Применение культур клеток для мониторинга природных очагов клещевых риккетсиозов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.30, кандидат медицинских наук Кумпан, Людмила Валерьевна

• Кумпан, Людмила Валерьевна
• кандидат медицинских наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Кумпан, Людмила Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ КЛЕЩЕВОГО РИККЕТСИОЗА.

1.1 Краткая история изучения клещевого риккетсиоза.

1.2 Таксономическое положение риккетсий.

1.3. История изучения эрлихиозов.

1.3.1 Таксономическое положение эрлихий и анаплазм.

1.3.2 Филогенетические связи между представителями родов Anaplasma, Ehrlichia и Neorickettsia.

1.4 Культивирование риккетсий и эрлихий.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ОЧАГОВ КЛЕЩЕВОГО РИККЕТСИОЗА.

3.1 Эпидемиологический анализ заболеваемости клещевым риккетсио-зом в Российской Федерации.

3.2. Современная ситуация по клещевому риккетсиозу в Алтайском крае, республике Алтай и Красноярском крае.

3.3. Современное представление об эпидемиологии моноцитарного эрли-хиоза и гранулоцитарного анаплазмоза в России.

ГЛАВА 4. ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЯ АНАПЛАЗМОЗА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ОТ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА.

4.1 Выделение и изучение культуральных и субмикроскопических свойств анаплазм.

4.2 Получение анаплазмозного антигена и его экспериментальное изучение.

ГЛАВА 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ РИККЕТСИЙ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ СТРУКТУРЫ

ИХ ПОПУЛЯЦИЙ.

5.1 Экспериментальное изучение биологических свойств риккетсий в культуре клеток Vero.

5.2 Изучение в культуре клеток полевого материала.

5.3 Обоснование тактики применения культуры клеток в системе эпидемиологического надзора за клещевыми инфекциями.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение культур клеток для мониторинга природных очагов клещевых риккетсиозов»

В последние годы существенно расширились представления о распространении, таксономии и экологии риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ). Возрастанию интереса к этой группе инфекций способствовал резкий рост заболеваемости риккетсиозами в большинстве регионов мира (Burgdorfer, 1975; Hattwicck et al., 1976; Mansueto et al., 1986; Рудаков и др., 1994). Отмечается увеличение числа новых представителей риккетсий группы КПЛ, некоторые из них получили статус самостоятельного вида. Это в определенной мере связано с совершенствованием методов культивирования и идентификации риккетсий с использованием техники моноклональных антител и комплекса генетических методов.

В настоящее время отмечается преобладание выявленных генотипирова-нием риккетсий в переносчиках, без изоляции штаммов вследствие невозможности культивирования на традиционных моделях, и без изучения биологической характеристики. Это привело к тому, что среди известных видов (генотипов риккетсий) преобладают риккетсии с не установленной патогенностью, среди новых представителей группы КПЛ выделяют как патогенные (R.honei, R.africae), так и непатогенные (R.helvetica) риккетсии. Патогенность ряда из них остается пока не изученной. Непатогенные риккетсии в последние годы обнаружены на различных континентах (Bell et al., 1963; Burgdorfer et al., 1975; Niebylsky et al., 1996) В результате анализа новых данных развита концепция о непатогенных риккетсиях группы КПЛ (Burgdorfer et al.,1981). Однако в Евразии на большей части очаговых территорий выделены только патогенные для морских свинок штаммы R.sibirica (Балаева и др., 1993; Balaeva et al., 1993; 1996).

Поскольку новые генотипы риккетсий плохо культивируются на традиционных моделях (морские свинки, куриные эмбрионы), а изучение риккетсий с помощью экспериментальной клещевой модели, очень трудоёмкий метод, нами в качестве модели для изучения клещевых патогенов были взяты перевиваемые клеточные культуры. Экспериментальное и полевое изучение риккетсий группы КПЛ позволит расширить представления о механизмах сохранения риккетсий в клещевых популяциях, их гетерогенности, изменчивости, влиянии изменений популяционных характеристик риккетсий на эпидемический процесс.

Цель исследования: Определение возможности применения культур клеток для первичной изоляции и культивирования риккетсий различных видов, в том числе новых генотипов с не установленной патогенностью для человека и отработка тактики применения методов микробиологического мониторинга в системе эпидемиологического надзора, для оценки структуры популяций риккетсий и свойств циркулирующих штаммов.

Задачи исследования:

1 .Экспериментальное обоснование применения различных клеточных линий для культивирования патогенных и с не установленной патогенностью риккетсий и других клещевых микроорганизмов (подбор чувствительных линий, методов заражения и выявления, условий культивирования).

2.Использование культур клеток для изоляции и изучения известных и новых генотипов риккетсий и других протеобактерий.

3.Отработка тактики применения культур клеток в сочетании с методами микроанализа для мониторинга очагов трансмиссивных бактериальных инфекций.

Научная новизна

В результате проведенных исследований существенно дополнены представления о структуре популяций риккетсий в очагах клещевого риккетсиоза, что имеет большое значение для эпидемиологической характеристики очагов.

Впервые в России и мире с помощью культуры клеток удалось выделить и накопить штаммы нового генотипа риккетсий Candidates Rickettsia tarasevi-chiae. Впервые показана возможность культивирования в культуре клеток риккетсий новых генотипов R.sp.RpA4 и R.sp.DnS28, не культивирующихся на традиционных моделях.

На территории Западной Сибири от коровы больной анаплазмозом с помощью культуры клеток Vero выделен первый в России штамм анаплазм Anaplasma speciosus Omsk, который по нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16s р-РНК отличается от A.centrale и A.marginale. Разработан культуральный метод диагностики анаплазмоза с использованием клеток Vero.

Научно-практическая ценность работы:

Показана целесообразность использования культур клеток в сочетании с другими методами (молекулярно-биологические исследования, традиционные биологические модели и др.) для изучения популяций риккетсий, в том числе и риккетсий новых генотипов.

Предложены новые методические подходы к изучению структуры популяций риккетсий и анаплазм в природных очагах с различной эпидемической активностью.

Выделены в культуре клеток первые штаммы кандидата в новый вид Rickettsia tarasevichiae, которые выявлены на различных территориях России, в том числе с отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом.

Получены экспериментальные серии антигенов из штаммов риккетсий новых генотипов для диагностических целей.

Выделен и изучен первый в России штамм анаплазм A.sp.Omsk, который депонирован во Всероссийский музей риккетсиальных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Восемь первых в России и мире штаммов Candidatus Rickettsia tarasevichiae депонированы во Всероссийский музей риккетсиальных культур.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на Проблемной комиссии «Гигиена, экология, эпидемиология, общественное здоровье и здравоохранение» и кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии; эпидемиологии, гигиены, медицинской экологии Омской государственной медицинской академии,2006г.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на следующих отечественных и международных конференциях и съездах: 3 регион, научно -практ.конф., посвящ. 80-летию образования гос.санитарно - эпидемиол.службы Российской Федерации, 4 межрегион.конф. с международным участием, посвященной 60-летию кафедры эпидемиологии и 80-летию кафедры микробиологии Омской государственной медицинской академии, Омск, 13-14 ноября 2003 г, 5 межрегиональной научно-практ. конференции с международным участием, Омск 2004 г, на международной конференции в Логроно, Испания, июнь 2005 г.

Публикации:

Основные результаты опубликованы в 11 печатных работах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Для объективной оценки эпидемической активности природных очагов риккетсиозов разработаны новые методические подходы к изучению структуры популяций риккетсий.

2. Культура клеток является наиболее эффективным методом для выделения и изучения клещевых риккетсий и анаплазм, не культивирующихся на традиционных моделях, оценки структуры их популяций и создания диагностических препаратов.

3. По данным изоляции на культуре клеток показано преобладание риккетсий новых генотипов в структуре популяций на территориях с различным уровнем заболеваемости клещевым риккетсиозом.

Заключение диссертации по теме «Эпидемиология», Кумпан, Людмила Валерьевна

Выводы:

1. Показана эффективность применения для мониторинга очагов и изучения циркулирующих штаммов риккетсий культур клеток Vero и Нер-2. Использование культур клеток является перспективным методом для изоляции и изучения риккетсий, особенно с низкой вирулентностью.

2.Предложены новые методические подходы к микробиологическому мониторингу очагов с различной эпидемической активностью и изучению популяций риккетсий с использованием классических риккетсиологических и современных экспериментальных методов (культура клеток, КЭМ, и молекуляр-но-биологические методы).

3.С использованием культур клеток впервые в мире, выделены и изучены штаммы Rickettsia tarasevichiae.

4.Клеточные культуры являются оптимальной моделью для культивирования штаммов известных видов патогенных риккетсий (R.sibirica, R.slovaca), так и ряда новых генотипов риккетсий (R.sp.RpA4,R.sp.DnS28, R.sp.DnS14) с неустановленной для человека патогенностью. С помощью данной модели выделены и изучены штаммы риккетсий подгруппы R.massiliae. Получены куль-туральные антигены для РНИФ позволяющие выявлять антитела у серонега-тивных клещевых больных.

5. С использованием культур клеток Vero выделен и изучен первый в России штамм анаплазм (Anaplasma sp.Omsk) . Выделенный штамм анаплазм идентифицирован с помощью молекулярно биологических методов, нуклео-тидная последовательность гена 16s р-РНК новой анаплазмы депонирована в Генбанк. Установлена возможность накопления биомассы анаплазм и получен цельнорастворимый антиген для проведения диагностических исследований.

Заключение.

Последние десятилетия 20 столетия характеризовались активизацией эпидемического проявления клещевых риккетсиозов, объединяемых в группу клещевых пятнистых лихорадок, в различных регионах мира.

В последние десятилетия открыты и изучены несколько новых для науки представителей риккетсий группы КПЛ: R. helvetica, R. massiliae, R. honei, R. felis, R.peacockii, R. amblyommii, R. japonica, R. africae, возбудитель Астраханской клещевой пятнистой лихорадки и другие. Среди риккетсий данной группы выделяют как патогенные (R.honei, R.africae), так и непатогенные для человека (R. helvetica, R.peacockii) риккетсии. Патогенность вновь выявленных агентов пока не установлена. Непатогенные для человека риккетсии в последние годы обнаружены на различных континентах.

Поскольку критерии вида для группы КПЛ окончательно не установлены и роль новых представителей в инфекционной патологии человека не доказана, I более обоснованным, с нашей точки зрения, является представление о циркуляции в различных регионах мира слабо - и авирулентых риккетсий. Надо полагать, что некоторые из них являются гено - и фенотипически близкими к прото-типным патогенным для человека видам.

Одним из важнейших представителей группы КПЛ является клещевой риккетсиоз, эпидемически активные очаги которого распространены преимущественно в азиатской части России. Начиная с 30-х годов, с момента верификации клещевого риккетсиоза, отмечались периоды с различной эпидемической активностью очагов, свидетельствующие о цикличности эпизоотического и зависимого от него эпидемического процессов. В настоящее время эта инфекция зарегистрирована на 18 административных территориях юга Сибири и Дальнего Востока. С 1936 г. по 2004 г. в России зарегистрировано более 61 тысячи случаев этого заболевания. За более чем 65- летнюю историю изучения КР неоднократно отмечались периоды с различной эпидемической активностью очагов, свидетельствующие о цикличности эпизоотического процесса этой инфекции.

Проведенный анализ позволил выделить три многолетних периода. Первый период, характеризующийся подъемом уровня заболеваемости КР в стране, наблюдался с 1943 по 1968 гг., с регистрацией наибольшего количества случаев заболевания в 1945, 1954 и 1967 гг. преимущественно за счет региона Восточной Сибири. Во второй период (с 1968 по 1978 гг.) наблюдалось значительное снижение регистрации заболеваемости КР. Однако, с 1979 г. по настоящее время (третий период) наблюдается непрекращающийся рост заболеваемости с ростом показателей в 10 раз, преимущественно за счет Западной Сибири. Более 80 % случаев выявлены в Алтайском и Красноярском краях.

По заболеваемости этой инфекцией Алтайский и Красноярский края на протяжении ряда десятилетий имеют наиболее высокие показатели в стране. В Западной Сибири клещевой риккетсиоз не выявлен только на двух административных территориях (Омской и Томской областях). В последние годы отмечается возникновение новых (или ранее неизвестных) эпидемически активных очагов этой инфекции на периферии нозоареала, а именно в Новосибирской, Тюменской и Курганской областях. В Восточной Сибири наиболее высокие показатели заболеваемости отмечены в Красноярском крае, отдельные случаи - на большинстве других территорий юга региона (Бурятия, Иркутская и Читинская области, Тыва). Заболеваемость КР постоянно отмечается и на Дальнем Востоке - в Хабаровском и Приморском крае, Амурской области.

В настоящее время отсутствуют достоверные данные о причинах неуклонного роста заболеваемости клещевым риккетсиозом. Для объективной оценки эпидемической активности очагов риккетсиозов необходима разработка новых подходов к изучению количественных и качественных изменений в популяциях риккетсий.

Сопоставление территориального распределения заболеваемости КР за период с низким уровнем заболеваемости (60-е годы) и период резкого роста (1994-2003 гг.) свидетельствует о его изменениях за счет увеличения доли заболеваемости в Западной Сибири (с 24,5 до 55,0 %) и на Дальнем Востоке (с 7,5 до 23 %). При этом доля заболеваемости в Восточной Сибири снизилась с 68,0 до 22 %.

В период 1984-2004 гг. в России зарегистрировано 37220 случаев заболеваний клещевым риккетсиозом.

По данным официальной регистрации за 2000-2003 гг. на Западную Сибирь приходится 58%, на Дальний Восток — 18%, на Восточную Сибирь - 24% всех зарегистрированных заболеваний в стране. За последние три года отмечается незначительное снижение заболеваемости клещевым риккетсиозом на Дальнем Востоке.

Показатели заболеваемости на 100 тыс. населения с 1993 - 2004гг составляли, в Западно-Сибирском регионе - 9,0 (с колебаниями в различные годы от 4,8 до 15), в Дальне-Восточном - 7,6 (от 5,9 до 10,2), в Восточно-Сибирском -6,1 (от 4,3 до 8,9), соответственно (табл. 5). В Западно-Сибирском регионе наиболее высокие показатели заболеваемости отмечались в Республике Алтай и Алтайском крае (более 50,0 на 100 тыс. населения). В Восточно-Сибирском регионе показатели заболеваемости составил от 21,0 до 55,0. В Дальневосточном регионе максимальные показатели заболеваемости наЮО тыс. населения составил более 10,0.

Приведенные данные свидетельствуют, что наиболее высокие показатели заболеваемости в период 1994-2004 гг. регистрировались в Западно-Сибирском регионе (15,0 в 2001 г.). Анализ заболеваемости КР по регионам за последние 5 лет (1999-2003) показал, что в Западно-Сибирском регионе показатель на 100 тыс. населения составлял 11,3 в Восточно-Сибирском - 6,8, в Дальневосточном — 7,3. Сравнение с показателями заболеваемости КР в вышеназванных регионах за период 1991-1995 гг. свидетельствует об увеличении показателей в 19992003 гг., в основном, в Западно-Сибирском (с 13,1 до 15), Восточно-Сибирском (с 5,6 до 8,9 на 100 тыс. населения) регионах, при тенденции снижения показателей в Дальне-Восточном регионе (с 6,5 до 3,6). В 2002 произошло снижение показателя заболеваемости на 100 тыс. населения в Западно-Сибирском регионе и рост этого показателя в Восточно-Сибирском регионе, в результате чего произошло их выравнивание на значении 8,9.

В 2001г. было зарегистрировано наибольшее число случаев (3460 чел.), из них на Западную Сибирь приходится 64,7%, на Восточную Сибирь 21,8% и на Дальний Восток - 13,5%. Следовательно, резко возросшая с 1979 года заболеваемость КР, по данным последних лет, остается на стабильно высоком уровне.

В России 1999г. впервые серологически подтверждено заболевание мо-ноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ) у четырех больных в г. Перми после присасывания клещей (Ravyn et al.,1999). В клещах Ixodes persulcatus, собранных с растительности на территории Пермской области, авторами был генотипирован микроорганизм из рода Ehrlichia — Ehrlichia muris.

К настоящему времени установлено широкое распространение Е. muris на ряде территорий Азиатской части России в зоне распространения основного переносчика этого вида моноцитарных эрлихий - таежного клеща Ixodes persulcatus (Шпынов С.Н. и др.,2002,2003). ДНК эрлихий и анаплазм была выявлена и идентифицирована в 17 из 878 (1,9 %) исследованных иксодовых клещей. Е. muris была выявлена в клещах этого вида, собранных на территории Тюменской (5,3 %), Омской (3,3 %) и Новосибирской (3,8 %) областей и Алтайского края (8,5 %). Можно считать достаточно вероятным распространение Е.muris в пределах всего ареала этого клеща, в т.ч. в России - в пределах всего лесного пояса - от западных до восточных границ.

Эрлихии геногруппы (ГАЧ) были первоначально выявлены в клещах Ixodes persulcatus в Балтийском регионе России (Дубинина Е.В. и Алексеев А.Н.,1999; Alekseev A.N. et al.,2001) и граничащих с Российским Дальним Востоком севера - восточных районах Китая (Cao W.-C. et al.,2000). В дальнейшем - на Дальнем Востоке России - в Приморском (Шпынов С.Н. и др., 2004) и Хабаровском (Медянников О.Ю. и др.,2001) краях. К настоящему времени грану-лоцитарные эрлихии выявлены также в Новосибирской области (Morozova О. et al.,2002) и Алтайском крае (Шпынов С.Н. и др.,2003). Случаи гранулоцитарного эрлихиоза у людей были выявлены ретроспективно в Алтайском крае в 1999г.

Рудаков Н.В. и др.,2001) и в Новосибирской области в 2002г. (Рудаков и др.,2002). Можно считать достаточно вероятным распространение возбудителя ГАЧ в России в пределах всего ареала клещей Ixodes persulcatus, с возможными эпидемическими проявлениями очагов этой инфекции.

Анаплазмоз регистрируется во многих странах мира, в частности, в странах Европы, Балтии, Средней Азии, Латинской Америки, а так же во многих регионах России. На территории Западной Сибири анаплазмоз крупного рогатого скота ранее официально не регистрировался.

Возбудители анаплазмозов у людей и животных в России генетически не идентифицированы, не доказано генетическое родство и отличие между ними, однако считается, что один из них - A. phagocytophila является возбудителем гранулоцитарного анаплазмоза, как у животных так и у человека.

По данным сотрудников ИВМ ОмГАУ ( В.А. Стрельчик и др., 2000), за последние 15 лет в ряде хозяйств Омской, Новосибирской и Тюменской областях отмечались периодические вспышки заболевания животных с клиническими признаками анаплазмоза, в мазках крови от больных животных обнаруживали поражение эритроцитов анаплазмами.

На территории Западной Сибири 2004 году в Омске из селезенки коровы больной анаплазмозом, в культуре клеток Vero, нами был выделен первый в России штамм анаплазм, A.sp.Omslc, который по нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16s р-РНК отличался от A. marginale и A. centrale. До относительно недавнего времени эрлихии были известны как возбудители заболеваний животных на ряде континентов. В последнее время благодаря широкому внедрению методов генетического анализа протеобактерии, вызывающие эрлихиозы человека реклассифицированы в три рода Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia, вместо одного рода Ehrlichia (Dumler, Walker, 2001).

Диагноз эрлихиоза, может быть подтвержден микроскопически, серологически, или генетическими методами, а также прямым выделением возбудителя в культуре ткани (Dumler J.S.,1993).

Из-за отсутствия стандартных отечественных клеточных линий ДН82 и HL-60, нами в качестве биологической модели для культивирования и изучения анаплазм, была использована культура клеток Vero. Для заражения культуры клеток Vero, был использован материал, от больной коровы анаплазмозом, который в процессе нашего исследования был генотипирован, как Anaplasma spe-ciosus Omsk. Штамм генотипирован в Новосибирском институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Заражение культур клеток Vero проводили 10% суспензией, которая была получена из селезенки коровы больной анаплазмозом. Заражение и культивирование анаплазм проводили согласно описанной методике. Клетки культивировали в углекислотном термостате при температуре 35,6°С. На второй — третий день культивирования клеток при микроскопии в клетках наблюдали дегенеративные изменения. Изучение ультраструктуры проводили с помощью электронной микроскопии совместно с ИВМ ФГОУ ВПО ОМГАУ проф. Беспаловой Т.А.

Изучение субмикроскопической структуры анаплазмозных клеток проводилось в ультратонких срезах. При просмотре срезов обращали внимание на форму анаплазм, которая обычна была округлая или овальная. При проведении электронной микроскопии было установлено, что анаплазмы окружены плотной непроницаемой морулой (двухслойная цитоплазматическая мембрана), внутри которой находятся «инициальные тельца», каждая из которых окружена тонкой наружной и внутренней мембраной. Мелкие микроколонии состояли из одной - двух особей, а более крупные из нескольких. При наличие двух паразитов колонии имели вытянутую, многоугольную и округлую форму. Так же было установлено, что анаплазмы размножаются простым делением и почкованием, формируя колонии из 2 — 8 особей, формирование поперечных трубчатых структур и перетяжек, указывает на деление анаплазмозных клеток. Ультраструктура анаплазмозных клеток представлена протопластическими пучками в периплазмотическом пространстве, скоплениями рибосом, тонкими нитями ДНК, трубчатыми и везикулярными образованиями.

Нами была получена сыворотка, при гипериммунизации кроликов, которая обладает строгой специфичностью к гомологичному возбудителю в титре от 1:160 и выше. Полученная сыворотка может использоваться в РНИФ для индикации и идентификации возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота, изучения его антигенных свойств и родства, патогенеза болезни. Анаплазмозный антиген может применяться для РНИФ и других серологических методах диагностики для выявления антител.

Нами впервые был прокультивирован и накоплен в культуре клеток Vero первый в России штамм анаплазм, а также получен из этого штамма антиген, для проведения диагностики заболевания у животных и человека.

Первый в России штамм анаплазм был депонирован во Всероссийский риккетсиологический музей, для дальнейшего изучения.

В данной работе нами отработана тактика применения культур клеток для изучения риккетсий новых генотипов. Проведено экспериментальное и полевое изучение риккетсий группы КПЛ в очагах клещевого риккетсиоза и на территориях с отсутствием регистрируемой заболеваемости.

Для объективной оценки эпидемической активности очагов риккетсиозов разработаны новые подходы к изучению изменений в популяциях риккетсий. Экспериментальное и полевое изучение риккетсий группы КПЛ позволяет расширить представления о механизмах сохранения риккетсий в клещевых популяциях, их гетерогенности, изменчивости, влиянии изменений популяционных характеристик риккетсий на эпидемический процесс.

Использование культур клеток является перспективным методом для изоляции и изучения риккетсий группы КПЛ, особенно с низкой вирулентностью. Применение современных методов выделения и культивирования с использованием культур клеток позволило развить концепцию о непатогенных видах риккетсий и выделить ряд слабо и апатогенных представителей антигенного комплекса клещевой пятнистой лихорадки (Тарасевич И.В., Макарова В.А., 1981; Макарова В.А., Тарасевич И.В.,1989). Учитывая вышесказанное, а также особенности экологии возбудителей этой группы, мы считаем вполне обоснованным использование культуры клеток в качестве экспериментальной модели в сочетании с другими методами для изучения риккетсий новых генотипов. Для изучения возможности культивирования риккетсий новых генотипов в культуре клеток нами были использованы перевиваемые культуры клеток Vero и Нер-2, и семь штаммов, пяти генотипов риккетсий:

1. Штамм «107/ 87 - Баево» вид R.sibirica

2. Штамм «5/98-Караганда » генотип R.sp. RpA 4

3. Штамм «23/95-Еланда» генотип R. DnS 28

4. Штамм «Шайман» генотип R. DnS 14

5. Штамм «Доберман» генотип R. sp RpA 4

6. Штамм «Бурятия -5» генотип R. DnS 28

7. Штамм «Карпунино 19/69» генотип R.slovaca.

Для того, чтобы определить возможность культивирования риккетсий в культурах клеток Vero и Нер-2, мы прокультивировали в культуре клеток наиболее изученный штамм «107/ 87 — Баево» R.sibirica. В культуре клеток Vero и Нер-2 наблюдалось накопление риккетсий на протяжении 5 пассажей. С помощью этого штамма отработана фиксация мазков для РНИФ.

Штаммы«5/98-Караганда», «23/95-Еланда», были прокультивированы на двух линиях клеток Vero иНер-2, все остальные штаммы были прокультивированы только в культуре клеток Vero.

Культивирование риккетсий генотипов R.sp.RpA 4 и R.sp. DnS28 штам-мы«5/98-Караганда» и «23/95-Еланда», проводилось на протяжении 11 пассажей (срок наблюдения), а штаммы: «Шайман» генотип DnS 14, «Доберман» генотип RpA 4, «Бурятия-5» генотип DnS28, «Карпунино 19/69» генотип R.slovaca на протяжении 6 пассажей.

На протяжении 11 пассажей у генотипов R.sp. RpA 4 и R.sp. DnS28 отмечали незначительные дегенеративные изменения в двух клеточных культурах. Такая же картина наблюдалась и у других генотипов в культуре клеток Vero. Наши наблюдения подтверждают наблюдения Паутова и Игумнова (1968г), что риккетсии оказывают цитопатическое действие на клетки, хотя оно выражено менее четко, чем при культивировании вирусов.

При обработке данных однофакторным дисперсионным анализом максимальное накопление риккетсий в культуре клеток Vero у генотипа генотип R. sp. DnS28 штамм «23/95-Еланда», наблюдали на 7-8 пассаже, а в культуре клеток Нер-2 наЗ-4 пассаже.

У генотипа R. sp. RpA 4 штамм «5/98-Караганда», максимальное накопление в культуре клеток Vero и Нер-2 наблюдали на 9-10 пассаже. Как показал, однофакторный дисперсионный анализ значительных различий по уровню накопления риккетсий в культуре клеток Vero и Нер-2 не наблюдалось (F<Fos)

По среднестатистическим данным уровень накопления риккетсий на протяжении 6 пассажей у штаммов «Шайман», «Доберман», «Бурятия-5/2000», «Карпунино 19/69» был незначительным. Лучше всего культивировались штаммы «Шайман» и «Карпунино 19/69» максимальное накопление риккетсий наблюдалось на 3-4-5 пассажах и, накопление было стабильным. На основании результатов однофакторного дисперсионного анализа выявлены достоверные различия (Р < 0,05) между уровнем накопления риккетсий в культуре клеток Vero между штаммами

Из накопленной биомассы генотипов R.sp RpA 4 и R.DnS 28 готовили цельнорастворимый риккетсиальный антиген, полученный в соответствии с рекомендациями Здродовского П.Ф., Голиневич Е.М. (1972). Исходным материалом для приготовления цельнорастворимых антигенов являлась зараженная клеточная взвесь. Антигены были исследованы в перекрестном РСК с коммерческими сыворотками R.sibirica, R.prowazekii, антигенной реактивности не отмечено. Данный антиген проверен в перекрестной РСК с сыворотками больных. При исследовании 174 сывороток от больных с клещевыми инфекциями из Усть-Таркского района Новосибирской области и 21 сыворотки от больных из Алтайского края, в РСК с антигеном R.sibirica получен отрицательный результат. Выявлено 12 (6,8%) больных из Усть-Таркского района и 9 (42,8%) больных из Алтайского края положительно реагирующих с антигенами риккетсий новых генотипов. С антигенами R.sp.RpA 4 и R.sp.DnS2<§ сыворотки больных реагировали одинаково, что подчеркивает близкие антигенные связи этих риккетсий, имеющих высокую генетическую гомологию. Полученные результаты свидетельствуют об актуальности дальнейшей разработки диагностических препаратов на основе риккетсий новых генотипов.

С помощью культуры клеток Vero нами было проведено изучение 116 индивидуальных особей клещей. Материал был получен из Центрального, Западно-Сибирского, Восточно-Сибирского регионов России, а именно из Воронежской, Омской, Новосибирской областей и Красноярского края. Исследование индивидуальных особей клещей в культуре клеток было проведено впервые, ранее клещи исследовались пулами.

Из всех особей клещей была получена суспензия, которой и проводилось заражение подготовленных клеток.

Материал, полученный из окрестностей с. Подгородка Омской области, из заповедника «Столбы», Красноярского края, из с. Усть-Тарки Новосибирская область и из Воронежской области, культивировали в культуре клеток Vero на протяжении 4 пассажей. После каждого пассажа материал исследовали в РНИФ на наличие риккетсий группы КПЛ, а также проводили изучение морфологических и тинкториальных свойств по Здродовскому. По П.Ф.Здродовскому микроорганизмы окрашивались, в ярко-розовый или рубиново-красный цвет, цитоплазма клеток - в голубой, ядра - в синий. В культуре клеток Vero наблюдалось умеренное накопление или до 1,2-х крестов в поле зрения. Изученные штаммы реагировали с группоспецифическими сыворотками против Ag группы КПЛ и группы сыпного тифа. Из 58 исследованных клещей из с. Подгородка - 43 положительных, процент инфицированности материала составил 74,1%, из И исследованных клещей из Красноярского края з. «Столбы» -9 положительных, процент инфицированности (81,8%), исследованные клещи из Усть-Тарки из 10 -10 положительных (100%), при исследовании в культуре клеток клещей из Воронежской области из 37 клещевых изолятов, 21 положительный, что составило 56,8 % инфицированности.

Для проведения генетического анализа и определения видовой принадлежности, нами был отобран материал, где по нашим наблюдениям было большее накопление риккетсий в культуре клеток. Количество исследованного материала в ПЦР указано в главе материалы и методы. Молекулярно-генетические исследования проведены совместно с д.м.н. С.Н.Шпыновым, идентификация выделенных штаммов проведена в Средиземноморском университете на базе лаборатории «Unite des Rickettsies» (г. Марсель, Франция).

При исследовании молекулярно-генетическими методами 13 штаммов из окрестностей с.Подгородка Омской области, в 13 были обнаружены ДНК риккетсий группы КПЛ, в шести изолятах выделен новый генотип риккетсий относящийся к Candidatus Rickettsia tarasevichiae. В 9 изолятах из Усть-Таркского района Новосибирской области, семь идентифицированы, как Candidatus Rickettsia tarasevichiae, в одном из образцов обнаружена ДНК риккетсий группы КПЛ, идентифицировать которую не удалось и в одной пробе ДНК риккетсий не выявлены.

При исследовании шести проб, полученных из заповедника «Столбы» Красноярского края, в четырех пробах выявлена Candidatus Rickettsia tarasevichiae, в двух пробах ДНК риккетсий группы КПЛ не обнаружено.

При исследовании 14 изолятов полученных из Воронежской области в четырех пробах идентифицирован генотип R. sp RpA 4. В остальных образцах ДНК риккетсий не обнаружено.

И так нами с помощью культуры клеток удалось выделить и накопить первый в России штамм нового генотипа риккетсий относящийся к риккетсии Candidates Rickettsia tarasevichae, нами депонировано в Российский музей рик-кетсиологических культур 7 первых в России штаммов нового генотипа риккетсий, относящихся к риккетсии Candidatus Rickettsia tarasevichiae, для дальнейшего изучения и создания диагностических препаратов. Нам так же удалось прокультивировать штаммы риккетсий новых генотипов, не культивирующиеся на традиционных моделях.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Кумпан, Людмила Валерьевна, 2006 год

1. Антонов Н.И. Сыпная клещевая лихорадка в ДВК / Н.И. Антонов, А.Г. Найштат // Дальневосточный мед. журн. 1936. - Вып. 5. - С. 77-86.

2. Балашов Ю.С. Взаимоотношения кровососущих членистоногих и риккетсий / Ю.С. Балашов // Паразитология. 1971. - № 5. - С. 345-356.

3. Балашов Ю.С. Иксодовые клещи — паразиты и переносчики инфекций / Ю.С. Балашов СПб. : Наука, 1998. - 284 с.

4. Балашов Ю.С. Кровососущие членистоногие и риккетсии / Ю.С. Балашов, А.Б. Дайтер JL : Наука, 1973. - 251 с.

5. Барыкин В. Опыт культивирования сыпнотифозного вируса на куриных зародышах / В. Барыкин, А. Компанеец, А. Бочарова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1935. - С.15, 163.

6. Беклемишев В.Н. О взаимоотношениях между систематическим положением возбудителей и переносчиков трансмиссивных болезней наземных позвоночных и человека / В.Н. Беклемишев // Мед. паразитология и пара-зитар. болезни. 1948. - № 17. - С. 385-400.

7. Беляков В.Д. Качество и эффективность противоэпидемических мероприятий / В.Д. Беляков, А.А. Дегтярев, Ю.Г. Иванников JI. : Медицина, 1981.-303 с.

8. Беляков В.Д. Окружающая среда и эпидемиологический процесс / В.Д. Беляков //Вестн. АМН СССР. 1981. - № 3. - С. 80-85.

9. Беляков В.Д. Проблема саморегуляции паразитарных систем и механизм развития эпидемического процесса / В.Д. Беляков // Вестн. АМН СССР. — 1988.-№5.-С. 3-9.

10. Беляков В.Д. Эпидемиология / В.Д.Беляков, Р.Х. Яфаев. М. : Медицина, 1989.-416 с.

11. Вахба АХ.В. Роль современных лабораторных служб в эпидемиологическом надзоре за инфекционными болезнями и борьбе с ними / АХ.В. Вах-ба // Инфекционные болезни / Европейское региональное бюро ВОЗ. — Копенгаген, 1974. С. 42-46.

12. Вощакина Н.В. Материалы к характеристике вновь выявленного очага клещевого риккетсиоза в Армизонском районе Тюменской области / Н.В. Вощакина // Труды / Омский ин-т эпидемиологии, микробиологии и гигиены. Омск, 1950. - Т. 5. - С. 55-60.

13. Вощакина Н.В. Материалы к характеристике вновь выявленного очага клещевого риккетсиоза в Армизонском районе Тюменской области / Н.В. Вощакина // Труды / Омский НИИ эпидемиологии, микробиологии и гигиены. Омск, 1958. - Т. 5. - С. 55-60.

14. Вощакина Н.В. Очаг клещевого сыпного тифа в Новосибирской области / Н.В. Вощакина, М.С. Шайман, Н.М. Ерохин // Труды / Томский НИИ эпидемиологии и микробиологии. Томск, 1956. - Т. 7. - С. 153-159.

15. Выявление эрлихий в клещах Ixodes persulcatus на Урале и в Азиатской части России / С.Н. Шпынов и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2002. - Т. 2, №4.-С. 139-141.

16. Генотипирование риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки в клещах рода Dermacentor в России и Казахстане / С.Н. Шпынов и др. // Мед. паразитология и паразитар. болезни. 2003. - № 3. - С. 20-24.

17. Громов Б.В. Бактерии внутриклеточные симбионты животных / Б.В. Громов //Успехи микробиологии. - 1978. - Т. 13. - С. 50-71.

18. Гудима О.С. Культивирование риккетсий Бернета в культурах клеточных штаммов и трипсинизированных тканей / О.С. Гудима // Риккетсиозы. -М., 1960-С. 119.

19. Далматов В.В. Эпидемиологический надзор за инфекциями с широким диапазоном клинического проявления : дис. . д-ра мед. наук / В.В. Дал-матов. — Омск, 1987. 326 с.

20. Емельянов В.В. Эволюционное родство риккетсий и митохондрий эука-риота / В.В. Емельянов // Вестн. РАМН. 2000. - № 3. - С. 3-7.

21. Жмаева З.М. Иксодовые клещи носители риккетсий лихорадки-Ку и клещевого сыпного тифа Азии в Северном Казахстане / З.М. Жмаева, А.А. Пчелкина // Природная очаговость болезней и вопросы паразитологии. - Фрунзе, 1964. - Вып. 4. - С. 30-41.

22. Ивэнс А.С. Серологические обследования. Роль справочных банков сывороток ВОЗ / А.С. Ивэнс // Хроника ВОЗ. 1967. - Т. 21, № 5. - С. 181186.

23. Изучение членистоногих убежищного комплекса в природных очагах трансмиссивных вирусных инфекций / А.А. Тагильцев и др. // Руководство по работе в полевых и лабораторных условиях. Томск, 1990. — С. 106.

24. К вопросу об этиологии гранулоцитарного эрлихиоза человека на Дальнем Востоке России / О.Ю. Медянников и др. // Тихоокеанский мед. журн. — 2001. — № 2 (7). С. 126.

25. Клещевой риккетсиоз в Новосибирской области / Н.В. Рудаков и др. // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения Омской области : материалы обл. науч.-практ. конф. -Омск, 2000.-С. 192-194.

26. Кокорин И.Н. Выращивание риккетсий в культурах клеток / И.Н. Коко-рин // Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиоз-ных болезней. -М., 1965. С. 521.

27. Кокорин И.Н. Размножение риккетсий в культурах клеток / И.Н. Коко-рин, Н.Н. Рыбкина, М.Ю. Морозова // Вопросы инфекционной патологии и иммунологии. М., 1963. - С. 108.

28. Коренберг Э.И. Популяционные основы функционирования природных очагов / Э.И. Коренберг // Проблемы инфектологии. М., 1991. - С. 335343.

29. Коренберг Э.И. Эрлихиозы новая для России проблема инфекционной патологии / Э.И. Коренберг // Мед. паразитология и паразитар. болезни. — 1999.-№4.-С. 10-14.

30. Коршунова О.С. К этиологии дальневосточной сыпнотифозной лихорадки. Сообщение 1 / О.С. Коршунова // Журн. микробиологии. 1943. - № 1-2.-С. 51-55.

31. Коршунова О.С. Клещи Ixodoidae и Rickettsia sibirica (Dennacentorxenus sibiricus) полевые и экспериментальные исследования / О.С. Коршунова // Биологические взаимоотношения между переносчиками и возбудителями болезней. - М., 1967. - С. 86-103.

32. Коршунова О.С. О природных очагах клещевого сыпного тифа в Бурятской АССР / О.С. Коршунова, С.П. Пионтковская, В.Е. Флинт // Зоолог, журн. 1965. - Вып. 44, № 7. - С. 980-985.

33. Коршунова О.С. О природных очагах клещевого сыпного тифа в Восточном Казахстане / О.С. Коршунова, С.П. Пионтковская // Мед. паразитология и паразитар. болезни. 1961. - Т. 30, № 4. - С. 442-446.

34. Коршунова О.С. Этиология клещевого сыпного тифа в Красноярском крае / О.С. Коршунова // Журн. микробиологии. 1943. - № 1-2. — С. 5965.

35. Кронтовская М.К. Клещевой сыпной тиф на Востоке СССР / М.К. Кронтовская, Е.П. Савицкая // Сов. медицина. 1946. — № 12. - С. 15-17.

36. Кулагин С.М. Клещевой сыпной тиф в Алтайском крае : дис. . д-ра мед. наук / С.М. Кулагин. -М., 1953. 859 с.

37. Литвин В.Ю. Природная очаговость болезней: развитие концепции к исходу века / В.Ю. Литвин, Э.И. Коренберг // Паразитология. 1999. - Т. 33, вып. З.-С. 179-191.

38. Макарова В.А. Биологические свойства возбудителя «Астраханской» пятнистой лихорадки, выделенного из крови больных / В.А. Макарова, Н.Ф. Фетисова, И.В. Тарасевич // Вопросы риккетсиологии : сб. науч. тр. -М, 1994.-С. 73-78.

39. Макарова В.А. Вопросы идентификации риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки : дис. . канд. мед. наук / В.А. Макарова. М., 1978. - 167 с.

40. Макарова В.А. Выделение серологических и экологических вариантов R. sibirica в западной части ареала / В.А. Макарова // Вопросы риккетсиологии. -М., 1978.-С. 20-22.

41. Макарова В.А. Выделение штаммов риккетсий "астраханской" пятнистой лихорадки из клещей Rh. Pumilio / В.А. Макарова, Н.Ф. Фетисова, И.В. Тарасевич // Вопросы риккетсиологии : сб. науч. тр. М., 1994. — С. 7073.

42. Макарова В.А. Предварительные результаты изучения заболеваний группы клещевой пятнистой лихорадки в Астраханской области / В.А. Макарова, И.В. Тарасевич // Вопросы риккетсиологии : материалы IV Всесо-юзн. конф. М., 1989. - С. 75-77.

43. Многолетние материалы по эпидемиологии клещевого сыпного тифа в Красноярском крае / Н.В. Вощакина и др. // Вопросы краевой инфекционной патологии. Тюмень, 1967. - С. 5-7.

44. Новые данные о распространении риккетсий RpA4 и R.aeschlimannii в Северной Азии / С.Н. Шпынов и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2002. -Т. 2, №4.-С. 136-138.

45. Новые данные о риккетсиях группы КПЛ в России и Казахстане / Н.В. Рудаков и др. // Журн. инфекц. патологии. 2001. - № 2-3. - С. 75-80.

46. Паутов В.Н. Биология риккетсий / В.Н. Паутов, А.И. Игумнов. М., 1968. -С. 27.

47. Покровский В.И. Пути оптимизации эпидемиологического надзора за инфекционными болезнями в стране / В.И. Покровский // Журн. микробиологии. 1986. -№ 11.- С. 3-7.

48. Радованович М.Р. Национальные программы эпидемиологического надзора за инфекционными болезнями в Европе / М.Р. Радованович // Инфекционные болезни / Европейское региональное бюро ВОЗ. — Копенгаген, 1974.-С. 87-92.

49. Разведка риккетсиозов в МНР / Б. Бямбаа и др. // XVI Тихоокеанский научный конгресс : тез. докл. Хабаровск, 1979. — С. 16.

50. Результаты изучения современного состояния очагов клещевого риккет-сиоза на юге Западной и Средней Сибири / Н.В. Рудаков и др. // При-родноочаговые болезни человека. Омск, 1988. - С. 125-136.

51. Результаты изучения современного состояния очагов клещевого риккет-сиоза в Алтайском крае и Кемеровской области / Н.В. Рудаков и др. // Природноочаговые болезни человека : сб. науч. тр. — Омск, 1989. — С. 137-146.

52. Решетникова Т.А. Характеристика биологических свойств штаммов риккетсий, выделенных в Забайкалье и Приморье / Т.А.Решетникова, В.А. Макарова // Природноочаговые болезни человека : республ. сб. науч. работ.-Омск, 1989.-С. 147-153.

53. Ржегачек И. Иксодовые клещи и риккетсии / И. Ржегачек, А.Б. Дайтер // Риккетсиозы : сб. науч. тр. ин-та им. Пастера. Л., 1989. - Т. 66. - С. 6890.

54. Рудаков Н.В. Клещевой риккетсиоз / Н.В.Рудаков, А.С. Оберт. — Омск, 2001.- 120 с.

55. Рудаков Н.В. Новые данные о клещевом риккетсиозе в Новосибирской области / Н.В. Рудаков, Т.П. Малых, Ю.К. Бурцева // Мед. паразитология и паразитар. болезни. — 1990. — № 3. С. 54-55.

56. Рудаков Н.В. Основные направления эпидемиологического надзора и эпидемиологическое районирование Западной Сибири по клещевому риккетсиозу / Н.В. Рудаков // Вопросы риккетсиологии : сб. науч. тр. — М., 1994.-С. 35-38.

57. Рудаков Н.В. Очаги иксодориккетсиозов в условиях антропического воздействия / Н.В. Рудаков // VI Всесоюзное совещание по проблемам теоретической и прикладной акарологии : тез. докл. Л., 1990. - С. 109.

58. Рудаков Н.В. Современное представление о клещевом риккетсиозе / Н.В. Рудаков, И.Е. Самойленко, Т.А. Решетникова // Журн. инфекц. патологии. 1996. - Т. 3, № 4. - С. 64-69.

59. Рудаков Н.В. Современные подходы к эпидемиологическому надзору за природноочаговыми зоонозами / Н.В. Рудаков // Природноочаговые инфекции в России : тез. докл. Всерос. науч.- практ. конф. Омск, 1998. — С. 17-18.

60. Рыбкина Н.Н. Культивирование риккетсий в трипсинизированных клетках почечного эпителия морских свинок / Н.Н. Рыбкина // Вопросы вирусологии.-М., 1961.-С. 4, 479.

61. Самойленко И.Е. Использование микрокультур клеток для культивирования R. sibirica / И.Е. Самойленко, Н.В. Рудаков // Вопросы риккетсиологии : сб. науч. тр. М., 1994. - С. 83-86.

62. Саморегуляция паразитарных систем / В.Д.Беляков и др. JI. : Медицина, 1987.-239 с.

63. Серологические методы диагностики риккетсиозов : метод, рекомендации / И.В Тарасевич и др.; МЗ СССР. М., 1988. - 48 с.

64. Соловьев В.Д. Тканевые культуры в вирусологии / В.Д. Соловьев, Т.А. Бектемиров. Москва 1963 -199с.

65. Сомов Т.П. К эпидемиологии клещевого риккетсиоза Северной Азии в Приморском крае / Т.П. Сомов // Труды / Владивостокский НИИ эпиде-миол. и микробиол. Владивосток, 1969. - Вып. 4. - С. 28-37.

66. Сомов Г.П. Клещевой риккетсиоз Северной Азии / Т.П. Сомов // Природ-ноочаговые болезни в Приморском крае. Владивосток, 1975. - С. 83101.

67. Тарасевич И.В. Идентификация риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки / И.В. Тарасевич, В.А. Макарова // Вопросы риккетсиологии. — М., 1981.-Вып. 2.-С. 62-64.

68. Тарасевич И.В. Эпиднадзор за риккетсиозами / И.В. Тарасевич // Вопросы риккетсиологии : сб. науч. тр. М., 1988. - С. 3-6.

69. Тридцатилетние материалы по эпидемиологии клещевого сыпного тифа Азии в Красноярском крае / Н.В. Вощакина и др. // Вопросы инфекционной патологии. Омск, 1968. - С. 46-47.

70. Черкасский Б.Л. Система эпидемиологического надзора как отражение структуры эпидемического процесса / Б.Л. Черкасский // Журн. микробиологии. 1986. - № 11.-С. 74-78.

71. Черкасский Б.Л. Систематический подход в эпидемиологии / Б.Л. Черкасский. М.: Медицина, 1988. - 288 с.

72. Черкасский Б.Л. Современные теоретические основы профилактики инфекционных болезней / Б.Л. Черкасский // Материалы XVIII съезда микробиологов, эпидемиологов, паразитологов. М. ; Алма-Ата. - 1989. — С. 134-142.

73. Черкасский Б.Л. Социально-экологическая концепция эпидемического процесса / Б.Л. Черкасский // Актуальные вопросы эпидемиологии, диагностики, патогенеза и иммунологии инфекционных болезней : сб. науч. тр. ЦНИИЭ.-М., 1985.-С. 14-16.

74. Шайман М.С. Вирусологическая характеристика очага клещевого сыпного тифа в Новосибирской области /М.С. Шайман // Труды / Омский НИИ эпидемиологии, микробиологии и гигиены. Омск, 1957. - Т. 4. - С. 6776.

75. Шайман М.С. Методические рекомендации по диагностике и эпидемиологической разведке природных очагов клещевого риккетсиоза Азии / М.С. Шайман. — Омск, 1972. 10 с.

76. Шайман М.С. Новые данные об эндемических риккетсиозах Алтайского края / М.С. Шайман // Владивостокский НИИЭМГ : тез. докл. Владивосток, 1966.-С. 77-78.

77. Шайман М.С. Обнаружение нового природного очага клещевого сыпного тифа Северной Азии в Западной Сибири // Мед. паразитология и парази-тар. болезни. 1971. - Т. 40, № 3. - С. 368-369.

78. Шматиков М.Д. Клещевая сыпная лихорадка / М.Д. Шматиков, М.А. Велик // Клин, медицина. 1939. - Вып. 17. - С. 124-126.

79. Штейнхауз Э. Микробиология насекомых / Э. Штейнхауз. М., 1950. — 766 с.

80. Эпидемиологическая активность очагов клещевого риккетсиоза на территориях различной степени хозяйственного освоения / Н.В. Рудаков и др. // Природноочаговые болезни человека. Омск, 1991. - С. 118-124.

81. Эпидемиологический надзор за клещевым риккетсиозом. Иммунодиагностика и методы выявления возбудителя : метод, рекомендации. — Омск, 1992.-36 с.

82. Яблонская В.А. Характеристика культуральных, патогенных и иммуно-генных свойств риккетсий, выделенных в ЧССР / В.А. Яблонская // Журн. микробиологии. 1976. -№ 2. - С. 133-134.

83. ЮО.Ястребов В.К. Материалы по типизации природных очагов клещевого риккетсиоза Сибири и Дальнего Востока / В.К. Ястребов, Т.А. Решетникова // Мед. паразитология и паразитар. болезни. 1990. — №4.-С. 15-17.

84. Ястребов В.К. Система эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом / В.К. Ястребов // Вопросы риккетсиологии : материалы Всесоюз. конф. М.,1989. - С. 164-167.

85. Ястребов В.К. Структура нозоареалов и особенности эпидемиологии клещевого энцефалита и клещевого риккетсиоза в Сибири / В.К. Ястребов // Клещевой энцефалит : сб. ст. / под ред. Г.Н. Леоновой, Л.М. Сомовой-Исачковой. Владивосток, 2002. - С. 130-136.

86. Ястребов В.К. Эпидемиологическое значение очагов клещевого риккетсиоза Северной Азии различного ландшафтного типа в Алтайском крае / В.К. Ястребов // Журн. микробиологии. 1971. - № 4. - С. 22-26.

87. Acute febrile cerebrovasculitis: a syndrome of unknown, perhaps rickettsial cause / R.P. Wenzel et al. // Ann Intern Med. 1986. - Vol. 104. - P. 606615.

88. Anaclcer R.L. Reactivity of monoclonal antibodies to Rickettsia riclcettsii with spotted and typhus group rickettsiae / R.L. Anacker, R.E. Mann, C.J. Gonzales // Clin. Microbiol. 1987. - Vol. 25, № 1. - P. 167-171.

89. Astrakhan fever rickettsiae: antigenic and genotypic analysis of isolates obtained from human and Rhipicephalus pumilio ticks / M.E. Eremeeva et al. // Am. Trop. Med. Hyg. 1994. - Vol. 51. - P. 697-706.

90. Astrakhan fever, a spotted-fever rickettsiosis / I.V. Tarasevich et al. // Lancet. 1991. - Vol. 337, № 8734. - P. 172-173.

91. Bell E.J. Immunologic relationships among the spotted fever group of rock-ettsias determined by toxin neutralization tests in mice with convalescent animal serums / E.J. Bell, H.G. Stoenner // J. Immunol. 1960. - Vol. 84. - P. 174-182.

92. Biological and genetic characterization of Rickettsia sibirica strains in the endemic area of the North asian tick typhus / N.M. Balaeva et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1996. - Vol. 55. № 6. - P. 685-692.

93. Bourtzis К. The many faces of Wolbahia / K. Bourtzis, H.R. Braig I I Rickettsiae and Rickettsial Diseases at the Turn of the Third Millenium. -Marsielle, 1999. P. 199-219

94. Burgdorfer W. Investigation of "transovarial transmission" of Rickettsia rickettsii in the wood tick / W. Burgdorfer // Exptl. Parasitol. 1963. - Vol. 14.-P. 152-159.

95. Burgdorfer W. Mechanisms of transovarial infection of spotted fever rickettsiae in ticks / W. Burgdorfer, L.P. Brinton // Ann. N. Y. Acad. Sci. -1975.-Vol. 266.-P. 61-72.

96. Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its application for the rickettsiae / V. Roux et al. // Int. J. Syst. Bacteriol. -1997.-Vol. 47.-P. 252-261.

97. Contribution to the natural focality of rickettsiae belonging to the Rocky Mountain spotted fever (RMSF) group in Slovakia / J. Rehacek et al. // Folia Parasitol. 1972. - Vol. 19. - P. 41-52.

98. Cowdry E.V. Studies on the aetiology of heartwater.l.Observation of a rickettsia, Rickettsia ruminantium (n.sp.) in the tissues of infected animals / E.V. Cowdry // J Exp Med. 1925.- Vol. 42. - P. 231 -252.

99. Cox H.R. Cultivation of rickettsiae of Rocky Mountain spotted fever, typhus and Q fever groups in the embryonic tissues of developing chicks / H.R. Cox // Science. 1941.-Vol. 94.-P. 399-403.

100. Detection and identification of Ehrlichia, Borrelia burgdorferi sensu lato, and Bartonella species in Dutch Ixodes ricinus ticks / L.M. Schouls et al. // J Clin Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 2215-2222.

101. Detection and identification of spotted fever group Rickettsiae and Ehr-lichiae in African ticks / P. Parola et al. // Emerg. Infect Dis. 2001. — № 7. — P. 1014-1017.

102. Donatien A. Existence en Algerie d'une Rickettsia du chien / A. Donatien, F. Lestoquard // Bull. Soc. Path. Exot. 1935. - Vol. 28. - P. 418-419.

103. Dumler J.S. Tick-born ehrlichioses / J.S. Dumler, D.H. Walker // The Lancet Infectious Diseases. -2001. April. - P. 21-28.

104. Ecology and epidemiology of spotted fever group Rickettsiae and new data from their study in Russia and Kazakhstan / N.V. Rudakov et al. // Ann N Y Acad Sci. 2003. - Vol. 990. - P. 12-24.

105. Eisemann C.S. Proteins of typhus and spotted fever group rickettsiae / C.S. Eisemann, J.V. Osterman // Infect. Immunol. 1976. - Vol. 14. - P. 155-162.

106. Epidemiologic, clinical, and laboratory findings of human ehrlichiosis in the United States, 1988 / T.R. Eng et al. // JAMA. 1990. - Vol. 264, № 17. - P. 2251-2258.

107. Eremeeva M.E. Determination of the genome size and restriction pattern polymorphism of Rickettsia prowazekii and R. typhi by pulsed field gel electrophoresis / M.E. Eremeeva, V. Roux, D. Raoult // FEMS Microbiol. Letters. 1993.-Vol. 112.-P. 105-112.

108. Eremeeva M.E. Differentiation among the spotted fever group rickettsiae species by analysis of restriction fragment length polymorphism of PCR-amplified DNA / M.E. Eremeeva, X.J. Yu, D. Raoult // J. Clin. Microbiol. -1994.-Vol. 32.-P. 803-810.

109. First Documented Human Rickettsia aeschlimannii Infection / D. Raoult et al. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol 8, № 7. - P. 748-749.

110. First isolation of Rickettsia helvetica from Ixodes ricinus ticks in France / P. Parola et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1998. - Vol. 17. - P. 95100.

111. Genotypic and biological characteristics of nonidentified strain of spotted fever group rickettsiae isolated in Crimea / N.M. Balayeva et al. //Acta virol. -1993.-Vol. 37.-P. 475-483.

112. Gilmore R.D. DNA polymorphism in the conserved 190 kDa antigen gene repeat region among the spotted fever group riskettsiae / R.D. Gilmore, G. Hackstadt // Biochimica et Biophysica Acta. 1991. - Vol. 1097. - P. 77-80.

113. Gordon W.S. Studies in Iouping ill, tick-borne fever and scrapie / W.S. Gordon et al. // Proc.3rd Int Congr Microbiol., NY.- 1940.- P. 362-363.

114. Human granulocytic ehrlichiosis in the upper midwest United States: a new species emerging? / J.S. Bakken et al. // JAMA. 1994. - Vol. 272. - P. 212218.

115. Identification of a granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease / S.-M. Chen et al. // J. Clin. Microbiol. 1994. -Vol. 32.-P. 589-595.

116. Incidence, clinical observations and risk factors in the severe form of Mediterranean spotted fever among patients admitted to hospital in Marseille 19831984 / D. Raoult et al. // J Infect. 1986. - № 12. - P. 111 -116.

117. Isolation and characterization of a new Rickettsia from Ixodes ricinus ticks collected in Slovakia / Z. Sekeyova fet al.// Ann N Y Acad Sci. — 2003.-Vol. 990.-P. 54-56.

118. Kordova N. Niektore vysledky studia C. burneti v tkanivovych kulturach / N. Kordova // Csi. Mikrobiol. 1958. - P. 3, 220.

119. La Rocha-Lima H. Zur Antiologie des Fleckfebers / H. La Rocha-Lima // Berlin. Klin. Wsch. 1916. - Vol. 53. - P. 567.

120. Lackman D.B. Antigenic types in the Rocky Mountain spotted fever group of rickettsiae / D.B. Lackman, E.G. Pickens // Bacteriol. Proc. 1953. — Vol. 3. -P. 51.

121. Maeda K. Human infection with Ehrlichia canis, a leukocytic rickettsia / K. Maeda, N. Markowitz, R.C. Hawley // N Engl J Med. 1987. - Vol. 316. - P. 853-856.

122. Marchette N. The tick-borne rickettsiae of the spotted fever or tick typhus group / N. Marchette, D. Stiller // Ecological relationships and evolution of the rickettsiae. Boca Raton, Fla : CRC Press, 1982. - Vol 1. - P. 75-112.

123. Mediterranean spotted fever in Marseille: descriptive epidemiology and the influence climatic factors / D. Raoult et al. // Eur J Epidemiol. 1992. - № 8. -P. 192-197.

124. Monocytic Ehrlichia in Ixodes persulcatus ticks from Perm, Russia / M.D. Ravyn et al. // Lancet. 1999. - Vol. 353. - P. 722-723.

125. New Rickettsiae in ticks collected in territories of the former Soviet Union / E. Rydkina et al. //Emerg. Infect. Dis. 1999. -N 5. - P. 811-814.

126. A new tick-transmitted disease due to Rickettsia slovaca / D. Raoult et al. // Lancet. 1997. - Vol. 350. - P. 112-113.

127. Observations on an infectious agent from Amblyomma maculatum / R.R. Parker et al. // Pub. Health Rep. 1939. - Vol. 54. - P. 1482-1484.

128. Ormsbee R.A. Rickettsiae as organisms / R.A. Ormsbee // Rickettsiae and Rickettsial Diseases / ed. S. Kazar. Bratislava, 1985. - P. 15-37.

129. Parker R.R. Rocky mountain spotted fever. A study of the relationship between the presence of rickettsia-like organisms in tick smears and the infec-tiveness of the same ticks / R.R. Parker, R.R. Spencer // Pub. Health Rep. -1926.-P. 461-469.

130. Peter O. Isolation by a sensitive centrifugation cell culture system of 52 strains of spotted fever group rickettsiae from ticks collected in France / O. Peter, D. Raoult, B. Gilot // J Clin Microbiol. 1990. - № 28. - P. 1597-1599.

131. Phylogenetic diversity of rickettsiae / W.G. Weisburg et al. // J Bacteriol. — 1989.-№ 171.-P. 4202-4206.

132. Pickens E.G. Use of serum in identification and serologic classifications of Rickettsia acari and Rickettsia australis / E.G. Pickens et al. // J. Immunol. — 1965.-Vol. 94.-P. 883-889.

133. Plotz H. Differentiation between fievre boutonneuse and Rocky Montain spotted fever by means of complement fixation / H. Plotz, R.L. Reagan, K. Wertman // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1944. - Vol. 55. - P. 173-176.

134. Proteinic and genomic identification of spotted fever group rickettsiae isolated in the former USSA / M.E. Eremeeva et al. // J. of Clinical Microbiol. -1993. Vol. 31. - P. 2625 -2633.

135. Raoult D. A new spotted-fever-group rickettsiosis / D. Raoult, P. Brouqui, V. Roux // Lancet. 1996. - P. 348-412

136. Raoult D. Rickettsioses as paradigms of new or emerging infectious diseases / D. Raoult, V. Roux // Clin Microbiol Rev. 1997. - Vol. 10, № 4. - P. 694697.

137. Reassessment of the taxonomic position of Rickettsia grilli / V. Roux et al. // Int. J. Syst. Bacterial. 1997. - № 47. - P. 1255-1257.

138. Regnery R.L. Genotipic identification of rickettsiae and estimation of intras-pecies sequence divergence for portions of two rickettsial genes / R.L.

139. Regnery, C.L. Spruill, B.D. Plikaytis I I J Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P. 1576-1589.

140. Rehacek J. Acari-borne rickettsiae in Eurasia / J. Rehacek, I.V. Tarasevich // Veda publishing house of the Slovak Academy of Science. Bratislava, 1988.- 344 p.

141. Report of the ad hoc committee on reconciliationof approaches to bacterial systematics / L.G. Wayne et al. // Inf. J. Syst. Bacteriol. 1987. - Vol. 37. -P. 463-464.

142. Ricketts H. A microorganism which apparently has a specific relationship to Rocky Mountain spotted fever. A preliminary report / H. A. Ricketts // JAMA.- 1909.-Vol. 52.-P. 379.

143. Rikihisa Y. The tribe Ehrlichieae and ehrlichial diseases / Y. Rikihisa // Clin Microbiol Rev. 1991. -№ 4. - P. 286-308.

144. Ristic M. Capillary tube agglutination test for anaplasmosis / M. Ristic // I. Am. Vet. Med. Ass. - 1962. - Vol. 141, № 5. - P. 283-289

145. Roux V. Global Genetic Diversity of Spotted Fever Group Rickettsiae / V. Roux, D. Raoult // Rickettsial Infection and Immunity / ed. Anderson et al.. — New York : Plenum Press, 1997.

146. Roux V. Phylogenetic analysis and taxonomic relationships among the genu / V. Roux, D Raoult // Rickettsiae and Rickettsial Diseases at the Third Millenium. Marsielle, 1999. - P. 52-66.

147. Roux V. Phylogenetic analysis and taxonomic relationships among the genus Rickettsia / V. Roux, D. Raoult // Rickettsiae and Rickettsial Diseases at the Turn of the Third Millenium. Paris, 1999. - P. 52-66.

148. Roux V. Phylogenetic analysis of members of the genus Rickettsia using the gene encoding the outer-membrane protein rOmpB (ompB) / V. Roux, D. Raoult // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. - Vol. 50, pt. 4. - P. 1449-1455.

149. Rudakov N.V. Tick-borne rickettsiosis in Russia (epidemiology and current conditions of natural foci) / N.V. Rudakov // Rickettsiae and Rickettsial Diseases : proceedings of the V-th International Symposium. Bratislava, 1996. -P. 216-219.

150. Schaechter M. Study on the growth of Rickettsiae. II. Morphologis observations of living Rickettsiae in tissue culture cells / M. Schaechter, F.M. Boze-man, J.E. Smadel // Virologi. 1957. - P. 3, 160.

151. Serologic typing of rickettsiae of the spotted fever group by micro-immunofluorescence / R.N. Philip et al. // J. Immunol. 1978. - № 121. - P. 1961-1968.

152. Spotted fever group rickettsioses in China / M.I. Fan et al. // Rickettsial and Rickettsial Diseases at the Turn of the Third Millenium. Marsielle, 1999. - P. 247-257.

153. Studies of a "new" rickettsiosis, "Astrakhan" spotted fever / I.V. Tarasevich et al. // Eur. J. Epidemiol. 1991. - № 7. - P. 294-298.

154. Tarasevich I. Outbreak of epidemic typhus in Russia / I. Tarasevich, E. Rydkina, D. Raoult // Lancet. 1998. - Vol. 352, № 9134. - P. 1151.

155. Walker D.H. Biology of rickettsial diseases / D.H. Walker // CRC Press, Boca Raton. Florida, 1988. - 50 p.

156. Walker D.H. Emergence of the ehrlichioses as human health problems / D.H. Walker, J.S. Dumler// Emerg. Infect. Dis. 1996. - Vol. 2, № 1 - P. 18-27.

157. Walker D.H. Rickettsioses of the spotted fever group around the word / D.H. Walker //J. Dermatology. 1989. - Vol. 16. - P. 169-177.

158. Weiss Е. Order I Rickettsiales, Gieszczkiewicz 1939 / E. Weiss J. W. Moulder // Bergey's manual of systematic bacteriology / N.R. Krieg, J.G. Holt (eds.). Baltimore, 1984.- P. 687-703.

159. Weiss E. Separation of viable Rickettsia typhi from yolk sac and L cell host components by renografin density gradient centrifugation / E. Weiss, J.C. Coolbaugh, J.C. Williams // Appl Microbiol. 1973. - Vol. 30. - P. 456-463.

160. Wolbach S. B. Studies on rocky mountain spotted fever / S. B. Wolbach // J Med Res. 1919. -N41. - P. 1-70.

161. Zinsser H. Study of rickettsiae grown on agar tissue culture / H. Zinsser, F. Fitzpatric, H. Wei // J. Exp. Med. 1939. - P. 69, 179.