Полусинтетические флавоцитохромы Р450: Перенос электронов и катализ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Шумянцева, Виктория Васильевна

• Шумянцева, Виктория Васильевна
• доктор биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации доктор биологических наук Шумянцева, Виктория Васильевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. МОНОКОМПОНЕНТНЫЕ ФЛАВОЦИТОХРОМЫ КАК КАТАЛИТИЧЕСКИ САМОДОСТАТОЧНЫЕ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ.

1.1. ЦИТОХРОМ Р450 ВМЗ (СУР 102).

1.2. СИНТАЗА ОКСИДА АЗОТА (II).

1.3. ДРУГИЕ ПРИМЕРЫ ПРИРОДНЫХ МОНОКОМПОНЕНТНЫХ ФЛАВОГЕМОПРОТЕИНОВ.

1.3.2. Цитохром Ь558.

1.3.4. Цитохром Р4501Ъху.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Полусинтетические флавоцитохромы Р450: Перенос электронов и катализ»

ПРИРОДНЫХ ОКСИГЕНАЗНЫХ СИСТЕМ.41

2.1 НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИНТЕТИЧЕСКИЕ АНАЛОГИ МИКРОСОМАЛЬНОЙ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ СИСТЕМЫ НА

ОСНОВЕ ПОРФИРИНОВ И ИХ АНАЛОГОВ.43

2.2. ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ МОДЕЛИ ЦИТОХРОМ Р450

СОДЕРЖАЩИХ СИСТЕМ.53

2.2.1. Роль каркасных молекул в конструировании модельных систем.53

2.2.2. Получение каталитических антител к металлопорфиринам.58

2.2.3.Восстановители, используемые в системах, содержащих металлопорфирины.59

Глава 3. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЕМОПРОТЕИНОВ И ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ.62

3.1. ХИМИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ С ЦЕЛЬЮ ВКЛЮЧЕНИЯ НОВЫХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ.62

3.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ИССЛЕДОВАНИИ ГЕМОПРОТЕИНОВ.67

3.2.1. Применение принципов электролиза для восстановления гемопротеинов.67

3.2.2. Использование неорганических полупроводников в окислительно-восстановительных системах.79

3.2.3. Конструирование ферментативной «гальванической пары» для осуществления окислительно-восстановительных реакций.79

3.3.ФОТОИНДУЦИРОВАННЫЙ ЭЛЕКТРОННЫЙ ТРАНСПОРТ. 81

3.4. ИЗМЕНЕНИЕ МИКРООКРУЖЕНИЯ БЕЛКА И ЕГО АКТИВНОГО ЦЕНТРА.84

3.4.1. Моделирование мембранного окружения.84

3.4.2. Ферментативный катализ в обращенных мицеллах и органических растворителях.85

3.5. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА РЕАКЦИИ, КАТАЛИЗИРУЕМЫЕ ГЕМОПРОТЕИНАМИ.89

3.6. ВЛИЯНИЕ ДАВЛЕНИЯ НА КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕМОПРОТЕИНОВ.91

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.95

4.1. Реактивы.95

4.2. Препаративные методы.96

4.3. Аналитические методы.100

4.3. Электрохимические методы.105

4.5. Фотовосстановление флавоцитохромов.108

Глава 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ.110

5.1. Цель и задачи исследования.110

5.2. Влияние модификации различных аминокислотных остатков на активность цитохромов Р450.111

5.3. Использование FMN и FAD в качестве медиаторных групп. 116

5.4. Модификация цитохрома Р450 2В4 по SH-группе цистеина 152.119

5.5. Рибофлавин как медиатор электронного транспорта при восстановлении цитохрома Р450. 123 б

5.5.1. Разработка метода ковалентного связывания гемпротеина с рибофлавином.124

5.5.2. Исследование разностных спектров связывания субстратов I и II типа с флавоцитохромом Р450 2В4.129

5.5.3. Редуктазная активность флавоцитохрома RfP450 2В4.130

5.5.4. Монооксигеназная активность флавоцитохрома RfP450 2В4.136

5.5.5. Исследование механизма реакций, катализируемых полусинтетическим флавоцитохромом RfP450 2В4.140

5.6. Пероксидазные реакции, катализируемые флавоцитохромом RÍP450 2B4.142

5.6.1. Кинетические параметры пероксидазных реакций флавоцитохрома Р450 2В4.142

5.6.2. Влияние цианида натрия на Н2О2 - зависимые реакции флавоцитохрома RfP450 2В4.146

5.6.3. Влияние специфического ингибитора цитохрома Р450 -SKF-525A на Н202-зависимые реакции, катализируемые флавоцитохромом RfP450 2В4.149

5.6.4. Исследование люминол-зависимой хемилюминесценции в системе флавоцитохром RfP450 2В4 -пероксид водорода.150

5.7. Конструирование искусственных флавогемопротеинов на основе альбумина.157

5.8. Электрохимические методы восстановления полуискусственных флавоцитохромов.162

5.8.1. Восстановление флавоцитохрома РКР450 2В4 и флавоцитохрома 1^Р450 1А2 в растворе.162

5.8.2. Иммобилизация флавоцитохромов 1^Р450 2В4, Г^Р450 1А2 и РМР450бсс на родий-графитовых печатных электродах. 174

5.9. Фотохимические реакции в системе флавины -цитохром Р450

2В4.191

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.202

ВЫВОДЫ.206

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.208

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Цитохромы Р450 (ЕС. 1.14.14.1) являются монооксигеназами, уникальное свойство которых - способность гидроксилировать неактивированные атомы углерода. Цитохромы Р450 представлены примерно 400 конституитивными и индуцируемыми изоформами с молекулярной массой 49-55 кДа (Werck-Reichhart and Feyereisen, 2000; Мишин и Ляхович, 1985). Цитохромы метаболизируют около 200000 различных соединений, катализируя примерно 60 типов химических реакций. Такими реакциями являются гидроксилирование циклических соединений (ароматических углеводородов), гидроксилирование алифатических соединений (алканов и алкильных боковых заместителей), N-, О- или S-деметилирование, деалкилирование, эпоксидирование, N-окисление (образование N-оксидов и N-гидроксилирование), S-окисление и десульфирование т. д. (Archakov and Bachmanova, 1990; Ortiz de Montellano, 1995, Werck-Reichhart and Feyereisen, 2000). Цитохромы осуществляют восстановление нитросоединений, азосоединений и соединений, содержащих эпоксидные и NO-группы. Эта особенность цитохромов Р450 делает их перспективными в использовании для анализа содержания в различных средах лекарственных препаратов и (или) их метаболитов, ксенобиотиков, а также для стереонаправленного синтеза стероидов или других классов биологически активных соединений. Повышение эффективности ферментативного катализа гемопротеинов является важной практической задачей. По своей молекулярной организации цитохром Р450-содержащие системы могут быть классифицированы на три основных типа (Archakov and Degtyarenko, 1993; Degtyarenko and Archakov, 1993). Первый тип представляет собой трехкомпонентную систему, состоящую из цитохрома Р450 и его белков - редокс-партнеров. В случае Pseudomonas putida это NADH-специфичный флавопротеин путидоредоксин редуктаза, белок, содержащий железо-серный кластер - путидоредоксин и цитохром Р450 101 (Р450сат). В случае митохондриальной гидроксилазной системы коры надпочечников кроме гемопротеина цитохрома Р450 11А1 (P450scc) это адренодоксин редуктаза и адренодоксин. Второй тип -микросомальная монооксигеназная система -состоит из цитохрома Р450 (например Р450 2В4) и электронотранспортного флавопротеина 1\1АО(Р)Н-зависимой цитохром Р450-редуктазы (Archakov and Bachmanova, 1990). К третьему типу относятся однокомпонентные флавогемопротеины, состоящие из одной полипептидной цепи с флавин- и гем- связывающими участками. К ним относятся цитохром Р450 ВМЗ (СУР 102, ЕС. 1.14.13.1), выделенный из клеток Bacillus megaterium (Narhi et al., 1986) и синтазы оксида азота (ЕС 1.14.13.39), (Stuehr, 1999).

Перспективы использования цитохром Р450-содержащих ферментных систем довольно обширны вследствие функциональной значимости этого класса ферментов. Однако до сих пор реальные успехи в этой области весьма ограничены вследствие высокой степени инактивации цитохромов Р450 и его самоинактивации при химическом восстановлении и в процессе катализа. (Karuzina et al., 1999). Создание модельных селективных стероидгидроксилирующих систем позволит сконструировать оксигеназные реакторы. Разработка модельных детоксицирующих систем перспективна для окисления ксенобиотиков в более полярные метаболиты, что облегчает их последующий метаболизм экскреторными органами. Конструирование модельных цитохром Р450-систем для создания метаболических карт различных лекарственных соединений с целью обнаружения наиболее токсичных реакционноспособных метаболитов позволит оценить потенциальную канцерогенную или мутагенную опасность того или иного класса соединений. Решающую роль микросомальная монооксигеназная система печени играет и в окислении холестерина, и в биосинтезе из него желчных кислот, что является основным путем удаления холестерина из организма. Вследствие высокой лабильности природного цитохрома Р450 большое значение имеет проблема создания искусственных модельных систем, которые с одной стороны, являлись бы аналогами цитохрома Р450 и обладали его основными свойствами, а с другой стороны, были бы более стабильными in vitro, что значительно повысило бы их эффективность и облегчило бы изучение таких систем. Сопоставление скоростей реакций, катализируемых moho-, ди- и трехкомпонентными цитохром Р450-содержащими системами, позволяет сделать вывод о том, наиболее эффективны монокомпонентные системы.

Для создания однокомпонентной системы на основе цитохрома Р450, обладающей монооксигеназной и редуктазной активностью, был предложен подход, основанный на ковалентном связывании с гемопротеином цитохромом Р450 флавиновых нуклеотидов FMN, FAD или рибофлавина. Необходимо отметить, что цитохром Р450 не проявляет каталитическую активность (как редуктазную, так и монооксигеназную) без белков - редокс-партнеров.

В данном исследовании предложено следующее научное направление: создание однокомпонентной полусинтетической модели, обладающей активностью, свойственной цитохром Р450-содержащим системам. В качестве доноров электронов предложено использовать как традиционные восстановители цитохром Р450-содержащих систем - NAD(P)H или NADH, так и альтернативные подходы, основанные на электрохимическом и фотохимическом восстановлении полусинтетических флавогемопротеинов, полученных на основе цитохромов Р450. и

Перспективность таких способов восстановления заключается в возможности создания на основе однокомпонентной полусинтетической системы и альтернативных источников электронов биосенсоров для определения ксенобиотиков в различных средах. Цель исследования

Цель настоящей работы - 1) создание однокомпонентной полусинтетической модели, обладающей активностью, свойственной цитохром Р450-содержащим системам; 2) использование альтернативных неэнзиматических источников электронов для восстановления полусинтетических флавогемопротеинов, полученных на основе цитохромомв Р450.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи.

1. Разработать методы ковалентного связывания гемопротеина цитохрома Р450 с флавиновыми нукпеотидами FMN, FAD или рибофлавином.

2. Охарактеризовать флавогемопротеины с помощью спектральных методов.

3. Изучить редуктазную активность полусинтетических флавоцитохромов Р450.

4. Исследовать МА0(Р)Н-зависимую монооксигеназную активность флавоцитохромов Р450.

5. Исследовать возможность использования электрохимического восстановления полученных полуискусственных флавогемопротеинов на основе цитохрома Р450.

6. Разработать методы каталитического электролиза для метаболизма типичных субстратов цитохромов Р450.

7. Изучить фотовосстановление полусинтетических флавоцитохромов Р450.

8. Сконструировать лабораторный прототип электрохимического биосенсора на основе полусинтетических флавоцитохромов Р450.

Положения, выносимые на защиту

1. В результате химической модификации цитохромов Р450 2В4, 1А2 и цитохрома Р450зсс получены ковалентные комплексы цитохромов Р450 с рибофлавином (флавоцитохромы 1^Р450).

2. Полусинтетические флавоцитохромы РМР450 являются бифункциональными ферментами, так как проявляют ЫАО(Р)Н-зависимую редуктазную и монооксигеназную активность.

3. Для восстановления полусинтетических флавоцитохромов 1=ИР450 2В4, Р№450 1А2 и РМР450зсс возможно использование альтернативных источников электронов, таких как электрохимическое восстановление и фотовосстановление.

4. Перспективность таких способов восстановления заключается в возможности создания на их основе биосенсоров для определения концентрации субстратов цитохрома Р450 в различных средах, а также биореакторов для получения биологически активных соединений.

Научная новизна работы.

В работе впервые показано, что химически модифицированные цитохромы Р450 2В4 и 1А2 проявляют ЫАО(Р)Н-зависимую редуктазную и монооксигеназную активность без участия белков - редокс-партнеров.

Установлено, что полусинтетические флавоцитохромы РНР450 участвуют в пероксидазных реакциях. Проведено исследование люминол-зависимой хемилюминесценции полусинтетического флавогемопротеина РМР450 2В4 в присутствии пероксида водорода. Показано, что в исследуемой полуискусственной системе наблюдается генерирование активных форм кислорода.

Исследовано электрохимическое восстановление флавоцитохромов RfP450 2В4, 1А2 и see. Обратимость электрохимических процессов подтверждена с помощью метода цикловольтамперометрии.

Электрохимическое восстановление флавоцитохромов RfP450 2В4, RfP450 1А2 и RfP450scc не требует присутствия дополнительных белков редокс-партнеров, медиаторов или промоторов. Установлено, что химическая модификация цитохромов Р450 реакционноспособными производными рибофлавина способствует электронному транспорту к железу гема. Электролиз флавогемопротеинов RfP450 2В4, RfP450 1А2 и RfP450scc при контролируемом напряжении в присутствии субстратов этих изоформ цитохрома Р450 позволяет электрокаталитически получать соответствующие метаболиты. Необходимо отметить, что скорости электрокаталитических реакций сравнимы со скоростями аналогичных NAD(P)H-зависимых реакций, катализируемых микросомальной системой или мономерной реконструированной системой.

Сконструированны ферментные электроды, содержащие иммобилизованные флавоцитохромы RfP450 2В4, RfP450 1А2 и RfP450scc. Электроды с иммобилизованными полусинтетическими флавогемопротеинами являются основным элементом амперометрических биосенсоров для определения содержания в различных средах типичных субстратов перечисленных изоформ цитохрома Р450.

Показано, что нековалентная смесь рибофлавин - цитохром Р450 2В4 (20:1) и полусинтетический флавоцитохром RfP450 2В4 (10+1) в анаэробных условиях могут быть восстановлены фотохимически. Фотохимическое восстановление не сопровождается инактивацией гемопротеина.

Созданы искусственные модели, обладающие цитохром Р450 активностью на основе тройного нековалентного комплекса сывороточный альбумин человека - гемин - рибофлавин. Показано, что искусственный гемоальбумин может быть восстановлен активными металлами, такими как цинк. В присутствии рибофлавина показана возможность фотохимического восстановления гемоальбумина.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные в ходе выполнения работы результаты продемонстрировали возможность создания на основе цитохромов Р450 1А2, 2В4 и Р450зсс однокомпонентных флавогемопротеинов, обладающих как редуктазной, так и монооксигеназной активностью. Монооксигеназная активность полученных полусинтетических флавогемопротеинов сравнима с активностью как микросомальной системы, содержащей гемопротеин цитохром Р450 и МАОРН-зависимую цитохром Р450 редуктазу, так и активностью мономерной реконструированной системы. Восстановленные пиридиновые нуклеотиды ЫАРН и ЫАРРН восстанавливают флавины в составе полусинтетических флавоцитохромов. Следовательно, полуискусственные флавоцитохромы проявляют также свойства флавинредуктаз. Проведенные нами исследования позволяют использовать полуискусственные флавогемопротеины для исследования субстратной специфичности цитохромов Р450.

Создание флавогемопротеинов на основе цитохромов Р450 имеет большое значение для понимания механизмов переноса электронов в микросомальной монооксигеназной двухкомпонентной системе флавопротеин - цитохром Р450 и в митохондриальной трехкомпонентной системе.

Проведенные нами исследования показали, что вместо традиционных восстановителей гемопротеинов, таких как МАОРН или ЫАОН возможно использование альтернативных источников электронов. Электрохимическое восстановление флавоцитохромов Р450 при контролируемом напряжении в присутствии типичных субстратов цитохромов Р450 позволяет сконструировать амперометрический биосенсор для мониторинга за содержанием ксенобиотиков и биологически активных соединений.

Полученные экспериментальные данные открывают новые возможности для создания биосенсоров и биореакторов на основе цитохромов Р450.

Апробация работы.

Основные положения диссертации были представлены на 7-ой международной конференции по биохимии и биофизике цитохрома Р450 (Москва, 1991), на 8-ой международной конференции по цитохрому Р450: биохимия, биофизика и молекулярная биология (Лиссабон, 1993), на 10-ом международном симпозиуме «Микросомы и окисление лекарств» (Торонто, 1994), на 7-й международной конференции по химии порфиринов и их аналогов (С.-Петербург, 1995), на 9-ой международной конференции «Цитохром Р450: биохимия, биофизика и молекулярная биология» (Цюрих, 1995), на 11-ом международном симпозиуме «Микросомы и окисление лекарств» (Лос-Анжелес, 1996), на 10-ой международной конференции «Цитохром Р450: биохимия, биофизика и молекулярная биология (Сан-Франциско, 1997), на 2-ом Биохимическом съезде (Москва, 1997), на 12-ом международном симпозиуме «Микросомы и окисление лекарств» (Монпелье, 1998), на 11-ой международной конференции по цитохрому Р450 (Сендай, 1999), на 13-ой международной конференции «Микросомы и окисление лекарств»

Стреза, 2000), на Международной конференции «От последовательности к функции: экспериментальные и компьютерные исследования надсемейства цитохромов Р450» (Москва, 2000), на 12-ой международной конференции «Цитохром Р450: биохимия, биофизика и молекулярная биология» (Гранд Мотт, 2001).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Шумянцева, Виктория Васильевна

выводы

1. Разработаны методы для получения полусинтетических флавогемопротеинов на основе цитохромов Р450 2В4, Р450 1А2 и Р450зсс.

2. Показано, что полусинтетические флавоцитохромы проявляют ЫАО(Р)Н-зависимую редуктазную активность по отношению к типичным акцепторам электронов.

3. Исследована ЫАО(Р)Н-зависимая монооксигеназная активность флавоцитохромов Р450. Показано, что скорости реакций, катализируемых полусинтетическими флавогемопротеинами, сравнимы с аналогичными реакциями, катализируемыми микросомальной монооксигеназной системой или мономерной реконструированной системой.

4. Полусинтетический флавоцитохром РМР450 2В4 катализирует Н202-зависимые реакции с участием железа гема и генерированием активных форм кислорода, аналогично цитохрому Р450. Активные формы кислорода были зарегистрированы с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции.

5. Исследовано электрохимическое восстановление полуискусственных флавогемопротеинов на основе цитохромов Р450 2В4, Р450 1А2 и Р450эсс. Показано, что флавоцитохромы РГР450 2В4, РГР450 1А2 и РШМбОэсс могут быть восстановлены с использованием родий-графитовых электродов, полученных методом печати, при напряжении -500 -550 гтЛ/.

6. Разработаны методы каталитического аэробного электролиза для метаболизма типичных субстратов цитохромов Р450.

7. Получены ферментные электроды, содержащие флавоцитохромы РШ^бО 2В4, РМР450 1А2 и РШМбОзсс.

8. Исследовано фотовосстановление полусинтетического флавоцитохрома [^Р450 2В4 и нековалентной смеси рибофлавин - цитохром Р450 2В4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цитохром Р450-содержащие монооксигеназные системы играют ключевую роль в метаболических превращениях эндогенных и экзогенных соединений. Цитохром Р450 - фермент, связывающий и метаболизирующий множество неполярных химических соединений, которые применяются в фармакологии (лекарства, антибиотики, химиотерапевтические вещества, витамины, пищевые добавки), в сельском хозяйстве (инсектициды, пестициды), в различных отраслях химической промышленности (полихлорированные и полибромированные бифенилы) и составляющие главную токсикологическую опасность для воздушного и водного бассейна индустриальных городов (бензопирен, бензантрацен и ряд полициклических ароматических углеводородов).

Цитохромы Р450 являются первым барьером, определяющим характер и степень воздействия химических веществ на клетку. Список этих веществ обширен, так как живые организмы находятся в постоянном контакте с химическими факторами окружающей среды; результатом этой жизнедеятельности и взаимодействия является накопление веществ, которые не являются участниками нормально протекающих процессов.

В связи с важностью этого суперсемейства множественных форм цитохрома Р450 необходимо понимание тонких механизмов функционирования, воздействия, и взаимного влияния компонентов и партнеров этого окислительно-восстановительного многокомпонентного ферментного комплекса окислительно-восстановительных ферментов. Одной из ключевых стадий является перенос электронов и соответствующие окислительно-восстановительные реакции, протекающие в мультиферментном комплексе.

Вследствие такой «многомерности» цитохром Р450 -содержащих систем активно исследуются как механизмы действия этих систем, так и модельные искусственные химические (или биологические) структуры, проявляющие активность Р450 - систем, но лишенные основного недостатка этого суперсемейства - многокомпонентности.

При создании полусинтетических флавогемопротеинов на основе цитохрома Р450 необходимо было доказать действенность и универсальность пути переноса электронов от флавиновых нуклеотидов к железу гема. Полученные нами флавоцитохромы РКР450 2В4, ЯШ^бО 1А2 и РКР450всс проявляли редуктазную активность, которая не свойственна гемопротеину цитохрому Р450.

Флавины, включенные в полипептидную цепь гемопротеина, сохраняли способность восстанавливать искусственные акцепторы электронов, такие, как цитохром с и феррицианид калия, а также внутримолекулярно восстанавливать железо гема. Скорость редуктазных реакций достаточно велика и сопоставима со скоростями редуктазных реакций в мультиферментных ансамблях.

Эти свойства полуискусственных флавогемопротеинов, содержащих ковалентно связанные изоаллоаксазиновые группы, доказывает универсальность цепи переноса электронов в направлении от донора электронов (в данном случае МАР(Р)Н), к флавинам, а затем к железу гема.

Такую универсальность подтверждают также работы по конструированию функционально-активных неприродных, нефизиологических пар флавин - гем, таких как флаводоксин -цитохром сббЗ, флаводоксин - цитохром с из сердца лошади (СПагсП, 1999; ОНагсП, 2000) гемовй домен цитохрома Р450 ВМЗ и флаводоксин, гемовый домен цитохром Р450 ВМЗ и ЫАОРН зависимая цитохром Р450 редуктаза, или цитохром Р450 2В4 и флавиновый домен цитохрома Р450 ВМЗ (0ауус1оу е! а1., 2000).

Важным свойством полусинтетических флавогемопротеинов является их способность связывать субстраты. Следовательно, химическая модификация цитохрома Р450 активированными производными рибофлавина не затрагивает места связывания субстратов.

Была исследована способность химически сконструированных флавогемопротеинов Р№450 2В4, 1^Р450 1А2 и [^Р4505сс гидроксилировать субстраты. Наиболее подробно была исследована ЫАОН-зависимая монооксигеназная активность Г^Р450 2В4.

Показано, что каталитическая активность в реакциях Ы-деметилирования аминопирина и диметиланилина и п-гидроксилирования анилина зависит от количества ковалентно связанных молекул рибофлавина. Наибольшая активность отмечена для флавогемопротеинов, содержащих 10-12 остатков флавина. Корреляция между монооксигеназной активностью и количеством изоаллоксазиновых остатков свидетельствует о проникновении рибофлавинов с поверхности белка в полости, расположенные на более близком расстоянии к акцептору электронов - гему.

Доказательство реализации эффективного переноса электронов в полученных полусинтетических флавоцитохромах позволило перейти к исследованию неэнзиматических способов восстановления. Использование альтернативных источников электронов позволяет повысить технологичность биоинженерных подходов. Учитывая значимость цитохром Р450 - содержащих ферментативных систем в нормальном функционировании клетки и при патологических изменениях, весьма актуальны проблемы конструирования биосенсоров на основе цитохромов Р450.

Разработанные методы синтеза функционально-активных ферментных электронов с использованием в качестве рабочих печатных родий-графитовых электродов и условия их использования перспективны для получения цитохром Р450 -биосенсоров.

Таким образом, разработан метод получения полусинтетических флавоцитохромов, обладающих монооксигеназной и редуктазной активностью.

Самодостаточность таких флавогемопротеинов продемонстрирована в реакциях с использованием альтернативных источников электронов, таких как электрохимическое восстановление и фотовосстановление.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Шумянцева, Виктория Васильевна, 2002 год

1. Бачманова Г.И., Карузина И. И., Менгазетдинов Д.И., Погодина O.K., Хайтина С. 3. Панченко Л. И., Твертилов В. Н., Коэн Я.М., Арчаков А. И. Термическая и протеолитическая инактивация цитохрома Р450. Биохимия. 1981. т.46, с.280-285.

2. Бачманова Г.И., Чернобровкина Т.В., Панченко Л.И., Карузина И.И., Коэн Я.М., Арчаков А.И. Роль гидрофобных взаимодействий в электронном транспорте в микросомах печени. Биохимия. 1974, т. 39, с.828-833.

3. Голубчиков O.A. (ред.) Успехи химии порфиринов. С.Петербург., НИИ химии. 1997, т.1, с.357-360.

4. Готтих М.Б., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. Получение фосфоамидов моно- и олигонуклеотидов в водной среде. Биоорганическая химия. 1983, т.9, с.1063-1067.

5. Гурьев О. Л., Гилевич С. Н., Чащин В. Л. Реконструкция холестерингидроксилирующей системы из митохондрий коры надпочечников на основе цитохрома P450scc, адренодоксина и редокс-медиатора нейтрального красного. Биохимия. 1990, т.55, с.1553-1560.

6. Долгих Д.А., Габриэлян А.Э., Наволоцкая Е.В., Чемерис В.В., Кирпичников М.П., Искусственный белок с заданной пространственной структурой и биологической активностью. Биофизика. 1993, т.38, с.67-74.

7. Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Птицын О.Б., Чемерис В.В.

8. Белковая инженерия искусственных белков. Мол. биол. 1996, т.ЗО, с.261-272.

9. Евтюгин Г.А., Будников Г.К., Николаев Е.Б., Биосенсоры для определения ингибитора ферментов в окружающей среде. Успехи химии. 1999, т.68(12), с. 1142-1167.

10. Ю.Зубов В.П., Иванов А.Е., Жигис Л.С., Раппопорт Е.М., Марквичева Е.А., Лукин Ю.В., Зайцев С.Ю. Молекулярное конструирование полимерных материалов для биотехнологии и медицины. Биоорганическая химия. 1999, т.25, вып.11, с.868-880.

11. Еремин А.Н., Литвинчук A.B., Метелица Д.И. Операционная стабильность каталазы и ее коньюгатов с альдегиддекстранами и супероксиддисмутазой. Биохимия. 1996, т.61, с.664-679.

12. Еремин А.Н., Метелица Д.И. Метгемоальбумин как биокатализатор окисления ароматических аминов. Биохимия. 1998, т.63, с.1400.

13. Канаева И.П., Скоцеляс Е.Д., Кузнецова Г.П., Антонова Г.И., Бачманова Г.И., Арчаков А.И. Реконструкция мембранноймонооксигеназной содержащей цитохром Р450 системы печени с помощью детергента в растворе. Биохимия. 1985, т.50, с. 1382-1387.

14. Карузина И.И., Бачманова Г. И. Менгазетдинов Д.Э., Выделение и свойства цитохрома Р450 из микросом печени кроликов. Биохимия. 1979, т.44, с.1044-1057.

15. Клячко Н.Л., Богданова Н.Г., Левашов A.B., Кабанов A.B., Пшежецкий A.B., Хмельницкий Ю.Л., Мартинек К., Березин И.В. Ферментативный катализ в коллоидных растворах глицерина в органических растворителях. ДАН СССР 1987, т.297, с.483-487.

16. Клячко Н.Л., Левашов A.B., Мартинек К. Пероксидаза в системе аэрозоль ОТ-вода-октан. Мол. биол. 1984, т. 18, с. 1019-1032.

17. Левашов А. В., Клячко Н. Л., Пшежецкий А. В., Мартинек К. Суперактивность кислой фосфатазы в обращенных мицеллах поверхностно-активных веществ в органических растворителях. ДАН СССР. 1986, т.289, с.1271-1273.

18. Лепешева Г. И., Усанов С. А. Динамика и функциональная активность цитохрома P450scc селективно меченого флуоресцеинизотиоцианатом. Биохимия. 1997, т.62, с.758-768.

19. Мартинек К., Левашов A.B., Клячко Н.Л., Березин И.В. Катализ водорастворимыми ферментами в органических растворителях. Стабилизация ферментов обращенными мицеллами. ДАН СССР. 1977, т.236, с.920-923.

20. Метелица Д.И. Моделирование окислительновосстановительных ферментов. Наука и техника. Минск 1984, с. 148-247.

21. Метелица Д.И. Моделирование окислительно-восстановительных реакций. Усп. совр. биол. 1988, т.28, с.145-155.

22. Метелица Д.И., Шибаев В.А., Еремин А.Н., Мельник В.И., Жилина З.И. Тетрафениллорфирин железа (III) в обращенных мицеллах поверхностно-активных веществ модели пероксидазы. Биохимия. 1995, т.60, с.349-363.

23. Мишин В.М., Ляхович В.В., Множественные формы цитохрома Р450. Наука, Новосибирск, 1985.

24. Мюр П., Шеллер Ф., Кюн М. Применение цитохрома Р-450 и железопорфирина в качестве катализаторов в реакциях гидроксилирования совместно с электрохимическими системами. Прикладная биохимия и микробиология. 1982, т.18, с.481-488.

25. Никандров В.В. Неорганические полупроводники-фотосенсибилизаторы биохимических окислительно-восстановительных реакций. Биологические мембраны. 1998, т. 15, с.598.

26. Пикулева И.А., Лапко А.Г., Ахрем A.A., Усанов С.А., Чащин В.Д. Локализация модифицированного тетранитрометаном тирозина в полипеетидной цепи холестерингидроксили-рующего цитохрома Р450. Биоорганическая химия. 1987, т. 13, с.739-747.

27. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.В., Клебанов Ю.А., Владимиров Ю.А. Ингибирование сывороточными антиоксидантами окисления люминола в присутствии гемоглобина и перекиси водорода. Вопросы медицинской химии. 1997, т.43, с.87-93.

28. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М., Наука. 1977, с.25-46.

29. Уваров В.Ю., Давыдов P.M., Тимофеев В.П. ЭПР-спектроскопия спин-меченого цитохрома Р-450 ЛМ2 в изолированном и мембрано-связанном состояниях. Биофизика. 1988, т.33, с.719-720.

30. Усанов С. А., Пикулева H.A., Чащин В.Л., Ахрем A.A. Селективная химическая модификация холестерингидроксилируюшего цитохрома Р450 измитохондрий коры надпочечников тетранитрометаном. Биоорганическая химия. 1984, т. 10, с.32-45.

31. Ферапонтова Е.Э., Григоренко В.Г., Егоров A.M. Рекомбинантные формы пероксидазы хрена, иммобилизованные на золотых электродах: создание П-чипа и биферментных электродов на его основе. Биохимия. 2001, т.66, с.1026-1035.

32. Шлык М.А., Никандров В.В., Зорин Н.А., Красновский А.А. Образование водорода при прямой фотоиндуцированном переносе электронов от неорганического полупроводника к бактериальной гидрогеназе. Биохимия. 1989, т.54, с.1598-1606.

33. Abe М., Kyogoku Y. Vibration analysis of flavin derivatives: normal coordinate treatments of lumiflavin. Spectrochimica Acta. 1987, v.43, N8, p. 1027-1037.

34. Allen H., Hill O., Hunt I. Direct and Indirect electrochemical investigations of metalloenzymes. Methods of Enzymol. 1993, v.227, p.501-522.

35. Allen P.M., Hill O., Allen H., Walton N.J. Surface modifiers for the promotion of direct electrochemistry of cytochrome c. J. Electroanal. Chem. 1984, v.178, p.69-86.

36. Archakov A.I., Bachmanova G.I., Devichensky, Karusina I.A., Zherebkova N.S., Alimov G.A., Kuznetsova G.P., Karyakin A.V. The reconstitution of microsomal redox chains. Biochem. J. 1974, v.144, p.1-9.

37. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P450 and Active Oxygen, Taylor and Francis Eds., London. 1990, p.105.

38. Archakov A.I., Degtyarenko K.N. Structural classification of the P450 superfamily based on consensus sequence comparison. Biochem. and Mol. Biol. Int. 1993, v.31(6), p.1071-1080.

39. Armstrong F.A., Allen H., Hill 0., Walton N.J. Reactions of electon-transfer proteins at electrodes. Q. Rev. Biophys. 1985,v.18, p.261-322.

40. Armstrong F.A. Probing metalloprotein by voltammetry: in Structure and Bonding. 1990, v.72, p. 137-221.

41. Armstrong F.A. Dynamic electrochemistry of iron-sulfur proteins. Adv. Inorg. Chem. 1992, v.38, p.117-163.

42. Armstrong F.A., Hill H., Allen O., Walton N.J. Direct electrochemistry of redox proteins. Acc. Chem. Res. 1988, v.21, p.407-413.

43. Bachmann T.T., Schmid R.D. A disposable multielectrode biosensor for rapid simultaneous detection of the insecticides paraoxon and carbofuran at high resolution. Anal. Chim. 1999, v.401, p.95-103.

44. Badia A., Carlini R., Fernandez A., Battaglini F., Mikkelsen S.R. and English A.M. Intramolecular electron-transfer rates in ferrocene-derivatized glucose oxidase. J. Am. Chem. Soc. 1993, v.115, N.16, p.7053-7060.

45. Baek K.J., Thiel B. A., Lucas S., Stuehr D.J. Macrophage nitric oxide synthase subunits. J. Biol. Chem. 1993, v.268, N.28, p.21120-21129.

46. Balwin J.E., Morris G.M. and Richards W.G. The role of Trp 97 in the electron transfer of cytochrome P450 BM3. Proc. R. Soc. London B. 1994, v. 245, N.1322, p.43-51.

47. Barbas C.F., Rosenblum J., Lemer R.A. Direct selection of antibodies that ccordinate metals from semisynthetic combinatorial libraries. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993, v.90, N.14, p.6385-6389.

48. Barker P.D., Gleria K.Di, Hill H.A., Lowe V.J. Electron transfer reactions of metalloproteins at peptide-modified gold electrodes. Eur. J. Biochem. 1990, v.190, p.171-175.

49. Bartlett P.N., Whitaker R. 1987. Electrochemical immobilization of enzymes. Part I: Theory J. Electroanal. Chem. 1987, v.224, p.27-35.

50. Bendioui F., Devynck J., Bied-Charreton C. Monooxygenase line dioxygen activation. Acc. Chem. Res. 1995, v.28, p.30-45.

51. Benson D.E., Wisz M. S., Hellinga H.W. The development of new biotechnologies using metalloprotein design. Current Opinion in Biotechnology. 1998, v.9, p.370-376.

52. Berezin I.V., Varfolomeev S.D. Bioelectrocatalysis as a new phenomenon. In: Frontiers in bioorganic chemistry and molecular biology, IUPAC, Pergamon,Oxford. 1980, p.467.

53. Berg J. M., Metalloprotein design. Curr. Opin. Struct. Biol. 1993, v. 3, p.585-588.

54. Bernhardt R., Dao N.T.N., Schwartze W., Friedrich J., Janig G.-R. and Ruckpaul K. Modification of cytochrome P-450 with fluorescein isothiocyanate. Biochim. Biophys. Acta. 1983, v.745, p.140-148.

55. Bernhardt R., Kraft R. and Ruckpaul K., Molecular mechanism of P-450/reductase interaction. In Cytochrome P-450: Biochemistry and Biophysics of Cytochrome P-450, edited by I. Schuster (London: Taylor & Francis), 1989, p.320-323.

56. Bernhardt R.,Makower A., Janig G.-R. and Ruckpaul K. Selective chemical modification of functionally linked lysine in cytochrome P-450 LM2. Biochim. Biophys. Acta. 1984, v.785, p. 186-190.

57. Bes M.T., De Lacey A.L., Peleato M.L., Fernandez V.M., Gomez-Moreno C. The covalent linkage of a viologen to a flavoprotein reductase transforms it into an oxidase. Eur. J. Biochem, 1995, v.233, p.593-599.

58. Black S.D. and Coon M.J., Studies on the identity of the heme-binding cysteinyl residue in rabbit liver microsomal cytochrome P-450 isozyme 2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985, v.128, p.82-89.

59. Bond A.M., Hill H.A.O., Page D.J., Psalti I.S.M. and Walton N.J. Evidence for fast and discriminatory electron transfer of proteins at modified gold electrodes. Eur. J. Biochem. 1990, v. 191, p.737-742.

60. Bowden E.F., Hawkridge F.M. Intrfacial electrochemistry of cytochrome c at tin oxide, indium oxide, gold, and platinum electrodes. J. Electroanal.Chem. 1984, v. 161, p.355-376.

61. Breslow R., Huang Y., Zhang X., Yang J. An artificial cytochrome P450 that hydroxylates unactivated carbons with regio- and stereoselectivity and useful catalytic turnovers. Proc. Nat. Acad. Sci. 1997, v.94, p.11156-11158.

62. Bruice Th.C. Mechanism of Flavin Catalysis. Acc. Chem. Res. 1980, v.13, p.256-262.

63. Brzezinski P. And Wilson M.T. Photochemical electron injection into redox-active proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, v.94, p.6176-6179.

64. Cardona C., McCarley T.D., Kaifer A.E. Synthesis, Electrochemistry, and Interactions With-Cyclodextrin of Dendrimers Containing a Single Ferrocene Subunite Located «Off-Center». J. of Org. Chemistry. 2000, v.65(6), p.1857-1864.

65. Centeno F. and Gutierrez-Merino C. Location of functional center in the microsomal cytochrome P450 system. Biochemistry 1992, v.31, p.8473-8481.

66. Chen Y., Rosazza Y.P.N. Structure-function studies of N0-synthase. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1994, v.203, N.2, p.1251-1258.

67. Chen P.-F., Tsai Ah.-Lim, Wu K.K. Cysteine 99 of endothelial nitric oxide synthase (NOS-III) is critical for tetrahydrobiopterin-dependent NOS-III stability and activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, v.215, N.3, p.1119-1129.

68. Chen J., Wollenberger U., Lisdat, Ge B., Scheller F. Superoxide sensor based on hemin modified electrode Sensors and Activators B: Chemical 2000, v.70(1-3), p.115-120.

69. Choi J.W., Kim M.J., Chung S.W., Oh S.Y., Shin D.M., Lee W.H. Molecular photodiode consisting of flavin-viologen-TCNQ LB multilayers. Mol. Cryst. Liq. Cryst. 1997, v.294, p.217-220.

70. Choi H.-G., Min J., Choi J.W., Lee W.H. Molecular photoreceptor consisting of bacteriofhodopsin/flavin Langmuir-Biodgett films Biosens. Bioel. 1998, v.13, p.1069-1075.

71. Chroma Ch.T., Lear J.D., Nelson M.J., Dutton L.P., Robertson

72. D.E., DeGrado W.F. Design of a heme-binding four helix bundle. J. Amer. Chem. Soc. 1994, v.116, N.3, p.856-865.

73. Clark L.C., Jr., Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann. NJ. Acad. Sci. 1962, v.102, p.29-45.

74. Cochran A.G., Schultz P.G. Antibody catalyzed porphyrin metallation. Science. 1990, v.249, p.781-783.

75. Collman J.P. Functional Analogs of Heme Protein Active Sites. Inorg. Chem. 1997, v.36, p.5145-5155.

76. Compton B J., Purdy W. Fluoral-P, a member of selective famiky of reagents for aldehydwes. Anal. Chim.Acta. 1980, v. 119, p.349-357.

77. Conrad D.W., Zhang H., Stewart D.E., Scott R.A. Distance Dependence of Long-Range Electron Transfer in Cytochrome C Derivatives Containing Covalently Attarched Cobalt Cage Complex. J. Am. Chem. Soc. 1992, v.114, p.9909-9915.

78. Contzen J., Jung C. Changes in secondary structure and salt links of cytochrome P450cam induced dy photoreduction: a Fourier transform infrared spectroscopic study. Biochemistry. 1999, v.38, p. 16253-16260.

79. Coon M.J., Ding X.X., Pernecky S.J., Vaz A.D. Cytochrome P450: progress and predictions. FASEB J. 1992, v.6(2), p.669-673.

80. Cosnier S. Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment or attachment to electrochemically polymerized films. A review. Biosensors and Bioelectronic. 1999, v. 14, p.443-456.

81. Cosnier S, Gondran C., Wessel R., Montforts F.P., Wedel M., Poly (pyrrole-metallodeutero porphyrin) electrodes: towards electrochemical biomimetic devices. J. of Electroanalytical Chemistry. 2000, v.488, p.83-91.

82. Creager S. E., Raybuck S.A., Murray R.W. Electrochemical reactivity of manganese (II) porphyrins. Effects of dioxygen, benzoic anhydride, and ax:al ligands. J. Am. Chem. Soc. 1986, v.108, p.4225-4227.

83. Cruanes M.T., Rodgers K.K., Sligar S.G. Protein electrochemistry at high pressure. J. Am. Chem. Soc. 1992, v.114, p.9660-9661.

84. Cruz Vieira I., Fatibello-Filho O, Amperometric biosensor for the determination of phenols using a crude extract of sweet potato. Analytical Letters. 1997, v.30, p.895-907.

85. Cuendet P., Rao K.K., Gratrel M„ Hall D.O. Lightinduced H2 evolution in a hydrogenase-Ti02 particle system by direct electron transfer or via rhodium complexes. Biochemie. 1986, v.68, p.217-221.

86. Daff S.N., Chapman S.K., Turner K.L., Holt R.A., Govindaraj S., Poulos T.L., Munro A.W. Redox control of the catalytic cycle offlavocytochrome P450 BM3. Biochemistry. 1997, v.36, p.13816-13823.

87. Daff S., Ingledew J., Reid A.G., Chapmann K. S. New insight into catalytic cycle of flavocytochrome b2 . Biochemistry. 1996, v.35, p.6345-6350.

88. Dahiyat B.I., Mayo S.L. De novo protein design: fully automated sequence selection. Science. 1997, v. 278,p. 82-87.

89. Davydov D.R., Khyushko T.V, Kanaeva I.P., Koen Ya. M., Samenkova N.F., Archakov A.I., Hui Bon Hoa G.Interaction of cytochrome P450 2B4 with NADPH-cytochrome P450 reductase studied by fluorescent probe. Biochimie 1996, v. 78, p. 734-743.

90. De Benedetto, An Enzyme Switch Employing Direct Electrochemical Communication between Horseradish Peroxidase and a Poly (aniline) Film. Analytical Chemistry. 1998, v.70 (17),p.3685-3694.

91. Degtyarenko K.N. Structural domains of P450-containing monooxygenase systems. Protein Engineering. 1995, v.8, N.8, p.737-747.

92. Degtyarenko K.N., Archakov A.I. Molecular evolution of P450 superfamily and P450-confaining monooxygenase systems. FEBS Letters. 1993, v.332, N.1, 2, p.1-8.

93. Desai U.R., Osterhout J.J., Klibanov A.M. Protein structure in the lyophilized state: a hydrogen isotope exchange/NMR study with bovine pancreatic trypsin inhibitor. J. Am. Chem. Soc. 1994, v.116, p.9420-9422.

94. De Vass J.J., Sibbesen 0., Zhang Z. and Ortiz de Montellano P.R., Substrate docking algorithms and prediction of the substrate specificity of cytochrome P450cam and its L244A mutant. J. Am. Chem. Soc. 1997, v.119, p.5489-5498.

95. Dick D., Rao V., Sukumaran D., Lawrence D. Molecular encapsulation: cyclodextrin-based analogues of heme-containing proteins. J. Amer. Chem. Soc. 1992, v.114, N.7, p.2664-2669.

96. Di Gleria K., Halliwell C.M., Jacob C., Hill H.A.O. Site-specific introduction of an electroactive label into a non-electroactive enzyme (p-lactamase I). FEBS Letter. 1997, v.400, p. 155-157.

97. Di Gleria K„ Hill H.A.O, Wong L.L. N-(2-ferrocene-ethyl)maleimide: a new electroactive sulphydryl-specific reagent for cysteine-containing peptides and proteins. FEBS Letters. 1996,v.390, p.142-144.

98. Digman I.G., Strobel W. NADPH-cytochrome reductase from rat liver:purification by affinity chromatography, and characterization. Biochemistry. 1977, v.16, p.1116-1123.

99. Downard A.J. Electrochemically assisted covalent modification of carbon electrodes. Electroanalysis. 2000, v.12, N.14, p.1085-1096.

100. Durliat H. and Comtat M. Electrochemical reduction of methemoglobin either directly or with flavin mononucleotide as a mediator. J. Biological Chemistry. 1987, v.262, N.24, p.11497-11500.

101. Ellist W.D., Dunford H.B. The Kinetics of Cyanide and Fluoride Binding by Ferric Horseradish Peroxidase. Biochemistry 1968, v. 7, p. 2054-2062.

102. Estabrook R.W., Faulker K.M., Shet M.S., Fisher C.W. Application of electrochemistry for P450-catalyzed reactions. Methods in Enzymology. 1996, v.272 (B), p.44-51.

103. Estabrook R.W., Shet M.S., Faulker K.M., Fisher C.W. The use of electrochemistry for the synthesis of 17a hydroprogesterone by a fusion protein containing P450c17. Endocr. Ine Res. 1996, v.22, p.665-671.

104. Estabrook R.W., Shet M.S., Fisher C.W., Jenkins C.M., Waterman M.R. The interaction of NADPH-P450 reductase with P450: an electrochemical study of the role of the flavin mononucleotide binding domain. Arch. Biochem. Biophys. 1996, v.333, p.308-315.

105. Faulkner K.M., Shet M.S., Fisher C.W., Estabrook R.W. Electrocatalytically driven co-hydroxylation of fatty acids using cytochrome P450 4A1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, v.92, p.7705-7709.

106. Foster R., Cassidy J., O'Donoghue E. Electrochemical diagnostic strip device for total cholesterol and its subfractions.

107. Electroanalysis. 2000, v. 12, p.716-721.

108. Furuya H., Shimidzu T., Hirano K., Hatanu M., Fujii-Kuriayma Y., Site-directed mutageneses of rat liver cytochrome P450. Biochemistry. 1989, v.28, N.17, p.6848-6857.

109. Garguilo M.G., Huynh N., Proctor A. and Michael A.C. Amperometric sensors for peroxide, choline, and acetylcholine based on electron transfer between horseradish peroxidase and a redox polymer. Anal. Chem. 1993, v.65, p.523-528.

110. Ghosh D.K., Abu-Soud H.M., and Stuehr D.J. Domains of macrophage NO synthase have divergent roles in forming and stabilizing the active dimeric enzyme. Biochemistry. 1996, v.35, p. 1444-1449.

111. Ghosh D.K., Stuehr D.J. Macrophage NO synthase: characterization of isolated oxygenase and reductase domains reveals a head-to-head subunit interaction. Biochemistry. 1995, v.34, N.3, p.801-807.

112. Gilardi G., Fantuzzi A., Sadeghi S. Engineering and design in the bioelectrochemistry of metalloproteins. Current Opinion in Struct. Biol. 2001, v.11, p.491-499.

113. Golly I. and Hlavica P. Chemical Modification of lysine residues in cytochrome P-450LM2 (P450IIB4): influence on heme liganding of arylamines. Archives of biochemistry and biophysics. 1992, v.292, p.287-294.

114. Govindaraj S., Li H., Poulos T.L., Flavin supported fatty acid oxidation by the heme domain of bacillus megaterium cytochrome P450 BM-3. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1994, v.203, N.3, p. 1745-1749.

115. Govindaraj S., Poulos T.L. Role of the linker region connecting the reductase and heme domains in cytochrome P450bm-3-Biochemistry. 1995, v.34, N.35, p.11221-11226.

116. Govindaraj S., Poulos T.L. The domain architecture of cytochrome P560BM-3. J. Biol. Chem. 1997, v.212, p.7915-7921.

117. Groves J.T., Kruper W.J., Preparation and characterozation of on oxoporphinato chromium (V) compleex. J. Am. Chem. Soc. 1979, v.101, p.7613-7615.

118. Groves J.T., Nemo T.E. Aliphatic hydroxylation catalyzed by iron pophyrin complexes. J. Am. Chem. Soc. 1983, v.105, p.6243-6248.

119. Groves J.T., Watanabe Y. Reactive iron porphyrin derivatives related to the catalytic cycles of cytochrome P-450 and peroxidase. Studies of the mechanism of oxygen activation. J. Am. Chem. Soc. 1988, v.110, p.8443-8452.

120. Gu Y., Li P., Sage T., Champion P. Photoreduction of hemeproteins: spectroscopic studies and cross-section measurement. J. Am. Chem. Soc. 1993, v. 115, p.4993-5004.

121. Guengerich F.P. Oxidation-reduction properties of rat liver cytochrome P-450 and NADPH-cytochrome P-450 reductase related to catalysis in reconstituted systems. Biochemistry. 1983, v.22, p.2811-2820.

122. Guengerich F.P. in Frontiers in Biotransformation (Ruckpaul K. and Rein U, eds) 1989, v.1, p.101-150.

123. Guengerich F.P., Jonson W. W. Kinetics of Ferric Cytochrome P450 Reduction by NADPH-Cytochrome P450 Reductase: Rapid Reduction in the Absence of Substrate and Variations among Cytochrome P450 Systems. Biochemistry. 1997, v.36, p. 14741-14750.

124. Gunsalus I. C., Bernhardt R., Koga H. and Ullah A.H.J. Model P-450 monooxygenases from prokaryotes. In 4th International Symposium on Comparative Biochemistry of Cytochrome P-450, (Antwerpen: Janssen Research Foundation), 1985, p.25-26.

125. Gunsalus I. C., Wagner G.C., Bacterial P450cam methylenmonooxygenase components:cytochrome m, putidaredoxin and putidaredoxin reductase. Mwethods Enzymol. 1978, v.52, p.166-188.

126. Guo Y., Dong S. Organic Phase Enzyme Electrodes Based on Organohydrogel, Analytical Chemistry. 1997, v.69(10), p. 19041908.

127. Hadgson A.V., Strobel H.W. Quantitation of FAD-dependent cytochrome P450 reductase activity by photoreduction. Anal. Biochem. 1996, v.243, p. 154-157.

128. Hagen W.R. Direct electron transfer of redox proteins at the bare glassy carbon electrode. Eur. J. Biochem. 1989, v. 182, p.523-530.

129. Hamachi I., Fujita A., Kunitake T. Molecular Assembly: Functional conversion of cytochrome c via Non covalent interactions. J. Am. Chem. Soc 1997, v. 119, p.9096-9102.

130. Haniu M., McMamms M.E., Birkett D.J., Lei T.D. and Shively J.E. Structural and functional analysis of NADPH-cytochrome P-450 reductase from human liver. Complete sequence of human enzyme ahd NADPH-binding sites, Biochemistry. 1989b, v.28, p.8639-8645.

131. Haniu M., Yuan H., Lee T.D., and Shively J.E. Functional tyrosine residues in rat liver cytochrome P-450. In Cytochrome P-450: Biochemistry and Biophysics, edited by I. Schuster (London: Taylor & Francis), 1989a, p.359-362.

132. Hara M. Immobilization of P450 monooxygenases and chloroplast for use in light-driven bioreactors. J. of Bioscience and Bioengineering. 1999, v.87, N.6, p.793-797.

133. Hara M. Application of P450s for biosensing: combination of biotechnology and electrochemistry. Material Science and Engineering. 2000, c.12, p.103-109.

134. Hashimoto S.H., Imai Y. Purification of a substrate complex of cytochrome P-450 from liver microsomes of 3-methylcholanthrenetreated rabbits. Biochem.Biophys. Res. Commun. 1976, v. 68, p. 821-827.

135. Heller A. Electrical wiring of redox enzymes. Acc. Chem Res. 1990, v.23, p.128-134.

136. Hellinga H. W. Metalloprotein design. Curr. Opin. Biotechnol. 1996, v.7, p.437-441.

137. Hellinga H. W. The construction of metal centers in proteins by rational design. Fold. Des. 1998, v.3, R1-R8.

138. Henricson G., Johansson, Petersson G. A critical review of cellobiose dehydrogenases J. Biotechnology. 2000, v.78, p.93-113.

139. Herron N., Tolman C.A. A Highly Selective Leolite Catalyst for Hydrocarbon Oxidation. A Completely Inorganic mimic of the alkame co-Hydroxylases. J. Am. Chem. Soc. 1987, v. 109, p.2837-2839.

140. Hevel J.M., White A.K., Marietta M.A. Purification of the inducible murine macrophage nitric oxide synthase. Identification as a flavoprotein. J. Biol. Chem. 1991, v.266, N.34, p.22789-22791.

141. Hill H. A., Hunt N.I. Direct and indirect electrochemical investigations of metalloenzymes. Methods in Enzymology. 1993, v.227, p.501-522.

142. Hone S., lizuka T., Imai Y. and Yamano T. Molecular properties. In Cytochrome P-450, edited by R. Sato and T. Omura (Tokyo, New York: Kodansha L. T. D., Academic Press), 1978, p.37-135.

143. Hsich L.C., Stephans J.C., Schultz P.G. An Efficient Antibody-Catalyzed Oxygenation Reaction. J. Am. Chem. Soc. 1994, v. 116, N.5, p.2167-2168.

144. Hu Y., Hua N., Zeng Y. Facilitated electron transfer for myoglobin in surfactant polymer 2C1N+PVC - composize films on pyrolytic graphite electrode. Microchemical Journal. 2000, v.65(2), p.147-157.

145. Hui Bon Hoa G., Di Primo C., Deprez E. Cytochrome CP450 Biochemistry and Biophysies Procudinjs of th 7th International Conference on Biochemistry and Biophysics of P450: Structure and Function, Biotechnological and Ecological Aspects. 1992, p.21-26.

146. Hui Bon Hoa G., Di Primo C., Dondaine I., Sligar S.G., Gunsalus I., Douzon P. Conformational changes of cytochromes P450cam and P-450lin induced by high pressure. Biochemistry. 1989, v.28, p.651-656.

147. Ichikama Y. and Yamano T. Reconversion of detergent and sulfhydryl reagent-produced P-420 to P-450 by polyols and glutathione. Biochim. Biophys. Acta. 1967, v. 131, p.490-497.

148. Ichikama Y. and Yamano T. Cytochrome P-450. IV. Stability of cytochrome P-450 and conversion to cytochrome P-420. Isolation and properties of cytochrome P-420. Pharmacol. Therap.1978, v.2, p.673-692.

149. Inouye K. and Coon M.J. Properties of the tryptophan residue in rabbit liver microsomal cytochrome P-450 isozyme 2 as determined by fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985a, v. 128, p.676-682.

150. Ivanov A.N., Lukachova L.V., Evtugyn G.A., Karyakina E.E., Kiseleva S.G., Budnikov H.C., Karpacheva A.A., Karyakin A.A. Polyanilin-modified cholinesterase sensor for pesticide determination. Bioelectrochemistry. 2002, v. 55, p. 75-77.

151. Janig G.-R., Makower A., Bernhardt R. and Ruckpaul K. Chemical modification of cytochrome P-450 LM2. Characterization of tyrosine as axial heme iron ligand trans to thiolate. Biochim.

152. Biophys. Acta. 1984a, v.787, p.8-19.

153. Janig G.-R., Makower A.,Kraft R., Rabe H. and Ruckpaul K. Identification of tyrosune as axial heme iron Irgand in cytochrome P-450LM2. Xenobiotica. 1984b, v. 14, p.49-57.

154. Janig G.-R. and Pfeil D. Structure-function relationships of the essential components of the liver microsomal monooxygenase system. In Cytochrome P-450, edited by K. Ruckpaul and H. Rein, (Berlin: Akademie-Verlag). 1984, p.58-110.

155. Janig G.-R., Usanov S.A. and Ruckpaul K. Identification of the ligand trans to thiolate in cytochrome P-450 LM2 by chemical modification. FEBS Lett. 1983, v. 159, p.58-62.

156. Jin W., Bier F. Construction and characterization of a multi-layer enzyme electrode: covalent binding of quinoprotein glucose dehydrogenase onto gold electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 1995, v. 10, p.823-829.

157. John R., Spencer M., Wallace G.G., Smyth M.R. Development of a polypyrrole-based human serum albumin sensor. Anal. Chim. Acta. 1991, v.24, p.381-385.

158. Kabanov A.V., Levashov A.V., Klyachko N.L., Martinek K.

159. Enzymes entrapped in the reversed micelles of surfactant in organic solvents : a theoretical treatment of the catalytic activity regulation. J. Theor. Biol. 1988, v.133, p.327.

160. Kahn G.F., Ohwa M. and Wernet W. Design of a stable charge transfer complex electrode for a third-generation amperometric glucose sensor. Analytical Chemistry. 1996, v.68, p.2939-2945.

161. Karuzina 1.1., Archakov A.I. The oxidative inactivation of cytochrome P450 in monooxygenase reactions. Biology and Medicine. 1994, v.16, p. 73-97.

162. Karuzina 1.1., Archakov A.I. Hydrogen peroxide-mediated inactivation of cytochrome P450 in monooxygenase reactions. Free Radical Biology and Medicine. 1994, v. 17, p.537-567.

163. Karyakin A.A., Bobrova O.A., Lukachova L.V., Karykina E.E.

164. Potentiometric biosensors based on polyanilin semiconductor films. Sensors and Activators B: Chemical. 1996, v. 33, p.34-38.

165. Kato R., Iwasaki K., Noguchi H. Stimulatory effect of FMN and methyl viologen on cytochrome P450 dependent reduction of tertiary amine N-oxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978, v.72, N.1, p.267-274.

166. Kazlauskaite J., Westlake A.C.G., Wong L.L. and Hill H.A.O. Direct electrochemistry of cytochrome P450cam. J.Chem. Soc. Chem. Commun. 1996, v.18, p.2189-2190.

167. Kellner C.R., Maves S.A., Sliger S.G. Engineering cytochrome P450sfor bioremeditation. Curr.Opin. Biotechnol. 1997, v.8, p.274-278.

168. Kerwin J.F., Lancaster J.R., Feldman. NO-synthase. J. Med. Chem. 1995, v.38, p.4343-4362.

169. Kiechle F.L., Malinski T. Nitric oxide. Biochemistry, pathophysiology, and detection. Amer J. Clin. Path. 1993, v. 100, p.567-575.

170. Kitson T.M. Comparison of resorufin acetate and p-nitrophenyl acetate as substrates for chymotrypsin. Bioorganic chemistry. 1996, v.24, p.331-339.

171. Klatt P., Schmid M., Leopold E., Schmidt K., Werner E.R., Mayer B., The pteridine binding site of brain nitric oxide synthase. J. Biol. Chem. 1994, v.269, N.19, p.13861-13866.

172. Klein M.L. and Fulco A.J. P450 BM-3 and other induciblebacterial P450 cytochromes. J. Biol. Chem. 1993, v.268, N.17, p.12231-12234.

173. Klibanov A.M. Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents. Trends in Biochem. 1989, v.14, p.141-144.

174. Klibanov A.M. What is remembered and why? Nature. 1995, v.374, p.596.

175. Klyachko N.L., Klibanov A.M., Oxidation of dibenzothiophene catalyzed by hemoglobin and other hemoproteins in various aqueous=organic media. Applied Biochem. Biotechnol. 1992, v.37, p.53.

176. Kobayashi Y., Fang X., Halpert J.R. Stoichiometry of 7-ethoxycoumarin metabolism by cytochrome P4502B1 wildtype and five active-site mutants. FEBS Letter. 1997, v.416, p.77-80.

177. Kokubo T., Sassa S. & Kaiser E.T. Flavohemoglobin: a semisynthetic hydroxylase acting in the absence of reductase. J. Am. Chem. Soc. 1987, v. 109, N.2, p.606-607.

178. Kong J., Lu Z., Lvov Y., Desamero R.Z.B., Frank H.A., Rusling J.F. Direct Electrochemistry of Cofactor Redox Sites in a Bacterial Photosynthetic Reaction Center Protein. J. Am. Chem. Soc. 1998,v. 120(29), p.7371-7372.

179. Kulys J., D Costa E. J. Printed amperometric sensor based on TCNQ and cholinesterase. Bios. Bioelectr. 1991, v.6, p. 109-115.

180. Kunz B.C. and Richter C. Chemical modification of microsomal cytochrome P-450: Role of lysil residues in hydroxylation activity. FEBS Lett. 1983, v.161, p.311-314.

181. Kuriyan J., Simon R.J., Kokubo T., Kaiser E.T., Pahler A. The X-ray structure of flavohemoglobin: a semisynthetic hydroxylase. J. Am. Chem. Soc. 1988, v.110, N.18, p.6261-6263.

182. Lamb S.B., Lamb D.C, Kelly S.L., Stuckley D.S. Cytochrome P450 immobilisation as a route to bioremediation/bicatalysis. FEBS Letters. 1998, v.431, p.343-346.

183. Ledon H. J., Bonnet M. Photoassisted Reduction of Molecular Oxygen to Hydrogen Peroxide Catalyzed by Oxoalkoxomolybdenum (V) Porphyrin. J. Am. Chem Soc. 1981, v.103, N.20, p.6209-6211.

184. Lei C., Wollenberger U., Jung C., Scheller F.W. Clay-bridged electron transfer between cytochrome P450cam and electrode. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, v.268, p.740-744.

185. Leone A.M., Palmer R.M.j., Knowles R.G., Francis P.L., Ashton D.S., Moncada S. Constitutive and inducible nitric oxide synthases incorporate molecular oxygen into both nitric oxide and citrulline. J. Biol. Chem. 1991, v.266, N.35, p.23790-23795.

186. Levine H.L.& Kaiser E.T. Oxidation of Dihydronicotinamides by

187. Flavopapain. J. Am. Chem. Soc. 1978, v. 100, p.7670-7677.

188. Lepesheva G.I., Strushkevich N.N., Usanov S.A. Conformational dynamics and molecular interaction reactions of recombinant cytochrome P450 see (CYP 114A) detected by fluorescence energy transfer. Biochem. Biophys. Acta. 1999, v.1434, p.31-43.

189. Lewis D. F. V. Cytochrome P450. Structure, function and mechanism. Taylor and Francis Eds., London. 1996, p.79.

190. Lewis D.F.V., Hlavica P. Interaction between redox partners in various cytochrome P450 systems: functional and structural aspects. Biochem.Biophys.Acta. 2000, v.1460, p.353-374.

191. Lewis D. F. V., Pratt J.M. The cytochrome P450 catalytic cycle and mechanisms of substrate oxygenation. Drug.Metab. Rev. 1998, v. 30, p. 321-350.

192. Li H., Poulos T.L., Fatty acid metabolism, conformational change, and electron transfer in cytochrome P450(BM-3). Biochem. Biophys. Acta. 1999, v.1441(2-3), p.141-149.

193. Lo K.K-W., Wong L-L., Hill H.A.O. Surface-modified mutants of cytochrome P450Cam: enzymatic properties and electrochemistry. FEBS letters. 1999, v.451, p.342-346.

194. Lvov Y.M., Lu Z., Schenkman J. B., Zu X., Rusling J.F. Direct electrochemistry of myoglobin and cytochrom P450cam in alternate layer-by-layer filmswith DNA and other polyions. J. Am. Chem. Soc. 1998, v. 120, p.4073-4080.

195. Macdonald I. D. G., Smith W.E., Munro A. W. Analysis of the struture of the flavin-binding sites of flavocytochrome P450 BM3 using enhanced Raman scattering. Eur. Biophys. J. 1999, v.28, p.437-445.

196. Macpherson A.N., Telfer A., Barber J. and Truscott T.G. Direct detection of singlet oxygen from isolated photosystem II reaction centres. Biochimica et Biophysica Acta. 1993, p.301-309.

197. Makower A., Bernhardt R., Rabe U., Janig G.-R. and Ruckpaul K. Identification of lysine (384) in cytochrome P-450 LM2 as functionally linked residue. Biomed. Biochim. Acta. 1984, v.43, p.1333-1341.

198. Mansuy D. Cytochrome P450 and synthetic models. Eur. J. Biochem. 1989, v.84, p.348-355.

199. Mansuy D., Battioni P., Battioni J. Chemical model systems for drug metabolizing cytochrome P450-dependent monooxygenases. Eur. J. Biochem. 1989, v.184, p.267-285.

200. Marcus R.A. and Sutin N. Electron transfers in chemistry and biology. Biochimica et Biophysica Acta. 1985, p.265-322.

201. Marietta M.A. Nitric oxide synthase structure and mechanism. J. Biol. Chem. 1993, v.268, N.17, p.12231-12234.

202. Martins S., Blanke S.R., Hager L.P., Sligar S.G. Probing the heme iron coordination structure of pressure-induced cytochrome P420Cam- Biochemistry. 1996, v.35, p.14530-14536.

203. Massey V. J. Activation of Molecular oxygen by Flavins and

204. Flavoprotein. Biol. Chem. 1994, v.269, p.22459-22462.

205. Massey V. The chemical and biological versatility of riboflavin. Biochem. Society Transactions. 2000, v.28, p.283-296.

206. Matsuda Y., Sakamoto S., Koshima H., Murakami Y. Models of oxidized Heme proteins. Preparation characterization of a trans-dioxo ruthenium (VI) porphyrin complex. J. Am. Chem. Soc. 1985 v.107, p.6415-6416.

207. Mayhew M.P., Reipa V., Holden M.J., Vilker V.L. Improving the cytochrome P450 enzyme system for electrode-driven biocatalysis of styrene epoxidation. Biotechnology Progress. 2000, v. 16, p.610-616.

208. McLendon G. Long-distance electron transfer in proteins and model systems. Acc. Chem. Res. 1988, v.21, p.160-167.

209. McMillan K., Masters B.S.S. Optical difference spectrophotometry as a probe of rat brain nitric oxide synthase heme-substrate interaction. 1993, v.32, N.38, p.9875-9880.

210. Meunier B. Metalloporohyrins as Versatile Catalyste for Oxidation Reactions and Oxidative DNA Cleavege. Chem. Rev. 1992, v.92, p.1411-1456.

211. Miles C.S., Ost T.W., Noble M.A., Munro A.W., Chapman S.K. Protein engineerinfg of cytochromes P-450. Bichem.Biphys.Acta. 2000, v. 1543(2), p.383-407.

212. Miyasaka T., Koyama K., Itoh I. Quantum conversion and image detection by a bacteriorhodopsin-based artificial photoreceptor. Science. 1992, v.255, p.342-344.

213. Modi S., Primose W.U., Boyle J.M.B., Gibson C.F., Lian Lu-Yun., Roberts G.C.K. NMR studies of substrate binding to cytochrome P450bm3: comparisons to cytochrome P450cam-Biochemistry. 1995, v.34, N.28, p.8982-8988.

214. Mueller E.J., Loida P.J., Sliger S.G. Twenty five years of cytochrome P450cam research. Mechanistic insight into oxygenase catalysis. Cytochrome P450: Structure, Mechanism and Biochemistry. Second edition,ed.by P.R. Ortiz de Montellano. New

215. York, Plenum Press. 1995, chapter 3. p. 103.

216. Morild E. In Advances in Protein Chemistry Acad. Press. The theory of pressure effects on enzymes. 1981, v.34, p.93-167.

217. Munro A.W., Malarkey K., McKnight J., Thomson A.J., Kelly S.M., Price N.C., Lindsay J.G., Coggins J.R., Miles J.S. The role of tryptophan of cytochrome P450 BM3 from Bacillus megaterium in catalytic function. Biochem. J. 1994, v.303, p.22718-22725.

218. Munro A.W., Noble M. A., Robledo L, Daff S., Chapman S. K. Determination of the redox properties of human NADPH-cytochrome P450 reductase. Biochemistry. 2001, v.40(7), p. 19561963.

219. Murataliev M.B., Klein M., Fulco A., Feyereisen R. Functional interactions in cytochrome P450 BM3: flavin semiguinome intermediates, role of NADP(H), and mechanism of electron transfer by the flavoprotein domain. Biochemistry. 1997, v.36, p.8401-8412.

220. Nakayama N., Shoun H. Fatty acid hydroxylase of the fungus Fusarium oxysporum is possibly a fused protein of cytochrome P-450 and its reductase. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1994, v.202, N.1, p.586-590.

221. Nakayama N., Takemae A., Shoun H. Cytochrome P450foxy, a catalytically self-sufficient fatty acid hydroxylase of the fungus Fusarium oxysporum. J. Biochem. 1996, v.119, p.435-440.

222. Nam W„ Han H.J., Oh S-Y., Lee Y.J., Choi M-H., Han S-Y., Kim

223. C., Woo K., Shin W. 2000. New insights info the Mechanisms of O-O bond cleavage of Hydrogen Peroxide and tert-alkyl hydroperoxides by Iron (III) Porphyrin complexes.

224. Narasimhulu Sh. Substrate-induced spin-state transition in cytochrome P450lm2: a temperature-jump relaxation study. Biochemistry. 1993, v.32, p. 10344-10350.

225. Narhi L.O., Fulco A.J. Characterization of a catalytically self-sufficient 119,000-dalton cytochrome P-450 monooxygenase induced by barbiturates in Bacillus megaterium. J. Biol. Chem. 1986, v.261, N.16, p.7160-7169.

226. Narhi L.O., Fulco A.J. Identification and characterization of two functional domains in cytochrome P450 BM3, a catalytically self-sufficient monooxygenase induced by barbiturates in Bacillus megaterium. J. Biol. Chem. 1987, v.262, N.5, p.6683-6690.

227. Nash T. The Colorimetric Estimation of Formaldehyde by Means of the Hantzsch Reaction. Biochem. J. 1953, v.55, N.3, p.416-421.

228. Nassar A.E.F., Rusling J.F. Electron transfer between electrodes and heme proteins in protein DNA films. J. Am. Chem. Soc. 1996, v.118, p.3043-3044.

229. Nelson D.R., Koymans L., Kamataki T., Stegerman J.J., Feyereisen R., Waxman D.J., Waterman M.R., Gotoh O., Coon M.J., Estabrook R.S., Gunsalus I.C., Nebert D.W. P450 Superfamily: Update on New Seguences, Gene-mapping,

230. Accession Numbers and Nomenclature, Pharmacogenetics. 1996, v.6(1), p. 1-42.

231. Newcomb M., Toy P.H. 2000. Hypersensitive Radical Probes and the Mechanisms of Cytochrome P450-catalyzed Hydroxylation Reactions. Acc. Chem. Res. 2000, v.33, p.449-455.

232. Omura T. and Sato R. A new cytochrome in liver microsomes. J. Biol. Chem. 1962,v.237, p.1375-1376.

233. Omura T. and Sato R. The carbon monooxide-binding pigment of liver microsomes. II. Solubilization, purification, and properties. J. Biol. Chem. 1964, v.239, p.2379-2385.

234. Onuoha A.C., Zu X., Rusling J.F. Electrochemical generation and reactions of ferrylmyoglobins in water and microemulsions. J. Am. Chem. Soc. 1997, v.119, p.3979-3986.

235. Ortiz de Montellano P.R. Oxygen activation and transfer. 1986, p.217-271.

236. Ortiz de Montellano P.R. Cytochrome P450: Structure, Mechanism and Biochemistry, 2nd edn, Plenum Press, New York. 1995.

237. Ortiz de Montellano P.R. Heme Oxygenase Mechanism: Evidence for an Electrophilic Ferric Peroxide Species. Acc. Chem. Res. 1998, v.31, p.543-549.

238. O'Shannessy D.J., Brigham-Burke M., Pack K. Immobilization chemistries suitable for use in the BIAcore surface plasmon resonance detector. Anal. Biochem. 1992, v.205, p. 132-136.

239. Oster T., Boddupalli S.S., Peterson J.A. Expression, purification and properties of the flavoprotein domain of cytochrome P450bm-3-J. Biol. Chem. 1991, v.266, N.33, p.22718-22725.

240. Ozaki S., Matsui T., Watanabe Y. Conversion of mioglobin into a peroxygenase a catalytic intermediate of sulfoxidation and epoxidation by the F43H/64L mutant. J. Am. Chem.Soc. 1997, v.119, p.6666-6667.

241. Pai E.F., Schulz G.E. Flavins and flavoproteins Devel. Biochem. 1982, v.21, p.3.

242. Pardo-Yissar V., Katz E., Willner I., Kotlyyar A.B., Sanders C., Lill H., Biomaterial engineered electrodes for bioelectronics.Faraday Discuss. 2000, v.116, p.119-134.

243. Peisach J. and Blumberg W.E. Electron paramagnetic resonance study of high- and lowspin forms of cytochrome P-450 in liver and in liver microsomes from a methylcholantrenetreated rabbit. Proc. Nat. Acad. Sci., USA. 1970, v.67, p.172-179.

244. Perry J.M., Marietta M.A. Effects of transition metals on nitric oxide synthase catalysis. Proc. Nate. Acad. Sci, USA. 1998, v. 19, p.11101-11106.

245. Pirola M.C., Monti F., Aliverti A. & Zanetti G. A functionalheterologous electron-transfer protein complex: Desulfovibrio vulgaris flavodoxin covalently linked to spinach ferredoxin -NADP+reductase. Arch. Biochem. Biophys. 1994, v.311, p.480-486.

246. Porter T.D. An unusual yet strongiy conserved flavoprotein reductase in bacteria and mammals. TIBS. 1991, p. 154-158.

247. Prough R.A., Burke M.D., Mayer R.T. Direct fluorometric methods for measuring mixed flunction oxidase activity. Methods Enzymol. 1978, v.52, p.372-377.

248. Pufahe R.A., Wishnok J. S., Marietta M.A. Hydrogen Peroxide-Supported Oxidation of NG-Hydroxy-l-Arginine by Nitric Oxide Syntahase. Biochemistry, 1995, v. 34, N.6, p. 1930-1931.

249. Rainina, Efremenco E.N., Varfolomeyev S.D. The development of a new biosensor based on recombinant E. Coli for the direct detection of organophosphorus neurotoxins. Biosensors & Bioelectronics. 1996, v.11, N.10, p.991-1000.

250. Ram M.K., Adami M., Paddeu S., Nicolini C. Nano-assembled of glucose oxidase on the in situ self-assembled films of polypyrrole and its optical, surface and electrochemical characterizations. Nanotechnology. 2000, v.11, p.112-119.

251. Ravichandran K.G., Boddupalli S.S., Hasermann C.A., Peterson J.A., Deisenhofer J. Crystal structure refinement of cytochrome P450 BM-3. Science. 1993, v.261, p.731-736.

252. Rein H., Jung С., Ristau О. and Fridrich J. Biophysical properties of cytochrome P-450, analysis of the reaction mechanism -Thermodynamic aspects. In Cytochrome P-450, edited by K. Ruckpaul and H. Rein (Berlin: Akademie Verlag). 1984, p. 163249.

253. Regan L. Protein design: novel metal-binding sites. Trends Biotechnol. 1995, v.20, p.280-285.

254. Rojas C.F., Kamtekar S., Simons C.T., McLean J.F., Vogel K.M., Spiro T.G., Fard R.S., Hecht M.N. De novo heme preoteins from designed combinatorial libraries. Protein Sci. 1997, v.6, p.2512-2524.

255. Rueff J., Rodrigues A., Laires A., Gaspar J. Activation of promutagens by porphyrinic biomimetic system. Mutation Research. 1992, v.269, p.243-250.

256. Rus O.B., Puchkaev A.V. & Metelitza D.I. Methemalbumin as biocatalyst of oxidation of aromatic amines by hydrogen peroxide. Biochemistry (Moscow). 1996, v.61, p.1283-1290.

257. Rusche K.M., Spiering M.M., Marietta M.A. Reactions catalyzed by tetrahydrobiopterin-free nitric oxide synthase. Biochemistry. 1998, v.37(44) p. 15503-15512.

258. Rusling J.F. Enzyme bioelectrochemistry in cast biomembrane-like films. Acc. Chem. Res. 1998, v.31, p.363-369.

259. Rusling J.F., Nassar A.E.F. Enhanced electron transfer for myoglobin in surfactant films on electrodes. J. Am. Chem. Soc. 1993, v.115, p.11891-11897.

260. Rusling J.F., Znang H. Preconcentration and catalysis in reduction of aliphatic organohalides using surfactant-coated electrodes. Talanta. 1993, v.40, p.741-747.

261. Sadeghi S.J., Meharenna Y. T., Fantuzzi A., Valetti F., Gilardi G. Engineering artificial redox chains by molecular "Lego". Faraday

262. Discuss. 2000, v.116, p. 135-53, discussion 171-190.

263. Sadeghi S.J., Valetti F., Cunha C.A., Romao M.J., Soares C.M., Gilardi G. Ionic strength dependence of the non-physiological electron transfer between flavodoxin and cytochrome c553 from D vulgaris. J. Biol. Inord. Chem. 2000, v.5(6), p.730-737.

264. Saito Y., Mifune M., Kawaquchi T., Odo J., Tanaka Y., Chikuma M., Tanaka H. Catalase-like catalytic activity of ion-exchange resins modified with metalloporphyrins. Chem. Pharm. Bull. 1986, v.34, N7, p.2885-2889.

265. Saricifitci N.S., and Heeder A.J. in Nalwa H.S. (Ed.), Handbook of Organic Conductive molecules and Polymers, Vol. 1, Wiley, New York. 1991, p.437.

266. Sar Kar N., Rom M.K., Sarkar A., Narizzano R., Paddeu S., Nicolini C. 2000. Nanoaccemblies of sulfonated polyaniline multilayers. Nanotechnology, v.11, p. 119-122.

267. Sakaki T., Shibata M., Yabusaki Y., Murakami H. and Ohkawa H. Expression of bovine cytochrome P450c21 and its fused enzymes with yeast NADPH-cytochrome P450 reductase in Saccharomyces cerevisiae. DNA Cell Biology. 1990, v.9, p.603-614.

268. Sasaki S., Tokitsu Y., Ikebukuro K., Yokoyama K.,Masuda Y., Karube I. Biosensing of a herbicide using a chemically modified antibody in organic solvent. Analytical letters. 1997, v.30(3), p.429-443.

269. Scheller F.W., Schubert F., Neumann B., Pfeiffer D., Hintsche R., Dransfeld I., Wollenberger U., Renneberg R., Warsinke A. Second generation biosensors. Biosensors & Bioelectronics. 1991, v.6, p.245-253.

270. Scheller F.W., Wollenberger U., Warsinke, Lisdat F. Research and development in biosensors. Current Opinion in Biotechnology, 2001, v.12(1), p.35-40.

271. Schmidt H-L., Schuhmann W. Reagentless oxidoreductase sensors. Biosensors & Bioelectronics. 1996, v.11, n 1/2, p.127-135.

272. Schuhmann W. Conductihg polymer based amperometric enzyme electrodes. Mi Krochim. Acta. 1995, v.121, p.1-29.

273. Schwarz D., Kissevel P., Wessel R., Jueptner O., Schmid R.D. a-Branched 1,2-Diacyl Phosphotidylcholines as Effectors of Activity of Cytochrome P450 scc(11A1) J. Biol. Chem. 1996,v.271, N.22, p. 12840-12846.

274. Schwarze W., Bernhardt R, Janig G.-R. and Ruckpaul K. Fluorescent energy transfer measurements on fluorescein isothiocyanate modified cytochrome P450 LM2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983, v.113, p.352-360.

275. Schwabacher A.W., Weinhouse M.I., Auditor M.-T., Lerner R.A. Metalloselective Anti-Porphyrin Monoclonal Antibodies. J. Amer. Chem. Soc. 1989, v.111, N.6, p.2344-2346.

276. Schwaneberg U., Appel D., Schmitt J., Schmid R. P450 in biotechnology: zine driven-hydroxylation of p-nitrophenoxydodecanoic acid using P450 BM-3 F87A asa catalysa. J. of Biotechnology, 2000, v.84(3), p.249-257.

277. Senaratne V. and Bowden E.F. The electrode reaction of euglena gracilis cytochrome c-552 at edge-oriented pyrolytic graphite. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988, v.157, N.3, p.1021-1026.

278. Sevrioukova I.F., Hazzard J.T., Tollin G., Poulos T. L. Laser flash indused electron transfer in P450cam monooxygenase: putidaredoxin reductase putidaredoxin interaction. Biochemistry. 2001, v.40, N.35, p.10592-10600.

279. Sharp R.E., Dutton C.M., Rabanal F., Dutton P.L. Design, synthesis, and characterisation of a photoactivatable flavocytochrome molecular maquette. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998, v.95, p. 10465-10470.

280. Sharp R.E., White P., Chapman S.K., Reid G.A. Role of the interdomain hinge of flavocytochrome b2 in intra-and inter-protein electron transfer. Biochemistry. 1994, v.33, N.17, p.5115-5120.

281. Shen A.L., Porter T.D., Wilson T.E. and Kasper C.B. Structural analysis of the FMN binding domain of NADPH-cytochrome P-450 oxidoreductase by site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem. 1989, v.264, N.13, p.7584-7589.

282. Shimada H., Sligar S.G., Yeom H., Ishimura Y. In: Oxygenases and Model Systems; Funabiki T., Ed., Khower Academic Publishers., Dordrecht, The Netherlands. 1997, p. 195-221.

283. Shimizu T., Tateishi T., Hatano M. and Fujii-Kuriyama Y. Probing the role of lysines and arginines in the catalytic function of cytochrome P450d by site-directed mutagenesis. J. Biological Chemistry. 1991, v.266, N.6, p.3372-3375.

284. Shimoji M., Jin H., Higgins L., Jones J., Design of a novel P450: a functional bacterial-human cytochrome P450 chimera. Biochemistry. 1998, v.37, p.8848-8852.

285. Shumilin I.A., Nikandrov A.A, Krasnovsky A.A., Popov V.O. Metal as a novel type of the enzyme substrate. Metallic cadmium photogenerated in the system CdS-formate as a substrate of the NAD-dependent hydrogenase. FEBS Letters. 1993, v.328, p. 189192.

286. Shumilin I .A., Nikandrov V.V., Popov V.O., Krasnovsky A.A. Photogeneration of NADH under coupled action of CdS semiconductor and hydrogenase from Alcaligenes eutrophus without exogenous mediators. FEBS Letters. 1992, v.306, p. 125128.

287. Sliger S.G., Salemme R. Protein engineering for molecular electronics. Curr. Opin. Biotechnol. 1992, v.3,p.388-393.

288. Somasundrum M., Tanticharoen M., Kirtikara J. H2O2 from an oxidase enzyme can be detected cathodically using metal microparticles dispersed in a polymeric film electrode. J. Electroanal. Chem. 1996, v.407, p.247-251.

289. Stuehr D.J. Mammalian nitric oxide synthases. Biochim. Biophys. Acta. 1999, v.1411, p.217-230.

290. Sumimoto H., Sakamoto N., Nozaki M., Sakaki Y., Takeshige K., Minakami S. Cytochrome b558, a component of the phagocyte NADPH oxidase, is a flavoprotein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992, v.186, N.3, p.1368-1375.

291. Sun W., Kong J., Deng J. Electrocatalytic activity of riboflavin chemically modified electrode toward dioxygen reduction. Analytical Letters. 1996, v.29, p.2425-2439.

292. Suzuki H. Advances in the microfabrication of electrochemical sensors and systems. Electroanalysis. 2000, v. 12, N.9, p.703-715.

293. Tabushi I. Reductive dioxygen activation by use of artificial P450 systems. Coord. Chem. Rev. 1988, v.86, p. 1-42.

294. Tabushi I., Kobera M. A new and efficient biomimetic system for hydrocarbon oxidation by dioxygen using manganese porphyrins, imidazole, and zinc. J. Am.Chem. Soc. 1986, v.108, p.1101-1103.

295. Tegoni M., Begotti S, Cambillau C. X-ray structure of two complexes of the Y143F flavocytochrome b2 mutant crystallized in the presence of lactate or phenyllactate. Biochemistry. 1995, v.34,1. N.31, p.9840-9850.

296. Tschirret-Guth R.A., Hoa G.H.B., Ortiz de Montellano P.R. Pressure-induced deformation of the cytochrome P450Camactive site. J. Am. Chem. Soc. 1998, v.120, p.3590.-3596.

297. Uvarov V.Yu., Tretiakov V.E., Leschenko A.V., Dzuzenova C.S., Tretiakova L.Z., Rukavishnikov I.G., Archakov A.I. Effect of microenvironment on the tertiary structure of cytochrome P450 LM2. Eur. J. Biochem. 1989, v.181, p.391-396.

298. Valetti F., Sadeghi S. J., Meharenna Y.T., Leliveld S.R., Gilardi G. Engineering multi-domain redox proteins containing flavodoxin as bio-transformer: preparatory studies by rational design. Biosens Bioelectron. 1998, v.3, N 6, p.675-685.

299. Varfolomeev S.D., Kurochkin I.N., Yaropolov A.I. Laccase: properties, catalytic mechanism and applicability. Biosensors and Bioelectronics. 1990, v.11, p.863.

300. Vergeres G., Winterhalster K.H., Richter C. Identification of the Membrane Anchor of Microsomal Rat Liver Cytochrome P-450. Biochemistry 1989, v. 28, N.9, p.3650-3655.

301. Vergeres G., Winterhalter K.H., Richter C. Localization of the N-terminal methionine of lever cytochrome P450 in the lumen of the endoplasmic reticulum. Biochem. Biophys. Acta. 1991, v. 1063, p.235-241.

302. Vidal J.-C., Garcia-Ruiz E., Castello J.-r. Design of multilayer cholesterol amperometric biosensor for preparation and use in flowsystems. Electroanalysis. 2001, v.3, p.229-235.

303. Vladimirov Yu.A. Free radicals, Aging and degenerative diseases, New-York, London: Alan R. Liss Inc. 1986, 141-195.

304. Walsh C., Fisher J., Spencer R., Graham D.W., Ashton W.T., Brown J.E., Brown R.D. and Rogers E.F. Chemical and enzymatic properties of riboflavin analogues. Biochemistry. 1978, v. 17, N.10, p.1942-1951.

305. Wang L., Hu N. Direct electrochemistry of Hemoglobin in layer-by-layer films with poly (vinyl sulfonate) grown on pyrolytic graphite electrodes. Bioelectrochemistry. 2001, v.53(2), p.205-212.

306. Wang J., Stuehr D.J., Ikeda-Saito M. and Rousseau D.L. Heme coordination and structure of the catalytic site in nitric oxide synthase. J. Biol. Chem. 1993, v.268, N.30, p.22255-22258.

307. Werck-Reichhart D., Feyerreisen R. Cytochrome P450:a success story. Genome Biology. 2000, 3003.1-3003.9.

308. Wertz D. L., Sisemore M. F., Selke M., Driscoll J., Valentine S. Mimicking cytochrome P450 and aromatase: aromatization of a substrate analogue by a peroxo Fe(lll) porphyrin complex. J. Am., Chem. Soc. 1998, v.120, p.5331-5332.

309. White K.A., Coon M.J. Oxygen activation by cytochrome P-450. Annu. Rev. Biochem. 1980,v.49, p.315-356.

310. White K.A., Marietta M.A. Nitric oxide synthase is a cytochrome P450 type hemoprotein. Biochemistry. 1992, v.31, N.29, p.6627-6631.

311. Willie A., Stayton P.S., Sligar S.G., Durham B., Millett F. Genetic engineering of redox donor sites: measuremont of intracom lex electron transfer between ruthenium-65-cytochrome bs cytochrome C. Biochemistry. 1992, v.31, p.7237-7242.

312. Willner I., Zahavy E. Activation of glutathione reductase by light: a novel approach to design redox photo-enzymes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994, v.33, p.581-583.

313. Woggon W.-D., Patzel H., Cytochrome P450: Biochemistry and Biophysics, INCO-TNC, Joint Stock Company, Moscow. 1992, p.78.

314. Woggon W.-D., Staubli B., Fretz H. Synthetic analogues of the active site of cytochrome P450. Proceedings of the 7th International Conference. Cytochrome P450: biochemistry and biophysics. Moscow. 1991, p.356-358.

315. Wu J., Gorenstein D.G. Structure and dynamics of cytochrome c in nonaqueous solvents by 2D NH-exchange NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 1993, v.115, p.6843-6850.

316. Wu Z., Wang B., Dong S., Wang E. Amperometric glucose biosensor based on lipid film. Biosens. Bioelectronics. 2000, v.15, p.143-147.

317. Wuttke D.S., Gray H.B. Semisynthesis of Bipyridyl-Alanine Cytochrome C Mutants: Novel Proteins with Enhanced Electron-Transfer Properties. J. Am. Chem. Soc. 1993, v.115, p.8455-8456.

318. Xia Z.X., Mathews F.S. Molecular structure of flavocytochrome b2 at 2.4 A resolution. J.Mol. Biol. 1990, v.212, N.4, p.837-863.

319. Xie Q.W., Cho H.J., Calaycay J., Mamford R.A., Swiderek K.M., Lee T.D., Ding A., Troso T., Nathan C.F. Cloning and characterization of inducide nitric oxide synthase from mouse macrophages. Science. 1992, v.256, p.225-228.

320. Xu K., Grebenow K., Klibanov A.M. Enzymes in organic solvents properties and applications. Biotechnol. Bioeng. 1997, v.56, p.485.

321. Yeom H., Sliger S.G., Li H., Poulus Th.L. The role of Thr 268 in oxygen activation of cytochrome P450 BM-3. Biochemistry. 1995, v.34, N.45, p.14733-14740.

322. Yeon H and Sligar S.G. The role of thr268 in oxygen activation of cytochrome P450BM-3- Biochemistry. 1995, v.34, p.14733-14740.

323. Yu C.-A. and Gunsalus I.C. Cytochrome P-450cam. II. Interconversion with cytochrome P-420, J. Biol. Chem. 1974, v.249, p. 102-106.

324. Direct electron injection from electrodes to cytochrome P450cam in biomembrane-like films. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1997, v.93, p. 1769-1774.

325. Zhu H., Riggs A.F. Yeast flavohemoglobin is an ancient protein related to globins and a reductase family. Proc. Nat. Acad. USA. 1992, v.89, N.11, p.5015-5019.

326. Zu X., Zu Z., Zhang Z., Schenkman J., Rusling J. Electroenzyme-catalyzed oxidation of styrene and cis-p-methylstyrene using thin films of cytochrome P450cam and myoglobin. Langmuir 1999, v. 15, N.21, p.7372-7377.

327. Проведенные исследования были поддержаны: грантами РФФИ

328. Исследование белок-белковых взаимодействий цитохромов Р450 с редокс партнерами в монооксигеназной системе» № 1587926,

329. Полусинтетические флавоцитохромы как биосенсоры для контроля за содержанием лекарственных препаратов и их метаболитов в различных средах» № 00-04-48054; Государственными Программами

330. Создание электрохимических биосенсоров на основе цитохрома Р450»,

331. Конструирование биосенсоров для фракционного определения холестерина в крови с помощью цитохрома Р450», Российско-немецким грантом ВМВР N 0311721, Европейским грантом 1МСО-Сорегтсиз N0. ЕЗВ1С15СТ960810.