилирование ДНК производными гекса-аденилата. Биорган.химия,1975б,т.1, № 12,с.1707-1715.

15. Грязнова И.М., Будкер В.Г., Дианов Г.Л., Салганик

16. Р.И. Перенос экзогенной полиалкилирующей РНК в асцитные клетки карциномы Эрлиха с помощью липосом. Биохимия,1984.

17. Гусев В.А., Каргинов В.А., Кравченко В.В., Петренко

18. B.А., Петров Н., Семенова Л.Н. Модификация операторно-промо-торного участка ДНК фага лямбда в составе специфического комплекса С рнк-полимеразой Escherichia coli. Докл.АН СССР^ 1981,т.260, N° 3, с.753-756.

19. Дашкевич B.C., Дымшиц Г.М., Салганик Р.И. Изучение состояния ДНК регенирирующей печени крыс при репликации и траскрипции. Молекуляр.биология,1968,т.2,вып.4,с.562-567.

20. Дианов Г.Л., Бондарь Т.С., Салганик P.M. Исследова -ние комплементарного взаимодействия множественно алкилированных полирибонуклеотидов.-Молекуляр.биология,1979а,т.13,вып.2,с.383-387.

21. Дианов Г.Л., Овчинникова Л.П., Воронина Е.Н., Коко -за Е.Б., Салганик Р.И, Получение направленных мутаций у фага Т7 с помощью полиалкилирующих РНК, комплементарных избранным генам. Докл.АН СССР,19796,т.248, № 2,0.465-468.

22. Дианов Г.Л., Мазин А.В., Зайцев Б.Н., Вавилин В.И., Салганик Р.И, Направленная модификация ранней области ДНК бактериофага Т7 путем алкилирования в R-петле, образованной модифицированным транскриптом.- Молекуляр.биология,1980,т.19, вып.2,с.261-264.

23. Мазин А.В., Дианов Г.Л., Салганик Р.И. Использование алкилирующих производных ДНК для направленного воздействия на геном. Молекуляр.биология,1981,т.15,вып.I,с.252-256.

24. Мазин А.В., Дианов Г.Л., Овчинникова Л.П., Салганик Р.И. Индукция направленных мутаций в гене устойчивости к тетрациклину плазмиды pBR322 с помощью комплементарных однонитевых фрагментов ДНК, несущих алкилирующие группы. Докл.

25. АН СССР,1983,т.268,Ш 4, с.979-983.

26. Салганик Р.И. О возможности контролировать мутационный процесс, используя химические мутагены, реагирующие преимущественно с однонитевыми ДНК, при локальных изменениях состояния ДНК в клетках. Докл.АН СССР,1968,т.180, № 3,с.726-729.

27. Салганик Р.И., Дианов Г.Л., Курбатов В.А., Шишкин

28. Г.В., Галль А.А. Направленное воздействие на геном бактериофага Т7 с помощью транскрипта области ранних генов, несущего множественные алкилирующие группы.- Докл.АН СССР,1978,т.239, №I,c.2I7-2I9.

29. Салганик Р.И., Мазин А.В., Дианов Г.Л., Овчинникова Л.П. Индукция повторяющихся нуклеотидных последовательностей1. TIв гене Тс плазмиды pBR322 в результате ген-направленногомутагвнеаа. Докл.АН СССР,1984а,т.274, № I, с.197-201.

30. Backman K., Ptashne M. Maximizing gene expression on a plasmid using recombination in vitro.-Cell,1978,v.30,IT 1, p.65-71.

31. Backman K#, Betlach M., Boyer H.W., Yanofsky S. Genetic and physical studies on the replication of Col E1-type plasmids. Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,1979»v#43, Part 1, p.69-76.

32. Bahl C.P., Wu R., Brousseau R., Sood A.K., Hsiung H.M., Narang S.A. Chemical synthesis of versatile adaptor for molecular cloning.- Biochem.Biophys.Res.Commun. ,1977,v.81,N 3,1. P*695-703*

33. Beattie K.L., Wiegand R.C., Radding C.M. Uptake of homologous single-stranded fragments by superhelical DNA. II Characterization of the reaction.-J.Mol.Biol.,1977,v.116,N 4, p.783-803*

34. Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Synthesis of ribonucleosides and deoxyribonucleoside phosphates containing 2-chlorоethylamine and nitrogen mastard residues.-Tet-rahedron letters,1967,v.37, p.3557-3562.

35. Betlach M.C., Hershfield V.,Chow L., Brown W., Goodman H.M., Boyer H.W. A restriction endonuclease analysis of the bacterial plasmid controlling the EcoRI restriction and modification of DNA.-Fed.Proc.,1976,v.359,p.2037-2043.

36. Bhanot O.S., Khan S.A., Chambers R.W. A new system for studying molecular mechanisms of mutation by carcinogens. -J.Bio1.Chem., 1979, v. 254, N 24,p.12684-12693•

37. Bolivar E., Backman K. Plasmids of Escherichia coli as cloning vectors.- In: Methods in Enzymology,1979»v.68, p.245-268, ed.by L.Grossman and K.Moldave, N.Y.-London,Academic Press.

38. Bolivar P., Rodriguez R.b., Green P.J., Betlach M.C., Heyneker H.L., Вбуег H.W., Crosa J.H., Falkow S. Constraction and characterization of new cloning vehicles. II. A Multipurpose cloning system. Gene,1977»v.2,p.95-102.

39. Brookes P. Reaction of alkylating agents with nucleic acids.- In: Chemiotherapy of Cancer,1964,p.31-4-3» ed. Plat-tner P.A.,Elsevier Publishing Company, Amsterdam.

40. Brookes P., Lowley P.D. The reaction of mono- and difunctional alkylating agents with nucleic acids. -Biochem. J.,1961,v.80,N 3,P*496-503

41. Acad.Sci.USA,1975,v.72,N p. 1392-1396.

42. Colman A., Byers M.J., Primrose S.B., Lyons A. Rapid method of purification plasmid DNA by hydroxylapatite chromatography." Eur«J.Bact. ,1978,v.91»N 2,р.ЗОЗ-ЗЮ,

43. Corden J., Wasylyk В., Buchwalder A., Sassone-Corsi P., Kedinger C., Chambon P. Promoter sequences of eukaryotic protein-coding genes.- Science,1980,v.209,N 4464,p.1406-1414.

44. Datta N., Kontamichalou P. Penicillinase synthesis controlled by infectious R factors in enterobacteriaceae. -Nature,1965,v.208,N 5007,p.239-243.

45. DiMaio D., Nathans D. Cold-sensitive regulatory mutants of simian virus 40. J.Mol.Biol.,1980,v.140, N 1,p.129-142.

46. Domingo E., Flavell R.A., WeissmannC. In vitro site-directed mutagenesis: Generation and properties of an infections extracistronic mutant of bacteriophage • Gene,1976,v.1,N 1,p.3-25.

47. Emtage J.C., Tacon W.C.A., Catlin G.H., Jenkins В., Porter A.G., Carey N.H. Influenza antigenic determinants are expressed from haemagglutinin genes cloned in Escherichia coli.- Nature,1980,v.283,N 5743,p.171-174.

48. Plavell R.A., Sabo D.L., Bandle E.F., Weissmann C. Site-directed mutagenesis: Generation of an extracistronic mutation in bacteriophage.^ RNA.- J.Mol.Biol.,1974,v.89, N 2,p.255-272.

49. Fuchs R.P.P., Schwartz N., Daune M.P. Hot spots of frameshift mutations induced by the ultimate carinogen Nf-acetyl-N-2-acetylaminofluorene. Nature,19S1,v.294,N 5842, p.654-659*

50. Gayda R.C., Tanabe J.H., Knigge K.H., Markovitz A. Identification by deletion analysis of an inducible protein required for plasmid pSC101-mediated tetracycline resistance. Plasmid,1979,v,2, N 3,p.417-425»

51. Gillam S., Smith M. Site-specific mutagenesis using synthetic oligodeoxyribonucleotide primers.1. Optimum condi* tions and minimum oligodeoxyribonucleotide lenth. Gene, 1979a,v.8,N 1,p.81-97.

52. Gillam S., Janke P., Astell C., Phillips S., Hutchison C.A.III, Smith M. Defined transversion mutations at a specific position in DNA using synthetic oligodeoxyribonucleotides as mutagens. Nucleic Acids Res.,1979,v.6,N 9,p.2973-2985.

53. Goodman M.F., Keener S., Guidolli S., Branscomb E.W. On the enzymatic basis for mutagenesis by manganese.- J.Biol. Ohem.,1983,v.258,N 16,p.3469-3475*

54. Grineva N.I., Karpova G.G. Complementarily addressed modifications of rRNA with p-(chloroethylmethylamino) benzy-lidene hexanucleotides.- FEBS Lett,1973»v.32, N 3,p.351-355»

55. Gruss P., Dhar R., Khoury G. Splicing as a requirement for biogenesis of functional 16S mRNA of simian virus 40.- Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1979,v.76,N 2,p.943-947.

56. Hall A., Knowles J.R. Directed selective pressure on a JJ -lactamase to analyze changes involved in the develop -ment of enzyme function.- Nature,1976,v.264,N 5588,p.804-808.

57. Hayatsu H. Bisulfite modification of nucleic acids and their constituents.- Prog.Nuclein Acids Res.Mol.Biol., 1976,v.16,p.75-124.

58. Heffron F., Bedinger P., Champoux J.J., Falkow S. Deletions affecting transposition of an antibiotic resistance gene.- Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1977,v.74,N 2,p.702-706.

59. Heffron F., So M., McCarthy B.J. In vitro mutagenesis of a circular DNA molecule using synthetic restriction sites.- Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1978,v.75,N 12,p.6012-6016.

60. Hershfield V., Boyer H.W., Yanofsky C., Lovett M.A., Helinski D.R. Plasmid ColE1 as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA.- Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1974,v. 71,N 9,p.3455-3459*

61. Hillen W., Unger B. Binding of four repressors to double stranded tet operator region stabilazes it against thermal denaturation.- Nature,1982,v.297,N 5868,p.700-702.

62. Humayan M.S., Chambers E.W. Constraction of a site specific deletion frameshift mutation in an essential gene of bacteriophage Ij) X174.- Nature, 1979,v.278,N 5704,p.524-529.

63. Hutchison C.A., Philips S., Edgell M.H., Gillam S., Jahnke P., SifLth M. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.- J.Biol.Chem.,1978,v.253»N 18,p.6551-6560.

64. Inman E.B., Schnos M. Structure of branch points in replicating DNA. Presence of single-stranded connections in

65. К DNA branch points.- J.Mol.Biol.,1971,v.56,N 2,p.319-325*

66. Jorfc^isen E.A., Eernikoff W.S. Organization of structural and regulatory gene that mediate tetracycline resis -tance in transposon Tn10.- J.Bacteriol.,1979,v.138,N 4,p.705-714.

67. Kaiser A.D., Hogness D.S. The transformation of Escherichia coli with deoxyribonucleic acid isolated frombacteriophage X dg# J.Mol.Biol.,1960,v.2,N 6,p.392-415*

68. Kalderon D., Oostra B.A., Ely B.K., Smith A.E. Deletion loop mutagenesis: a novel method for the constructionof point mutations using deletion citation. Nucleic AcidsЙ

69. Res., 1982,v.10, N 17,p.5161-5171.

70. Lai С.-J», Nathans D. Deletion mutants of SV40 generated by enzymatic excision of DNA segments from the viral genome.- J.Mol.Biol.,1974,v.89,N 1,p.179-193

71. Lai C.-J., Nathans D. The B/C gene of simian virus 40. Virology,1976,v.75,N 2,p.333-345.

72. Levy S.B., McMurry L. Detection of an inducible membrane pro-^in associated with R-factor mediated tetracycline1. Vjlresistance.- Biochim.Biophys.Res.Commun,1974,v.56,N 4,p.1060-1080.

73. Maniatis T. Recombinant DNA procedures in the study of eukaryotic genes.-Cell.Biol.,1980,v.3,p.564-608.109* Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA.- Proc.Nat.Acad.USA,1977,v.77,N 2,p.560-564.

74. Maxam A.M., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages.- In: Method in Enzymo-logy,1980,v.65. Part 1,p.499-550, ed L.Grossman and K.Moldave, N.Y.-London,Academic Press.

75. McEntee K., Weinstock G.M., Lehman I.E. Initiation of general recombination catalyzed in vitro by the rec A protein of Escherichia coli.- Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1979, v.76,N 6,p.2615-2619.

76. McMurry L., Petrucci E.E., Levy S. Active efflux of tetracycline encoded by four genetically different tetracycline resistance determinant in Escherichia coli.-Proc. Nat. Acad.Sci.USA,1980,v.77,N 7,p.3974-3977

77. Meynell E., Datta N. Mutant drug resistance factors of high transmissibility. Nature, 1967,v.214, N 5091,p.885-888.

78. Miller U.K., Pried M. Construction of infections polyoma hybrid genomes in vitro.- Nature,1976,v.259, N 5544,p.598-601.

79. Minkley E.G. Transcription of the early region of bacteriophage T7# Specifity and selectivity in the in vitro initiation of RNA synthesis.- J.Mol.Biol.,1974,v.83,N 3,p. 305-331.

80. Mulligan B.C., Berg P. Expression of a bacterial gene in mammalian cells.- Science,1980,v.209,N 4464,p.1422-1427»

81. Muller W., Weber H., Meyer F., Weissmann C. Site-directed mutagenesis in DNA: Generation of point mutations in cloned J3 -globin complementary DNA at positions corresponding to amino acids 121 to 123» J.Mol.Biol.,1978,v.124,N 2, p.343-358.

82. Murray N.E., Murray K. Manipulation of restriction targets in phage X to form receptor chromosomes for DNA fragments.- Nature,1974,v.251,P*476-481.

83. Osterlund M., Luthman H., Nilsson S.V., Magnusson G. Ethidium-bromide-inhibited restriction endonucleases cleave one strand of circular DNA.- Gene,1982,v.20,N 1,p.121-125»

84. Parker R.C., Watson R.M., Vinograd J. Mapping of closed circular DNAs by cleavage with restriction endonucleases and calibration by agarose gel electrophoresis.- Proc. Nat .A cad. S ci .tJSA, 1977, v. 74, N 3, P • 851-855•

85. Radding C.M., Beattie K.L., Holloman W.K., Wiegand R.C. Uptake of homologous single-stranded fragments by super-helical DNA. IV. Branch migration.- J.Mol.Biol.,1977,v.116,1. N 4,p.825-839*

86. Rawlins D.R., Muzyczka N. Construction of a specific amber codon in the Simian virus 40 T-antigen gene by site-di-reoted mutagenesis. J.Virol.,1980,v.36,N 4,p.611-616.

87. Razin A., Hirose T., Itakura K., Riggs A.D. Efficient correction of a mutation by use of chemically synthesized DNA.- Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1978,v.75,tf 9,P-4268-4270.

88. Richardson C.C. The 5,-terminal nucleotides of T7 bacteriophage deoxyribonucleic acid.-J.Mol.Biol.,1966,v.15, N 1,p.49-61.

89. Richardson С.0., Kornberg А dexoxyribonucleic acid phosphatase-exonuclease from Escherichia coli.-J.Biol. Chem.,1964,v.239,N 1,p.242-250.

90. Ripley L.S., Glickman B.W. Unique self-conq?lementa-ry of polindromic sequences provides DNA structural.intermediates for mutation.- Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.,1983, v.47, Part 2,p.851-855•

91. Robins D.M., Ripley S., Henderson A.S., Axel R. Transforming ША integrates into the host chromosome.- Cell, 1981,v.23, N 1,p.29-40.

92. Rogers S.G., Weiss B. Exonuclease III of Escherichia coli K-12, an AP Endonuclease.- In: Methods in Enzymology, 1980,v.65, Part I, p.201-211, ed.by L.Grossman and K.Moldave, N.Y.-London, Academic Press.

93. Sanger P-., Coulson A.B. The use of thin acrylamide gels for ША sequencing.- FEBS Lett.,1978,v.87,N 1,p.107-110.

94. Scheller B.H., Dicherson B.E., Boyer H.W., Biggs A.D., Itakura K. Chemical synthesis of restriction enzyme recognition sites useful for cloning. Science,1977»v.196,1. N 4286, p.177-180.

95. Scherrer S., Davis E.W. Beplacement of chromosome segment with altered DNA sequences constructed in vitro. -Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1979»v.76,N 10,p.4951-4955.

96. Schmeckpeper B.3., Smith K.D. Use of formamide in Nucleic Acid reassociation. Biochemistry,1972,v#11, N 7, p.1319-1325»

97. Shenk Т.Е., Carbon 2», Berg P. Construction and analysis of viable deletion mutants of SV40.- J.Virol.,1976, v.18,N 4,p.664-671.

98. Shibata Т., DasGupta C., Cunningham E.P., Eadding C.M. Purified Escherichia coli rec A protein catalyzes homologous pairing of superhelical DNA and single-stranded fragments. Proc.Nat.Acad.Sci."DJSA,1979,v.76,N 4,p. 1638-1642.

99. Shortle D., Botstein D. Single-stranded gaps as localized targets for in vitro mutagenesis. In: Molecular and Cellular Mechanisms of Mutagenesis,1981,ed. Lemontt J.F., Ge-nerosa W.M. New York, Plenum.

100. Shortle D., Nathans D. Local mutagenesis: A method for generating viral mutants with base substitutions in preselected regions of the viral genome.- Proc.Nat.Acad.Sci.tTSA, 1978,v.75, N 5,p.2170-2174.

101. Shortle D., Koshland D., Weinstock G.M., Botstein D. Segment-directed mutagenesis: Construction in vitro of point mutations limited to a small predetermined region of a circular DNA molecule.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1980,v.77,N 9,P«5375-5379.

102. Shortle D.E., Margolskee B.F., Nathans D. Mutational analysis of the simian virus 40 replicon: Pseudorevertants of mutants with a defective replication origin.- Proc.Nat.Acad. Sci.,USA,1979,v.76,N 12,p.6128-6131.

103. Solnick D. A mutant of adenovirus type 5 with a defect in the splicing of RNA from the early region 1A.- Nature,1981,v.29, N 5815,p.508-510.

104. Stuher D., Budard H. Organization of transcriptional signals in plasmid pBR322 and pACYC184.- Proc.Nat.Acad.Sci. USA,1981,v.78,N 1,p.167-171.

105. Tai H.T., Smith C.A., Sharp P.A., Vinograd J. Sequence heterogenety of closed SV40 DNA. J.Virol, 1972,v.9, p.317.

106. Tait R.C., Boyer H.W. On the nature of tetracycline resistance controlled by the plasmid pSC101.- Cell,1978,v.13, N 1,p.73-81.

107. Tait R.C., Rodriguez R.L., Boyer H.W. Altered tetracycline resistance in pSC101 recombinant plasmid.- Mol.Gen. Genet.,1977,v.151,N 3,P-327-331.

108. Taniguchi Т., Weissmann C. Site-directed mutations in the initiator region of the bacteriophage Qj} coat cist-ron and their effect on ribosome binding.- J.Mol.Biol.,1978, v.118, N 4,p.533-565»

109. Treisman К., Novak V., Favaloro J., Kamen B. Transformation of rat cells by an altered polyoma virus genome expressing only the middle T proteins. Nature,1981,v.292,1. N 5824,p.595-600.

110. Volker Т.А», Showe M.K. Induction of mutations in specific genes of bacteriophage T4 using cloned restriction fragments and marker resuce.- Mol.Gen.Genet,1980,v.177» N 3» p,447-452.

111. Wallace Е.Б., Johnson P.F., Tanaka S., Schold И., Itakura K., Abelson J. Directed deletion of a yeast transfer-ENA intervening sequence.- Science,1980,v.209,N 4464,p.1396-1400.

112. Weissmann 0., Nagata S., Taniguchi Т., Weber H., Meyer F. The use of site-directed mutagenesis in reversed genetics.- Ins Genetic Engineering Principles and Methods,1979, v.1,p.133-150, ed. Setlou J.K., Hollaender A. New York, Ple-mun.

113. Wiegand B.C., Beattie K.L., Holloman W.L., Eadding C.M. Uptake of homologous single-stranded fragments by super-helical DNA. III. The product and its enzymic conversion toa recombinant molecule. J.Mol.Biol.,1977,v.116,IT 4,p.805-824.

114. Wilkinson A.J., Fersht A.R., Blow D.M., Winter G. Site-directed mutagenesis as a probe of enzyme structure and catalysis: tyrosyl-tRNA synthetase cysteine-35 to glyci-ne-35 mutation— Biochemistry,1983,v.22, N 15 ,p.3581-3586.

115. Woflson J., Dressier D. Regions single-stranded DNA in the growing points of replicating bacteriophage T7 chromosomes. Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1972,v.69,N 9,p.2682-2686.

116. Yang H., Zubay G., Levy S. Synthesis of an R plasmid protein associated with tetracycline resistance is negatively regulated. Proc.Nat.Acad.Sci.fJSA,1976,v.73, N 5, p.1509-1512.

117. Yoon K. Localized mutagenesis of the tetracycline promoter region in pBR322 by 4*,5*,8-trimethylpsoralen.-Mutat.Res.,1982,v.93, И 3»p«253-262.

118. Салганик P. И., Дианов Г. Л., Васюнина В. А., Овчинникова Л.П., Синицина О.й. Индукция широкого спектра рекомбинаций в результате ограниченного сайт-направленного поврездения плазмидной .1ЩК химическими мутагенами. Докл.АН СССР, 19846,