Повышение регенеративного потенциала имплантационного материала на основе костного коллагена и рекомбинантного белка человека rhBMP-2 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Громов, Александр Викторович

• Громов, Александр Викторович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Громов, Александр Викторович

ОГЛАВЛЕНИЕ................................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................6

I. ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................8

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................12

1. Костная ткань 12

1.1. Состав костной ткани........................................................................................12

1.1.1. Межклеточный матрикс...............................................................................12

1.1.2. Клетки костной ткани..................................................................................23

1.2. Классификация костных тканей.........................................................................25

1.3. Кость как орган....................................................................................................26

1.3.1. Компактное вещество..................................................................................26

1.3.2. Губчатое вещество.......................................................................................27

1.3.3. Надкостница..................................................................................................28

1.3.4. Эндост............................................................................................................28

1.4. Развитие, рост и регенерация костной ткани..................................................29

1.4.1. Развитие костной ткани...............................................................................29

1.4.2. Физиологическая регенерация....................................................................31

1.4.3. Репаративная регенерация...........................................................................31

1.5. Кость как объект трансплантации и тканевой инженерии..........................32

2. ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ 34

2.1. Аутогенные материалы.......................................................................................35

2.2. Аллогенные материалы........................................................................................36

2.3. Ксеногенные материалы......................................................................................37

2.4. Деминерализованный костный матрикс............................................................37

2.5. Минеральный матрикс.........................................................................................40

2.6. Синтетические материалы.................................................................................41

2.7. Костные морфогенетические белки как компоненты остеопластических материалов............................................................................................................43

2.7.1. Получение BMP............................................................................................44

2.7.2. Носители BMP..............................................................................................45

2.7.3. Коммерчески доступные препараты с BMP..............................................51

2.8. Заключение по разделу..........................................................................................53

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................................................55

3. Материалы, реактивы и оборудование 55

3.1. Клеточные линии...................................................................................................55

3.2. Лабораторные животные...................................................................................55

3.3. Питательные среды.............................................................................................55

3.4. Имплантационные материалы.............................. ...............................................56

3.5. Материалы для иммуноферментного анализа..................................................56

3.6. Медицинские препараты.................................. .....................................................56

3.7. Другие реактивы...................................................................................................56

3.8. Оборудование.........................................................................................................57

Методы 58

4.1. Определение содержания жира в костной ткани................. ............................58

4.2.Двулучевой сканирующий электронный микроскоп...........................................59

4.3. Определение содержания кальция в костной ткани........................................59

4.4. Определение содержания влаги в костной ткани.............................................60

4.5. Определение рН водной вытяжки костной крошки.........................................60

4.6. Определение остаточного содержания нативных ВМР-2 и ВМР-7 в костной ткани.......................................................................................................61

4.7. Определение микробиологической обсемененности полученных материалов............................................................................................................62

4.8. Метод иммуноферментного анализа концентрации рекобинантного rhBMP-2..................................................................................................................62

4.9. Фракционирование белков методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (ПААГ-ДСН).................................................63

4.10. Определение биологической активности rhBMP-2 на клетках линий С2С12 и СЗН10Т1/2...............................................................................................64

4.11. Метод определения активности щелочной фосфатазы в мышечной ткани крыс.............................................................................................................64

4.12. Метод определения концентрации кальция в образцах мышечной тканей крыс...........................................................................................................65

4.13. Экспериментальная модель эктопического остеогенеза............................66

4.14. Определение количества иммобилизованного на ДКМ rhBMP-2................66

4.15. Экспериментальная модель ортотопического остеогенеза.......................66

4.15.1. Хирургические операции........................................................................66

4.15.2. Гистологическое исследование костного материала............................67

4.16. Экспериментальная модель восстановления сегментарного дефекта гребня альвеолярного отростка челюстей собаки...........................................68

4.16.1. Проведение эксперимента.......................................................................68

4.16.2. Гистологическое исследование костного материала............................69

4.17. Экспериментальная модель дефектов бедренных и большеберцовых костей у кроликов..................................................................................................70

4.17.1. Методика насыщения пористых титановых имплантатов композиционным материалом на основе ДКМ с добавлением rhBMP-2.........................................................................................................70

4.17.2. Методика насыщения пористых титановых имплантатов прилипающей фракцией аутологичных миелокариоцитов......................71

4.17.3. Хирургические операции........................................................................71

4.17.4. Гистологическое исследование костного материала............................72

4.17.5. Определение прочности новообразованной костной ткани................73

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................75

5. Разработка методики получения ксеногенного деминерализованного костного матрикса 75

5.1. Фрагментация кости и грубая очистка.............................................................75

5.2. Обезжиривание.....................................................................................................76

5.3. Первичный размол и деминерализация................................................................78

5.3.1. Определение оптимального размера костной крошки для полной деминерализации..........................................................................................78

5.3.2. Определение оптимальной концентрации кислоты и времени обработки для полной деминерализации костной крошки......................81

5.4. Отмывка и высушивание......................................................................................82

5.5. Вторичный размол и фракционирование............................................................82

5.6.Лиофилизация и радиационная стерилизация...................................................83

5.7. Остаточное содержание нативных факторов роста кости ВМР-2 и

BMP-7 на различных этапах технологического процесса получения ДКМ....84

5.8. Технологическая схема получения ДКМ в виде крошки.....................................88

5.9. Виды исполнения ДКМ..........................................................................................88

5.10. Преимущества разработанной методики получения ДКМ.........................91

6. Получение и определение биологической активности рекомбинантного фактора роста человека RHBMP-2 92

6.1. Определение биологической активности rhBMP-2 in vitro..............................94

6.1.1. Определение концентрации rhBMP-2 с помощью ИФА..........................94

6.1.2. Определение биологической активности рекомбинантного rhBMP-2

на клетках линий С2С12 и СЗН10Т1/2.......................................................97

6.2. Определение биологической активности rhBMP-2 in vivo на модели эктопического остеогенеза.................................................................................98

6.2.1. Оптимизация методики определения активности щелочной фосфатазы в мышечной ткани.....................................................................98

6.2.2. Оптимизация методики определения количества кальция в мышечной ткани...........................................................................................99

6.2.3. Определение активности щелочной фосфатазы и кальция в коллагеновых губках, пропитанных rhBMP-2, на модели эктопического остеогенеза........................................................................100

7. Получение композитного остеопластического материала на основе ДКМ с добавлением RHBMP-2 и гиалуроновой кислоты 103

7.1. Оптимизация условий иммобилизации rhBMP-2 на ДКМ...............................104

7.2. Определение соотношения компонентов композиционного препарата.......106

7.3. Токсикологическое исследование материала...................................................108

7.3.1. Краткое изложение результатов испытаний............................................108

7.3.2. Выводы по результатам испытаний.........................................................109

8. Исследование остеогенных свойств разработанного остеопластического материала 109

8.1. Исследование остеогенных свойств разработанного материала на модели ортотопического остеогенеза.............................................................110

8.1.2. Результаты гистоморфометрического анализа........................................112

8.1.3. Заключение..................................................................................................115

8.2. Исследование остеогенных свойств разработанного материала при восстановлении сегментарного дефекта гребня альвеолярного отростка челюстей..............................................................................................................117

8.2.1. Проведение эксперимента.........................................................................118

8.2.2. Результаты морфологического исследования искусственно созданного дефекта челюсти в подгруппах с разным способом восстановления альвеолярного гребня.....................................................121

8.2.3. Результаты гистологического исследования костного регенерата в области искусственно созданного дефекта челюсти..............................125

8.2.4. Заключение..................................................................................................128

8.3. Исследование остеогенных свойств разработанного материала совместно с композитным имплантатом из пористого титанового матрикса на модели дефектов бедренных и болыиеберцовых костей.........129

8.3.1. Результаты морфологического и гистоморфометрического анализа ...130

8.3.2. Определение прочности новобразованной костной ткани....................132

8.3.3. Заключение..................................................................................................133

9. Анализ клинических испытаний разработанного материала 134

9.1. Клинические испытания в РКБ им. Г.Г. Куватова..........................................134

9.2. Клинические испытания в ГКБ имени С. П. Боткина.....................................135

9.3. Заключение по клиническим исследованиям.....................................................136

9.4. Регистрация изделия медицинского назначения «Гамалант-крошка».........137

V. ВЫВОДЫ.................................................................................................................138

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................140

ПРИЛОЖЕНИЯ..........................................................................................................160

Список сокращений

ДКМ - деминерализованный костный матрикс,

BMP - костный морфогенетический белок, bone morphogenetic protein,

rhBMP - рекомбинантный человеческий костный морфогенетический белок,

recombinant human bone morphogenetic protein,

MKM - межклеточный матрикс,

ПГ — протеогликан,

ГАГ - гликоазаминогликан,

сГАГ - сульфатированный гликозаминогликан,

ГАП — гидроксиапатит,

МСК - мезенхимальные стволовые клетки,

ЩФ - щелочная фосфатаза,

АФК - аморфный фосфорнокислый кальций,

ПЦР - полимеразная цепная реакция,

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,

FGF - фактор роста фибробластов, fibroblast growth factor,

IGF - инсулиноподобные факторы роста, insulin-like growth factor,

TGF - трансформирующий фактор роста, transforming growth factor,

PLA-DX-PEG - полилактид - п-диоксанон - полиэтиленгликоль, polylactic acid-p-

dioxanone-polyethylene glycol,

PLGA - полилактогликолевая кислота, polylactic-co-glycolic acid,

PGA - полигликолевая кислота, polyglycolic acid,

PEG - полиэтиленгликоль, polyethylene glycol,

IlTi(a-C) — пористый титан с алмазоподобными плёнками,

ИФА - иммуноферментный анализ,

ПААГ - полиакриламидный гель,

ДСН - додецилсульфат натрия,

кДа — килодальтон,

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан, ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.

Для обозначения аминокислотных остатков использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPАС) и Международного союза биохимиков (IUB).

I. Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Повышение регенеративного потенциала имплантационного материала на основе костного коллагена и рекомбинантного белка человека rhBMP-2»

Актуальность работы

Проблема восстановления анатомической целостности и функциональности сегментов опорно-двигательного аппарата при его повреждениях по-прежнему остается весьма актуальной. В случае неудачной фиксации, при большом объеме повреждения, а также в пожилом возрасте собственная регенеративная функция кости может оказаться недостаточной, что приводит к неполному сращению, возникновению ложного сустава, повторным переломам или дефектам кости. Для стимуляции репаративного остеогенеза и восстановления целостности костной ткани используются материалы как природного, так и искусственного происхождения [Janicki, 2011].

Применение аутологичного костного материала, полученного из подвздошного гребня, нижней или верхней челюсти самого пациента, высокоэффективно благодаря наличию собственных клеточных и внеклеточных компонентов пациента [Becker, 1994; Urist, 1974], обеспечивающих регенеративный потенциал. Однако процедура забора материала болезненна и травматична, увеличивает время основной операции, может быть связана с последующими осложнениями [Cricchio, 2003; Joshi, 2004], а также имеет ограничения по допустимому объему забираемой костной ткани. Использование аутотрансплататов нежелательно в детском и пожилом возрасте.

В качестве альтернативы аутологичной кости широко применяются материалы на основе деминерализованного костного матрикса (ДКМ) как аллогенного, так и ксеногенного происхождения [Strates, 1993; Савельев, 1996; Solheim, 1998; Bauer, 2000; Oakes, 2003; Takikawa, 2003]. Костный матрикс, лишенный минеральной основы, быстрее васкуляризируется в организме реципиента и замещается новообразованной костной тканью [Urist, 1971; Yoon, 2002; Булатов, 2005]. ДКМ обладает высокой биосовместимостью, может служить матрицей для остеогенных клеток, проникающих в имплантат (остеокондуктивность), а также стимулировать образование новой костной ткани (остеоиндуктивность). По своему составу ДКМ на 98% представляет собой коллаген I типа. Кроме того, ДКМ содержит комплекс костных морфогенетических белков (bone morphogenetic protein, BMP), обуславливающих его остеоиндуктивные свойства.

Согласно результатам современных исследований, BMP являются самыми важными факторами регенерации кости и хряща. BMP это цитокины, принадлежащие к

суперсемейству трансформирующего ростового фактора -ß. Они действуют на рецепторы клеточной мембраны и играют значительную роль в регулировании роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, нервные и эпителиальные клетки. К настоящему времени идентифицировано 20 видов ВМР, наиболее изученными из которых являются ВМР-2 и ВМР-7.

Активность нативных факторов роста, входящих в состав ДКМ, сильно различается у материалов, полученных по различным методикам [Li, 2000; Wildemann, 2007]. Избыточная деминерализация костного матрикса [Iwata, 2002], использование химических реагентов [Hallfeldt, 1992; Pekkarinen, 2004], термическая обработка [Ни, 1997], высокие дозы гамма-излучения [Howard, 1998], используемые при изготовлении ДКМ, могут существенно снижать активность факторов роста, входящих в его состав, что негативно сказывается на остеиндуктивных свойствах материала [Pietrzak, 2009]. Таким образом, существует необходимость разработки методики получения ДКМ с высоким остаточным содержанием нативных факторов роста кости, определяющих его остеоиндуктивный потенциал.

Помимо оптимизации условий получения ДКМ, регенеративный потенциал разрабатываемого остеопластического материала может быть повышен за счет введения в его состав дополнительных факторов роста кости. С помощью методов генной инженерии разработаны технологии получения рекомбинантных ВМР, в том числе рекомбинантного человеческого ВМР-2 (rhBMP-2) [Niederwanger, 1996; Schwartz, 1998]. Данные технологии позволяют синтезировать белок в количестве, достаточном для производства содержащих его остеопластических материалов в промышленных масштабах [Bessho, 2000].

В настоящее время ряд таких материалов активно применяется в США и странах западной Европы при лечении сложных травм и переломов, например, «INFUSE» (Medtronic Biologics, США) и «OSSIGRAFT» ОР-1 (Stryker Biotech, США). Применение этих материалов в России ограничено из-за их крайне высокой стоимости, поэтому разработка остеоиндуктивных костнопластических материалов отечественного производства, более дешевых и доступных, сделает возможным их внедрение в российскую практику здравоохранения.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является разработка и оптимизация методики получения композиционного материала с повышенным регенеративным потенциалом на основе костного коллагена (ДКМ) и рекомбинантного белка человека rhBMP-2 для регенерации костной ткани.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

Разработка оптимизированной методики получения высокоочищенного ДКМ с высоким остаточным содержанием нативных факторов роста кости.

Определение биологической активности in vitro и in vivo препарата rhBMP-2, экспрессированного в клетках Escherichia coli.

Разработка методики получения композиционного материала на основе ДКМ с добавлением гиалуроновой кислоты и rhBMP-2, позволяющей сохранить их биологическую активность.

Исследование регенеративного потенциала разработанного композиционного материала на моделях дефектов костей животных.

Научная новизна

Разработана оптимальная методика получения высокоочищенного ДКМ в виде крошки, блоков, мембран и стержней различного размера с высоким остаточным содержанием нативных факторов роста кости ВМР-2 (160-180 нг/г) и ВМР-7 (100-145 нг/г), включающая стадии контроля готовой продукции по ряду параметров: степень деминерализации, остаточное содержание липидов, нативных факторов роста ВМР-2 и ВМР-7, влажность, pH, микробиологическая обсемененность.

Доказана высокая биологическая активность полученного в лаборатории препарата rhBMP-2, экспрессированного в клетках Escherichia coli. Полученный препарат взаимодействует со специфическими антителами к ВМР-2. Остеоиндуктивная активность rhBMP-2 в тестах in vitro и in vivo не уступает активности зарубежных коммерческих препаратов-аналогов.

Разработана методика иммобилизации rhBMP-2 на ДКМ, позволяющая сохранить их биологическую активность. Для повышения пластичности полученного композиционного материала на основе ДКМ в его состав была добавлена гиалуроновая кислота, было подобрано оптимальное соотношение компонентов.

Показан высокий регенеративный потенциал разработанных остеопластических материалов на моделях- ортотопического остеогенеза у крыс, восстановления сегментарного дефекта гребня альвеолярного отростка челюсти собаки, а также дефектов бедренных и большеберцовых костей у кроликов.

Проведены токсикологическое исследование, а также клиническая апробация разработанных материалов.

Практическая значимость работы

Разработанный в рамках диссертационной работы материал на основе ДКМ в виде крошки был зарегистрирован как ИМИ «Крошка костная деминерализованная лиофилизированная для заполнения костных дефектов «Гамалант-крошка»» (регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13111) и разрешен для применения на территории Российской Федерации в качестве изделия медицинского назначения. Область применения: травматология, ортопедия, спинальная хирургия, челюстно-лицевая хирургия.

Остеопластические материалы на основе ДКМ в виде блоков, мембран и стержней с добавлением рекомбинантного фактора роста кости гЬВМР-2, полученные по разработанной технологии, могут быть использованы в качестве изделий медицинского назначения и в качестве компонентов при изготовлении других изделий медицинского назначения, применяемых в общей травматологии, хирургии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии и стоматологии.

Препарат гЬВМР-2, полученный по разработанной методике, может применяться как дополнительный компонент различных композиционных остеопластических материалов с целью улучшения их остеоиндуктивных свойств.

II. Обзор литературы

1. Костная ткань

Для восстановления целостности кости наиболее эффективным является материал, состав которого приближен к составу костной ткани. Разработка такого материала подразумевает изучение состава и строения кости на разных уровнях организации: молекулярном, клеточном и тканевом.

Важнейшим аспектом физиологии костной ткани являются процессы регенерации, которые делятся на физиологические и репаративные. Физиологическая регенерация заключается в ремоделировании костной ткани, в процессе которой происходит частичная или полная резорбция старых и формирование новых костных структур. Репаративная регенерация наблюдается при переломах костей. Глубокое изучение механизма репаративной регенерации позволит создавать остеопластические материалы, содержащие в своем составе компоненты, стимулирующие процессы восстановления костной ткани в зоне имплантации, а также способствующие интеграции имплантата в костную ткань.

1.1. Состав костной ткани

Костная ткань состоит из клеточных элементов и межклеточного матрикса, который содержит органические и неорганические минеральные вещества и воду. Общая биохимическая схема структуры кости представлена на рис.1.1. [Слуцкий, 1969]. Рассмотрим последовательно все вышеперечисленные компоненты.

1.1.1. Межклеточный матрикс

Межклеточный матрикс (МКМ) костной ткани на 30 % состоит из органических компонентов (коллаген I типа, протеогликаны (ПГ), гликоазаминогликаны (ГАГ), фибронектин, остеонектин и др.), на 60% из минеральных веществ (гидроксиапатит (ГАП) и аморфные фосфаты кальция), и на 10% из воды, находящейся в свободном и связанном состоянии [Альберте, 1994].

Костная ткань

Межклеточный матрикс

Минеральные компоненты

Гидроксиапатит, аморфные фосфаты

кальция, микроэлементы, соли

Органические компоненты

Ж

Коллаген, протеогликаны, гликоазаминогликаны, липиды, органические кислоты, факторы роста

Клетки

Остеогенные клетки-предшественники, остеобласты, остеоциты, остеокласты

Рис. 1.1. Биохимическая схема структуры костной ткани.

Многообразие вариантов костной ткани в организме человека делает невозможной всякую попытку представить химический состав костной ткани в обобщенном виде. На рис. 1.2. представлен состав зрелой компактной пластинчатой костной ткани человека [Торбенко, 1977].

ГАГ НКБ

ЛИП 4о/0 3о/о

Рис. 1.2. Состав зрелой компактной пластинчатой костной ткани: МК - минеральные компоненты, КОЛ - коллаген типа I, НКБ - неколлагеновые белки, ГАГ -гликозамингликаны, ЛИП - липиды.

1.1.1.1. Органические компоненты Органическая составляющая костной ткани на 95-98 % представлена коллагеном I типа, обеспечивающим её прочность [Торбенко, 1977].

На 3-5% - это неколлагеновые белки, играющие исключительную роль в обмене органических веществ, минералов, витаминов и микроэлементов. По функциональной активности, достаточно условно, их можно разделить на две подгруппы:

• Белки, которые активно участвуют в формировании микроархитектоники костной ткани, связывании органического матрикса с минеральным. К ним можно отнести ПГ, фибронектин, остеонектин.

• Белки, обладающие способностью воздействовать на адгезию, миграцию и функциональную активность остеогенных и вспомогательных клеток остеобластов и остеокластов. Это специфические остеотропные гормоны и ростовые, хемотаксические, трансформирующие дифференцирующие факторы (костные морфогенетические белки, остеопонтин, остеокальцин, тромбоспондин, и т.д.). Вместе с коллагеном они участвуют в формировании гуморальной составляющей костного микроокружения [Слуцкий, 1986].

Коллаген - основная макромолекула костной ткани, фибриллярный белок уникального аминокислотного состава и пространственной организации. В тканях человека существует не менее 19 видов коллагена, но в костной ткани подавляющая его часть представлена коллагеном типа I (90-95%), остальная часть приходится в основном на V тип [Торбенко, 1977].

Изоформы коллагена различаются по аминокислотному составу, иммунологическим, хроматографическим свойствам, макромолекулярной организации и распределению в тканях. В морфофункциональном плане все изоформы подразделяют на интерстициальные коллагены (I, II, III, V типов), которые формируют крупные фибриллы; не фибриллярные (минорные) коллагены (IV, VI-XIX типов), образующие мелкие фибриллы и выстилающие базальные мембраны. Коллагены I и V типов называют перицеллюлярными. Они откладываются вокруг клеток, образуя опорные структуры [Yamauchi, 1989].

Рис. 1.3. Пространственная структура коллагена.

Молекула коллагена состоит из трех альфа-цепей, обвитых одна вокруг другой и образующих правовращающую спираль. Альфа-цепи построены из часто повторяющихся фрагментов, имеющих характерную триплетную последовательность -Gly-X-Y. Положение X часто занимает пролин (Pro) или 4-гидроксипролин (4-Нур), Y -гидроксилизин, а третье место всегда занимает глицин, благодаря чему обеспечивается плотная упаковка трех полипептидных цепей в фибриллу (Рис. 1.3.) [Weiner, 1992].

Эти «жесткие» аминокислоты ограничивают вращение полипептидного стержня и, таким образом, увеличивают стабильность тройной спирали [Bruckner, 1994]. Остатки гидроксипролина придают структуре дополнительную стабильность за счёт образования большого количества внутримолекулярных водородных связей. Молекулы коллагена ассоциируют в фибриллы, которые видны в виде пучков в межклеточном матриксе соединительной ткани. Тип 1 образует видимые фибриллы с периодичностью 67 нм. Длительность секреции коллагена в остеобластах от момента начала сборки молекулы до включения его в структуру костного матрикса составляет около 35 часов. Коллагеновые волокна в костной ткани имеют строго определенную ориентацию [Щараев, 1997]. Как правило, они располагаются в виде концентрических слоев, расположенных под определенным углом друг к другу, что обеспечивает биомеханическую устойчивость системы. При нейтральных значениях pH коллаген электростатически связывается с ПГ. Присутствие L-идуроновой кислоты способствует более прочному связыванию, и ПГ взаимодействуют с коллагеном сильнее, чем соответствующие ГАГ [Pedersen, 1998].

Таким образом, коллагеновая сеть, состоящая из многочисленных волокон, погружена в макромолекулярные агрегаты ПГ и тесно взаимодействует с межклеточным матриксом и кристаллическими молекулами ГАП, образуя прочную биомеханическую систему.

Функции коллагена в костной ткани многообразны. Прежде всего - это механохимическая роль. Коллаген «цементирует» кристаллы минеральной фазы, обеспечивая кости, помимо твердости и прочности, эластичность, возможность противостоять изгибающим и ротационным нагрузкам. Как наиболее стабильный структурный элемент МКМ, коллаген организует в пространстве другие компоненты костной ткани, отвечает за форму закладывающегося костного органа. В процессе физиологической и репаративной регенерации, коллаген служит субстратом

прикрепления циркулирующих камбиальных клеточных элементов, привлекаемых в участки регенерации хемотаксическими факторами [Sampath, 1993]. Он обеспечивает не только достаточный пул клеток, способных дифференцироваться в остеогенные, но и направленный биосинтез тканеспецифического минерализующегося МКМ [Mardon, 1997].

Протеогдиканы (ПГ) - это класс макромолекул с молекулярной массой 70-80 кДа, состоящие из стержневого белка, с которыми ковалентно связаны цепи ГАГ. Этот конгломерат образует в соединительной ткани волокнисто-подобную матрицу. ПГ содержат в своём составе (за исключением кератансульфата) L - глюкуроновую кислоту, на поверхности, которой прикрепляются связывающие протеины, обычно через О-гликозидную связь с сериновыми остатками в белке. От них в разные стороны отходят многочисленные цепи центральных белков. В свою очередь к центральным белкам присоединяются олигосахариды, кератансульфаты, ГАГ и различные ростовые факторы, образующие многомерную структуру [Зиненко, 1994].

Протеогликановый компонент матрикса обеспечивает такие свойства костной ткани, как «обратимая деформация». Благодаря своим полианионным характеристикам, ПГ ответственны за гидратацию матрикса и, таким образом, за прочность на сжатие, способность деформироваться и преодолевать деформации, восстанавливать свое гидратированное состояние [Reddi, 1994].

ПГ связываются с коллагеном через ГАГ и могут участвовать в регулировании диаметра соединительнотканных фибрилл.

Гликозаминогликаны (ГАГ) - мукополисахариды, построенные из повторяющихся дисахаридных единиц, одна из которых уроновая кислота, а другая аминосахар (N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин). Повторяющиеся дисахаридные субъединицы: хондроитин, дерматан, кератан, гепаран. ГАГ подразделяют на две группы - несульфатированные (гиалуроновая кислота, хондроитин) и сульфатированные (гепаран сульфат, дерматансульфат, кератан сульфат).

Все ГАГ при нейтральных значениях pH электростатически связываются с коллагеном. Наличие большого числа анионных групп у гликозамингликанов определяет высокую кальций-связывающую способность [Юшков, 1994].

Остеонектин - гликопротеин, с молекулярной массой 32 кД, осуществляет свою функцию через домены для связывания Са2+. Служит в костной ткани для связи

кристаллов фосфатов кальция с коллагеном типа I. Кроме того, остеокальцин участвует вместе с коллагеном в регулировании процессов осаждения Са2+ и Р043" из растворов в костной ткани [Дерхо, 2004].

Костные морфогенетические белки (Bone Morphogenetic Proteins, BMP) -цитокины, принадлежат к суперсемейству трансформирующих ростовых факторов р (transforming growth factor-p, TGF-(3). Согласно результатам современных исследований костные морфогенетические белки являются самыми важными факторами регенерации кости и хряща. Они действуют на трансмембранные рецепторы и играют значительную роль в регулировании роста, дифферецировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, нервные и эпителиальные клетки [Urist, 1965; Reddi, 2001а]. Опыты на животных и широкое клиническое применение продемонстрировали эффективность BMP в качестве активного стимулятора остеогенеза, по своему регенераторному потенциалу равному или превосходящего аутологичный костный материал (см. раздел 2.7).

К настоящему времени идентифицировано 20 видов BMP. Наиболее изученными, применительно к регенерации кости и хряща, являются ВМР-2 и ВМР-7, однако есть сообщения об активном участии в остеогенезе и хондрогенезе других видов BMP (табл. 1). [Cheng, 2003; Bessa, 2008а].

Таблица 1. BMP, принадлежащие к суперсемейству TGF-p и их основные физиологические

роли.

Белок Номенклатура Основные физиологические функции Литература

Костные морфогенетические белки

ВМР-2 ВМР-2а Морфогенез кости и хряща, формирование сердца [Wang, 1990; Kang, 2004; Callis, 20051

ВМР-3 Остеогенин Негативный регулятор костного морфогенеза [Hiño, 2004]

ВМР-ЗЬ GDF-10 Негативный регулятор костного морфогенеза [Hiño, 2004]

ВМР-4 ВМР-2Ь Морфогенез кости и хряща, формирование почек [Luyten, 1994; Oxburgh, 20051

ВМР-5 - Развитие конечностей, костный морфогенез [Cho, 2002; Zuzarte-Luis, 2004]

ВМР-6 Vrgl, Dvr6 Гипертрофия хряща, костный морфогенез [Rickard,1998; Kang, 2004]

ВМР-7 ОР-1 Морфогенез кости и хряща, формирование почек [Reddi, 1998; Kang, 20041

ВМР-8 ОР-2 Костный морфогенез, сперматогенез [Ozkaynak, 1992; Cho, 2002]

ВМР-9 GDF-2 Костный морфогенез, развитие холинергических нейронов, метаболизм глюкозы [Chen, 2003; Kang, 2004]

ВМР-11 GDF-11 Формирование осевого скелета, развитие глаза, поджелудочной железы, формирование почек [Esquela, 2003; Harmon, 2004; Kim, 2005; Andersson, 20061

Хрящевые морфогенетические белки

BMP-12 CDMP-3, GDF-7 Развитие связок и сухожилий, развитие сенсорных нейронов [Reddi, 2003; Lo, 2005]

ВМР-13 CDMP-2, GDF-6 Развитие и гипертрофия хряща [Reddi, 2003]

BMP-14 CDMP-1, GDF-5 Хондрогенез, ангиогенез [Reddi, 2003; Zeng, 2007]

Другие

ВМР-8Ь OP-3 Сперматогенез [Zhao, 1996]

ВМР-10 - Морфогенез сердца [Chen, 2004]

ВМР-15 GDF-9b Физиология яичников [Knight, 2006]

ВМР-16 Nodal Формирование эмбриона [Celeste, 1999]

BMP-17 Lefty Формирование эмбриона [Celeste, 2000]

BMP-18 Lefty Формирование эмбриона [Celeste, 2000]

BMP обладают значительным структурным сходством: полипептидная цепь содержит около 110 аминокислотных остатков, и характеризуется консервативностью, в частности, содержит семь остатков цистеина, присутствующих у всех членов семейства. BMP - это димерные белки (Рис. 1.4). Димерные формы BMP образуются за счет дисульфидных связей, причем нарушение этих связей приводит к разрушению димера и потере биологической активности [Reddi, 2001а].

Белки BMP синтезируются в виде больших молекул - предшественников. После димеризации эти белки подвергаются расщеплению в сайте Arg-X-X-Arg с образованием зрелого димера. При этом цепи димера скреплены дисульфидными связями. Димеризация является необходимым условием для функционирования BMP [Granjeiro, 2005].

Рис. 1.4. Пространственная структура димера белка ВМР-2. Синим и красным цветами выделены разные мономеры белка, желтым показан дисульфидный мостик, стабилизирующий димер. (Protein Data Bank, code 1REW).

BMP обладают следующими основными функциями:

• участвуют в хондрогенезе и остеогенезе, стимулируют образование костной ткани;

• индуцируют образование костной ткани в последовательности подобной эмбриональному морфогенезу;

• способствуют дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты;

• привлекают мезенхимальные стволовые клетки к местам повреждения (хемотаксис);

• стимулируют синтез коллагена, индуцируют синтез щелочной фосфатазы, синтез остеокальцина, остеопонтина, остеонектина и др;

• стимулируют синтез ангиогенных факторов роста;

• взаимодействуют с рецепторами на мембране клеток мишеней;

• образуют комплексы с внеклеточными матричными белками, с последующей фиксацией BMP во внеклеточном матриксе;

• контактируют с внеклеточными белками-антагонистами (ноггин, хордин), что приводит к ингибированию активности BMP [Reddi, 2000; Reddi, 2001b].

Участвуя в хондрогенезе и остеогенезе, BMP стимулируют костеобразование по механизму непрямого остеогенеза (более подробно см. раздел 1.4.1). Остеогенез с

помощью BMP — это последовательный каскад событий со следующими главными фазами:

• хемотаксис;

• быстрое деление мезенхимальных остеопрогениторных клеток;

• дифференцировка МСК в хондробласты и формирование хряща;

• ангиогенез и синтез внеклеточного матрикса;

• замена хрящевой ткани на костную [Reddi, 1998; Reddi, 2001b].

На сигналы BMP могут отвечать клетки-мишени: плюрипотентные мезенхимальные стволовые клетки (МСК), остеобласты, миобласты, фибробласты, нервные клетки; при этом наблюдается индукция синтеза белков-маркеров метаболизма кости - щелочной фосфатазы, остеокальцина, остеопонина, остеонектина.

Рецепторами BMP являются трансмембранные серин/треониновые киназы. Существует 2 типа рецептов BMP: тип I и тип II (BMPR-I, BMPR-II). Взаимодействие белков BMP с рецепторами обоих типов приводит к активации рецепторов путем автофосфорилирования (Рис. 1.5). Тогда эти белки становятся способны к активации белков SMAD путем фосфорилирования. Белки SMAD являются семейством сигнальных белков позвоночных, гомологичных MAD-белкам дрозофил и SMA-белкам нематод. Активированные белки SMAD регулируют транскрипцию генов [Granjeiro, 2005; Weber, 2007].

Все типы клеток, участвующие в процессе костеобразования, являются клетками-мишенями для BMP. В пределах скелета клетки-мишени BMP расположены в перихондриуме, периостиуме, пластинах роста, суставном хряще [Jeppsson, 2003].

Взаимодействие BMP с рецепторами на мембране клеток-мишеней может тормозиться внеклеточными белками-антагонистами (ноггин, хордин), которые связывают BMP и предотвращают их последующую активность. Этот механизм, возможно, является защитной реакцией организма против чрезмерной активности BMP при остеогенезе. Опыты с трансгенными мышами показали, что специально выведенные линии с высоким уровнем синтеза антагониста BMP ноггина демонстрируют выраженную остеопению в костях скелета. Также была получена линия мышей нокаутных по гену BMP-2, при этом животные погибали еще на стадии развития зародыша [Kwong, 2009; Potier, 2007; Tsumaki, 2002].

В MPs

1 f N. 1-Ион ии, хордии

Цитоплазма (р} WPJ is) | BMPR-I

Smad 1. 5

1 BMPR-11

Smad 4

Smad 6. 7

Рис. 1.5. BMP-опосредованная регуляция транскрипции в клетке. Образование комплекса BMP с рецепторами обоих типов запускает активацию белков SMAD (сигнальные медиаторы BMP рецепторов), которые проникают в ядро и регулируют транскрипцию соответствующих генов [Granjeiro, 2005].

Основное место локализации BMP - внеклеточный соединительно-тканный матрикс, содержащий остеопрогениторные и мезенхимальные клетки [Kawakami, 2001]. Помимо тканей скелета, высокие уровни BMP отмечены в простате и плаценте [Paralkar, 1998], также эти белки сконцентрированы в периодонтальных волокнистых структурах и пульпе зуба.

BMP устойчивы к температурному воздействию до 65°С, к действию 2 М соляной кислоты, 6 М мочевины и 4 М гуанидинхлорида, инактивируются трипсином, но устойчивы к действию коллагеназ, что используется при биохимической экстракции из костного матрикса. Также можно отметить высокую степень сродства BMP к гепарину и его миметикам [Reddi, 2001а].

Остеокалъцин - полипептид (5,8 кД), состоящий из одной цепи 46-50 аминокислот, синтезируется остеобластами. 75% связывается с минеральной частью костного матрикса, остальное количество находится в крови, почках, печени и других органах. Полипептид имеет высокое сродство к кальцию и ГАП. Считается, что остеокальцин является хемоаттрактантом для остеокластов и их предшественников [Ingram, 1994].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Громов, Александр Викторович, 2013 год

Список литературы

1. Альберте, Б. Молекулярная биология клетки / Б. Альберте, Д. Брейд, Дж. Льюис. -М.: Мир, 1994. - Т.З. - 504 с.

2. Берченко, Г.Н. Костные трансплантанты в стоматологии и ортопедии / Г.Н. Берченко // Биоматериалы. - 2008. - №9. - С.4-5.

3. Булатов, A.A. Деминерализованные костные трансплантаты и индукционный остеогенез / A.A. Булатов // Травматология и ортопедия. - 2005. - №2(35). - С.53-59.

4. Быков, В.Л. Цитология и общая гистология / В.Л. Быков. - СПб: Сотис. - Учебник для ВУЗов. - 2002. - С.358-392.

5. Вавилова, Т.П. Биохимия тканей и жидкостей полости рта: учебное пособие / Т.П. Вавилова. - М.: 2-е изд., испр. и доп., 2008. - 250 с.

6. Григорян, A.C. Проблемы интеграции имплантатов в костную ткань (теоретические аспекты) / A.C. Григорян. - М.: Техносфера, 2007. - 128 с.

7. Гюнтер, В.Э. Никелид титана. Медицинский материал нового поколения / В.Э. Гюнтер, В.Н. Ходоренко, Ю.Ф. Ясенчук. - Томск: МИЦ, 2006. - 296 с.

8. Дерхо, М.А. Динамика биохимических показателей в ходе остеогенеза после травмы различных костей скелета у собак / М.А. Дерхо, К.С. Десятниченко. - М.: ФГОУ ВПО «МГАВМиБ им. К.И. Скрябина. - 2004. - С. 19-24.

9. Донченко, C.B. Первый опыт применения остеопластических материалов нового поколения, содержащих рекомбинантные человеческие костные морфогенетические белки (rhBMPs), при дефектах и посттравматической патологии костной ткани / C.B. Донченко, A.C. Карягина, Д.В. Алексеев и др. // Московский медицинский журнал. - 2012. - №4. - С. 16-21.

10. Дробышев, А.Ю. Применение различных методов увеличения параметров альвеолярного отростка нижней челюсти / А.Ю. Дробышев, A.A. Киселёв // Современные проблемы имплантологии. — 2004. - С. 160-161.

11. Зиненко, Т.Н. Глюкозамин в физиологической регенерации суставного хряща / Т.Н. Зиненко // Ортопед, и травматол. - 1994. - № 4. - С.76.

12. Касавина Б.С. Минеральные ресурсы организма / B.C. Касавина, В.П. Торбенко. -М.: Наука, 1975. - 197 с.

13. Коваленко, П.П. Основы трансплантологии / П.П. Коваленко. - Ростов на Дону, 1975.-180 с.

14. Кораго, A.A. Введение в биоминералогию / A.A. Кораго. - СПб., 1992. - 286 с.

15. Коржевский, Д. Э. Основы гистологической техники / Д.Э. Коржевский, A.B. Гиляров. - СПб.: СпецЛит, 2010. - 95 с.

16. Корнилов, Н.В. Адаптационные процессы в органах скелета / Н.В. Корнилов, A.C. Аврунин. - СПб.: Морсар AB, 2001. - 296 с.

17. Кулаков, A.A. Использование аутокостных трансплантатов с целью увеличения альвеолярных отростков и замещению костных дефектов челюстей при дентальной имплантации / A.A. Кулаков, A.C. Караян, В.М. Королев // Стоматология. - 2007. -№2 - С.27-29.

18. Курепина, М. М. Анатомия человека: учебник для вузов / М.М. Курепина, А.П. Ожигова, A.A. Никитина. -М.: Владос, 2003. 384 с.

19. Лекишвили, М.В. Новые биопластические материалы в реконструктивной хирургии / М.В. Лекишвили, А.Ф. Панасюк // Вестник РАМН. - 2008. - N«9. - С.ЗЗ-36.

20. Лысенок, Л. Н. Биоматериаловедение: вклад в прогресс современных медицинских технологий / Л.Н. Лысенок // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2005. - №2. - С.56-61

21. Минченко, Б.И. Биохимические показатели метаболических нарушений в костной ткани / Б.И. Минченко, Д.С. Беневоленский, P.C. Тишенина P.C. // Клин. лаб. диагностика. - 1999. -№ 4. - С. 11-17.

22. Омельянченко, Н.П. Регенерация костной ткани / Н.П. Омельянченко, Г.А. Илизаров, В.И. Стецулла // Травматология и ортопедия. Руководство для врачей, М.: Медицина, 1997. - С.393-482.

23. Рубштейн, А.П. Способ оценки прочности на разрыв системы кость-имплантат в условиях остеоинтеграции / А.П. Рубштейн, И.Ш. Трахтенберг, Э.Б. Макарова и др. // Патент 2471248 С1. - ИФН УрО РАН, ФГУ «УНИИИТО им. В.Д. Чаклина Минздравсоцразвития». - 2012а.

24. Рубштейн, А.П. Биоимплантаты на основе пористого титана с алмазоподобными пленками для замещения костной ткани // А.П. Рубштейн, Э.Б. Макарова, И.Ш. Трахтенберг. - Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2012b. 137 с.

25. Савельев, В.И. Получение и сохранение деминерализованной костной ткани для клинического применения / В.И. Савельев // Деминерализованные костные трансплантаты и их использование в восстановительной хирургии / Савельев В.И. -СПб., 1996, с. 3-12.

26. Сапин, М.Р. Анатомия человека / М.Р. Сапин. М: Медицина, 2001. - с.64-65, 100104.

27. Слуцкий, Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани / Л.И. Слуцкий. - Л.: Медицина, 1969. 375 с.

28. Слуцкий, Л.И. Органический матрикс кости: новые биохимические данные / Л.И. Слуцкий, Н.А. Севастьянова // Ортопед, травматол. - 1986. - №8. - С.82-87.

29. Торбенко, В.П. Функциональная биохимия костной ткани / В.П. Торбенко, Б.С. Касавина. - М.: Медицина, 1977. - 272 с.

30. Федорова, М.З. Зависимость остеоиндуктивных свойств биокомпозитного материала от физико-химических характеристик покрытия / М.З. Федорова, Ю.Р. Колобов, М.Б. Иванов и др. // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2009. - Т.148. - №11. -С.576-579.

31. Щараев, П.Н. Диагностическое значение анализа показателей обмена коллагена / П.Н. Щараев, Н.С. Стрелков, Ж.С. Афсари // Клин, лаб. диагностика. - 1997. - № 6. -С.48.

32. Юшков, В.Г. Гликопротеины и гемопоэз / В.Г. Юшков, Г.К. Попов, М.В. Севергин. -Екатеринбург, 1994. - 124 с.

33. Accorsi-Mendonca, Т. Physicochemical characterization of two deproteinized bovine xenografts. / T. Accorsi-Mendonca, M.B. Conz, T.C. Barros et al. // Braz. Oral. Res. -2008. - N22. - P.5-10.

34. Aebli, N. Effects of bone morphogenetic protein-2 and hyaluronic acid on the osseointegration of hydroxyapatite-coated implants: an experimental study in sheep / N. Aebli, H. Stich, P. Schawalder et al. // J. Biomed. Mater. Res. A. - 2005. - N.73. -P.295-302.

35. Albrektsson, T. Principles of osseointegration. / T. Albrektsson // Dental and maxillofacial implantology / Hobkirk J.A., Watson K. London: Mosby-Wolfe. - 2005. -P.9-19.

36. Barzel, U.S. Acid-base balance in disorders of calcium metabolism / U.S. Barzel // N. Y. State J. Med. - 1976. - N.76. - P.234-237.

37. Bauer, T.W. Bone graft materials / T.W. Bauer, G.F. Muschler // Clin. Orthop. - 2000. -N.371. - P.10-27

38. Becker, W. The comparison of demineralized freeze-dried bone and autologous bone to induce bone formation in human extraction sockets / W. Becker, B. Becker, R. Caffesse // J. Periodont. - 1994. - N.65. - P.1128-1133

39. Bessa, P.C. Bone morphogenetic proteins in tissue engineering: the road from laboratory to clinic, part II (BMP delivery) / P.C. Bessa, M. Casal, R.L. Reis // J. Tissue Eng. Regen. Med. - 2008a. - N.2(1). - P.l-13.

40. Bessa, P.C. Bone morphogenetic proteins in tissue engineering: the road from laboratory to clinic, part II (BMP delivery) / P.C. Bessa, M. Casal, R.L. Reis // J. Tissue Eng. Regen. Med. - 2008b. - N.2(2-3). - P.81-96.

41. Bessho, K. Bone induction by Escherichia coli -derived recombinant human bone morphogenetic protein-2 compared with Chinese hamster ovary cell-derived recombinant human bone morphogenetic protein-2. / K. Bessho, Y. Konishi, S. Kaihara et al.// Br. J. Oral. Maxillofac. Surg. - 2000. - N.38(6). - P.645-649.

42. Bhatt, R.A. Bone graft substitutes / R.A. Bhatt, T.D. Rozental // Hand Clin. - 2012. -N.28(4). - P.457-468.

43. Bilic, R. Osteogenic protein-1 (BMP-7) accelerates healing of scaphoid non-union with proximal pole sclerosis / R. Bilic, P. Simic, M. Jelic et al. // Int. Orthop. - 2006. - N.30. -P.128-134.

44. Blum B. Measurement of bone morphogenetic proteins and other growth factors in demineralized bone matrix / B. Blum, J. Moseley, L. Miller et al // Orthopedics. - 2004. -N.27(1). - P.161-165.

45. Bohner, M. Calcium orthophosphates in medicine: from ceramics to calcium phosphate cements / M. Bohner // Injury. - 2000. - N.31. - P.37-47.

46. Boyce, T. Allograft bone. The influence of processing on safety and performance / T. Boyce, J. Edwards, N. Scarborough // Orthop. Clin. North Am. - 1999. - N.30(4). -P.571-581.

47. Bradford, M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. - 1976. - N.72. - P.248-254.

48. Bruckner, P. Structure and function of cartilage collagens / P. Bruckner, M. Rest // Microcopy. -1994. - N.28. - P.378.

49. Buckwalter, J.A. Bone biology. II: Formation, form, modeling, remodeling and regulation of cell function / J.A. Buckwalter, M.J. Glimcher, R.R. Cooper et al. // J. Bone Joint Surg. Am. - 1995. - N.77. - P.1276-1289.

50. Burkus, J.K. Use of rhBMP-2 in combination with structural cortical allografts: clinical and radiographic outcomes in anterior lumbar spinal surgery / J.K. Burkus, H.S. Sandhu, M.F. Gornet et al. // J. Bone Jt. Surg. - 2005. - N.87(6). - P.1205-1212.

51. Callis, T.E. Bone morphogenetic protein signaling modulates myocardin transactivation of cardiac genes. / T.E. Callis, D. Cao, D.Z. Wang // Circ. Res. - 2005. - N.97. - P.992-1000.

52. Calori, G.M. The use of bone-graft substitutes in large bone defects: any specific needs? / G.M. Calori, E. Mazza, M. Colombo // Injury. - 2011. -N.42(2). - P.56-63.

53. Carson, J.S. Synthetic bone scaffolds and fracture repair / J.S. Carson, M.P. Bostrom // Injury. - 2007. - N.38(1). - P.33-37.

54. Celeste, A.J. Bone morphogenetic protein (BMP)-17 and BMP-18 compositions. / A.J. Celeste, B.L. Murray // US Patent No. 6027917. - 2000.

55. Celeste, A.J. Nucleic acids encoding bone morphogenic protein-16 (BMP-16) / A.J. Celeste, B.L. Murray // US Patent No. 596503. -1999.

56. Chen, C. An integrated functional genomics screening program reveals a role for BMP-9 in glucose homeostasis / C. Chen, K.J. Grzegorzewski, S. Barash et al. // Nat. Biotechnol. - 2003. - N.21. - P.294-301.

57. Cheng, H. Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenetic proteins (BMPs) / H. Cheng, W. Jiang, F.M. Phillips et al. // J. Bone Joint Surg. Am. -2003. - N.85-A. - P.1544-1552.

58. Cho, T.J. Differential temporal expression of members of the transforming growth factor beta superfamily during murine fracture healing. / T.J. Cho, L.C. Gerstenfeld, T.A. Einhorn // J. Bone Miner. Res. 2002. - N.17. - P.513-520.

59. Cricchio, G. Donor site morbidity in two different approaches to anterior iliac crest bone harvesting / G. Cricchio, S. Lundgren // Clin. Implant. Dent. Relat. Res. - 2003. - N.5. -P.61-69.

60. Dutta Roy, T. Performance of hydroxyapatite bone repair scaffolds created via three-dimensional fabrication techniques / T. Dutta Roy, J.L. Simon, J.L. Ricci et al. // J. Biomed. Mater. Res. A. - 2003. - N.67. - P.1228-1237.

61. Eckardt, H. Recombinant human bone morphogenetic protein 2 enhances bone healing in an experimental model of fractures at risk of non-union / H. Eckardt, K.S. Christensen, M. Lind et al. // Injury. - 2005. - N.36. - P.489-494.

62. Esquela, A.F. Regulation of metanephric kidney development by growth/differentiation factor 11 / A.F. Esquela, S.J. Lee // Dev. Biol. - 2003. - N.257. - P.356-370.

63. Faulker, W.R. Selected methods for the small clinical chemistry laboratory / W.R. Faulker, S. Meites // Washington, D.C. - 1982. - P.125.

64. Frame, J.W. Porous calcium sulfate dehydrate as a biodegradable implant in bone / J.W. Frame // J. Dent. - 1975. - N.3. - P.177-187.

65. Friedlaender, G.E. Osteogenic protein 1 (bone morphogenic protein-7) in the treatment of tibial non-unions / G.E. Friedlaender, C.R. Perry, J.D. Cole et al. // J. Bone Jt. Surg. -2001. - N.83A. - P.151-158.

66. Fukuroku, J. Extracortical bone-bridging fixation with use of cortical allograft and recombinant human osteogenic protein-1 / J. Fukuroku, N. Inoue, B. Rafiee et al. // J. Bone Jt. Surg. - 2007. - N.89A(7). - P.1486-1496.

67. Gao, T. Effect of molecular weight of thermoreversible polymer on in vivo retention of rhBMP-2 / T. Gao, H. Uludag // J. Biomed. Mater. Res. - 2001. - N.57. - P.92-100.

68. Gautschi, O.P. Bone morphogenetic proteins in clinical applications / O.P. Gautschi, S.P. Frey, R. Zellweger // J. Surg. - 2007. - N.77. - P.626-631.

69. Geiger M. Collagen sponges for bone regeneration with rhBMP-2 / M. Geiger, R.H. Li, W. Friess // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2003. - N.55. - P.1613-1629.

70. Getty, P.J. Complications and functional outcomes of reconstruction with an osteoarticular allograft after intra-articular resection of the proximal aspect of the humerus / P.J. Getty, T.D. Peabody // J. Bone Joint Surg. Am. - 1999. - N.81(8). -P.1138-1146.

71. Glantz, P.O. Definitions in biomaterials / P.O. Glantz // Progress in biomedical engineering, vol 4. / Williams D.F. Amsterdam: Elsevier. -1987. - P.24.

72. Glowacki, J. A review of osteoinductive testing methods and sterilization processes for demineralized bone / J. Glowacki // Cell Tissue Bank. - 2005. - N.6. - P.3-12.

73. Goldberg, V.M. Biology of Autografts and Allografts / V.M. Goldberg, S. Stevenson, J.W. Shaffer // Bone and Cartilage Allografts / Friedlaender G.E. and Goldberg V.M. Park Ridge, IL: American Academy of Orthopaedic Surgeons. - 1991. - P.3-11.

74. Gomes, M.E. Methodologies for processing biodegradable and natural origin scaffolds for bone and cartilage tissue-engineering applications / M.E. Gomes, P.B. Malafaya, R.L. Reis. // Methods Mol. Biol. - 2004. N.238. - P.65-76.

75. Govender, S. The BMP-2 evaluation in surgery for tibial trauma (BESTT) study group. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 for treatment of open tibial fractures: a prospective, controlled, randomized study of 450 patients / S. Govender, C. Csimma, H.K. Genant // J. Bone Jt. Surg. - 2002. - N.84A. - P.2123-2134.

76. Granjeiro, J.M. Bone morphogenetic proteins: from structure to clinical use / J.M. Granjeiro // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. - 2005. - P. 14631473.

77. Grayson, A.C. Differential degradation rates in vivo and in vitro of biocompatible poly(lactic acid) and poly(glycolic acid) homo- and co-polymers for a polymeric drug-delivery microchip / A.C. Grayson, G. Voskerician, A. Lynn et al. // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. - 2004. - N.15. - P.1281-1304.

78. Gruskin, E. Demineralized bone matrix in bone repair: history and use / E. Gruskin, B.A. Doll, F.W. Futrell et al. // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2012. -N.64(12). - P.1063-1077.

79. Gupta, D. Osteoinductivity of partially decalcified alloimplants in healing of large osteoperiosteal defects / D. Gupta, S.M. Tuli // Acta Orthop. Scand. - 1982 - N.53. -P.857-865.

80. Haid, R.W. Posterior lumbar interbody fusion using recombinant human bone morphogenetic protein type 2 with cylindrical interbody cages / R.W. Haid, C.L. Branch Jr., J.T. Alexander et al. // Spine J. - 2004. - N.4. - P.527-539.

81. Hallfeldt, K.K. The effect of various sterilization procedures on the osteoinductive properties of demineralized bone matrix / K.K. Hallfeldt, S. Kessler, M. Puhlmann et al. // Unfallchirurg. - 1992. - N.95. - P.313-318.

82. Han, D.K. Effect of a fibrin-fibronectin sealing system as a carrier for recombinant human bone morphogenetic protein-4 on bone formation in rat calvarial defects / D.K. Han, C.S. Kim, U.W. Jung et al. // J. Periodontol. - 2005. - N.76. - P.2216-2222.

83. Harmon, E.B. GDF11 modulates NGN3+ islet progenitor cell number and promotes ß cell differentiation in pancreas development / E.B. Harmon, A.A. Apelqvist, N.G. Smart et al. // Development. - 2004. - N.131. - P.6163-6174.

84. Hartigan, B.J. Use of bone graft substitutes and bioactive materials in treatment of distal radius fractures / B.J. Hartigan, M.S. Cohen // Hand. Clin. - 2005. - N.21. - P.449-454.

85. Hench, L.L. Bioactive Bone Substitutes / L.L. Hench // Bone Grafts and Bone Graft Substitutes / Habal M.B., Reddi A.H. Philadelphia: WB Saunders. - 1992. - P.263-275.

86. Hill, C. Development of the BAP Tandem-R assay for the specific detection of bone alkaline phosphatase in human serum / C. Hill, M. Cerrito, E. Grafstein et al. // Clin. Chem. - 1991. - N.37. - P.1019.

87. Hino, J. Bone morphogenetic protein-3 family members and their biological functions / J. Hino, K. Kangawa, H. Matsuo et al. // Front. Biosci. - 2004. - N.9. - P.1520-1529.

88. Hinz, P. A new resorbable bone void filler in trauma: early clinical experience and histologic evaluation / P. Hinz, E. Wolf, G. Schwesinger et al. // Orthopedics. - 2002. -N.25. - P.597-600.

89. Hong, S.J. The effect of a fibrin-fibronectin/ß-tricalcium phosphate/recombinant human bone morphogenetic protein-2 system on bone formation in rat calvarial defects / S.J. Hong, C.S. Kim, D.K. Han et al. // Biomaterials. - 2006. - N.27. - P.3810-3816.

90. Honsawek, S. Extractable bone morphogenetic protein and correlation with induced new bone formation in an in vivo assay in the athymic mouse model. / S. Honsawek, R.M. Powers, L. Wolfinbarger // Cell Tissue Bank - 2005. - N.6. - P.13-23.

91. Howard, B.K. Osteoinduction using bone morphogenic protein in irradiated tissue / B.K. Howard, K.R. Brown, J.L. Leach et al. // Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. - 1998. -N.124. - P.985-988.

92. Hu, Y. The effects of microwave heating on osteoinduction of demineralized bone matrix in rabbits / Y. Hu, J. Wang, S. Lu // Zhonghua Wai Ke Za Zhi. - 1997. - N.35. - P.564-567.

93. Hu, Z.M. The osteoinductive activity of bone morphogenetic protein (BMP) purified by repeated extracts of bovine bone / Z.M. Hu, S.A. Peel, G.K. Sandor et al. // Growth Factors. - 2004. - N.22(1). - p.29-33.

94. Hubbell, J. Matrix-bound growth factors in tissue repair / J. Hubbell // Swiss Med. Wkly.

- 2006. - N.136. - P.387-391.

95. Hunt, D.R. Hyaluronan supports recombinant human bone morphogenetic protein-2 induced bone reconstruction of advanced alveolar ridge defects in dogs. A pilot study. / D.R. Hunt, S.A. Jovanovic, U.M. Wikesjo et al. // J. Periodontol. - 2001. - N.72. -P.651-658.

96. Ingram, R.T. Age-and gtnder-related changes in the distribution of osteocalcin in the extracellular matrix of normal male and female bone / R.T. Ingram, Y.K. Park, B.L. Clarke // J. Clin. Invest. - 1994. - N.94. - P.35-41.

97. Isa, Z.M. Dental Implants: Biomaterial, Biomechanical And Biological Considerations / Z.M. Isa, J.A. Hobkirk // Annals of Dentistry. - 2000. - N.7(1). - P.27-35.

98. Israel, D.I. Expression and characterization of bone morphogenetic protein 92 in Chinese hamster ovary cells / D.I. Israel, J. Nove, K.M. Kerns et al. // Growth Factors. - 1992. -N.7. - P.139-150.

99. Iwata, H. Demineralized bone matrix and native bone morphogenetic protein in orthopaedic surgery / H. Iwata, S. Sakano, T. Itoh et al. // Clin. Orthop. Relat. Res. -2002. - N.395. - P.99-109.

100. Janicki, P. What should be the characteristics of the ideal bone graft substitute? Combining scaffolds with growth factors and/or stem cells. / P. Janicki, G. Schmidmaier // Injury. - 2011. - N.42(2). - P.77-81.

101. Jeon, O. Enhancement of ectopic bone formation by bone morphogenetic protein-2 released from a heparin-conjugated poly(L-lactic-co-glycolic acid) scaffold / O. Jeon, S.J. Song, S.W. Kang et al. // Biomaterials. - 2007. - N.28. - P.2763-2771.

102. Jeppsson, C. A combination of bisphosphonate and BMP additives in impacted bone allografts / C. Jeppsson, J. Astrand, M. Tagil et al. // Acta Orthop. Scand. - 2003. - N.74.

- P.483-489.

103. Johnsson, R. Randomized ra-diostereometric study comparing osteogenic protein-1 (BMP-7) and autograft bone in human noninstrumented posterolateral lumbar fusion:

Volvo Award in clinical studies / R. Johnsson, B. Stromqvist, P. Aspenberg // Spin. -2002. - N.27. - P.2654-2661.

104. Jones, A.A. The effect of rhBMP-2 around endosseous implants with and without membranes in the canine model / A.A. Jones, D. Buser, R. Schenk et al. // J. Periodontol. - 2006. - N.77. - P. 1184-1193.

105. Joshi, A. An investigation of post-operative morbidity following chin graft surgery / A. Joshi // Br. Dent. J. - 2004. - N.28. - P.215-218.

106. Kakiuchi, M. The relative clinical efficacy of surface-decalcified and wholly decalcified bone alloimplants / M. Kakiuchi, K. Ono // Int. Orthop. - 1987. - N.ll. - P.89-94.

107. Kang, Q. Characterization of the distinct orthotopic bone-forming activity of 14 BMPs using recombinant adenovirus-mediated gene delivery / Q. Kang, M.H. Sun, H. Cheng et al. // Gene Ther. - 2004. - N.ll. - P.1312-1320.

108. Karageorgiou, V. Porous silk fibroin 3D scaffolds for delivery of bone morphogenetic protein-2 in vitro and in vivo / V. Karageorgiou, M. Tomkins, R. Fajardo et al. // J. Biomed. Mater. Res. A. - 2006. - N.78. - P.324-334.

109. Kawakami, T. Characteristics of bone morphogenetic protein-induced chondroid bone: histochemical, immunohistochemical and in situ hybridization examinations / T. Kawakami, T. Kawai, A. Kimura et al. // J. Int. Med. Res. - 2001. - N.29(6). - P.480-487.

110. Kim, H.D. Retention and activity of BMP-2 in hyaluronic acid-based scaffolds in vitro / H.D. Kim, R.F. Valentini // J. Biomed. Mater. Res. - 2002. - N.59. - P.573-584.

111. Kirker-Head, C. BMP-silk composite matrices heal critically sized femoral defects / C. Kirker-Head, V. Karageorgiou, S. Hofmann et al. // Bone. - 2007. - N.41. - P.247-255.

112. Klein, L. Bone mass and comparative rates of bone resorption and formation of fibular autografts: comparison of vascular and nonvascular grafts in dogs / L. Klein, S. Stevenson, J.W. Shaffer et al. // Bone. 1991. - N.12(5). - P.323-329.

113. Kneser, U. Evaluation of processed bovine cancellous bone matrix seeded with syngenic osteoblasts in a critical size calvarial defect rat model / U. Kneser, L. Stangenberg, J. Ohnolz et al. // J. Cell Mol. - 2006. - N.10. - P.695-707.

114. Knight, P.G. TGF-P superfamily members and ovarian follicle development / P.G. Knight, C. Glister // Reproduction. - 2006. - N.132. - P.191-206.

115. Kokubo, S. Bone regeneration by recombinant human bone morphogenetic protein-2 and a novel biodegradable carrier in a rabbit ulnar defect model / S. Kokubo, R. Fujimoto, S. Yokota et al. // Biomaterials. - 2003. - N.24. - P.1643-1651.

116. Kubler, N.R. Inductive properties of recombinant human BMP-2 produced in a bacterial expression system / N.R. Kubler, J.F. Reuther, G. Faller et al.// Int. J. Oral Maxillofac. Surg. - 1998. - N.27. - P.305-309.

117. Kuboki, Y. BMP-induced osteogenesis on the surface of hydroxyapatite with geometrically feasible and nonfeasible structures: topology of osteogenesis / Y. Kuboki, H. Takita, D. Kobayashi et al. // J. Biomed. Mater. Res. -1998. - N.39. - P. 190-199.

118. Kühne, J.H. Bone formation in coralline hydroxyapatite. Effects of pore size studied in rabbits. / J.H. Kühne, R. Bartl, B. Frisch et al. // Acta Orthop. Scand. - 1994. - N.65. -P.246-252.

119. Kwong, F.N. Regional and cellular localisation of BMPs and their inhibitors' expression in human fractures / F.N. Kwong, J.A. Hoyland, C.H. Evans et al. // Int. Orthop. - 2009.

- N.33(1). - P.281-288.

120. Le Roux, P. OP-1 enhances dendritic growth from cerebral cortical nerons in vitro / P. Le Roux, S. Behar, D. Higgins et al. // Exp. Neurol. - 1999. - N.160(1). - P.151-163.

121. Lekishvili, M. Experimental and clinical study of the demineralized bone allografts manufactured in the tissue bank of CITO / M. Lekishvili, A. Snetkov, M. Vasiliev et al // Cell Tissue Bank. - 2004. - N.5. - P.231-238.

122. Lewandrowski, K.U. Vertebral osteolysis after posterior interbody lumbar fusion with recombinant human bone morphogenetic protein 2: a report of five cases / K.U. Lewandrowski, C. Nanson, R. Calderon et al. //Spine J. - 2007. - N.7(5). - P.609-614.

123. Li, H. Identification of bone morphogenetic proteins 2 and 4 in commercial demineralized freeze-dried bone allograft preparations: pilot study. / H. Li, Z. Pujic, Y. Xiao et al. // Clin. Implant. Dent. Relat. Res. - 2000. - N.2(2). - P.110-117.

124. Li, P. The role of hydrated silica, titania, and alumina in inducing apatite on implants / P. Li, C. Ohtsuki, T. Kokubo et al. // J. Biomed. Mater. Res. - 1994. - N.28(1). - P.7-15.

125. Liu, H.C. Osteogenic evaluation of glutaraldehyde crosslinked gelatin composite with fetal rat calvarial culture model / H.C. Liu, C.H. Yao, J.S. Sum et al. // Artificial Organs

- 2001. - N.25(8). - P.644-654.

126. Liu, Y. BMP-2 liberated from biomimetic implant coatings induces and sustains direct ossification in an ectopic rat model / Y. Liu, K. de Groot, E.B. Hunziker // Bone. - 2005.

- N.36. - P.745-757.

127. Lo, L. Late-emigrating neural crest cells in the roof plate are restricted to a sensory fate by GDF7 / L. Lo, E.L. Dormand, D.J. Anderson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. -N.102. - P.7192-7197.

128. Long, B. Evaluation of a novel reconstituted bone xenograft using processed bovine cancellous bone in combination with purified bovine bone morphogenetic protein / B. Long, L. Dan, L. Jian et al. // Xenotransplantation. - 2012. - N.19(2). - P.122-32.

129. Lutolf, M.P. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: engineering cell-invasion characteristics / M.P. Lutolf, J.L. Lauer-Fields, H.G. Schmoekel et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2003. - N.100. - P.5413-5418.

130. Luyten, F.P. Recombinant bone morphogenetic protein-4, transforming growth factor-beta 1, and activin A enhance the cartilage phenotype of articular chondrocytes in vitro / F.P. Luyten, P. Chen, V. Paralkar et al. // Exp. Cell. Res. - 1994. - N.210. - P.224-229.

131. Lynch, S. Tissue Engeneering. Application in Maxillofacial Surgery and Periodontics / S. Lynch, R. Marx, R. Genco // Chicago: Quintessence Publ. Co. Ink. - 1999. - P.285.

132. Maire, M. Bovine BMP osteoinductive potential enhanced by functionalized dextran-derived hydrogels / M. Maire, F. Chaubet, P. Mary et al. // Biomaterials. - 2005. - N.26.

- P.5085-5092.

133. Malafaya, P.B. Polymer based scaffolds and carriers for bioactive agents from different natural origin materials / P.B. Malafaya, M.E. Gomes, A.J. Salgado et al. // Adv. Exp. Med. Biol. - 2003. - N.534. - P.201-233.

134. Mano, J. Osteochondral defects: present situation and tissue engineering approaches / J. Mano, R.L. Reis // J. Tissue Eng. Regen. Med. - 2007. - N.l. - P.261-273.

135. Mardon, H.J. A tissue - specific protein in rat osteogenic tissue / H.J. Mardon, J.T. Triffitt // J. Bone and Mineral Res. - 1997. - N.2. - P.191-199.

136. Marks, T. Histological and radiographic comparison of allograft substitutes using a continuous delivery model in segmental defects / T. Marks, S. Wingerter, L. Franklin et al. // Biomed. Sci. Instrum. - 2007. - N.43. - P.194-199.

137. Maus, U. How to store autologous bone graft perioperatively: an in vitro study / U. Maus, S. Andereya, S. Gravius et al. // Arch. Orthop. Trauma Surg. - 2008. - N.128. - P.1007-1011.

138. McKee, M.D. The effect of human recombinant bone morphogenic protein (RHBMP-7) on the healing of open tibial shaft fractures: results of a multi-center, prospective, randomized clinical trial / M.D. McKee, E.H. Schemitsch, J.P. Waddell et al. // Toronto: Proceedings of the 18th Annual Meeting of the Orthop. Trauma Ass. - 2002. - P.157-158.

139. McKee, M.D. The treatment of long bone nonunion with rhBMP: results of a prospective pilot study / M.D. McKee, E.H. Schemitsch, J.P. Waddell et al.// San Francisco Am. Acad. Orthop. Surg. 71st. Annual meeting. - 2004. - P.242.

140. Miyamoto, S. Evaluation of polylactic acid homopolymers as carriers for bone morphogenetic protein / S. Miyamoto, K. Takaoka, T. Okada et al. // Clin. Orthop. Relat. Res. - 1992. - N. 278. - P.274-285.

141. Mummaneni, P.V. Contribution of recombinant human bone morphogenetic protein-2 to the rapid creation of interbody fusion when used in transforaminal lumbar interbody fusion: a preliminary report / P.V. Mummaneni, J. Pan, R.W. Haid et al. // J. Neurosurg. Spine. - 2004. - N.l. - P.19-23.

142. Murakami, N. Repair of a proximal femoral bone defect in dogs using a porous surfaced prosthesis in combination with recombinant BMP-2 and a synthetic polymer carrier / N. Murakami, N. Saito, J. Takahashi et al. // Biomaterials. - 2003. - N.24. - P.2153-2159.

143. Murray, S.S. A statistical model to allow the phasing out of the animal testing of demineralised bone matrix products/ S.S. Murray, E.J. Brochmann, J.O. Harker et al. // Altern. Lab. Anim. - 2007. - N.35(4). - P.405-409.

144. Nakahara, H. Culture-expanded periosteal-derived cells exhibit osteochondrogenic potential in porous calcium phosphate ceramics in vivo / H. Nakahara, V.M. Goldberg, A.I. Caplan // Clin. Orthop. Relat. Res. - 1992. - N.276. - P.291-298.

145. Niederwanger, M. Demineralized bone matrix supplied by bone bank for a carrier of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2): A substitute for autogeneic bone grafts / M. Niederwanger, M.R. Urist // J. Oral. Implantol. - 1996. -N.22. - P.210-215.

146. Noshi, T. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 potentiates the in vivo osteogenic ability of marrow/hydroxyapatite composites / T. Noshi, T. Yoshikawa, Y. Dohi et al. // Artif. Organs. - 2001. - N.25. - P. 201-208.

147. O'Connor, J.P. Animal models of heterotopic ossification / J.P. O'Connor // Clin. Orthop. Relat. Res. - 1998. - N.346. - P.71-80.

148. Oakes, D.A. An evaluation of human demineralized bone matrices in a rat femoral defect model / D.A. Oakes, B.C. Lee, J.R. Lieberman // Clin. Orthop. - 2003. - N.413. - P.281-290.

149. Oxburgh, L. BMP4 substitutes for loss of BMP7 during kidney development / L. Oxburgh, A.T. Dudley, R.E. Godin et al. // Dev. Biol. - 2005. - N.286. - P.637-646.

150. Ozkaynak, E. Osteogenic protein-2. A new member of the transforming growth factorbeta superfamily expressed early in embryogenesis. / E. Ozkaynak, P.N. Schnegelsberg, D.F. Jin et al. // J. Biol. Chem. - 1992. - N.267. - P.25220-25227.

151. Panchbhavi, V.K. Synthetic bone grafting in foot and ankle surgery / V.K. Panchbhavi // Foot Ankle Clin. - 2010. - N.15(4). - P.559-576.

152. Pape H.C. Autologous bone graft: properties and techniques / H.C. Pape, A. Evans, P. Kobbe // J. Orthop. Trauma. - 2010. - N.24(1). - P.36-40.

153. Paralkar, V. M. Cloning and characterization of a novel member of the transforming growth factor-beta/bone morphogenetic protein family / V.M.Paralkar, A.L. Vail, W.A. Grasser // J. Biol. Chem. - 1998. - N.273(22). - P.13760-13767.

154. Park, Y.J. Immobilization of bone morphogenetic protein-2 on a nanofibrous chitosan membrane for enhanced guided bone regeneration / Y.J. Park, K.H. Kim, J.Y. Lee et al. // Biotechnol. Appl. Biochem. - 2006. - N.43. - P.17-24.

155. Patel, V.V. Controlling bone morphogenetic protein diffusion and bonemorphogenetic proteinstimulated bone growth using fibrin glue // V.V. Patel, L. Zhao, P. Wong et al. // Spine. - 2006. - N.31. - P.1201-1206.

156. Patel, Z.S. Biodegradable gelatin micropaticles as delivery systems for the controlled ralase of bone morphogenetic protein-2 / Z.S. Patel, M. Yamamoto, H. Ueda et al. // Acta Bio-mater. - 2008. - N.4-5. - P. 1126-1138.

157. Pedersen, B.J. Type I collagen C-telopeptide degradation products as bone resorbtion markers / B.J. Pedersen, P. Ravn, M. Bonde // J. Clin. Ligand Assay. - 1998. - P. 18-127

158. Pekkarinen, T. Influence of ethylene oxide sterilization on the activity of native reindeer bone morphogenetic protein / T. Pekkarinen, O. Hietala, T.S. Lindholm et al. // Int. Orthop. - 2004. - N.28. - P.97-101.

159. Pietrzak, W.S. BMP depletion occurs during prolonged acid demineralization of bone: characterization and implications for graft preparation / W.S. Pietrzak, S.N. Ali, D. Chitturi et al.// Cell Tissue Bank - 2009. - N.12(2). - P.81-88.

160. Potier, E. Hypoxia affects mesenchymal stromal cell osteogenic differentiation and angiogenic factor expression / E. Potier, E. Ferreira, R. Andriamanalijaona et al. // Bone.

- 2007. - N.40. - P.1078-1087.

161. Pratt, A.B. Synthetic extracellular matrices for in situ tissue engineering / A.B. Pratt, F.E. Weber, H.G. Schmoekel et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2004. - N.86. - P.27-36.

162. Reddi, A.H. Cartilage-derived morphogenetic proteins and cartilage morphogenesis / A.H. Reddi // Microsc. Res. Technol. - 1998. - N.43. - P.131-136.

163. Reddi, A.H. Morphogenesis and tissue engineering of bone and cartilage: inductive signals, stem cells, and biomimetic biomaterials / A.H. Reddi // Tissue Eng. - 2000. -N.6(4). - P.351-359.

164. Reddi, A.H. Bone morphogenetic proteins: from basic science to clinical applications / A.H. Reddi // J. Bone Joint Surg. Am. - 2001a. - N.83-A (1). - P. 1-6.

165. Reddi, A.H. Interplay between bone morphogenetic proteins and cognate binding proteins in bone and cartilage development: noggin, chordin and DAN / A.H. Reddi // Arthritis Res. - 2001b. - N.3(1). - P. 1-5.

166. Reddi, A.H. Cartilage morphogenetic proteins: role in joint development, homoeostasis, and regeneration / A.H. Reddi // Ann. Rheum. Dis. - 2003. - N.62(2). - P.73-78.

167. Rickard, D.J. Bone morphogenetic protein-6 production in human osteoblastic cell lines. Selective regulation by oestrogen. / D.J. Rickard, L.C. Hofbauer, S.K. Bonde et al. // J. Clin. Invest. - 1998. - N.101. - P.413-422.

168. Ristiniemi, J. RhBMP-7 accelerated the healing of distal tibial fractures treated by external fixation / J. Ristiniemi, T. Flinkkila, P. Hyvonen et al. // J. Bone Jt. Surg. - 2007.

- N.89B. - P.265-272.

169. Saito, N. Biodegradable poly-D,Llactic acid-polyethylene glycol block copolymers as a BMP delivery system for inducing bone / N. Saito, T. Okada, H. Horiuchi et al. - J. Bone Joint Surg. Am. - 2001. - N.83A(1). - P.92-98.

170. Saito, N. Local bone formation by injection of recombinant human bone morphogenetic protein-2 contained in polymer carriers / N. Saito, T. Okada, H. Horiuchi et al. // Bone. -2003. - N.32. - P.381-386.

171. Saito, N. New synthetic biodegradable polymers as BMP carriers for bone tissue engineering / N. Saito, K. Takaoka // Biomaterials. - 2003. - 24(13). - 2287-2293.

172. Saito, N. Synthetic biodegradable polymers as drug delivery systems for bone morphogenetic proteins / N. Saito, N. Murakami, J. Takahashi et al. // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2005. - N.57. - P.1037-1048.

173. Sakou, T. Bone morphogenetic proteins: from basic studies to clinical approaches / T. Sakou // Bone. - 1998. - N.22(6). - P.591-603

174. Sampath, T.K. Role of osteogenic protein-1 (OP-1) in growth, development and repair of bone / T.K. Sampath // J. Cell. Biochim. - 1993. - N.17E. - P. 147.

175. Sandhu, H.S. Bone grafting for spinal fusion / H.S. Sandhu, H.S. Grewal, H. Parvataneni // Orthop. Clin. North Am. - 1999. - N.30(4). - P.685-698.

176. Schwartz, Z. Addition of human recombinant bone morphogenetic protein-2 to inactive commercial human demineralized freeze-dried bone allograft makes an effective composite bone inductive implant material / Z. Schwartz, A. Somers, J.T. Mellonig et al. // J. Periodontol. - 1998. - N.69. - P.1337-1345.

177. Schwarz, N. Fresh autogeneic, frozen allogeneic, and decalcified allogeneic bone grafts in dogs / N. Schwarz, G. Schlag, M. Thurnher // J. Bone Joint Surg. Br. - 1991. -N.73(5). — P.787-790.

178. Schwender, J.D. Minimally invasive transforaminal lumbar interbody fusion (TLIF): technical feasibility and initial results / J.D. Schwender, L.T. Holly, D.P. Rouben et al. // J. Spin. Disord. Tech. - 2005. - N.18. - P.l-6.

179. Seeherman H. rhBMP-2/calcium phosphate matrix accelerates osteotomy-site healing in a nonhuman primate model at multiple treatment times and concentrations / H. Seeherman, R. Li, M. Bouxsein et al. // J. Bone Joint Surg. Am. - 2006. - N.88. - P.144-160.

180. Seeherman, H. Delivery of bone morphogenetic proteins for orthopedic tissue regeneration / H. Seeherman, J.M. Wozney // Cytokine & Growth Factor Reviews. -2005. - N.16. - P.329-345.

181. Seeherman, H. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 delivered in an injectable calcium phosphate paste accelerates osteotomy-site healing in a nonhuman primate model / H. Seeherman, M. Bouxsein, H. Kim et al. // J. Bone Joint Surg. Am. -2004. - N.86A. - P.1961-1972.

182. Senn, N. On the healing of aseptic bone cavities by implantation of antiseptic decalcified bone / N. Senn // Am. J. Med. Sci. - 1889. - N.98. -P.219-243.

183. Shimazu, C. Enhanced vertical alveolar bone augmentation by recombinant human bone morphogenetic protein-2 with a carrier in rats / C. Shimazu, T. Hara, Y. Kinuta et al. // J. Oral. Rehabil. - 2006. - N.33. - P.609-618.

184. Silva, G.A. Synthesis and evaluation of novel bioactive composite starch/bioactive glass microparticles / G.A. Silva, F.J. Costa, O.P. Coutinho et al. // J. Biomed. Mater. Res. A. -2004. — N.70. - P.442-449.

185. Simmons, C.A. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells / C.A. Simmons, E. Alsberg, S. Hsiong et al. // Bone. - 2004. - N.35. - P.562-569.

186. Solheim, E. Osteoinduction by demineralized bone / E. Solheim // Int. Orthop. - 1998. -N.22(3). - P.335-342

187. Strates, B.S. Contribution of osteoinductive and osteoconductive properties of demineralized bone matrix to skeletal repair / B.S. Strates, J.T. Tiedeman // Eur. J. Exp. Muskuloskeletal Res. - 1993. - N.2(2). - P.63-67

188. Summers, B.N. Donor site pain from the ilium. A complication of lumbar spine fusion. / B.N. Summers, S.M. Eisenstein // J. Bone Joint Surg. Br. - 1989. - N.71(4). - P.677-680.

189. Suzuki, Y. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo / Y. Suzuki, M. Tanihara, K. Suzuki et al. // J. Biomed. Mater. Res. - 2000. - N.50. - P.405-409.

190. Takahashi, Y. Enhanced osteoin-duction by controlled release of bone morphogenetic protein-2 from biodegradable sponge composed of gelatin and beta-tricalcium phosphate / Y. Takahashi, M. Yamamoto, Y. Tabata. // Biomaterials. - 2005. - N.26(23). - P.4856-4865.

191. Takahashi, Y. Skull bone regeneration in nonhuman primates by controlled release of bone morphogenetic protein-2 from a biodegradable hydrogel / Y. Takahashi, M. Yamamoto, K. Yamada et al. // Tissue Eng. - 2007. - N.13. - P.293-300.

192. Takikawa, S. Comparative evaluation of the osteoinductivity of two formulations of human demineralized bone matrix / S. Takikawa, T.W. Bauer, H. Kambic et al. // J. Biomed. Mater. Res. - 2003. - N.65-A(l). - P.37-42.

193. Thomson, R.C. Hydroxyapatite fiber reinforced poly (a-hydroxy ester) foams for bone regeneration / R.C. Thomson, M.J. Yaszemski, J.M. Powers et al. // Biomaterials. - 1998. - N.19. - P.1935-1943.

194. Tsiridis, E. In vitro and in vivo optimization of impaction allografting by demineralization and addition of rh-OP-1 / E. Tsiridis, Z. Ali, A. Bhalla et al. // J. Orthop. Res. - 2007. - N.25(11). - P. 1425-1437.

195. Tsumaki, N. Bone morphogenetic protein signals are required for cartilage formation and differently regulate joint development during skeletogenesis / N. Tsumaki, T. Nakase, T. Miyaji et al. // J. Bone Miner. Res. - 2002. - N.17. - P.898-906.

196. Uludag, H. Characterization of rhBMP-2 pharmacokinetics implanted with biomaterial carriers in the rat ectopic model / H. Uludag, D. D'Augusta, R. Palmer et al. // J. Biomed. Mater. Res. - 1999. - N.46. - P.193-202.

197. Urist, M.R. Bone formation by autoinduction / M.R. Urist // Science. - 1965. - N.150. -P.839-899.

198. Urist, M.R. Bone morphogenetic protein / M.R. Urist, B.S. Strates // J. Dental. Res. -1971. - N.50.(6). - P.1392-1406.

199. Urist, M.R. Preservation and biodégradation of the morphogenetic property of bone matrix / M.R. Urist, H. Iwata // J. Theor. Biol. - 1973. - N.38. - P.155-167.

200. Viljanen, V.V. Comparison of native xenogeneic and allogeneic bone morphogenetic proteins in the sheep skull defect assay model / V.V. Viljanen, T.S. Lindholm // Ann. Chir. Gynaecol. - 1997. - N.86(3). - P.255-259.

201. Vogelin, E. Healing of a critical-sized defect in the rat femur with use of a vascularized periosteal flap, a biodegradable matrix, and bone morphogenetic protein / E. Vogelin, N.F. Jones, J.I. Huang et al. // J. Bone Joint Surg. Am. - 2005. - N.87. - P.1323-1331.

202. Wang, E.A. Bone morphogenetic proteins (BMPs): therapeutic potential in healing bony defects / E. A. Wang // Trends Biotechnol. - 1993. - N.ll. - P.379-383.

203. Wang, E.A. Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation / E.A. Wang, V. Rosen, J.S. D'Alessandro et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. -N.87. — P.2220-2224.

204. Weber, D. A silent H-bond can be mutationally activated for high-affinity interaction of BMP-2 and activin type IIB receptor / D. Weber, A. Kotzsch, J. Nickel // BMC Structural Biology. - 2007. - N.7. - P.6.

205. Weiner, S. Bone structure: from angstroms to microns / S. Weiner, W. Traub // FASEB J.

- 1992. - N.6(3). - P.879-885.

206. Wenz, B. Analysis of the risk of transmitting bovine spongiform encephalopathy through bone grafts derived from bovine bone / B. Wenz, B. Osech, M. Horst et al. // Biomaterials. - 2001. - N.22. - P.1599-1606.

207. Wildemann, B. Quantification of various growth factors in different demineralized bone matrix preparations / B. Wildemann, A. Kadow-Romacker, N.P. Haas et al. // J. Biomed. Mater. Res. A. - 2007a. - N.81(2). - P.437-442.

208. Wilson-Hench, J. Osteoinduction. / J. Wilson-Hench // Progress in biomedical engineering, vol 4. Definitions in biomaterials. / Williams D.F. Amsterdam: Elsevier. -1987. - P.29.

209. Winet, H. Incorporation of polylactidepolyglycolide in a cortical defect: neoosteogenesis in a bone chamber / H. Winet, J.O. Hollinger // J. Biomed. Mater. Res. - 1993. - N.27. -P.667-676.

210. Wozney, J.M. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair / J.M. Wozney, V. Rosen // Clin. Orthop. - 1998. - N.346. -P.26-37.

211. Wozney, J.M. Overview of bone morphogenetic proteins / J.M. Wozney // Spine. - 2002.

- N.27(1). - P.2-8.

212. Yamamoto, M. Enhanced bone regeneration at a segmental bone defect by controlled ralase of bone morphogenetic protein-2 from a biodegradable hydrogel / M. Yamamoto, Y. Takahashi, Y. Tabata // Tissue Eng. - 2006. - N.12(5). - P.1305-1311.

213. Yamamuro, T. Bone Bonding Behavior and Clinical use of A-W Glass-Ceramic / T. Yamamuro // Bone Grafts, Derivatives and Substitutes / Urist M.R., O'Connor B.T., Burwell R.G. Oxford: Butterworth-Heinemann Ltd. - 1994. P.245-259.

214. Yamauchi, M. Cross-linking and stereospecific structure of collagen in mineralized and nonmineralized skeletal tissues. / M. Yamauchi, E.P. Katz, O. Kazunori et al. // Connect. Tissue Res. -1989. - N.21. - P. 159-169.

215. Yang, C. The application of recombinant human collagen in tissue engineering / C. Yang, P.J. Hillas, J.A. Baez et al. // Bio. Drugs. - 2004. - N.18. - P.103-119.

216. Yoneda, M. Repair of an intercalated long bone defect with a synthetic biodegradable bone-inducing implant / M. Yoneda, H. Terai, Y. Imai et al. // Biomaterials. - 2005. -N.26. - P.5145-5152.

217. Yoon, S.T. Osteoinductive molecules in orthopaedics: basic science and preclinical studies / S.T. Yoon, S.D. Boden // Clin. Orthop. - 2002. - N.395. - P.33-43.

218. Yoshida, K. Osteoinduction capability of recombinant human bone morphogenetic protein-2 in intramuscular and subcutaneous sites: an experimental study / K. Yoshida, K. Bessho, K. Fujimura et al. //J. Craniomaxillofac. Surg. - 1998. - N.26(2). P.112-115.

219. Yuan, H. Use of an osteoinductive biomaterial as a bone morphogenetic protein carrier / H. Yuan, J.D. De Bruijn, X. Zhang et al. // J. Mater. Sei. Mater. Med. - 2001. - N.12. -P.761-766.

220. Zeng, Q. Growth and differentiation factor-5 (GDF-5) stimulates osteogenic differentiation and increases vascular endothelial growth factor (VEGF) levels in fat-derived stromal cells in vitro / Q. Zeng, X. Li, G. Beck et al. // Bone. - 2007. - N.40. -P.374-381.

221. Zhang, M. A quantitative assessment of osteoinductivity of human demineralized bone matrix / M. Zhang, R.M. Powers Jr., L. Wolfinbarger Jr. // J. Periodontol. - 1997. -N.68(11). -P.1076-1084.

222. Zhao, G.Q. The gene encoding bone morphogenetic protein 8B is required for the initiation and maintenance of spermatogenesis in the mouse / G.Q. Zhao, K. Deng, P.A. Labosky et al. // Genes. Dev. - 1996. - N.10. - P.1657-1669.

223. Zotz, T.G.G. Experimental model of heterotopic ossification in Wistar rats / T.G.G. Zotz, J.B. de Paula, A.D.L. Moser // Braz. J. Med. Biol. Res. - 2012. - N.45(6). - P.497-501.

224. Zuzarte-Luis, V. A new role for BMP5 during limb development acting through the synergic activation of Smad and MAPK pathways / V. Zuzarte-Luis, J.A. Montero, J. Rodriguez-Leon et al. // Dev. Biol. - 2004. - N.272. - P.39-52.

160

Приложения

Приложение №1.

С: \EDAX3 2\ GENESX S\GENMAi>S. S PC

kV:10.0

Tilt:0.00

XJcof f: 39 . 48

R«»0.136 59

423

LS«c '. 1412

23~Jvm~2Q10

13:22101

2.00

2.50

3. 00

3.50

4.00

4.50

5. 00

keV :

Рис.3.50. Данные рентгеновского микроанализа в области 1 на поперечном

срезе кортикальной пластины.

С: \EDAX32\GENESIS\GENMAPS SPC .....I

kVtlO.O Tilt:0.00 Tkoff:39.48 Oet:SOTW Kaso:13« 59 top T:25.6

FS : 451 LSec : 128.4 Prst:None 23-Jun-2010 13:25:33

Мд

А I

Са

EDS Quantitative Results Element Wt% At% С 68 57 76.30 25.7b 21.50

О Na Mg i> Ca.

0.22 0 09 0.42 0.85

0 15 0.04 0.20 0.35

1.00

1.50

2.00

2 50

3.00

3.50

4.00

4.50

5 00

keV

С;\ЕМиС32\ЙЕЫ£а13\(ЖНМА?3 ЗРС

кУЮ.о

Т11к:0.00

ТкоН 39 48

: 8«««

¡»»30:136.59

Ажр.Т-25 6

ГС . 264

Ь8*с ; 114 . *?

¡Е>гя1:Копа

23~С1ип~2010

13.28,42

С*

¿08 »»аи11«Л

£1<да«т* КМ

с о №

мд

р

Са

49 12 61 45

32 О О 5

11

ВЗ 30 44 О

88 29 41

78 18

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4 00

4. 53

5,00

Рис.3.52. Данные рентгеновского микроанализа в области 3 на поперечном

срезе кортикальной пластины

С: \EI3AX32\GEHESXS\GEi3HAFS. ЗРС

кУ:10,0

Ti.lt :0.00

ТкоГ£:39.48

Ввг.вОТИ

йя»о.136.59

Ажр Т:25.6

ГЗ ; 304

0. 50

Ьввс • 159 4

23-Лт-2010

13:31-36

1.00

1.50

2.00 2.50

ЕВЗ Вваи1е1!

Е1ещвпЬ ММ

С 28 89 42.15 О

N3 0.34 42 84

15

3.00

3,50

4.00

5. 00

кеУ

Приложение №2.

EDS Quantitative Results Element Wt% At% С 27.61 41.52 О 35.60 40.20 Na 0 . 82 0 . 64 Mg 0 .31 0 .27 P 9.96 5.81 Ca 25 65 11.56

SEI

50um

140x

Рис.3.54. Губчатая пластина до деминерализации. Изображение и элементный состав получены на сканирующем электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI Company, США).

EDS Quantitative Results

«ment Wt% At%

С 77 98 82 99

О 20 37 16 28

На 0 41 0 23

Kg 0 37 0 19

F 0 18 0 08

Cl 0 39 0 14

К 0 29 0 10

Ca 0 00 0 00

SEI •——< Söuro 140*

С : \EDAX32\GEHESIS\GEMKAPS. SPC X_K±___Z «pnt>__________

T».i»-n Ot) ... Ifcaff'H 61 ~ Рим; ; <№Ш Brno : 131 Amt»,T; 102 4

JŒ^JUSJL ШшЗиЯояя ........ __ïz^Jtmrisaû_ _____млжил Su...............

С

Mg

Ha

Cl

0.60

1.20

1.80

2 .40

3.80

Ce

3. 60

4.20

4.80

5 40

6.00 keV

Рис.3.55. Губчатая пластина после деминерализации. Изображение и элементный состав получены на сканирующем электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI Company, США).

Приложение №3. Подробное описание некоторых клинических случаев.

Клинический случай №1

Пациентка №1 в 57-летнем возрасте поступила в 27-ое Травматологическое отделение ГКБ им. С.П. Боткина с застарелой (4 года назад) травмой правой руки -поперечным переломом средней трети плечевой кости со смещением (Рис. 3.56, А). Перелом был отягощен повреждением лучевого нерва. Пациентке произвели остеосинтез плечевой кости пластиной. Из-за несостоятельности остеосинтеза (Рис. 3,56, Б) через 6 недель выполнена вторая операция: удаление пластины, ревизия лучевого нерва, реостеосинтез плечевой кости штифтом (Рис. 3,56, В).

В течение 4-х лет пациентка жаловалась на боли, выраженную слабость в правой руке, невозможность больше 10 минут работать рукой. При обследовании в феврале 2011 был выявлен ложный сустав средней трети плечевой кости с остеолизисом костной ткани в дистальном отделе плеча в месте контакта штифта (Рис. 3.56, Г) [Донченко, 2012].

Рис. 3.56. Пациентка №1 с поперечным переломом средней трети плечевой кости со

смещением (А). Первый остеосинтез несостоятельный (Б). Через 6 недель реостеосинтез плечевой кости штифтом (В). При обследовании через 4 года - ложный сустав с остеолизисом костной ткани в месте контакта штифта (Г).

В отделении была проведена операция по удалению штифта с резекцией ложного сустава плечевой кости (укорочение до 3-х см). Произведен реостеосинтез правой плечевой кости пластиной ЬСР. В качестве остеоиндуктивного материала использовали материал ДКМ в виде крошки с добавлением гЬВМР-2 (Рис. 3.57, А-Г).

Через 6 месяцев после операции у пациентки отмечена консолидация костных фрагментов с формированием костной мозоли, восстановлением функции руки. (Рис. 3.58, А).

На Рис. 3.58, Б представлена рентгенограмма, сделанная спустя более 1,5 лет после операции. На контрольном осмотре достигнутый результат лечения сохранен. По сравнению с ближайшим плановым осмотром (6 месяцев после операции) наблюдается компактизация костной мозоли, замещение костнопластического материала новообразованной костной тканью. Рука полностью функционально активна, болевые симптомы не отмечаются.

Рис. 3.57. Пациентка №1. Операция по удалению штифта (А) с резекцией ложного сустава плечевой кости (Б), реостеосинтез правой плечевой кости пластиной ЬСР (В), в качестве остеоиндуктивного материала использовали материал ДКМ в виде крошки с

добавлением гИВМР-2 (Г).

Рис. 3.58. Пациентка №1. Консолидация костных фрагментов с формированием костной

мозоли через 6 месяцев (А) и через 1,5 года (Б) после операции. Рука полностью функционально активна, болевые симптомы не отмечаются.

Клинический случай №2

Пациентка №2 в 28-летнем возрасте поступила с травмой в 27-ое Травматологическое отделение ГКБ им. С.П. Боткина, где ей поставили диагноз «ложный сустав правых болыпеберцовой и малоберцовой костей в нижней трети».

Ранее у пациентки уже была установлена металлоконструкция. После удаления штифта из правой малоберцовой кости провели резекцию ложного сустава правой болыпеберцовой кости (Рис. 3,59, А).

После этого проводили пластику с использованием ДКМ в виде крошки с остеосинтезом правой болыпеберцовой кости пластиной Ах8о8 аШего-1а!ега1 фирмы Б^укег (Рис. 3.59, Б-Г).

Рис. 3.59. Пациентка №2. Резекция ложного сустава правой большеберцовой кости (А), остеопластика ДКМ в виде блока (Б-В) и ДКМ в виде крошки (Г) с остеосинтезом пластиной Ах8оБ агиего-Ыега! фирмы Зггукег.

Ниже представлены данные рентгенологического контроля сразу после операции (Рис. 3.60, А) и спустя 10 дней после нее (Рис. 3.60, Б).

Рис. 3.60. Пациентка №2. Данные рентгенологического контроля сразу после операции

(А) и спустя 10 дней после нее (Б У