Повышенная устойчивость недифференцированных и опухолевых клеток к повреждающему действию низких температур тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Райдан Мазен

• Райдан Мазен
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Райдан Мазен

1. ВВЕДЕНИЕ.^.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Выделение и культивирование клеток.

3.1.1. Выделение и культивирование кератиноцитов.

3.1.2. Выделение и культивирование стромальных клеток костного мозга (СККМ) крысы.

3.1.3. Выделение и культивирование клеток опухоли

ЕН8 саркомы мышей линии Ва1Ь.

3.1.4. культивирование клеток линии А43 1.

3.2. Направленная дифференцировка СККМ в адипоцитарном или остеогенном направлении.

3.3. Методы оценки жизнеспособности клеток.

3.3.1. Определение жизнеспособности кератиноцитов.

3.3.2. Фотоколориметрический метод оценки доли жизнеспособных клеток СККМ до и после их охлаждения.

3.4. Исследуемые объекты и режимы их охлаждения.

3.4.1. Исследуемые объекты.

3.4.2. Охлаждение клеток кожи человека.

3.4.3. Охлаждение СККМ крысы и опухолевых клеток.

3.5.Иммунофлуоресцентный анализ степени дифференцировки кератиноцитов.

3.6. Стриппинг многослойного пласта кератиноцитов и снятие клеток базалыюго слоя.

3.7. Выделение белков теплового шока.

3.8. 8В8-электрофорез и иммунноблотинг.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Воздействие холода на гетерогенную популяцию кератиноцитов.

4.2. Иммунофлюоресцентный анализ гетерогенной популяции кератиноцитов.

4.3. Содержание белка теплового шока Нвр 70 у дифференцированных и недифференцированных кератиноцитов.

4.4. Воздействие низких температур на СККМ до и после их дифференцировки в адипогенном или остеогенном направлениях.

4.5. Результаты воздействия низких температур на опухолевые клетки трансформированной линии А эпидермоидная карцинома человека).

4.6. Результаты воздействия низких температур на опухолевые клетки ЕНБ.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Повышенная устойчивость недифференцированных и опухолевых клеток к повреждающему действию низких температур»

Во второй половине двадцатого столетия в медицине возникло но^ое направление, интенсивно развивающееся в настоящее время и связанное^' с применением низких температур при лечении различных заболеваний человека, ц в косметических целях. Эти методы воздействия получили название криотерапии и криохирургии и используются во многих клиниках Авторы, изучавшие действие низких температур на организм, выдвигают разные предположения по поводу причин различной устойчивости клеток в составе ткани. К ним относят, напри^^ степень гидрофильности клеточной мембраны, изменение структуры клочки, различное количество кристаллов льда внутри клетки или в ее окруже:ции? денатурацию клеточных белков, изменение синтеза и локализации внутриклеточных криопротекторов.

Согласно представлениям медиков, применяющих воздействие Паров жидкого азота для омоложения кожного покрова, этот процесс осуществляемся за счет разрушения «старых», дифференцированных клеток и сохранения «Юных» недифференцированных, способствующих его регенерации.

На сегодняшний день все высказываемые соображения остаются Только предположениями. Конкретные механизмы разной устойчивости разных клеток и тканей организма к действию низких температур остаются невыясненными и требуют систематического изучения. Огромное количество сделанных наблюдений и накопленных экспериментальных данных создало достаточную основу для получения ответов на многочисленные непрерывно возникающие вопросы.

Еще с древних времен действие холода на человека и на животных привлекало внимание врачей и исследователей. Повышенный интерес к действию низких температур на живые организмы объяснялся рядом обстоятельств. Во-первых, было замечено, что при длительном воздействии холодного воздуха у человека может происходить обморожение кожных покровов и разрушение тканей. Во-вторых, было установлено, что существуют живые организмы, способные сохранять жизнеспособность даже при существенном понижении температуры окружающей среды. И, наконец, обнаружилось, что холод может иметь и обратный эффект и способствовать восстановлению поврежденных тканей.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Многолетний опыт применения холода при лечении заболеваний человека

Еще в древнем Египте, как следует из найденных рукописей, было замечено, что холод оказывает положительное влияние на заживление ран. Поэтому египтяне использовали холодные компрессы при лечении переломов и для снижения интенсивности воспалительных процессов. Древние греки также положительно оценивали применение охлаждения при лечении ран. Гиппократ, в частности, писал в своих трудах о терапевтическом эффекте холода, заключающемся в подавлении в ранах кровотечения и уменьшении отеков.

Затем воздействие холодом в терапевтических целях стали применять в разных странах Европы. Так итальянские врачи около 500 лет тому назад, стали использовать воздействие холодом в качестве обезболивающего средства. Среди известных европейских врачей, которые широко применяли охлаждение при лечении разных заболеваний, были Thomas Bartholin (1661) и Dominique Jean Larrey (1766-1783), которые показали, что при применении холода заживление ран проходит без осложнений. Известный русский хирург Н.И. Пирогов применял охлаждение во время проведения таких сложных хирургических операций как ампутации конечностей и рекомендовал использовать его в тех случаях, когда в опухших, воспаленных ранах начинается паренхиматозное кровотечение (Ситовский и др., 1986).

Во всех перечисленных случаях использовалось сравнительно небольшое понижение воздействующих температур вплоть до температуры льда, равной 0 °С. Наряду с этим было обращено внимание на разрушительное действие более низких температур окружающей среды на клетки и ткани человека, которое после обморожения кожной ткани может приводить к развитию гангрены. Этот повреждающий эффект низких температур также нашел применение в хирургии. Так, например, Dr. James Arnott (1797-1883) впервые использовал лед, полученный из солевого раствора с температурой от -18°С до -24°С, для удаления злокачественных опухолей (Abakali et al., 2006).

Таким образом, на протяжении многих столетий происходило постепенное распространение в медицине методов холодового воздействия при лечении различных заболеваний, и накопленный экспериментальный опыт стал основой для развития последующих криотерапии и криохирургии. При этом, однако, были накоплены знания только о конечных, положительных результатах применения охлаждения при лечении разных заболеваний. Вместе с тем до прошлого столетия конкретные механизмы действия низких температур на клетки и ткани организма оставались неизвестными.

2.2. Возникновение и развитие криобиологии.

Дальнейшие исследования влияния значительно более низких температур на биологические объекты и возможности их практического применения были тесно связаны с интенсивным развитием клеточной и молекулярной биологии, а также биотехнологии. Практически все основные сведения о механизмах поведении клеток человека, животных и растений: о процессах их деления, миграции, изменения морфологии, взаимодействия между собой и с микроокружением, экспрессии генов, превращения в злокачественные клетки - были получены при исследовании клеток, выделенных из организма и поддерживаемых в жизнеспособном состоянии в соответствующих питательных средах. В первой трети 20-го столетия основные усилия исследователей были направлены на выявление условий, необходимых для выживания и размножения клеток в культуре. При этом выяснилось, что в процессе длительного культивирования в них накапливаются изменения на генном и хромосомном уровне, меняется их морфология и метаболизм. В связи с этим было необходимо найти способы сохранения их исходных свойств. По аналогии с некоторыми живыми организмами, впадающими в состояние анабиоза при понижении температуры окружающей среды, исследователи пытались сохранять свойства культивируемых клеток путем понижения температуры. Действительно оказалось возможным сохранять их жизнеспособность в этих условиях, по в течение только ограниченного времени (до полугода). При этом они, тем не менее, теряли свои исходные свойства (Маппопеп е1 а!., 1990).

Успешное развитие криобиологии и создание способов криоконсервации клеток человека, животных и растений началось только после того, как в 1899 году Линде и Дьюар впервые получили жидкий воздух, азот и водород, а Тизельтон-Даер заморозил в жидком азоте семена растений, которые после размораживания сохранили способность к прорастанию (Thiselton-Dyer, 1899). Таким образом, представлялось, что безопасный источник низких температур в виде жидкого азота найден. В 1892 году Дьюар изобрел также специальные вакуумные сосуды, в которых можно было сохранять сжиженные газы, и благодаря этому жидкий азот стал доступен для исследователей (Sommer, 1960).

Кроме того, в середине 19-ого века Julius Von Sachs разработал новой тип микроскопа (Diller, 1996), который позволял работать в условиях низких температур, что давало возможность изучать процессы клеточной дегидратации и образования внутриклеточных кристаллов льда.

Оказалось, однако, что далеко не все биологические объекты можно было замораживать и хранить при таких низких температурах как - 196 °С. Большинство из них разрушалось и погибало. Те же из них, которые сохраняли жизнеспособность после размораживания, как правило, принадлежали организмам, которые жили в умеренном климате и имели, по-видимому, генетически закрепленную способность адаптироваться к действию низких температур окружающей среды. На основании этих наблюдений были начаты систематические исследования, которые проводились в двух основных направлениях. Одно из них было посвящено изучению влияния холода на структурные и метаболические изменения в клетках, приводящие их к разрушению и гибели. Другое же было сосредоточено на выяснении механизмов адаптации и устойчивости разных организмов к низким температурам окружающей среды и выявлению факторов, способствующих защите тканей от переохлаждения.

2.3. Причины негативного воздействия на клетки низких температур

В результате систематических исследований механизмов? криоповреждений было установлено, что главной причиной гибели клеток является образование вших кристаллов льда в процессе охлаждения, приводящее к разрушению; клеточных мембран и денатурации белков;

Так как молекулы воды в большей степени находятся во внеклеточной среде, то образование ледяных ядер происходит сначала вне клетки. Лед является плохим растворителем для солей, что приводит к накоплению их вокруг клеток и повышению осмотического давления. Вследствие чего происходит сокращение и отвердение клеточной мембраны. Переход из жидкой фазы в гелеобразную сопровождается также изменением белкового состава, из-за чего нарушается транспортный процесс и проницаемость мембраны (Balasubramanian, 2006). В тех случаях, когда такие структурные изменения были необратимы, приток молекул воды после оттаивания приводит к разрыву клеточной мембраны. Согласно» данным Юнг-Лаплас (Young-Laplace), клетка способна выдержать lkPa гидростатического давления. Таким образом, повреждение мембраны может быть связано с необратимым понижением осмотического давления и выраженным процессом дегидратации (Grosberg, et al., 1986).

Поверхностная мембрана клетки состоит из двух фосфолипидных слоев, одна сторона которых представляет собой алифатическую цепь и является гидрофобной, а другая (карбоксильная часть) является гидрофильной. Белковые молекулы, встроенные в билипидный слой, выполняют транспортную и структурную функции, кроме этого, за счет взаимодействия молекул белка с водой обеспечивается устойчивость клеточной мембраны к изменению температуры среды (Wolfe, 2002). При изменении окружающей температуры происходят изменения в структуре билипидного слоя клеточной мембраны. Повышение температуры приводит к образованию шестиугольной структуры билипидного слоя, а понижение температуры вызывает ее переход из жидкого состояния, в; твердое состояние (Crowe et al., 1984; Харакоз, 2001) (рис.1).

SWJW

9 On О

IrflÁf Aifct ffy- J liquid crystal Lamellar phase at high hydxadon

OOOOOOOO liquid crystal lamellar phase at lover hydration gel phase has lo-ver hydration

J&jzbTijtáilÁr 'Зг&хй " aflijtxf jüjxfjvtmtrin-w ¿t&n/Jis phase separation in fluid state ф is the higher hyd rating species inverted hexagonal phase

Рис. 1. Схема водно-липидных фаз модельной мембраны претерпевающей обезвоживание (Wolfe, 1994).

Согласно теории ДЛФО (Дерягина-Ландау-Фервея-Овербека) взаимодействие между поверхностью мембраны и ионами зависит от электростатических сил, силы энтропии и силы Ван-дер-Ваальса. (Parsons et al., 2011). Кроме того, на их взаимодействие влияет еще одна сила - сила дегидратации. В процессе дегидратации происходит удаление из мембраны молекул воды, что приводит к уменьшению ее толщины и, соответственно. площади поверхности. Wolfe и Bryant (1992) установили, что при снижении содержания молекул воды в клетке на 10%, толщина клеточной мембраны (КМ) изменяется от 5 пш до 0,5 nm (Bryant et al., 1992). Такое уменьшение расстояния Ы между двумя слоями- приводит к увеличению сил напряжения вследствие «сил дегидратации». Таким образом, при сокращении площади поверхности длинные липидные молекулы образуют плотную квазидвухмерную структуру. Уменьшение площади поверхности мембраны приводит к так называемому фазовому переходу. Многочисленные исследования показали, что при сокращении площади на 20-25%, (Vennemann et al., 1986; Holger et al., 2001) толщина бислоя возрастает настолько, что объем мембраны снижается на 3-5%. Процесс отвердения сопровождается падением энтропии. (Jendrasiak et al., 1974; Cevc et al., 1987; Heidi et al., 2007)

Из этих наблюдений, в частности, следует, что если один слой фосфолипидов переходит в твердое состояние, а другой при этом остается неизменным, то возникает деформация мембраны и она становится вогнутой в сторону более твердого монослоя. Такое состояние вызывает напряжение, и мембрана может разрушаться, В этом случае формообразующая роль фазового перехода очевидна. Такой механизм формирования изгибов может оказывать негативное влияние на структурную целостность мембраны,

При исследовании травм в результате холодового шока у амебы ученые Университета Кембриджа и Института цитологии РАН (1984) обнаружили увеличение адгезивной способности клеток к субстрату, изменение морфологии клеток, что привело к уменьшению их жизнеспособности на 4% при -10 °С в течение 5 минут (McLellan et al., 1984). Ученые так же выяснили, что изменения температуры вызывают агрегацию актиновых филаментов у A. proteus и Вог amoeba, что сопровождается снижением их активности на 10% и, в том числе, изменением времени их распластывания и деления. Влияние низких температур на адгезию и агрегацию клеток может быть непосредственно связано с изменением белкового состава и состояния внеклеточного матрикса, что требует проведения специальных и более детальных исследований.

Повреждающее действие низких температур может быть связано также с денатурацией внутриклеточных белков, осуществляющих регуляцию жизнедеятельности клеток в составе ткани и при культивировании in vitro.

Белки обеспечивают транспорт веществ в процессах эндоцитоза и экзоцитоза, принимают участие в распределении веществ в цитоплазме, в передаче сигналов, а так же определяют морфологию клеток. Каждый тип белковых молекул имеет определенную трехмерную структуру, определяющую степень активности данной молекулы, и которая может изменяться под воздействием неблагоприятных условий среды (Morley et al., 1995). В то лее время исследования влияния холода на структуру и активность некоторых ферментов показали, что, несмотря на происходящие адаптивные изменения, необходимые для исполнения каталитического процесса, их трехмерная структура при этом практически не менялась (Auerbach et al., 1998).

Устойчивость структуры белков зависит от ионных взаимодействий, водородных связей, гидрофобных и Ван-дер-ваальсовых взаимодействий (Jaenicke, 1991; Jaenicke, 2000).Установлено, что денатурация белковых молекул под воздействием низких температур происходит в основном за счет разрыва водородных связи (Rees et al., 1984). Кроме того, разрушение мембранных структур может приводить к высвобождению из лизосом протеаз, разрущающих структуру разнообразных белков.

В отличие от действия высоких температур денатурация наиболее устойчивых белков, вызванная охлаждением, может быть обратимой. В этом случае холод нарушает водородные связи, но при этом сохраняется целостность полипептидных цепей. Такой процесс называют частичной денатурацией, при которой возникшие изменения в структуре белка при правильном выведении клеток из охлажденного состояния, могут восстановиться, и поэтому не происходит гибели клеток. (Bischof et al., 2005; Wolkers et al. 2007; Mallamace et al., 2007).

Разрушительное действие низких температур в значительной степени зависит также от скорости охлаждения клеток. Изучение влияния холода на два вида амеб Amoeba, proteus и Amoeba sp, показало, что процесс восстановления жизнеспособности после воздействия на них -10 °С значительно различается и зависит от скорости охлаждения. Для Amoeba sp оптимальной была скорость <0.1 °С/мин и для A. proteus < 90 °С/мин (McLellan et al., 1984). В большой степени это может быть связано с количеством воды, содержащейся в клетке и в околоклеточном пространстве. Как правило, в последнем ее содержится больше, t чем в цитоплазме, и поэтому образование кристаллов льда при замораживании идет там быстрее (Baust et al., 2005). Образование льда в межклеточном пространстве повышает осмотическое давление и приводит к выходу воды из

1 клеток в окружаюшую среду для установления равновесия осмотического давления у V

Baust et al., 2004; Beck et al., 2007). Однако, если скорость охлаждения слишком высока, вода внутри клетки образует кристаллы льда (BKJI) и не успевает выходить наружу, что приводит к разрушению целостности мембраны и органелл. Количество воды внутри клетки определяет степень повреждения клеток при воздействии холода, 5-10% BKJI является летальным (Wolkers et al., 2007). Если же скорость охлаждения очень медленная, то происходит сильная дегидратация, приводящая к их гибели. Поэтому при воздействии холода на клетки необходимо применять оптимальный режим охлаждения и время экспозиции. Это можно определить только экспериментальным путем, поскольку разные клетки имеют разную проницаемость клеточной мембраны, содержат разное количество воды и имеют разную вязкость цитоплазмы, зависящую от содержания в ней макромолекул и гидрофильных ультраструктур.

Целый ряд исследований показал, что вода в биологических объектах замораживается не полностью при понижении температуры значительно ниже нуля и даже при образовании кристаллов льда (Mazur, 1963; Becker et al., 2007). Причиной такого явления может быть повышенная: вязкость цитоплазмы или внеклеточной среды, замедляющая формирование центров кристаллизации (нуклеации) льда и образование вместо кристаллов стекловидной структуры, сопровождающаяся внутриклеточной ветрификацией. (Beerling, 2001., Wolfe et al., 2002).

Таким образом, главными повреждающими факторами являются образование в клетках кристаллов льда и дегидратация клеток в результате роста кристаллов льда во внеклеточном пространстве. При этом, однако, степень разрушительного воздействия этих факторов может значительно различаться в зависимости от типа клеток, их морфологии, расположения в организме или в соответствующей ткани, от типа специализации и осуществляемых функций. Кроме того, степень устойчивости клеток к действию низких температур может зависеть от наличия или появления в клетках защитных факторов, которые позволяют разным организмам приспосабливаться к изменениям температуры окружающей среды, особенно проживающим в умеренном климате. Изучению таких защитных механизмов посвящено большое число исследований, результаты которых,, в конечном счете, дали возможность найти способы надежной криоконсервации культивируемых клеток животных и растений^

2.4; Механизмы адаптации живых организмов к холоду

Результаты многочисленных проведенных исследований свидетельствовали о том, что одноклеточные и многоклеточные организмы в природе имеют различные механизмы адаптации для выживания при изменении температуры окружающей среды. Ученые выяснили, что у животных, обитающих в холодном, климате, наблюдаются два основных адаптационных механизма при изменении температуры окружающей среды. Первый механизм связан с предотвращением образования кристаллов льда с помощью появления или накапливания в клетках разных биологически активных молекул. В 1912 году русский ученый Hi А. Максимов обнаружил криозащитный эффект глицерина и Сахаров при замораживании клеток растений (Максимов, 1952). Позднее, в 1949 году, Одри Смит и Полдж получили аналогичный результат при глубоком замораживании спермы петухов в присутствии глицерина (Смит, 1963). В дальнейшем, разными авторами было подтверждено, что под действием холода в тканях холодоустойчивых организмов происходит накопление олигосахаридов (Storey et al., 2004; Cavender-Bares, 2005), растворимых углеводородов (Byrant et al., 2001), глицерина (Layne et al., 2001) и аминокислот (Davies, 2002). Также было обнаружено появление белков AFP (антифризные белки), снижающих температурный порог, необходимый для образования кристаллов. Так, например, у рыб, обитающих в холодном климате, выявлено два типа белков AFP. Один из них главным образом локализуется в печени, а другой синтезируется, в тканях, имеющих прямой контакт с окружающей средой. (Kanwisher, 1966). В; настоящее время эти белки применяют при выведении морозоустойчивых растений (Murray, 2002).

Кроме уже хорошо известных гетерогенных нуклеаторов льда (INA), таких как органические структуры и йодистое серебро, найден у морозоустойчивых личинок Eurosta solidaginis новый ряд INA. Более детальные исследования-показывают, что INA становятся активными при- взаимодействии с клеточными мембранами.

Другим механизмом защиты, от переохлаждения является перераспределение воды, так называемый процесс «преднамеренного обезвоживания». У многоклеточных высокоорганизованных организмов в дерме обнаруживаются клетки (луковицы Крауса), основная функция которых состоит в распознавании изменений температуры окружающей среды и передаче сигналов, активирующих реакции расщепления жиров (Diana, 2003) . У одноклеточных эту роль выполняют цитоплазматические мембраны (Vigh, 1993), которые активируют транскрипцию различных защитных белков (Jaglo-Oltosen, 1998; Knight, 2002) и регулируют ионный транспорт через клеточную мембрану (Murphy, 1977).

Важную роль играют также такие белки, как протектины (Hincha, 2002., Breman, 2006), которые стабилизируют мембрану во время охлаждения и защищают от гипоксии (Storey, 2006). В последнее время особое внимание уделяется изучению роли шаперонов, которые синтезируются клетками в ответ на разные виды стресса, и предотвращают денатурацию белков, а так же сохраняют целостность клеточной мембраны.

5. Белки теплового шока и их роль в защите клеток от воздействия низких температур.

Шапероны, в число которых входят белки теплового шока, выполняют в клетках защитную функцию, которая состоит в восстановлении правильной вторичной структуры повреждённых белков, а также в обеспечении нормальных процессов образования и диссоциации белковых комплексов (Baust, 2004). Они содействуют правильному фолдингу полипептидов путем связывания с незащищенными гидрофобными участками полипептидных цепей, а так же предотвращают неспецифическую агрегацию белков. Шапероны называют еще белками теплового шока, потому что они синтезируются в клетках в ответ на повышение температуры окружающей среды или при возникновении других стрессорных воздействий (Beck, 2002; Baust, 2005). Как низкие, так и высокие температуры могут оказывать сильное негативное влияние на клетки. Шапероны в этих случаях принимают активное участие в предотвращении потенциального вреда, который может возникнуть из-за неправильного складывания^ полипептидных цепей белков (Beck, 2007; Becker, 2007). Есть виды шаперонов, принимающих участие в фолдинге только что созданных белковых цепей непосредственно в процессе их выхода из рибосомы и формирования белковой молекулы.(Веег1^, 2001; Belhamadia, 2004)

К наиболее распространенным и хорошо изученным шаперонам относятся члены семейства белков теплового шока Hsp 70. Молекула lisp 70 содержит 641 аминокислотный остаток и состоит из двух функционально различных доменов. В N-концевой части находится АТФ-связывающий домен, а С-концевой домен обладает пептидсвязывающей активностью. Конформационные изменения N-концевого домена, происходящие при связывании АТФ и ее гидролизе, приводят к изменению конформации С-концевого участка, в результате чего происходит захватывание или высвобождение пептида-мишени. Эти циклы связывания и освобождения полипептидов защищают пептиды от образования нерастворимых агрегатов во время их фолдинга и доставки через сеть внутриклеточных мембранных структур в митохондрии, хлоропласты и другие органеллы (Benedict 1956; Benes, 2001).

С С-концевым участком Hsp 70 связываются полипептиды с открытыми гидрофобными группами, (от 8 до 13 остатков), что характерно для только что синтезированных полипептидов с еще не сформированной вторичной структурой или разворачивающихся структур под влиянием повреждающих факторов (Bellissent-Funel, 2003; Belhamadia, 2004)

Hsp70 реагируют на низкие температуры, как на вид стрессорного воздействия (Вепеу, 2001) . В ходе ряда исследований было показано, что Hsp70 у человека способен сохранять функциональную активность даже развернутой под влиянием холода в -4 °С ß-галактозидазы, соизмеримой с ее активностью в нормальном состоянии. В поддержании развернутой конформации белковой молекулы кроме Hsp70 принимают участие ко-шапероны - DnaJ(Hsp40), GrpE, Hip and Hop. Было обнаружено, однако, что при действии низких температур эффективность связывания Hsp70 с белками мишенями была низкая, что может быть связанно с отсутствием участия ко-шаперонов (Benson, 1992)

При исследовании синтеза белков холодового шока (CSP) у прокариот во времия акклимитизации к холоду и при холодовом шоке, было установлено, что они вырабатываются в большом количестве (Гольдштейн и др., 1990;. Phadtare и др., 1999;. Шмид и др., 2009.). Исследования так же показали, что белки холодового шока (CSP) содержат специфический домен, который участвует в регуляции экспрессии генов на транскрипционном или трансляционном уровне (wolfe, 1994; Graumann, Marahiel, 1997;. Ermolenko, Makhatadze, 2002). CSP у прокариот - это небольшие по размеру молекулы, состоящие из 65-75 аминокислотных остатков. Они способны связываться с РНК и ДНК и облегчают процесс трансляции при низких температурах путем блокировки преждевременного формирования вторичной структуры мРНК (Jiang et al., 1997; Graumann, Marahiel, 1998).

Таким образом, CSP при воздействии на клетки низких температур, играют важную защитную роль, сохраняя белки в их активном состоянии, что необходимо для выполнения ими жизненно важных функций клеток. Как следует из результатов проведенных исследований, от различий в содержании таких белков может существенно зависеть устойчивость клеток на разных стадиях дифференцировки. Известно, что уровень синтеза таких защитных белков у разных типов клеток может быть разным, однако неизвестно, изменяется ли содержание таких белков у клеток с разной степенью дифференцировки. В литературе, посвященной анализу действия низких температур на ткани живых организмов, такие данные к настоящему времени отсутствуют. В то же время в виду сложившихся в медицине представлений об избирательном действии холода на разные клетки необходимо выяснить, могут ли эти белки играть существенную роль в обеспечении их устойчивости.

2.6. Использование низких температур в современной медицине.

На основе данных, полученных при изучении процессов криоконсервации.и причин разрушения клеток при действии низких температур, были разработаны способы лечения разных кожных заболеваний, а также методы разрушения новообразований, которые сформировали в медицине область криотерапии и криохирургии. В настоящее время врачи используют низкие температуры для омоложения кожи, удаления родимых пятен, возрастных кератозов, келлоидных рубцов, удаления полипов, атером, бородавок и лечения других заболеваний, в том числе и в онкологии при деструкции разных видов опухолей. Наряду с очевидным положительным клиническим эффектом конкретные механизмы действия еще не выяснены. Сложившиеся же у врачей представления о том, что холод способствует разрушению дифференцированных клеток и сохранению (молодых) недифференцированных, за счет чего и происходит процесс омоложения кожи, а также ускорение заживления ран и снижение образования рубцов, не являются достаточно экспериментально обоснованными и остаются пока на уровне предположений.

Имеющиеся на сегодняшний день данные о влиянии холода на живые организмы нуждаются в более точных и детальных исследованиях, результаты которых позволят более точно рассчитывать оптимальные режимы воздействия низких температур для каждого случая их применения (Магиг, 1988). В связи с интенсивным развитием криохирургии в последнее время врачей и хирургов начало интересовать, что именно происходит с клетками, которые подвергаются воздействию низких температур при удалении новообразований и за счет чего может происходить процесс регенерации тканей, исследования данной проблемы являются чрезвычайно актуальными и необходимыми. В нашей лаборатории около десяти лет тому назад были проведены первые исследования устойчивости культивируемых клеток опухолевого происхождения к действию разных низких температур. Эти эксперименты проводились по просьбе криохирургов, которые обнаружили, что в ряде случаев после удаления опухолей путем их охлаждения жидким азотом, в тех же местах через некоторое время вновь образуются опухоли. Результаты проведенных экспериментов показали, что гибель клеток зависит как от выбранных режимов охлаждения, так и от того состояния, в котором они находились во время воздействия. Клетки, находившиеся в питательной среде в виде суспензии, все погибали, а если находились в осадке после центрифугирования, то некоторые из них сохраняли жизнеспособность и могли размножаться и образовывать монослой в культуре (вгапоу е1 а1., 2001). Эти результаты послужили основой-для дальнейшего изменения режимов охлаждения при удалении опухолей и продемонстрировали важность изучения устойчивости разных типов клеток к действию низких температур.

Так как использование низких температур в криохирургии неразрывно связано с последующим восстановлением структурной и функциональной целостности обработанных тканей, крайне важно выяснить, в какой мере оставшиеся жизнеспособными клетки способны к дальнейшему размножению и дифференцировке. Исследования в этой области только начинаются, но уже первые полученные результаты свидетельствуют о перспективности проведения экспериментальных работ в этом направлении. Так, например, Ваканти с соавторами (2001) обнаружил в разных тканях мелкие спорообразные клетки, которые сохраняли жизнеспособность после воздействия на ткань низкими (-86 °С) и высокими (+86 °С) температурами. Он предполагал, что это могут быть мультипотентные стволовые клетки. Уже в период проведения исследований, представленных в данной диссертации, в литературе появились короткие сообщения о сохранении в составе кожной и жировой ткани после их глубокого замораживания жизнеспособных клеток, похожих по своим характеристикам на стволовые мезенхимальные клетки (Кульнева и др., 2008; Савченкова, 2008).

Затем были опубликованы более подробные результаты исследований влияния температуры -70 °С на выделенную липосакцией жировую ткань человека, в которой оставались жизнеспособные клетки, способные к росту и дифференцировке в культуре (Савченкова и Коржикова, 2010). При этом, однако, во всех этих работах не было установлено, зависит ли сохранение жизнеспособности от свойств самих клеток или от защитного действия того микроокружения, в котором они находились. Кроме того, в данных исследованиях применяли только те режимы замораживания, которые были разработаны для криоконсервации культивируемых клеток, и поэтому оставалось неясным, каковы

Ж 9 пределы устойчивости клеток в разных тканях и при воздействии Р^х-зг^-^.' температур.

Успешные попытки получения клеточных ядер из тканей животд^г^ подвергнутых глубокому замораживанию, были предприняты в последнее вр»«^^^ рядом авторов (Li, Mombaerts, 2008; Loi et al., 2008; Hoshino et al., 2009). При 3-х-«-. v> ai. однако, исследователей интересовала не жизнеспособность клеток, а возможна

ГЬ получения из них неразрушенных ядер для дальнейшей пересадку В энуклеированные ооциты. Поэтому из этих данных остается неизвесх^^-^ сохраняли ли жизнеспособные клетки способность к дальне;^ дифференцировке в культуре.

Все вышеперечисленные литературные данные свидетельствуют в существующих представлений о возможной повышенной устойчи^0с^ недифференцированых клеток к действию низких температур. Вместе с Teivt^ д.дя выяснения степени устойчивости клеток, находящихся на разных сгг^д;нях дифференцировки, и ее зависимости от окружающей ткани необходимо пР0Ве;Д1^цие более систематических и детальных сравнительных исследований, чему и ^5Ьтла посвящена настоящая работа.

В связи с тем, что подавляющее число хирургических onepaj^j^ применением низкотемпературного воздействия производят при лечении к°>1сцого покрова человека, представляется логичным и вполне обоснованным пР°Водить такие детальные исследования устойчивости клеток разной с>1,ецени дифференцировки к охлаждению именно на этой ткани.

2.7. Строение кожной ткани человека

Кожа состоит из двух основных частей - эпидермиса и дермы Эпидермис представлен многослойным плоским постоянно обновляюцц^^ ороговевающим эпителием. Клетки эпидермиса, основную массу Которых составляют кератиноциты, образуют 5 основных слоев: базальный, шиг*оватый зернистый, блестящий и роговой, (Хэм и Кормак, 1983).

Подкожно-жировая клетчатка

Базальный слой Назальна* мембрана

Роговой слой слой слой

Шиповатый слой

Рис. 2. Схема строения кожи человека (Bernard, 2011).

Непосредственно на базальной мембране, представляющей сложную структуру разнообразных белков внеклеточного матрикса, отделяющую эпидермис от дермы, располагаются клетки, составляющие базальный слой. Это недифференцированные кератиноциты, которые представлены стволовыми и транзиторными клетками. Для стволовых клеток характерно ассиметричное деление, в результате которого одна клетка остается стволовой, а другая становится транзиторной. Транзиторные кератиноциты активно размножаются и затем вступают в процесс дифференцировки, т.е., специализируются и последовательно перемещаются в поверхностные слои эпидермиса и образуют вышеперечисленные слои. Таким образом, клетки базального слоя обеспечивают обновление эпидермиса.

Дифференцированные кератиноциты представлены в супрабазальных слоях эпидермиса, расположенных выше базального, и различаются между собой i гистологически и представляют различную степень дифференцировки кератиноцитов. Клетки шиповатого слоя, располагающегося над базальными клетками в 5-10 слоев, имеют полигональную форму и соединены между собой многочисленными мостиками - десмосомами. В десмосомах заканчиваются пучки промежуточных кератиновых филаментов. Зернистый слой состоит из 3-4 слоев плоских клеток, в цитоплазме которых накапливаются гранулы кератогиалина — предшественника рогового вещества кератина. Следующий - блестящий слой также состоит из 3-4 слоев плоских клеток, в которых ядра подвергаются деструкции и гибнут. Самый поверхностный, роговой слой состоит из многих слоев ороговевших клеток - роговых чешуек. Продолжительность всего процесса от клеточного деления до слущивания роговых чешуек с поверхности кожи в организме составляет 20-40 дней (в зависимости от локализации участка кожи). При этом постоянно происходит не только слущивание роговых чешуек, но и вступление в дифференцировку новых клеток. В норме оба процесса сбалансированы. ^

1 Базальная мембрана располагается на границе между эпителием и соединительной тканью и играет большую роль в контроле жизнедеятельности клеток. Как и в других тканях, базальная мембрана кожи участвует в создании и сохранении архитектуры ткани, обеспечении прикрепления соседних клеток, контролировании клеточной миграции и инвазии. Она состоит из трех зон: прозрачной пластины (Lamina lucida), плотной пластины (Lamina densa) и фибриллярной зоны (Sublamina densa) (Zillikens, 1999). Эти слои состоят из разных элементов внеклеточного матрикса (ВКМ) таких, например, как ламинин, фибронектин и коллагеновые волокна, которые наряду с полудесмосомами связывают базальные клетки с мембраной (Timpl et al., 1981; Yurchenko, Furthmayr, 1984; Yurchenko et al., 1992; Smola et al., 1998). При этом кератиноциты в культуре растут только на субстрате, состоящем из белков ВКМ и, в частности, коллагена I типа - преобладающего во внеклеточном матриксе. Коллаген синтезируется фибробластами - основным клеточным типом дермы, подлежащей под базальной мембраной эпидермиса.

Дерма делится на 2 слоя - сосочковый и сетчатый, которые не имеют четкой границы. Сосочковый слой располагается непосредственно под базальной мембраной и состоит из рыхлой соединительной ткани. Свое название этот слой получил от многочисленных сосочков, вдающихся в эпидермис. Внеклеточный матрикс состоит из коллагеновых и эластических волокон.

Сетчатый слой, обеспечивающий прочность, образован плотной соединительной' тканью с мощными пучками коллагеновых волокон и сетью эластических волокон. Пучки коллагеновых волокон проходят в двух направлениях: одни лежат параллельно поверхности кожи, другие — под углом. Вместе они образуют сеть, строение которой определяется функциональной нагрузкой на кожу. Клетки дермы представлены в основном фибробластами. Также встречаются макрофаги, тканевые базофилы и гладкомышечные клетки.

Кроме того, через дерму и эпидермис проходят волосяные фолликулы, потовые и сальные железы. В луковицах волосяных фолликул также, как и в базальном слое эпидермиса, находятся кератиноциты. Как можно видеть, кожная ткань представляет собой сложную структуру, состоящую из тесно взаимодействующих между собой клеток, которые могут оказывать обоюдное влияние на процессы морфогенеза и регенерации при различных видах повреждений. Для того, чтобы установить в какой степени устойчивы разные клетки к воздействию низких температур, необходимо иметь возможность следить за поведением кератиноцитов, находящихся на разных стадиях дифференцировки.

2.8. Дифференцировка кератиноцитов

В эпидермисе и волосяных фолликулах поддерживается баланс между делящимися и дифференцирующимися клетками. Базальные эпидермальные клетки отвечают на некий внешний сигнал, который, как предполагается, запускает программу терминальной дифференцировки. Когда клетки приостанавливают деление и начинают перемещаться к поверхности кожи, они изменяют свои адгезивные свойства, вследствие чего, вероятно, изменяются стадии их дифференцировки (Watt et al., 1993).

В процессе дифференцировки клетки эпидермиса постепенно меняют свои морфо-биохимические свойства, которые Выражаются в изменении размера, формы, организации цитоскелета и поверхностных рецепторов (Matoltsy, 1976). В настоящее время по степени дифференцировки кератиноциты подразделяют на 1 стволовые, транзиторные (находящиеся на пути к дифференцировке) и

I дифференцированные клетки (Allen, Potten, 1974; Potten et al., 1974; Lajtha, 1979;

Lavker, Sun, 1982; Potten, 1983; MacKenzie, Bickenbach, 1985). Стволовые и транзиторные клетки, как уже было сказано, сосредоточены в базальном слое, дифференцированные преимущественно находятся в супрабазальных слоях.

Стволовые кератиноциты - это «клетки, способные к самоподдержанию, например, с неизменной пролиферативной способностью на "протяжении всей жизни организма» (Lajtha, 1979). Большинство их находится в фазе G0 клеточного цикла (Potten et al., 1978). Считается, что стволовые клетки не существуют в организме сами по себе, а находятся в определенном микроокружении, которое обычно обозначают термином «ниша», где специфическое микроокружение стабилизирует их специфические свойства. В настоящее время этот термин используется для обозначения совокупности факторов, обеспечивающих жизнеспособность и самовоспроизведение стволовых клеток, а также дифференциацию дочерних транзиторных клеток. К числу факторов регулирующих их поведение относятся белки внеклеточного матрикса базальной J мембраны а также соседние клетки, включая фибробласты дермы, продуцирующих факторы роста и другие регуляторные молекулы (Spradling et al., 2001). Пространственная структура базальной мембраны и состав входящих в нее молекул еще полностью не установлены.

Считается, что клетки эпидермиса со свойствами стволовых клеток, имеют следующие характеристики: длительный клеточный цикл (до 200 ч) (Potten et al., 1 1982), что определяется по сохранению метки в ядре (меченного тимидина или

BrDu), высокий пролиферативный потенциал, локализация в защитной нише, способность сохранять и восстанавливать ткань, в которой они находятся, большая продолжительность жизни, и способность создавать клоны (Potten, Hendry, 1973; Bickenbach, 1981; Lavker, Sun, 1982; и др.). Такие клетки находятся в области «выпячивания» волосяного фолликула (Cotsarelis, Sun, Lavker, 1990; Michel et al., 1996; Morris, Potten, 1999) и в межфолликулярном базальном слое эпидермиса (Bickenbach, Mackenzie, 1984). Исследования in vitro показали, что в базальном слое эпидермиса содержится от 1 до 10% клеток, которые могут быть отнесены к t стволовым (Potten, Hendry, 1973; Morris et al., 1985; MacKenzie, Bickenbach, 1985; Morris, Potten, 1994; и др.).

Длительное время существовало убеждение, что транзиторные клетки необратимо выходят из компартмента стволовых клеток, однако стали появляться данные, свидетельствующие о том, что между стволовыми и транзиторными клетками нет резкой границы, а скорее имеется постепенный переход. После того, как стволовые клетки в результате деления дают начало транзигорным? клеткам, последние еще некоторое время могут сохранять свойства стволовых клеток. Например, Поттен называет их потенциальными стволовыми клетками и считает, что в норме они относятся к транзиторной субпопуляции, но при определенных условиях, например, гибели предсуществующих стволовых клеток, могут замещать последние (Potten, Morris, 1988).

Предполагают также, что транзиторные клетки являясь дочерними клетками стволовых, пролиферируют с высокой скоростью, но имеют ограниченное время жизни,. Идентификацию стволовых и транзиторных клеток затрудняет отсутствие специфических молекулярных маркеров. Как правило, для этого используют радиоактивные метки и клональный анализ. Эти два метода дают информацию, дополняющую идентификацию клеток с помощью анализа присутствия различных маркерных белков (Barrandon, 1993). Принято считать, что стволовые клетки отличаются от транзиторных по их более высокому синтезу a2ßl и a3ßl интегринов (Jones et al., 1995). Транзиторные клетки дают начало клеткам, которые начинают дифференцироваться (Barrandon and Green 1987; Jones and Watt 1993).

Одним из признаков, отражающих дифференцировку кератиноцитов in vivo, является смена в их цитоплазме ряда специфичных белков, в частности, кератинов (К) и появлением в супрабазальных клетках инволюкрина (Banks-Schlegel, Green, 1981; Moll et al., 1982; Barrandon, Green, 1987). Кератины являются одним из основных компонентов эпителиальных клеток и представляют собой белки промежуточных филаментов, диаметр которых составляет 7-11 нм.

В клетках кератины существуют в виде гетеродимеров, состоящих из двух цепей: кислой (тип II) и основной (тип I) субъединиц кератина. Всего у человека обнаружено 20 кератинов (Fuchs, 1988; Fuchs, Weber, 1994). Однако в клетках кожи обнаруживаются не все кератины. Для клеток базального слоя характерно присутствие К5 (58 кДа) и К14 (50 кДа) и иногда К15 и К17 (Nelson, Sun, 1983; Lloyd et al., 1995). Предполагается, что синтез этих кератинов может продолжаться и в супрабазальных слоях (Fuchs and Green, 1980; Woodcock-Mitchell et al., 1982; Skerrow and Skerrow, 1983). Однако мРНК кератинов K14 и К5 экспрессируется преимущественно в базальном слое (Tyner and Fuchs, 1986; Lersch and Fuchs, 1988). По мере дифференцировки базальных клеток они снижают экспрессию К5, К14 и К15 и начинают синтезировать новые наборы кератинов (Fuchs, Green, 1980; Sun et al., 1984; Lloyd et al., 1995).

Для клеток супрабазальных слоев характерна экспрессия К1 (67 кДа), К2 (65 кДа), К10 (56,5 кДа) и К11 (56 кДа) (Rice, Green, 1979; Viae et al., 1980; Tseng et al., 1982; Woodcock-Mitchell et al., 1982; Skerrow and Skerrow, 1983; Kopan et al., 1987). Сдвиг к сторону синтеза К1 и К10 один из самых ранних биохимических показателей перехода клеток к терминальной дифференцировке (таблица 1).

Таб. 1

Основные кератины клеток эпидермиса кожи человека.

Кератины (пары) Локализация

Тип II Тип I

К5 К14 Клетки базального слоя, область «выпячивания» волосяного корня, наружная оболочка корня волоса

К1 К10 Клетки шиповатого слоя, внутренняя оболочка корня волоса

К2 К11 Клетки вышележащих слоев

Кб К16 Гиперпролиферативный эпителий, при заживлении ран, наружная оболочка корня волоса

К19 Стволовые клетки эпидермиса и волосяных фолликул

Синтез кератинов в культуре первичных кератиноцитов и в линиях трансформированных клеток может значительно отличаться от таковой в организме (Wu, Rheinwald, 1981; Quinlan et al., 1985). В случае дифференцировки в гиперпролиферативном эпидермисе (включая тканевую культуру), при повреждении и при заживлении ран экспрессируются Кб и К16 (Moll et al., 1982; Sun et al., 1984). В культуре по достижении монослоя кератиноциты синтезируют К5, К14, К6,К16.

Кроме того, во время терминальной дифференцировки кератиноцитов экспрессируются такие белки как инволюкрин, лорикрин и филаггрин (Steinert et al., 1981; Dale 1977; Balmain et al., 1977; Watt, 1983).

Кератин Kl9 (40 кДа) является маркером, широко используемым для идентификации стволовых клеток кожи (Michel et al., 1996), в том числе клеток волосяных фолликулов. К19-положительные клетки относятся к клеткам, длительно сохраняющим радиоактивную метку и экспрессирующим высокий уровень аЗЫ интегрина. Количество таких клеток снижается по мере старения организма. У новорожденных в базальном слое кератиноцитов крайней плоти экспрессия К19 наблюдалась в 84% случаев, у доноров возрастом около 40 лет - в 0.1%. Кроме клеток волосяных фолликулов и клеток интерфолликулярного эпидермиса (Michel et al., 1996) Kl9 обнаруживается и в клетках целого ряда простых эпителиев (Moll et al., 1982).

Одним из фундаментальных нерешенных вопросов дифференцировки кератиноцитов остается вопрос о том, когда клетки начинают дифференцироваться: до того как покидают базальный слой или после? И какой именно фактор (внешний или внутренний) запускает процесс дифференцировки? К числу внешних факторов относятся элементы базальной мембраны, с которой клетки находятся в непосредственном контакте. Было замечено, что при нарушении контакта с базальной мембраной клетки начинают дифференцироваться (Watt, 1984; Tennenbaum et al., 1996). Показана также обратная связь между степенью распластанности клеток и уровнем экспрессии инволюкрина (Watt, 1987). Возможно, одним из стимулов дифференцировки является изменение соотношения рецепторов, вовлеченных в связь с лигандом. Показано, что при добавлении фибронектина к суспензионной культуре, когда все клетки круглые, дифференцировка не происходила (Adams,Watt, 1989). Подобные факты дали основание выдвинуть гипотезу о пассивной дифференцировке. Согласно выдвигаемым предположениям: в терминальную дифференцировку вступают те кератиноциты, которые выходят из базального слоя в результате потери связи с базальной мембраной, что запускает каскад событий, приводящих к.терминальной дифференцировке. По другим данным начало синтеза одного из маркеров дифференцировки, инволюкрина, может предшествовать переходу кератиноцитов в супрабазальное положение. Показано, что в монослойной культуре кератиноцитов приблизительно 30-50% базальных кератиноцитов содержат инволюкрин (Watt, Green, 1982). Таким образом, переход в поверхностные слои, скорее всего, является не причиной, а следствием дифференцировки. Этот переход происходит в результате изменения адгезивной способности кератиноцитов., в результате чего они перемещаются из базального слоя в вышележащие слои.

Кроме вышеперечисленных признаков предполагается, что стволовые клетки эпидермиса характеризуются быстрой адгезией к белкам ВКМ. При исследовании эффективности колониеобразования базальных клеток кожи человека in vitro было показано (Jones et al., 1995), что клетки, быстро адгезирующие к коллагену IV типа, формируют большие колонии. Данные других авторов (Radu et al., 2002; Kim et al., 2004) свидетельствуют о том, что более 50 % кератиноцитов, адгезирующих к коллагену IV типа за 10-20 мин, экспрессируют белок рбЗ, являющийся, как принято считать, маркером стволовых клеток, а также являются клетками, длительно сохраняющими метку.

Как следует из всего вышеизложенного, эпидермис кожи обновляется за счет базальных клеток, которые постоянно делятся и дифференцируются. При этом помимо нормального процесса слущивания терминально дифференцированных кератиноцитов (роговых чешуек) с поверхности кожи, подобный процесс может происходить под влиянием различных факторов окружающей среды, в том числе и под действием на них холода. Поскольку восстановление кожи должно происходить за счет недифференцированных кератиноцитов базального слоя, возникает вопрос о степени устойчивости этих клеток к низким температурам.

Ввиду того, что на устойчивость к действию низких температур кератиноцитов, находящихся в составе кожной ткани, помимо изменения их собственных свойств может влиять микроокружение и взаимодействие с другими клетками целесообразно проводить охлаждение, как выделенных клеток, так и клеток, находящихся в составе фрагментов ткани. Кроме того, вполне возможно, что устойчивость клеток к низким температурам может также зависеть от того, в каком виде они будут подвергнуты воздействию холодом. Например, при охлаждении в суспензии может происходить их сильное обезвоживание из-за накапливания вокруг них солей в процессе кристаллизации льда, в то время, как в осадке степень дегидратации может быть ниже и, следовательно, устойчивость клеток может увеличиваться.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Выделение и культивирование клеток

3.1.1. Выделение и культивирование кератиноцитов

Выделение кератиноцитов проводили по методу Рейнвальда (Rheinwald, 1980) с модификацией (Юдинцева и др., 1999). Кожу, полученную от здоровых л доноров, разрезали па мелкие кусочки размером 2x3 мм и инкубировали в течение 16-20 ч в смеси растворов 0.5% -ной диспазы II (Roche diagnostics GmbH Mannheim, Германия) и 0.2 %-ной коллагеназы гидробионтов (ОАО «Технология», Россия) при температуре +4 °С. Затем эпидермис отделяли пинцетом от дермы по линии базальной мембраны и обрабатывали смесью 0.125 %-ного раствора трипсина и 0,02 %-ного раствора версена при pH 7.6 в течение 10 мин при температуре 37 °С. Действие фермента останавливали добавлением 10 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США). Затем кусочки эпидермиса пипетировали для отделения от него кератиноцитов. Полученную суспензию клеток осаждали центрифугированием (600 g, 5 мин). Затем осадок клеток суспендировали в среде DMEM/F12 (Sigma, США).

Клетки в концентрацию! 14-15 х 104 кл/см2 вносили в чашки Петри, предварительно покрытые коллагеном I типа, выделенным из сухожилий крысиных хвостов (Chandrakasan et al., 1967), и культивировали в среде DMEM/F12 (Sigma, США) с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки и митогенов: инсулина в концентрации 5 мкг/мл (Sigma, США), гидрокортизона 5 мкг/мл (Sigma, США), эпидермального фактора роста 10 нг/мл (Sigma, США), холерного токсина 10 *10М (ICN-Flow, США), трансферрина 5 мг/мл (Sigma, США), аденина 1.8* 10"4 М (Sigma, США), лиотиронина 2*10"ПМ (Koch-Light, Великобритания) при 37 °С в атмосфере 5 % С02. Смену среды проводили через 2 сут.

3.1.2. Выделение и культивирование стромальных клеток костного мозга (СККМ) крысы

В работе были использованы беспородные крысы двухмесячного возраста. Животных усыпляли с помощью эфира и стерилизовали в 70%-ном спирте в течение 15 мин. Для выделения костного мозга брали бедренные кости. Промывали их в фосфатном буфере (PBS) без кальция и магния с добавлением гентамицина (Invitrogen, Великобритания) в концентрации 50 мкг/мл, отсекали эпифезы и осторожно вымывали костный мозг при помощи шприца с иглой 23G. Для выделения ядросодержащих клеток полученную смесь суспендировали в 2 мл PBS, наслаивали на 5мл раствора гистопака (Sigma, США) с плотностью 1,077 г/мл и центрифугировали при комнатной температуре 20 мин при 800 g. Клетки, находившиеся в интерфазном слое гистопака (в основном, ядросодержащие), переносили в другую пробирку и центрифугировали в десяти объемах раствора PBS при 600g в течение 15 мин при комнатной температуре для очистки от гистопака. Отмытые клетки переносили в пластиковые чашки Петри (Nunc, Дания) и культивировали в среде аМЕМ (Sigma, США), содержащей 10 % сыворотки эмбрионов коров (HyClone, США) и смесь пенициллина и стрептомицина (1:100 Invitrogen, Великобритания) при температуре 37 °С в атмосфере 5 % С02. Подсчет клеток проводили под инвертированным микроскопом с помощью камеры Горяева. Клетки пересевали, используя смесь 0.25%-ного раствора трипсина и 0.02%-ного раствора версена в PBS (137 мМ NaCl, 7 мМ Na2HP04, рН 7.4, 1.5 М КН2Р04, 2.7 мМ КС1) (Invitrogen, Великобритания).

3.1.3. Выделение и культивирование клеток опухоли EHS из мышей линии Balb

Суспензию клеток перевиваемой саркомы EHS (Englebreth-Holm- Swarm) (Kibbey, 1994) вводили под кожу мышам линии Balb. После образования опухолей мышей умерщвляли, затем иссекали опухоль и очищали её от некротизированной ткани. Далее с помошью скальпеля нарезали на мелкие фрагменты, помещали в колбу с раствором трипсина в концентрации 0.125 % и дезагрегацию опухоли проводили на магнитной мешалке в течение 20 мин. обработка трипсином повторяли трижды. Полученную фракцию клеток осаждали центрифугированием (600 g, 5 мин). Полученные осадки клеток суспендировали в среде ДМЕМ, содержащей 10 % сыворотки эмбрионов коров (Gibco) и смесь пенициллина и стрептомицина (1:100 Invitrogen, Великобритания), затем культивировали при температуре 37 °С в атмосфере 5 % С02.

3.1.4. Культивирование клеток линии А431.

Постоянная клеточная линия А431 (АТСС CRL-1555 - каталожный номер этой линии в Европейской коллекции клеточных культур) получена из эпидермоидной карциномы человека в 1997 г. путем последовательного субкультивирования. Для нашего исследования клетки А431 были предоставлены Коллекцией клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт Петербург)

3.2. Направленная дифференцировка СККМ в адипоцитарном или остеогенном направлении

Для индукции адипогенной дифференцировки использовали описанный в литературе метод (Reyes et al., 2010). Суспензию СККМ (2* 104 кл/см2) культивировали в среде, содержащей 90 % среды аМЕМ, 10 % лошадиной сыворотки (Sigma, США), 50 мкг/мл гентамицина (Invitrogen, Великобритания), 10" 9 M дексаметазона (Sigma, США), 50 мкг/мл аскорбината натрия (ICN, США), 1-кратный раствор ITS (100-кратный раствор, включающий инсулин, трансферрин, селенит натрия (Invitrogen, Великобритания), 1-кратный раствор LA-BSA (100-кратный раствор, содержащий 1 мкг/мл линолиевой кислоты и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина) (Sigma, США). Индукцию дифференцировки осуществляли в течение 2 нед. Смену среды проводили каждые 3-4-е сут. Степень дифференцировки клеток оценивали по содержанию в них липидов (Reyes et al., 2001). Краситель жировой красный (Sigma, США) готовили непосредственно перед окрашиванием клеток. Для этого 0.5%-ный раствор красителя в изопропаноле разводили в соотношении 3:2 дистиллированной водой и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0.2 мкм. Клетки промывали раствором PBS, фиксировали метанолом в течение 2 мин при температуре -20° С, промывали 50%-ным этанолом и окрашивали раствором жирового красного в течение 10 мин. Окрашенные клетки снова промывали 50%-ным этанолом, ополаскивали дистиллированной водой и сушили на воздухе.

Для индукции в остеогенном направлении суспензию СКЬСМ (1x10 кл/см ) переносили в индуцирующую среду, содержащую 90 % аМЕМ, 10 % лошадиной сыворотки (Sigma, США), 50 мкг/мл гентамицина (Invitrogen, Великобритания), 10"8 М дексаметазона (Sigma, США), 50 мкг/мл аскорбината натрия (ICN, США), 10 мМ Р -глицирофосфата натрия (Sigma, США) и культивировали в течение 2 нед. Смену среды проводили через каждые 3-4-е сут культивирования.

Степень дифференцировки клеток оценивали по интенсивности окраски на щелочную фосфатазу. Клетки 3 раза промывали раствором PBS и фиксировали 4%-ным раствором формальдегида (Sigma, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. Фиксированные клетки промывали трижды раствором PBS, после чего окрашивали на щелочную фосфатазу смесью BCIP-NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)-(HHTpocHfflffl тетразолий) (Sigma, США) в течение 20-40 мин в темноте при комнатной температуре. Окрашенные препараты 3-4 раза промывали дистиллированной водой и высушивали.

3.3. Методы определения жизнеспособности клеток

3.3.1. Определение жизнеспособности кератиноцитов

Жизнеспособность популяции кератиноцитов после воздействия на них низких температур оценивали по способности клеток к образованию многослойного пласта и времени, необходимого для осуществления этого процесса.

3.3.2. Фотоколориметрический метод оценки доли жизнеспособных клеток СККМ до и после их охлаждения

Долю жизнеспособных распластанных клеток: на поверхности культурального сосуда дифференцированных и недифференцированных СККМ, А431 и клеток опухоли EHS мыши до и после охлаждения определяли методом фотоколориметрического анализа. Содержимое каждой ампулы после охлаждения наносили по 200 мкл на 5 лунок в 96-луночной плате (Nunc, Дания) и инкубировали при температуре 37 °С в атмосфере 5 % С02 в течение 12 ч. После этого не прикрепившиеся клетки убирали вместе со средой, а клетки, оставшиеся прикрепленными и распластанными 2 раза промывали раствором PBS. фиксировали в течение 10 мин при комнатной температуре 70 %-ным раствором этилового спирта и окрашивали 0.1 %-ным раствором генциан-виолета в течение 20 мин, отмывали водой и высушивали. После чего высушенные клетки обрабатывали 10%-ной уксусной кислотой для экстракции из них поглощенного красителя. Далее с помощью анализатора «Charity» (ООО СКБ Пробанаучприбор, Россия) при длине волны 570 нм (Е570) измеряли оптическую плотность полученных растворов красителя в лунках. Предварительно была построена калибровочная кривая, с помощью которой по величине оптической плотности растворов в лунках судили о количестве жизнеспособных клеток. Каждый опыт повторялся 4-5 раз.

Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерной программы MS Excel. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости Р< 0.05.

3.4. Исследуемые объекты и режимы их охлаждения

3.4.1. Исследуемые объекты

Воздействия низких температур подвергали следующие объекты: клетки кожи человека, стволовые клетки костного мозга крысы, опухолевые клетки (клетки линии А431 и клетки опухоли EHS).

3.4.2. Охлаждение клеток кожи человека

Охлаждению подвергали: цельные фрагменты кожи, эпидермис после его отделения от дермы и кератиноциты, выделенные из эпидермиса в виде суспензии или в виде осадка после центрифугирования суспензии. Обработку исследуемых объектов холодом проводили двумя способами: путем прямого воздействия паров жидкого азота на клетки, используя чашки Петри с перфорированными крышками и путем охлаждения чашек Петри с неперфорированными крышками.

Охлаждение объектов проводили парами жидкого азота в камере программного замораживателя (Ice cube 1810, CSYLAB, Австрия) с электронным блоком контроля. Скорость охлаждения до температуры -10, -20 и -30 °С составляла 5 °С/мин, а до —40 °С и ниже до -12 °С/мин.

Для выявления оптимальных температурных режимов испытывали действие следующих низких температур: -10, -20, -30, -40, -50, -60 и -70 °С. К оптимальным температурам относили те, которые подавляли жизнеспособность гетерогенной популяции кератиноцитов, но в то же время не вызывали их полной гибели. Поскольку результат воздействия холодом мог зависеть от длительности экспозиции, соответственно, охлаждение проводили в течение 1, 3, 5 и 10 мин.

Жизнеспособность популяции кератиноцитов после воздействия на них низких температур оценивали по способности клеток к образованию многослойного пласта и времени, необходимого для осуществления этого процесса.

3.4.3. Охлаждение СККМ крысы и опухолевых клеток

Действию охлаждения подвергали СККМ до и после их дифференцировки в адипогенном или остеогенном направлении, опухолевые клетки трансформированной линии А431 и клетки первичной культуры, выделенной из EHS саркомы мыши (Kibbey, 1994). И в том и в другом случае клетки подвергались охлаждению в криоампулах в двух вариантах: в виде суспензии и в виде осадка после центрифугирования суспензии. Количество клеток в каждой криоампуле составляло 60 тыс/мл. Был использован такой же диапазон низких температур, как при обработке кератиноцитов Время охлаждения клеток после окончательного определения оптимальной температуры всегда составляло 5 мин. Количество жизнеспособных клеток после охлаждения в каждом варианте определяли методом фотоколориметрического анализа.

3.5. Иммунофлуоресцентный анализ степени дифференцировки кератиноцитов

Степень устойчивости к холоду эпидермальных клеток кожи человека, находящихся на разных стадиях дифференцировки, определяли по соотношению числа недифференцированных (молодых) клеток базального слоя и дифференцированных (старых) клеток в выделенной популяции после воздействия низких температур. Степень дифференцировки кератиноцитов определяли методом непрямой иммунофлуоресценции с помощью антител к соответствующим кератинам, являющимся маркерами определенной стадии дифференцировки.

Для проведения иммунофлуоресцентного анализа покровные стекла обрабатывали коллагеном I типа, полученным из сухожилий крысиных хвостов (Chandrakasan et al., 1967), в концентрации 1мкг/мл в течение ночи при +4 °С, затем трижды промывали раствором PBS (рН 7.4) и для исключения неспецифического связывания с субстратом обрабатывали 2 %-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 1 ч при 37 °С.

Затем на стекла наносили суспензию исследуемых клеток в концентрации ЗхЮ5 на стекло и выдерживали в течение Зч или 24 ч в ССЬ-инкубаторе при 37 °С. Неприкрепившиеся клетки удаляли, а распластанные фиксировали 4 %-ным раствором формальдегида (Sigma, США), обрабатывали 0.1 %-ным раствором Тритона X 100 в течение 15 мин, трижды промывали раствором PB S и наносили 2 %-ный раствор бычьего сывороточного альбумина на 30 мин для предотвращения неспсцифического связывания антител.

В качестве первых антител использовали следующие: моноклональные мышиные антитела на кератины человека (Novocastra laboratories Ltd., Великобритания):

Kl4 - маркер транзиторных клеток (в разведении 1:50),

Kl9 — маркер стволовых кератиноцитов и

К10 - маркер дифференцированных клеток (1:100).

В качестве вторых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против IgG мыши, конъюгированные с FITC (Fluorescein Isothiocynate) (rabbit anti-mouse IgG FITS-Conjugate, Sigma, США) в разведении 1:250.

Клетки инкубировали с первыми антителами против К14 иКЮ в течение 60 мин, а против К19 в течение 30 мин. После трехкратной отмывки клеток раствором PBS наносили вторые антитела и инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте с последующим 3-кратным отмыванием PBS.

Для выявления актиновых структур 100 мкл родамин-фаллоидина (Molecular probes, США) в концентрации 10 ед/мл наносили на покровное стекло и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте, после этого трижды отмывали раствором PBS. В качестве заключающей среды использовали Mounting medium (Pharmacia Biotech., Швеция). Идентификацию окрашенных клеток проводили с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL (Zeiss, Германия). Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм и HeNe -лазер с длиной волны 543 нм. Применяли раздельное сканирование для каждого сигнала. Совмещение двух сигналов проводили с помощью компьютерной программы Leica Confocal Software.

Соотношение клеток, находящихся на разных стадиях дифференцировки, определяли с помощью флуоресцентного конфокального микроскопа (Leica Karl Zeiss, Германия) путем подсчета окрашенных клеток (по 100 клеток в 6 разных полях зрения). Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерной программы Image J. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости Р < 0.05.

3.6. Стриппинг многослойного пласта кератиноцитов и снятие клеток базального слоя

За сутки до опыта ростовую питательную среду заменяли средой DMEM/F12 (Sigma, США) с пониженным содержанием ионов Ca (0.1 мМ) для того, чтобы произвести дестратификацию, то есть, отслоение и удаление супрабазальных слоев дифференцированных клеток (Jensen, Bolund, 1988). Эти клетки удаляли путем смывания их средой DMEM/F12. Оставшиеся прикрепленными к поверхности культурального сосуда клетки базального слоя промывали 0.02 %-ным раствором ЭДТА, затем открепляли от подложки смесью растворов 0.125 % трипсина и 0.02 % ЭДТА в соотношении 1:1 в течение 2-3 мин при 37 °С. После того, как клетки округлялись и начинали отделяться от субстрата, действие смеси трипсина и ЭДТА подавляли добавлением культуральной среды с сывороткой. Полученную суспензию клеток пипетировали, осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант удаляли, клетки промывали PBS и повторно центрифугировали. После удаления супернатанта осадок клеток суспендировали в среде DMEM/F12 и они могли быть использованы для выделения белков теплового шока.

3.7. Определение белков теплового шока

Для определения белков теплового шока были использованы как супрабазальные слои многослойного пласта кератиноцитов, так и клетки базального слоя, полученные в результате проведенной процедуры стрипиннга. Клетки базального слоя отделяли от поверхности культурального сосуда механически при помощи клеточного скребка и помещали в раствор PBS.

Кератиноциты супрабазального и базального слоев промывали по два раза раствором PBS с центрифугированием в течение 5 мин при 600g,. Супернатанты удаляли и полученные осадки суспендировали в лизирующем буфере в объеме в 2 раза большем, чем объем осадка. Лизирующий буфер готовили на дистилированной воде. Он содержал: 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl., 2 мМ EDTA., 0.5 %-ный Тритона XI00, ингибиторы протеаз, 100 мМ PMSF, 1М ДДТ для расщепления дисульфидных связей. Затем снова центрифугировали со скоростью 13тыс.об./мин, 15 мин при температуре +4 °С.

Полученные супернатанты переносили в новые пробирки и добавляли в них, в зависимости от полученного обьема, 4-кратный объем ацетона, pH 4-5, и оставляли в нем на 24 ч при -20 °С для полного осаждения белков. Ацетон удаляли после центрифугирования (13тыс.об./мин., 15 мин) при температуре +4 °С. Полученный осадок суспендировали в буфере Лэммли (Laemmli, 1970), содержащем 0.125 М Трис-HCl, pH 6.8, 2 %-ный SDS, 0.1 М ДТТ, 10 %-ный глицерин, 0.005%-ный бромфеноловый синий, и прогревали в течение 7 мин при 100 °С.

3.8. SDS-электрофорез и иммуноблотинг

Белки разделяли в 10 %-ном полиакриламидном геле в присутствии 0.1 %-ного раствора SDS, pH 8.3 (Bio-Rad Laboratories GmblI, Германия). Электрофорез проводили в электродном буфере в течение около 90 мин. при постоянном напряжении 100 В. Для определения молекулярного веса использовали белковые маркеры с молекулярной массой 10-170 кДа (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas, Литва). После окончания электрофореза гель инкубировали в течение 60 мин в фиксирующем растворе, содержащем 45 %-ный метанол и 10 %-ную ледяную уксусную кислоту, после чего окрашивали 0.125 % -ным раствором Кумасси (G - 250) в течение 60 мин и отмывали избыток красителя 7 %-ной уксусной кислотой. Окраска методом Кумасси позволяет получать линейную зависимость между количеством связанного с белком красителя и концентрацией белка. В препаратах определяли концентрацию тотального белка. Сравнительный анализ концентраций белков в геле проводили измерением оптической плотности электрофореграмм при помощи прибора ChemiDock XRS и программы Quantity One (BioRad).

Белки переносили на мембрану PVDF (Millipore) по стандартной методике (Towbin et al., 1979). Перенос осуществляли с помощью установки для переноса (BioRad, США) в течение ночи при температуре +4 °С и напряжении 15 В. После переноса отмывали мембрану в течение 20 мин раствором PBST, содержащем PBS и 0.1 %-ный Твин-20 (Tween-20). Затем выполняли забивку 5 %-ным раствором обезжиренного сухого молока, разведенного на PBST в течение 60 мин. После этого дважды промывали буфером PBST. Инкубировали при +4 °С с первыми антителами в течение ночи. Дважды отмывали буфером PBST. Затем инкубировали 60 мин со вторыми антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой.

После этого отмывали в течение 60 мин буфером PBST. Моноклональные антитела против белка теплового шока HSP 70 разводили в соотношении 1:1000; вторые антитела против IgG мыши (Sigma, США) разводили в соотношении 1:10000.

Для визуализации сигнала использовали систему хемилюминесценции ECL с добавлением субстратов люминола (1.25 мМ), паракумаровой кислоты (0.2 мМ) и 0.01 %-ной Н202 в 1.5 М Трис-HCl pH 8.8. Хемилюминесценцию регистрировали на установке ChemiDok XRS (BioRad). Фотографии гелей были получены на приборе ChemiDoc XRS с помощью программы QuantityOne. Вычисление средних значений и 95 %-ных доверительных интервалов проводили при помощи программ Origin и Excel. В работе представлены данные трех и более независимых экспериментов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Воздействие холода на гетерогенную популяцию кератиноцитов

Для того чтобы выяснить, оказывает ли холод различное действие на кератиноциты, находящиеся на разных стадиях дифференцировки, необходимо было, прежде всего, найти те оптимальные режимы охлаждения, при которых только часть исследуемой популяции клеток сохраняла бы жизнеспособность и была бы в состоянии пролиферировать и дифференцироваться до формирования многослойного пласта. С этой целью суспензию кератиноцитов, выделенных из фрагментов кожи, в концентрации 4*103 кл/мл подвергали действию следующих температур: -10, -20, -30, —40, -50,-60 и -70 °С в течение 1, 3, 5 или 10 мин.

Ввиду характерной особенности кератиноцитов базального слоя образовывать в культуре плотные колоний, оказалось невозможным производить точный подсчет оставшихся жизнеспособных клеток после охлаждения полученной суспензии. Предварительная диссоциация существующих в популяции колоний клеток с использованием ферментов приводит к потере пролиферативной способности и образованию многослойного пласта, свидетельствующего об их жизнеспособности. Поэтому сохранение жизнеспособности клеток в агрегатах оценивали по способности и времени формирования ими многослойного пласта в процессе культивирования.

Приведенные в табл. 2 данные демонстрируют, что при -10 и -20 °С способность клеток к формированию многослойного пласта не отличалась от контроля при 37 °С, и в том, и в другом случае для этого требовалось 20-25 сут. Напротив, при -50. -60 и -70 °С большинство клеток погибало, а оставшихся жизнеспособных клеток было недостаточно для формирования многослойного пласта даже в течение более длительного времени культивирования.

Наиболее приемлемыми режимами охлаждения, при которых часть клеток погибала, а оставшиеся кератиноциты сохраняли способность образовывать многослойный пласт, оказалось охлаждение суспензии до -30 и -40 °С в течение 5 мин. После такой обработки формирование пласта происходило через 30-35 и 40 сут, соответственно.

Табл.2

Формирование многослойного пласта кератиноцитов после 5 мин охлаждения их в суспензии и в осадке.

Температура, °С Сроки образования многослойного пласта

В суспензии В осадке

37 (контроль) 20 — 25 20 — 25

-10 20 — 25 20 — 25

-20 20 — 25 20 — 25

-30 30 — 35 20 — 25

-40 40 30 — 35

-50 не образуется 30 — 35

-60 * не образуется 40

-70 не образуется 40

Полученные данные также показали, что при действии холода в течение 1 мин или 3 мин время формирования пласта клетками чаще всего не отличалось от контроля, а при таком же воздействии в течение 10 мин клеток, способных к его образованию, оставалось слишком мало. Таким образом, наиболее оптимальным режимом селективного воздействия холода на исследуемые клетки оказалась экспозиция в течение 5 мин при -40 °С. В дальнейшей работе этот режим обработки низкими температурами служил отправной точкой при сравнении всех остальных вариантов проведенных экспериментов. Несмотря на гибель значительного числа клеток, жизнеспособными оставались преимущественно те из них, которые были способны к пролиферации и последующей дифференцировке, а именно, так называемые, молодые кератиноциты.

На рис. 3 представлены фотографии кератиноцитов, прикрепившихся к субстрату, в процессе их пролиферации и формирования многослойного пласта в контроле и после воздействия холодом. Можно видеть, что, как в контроле (рис. 3, а), так и после воздействия холодом при -20 °С в течение 5 мин через 7 сут после их посева на фоне монослоя распластанных кератиноцитов видны многочисленные колонии круглых клеток (рис.3, б). При охлаждении до -40 °С наблюдается большее взаимодействие между клетками и выстраивание их в цепочки (рис.3, в). При этом за 7 сут монослой распластанных базальных кератиноцитов не образуется, крупные колонии отсутствуют, формируется большое число тяжей из цепочек клеток. При дальнейшем культивировании этих клеток, спустя 14 сут, образовавшаяся сетка заполняется новыми клетками, в результате образуются крупные скопления клеток, которые являются, по-видимому, основой для дальнейшего формирования многослойного пласта через 35-40 сут. (рис.3, г).

Рис. 3. Состояние кератиноцитов через 7 сут. культивирования после охлаждения их парами жидкого азота в суспензии: а - 37 °С (контроль); б - (20 °С); в - (-40 °С); через 14 сут культивирования- г - (-40 °С).

Многолетний мировой опыт работы с клеточными культурами показывает, что одиночные клетки более чувствительны к негативным внешним воздействиям, чем популяции взаимодействующих между собой клеток. Ранее на примере трансформированной клеточной линии НеЬа нами было показано (Шубин и др, 1999), что степень повреждения культивируемых клеток в условиях низких температур зависит от степени их взаимодействия между собой. После обработки в одинаковых условиях парами жидкого азота клетки, находившиеся в суспензии, погибали, а значительная часть клеток, находившихся в осадке после предварительного центрифугирования перед охлаждением, оставалась жизнеспособной и быстро формировала монослой (Шубин и др, 1999).

Так как кератиноциты в составе эпидермиса находятся в тесном взаимодействии друг с другом, необходимо было выяснить, в какой мере это взаимодействие влияет на результат охлаждения. В связи с этим выделенные из ткани кератиноциты осаждали центрифугированием, а полученный осадок подвергали охлаждению парами жидкого азота в том же режиме, что и клетки в суспензии. Затем клетки суспендировали, вносили в чашки Петри и наблюдали за их способностью образовывать многослойный пласт.

Полученные результаты показали, что обнаруженная ранее тенденция клеток к большей устойчивости в осадке при действии низких температур распространяется и на кератиноциты. Эти клетки формировали пласт в течение 40 сут культивирования даже после действия охлаждения при -60 и -70 °С в течение 5 мин. При охлаждении осадка клеток до -40 или -50 °С пласт формировался лишь за 30-35 сут. При температурах охлаждения, равных -10, -20 или -30 °С, реакция клеток не отличалась от контроля, и пласт формировался за 20-25 сут (табл. 2). Таким образом, кератиноциты в осадке действительно оказываются более устойчивыми к воздействию даже самых низких температур.

Для того чтобы проверить, обладают ли повышенной устойчивостью к действию низких температур кератиноциты, взаимодействующие между собой в составе ткани, охлаждали эпидермис, отделенный от дермы, а также суспензию клеток, выделенных из цельного фрагмента кожи (рис. 4). фрагмент кожи фрагмент кожи выделенные нз эпидермиса кератнношггы в виде суспензии осадка 1 » 1 охлаждение I культивирование фрагмент кожн охлаждение выделенные нз эпидермиса кератнношггы культивирование охлаждение

Прямое Непрямое воздействие воздействие щ, ж перфорированная непер фор нрованная чашка Петри чашка Петри выделенные из эпидермиса кератнношггы

I I культивирование

Рис. 4. Схема экспериментов по воздействию низких температур на кератиноциты

После охлаждения эпидермиса при разных температурах из него выделяли кератиноциты и определяли их способность к образованию многослойного пласта. Вопреки ожиданиям, мы не обнаружили различий по жизнеспособности между клетками, подвергнутыми действию низких температур в составе эпидермиса и в суспензии. Как видно из табл. 3, и те, и другие клетки образовывали многослойный пласт через 20-25 сут после охлаждения при -10 и -20 °С в течение 5 мин. Клетки, находившиеся при -30 °С в течение 5 мин, образовывали пласт за 30-35 сут, а после охлаждения до температуры ниже -40 °С (5 мин) были не в состоянии образовывать пласт даже в течение 40 сут.

Табл. 3.

Влияние охлаэадения кератиноцитов в суспензии и в составе эпидермального слоя на время образования многослойного пласта.

Температура, °С Сроки образования многослойного пласта суспензии Эпидермис

37 (контроль) 20 — 25 20 — 25

-10 20 — 25 20 — 25

-20 20 — 25 20 — 25

-30 30 — 35 30 — 35

-40 40 40

-50 не образуется не образуется

-60 не образуется не образуется

-70 не образуется не образуется

Таким образом, клетки базальиого слоя, охлажденные как в суспензионном состоянии, так и в составе выделенного эпидермиса, не отличались по устойчивости к низким температурам. В связи с этим важно было выяснить влияние холода на фрагменты цельной кожи. В этой серии экспериментов охлаждение выделенных биоптатов проводили двумя способами: в обычных чашках Петри и в чашках с перфорированными крышками. Во втором случае биоптаты подвергались непосредственному действию паров азота, подобно аналогичному воздействию на кожу человека в медицинских целях.

Уже в первых экспериментах обнаружилось, что клетки биоптатов кожи, взятых из различных участков кожного покрова, различаются по устойчивости к действию низких температур. Поэтому в дальнейшей работе было проведено систематическое сравнительное исследование влияния низких температур на жизнеспособность кератиноцитов, выделенных из трех различных по локализации в организме типов биоптатов кожи: веки, лицо и грудь. Для проверки способности исследуемых клеток формировать многослойный пласт использовали, как и в предыдущих случаях, разные температуры и разную экспозицию, но в табл. 4 приведены только окончательные результаты, характеризующие оптимальные режимы охлаждения, установленные для разных исследованных биоптатов.

Оказалось, что различная устойчивость кератиноцитов к низким температурам зависит как от места локализации в кожной ткани, так и от условий обработки биоптатов холодом. Данные показывают, что клетки из области век менее устойчивы к холоду по сравнению с клетками лица и груди (табл. 4). При этом выяснилось, что на устойчивость к холоду существенно влиял способ охлаждения парами жидкого азота - непосредственно на биоптат или через неперфорированную крышку. Клетки век, подвергнутые обработке холодом при температурах ниже -30 °С (5 мин) в закрытой чашке, не формировали многослойный пласт даже в течение 40 сут. В то время как охлаждение при -30 °С в течение 5 мин не препятствовало формированию многослойного пласта. В то же время кератиноциты из биоптата, охлажденного в перфорированной чашке, могли выдержать лишь -20 °С в течение того же времени. При этом пласт формировался в течение 30-35 сут. После обработки парами жидкого азота при температуре —10 °С пласт формировался в течение 20-25 сут, что незначительно отличалось от контроля. Клетки лица в неперфорированной чашке выдерживали —40 °С в течение 5 мин, а в перфорированной - лишь 3 мин при той же температуре.

Табл. 4.

Оптимальные условия охлаждения биоптатов кожи разной локализации и для формирования пласта кератиноцитами в течение 40 сут.

Примечание: Образование пласта контрольными клетками (37 °С) не зависело от локализации и составляло 20—25 сут.

Параметр Чашки Петри Чашки Петри перфорированные веки лицо грудь веки лицо грудь

Температура,°С -30 -40 -50 -20 -40 -50

Время, мин 5 5 10 5 3 5

Самыми устойчивыми к таким условиям обработки оказались клетки кожи груди, которые выдерживали 10 мин охлаждения до —50 °С в неперфорированной чашке и такое же воздействие, но только в течение 5 мин в перфорированной. И в том, и в другом случае клетки формировали пласт за 40 сут. При -60 °С в течение 5 мин в этих же условиях пласт не формировался даже за 40 сут. При температуре -40 и -30 °С для формирования пласта было достаточно 30-35 сут. При температуре -10 и -20 °С пласт образовывался, как и в контроле, за 20-25 сут (табл. 4) . Более низкая устойчивость кератиноцитов из биоптатов кожи, подвергшихся охлаждению в перфорированной чашке, может объясняться деструктивным эффектом прямого воздействия паров жидкого азота на ткань.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при воздействии холодом на клетки или ткани в оптимальном режиме (5 мин при* -40 °С) оставшиеся жизнеспособными клетки размножаются и образуют, многослойный пласт практически во всех экспериментальных вариантах. Это давало основание полагать, что гибели подвергаются главным образом дифференцированные клетки.

Для того, чтобы убедиться в справедливости высказанного предположения, необходимо было подтвердить, что именно стволовые и транзиторные кератиноциты являются более устойчивыми к действию низких температур. С этой целью был проведен иммуннофлуоресцентный анализ клеток, окрашенных антителами против К19 (маркер стволовых клеток), К14 (маркер базальных или транзиторных клеток) и К10 (маркер дифференцированных кератиноцитов) после воздействия на них холода и последующего перевода в культуру. Исходя из результатов предыдущих экспериментов, охлаждению в течение 5 мин при -20 и -40 °С подвергали не цельный биоптат, а только эпидермис, отделенный от дермы. Для выявления всех клеток, прикрепившихся и распластанных на субстрате, использовали окраску актинового цитоскелета родамин-фаллоидином.

4.2. Иммуннофлуоресцентный анализ гетерогенной популяции кератиноцитов

Иммуннофлуоресцентный анализ гетерогенной популяции кератиноцитов в культуре проводили через 3 (рис. 5) и 24 ч (рис. 7) после воздействия холода. Эти временные интервалы были выбраны в связи с данными, полученными Спичкиной и соавторами (Спичкина, 2006), о том, что клетки разной степени дифференцировки в гетерогенной популяции базальных кератиноцитов отличаются по скорости адгезии к субстрату. Через 3 ч адгезирует только часть клеток, обладающих большим сродством к белкам базальной мембраны (в данном случае, к коллагену), а через 24 ч уже все клетки популяции прикрепляются к субстрату.

К19-БИС РФ Совмещение

Рис.5. Изменение соотношения стволовых и дифференцированных клеток в популяции кератиноцитов, прикрепившихся к субстрату за 3 ч после охлаждения до разных температур: а - 37 °С (контроль); 6 — (-20 °С); в - (-40 °С). Здесь и на рис. 7 клетки, меченные антителами против кератина 19 (К19-ФИТЦ); цитоскелет окрашивали родамин-фаллоидином (РФ) для визуализации всех клеток.

Анализ адгезировавших клеток показал, что в контроле (37 °С) наряду с ярко окрашенными против К19 стволовыми клетками присутствует также значительное количество дифференцированных кератиноцитов. Через 3 ч после воздействия холода (при -20 °С) общее число прикрепленных клеток на препаратах снижалось.

При этом относительное количество недифференцированных клеток возрастало. Дальнейшее понижение температуры до —40 °С сопровождалось отчетливым преобладанием на препаратах недифференцированных клеток. Подсчет соотношения стволовых и дифференцированных клеток показывает, что на долю стволовых клеток в контроле приходится 32 % от общего числа клеток, прикрепившихся к субстрату за 3 ч. После обработки холодом при температуре -20 °С их число увеличивается практически вдвое (до 63 %). После охлаждения при -40 °С их становится несколько больше (до 67 %), но эти различия не достоверны. Таким образом, несмотря на снижение общего количества устойчивых клеток, быстро адгезирующих к субстрату, при понижении температуры до -40 °С соотношение между стволовыми и дифференцированными кератиноцитами остается практически тем же самым, что отражено на рис. 6.

90 д 80 о л 70 я 60 к л 50 е 40 т о 30 к 20 в 10

0 й® та

88888

37 °С (контроль)

-20 °С

Ш8

-Ж) °С

Рис. 6. Соотношение жизнеспособных стволовых (1) и дифференцированных (2) кератиноцитов через 3 ч после охлаждения.

При анализе состава клеток, прикрепившихся к субстрату через 24 ч после охлаждения, как и следовало ожидать, на препаратах наблюдалось увеличение общего количества клеток, подвергнутых действию холода при тех же температурах по сравнению с их числом после 3 ч культивирования. При этом увеличение числа адгезировавших клеток, как в контроле, так и после действия холода, происходило за счет стволовых кератиноцитов (рис. 7).

К 19-РГГС РФ Совмещение а б В

Рис. 7. Изменение соотношения стволовых и дифференцированных кератиноцитов, окрашенных через 24 ч после охлаждения: а - 37 °С (контроль); б - (-20 °С); в - (-40 °С).

В контроле доля стволовых клеток составляла 42 %. После охлаждения при температуре -20 °С она возрастала до 65 % и доходила до 70 % после -40 °С. Так же, как и в случае прикрепления клеток в течение 3 ч после охлаждения, наибольшее изменение состава клеток в пользу увеличения доли стволовых клеток в популяции почти в два раза происходило уже под влиянием температуры -20 °С (рис. 8).

Д О л я к л е т о к в

90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

37 °С (контроль) Ш

-20 °С

-40 °С

Рис. 8. Соотношение жизнеспособных стволовых (1) и дифференцированных (2) кератиноцитов через 24 ч после охлаждения.

В наших предыдущих исследованиях было выявлено, что К19 не является маркером исключительно для стволовых кератиноцитов, он содержится в меньших количествах и в транзиторных клетках и постепенно исчезает в процессе перехода кератиноцитов в последующие дифференцированные состояния. В связи с этим клетки дополнительно метили антителами против К14, преимущественно взаимодействующими с транзиторными клетками, и против К10, характерный маркер дифференцированных клеток. Такая метка должна была уточнить, в какой мере предыдущее мечение охлажденных клеток против К19 соответствует именно доле стволовых кератиноцитов.

Рис. 9, а) показывает, что доля транзиторных клеток в контроле через 3 ч после посева составляет 47 %. После обработки холодом при температурах -20 и — 40 °С она увеличивается до 65 и 75 %, соответственно. Увеличение времени адгезии клеток до 24 ч приводит лишь к незначительным изменениям количества прикрепившихся клеток. В контроле за это время доля транзиторных клеток практически не изменилась (49 %). После охлаждения при температуре -20 °С она составляет те же 65 %, а при -40 °С даже снижается до 68 % (рис. 9, б), что может являться результатом начавшегося процесса дифференцировки. д 90 о 80 л я 70 к 60 л 50 е 40 т о 30 к 20 в 10 0

37 °С (контроль)

20 °С Т т

К;-:::::

Швзр 1

-40 °С д 90 о 80 л я 70 к 60 л 50 е

40 т о 30 к

20 в 10 0

37 °С (контрол 1»)

20 °С

40 °С □ *

Рис. 9. Соотношение транзиторных (1) и дифференцированных (2) кератиноцитов через 3 (а) и 24 (б) ч после охлаждения.

Таким образом, результаты показывают, что в популяции оставшихся жизнеспособных клеток после охлаждения при низких температурах действительно преобладают молодые (стволовые и транзиторные) кератиноциты.

4.3. Содержание белка теплового шока Нэр 70 в дифференцированных и недифференцированных кератиноцитах

Результаты экспрессии белков теплового шока Нвр 70 у дифференцированных и недифференцированных кератиноцитов представлены на рис. 10.

Недифференцированные Дифференцированные контроль -20 С -20 С контроль маркер

Рис. 10. Содержание белков теплового шока Н8Р70 в лизатах дифференцированных и недифференцированных кератиноцитов до и после охлаждения при температуре -20 °С.

Данные электрофоретического анализа белка теплового шока Шр 70 показывают, что концентрация этого белка в дифференцированных и недифференцированных кератиноцитах различается при воздействии на них низких температур, о чем свидетельствуют результаты, представленные на рис. 10. Можно видеть, что у дифференцированных и недифференцированных кератиноцитов ШР 70 при температуре 37 °С (контроль) содержится в соизмеримых количествах в обоих вариантах. Однако после воздействия низких температур при режиме -20 °С в течение 5 минут в недифференцированных клетках белок синтезируется в значительно большем количестве по сравнению с контролем, с другой стороны, у дифференцированных кератиноцитов этот белок практически не синтезируется. У недифференцированных его исходно значительно больше и под воздействием охлаждения количество его отчетливо возрастает.

4.4. Воздействие низких температур на СККМ до и после их дифференцировки в адипогенном или остеогенном направлении

Через 3 нед культивирования в индуцирующей среде доля СККМ, дифференцированных в адипогенном или остеогенном направлениях была максимальной, поэтому в эксперименты брали клетки именно после этого срока индукции (рис. 11).

Недифференцированные СККМ г , А"- - .

Л 'Л ?■ •

V- 'к #•

Уг*

Шт -* »5 *

• ^ ,, . ' »

V * у * • .ч»

Аднпоцнтарная днфференцнровка

Остеогенная днфференцнровка

Рис . 11. Стволовые клетки костного мозга (СКК М) после дифференцировки в адипогенном или остеогенном направлениях. Инвертированный микроскоп - Об.: 10х

Сначала действию низких температур подвергали исходные и дифференцированные стромальные клетки, находящиеся в суспензии.

Фотоколориметрический анализ клеточных популяций показал, что после охлаждения исходных СККМ при -20 °С доля клеток, способных! к дальнейшему росту в культуре, составляла около 70 *М>. При этих же услоЕыиях охлаждения суспензий СККМ, дифференцированных как в адипогенном, так и остеогенном направлении, доля жизнеспособных клеток снижалась до 50 % общего числа клеток.

При воздействии более низкой температуры (-40 °С) не был о зафиксировано существенных различий по устойчивости к холоду между Диффегх=>е;нцированными и недифференцированными СККМ. Доля клеток, способных к рост-у в культуре, во всех вариантах составляла 40 % от исходного количества.

Дальнейшее понижение температуры до -50 °С приводило хслетки к гибели. Клетки полностью утрачивали способность к распластыванию ти; пролиферации, (рис 12). При одном и том же режиме охлаждения СККМ, находхящиеся в осадке, сохраняли большее количество клеток, как дифференцированных, так и недифференцированных, способных к росту в культуре, чем СКГКМ в состоянии суспензии.

100 в

СККМ Адипоциты Остеоциты

Рис. 12 . Степень выживаемости стволовых и дифференцированных СККМ после охлаждения их до низких температур. Клетки, охлажденные в виде суспензии. Температура: 37 (1), -20(2), -40(3), -50(4) °С.

Результаты фотоколориметрического анализа показывают, что после охлаждения исходных СККМ в виде осадка при -20 °С доля жизнеспособных клеток составляла около 90 %, а при -40 °С около 70 % от общего количества клеток.

При дальнейшем снижении температуры до -50 °С незначительная часть клеток в осадке (20 %) все-таки выдерживала охлаждение, в то время как клетки в суспензии полностью погибали.

При охлаждении до -20 °С СККМ с адипогенной дифференцировкой жизнеспособными оставалось 70 % клеток, а при охлаждении до -40 °С - около 50 %. СККМ. СККМ, дифференцированные в остеогенном направлении, при охлаждении в осадке были менее устойчивы к действию холода по сравнению с недифференцированными клетками. При воздействии на них температуры -20 °С доля жизнеспособных клеток составляла 60 %, а при охлаждении до -40 °С жизнеспособными оставались 40 % клеток (рис. 13). В тоже время СККМ в осадке, дифференцированные в адипогенном и остеогенном направлениях, совсем не выдерживали охлаждения до -50 °С и погибали.

СККМ Адипоциты Остеоциты

Рис. 13 . Степень выживаемости стволовых и дифференцированных СККМ после охлаждения их до низких температур. Клетки, охлажденные в виде осадка. Температура: 37 (1), -20(2), -^0(3), -50(4) °С.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что устойчивость СККМ к воздействию низких температур снижается после их дифференцировки в адипогенном или остеогенном направлении.

4.5. Результаты воздействия низких температур на клетки постоянной линии А 431 (эпидермоидная карцинома человека) к о л и ч е с т в о к л е т о к

60 50 40 3020 ю к, ч \ - * \ ч \ ч V ч \ % V к ч ч. \ \ \ N \Г \ Г- . - осадок •-суспензия

37 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70

Рис. 14. Устойчивость к действию низких температур клеток А431 в осадке и в суспензии. Здесь и на рис. 15 по оси ординат количество клеток х 103

После 5-минутного охлаждения клеток постоянной линии А431 в суспензии, максимально низкая температура, которую они выдерясивали, составляла -30 °С, при этом часть популяции (20 %) сохраняла жизнеспособность. Клетки при температуры ниже -30 °С полностью погибали. Опухолевые клетки, подвергавшиеся охлаждению при -10 °С не отличались сильно от контроля (37 °С). Как показывают результаты, отраженные на рис. 14, доля клеток, оставшихся жизнеспособными после воздействия -20 °С, снижалась в половину. В то же время при охлаждении клеток в осадке их устойчивость к низким температурам не так резко падала по сравнении с тем, что наблюдалось при охлаждении в суспензия. При воздействии -10 и -20 °С клетки не отличались сильно от контроля, при -30°С около 60 % клеток остается жизнеспособными, при -40 °С доля оставшихся жизнеспособными клеток составляла 40 %. Устойчивость клеток к воздействиям низких температур резко падала при температуре ниже -40 °С, и клетки полностью разрушались.

4.6. Результаты воздействия низких температур на опухолевые клетки ЕН8. к о л и ч е с т в о к л е т о к

•суспензия ■ осадок

37

-10

-20

-30

-40

-50

Рис. 15. Устойчивость клеток ЕН8 к воздействию низких температур в состоянии осадка и в суспензии.

Для 5-минутного охлаждения свежевыделенных опухолевых клеток ЕН8 саркомы мышей, самой низкой была температура -40 °С, при которой часть клеток (60 %) сохраняла жизнеспособность. Устойчивость клеток при более низких температурах резко снижалась, так при -50 °С клетки разрушались и теряли жизнеспособность. При -10 °С количество распластанных при культивировании клеток не отличалось сильно от контроля и составляло около 95 %. При воздействии —20 °С и — 30 °С доля распластанных клеток составляла 80 % (Рис. 15).

5. ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования продемонстрировали избирательное повреждающее действие холода на различные эпидермальные клетки, отличающиеся по степени дифференцировки. Во всех вариантах экспериментов при оптимальных режимах обработки парами жидкого азота клеток в суспензии, в осадке, в составе эпидермиса или цельного биоптата кожи среди кератиноцитов, оставшихся жизнеспособными, неизменно преобладают стволовые и транзиторные клетки. При этом установлено, что оптимальным режимом, при котором сохраняется достаточное количество жизнеспособных клеток, которые могут формировать в культуре многослойный пласт, для суспензии кератиноцитов из цельного биоптата и кератиноцитов базального слоя эпидермиса (после его отделения от дермы) является 5-минутное охлаждение при —40 °С.

Кератиноциты в осадке после центрифугирования суспензии выдерживают охлаждение до -70 °С в течение 5 мин. Следует отметить также, что большая устойчивость молодых кератиноцитов к действию низких температур определяется их свойствами, а не пространственным расположением в ткани, так как их преобладание в популяции жизнеспособных клеток сохраняется после охлаждения и суспензии, и цельного эпидермиса приблизительно на том же уровне. Обращает на себя внимание значительно более высокая устойчивость к действию холода клеток, находящихся в составе биоптатов цельной кожи, и варьирование этой устойчивости в зависимости от того, из какого участка тела данный биоптат был получен. При этом, однако, кератиноциты базального слоя эпидермиса (после разделения биоптата на эпидермис и дерму), выделенные из кожи разной локализации, одинаково реагируют на воздействие холода при одной и той же температуре.

Причину этих явлений еще предстоит выяснить в ходе последующих исследований, но вполне вероятно, что обнаруженные различия связаны с изменением толщины кожного покрова в разных участках тела. Для достижения одной и той же температуры во фрагментах ткани разного объема требуется разное время при одном и том же режиме охлаждения. В пользу обоснованности такого предположения служат данные о деструктивном действии холода при непосредственном контакте биоптатов с парами жидкого азота.

В процессе культивирования кератиноцитов, подвергшихся охлаждению, в формирующемся многослойном пласте увеличивается количество клеточных агрегатов и уменьшается количество клеток, распластанных на субстрате (рис. 16). Поскольку процесс агрегации характерен для функционирования стволовых клеток, то это может служить дополнительным подтверждением селективного сохранения стволовых и транзиторных клеток после охлаждения.

Рис. 16. Культивируемые кератиноциты после их охлаждения до -40 °С в течение 5 мин. Срок культивирования 7 сут.

При оценке сроков формирования многослойного пласта кератиноцитов, подвергнутых охлаждению при разных температурах, подразумевалось, что увеличение времени формирования пласта при последовательном понижении действующих температур прямо связано с количеством погибших клеток в популяции. Вместе с тем, результаты иммунофлюоресцентного анализа соотношения недифференцированных (молодых) и дифференцированных (старых) клеток в популяции показывают, что наибольшие изменения в пользу преобладания недифференцированных клеток происходят уже после охлаждения до -20 °С, а дальнейшее понижение температуры до -40 °С существенно не изменяет состава популяции. Сопоставление этих данных приводит к заключению о том, что двукратное увеличение времени образования многослойного пласта в результате охлаждения до -40 °С связано, по-видимому, с изменением физиологического состояния самих стволовых и транзиторных кератиноцитов, но не с дополнительной гибелью дифференцированных клеток. С помощью каких именно молекулярных механизмов обеспечивается устойчивость недифференцированных клеток к действию низких температур, пока не ясно.

Таким образом, для селективного отбора молодых (недифференцированных) клеток достаточно охлаждения гетерогенной популяции клеток при температуре -20 °С. Этих клеток через 1 сут после охлаждения накапливается в популяции примерно в 2 раза больше, чем дифференцированных.

Следует отметить, что кроме сроков формирования многослойного пласта после охлаждения биоптатов кожи или суспензии кератиноцитов, наблюдались также изменения и в морфологии вновь образованного пласта. В нем по сравнению с контролем в большей степени отмечалась склонность кератиноцитов к агрегации, что характерно для стволовых клеток. При этом такие агрегаты не находились в разрозненном состоянии, они соединялись между собой вытянутыми клетками и в результате образовывали на поверхности чашки разветвленную сеть.

Эти данные еще раз подтвердили наши предыдущие наблюдения, свидетельствующие о том, что выявление в клетках с помощью антител кератинов К19 и К14 вопреки общепринятому мнению, не является основанием для отнесения их исключительно к стволовым или транзиторным кератиноцитам. При анализе препаратов, представленных на рис. 3 и 5, легко заметить, что интенсивность окраски клеток, меченных антителами против К19, различается от яркой до едва заметной. При этом охлаждение приводит практически к полному исчезновению слабо окрашенных клеток популяции, а ярко окрашенные остаются. По всей вероятности это означает, что-к слабо окрашенным относятся кератиноциты, уже вступившие на путь дифференцировки. С другой стороны, сопоставление количественного соотношения стволовых, транзиторных и дифференцированных клеток, меченных соответствующими антителами, показывает, что данные подсчета, полученные для стволовых и транзиторных клеток перекрываются. Это означает, что клеткам данного типа соответствует максимальная окраска, которая не исчезает полностью при переходе их на следующие стадии созревания, а постепенно снижается до полного исчезновения. Для данной работы это обстоятельство не имело решающего значения, так как молодые клетки четко отличались от дифференцированных кератиноцитов.

Причины, которые могут играть важную роль в устойчивости к низким температурам дифференцированных и недифференцированных клеток могут быть различными, например: степень гидрофильности (или гидрофобности) клеточной мембраны (Scott et al., 2005; Byrant et al., 1989), изменение структуры клетки в результате неравномерного осмотического стресса при охлаждении (Batysky et al., 1997), степень образования кристаллов льда внутри клетки или в ее окружении (Guenther et al., 2006; Mazur et al., 2008), обратимая или необратимая денатурация белков (Bischov et al., 2005), изменение синтеза и локализации внутриклеточных высокомолекулярных криопротекторов (Breton et al., 2000) и в первую очередь, белков теплового шока (HSP 70) при гипотермии (Alegna et al., 2005).

При анализе уровня синтеза белка теплового шока Hsp70 после воздействия на кератиноциты при температуре -20 °С в течение 5 мин обнаружилось, что у дифференцированных клеток этот белок слабо синтезируется по сравнению с недифференцированными, и это связано скорее всего с гибелью дифференцированных клеток, либо с нарушением их внутриклеточных процессов, в частности, синтеза белков, поскольку при 37 °С как у дифференцированных, так и у недифференцированных происходит синтез белка теплового шока Hsp70. Эти различия в синтезе белка теплового шока у дифференцированных и недифференцированных кератиноцитов могут быть одним из факторов, определяющих различия в устойчивости кератиноцитов, обладающих разной степенью дифференцировки. Известно, что этот белок активно участвует в трансмембранном транспорте, диспозиции разрушенных белков, предотвращает агрегацию пептидов и ингибирует клеточный апоптоз, в том числе и стрессы, вызванные изменением температуры окружающей среды.

Данные, полученные в настоящей работе по изучению воздействия низких температур на гетерогенную популяцию кератиноцитов, согласуются с представлениями врачей о том, что холод способствует омоложению кожи человека за счет разрушения дифференцированных клеток и сохранения недифференцированных кератиноцитов, участвующих в/ ее регенерации. Кроме того, наши результаты показывают, что наблюдения хирургов об образовании менее заметных рубцов после удаления родимых пятен, возрастных кератозов, келлоидных рубцов и др. с помощью обработки холодом (Сандомирский, 1987) вполне обоснованы. Сохранение недифференцированных подвижных кератиноцитов может приводить к более быстрому заживлению ран после хирургического вмешательства, в том числе и к образованию менее заметных шрамов.

Однако, представляло интерес выяснить, являются ли эти различия в устойчивости к низким температурам дифференцированных и недифференцированных кератиноцитов специфичными только для эпидермальных клеток, которые постоянно подвергаются действию температурных изменений окружающей среды, или обнаруженная тенденция распространяется и на другие типы клеток.

Результаты воздействия низких температур на СККМ до и после их дифференцировки показывают, что не только кератиноциты имеют разную устойчивость к низким температурам в зависимости от степени их дифференцировки. СККМ также различаются по степени устойчивости к холоду в зависимости от степени их дифференцировки. Клетки, находящиеся в виде суспензии после индукции дифференцировки в адипогенном или остеогенном направлении становятся менее устойчивыми к холодовому воздействию. А при понижении температуры до —40 °С доля оставшихся жизнеспособными клеток, как дифференцированных, так и недифференцированных, снижается до 40 %. По всей вероятности, это может быть связано с тем, что при выбранном режиме охлаждения повреждаются одни и те же защитные системы клетки, как у исходных СККМ, так и у дифференцированных, сохранившиеся в процессе индукции дифференцировки. Поэтому избирательного воздействия охлаждения до -40 °С мы не наблюдаем.

С другой стороны, клетки в, составе осадка выдерживали более низкие температуры охлаждения, чем клетки, охлажденные в суспензии. Кроме того, большая устойчивость части, недифференцированных СККМ к холоду (—50 °С) подтверждает наше предположение об изменении устойчивости СККМ после их дифференцировки.

Незначительные различия в устойчивости к холоду, полученные между адипогенными и остеогенными клетками при их охлаждении в виде осадка могут быть связаны с различной степенью изменения защитных механизмов при индукции дифференцировки клеток в разных направлениях. Сравнительное изучение устойчивости остеоцитов и адипоцитов требует более детального исследования.

Результаты настоящего исследования полностью согласуются с нашими, ранее полученными данными, о повышенной устойчивости к, действию холода стволовых и транзиторных кератиноцитов по сравнению с дифференцированными клетками. При этом, однако, степень устойчивости к действию низких температур у клеток этих двух типов различается.

Так, например, оптимальный режим охлаждения суспензии кератиноцитов составлял -40 °С, 5 мин, для суспензии СККМ он был -20 °С, 5 мин. Еще большие различия в устойчивости наблюдаются у клеток этих двух типов при охлаждении не в суспензии, а в виде осадка. Так, кератиноциты в осадке выдерживали более низкий температурный режим, (—70 °С, 5 мин), чем СККМ в таком же состоянии (50 °С, 5 мин). Эти различия в степени устойчивости вполне понятны, так как разные клетки в зависимости от типа ткани и от их локализации в организме по-разному подвергаются воздействию изменений температуры окружающей среды и поэтому в разной степени адаптированы к низким температурам.

Таким образом, полученные нами результаты позволяют утверждать, что стволовые клетки разного происхождения обладают повышенной устойчивостью к холоду по сравнению с дифференцированными клетками. При этом существенное значение имеют как режим охлаждения, так и состояние, в котором клетки подвергаются охлаждению.

Многие исследователи, изучающие стволовые и опухолевые клетки, утверждают, что сходство между этими клетками заключается в способности к самообновлению и активной пролиферации. В то же время ученые выяснили, что опухолевые клетки способны к перерождению в нормальные клетки, механизм которого идентичен процессу дифференцировки нормальных стволовых клеток (ЗЬасЫект, 2010). В связи с этим мы изучали устойчивость клеток постоянной трансформированной линии А431, полученной из эпидермоидной карциномы человека. Вопреки нашим ожиданиям клетки А431 оказались менее устойчивыми к воздействию низких температур, чем СККМ. Максимальная температура, которую они выдерживали при охлаждении в виде суспензии составляла -30 °С, т.е., на 10 °С выше, чем температура которую выдерживали СККМ (-40 °С в течение 5 мин). Такая же тенденция наблюдалась и при охлаждении их в виде осадка, они выдерживали более низкие температуры, чем при охлаждении в виде суспензии (— 40 °С в течение 5 мин.). Но все-таки они менее устойчивы к холодовому воздействию, чем СККМ, которые выдерживали -50 °С за такое же время экспозиции.

Не исключено, что трансформированное состояние опухолевых клеток линии А431 является причиной их меньшей устойчивости к низким температурам по сравнению с СККМ.

Результаты охлаждения свежевыделенных опухолевых клеток ЕН8 саркомы мышей линии Ва1Ь в виде суспензии подтвердили наше предположение. Они оказались более устойчивыми, чем трансформированные клетки постоянной линии А431. Однако при охлаждении в виде осадка они потеряли способность к распластыванию, даже при -20 °С и ниже. Причину этого следует выяснить в дальнейших исследованиях. Кроме того, результаты охлаждения клеток ЕН8 в виде суспензии действительно показывают, что устойчивость этих клеток похожа на устойчивость СККМ, охлажденных также в виде суспензии. Оба типа клеток теряют жизнеспособность при температуре -50 °С в течение 5 минут. Далее количество распластанных клеток после воздействия низких температур (-40 °С, 5 мин) у СККМ составляло 40 %, у ЕН8 - 60 %, а при воздействии температуры -20 °С, 5 мин у СККМ оно равнялось 70 %, тогда как у клеток ЕНБ - 80%. Эти данные действительно показывают, что устойчивость стромальных клеток к воздействиям низких температур очень похожа на устойчивость свежевыделенных опухолевых клеток саркомы. Возможно трансформация опухолевых клеток эпидермоидной карциномы человека, возникшая в процессе длительного культивирования (линия А431), приводит к снижению их устойчивости к низким температурам по сравнению со свежевыделенными опухолевыми клетками (клетки ЕН8 саркомы).

Таким образом, совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что клетки разного типа различаются по устойчивости к низким температурам, и что недифференцированные и опухолевые клетки являются более устойчивыми к холоду, чем дифференцированные. Кроме всего прочего, на устойчивость к холоду могут оказывать влияние и межклеточные взаимодействия в осадке и ткани. Выявленные различия в устойчивости клеток к холодовому воздействию могут иметь практическое применение для обогащения недифференцированными клетками гетерогенных клеточных популяций, используемых в клеточных технологиях.

6. ВЫВОДЫ

Рассмотрев полученные результаты, можно сделать следующие выводы.

1. Базальные кератиноциты кожи человека обладают различной устойчивостью к действию низких температур в зависимости от степени дифференцировки, локализации в разных участках кожного покрова, а также от способа воздействия на них парами жидкого азота.

2. Наибольшую устойчивость в гетерогенной популяции кератиноцитов демонстрируют недифференцированные клетки, находящиеся в осадке или в составе фрагментов ткани, которые сохраняют способность к размножению и последующей дифференцировке, в то время, как уже дифференцированные клетки погибают в процессе воздействия низкими температурами.

3. Аналогичной повышенной устойчивостью к действию охлаждения обладают стромальные клетки костного мозга крысы, устойчивость которых снижается после их направленной дифференцировки в адипоцитарном или остеогенном направлении.

4. Свежевыделенные опухолевые клетки ЕШ саркомы обладают повышенной устойчивостью к действию низких температур, соизмеримой в равных условиях с уровнем устойчивости стволовых клеток костного мозга. Наряду с этим клетки эпидермоидной карциномы, переведенные в культуру и существующие в виде постоянной клеточной линии А431, имели существенно меньшую устойчивость.

5. Одной из возможных причин повышенной устойчивости недифференцированных кератиноцитов может быть обнаруженное в них значительное увеличение синтеза белка теплового шока Н8Р70 после воздействия холодом по сравнению с дифференцированными клетками, в которых он практически не синтезируется.

6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Кульнева Е., Шарифуллина С.З., Чупикова Н.И., КоржиковаС.В., Тепляшин A.C. 2008. Выделение и характеристика, клеток человека, подобных эпидермальным стволовым клеткам, полученных из ткани кожи после глубокого замораживания. Цитология. 50 (9): 812-813.

Максимов H.A. 1952. Избранные работы по засухоустойчивости и зимостойкости растений. Т2. Зимостойкость растений, М., Изд. АН СССР: 185-240.

Савченкова И.П. 2008. Низкотемпературный шок, как способ выделения из жировой ткани жизнеспособной клеточной популяции с характеристиками мультипотентных мезенхимных клеток. Биофизика живой клетки. 9: 111-112.

Савченкова И.П. и Коржикова С.В. 2010. Подкожно-жировая ткань человека, подвергнутая низкотемпературному шоку, как источник жизнеспособной клеточной популяции с характеристиками мультипотентных мезенхимных стромальных клеток. Цитология. 52 (8); 621-627.

Сандомирский Б. П. 1987. Патофизиологические механизмы действия низких температур на ткани. Практическая криомедицина. Здоровье. 246 :8-23.

Смит 0.1963. Биологическое воздействие замораживания и переохлаждения. М., Изд. И.Л:22-56.

Спичкина О.Г., Калмыкова II. Воронкина КВ., Кухарева Л.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2006. Выделение популяции базальных кератиноцитов человека путем их селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса. Цитология. 48(10): 841-845.

Харакоз. Д.П. 2001. О возможной физиологической роли фазового перехода «жидкое-твердое» в биологических мембранах. Успех биологической химии. 41: 334-364.

Хэм, Д., Кормак. 1983. Гистология Пер. с англ. под ред. Ю. И. Афанасьева, Ю. С. Ченцова. Издательство: М.: Мир. 292

Цитоеский Н.Б., Геракин В.И., Шафронов В.В., Новак. М.М. 1986. Лечение гемангиом у детей жидким азотом. Киев. Здоровия. 120 с.

Юдинцева Н. М., Горелик Ю. В., Дьяконов И. А., Калмыкова, Н. В., Блинова М. И., Пинаев Г. П. 1999. Трансплантация аллогенных эпителиальных пластов на ожоговые раны. Цитология. 41 (3/4): 328.

Abakali. J., Ariahu. С.С., Nkpa. NN. 2006. quality and sensorial characteristics of osmotically dehydrated mango with syrups of inverted sugar and sucrose.J. Food process. Preserve. 30: 597-607.

Adams, J. C., Watt, F. M. 1989. Fibronectin inhibits the terminal differentiation of human keratinocytes. Nature. 340: 307-309.

Alegna R., Paola Т., Guillermo A., Mirian Strauss. 2005. Is hypothermia a stress condition in HepG2 cells? Expression and localization of Hsp 70 in human hepatoma cell line. Tissue and cell. 37: 59-65.

Allen T.D., Potten C.S. 1974. Fine-Structural Identification and Organization of the Epidermal Proliferative Unit. J. Cell Sci. 15: 291-319.

Auerbach, G., Ostendorp, R., Prade, L.1998. Lactate dehydrogenase from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima: the crystal structure at 2.1-angstrom resolution reveals strategies for intrinsic protein stabilization. Structure .6. 769-781.

Balasubramanian. S.K., Bischof. J.C., Hubel A. 2006. Water transport and IIF parameters for a connective tissue equivalent. Cryobiology. 52(l):62-73.

Balmain A., Loehren D., Fischer J., Alonso A. 1977. Protein synthesis during fetal development of mouse epidermis. I. The appearance of "histidine-rich protein". Dev Biol. 60(2): 442-452.

Banks-Schlegel S., Green H. 1981. Involucrin synthesis and tissue assembly by keratinocytes in natural and cultured human epithelia. J Cell Biol. 90(3): 732-737.

Barrandon Y., Green H. 1985. Cell size as a determinant of the clone-forming ability of human keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 82: 5390-5394.

Barrandon Y., Green H. 1987. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci USA. 84(8): 2302-2306.

Barrandon Y. 1993. The epidermal stem cell: an overview. Seminars in DEVELOPMENTAL BIOLOGY. 4: 209-215.

Batycky R. P., Hanmerstedt R., Edwards D. A. 1997. Osmotically driven intracellular transport phenomena. Phill.Trans.R.Soc.Lond.355:2459-2488.

Baust J.G., Gage A. A., Clarke D., Baust J.M., Van Bus kirk R.2004.Cryosuvgery-a putative approach to molecular-based optimization. Cryobiology.48(2): 190-204

Baust J.G., Gage A.A., Klossner D., Clarke D., Miller R., Cohen J., Katz A., Polascik T., Clarke H., Baust JM.2005. Issues critical to the successful application of cryosurgical ablation of the prostate.B JU Int.95.1187-1191.

Beck, E. H., Fettig, S., Knake, C., Hartig, K., Bhattarai. 2002. Spacific and unspecific responses of plants to cold and drought stress. Journal of biosciences.32:501-510.

Beck E.H., Fetitig S., Knake C., Hartig K.,Bhattarai.2007. The genetic improvement of wheet and barleyfor reproductive frost tolerance.j.biosci. 32:501-510.

BeckE.H, Heim R & Hansen J. 2007. Plant resistance to cold stress: Mechanisms and environmental signals triggering frost hardening and dehardening. J Biosci. 29: 449459.

Becker S.M., Kuznetsov A. V.2007. Thermal damage reduction associated with in vivo skin electroporation: A numerical investigation justifying aggressive pre-cooling. International Journal of Heat and Mass Transfer, 50(1-2), 105-116.

Beerling D. J., Terry A. C., Mitchell P. L., Callaghan T. V., Gwynn-Jones D., Lee J.A.2001.Time to chill: effects of simulated global change on leaf ice nucleation temperatures of subarctic vegetation.Am.J. Botany.88:628-633.

Belhamadia Y, Fortin A., Chamberland E.2004. Anisotropic mesh adaptation for the solution of the Stefan problem. J. of Comp. Phys. Vol. 194(l):233-255.

Belhamadia Y., Fortin A., Chamberland E.2004. Three-dimensional anisotropic mesh adaptation for phase change problems. J. of Comp. Phys. 201(2): 753-770.

Bellissent-Funel MC. 2003. Status of experiments probing the dynamics of water in confinement. Eur Phys. J E Soft Matter. 12(l):83-92.

Benedict, W. S., Gailar, 2N7L und Plyer, E. K. (1956). Rotation-Vibration Spectra of Deuterated Water Vapor. J. Clienm. Phys. 24: 1139-1165.

Benson E.E., Lynch P.T,—Z £>92. The embryogenic potential of rice cell suspensions affects their recovery following cryogenic storageJ.Jones.Plant.Sci.85:107-l 14.

Benes M. 2001.Mathematical and computational aspects of solidification of pure substances. Acta Math. Univ. C^<omenianae LXX: 123-151.

Beney L., Martinez de ^¿X^fciranon I., Maréchal P.A., Moundanga S., Gervais P. 2001. Osmotic destruction ojf Saccharomyces cerevisiae is not related to a high water flow rate across the membrane. DBiochem. Eng. J. 9:205-210.

Bernard A., Cohen, Christoph U. Lehmann, M. 2011. DermAtlas. Johns

Hopkins University. P.7609.

Bickenbach J.R. 1981. Identification of label-retaining cells in oral mucosa and skin. J Dent Res 122:1611-162.0.

Bickenbach J.R., Mackenzie I.C. 1984. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epittxelia. J Invest Dermatol 82:618-622.

Bischof J., He X .200J5 Physical aspects of cryobiology. Ann. N. Y. Acad. Sei. 1066:1-22.

Breman J.W.2006. CtLanracterisation of Pigments and Bioactive Substances from Marine Pseudoalteromonas Species and Hongiella, Strain T4.PhD.thesis.university of florida.

Breton G., Danyluk J., Quellet F., Sarhan F. 2000. Over expression of the acidic dehydrin WCOR410 improves freezing tolerance in transgenic strawberry leaves. Annu.Rev. 6:57-99.

Bryant G„ Pope, JT.JS^Z.^ Wolfe, J. 1992. Low hydration phase properties of phospholipid mixtures: evidenee for dehydration-induced fluid-fluid separations. Eur Biophys J. 21:223-232.

Bryant. G., Koster. Wolfe. 2001. J. Seed Science Research. 11. 17-25.

Byrant G., Wolfe J. Z <289. The interaction and fusion of bilayers formed from unsaturated lipids. Eur. Biopitys. 16: 369-374.

Cavender-Bares J. 2005. Impacts of freezing on long-distance transport in woody plants, vascular transport in plant. Elsevier Inc. Oxford, p.592

Cevc G., Marsh D. 1987. Phospholipid bilayers (physical principles and models) First Edition. New York: John Wiley and Sons: 247-293.

Chandrakasan G., Torchia D.A., Piez K.A. 1967. Preparation of intact monomeric collagen from rat tail tendon and skin and the structure of the nonhelical ends in solution J. Biol. Chem. 251: 6062-6067.

Crowe J.H., Crowe L. 1984. Effects of dehydration on membranes and membrane stabilization at low water activities. Chapman D. Biological membranes, Second Edition London: Academic Press: 58-103.

Crowe J. H., Crowe L. M., Carpenter J. F., Rudolph A. S., Wistrom C. A., Spcirg0 B. J., Anchordoguy T. J. 1988. Interactions of sugars with membranes. Biochim. Biophys 947: 367-384.

Cotsarelis G., Sun T.T., Lavker R.M. 1990. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61(7):1329-1337.

Dale B.A. 1977. Purification and characterization of a basic protein from the stratum corneum of mammalian epidermis. Biochim Biophys Acta. 491(1): 193-204.

Davies P.L., Baardsnes J., Kuiper M.J., Walker V.K. 2002. Structure and function of antifreeze proteins, Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci. 357 : 927-935

Diana J. Bowles, Peter J. Lillford, David A. Rees and Ian A. Shanks.2002. the molecular and structural biology of cold stress survivors. Phil. Trans. R. Soc. Lond: 357 829.

Diller, K.R. 1996. Pioneers in Cryobiology: Julius von Sachs (1832-1897). Cryo-Letters. 17. 201-212.

Ermolenko, D.N., G.I. Makhatadze. 2002. Bacterial cold-shock proteins. Cell. Mol. Life Sci. 59: 1902-1913.

Fachs E, Green H. 1980. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocytes. Cell. 19: 1033-1042. t

Fuchs E. 1988. Keratins as biochemical markers of epithelial differentiation. Trends in Genetics. 4: 277-281.

Fuchs E., Weber K. 1994. Intermediate filaments: Structure, dynamics, function, and disease. Annual. Review of Biochemistry. 63: 345-382.

Fuchs E. 1995. Keratins and the skin. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11: 123-153.

Fuchs E., Dowling J., Segre J., Lo S.H., and Yu Q.-CL 1997. Integrators of epidermal growth and differentiation: distinct functions of pi and 04 integrins. Curr. Opin. Gen. Dev. 7: 672-682.

Graumann P., Marahiel M.A. 1997. Effects of heterologous expression of CspB, the major cold shock protein of Bacillus subtilis, on protein synthesis in Escherichia coli.

Mol. Gen. Gen. 253(6):745-752.

Graumann P., Marahiel M.A. 1998. A superfamily of proteins that contain the cold-shock domain. TIBS.23:286-290.

Granov A,M-, Prokhorov D.G., Andreev A.P., Pinaev G.P., Prokhorov G.G., Vlasova F.V. 2001. Temperature measuring and evaluation of tumor cell viability in different zones of an ice ball. Practical application of in vitro experimental results. Basics of Cryosurgrry. Springer,.Wien-NewYork. Ed.Korpan N.N: 15-23.

Grosberg. A.Y., khokhlov. A. R. 1986. Phase transitions in polymer and biopolymer systems. Sov. Phys. Usp. 29:797-799.

Guenther J. F., Seki S., Kleinhans F. W., Edashige K., Roberts D. M., Mazur P. 2006. Extra- and intra-cellular ice formation in Stage I and II Xenopus laevis oocytes. Cryobiology.52: 401-416.

Heidi M., Mansour., Zografi. G. 2007. The relationship between water vapor absorption and desorption by phospholipids and bilayer phase transitions. Journal of pharmaceutical science. 96. (2): 1-20.

Hincha, D. K. 2002. Cryoprotectin: a plant lipid-transfer protein homologue that stabelises membrane during freezing. Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 357: 909-915.

Holger E., Grabitz P., Heimburg T. 2001. Enthalpy and volume changes in lipid membranes. The proportionality of heat and volume changes in the lipid melting transition and its implication for the elastic constants. J. Phys. Chem. 105 (30): 73537360.

Hoshino, T., A.M. Tronsmo, N. Matsumoto, T. Araki, F. Georges, T. Goda, D. Ohgiya & K. Ishizaki. 1998. Temperature sensitivity and freezing resistance among isolates of Typhula ishikariensis from Russia. ICEL. AGR. SCI. 47: 185-189.

Hoshino Y„ HayashiN., TaniguchiN., KobayashiN., SakaiK., Otani T., IritaniA., Saeki K. 2009. Resurrection of a bull by cloning from organs frozen without cryoprotectant in a -80 °C freezer for a decade. Plos ONE. 4,e4142.

Jaenicke, R. 1991. Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions. Eur. J. Biochem.202: 715-728.

Jaenicke, R. 2000. Stability and stabilization of globular proteins in solution. J. Biotechnol.79: 193-203.

Jaglo-Ottosen KR, Gilmour SJ, Zarka DG, Schabenberger O, Thomashow MF. 1998. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance.Science. 280: 104-106.

Jendrasiak GL, Hasty JH. 1974. The hydration of phospholipids. Biochim Biophys Acta. 337:79-91.

Jones P.H., Watt F.M. 1993. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression. Cell. 73: 713-724.

Jones P.H., Harper S., Watt,F.M. 1995. Stem cell patterning and fate in human epidermis. Cell. 80: 83-93.

Kanwisher J.W. 1966. Freezing in intertidal animals, in H. T. Mary man,. Ed. Cryobiology. Academic Press, London : 487-494.

Kibbey M.C. 1994. Maintenance of the EHS sarcoma and matrigel preparation. J. Tissue Culture Methods. 16: 227-230. t

I !

Kim D.S., Cho H.J., Choi H.R., Kwon S.B., Park K.C. 2004. Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents. Cell Mol. Life Sci. 61:2774-2781.

Knight M.R.2002. Signal transduction leading to low-temperature tolerance in Arabidopsis thaliana. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 357:871-875.

Kopan R., Traska G., Fuchs E. 1987. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. J. Cell Biol. 105: 427-440.

Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

LajthaLG. 1979. Stem cell concepts. Differentiation. 14: 23-34.

Lavker R.M., Sun T.-T. 1982. Heterogeneity in epidermal basal keratinocytes: morphological and functional correlations. Science. 215: 1239-1241.

Layne J. R. Jr. and A. Jones .2001. Freeze tolerance in the gray treefrog: cryoprotectant mobilization and organ dehydration. Journal of Experimental Zoology. 290: 1-5.

Layne. J.R., Jones A.L.2001.Freeze tolerance in the gray treefrog: ciyoprotectant mobilization and organ dehydration.J.Exp.Zool.290:1-5.

Lersch R., Fuchs E. 1988. Sequence and expression of a type II keratin, K5, in human epidermal cells. Mol. Cell. Biol. 8: 486-493.

Li J. Mombaerts. 2008. Nuclear transfer-mediated rescue of the nuclear genome of nonviable mouse cells frozen without cryoprotectant. Biol. Reprod. 79, 588-593.

Loi P., Matsukawa K, Ptak J., Clinton M., Fulka J.J. 2008. Freeze-dried somatic cells direct embryonic development after nuclear transfer. PloS ONE 3, e2978.

Lloyd C., Yu Q.C., Cheng J., Turksen K., Degenstein L., Hutton E., Fuchs E. 1995. The basal keratin network of stratified squamous epithelia: defining K15 function in the absence of K14. J Cell Biol. 129(5): 1329-1344.

Lundheim R. 2002. Physiological and ecological significance of biological ice nucleators. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 357: 937-943.

MacKenzie I.C., Bickenbach J.R. 1985. Label-retaining keratinocytes and Langerhans cells in mouse epithelia. Cell Tissue Res. 242 (3): 551-556.

Mallamace F., Chen S.H., Broccio M., Corsa.ro C., Crupi V., Majolino D., Venuti V., Baglioni P., Fratini E., Vannucci C., Stanley H.E.2007.Role of the solvent in the dynamical transitions of proteins:The case of the lysozyme-water system. Journal of Chemical Physics. 127. Article Number:045104.

Mannonen L., Toivonen L., Kauppinen V. 1990. Effect of long-term preservation on growth and productivity of Panax ginseng and Cataranthus roseus cell cultures. Plant Cell Rep. 9. (4): 173-178.

MatoltsyA.G. 1976. Keratinization. J. Invest. Dermatol. 67: 20-25.

Mazur P. 1963.Kinetics of Water Loss from Cells at Subzero Temperatures and the Likelihood of Intracellular Freezing. J. Gen. Physio.47.347-369.

Mazur P. 1977. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates. Cryobiology. 14: 251-272.

Mazur P. 79&S.Stopping biological time. The freezing of living cells. Ann N Y Acad Sci. 541: 514-31.

Mazur P., Kleinhans F. W. 2008. Relationship between intracellular ice formation in oocytes of the mouse and Xenopus and the physical state of the external medium-a revisit. Cryobiology. 56:22-27.

McLellan M.R., Morris G.J., Coulson G.E., James E.R., Kalinina L. V. 1984. Role of cytoplasmic proteins in cold shock injury of Amoeba. Cryobiology 21, 44-59.

Michel M., Torok N., Godbout M.J., Lussier M., Gaudreau P., Royal A., Germain L. 1996. Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites, and their number varies with donor age and culture stage. J Cell Sci. 109: 1017-1028.

Moll R., Frank W. W., Schiller D.L., Geiger B., Krepler R. 1982. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Review. Cell. 31(1): 11-24.

Morris R.J., Fischer S.M., Slaga T.J. 1985. Evidence that the centrally and peripherally located cells in the murine epidermal proliferative unit are two distinct cell populations. J Invest Dermatol. 84(4): 277-281.

Morris R.J., Potten C.S. 1994. Slowly cycling (label-retaining) epidermal cells behave like clonogenic stem cells in vitro. Cell Prolif. 27(5): 279-289.

Morris R.J., Potten C.S. 1999. Highly persistent label-retaining cells in the hair follicles of mice and their fate following induction of anagen. J Invest Dermatol. 112(4): 470-475.

Morley S. M., Dundas S. R., James J. L., Gupta T., Brown R. A., Sexton C. J., Navsaria H. A. Leigh., M., Lane E. B.1995. Temperature sensitivity of the keratin cytoskeleton and delayed spreading of keratinocyte lines derived from EBS patients. Journal of Cell Science.108: 3463-3471.

Murray, H. M., Hew, C. L., Fletcher, G. L. 2002. Skin-type antifreeze protein expression in integumental cells of larval winter flounder. 60.(6): 1391—1406.

Murphy D. J. 1977. Metabolic and Tissue Solute Changes Associated With Changes in the Freezing Tolerance of the Bivalve Mollusc Modiolus Demissus. J. Exp. Biol. 69:13-21.

MacKenzie I.C., Bickenbach J.R. 1985. Label-retaining keratinocytes and Langerhans cells in mouse epithelia. Cell Tissue Res. 242 (3): 551-556.

Nelson W., Sun T.-T. 1983. The 50- and 58-kdalton keratin classes as molecular markers for stratified squamous epithelia : cell culture studies. J. Cell Biol. 97: 244-251.

Parsons D.F., Ninham B.W. 2011. Surface charge reversal and hydration forces explained by ionic dispersion forces and surface hydration, Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Aspects.j.colsurfa.12. c 25.

Potten C. S., Hendry J.H. 1973. Clonogenic cells and stem cells in the epidermis. Int. J. Radiat. Biol. 24: 537-540.

Potten C.S., Hume W.J., Reid P., Cairns J. 1978. Cell. The segregation of DNA in epithelial stem cells. 5(3): 899-906.

Potten C.S., Wichmann H.E., Loeffler M., DobekK., Major D. 1982. Evidence for discrete cell kinetic subpopulations in mouse epidermis based on mathematical analysis.Cell Tissue Kinet. 15(3): 305-329.

Potten C. S. 1983. In: Stem Cells: Their Identification and Characterization, ed. Potten C. S. Churchill Livingston, London: 200-232.

Potten C.S., Morris R.J. 1988. Epithelial stem cells in vivo. J Cell Sci. Suppl. 10:

45-62.

Quinlan R.A., Schiller D.L., Hatzfeld M., Achtstatter T., Moll R., Jorcano J.L., Magin T.M., Franke W. W. 1985. Patterns of expression and organization of cytokeratin intermediate filaments. Ann. N.Y. Acad. Sci. 455: 282-306.

Radii E., Simionescu O., Regalia T., Dumitrescu D., Popescu L.M. 2002. Stem cells (p63(+)) in keratinocyte cultures from human adult skin. J. Cell. Mol. Med. 6: 593598.

Rees A.R., StenbergM.J.E.I984. From cells to atoms: an illustrated introduction to molecular biology. Blackwell Oxford. 94p

Reyes M., Lund T., Lenvik T., Agidar D., Koodie L., Verfaillie C.M. 2010. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood. 98: 2615-2625.

Rheimvald J.G. 1980. Serial cultivation of normal epidermal keratinocytes. Meth.Cell Biol. 21 A: 229-254.

Rice R.H., Green H. 1979. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18: 681-694.

Scott K.L., Lecak J., Acker J.P. 2005. Biopreservation of red blood cells: past, present, and future. Transfusion. Med. Rev. 19: 127-142.

Shackleton M. 2010. Normal stem cells and cancer stem cells: similar and different. Semin Cancer Biol. 20(2):85-92

Skerrow D., Skerrow C.J. 1983. Tonofilament differentiation in human epidermis: isolation and polypeptide chain composition of keratinocytes subpopulation. Exp. Cell Res. 143: 27-35.

Smola H., Stark H.J., Thiekotter G., Mirancea N., Krieg T., Fusenig N.E. 1998. Dynamics of basement membrane formation by keratinocyte-fibroblast interactions in organotypic skin culture. Exp. Cell Res. 239: 399-410.

Sommer A. 1960. Treatment of sarcoid skin lesions with cryotherapy. Bull Assoc Mil Dermatol; 9:12-13.

Spradling A., Drummond-Barbosa D., Kai T. 2001. Stem cells find their niche. Nature. 414: 98-104.

Steinert P.M., Cantieri J.S., Teller D.C., Lonsdale-Eccles J.D., Dale B.A. 198J. Characterization of a class of cationic proteins that specifically interact with intermediate filaments. Proc Natl Acad Sci USA. 78(7): 4097-4101.

Storey KB., Storey J.M. 2004. Adaptations of metabolism for freeze tolerance in the gray tree frog. Life in the frozen state. CRC Press, Boca Raton, p.700

Storey K.B. 2006. Reptile freeze tolerance: Metabolism and gene expression. Cryobiology.52:l-16

Sun T.-T., Eichner R., Schermer A., Cooper D., Nelson W.G., Weiss R.A. 1984. Classification, expression and possible mechanisms of evolution of mammalian epithelial keratins: a unifying model. In: The transformedphenotype, vol. 1, ed. Levine A.J., Vande Wounde G.F., Topp W.C., Watson J.D. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 169-176.

Tennenbaum T., Li L., Belanger A.J., De Luca L.M., Yuspa S.H. 1996. Selective changes in laminin adhesion and alpha 6 beta 4 integrin regulation are associated with the initial steps in keratinocyte maturation. Cell Growth and Differentiation. 7(5): 615-628.

Thiselton-Dyer W. 1989. The influence of the temperature of liquid hydrogen on the germinative power of seeds. Proc. Roy. Soc. 65.(420): 361-368.

Timpl R., Wiedemann H., Van Delden V, Furthmayr H., Kuhn K. 1981. A network model for the organization of Type IV collagen molecules in basement membrane. Eur. J. Biochem. 120: 203-211.

Towbin H., Staehelin T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.76: 4350-4.

Tseng S.C.J., Jarvinen M.J., Nelson W.G., Huang J.-W., Woodcock-Mitchell J., Sim T.-T. 1982. Correlation of specific keratins with different types of epithelial differentiation: monoclonal antibody studies. Cell. 30: 361-372.

Tyner A.L., Fuchs E. 1986. Evidence for posttranscriptional regulation of the keratins expressed during hyperproliferation and malignant transformation in human epidermis. J. Cell Biol. 103: 1945-1955.

Vacanti M.P., Roy A., Cortiella J., Bonassar L., Vacanti C.A.2001. Identification and initial characterization of spore-like cells in adult mammals. J. Cell Biochem. 80, 455-460.

Vennemann N., Lechner D., Henkel T., Knoll W. 1986. Densitometric Characterization of the Main Phase Transition of Dimyristoyl-Phosphatidylcholine between 0.1 and 40 MPa. New York: Wiley.(90). 10. 888-891.

Viae J., Staquet M.J., Thivolet J., Goujon C. 1980. Experimental production of antibodies against stratum corneum keratin polypeptides. Arch. Dermatol. Res. 267: 179188.

Vigh L., Los D.A., Horvath I., Murata N.1993. The primary signal in the biological perception of temperature: Pd-catalyzed hydrogenation of membrane lipids stimulated the expression of the desA gene in Synechocystis PCC6803. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 9090-9094.

Watt F.M., Green H. 1982. Stratification and terminal differentiation of cultured epidermal cells. Nature. 295 (5848): 434^36.

Watt F. W. 1983. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. Review. J Invest Dermatol. 81(1 Suppl): 100s-103s.

Watt F.M. 1984. Selective migration of terminally differentiating cells from the basal layer of cultured human epidermis. J. Cell Biol. 98: 16-21.

Watt F.W. 1987. Influence of cell shape and adhesiveness on stratification and terminal differentiation of human keratinocytes in culture. Review. J Cell Sci Suppl. 8: 313-326.

Watt F.M., Kubler M.-D., Hotchin N.A., Nicholson L.J., Adams J.C. 1993. Regulation of keratinocyte terminal differentiation by integrin-extracellular matrix interactions. J. Cell Sci., 106:, 175-182.

Watt F.M., Hertle D.M. 1994. Keratinocytes integrins. In The Keratinosytes Handbook. UK, Cambridge University Press: 153-164.

WattF. M. 1998. Epidermal stem cells: markers, patterning and the control of stem cell fate. Phil.Trans. R. Soc. Lond. B. 353: 831-837.

Watt F.M. 2002. Role of integrins in regulating epidermal adhesion, growth and differentiation. The EMBO Journal. 21(15): 3919-3926.

Wolfe J. 2002. Cellular thermodynamics. Encyclopedia of Life Science. A1363:

1-15.

Wolfe. J. 2002. Cellular Thermodynamics. Life Sciences. Macmillan New York.

1-17.

Wolfe, J., Yan, Z. and Pope, J. 1994. Hydration forces and membrane stresses: cryobiological implications and a new technique for measurement. Biophysical Chemistry. 49: 51-58.

Wolkers W.F., Balasubramanian S.K., Ongstsd E.L., Zee H.C., Bischof J.C.2007.Effects of freezing on membranes and proteins in LNCaP prostate tumor cells. Biochem. Biophys. Acta. 1768. 728-736.

Woodcock-Mitchell J., Eichner R., Nelson W.G., Sun T.-T. 1982. Immunolocalization of keratin polypeptides in human epidermis using monoclonal antibodies. J. Cell Biol. 95: 580-588.

Wu Y.J., Rheinwald J.G. 1981. A new small (40 kd) keratin filament protein made by some cultured human squamous cell carcinomas. Cell. 25(3): 627-635.

Yurchenko R., Furthmayr H. 1984. Self-assembly of basemenj^inembrane collagen. Biochemistry 23: 1839-1850.

Yurchenco P.D., Cheng Y.S., Colognato H. 1992. Laminin forms an independent network in basement membranes. J.Cell Biol. 117 (5): 1119-1133.

Zillikens D. 1999. Acquired skin disease of hemidesmosomes. J. Dermatol. Sei. 20: 134-154.