Принципы получения практически ценных штаммов культивируемых клеток растений методом экспериментального мутагенеза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, доктор биологических наук Каранова, Светлана Лаврентьевна

• Каранова, Светлана Лаврентьевна
• доктор биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации доктор биологических наук Каранова, Светлана Лаврентьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I Характеристика исходного материала

Глава II Получение суспензионной культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall.

Глава III Разработка метода массового получения клонов D. deltoidea

Глава IV Изучение летального и мутагенного действия N-HMM на культивируемые клетки растений

1. Общая характеристика действия N-HMM на рост культивируемых клеток растений

2. Изучение действия N-HMM на каллусную ткань D.deltoidea в пассаже после обработки

3. Анализ последействия N-HMM и селекция в клеточных популяциях D.deltoidea, растущих на агаризованной питательной среде

4. Изучение суспензионной культуры клеток D.deltoidea в пассаже после обработки мутагеном

5. Анализ последействия и селекция в суспензионной культуре клеток D.deltoidea ,, (

6. Индукция наследственных биохимических изменений соматических клеток Dioscorea deltoidea и Nicotiana tabaccum. Гормононезависимость.

7. Селекция клеточных линий Dioscorea deltoidea, Yucca gloriosa, Ajuga turkestanica с повышенным содержанием стероидов.

8. Получение мутантных клеточных линий Medicago sativa с повышенной активностью пероксидазы.

Глава V Физиологические и биохимические причины ауксиннезависимости D.deltoidea и N. tabaccum, индуцированной N-HMM

Глава VI Изучение дыхания в различающихся по биосинтезу стероидов клеточных,штаммах D.deltoidea ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ОБЩИЙ ИТОГ ИССЛЕДОВАНИЯ

СПИСОК ШТАММОВ, ПОЛУЧЕННЫХ АВТОРОМ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Принципы получения практически ценных штаммов культивируемых клеток растений методом экспериментального мутагенеза»

Актуальность работы

В настоящее время хорошо известно,что культивируемые клетки растений могут быть источником практически значимых веществ, а также могут служить моделями для изучения физиологических процессов.

В 60-е годы Р.Г.Бутенко впервые получила культуру тканей лекарственного растения-женьшеня и показала присутствие в биомассе специфических гликозидов и их биологическую активность,что явилось основой для развития нового направления в биологии культивируемых клеток-биотехнологии растений (Бутенко,1964). За прошедшее с тех пор время были введены в культуру in vitro десятки видов растений-продуцентов биологически активных веществ (БАВ), которые были интересными моделями для изучения вторичного метаболизма in vitro ( Zenk et al., 1977; Запрометов, 1981; Васильева и др., 1990; Носов, 1992; Загоскина, 1998). Делались попытки использования ряда штаммов как сырья для производства ценных лекарственных препаратов, однако действительно рентабельными для производства насчитываются единицы культур клеток растений (Бутенко, 1986; Fugita, 1988; Kreis, Reinhard, 1989). В качестве примера можно привести производство биомассы женьшеня (Panax ginseng С.А.Меу) в СНГ, используемой как адаптогенное и стимулирующее средство;производство нафтахинона шиконина из Lithospermum ergthrorhizon Seib et Zucc в Японии (фирма Toshiba) - красящего соединения, обладающего асептическими свойствами;раувольфии (Rauwolfía serpentina Benth) -продуцент антиаритмического алкалоида аймалина (СНГ); Coptis japónica - продуцент алкалоида берберина (Япония) (Kreis et al, 1989). Это связано прежде всего с тем, что в большинстве изученных штаммов клеток лекарственных растений содержание БАВ оказалось на порядок ниже, чем в интактных растениях (Запрометов, 1981), что значительно ограничивает применение их как продуцентов. Для преодоления этих сложностей существует ряд подходов. Одни из них связаны с физиологической регуляцией процессов роста и биосинтеза - оптимизация условий культивирования (Knobloch, Berlin, 1980); использование предшественников биосинтеза (Zenk et al., 1975; Нага et al, 1991); элиситоров (Godoy-Hernandes, Loyola-Vergas, 1991); создание стрессов (Носов и др., 1986; Godoy-Hernandes, Loyola-Vergas, 1991). Другие используют генетическую регуляцию, например, трансформацию (Robins et al., 1991; Кузовкина, 1992; Булгаков, 1996).

Большинство из перечисленных методов не позволяют получать стабильные продуктивные шаммы. Необходим поиск новых методов. В связи с этим цель работы заключалась в разработке научных основ применения методов экспериментального мутагенеза и клеточной селекции в биотехнологии растительных клеток - продуцентов и получении на этой основе мутантных штаммов с комплексом ценных признаков, представляющих интерес как для фундаментальных исследований, так и для практического использования. На наш взгляд, такой подход в настоящее время один из наиболее надежных.

Наряду с биотехнологическими аспектами применения новых подходов селекции, неоценимо значение таких работ для развития фундаментальных вопросов мутагенеза, генетики, молекулярной биологии, физиологии и биохимии растений. Методы выделения и культивирования in vitro больших количеств индивидуальных растительных клеток позволили использовать эффективные микробиологические приемы селекции мутантов в отношении растений.

Наша работа была начата тогда, когда еще не существовало генетики культивируемых клеток растений. С 70х годов началось развитие генетики соматических клеток растений in vitro во Франции, США, Германии, СССР, Венгрии и др. странах. Возможность отбора биохимических мутантов на уровне популяций соматических клеток растений in vitro была показана многими авторами (Lescure, Peand-Lenoel, 1967; Carlson, 1979, 1973; Ковалева, 1971; Lescure, 1973; Widholm, 1972, 1973, 1976; Maliga et al., 1973; Chaleff, Carlson, 1974, 1975; Muller, Gräfe, 1975; Muller et al., 1976; Sung, 1976; Karanova, Shamina, 1976; Каранова, 1977; Каранова, Шамина, Бутенко, 1978; Долгих, 1986; Майсурян и др., 1987; Шамина, 1988; Сидоров, 1989; Каранова, Урманцева, 1996). Однако изучение особенностей самого мутационного процесса в популяциях соматических растительных клеток к началу наших исследований (1971 г.) не было проведено, что было связано также с неразработанностью методических подходов. Методология и логика нашего исследования определялись не только поставленной целью, но и особенностями объектов исследования. Ими были, как правило, старые, потерявшие способность к морфогенезу, культуры клеток растений-продуцентов экономически значимых веществ.

В связи с выше сказанным были сформулированы следующие задачи исследования:

1 .Охаракеризовать биологическую систему - основной объект исследования, - культуру соматических клеток Dioscorea deltoidea Wall -продуцент стероидных соединений в разных условиях культивирования.

2.Отработать метод клонирования. Определить, какие клоны способны к дальнейшей репродукции, то есть жизнеспособны в генетическом смысле слова. Оценить репродуктивную выживаемость культивируемых клеток растений.

3.Определить диапазон генетически f активных доз N-HMM для 1 культивируемых клеток растений.

4. Дать количественную характеристику индуцированного мутационного процесса в культуре соматических клеток растений в разных селективных системах: прототрофности-ауксотрофности по фитогормонам и резистентности к аналогам аминокислот 5-МТ и ПФФА.

5. Определить направление и темп селекции в клеточных популяциях растений in vitro после действия N-HMM.

6.Дать физиологические характеристики альтернативных по разным прознакам клеточных линий: а) Определить биохимические механизмы, приводящие к ауксиннезависимости мутантных клонов Dioscorea deltoidea Wall и Nicotiana tabacum L. б) Исследовать некоторые особенности дыхания клеток суспензионных культур мутантных штаммов Dioscorea deltoidea Wall, различающихся по биосинтезу стероидов и росту, поскольку эти процессы являются энергозависимыми.

7.Разработать основы получения штаммов культивируемых клеток растений с новыми физиологическими признаками, определяющими их продуктивность, как по росту, так и по биосинтезу практически значимых веществ, с применением методов экспериментального мутагенеза и клеточной селекции.

8.Получить и охарактеризовать практически у ценные клеточные I линии, клоны и штаммы Dioscorea deltoidea Wall, Yucca gloriosa L., Ajuga turkestanica (Rgl) Brig.- продуцентов стероидов; Medicágo sativa L. -продуцента пероксидазы; Strophanthus gratus H.Baill - продуцента сердечных гликозидов.

Научная новизна

Впервые использована новая биологическая система для изучения мутагенеза - культура соматических клеток растений in vitro.

Разработана технология получения мутантных штаммов культивируемых клеток растений с новыми физиологическими признаками.

Определен диапазон генетически активных доз N-HMM для культивируемых клеток растений: от 0,1 до 32 мМ * час.

Установлено, что мутагенный эффект различных факторов на клеточные популяции растений in vitro необходимо определять с учетом жизнеспособных клонов, то - есть способных к дальнейшему размножению. Нами впервые определено, что для формирования такого клона клетка должна пройти не менее 9 циклов делений.

При анализе зависимостей "доза-эффект" впервые был обнаружен эффект стимуляции роста после воздействия малых доз N-HMM и волновой характер действия этих доз на культивируемые клетки растений. Показано, что стимулирующий эффект связан с активацией пролиферации. Культуры быстрее проходят свой отнтогенез в цикле выращивания. При пассировании после обработки клеток малыми дозами N-НММ можно получать интенсивно растущие варианты. Нами было высказано предположение о том, что при этом, по-видимому, отбираются наиболее жизнеспособные клетки с более коротким циклом. Это нашло в дальнейшем подтверждение при изучении наиболее продуктивного мутанта ИФРДМ0.5 (Смоленская, 1993).

С помощью статистический методов получены доказательства генетического контроля изменений количественного признака "интенсивность роста" после воздействия разных доз N-HMM на культивируемые клетки растений.

Проведен количественный анализ мутационного процесса в популяциях соматических клетках растений in vitro. Показана индукция мутаций в системе прототрофности - ауксотрофности по фитогормонам и в системе резистентности к аналогам аминокислот: 5-МТ и ПФФА под действием N-HMM. Впервые для культивируемых клеток показана индукция мутаций не только под действием ингибирующих, но и стимулирующих рост доз мутагена.

На основании анализа результатов в опытах по индукции наследственных изменений, выявленных в селективной системе прототрофности - ауксотрофности по фитогормонам, впервые для культивируемых растительных клеток было определено максимальное значение темпа спонтанных наследственных изменений на клетку за генерацию (не более 2*10"*).

При цитогенетическом анализе клеточных популяций нами впервые показана динамика процесса их стабилизации на определенном уровне плоидности. Скорость стабилизации выше при выращивании в жидкой питательной среде и более жестких условиях мутагенеза и отбора.

Показано, что N-HMM индуцирует генетические изменения, имеющие плейотропный эффект на признаки, затрагивающие как первичный, так и вторичный метаболизм, что позволяет получать мутантные штаммы с комплексом положительно измененных признаков.

Альтернативные по потребностям в фитогормонах клоны диоскореи и табака оказались интересной моделью для выяснения природы гормононезависимости культивируемых растительных клеток. Впервые, на полученных нами ауксиннезависимых мутантах диоскореи и табака, индуцированных N-HMM, показано, что этот признак может иметь не только эпигенетическую (как это обсуждалось в литературе для привыкших" (habituated) гормононезависимых штаммов растений in vitro), но и мутационную природу. При отборе в одинаковых селективных условиях могут быть получены генетически различные ауксиннезависимые клоны. Это определяется генотипом (видом растения); возрастом культур и, как следствие, их разными цитофизиологическими особенностями; генетической гетерогенностью клеточных популяций растений in vitro, а также дозой мутагена.

Физиологическое изучение этих клонов показало, что индуцированная N-HMM ауксиннезависимость клеток диоскореи определяется, вероятно изменением фермента антрфнилат-синтетазы, а также изменением системы временной инактивации избыточных индолов. Ауксиннезависимость мутантного клона табака, также индуцированная N-HMM, может быть связана, по-видимому, с изменением ферментативного комплекса окисления ИУК (ОИУК).

Получены принципиально новые данные, имеющие вклад в объяснение высокой продуктивности мутантного штамма диоскореи ИФР ДМ0.5, полученного после обработки клеток стимулирующей рост дозой N-HMM. Нами обнаружена перестройка дыхательной цепи митохондрий, что может быть связано, как с большей интенсивностью роста, так и с энергозависимым синтезом стероидов.

Практическая значимость

Работа выполнена на культурах клеток растений - продуцентов практически ценных веществ. Нами разработаны научные основы получения штаммов культивируемых клеток растений с новыми физиологическими признаками, определяющими их продуктивность, как по росту, так и по биосинтезу практически ценных веществ, с применением методов экспериментального мутагенеза и клеточной селекции.

Получены продуктивные штаммы продуцентов стероидных соединений. Лучший штамм диоскореи дельтовидной ИФРДМ0.5 имеет в 4-7 раз более высокое содержание гликозидно связанного диосгенина и в 5-8 раз более высокое содержание фуростаноловых сапонинов, чем исходный штамм ИФРД1. Такое содержание сапонинов близко к содержанию их в корневищах диоскореи дельтовидной, а иногда и превосходит его. Получен штамм живучки туркестанской, имеющий в 20 раз более высокое содержание экдистерона, чем исходный штамм. Получено три штамма юкки славной с содержанием стероидных гликозидов, в 2-3 раза превосходящим уровень исходного штамма. Получен ряд штаммов и клонов диоскореи, живучки, юкки, строфанта, люцерны с более интенсивным ростом, а значит с большей общей продуктивностью. Некоторые штаммы диоскореи способны к росту на питательных средах простого состава.

Разработаны оригинальные селективные условия и получены вариантные клеточные линии люцерны с повышенной активностью пероксидазы. Лучший клон в 2.3 раза превосходил активность пероксидазы в исходном штамме. Эти разработки нашли дальнейшее применение в работе по клеточной селекции в лаборатории Генетики культивируемых клеток ИФР РАН с целью получения риса, устойчивого к фитопатогенам (ВеНапэкауа е1 а1, 1997). ' ^

Предложены оригинальные селективные условия для получения вариантных клеточных линий с измененной регуляцией биосинтеза терпеноидов и стероидов, с использованием ингибиторов ключевого фермента биосинтеза терпеноидов и стероидов - ОМГКоА Ре.

Штаммы диоскореи, различающиеся по качественному составу и количественному содержанию стероидов и потребности в фитогормонах, а также штаммы юкки и живучки широко используются в исследованиях по физиологии, биохимии и биотехнологии клеток растений in vitro в различных научно-исследовательских учреждениях СНГ (в различных лабораториях и отделах ИФР РАН, Институте биохимии РАН, ВНИИ Биотехника, Москва; Институте биохимической физики РАН, Москва; Институте биохимии растений ГрАН, Тбилиси; Институте экспериментальной биологии УзбАН, Ташкент), а также в Институте экспериментальной ботаники Чехии, Прага.

Некоторые из перечисленных штаммов изучены в лабораторных условиях и могут быть использованы при разработке технологии выращивания клеток растений в промышленности. Разработан регламент на штамм ИФРДМ0.5 (Носов 1992, Липский 1993). Высокопродуктивный мутантный штамм диоскореи ИФРДМ0.5 передан для внедрения на Покровский завод биопрепаратов (Носов 1992). На основе этого штамма получен препарат фуростаноловых сапонинов "Дельтостим" и показана его высокая биологическая активность (ПосеШниченко, Васильева, 1995).

Апробация работы

Основные положения были доложены или представлены и одобрены на Всесоюзных конференциях по химическому мутагенезу (Москва, 1972, 1973гг); Всесоюзной конференции по генетики промышленных микроорганизмов (Цахкадзор, 1973, Армения); III Всесоюзном совещании по управляемому биосинтезу и биофизике популяций (Красноярск, 1973); Международном Конгрессе по культуре изолированных клеток растений (Лейстер, Англия, 1974г): II-IV Всесоюзных конференциях по культуре изолированных клеток, органов и тканей растений (Киев 1975; Абовян, 1979; Кишинев, 1983); Всесоюзном симпозиуме по клеточным популяциям (Ленинград, 1975); XIV Международном Ботаническом Конгрессе (Ленинград, 1975); Совещании стран СЭВ "Использование тканевых культур в селекции растений" (Оломоуц, ЧССР, 1976); I Симпозиуме по генетике культивируемых клеток in vitro (Гатерслейбен, ГДР, 1977); XII Международном Генетическом Конгрессе (Москва, 1978); Круглом столе "Генетические и экологические аспекты роста растений" (Москва, 1978, ИФР АН СССР); Всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1984, 1986, 1988); V Международном симпозиуме по генетике промышленных микроорганизмов (Сплит, Югославия, 1986); Всесоюзных конференциях по генетике соматических клеток (Звенигород, Московская область, 1981, 1986, 1989); Республиканской конференции по медицинской ботанике (Киев, 1984); VIII Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР - ГДР (Рига 1985); Международном Конгрессе по культуре растительных клеток и тканей (Минеаполис, США, 1986); V Съезде ВОГИС (Москва 1987); V Всесоюзной и I Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск 1988); II Международной Конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Алма-Ата 1993); VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro. Биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, ИФР РАН, 1997); Конференции по генетике соматических клеток в культуре (Черноголовка, Московская область, 1993); III Российском симпозиуме "Новые методы в биотехнологии растений" (Пущино, 1995); Международной конференции, посвященной Памяти академика A.A. Баева (Москва, 1996); Международном Рабочем Совещании по биотехнологии и применению пероксидазы (Санкт-Петербург, 1997), II Международном Симпозиуме по биотехнологии растений, (Киев, 1998), а также на научных семинарах Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Института молекулярной генетики РАН, Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, ВНИИ Биотехника Главмикробиопрома. Результаты и методы исследования неоднократно демонстрировались на ВДНХ СССР, награждены медалями ВДНХ.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 45 печатных работах. Получено два авторских свидетельства.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработана технология получения мутантных штаммов культивируемых клеток растений с комплексом ценных признаков с использованием методов химического мутагенеза и клеточной селекции.

2. Ы-НММ индуцирует наследуемые изменения в культуре соматических клеток растений. Величина индукции не менее, чем на 1-2 порядка превышает уровень спонтанной генетической изменчивости. Генетические изменения выявлены с помощью селективных условий: прототрофности - акусотрофности по фитогормонам; резистентности к токсическим аналогам аминокислот 5-МТ и ПФФА. Физиолого-биохимическое изучение выделенных вариантов также подтверждает наследственную природу измененных признаков.

3. Малые дозы №НММ оказывают стимулирующее действие на рост культивируемых клеток растений. Однако в пределах малых доз может быть несколько пиков стимуляции и спадов роста. Таким образом, обнаружен волновой характер действия И-ИММ на ростовые процессы.

После обработки стимулирующими рост и пограничными с ними ингибирующими рост дозами мутагена молено получать стабильные, интенсивно растущие штаммы и клоны.

Наследуемость изменений этого полигенного признака доказана с помощью методов количественной генетики.

4. Доказано, что индукция генных мутаций возможна не только игибирующими, но и стимулирующими рост дозами №НММ. Это показано с помощью селективной системы резистентности к аналогам аминокислот.

5. Ы-НММ индуцирует генетические изменения, имеющие плейотропный эффект.

6. С помощью методов индуцированного мутагенеза, клонирования и селективных сред получены высокопродуктивные штаммы и клоны культур клеток - продуцентов стероидов (диоскореи, живучки, юкки); возможного продуцента пероксидазы (люцерны). Получены прототрофные по ауксину клоны диоскореи и табака. Все варианты представляют интерес, как для фундаментальных исследований, так и для практического использования.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исходным материалом для исследования служили штаммы культур клеток различных видов растений - продуцентов биологически активных веществ:

- Dioscorea deltoidea Wall (сем. Dioscoreaceae, тропическая лиана), штамм ИФР Д1 из коллекции Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН. Штамм получен Саркисовой М.А. и Бутенко Р.Г (Саркисова, 1973). Продуцент стероидов. Для получения суспензионной культуры клеток этого штамма, которую использовали для клонирования, нами была проведена специальная методическая работа (Кфанова, Шамина, 1975). Исходная культура росла на модифицированной питательной среде MS (Аброшникова, 1970), содержащей 1мг/л 2,4-Д и ОДмг/л кинетина.

- Yucca gloriosa L. (сем. Agavaceae), тропическое травянистое растение, родиной которого является Северная Америка). Продуцент стероидов. Объектом исследования служила суспензионная культура, полученная в 1982г. в Институте биохимии растений ГССР, Тбилиси (Durmishidze, Gogoberidze, Mamaladze, 1983) из рыхлой каллусной ткани, не имеющей признаков гистологической дифференцировки, полученной Месхи, Гогоберидзе, Кацитадзе в 1978 году. Культура росла на среде MS в присутствии 2мг/л а-НУК. Нами была проведена совместная методическая работа для получения интенсивно растущей суспензионной культуры клеток юкки, которую использовали в опытах по мутагенезу и для клонирования (Гогоберидзе и др., 1988).

- Лjuga turkestanika (Rgl.) Brig (сем. Labiatae). Продуцент экдистероидов. В работе использовали культуру с признаками морфогенеза, полученную ранее из листа и завязи Закировой Р.П. (Лев и др., 1990)

Институт химии растительных веществ АН РУЗ (Ташкент). Культуры росли на среде MS в присутствии 1мг/л а-НУК и 0,002мг/л ДРОПП.

- Strophanthus gratus Н. Baill (сем. Apocynaceae). Продуцент сердечных гликозидов, строфантина; тропическое растение. Каллусные культуры, листовой и стеблевой штаммы, получены в 1986 году Фроловой JI.B., Отдел биологии клеток и биотехнологии ИФР РАН. Культуры росли на среде Гамборга В5 в присутствии 0,5мг/л 2,4-Д и 1мг/л БАП. Нами получена суспензионная культура клеток, которую использовали в опытах по клеточной селекции.

- Medicago sativa L. (сем. Leguminoseae). Возможный источник для получения коммерческих препаратов пероксидазы. Исходная каллусная ткань получена из листьев зеленых проростков (среда Гамборга В5) на Биофаке МГУ Скрипниковым А.Ю. в 1984 году (Газарян и др., 1992). В работе использовали суспензионную культуру клеток (штамм Л-1), которую выращивали на среде MS с 0,5г/л гидролизата казеина, 0,1мг/л кинетина и 1 мг/л 2,4-Д (Urmantseva et al., 1991).

- Nicotiana tabaccum L. (сем. Solanaceae). Каллусная культура клеток получена в 1976г. Комизерко Е.И. (ИФР АН СССР) из серцевинной паренхими стебля табака, сорт Висконсин-38. Из этой культуры нами была получена интенсивно растущая клеточная суспензия, которую использовали для клолнирования и обработки мутагеном. В стандартных условиях культуру выращивали на среде Мурасиге и Скуга, дополненнуйз мезо-инозитом (80мг/л), тиамином (0,4мг/л), сахарозой (3%), ИУК (1мг/л) и кинетином (1мг/л). Эту культуру использовали в работе как модельный объект.

Каллусные и суспензионные культуры клеток росли в темноте, при +26°С, влажности 70%. Культуры, растущие на агаризованной среде пассировали каждые 5-6 недель, а клеточную суспензию - каждые 2 недели.

Анализировали следующие признаки:

1. Интенсивность роста определяли по изменению сырой и сухой массы клеток в цикле выращивания и при пассировании. Повторность вариантов для каллусных культур не менее, чем 5-ти кратная, для суспензионных культур клеток - не менее, чем 3-х кратная.

Анализируя рост суспензии клеток у определяли их плотность (число V клеток в 1мл) в гемоцитометре Фукса-Розенталя. Культуры предварительно мацерировали в 20% хромовой кислоте 15-20 мин. при +70°С. Плотность (х) расчитывали по формуле: х=1000.МУЗ,2 , где М - среднее число клеток на камеру из 6-ти повторностей.

2. Состав суспензии определяли как соотношение числа отдельных клеток и разных типов агрегатов, выраженное в процентах. Анализировали в каждом варианте не менее 200 культивируемых единиц.

3. Жизнеспособность (процент живых клеток) оценивали методом прижизненного окрашивания 0,1% синькой Эванса или методом фазово-контрастной микроскопии. Анализировали в каждом варианте не менее 200 культивирумых единиц.

4. Дли характеристики цитологических и цитогенетических особенностей клеточных популяций культуры фиксировали в смеси этанол 1 уксусная кислота (3:1) темпорально в течение цикла выращивания. Временные давленные препараты окрашивали насыщенным ацетокармином при ступенчатом нагревании в течение 2-3 минут в тигле над пламенем спиртовки или ацетоорсеином в течение 20 минут при +60°С.

Митотический индекс или процент делящихся клеток определяли на 7-10 препаратах, при анализе 5-7 тыс. клеток на каждую точку фиксации. Соотношение разных типов клеток оценивали на этом же материале.

Цитогенетические признаки. Разнообразие клеток по числу хромосом анализировали на временных давленных препаратах. Число хромосом подсчитывали не менее, чем на 100 метафазных пластинках на вариант. Микроскопические наблюдения проводили на микроскопах МБИ-3 и Amplival при увеличениях 1350х и 1400х.

5. Клонирование проводили по методу Бергмана (Bergmann, 1960). Подготовленную суспензию смешивали в отношении 1:1 с агаризованной питательной средой (с 1,6% агара) при +40°С и помещали по 2мл в пластиковые чашки Петри диаметром 4см или по 10мл в чашки Петри диаметром 9см или по Змл в стеклянные чашки Петри диаметром 6см.

6. Селективные среды. а). Для учета и отбора прототрофных по фитогормонам клеток использовали следующие Среды: А"К+ - питательная среда без ауксина (2,4-Д); А'К" - без ауксина и кинетина. В обоих случаях из Среды исключали гидролизат казеина, содержащий триптофан - предшественник эндогенных ауксинов. б). Использовали также питательные Среды, содержащие аналоги аминокислот: 5-метил-ОЬ-триптофан ("Serva", Германия) и р-фторфенилаланин ("Serva", Германия). Аналоги добавляли к питательным средам после холодной стерилизации с помощью мембранных фильтров ("Millipore", США).

7. Обработка мутагеном. В работе использовали химический мутаген N-нитрозо-К-метилмочевину (N-HMM) в жидкой питательной среде при рН=5,6. Мутаген синтезирован в Институте химической физики РАН, (Москва). Маточный раствор (N-HMM) стерилизовали фильтрованием через стеклянный фильтр Шотта (3G5, Schott and Gen., Jena, DDR) и добавляли асептически к клеточной суспензии. Культуры инкубировали в растворе мутагена 1 час, затем 5 кратно отмывали избытком свежей питательной Среды и помещали на агаризованную питательную среду по 30 пробирок на вариант или рассевали в колбы с жидкой питательной средой по 3-5 колб на вариант, или на чашки Петри после смешивания с агаризованной средой, по 5-10 чашек на вариант.

8. При изучении метаболизма индольных соединений в прототрофной и ауксотрофной по ауксину клеточных линиях диоскореи определяли: а) рост клеток на среде с экзогенной ИУК и триптофаном по изменению плотности суспензии и жизнеспособности, а также сырой массы клеток. Предварительно клетки отмывали питательной средой без фитогормонов и в течение 3 суток инкубировали на этой среде для истощения гормонального пула. б) способность клеток обеих линий метаболизировать ИУК и предшественники изучали с помощью 14С-препаратов: равномерно меченой по углероду кольца антраниловой кислоты, 3-14С-Ь-триптофана и 2-14С-ИУК. Их асептически, после холодной стерилизации с помощью стеклянного фильтра Шотта, добавляли к суспензии клеток в фазе экспоненциального роста. После 30-ти часовой инкубации суспензию фильтровали и измеряли радиоактивность среды. Затем клеточную массу экстрагировали горячим метанолом, измеряли радиоактивность экстракта и остаточную активность клеточной массы. Экстракт упаривали и разделяли с помощью хроматографии на бумаге в 2 у системах растворителей. Для ИУК использовали смесь изопропанол - аммиак - вода, ИАВ, 10:1:1; для антраниловой кислоты и триптофана: бутанол - уксусная кислота - вода, БУВ, 4:1:1.

Значение Яг в выбранных системах растворителей было для ИУК - 0,50; для антраниловой кислоты 0,70-0,75; для триптофана 0,36-0,40.

Продукты метаболизма идентифицировали с помощью специфических реактивов и денситометрически, затем рассчитывали площади пиков (в процентах от общей радиоактивности хроматограмм). в). Содерэ/сание эндогенной ИУК определяли флуориметрическим методом как 2-метилиндол-а-пирон (Kamisaka, Larsen, 1970), добавляя при первой метанольной экстракции антиоксиданты, предотвращающие деструкцию ИУК: дитиотриэтол (0,2 мМ) и диэтилдитиокарбомат (0,4 мМ) -модификация метода М.Кутачека. Выход ИУК всегда был 70-80%. Параллельно определяли активность антрапшатсиптетазы по скорости синтеза клетками обеих линий антраниловой кислоты, добавляя антиоксиданты (Widholm, 1972, в модификации М.Кутачека).

Белок в ферментных экстрактах определяли по Lowry et al., 1951). Оценивали устойчивость 2 форм антранилатсинтетазы (аммоний- и глутамин-зависимой) у клеточных линий диоскореи к ингибированию триптофаном по степени подавления синтеза антраниловой кислоты. Все опыты повторяли 3-5 раз в 3-х кратной повторности.

9. Активность пероксидазы в Штаммах и клонах люцерны определяли в гомогенате ткани по окислению гваякола в присутствии перекиси водорода в фосфатном буфере, рН=5,5 (Ярош и др., 1987) и выражали в единицах оптической плотности (o.e.) при 470нм за минуту на 1мл суспензии.

10. Поглощение кислорода суспензионной культурой клеток диоскореи определяли полярографически, используя электрод конструкции Шольца (Шольц, Островский, 1965).

11. Определение содержания стероидных соединений. Для анализа фракции сапонинов и фитостеринов воздушно-сухую ткань исчерпывающе экстрагировали смесью хлороформа-метанола (2:1) при 60-70°С. Экстракт упаривали досуха и гидролизовали 1,2 н. HCl в 50% этаноле при 82-85°С в течение 16 часов. После гидролиза агликоны извлекали эфиром и анализировали методом ГЖХ. Условия анализа: хроматограф "Хром-41" (ЧССР), стеклянная колонка 1,2x0,3 заполнена chromaton-super, ОД 6-0,20мм, 3% OV-17, программирование температуры от 200°С до 280°С со скоростью 12°С в 1 минуту, температура испарителя - 310°С, детектора - 280°С. Идентификацию стероидных соединений проводили с помощью методов хроматографии, хроматомасс-спектрометрии и инфракрасной спектрометрии (Носов, 1984). Кроме того использовали модифицированный спектрофотометрический метод с реактивом Эрлиха (Васильева и др., 1987). 12. Результаты обрабатывали статистически (Плохинский, 1967, 1970; Урбах, 1964).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Каранова, Светлана Лаврентьевна

Выводы

1. Использована новая биологическая система для изучения индуцированного мутагенеза - культура соматических клеток растений in vitro. Разработаны методы массового получения клонов.Показано,что эффективность посева растительных клеток in vitro низкая (около 1.0%).Это связано с тем,что не все живые и начавшие делиться клетки формируют жизнеспособные клоны.Для образования таких клонов клетки должны пройти не менее 9 генераций. Охарактеризованы селективные системы: прототрофности-ауксотрофности по фитогормонам и резистентности к 5-МТ и ПФФА.

2. Впервые изучено действие N-HMM на рост культивируемых клеток различных видов лекарственных растений (Dioscorea deltoidea Wall, Medicago sativa L., Strophanthus gratus H.Baill.,Ajuga turkestanica (Rgl.) Brig, Yucca gloriosa L.) в широком диапазоне доз: от ОД до 32 мМ. час. Обнаружены стимулирующий, ингибирующий, сублетальный и летальный эффекты разных доз. После обработки стимулирующими рост дозами N-HMM клеточные популяции быстрее проходят свой онтогенез. В диапазоне малых доз наблюдалось несколько пиков vi стимуляции и спадов. Характер дозовых кривых определяется генотипом и зависит также от анализируемого признака ,возраста культур и их физиологического состояния. о

3. Впервые дана количественная характеристика индуцированного мутационного процесса в популяциях соматических растительных клеток in vitro в системе прототрофности-ауксотрофности по í i £ 193 фитогормонам и резистентности к 5-МТ и ПФФА.

Впервые для культивируемых растительных клеток показано,что мутагенное действие оказывали,как ингибирующие, так и стимулирующие рост дозы Ы-НММ. Величина индукции возрастала с увеличением дозы 1Ч-НММ. Мутаген не менее,чем на 1-2 порядка увеличивал частоту наследуемых изменений признаков.

4. Отобраны мутантные штаммы диоскореи, юкки, аюги, строфанта, люцерны с положительно измененным признаком "интенсивность роста клеток". Генетическая природа изменений впервые на уровне культивируемых клеток растений определена с помощью методов количественной генетики.

5. Ы-НММ индуцирует генетические изменения,имеющие плейотропный эффект. Получены мутанты с комплексом положительно измененных физиологических признаков.

Л ' .•

6. Проведен анализ спонтанных и индуцированных Ы-НММ изменений числа хромосом. Мутаген индуцирует изменение направления селекции в миксоплоидной исходной клеточной популяции в сторону стабилизации на околоди- и триплоидном уровне. Темп стабилизации зависит от дозы мутагена и условий культивирования.

7. В случае культур клеток-продуцентов стероидных соединений наблюдалась корреляция между интенсивностью роста и содержанием вторичных веществ. В результате были отобраны продуктивные, как по росту, так и по биосинтезу стероидов штаммы и клоны диоскореи, аюги

I !

• • (I 4' ф' $ и юкки.

11

8. Показано, что клетки диоскореи и табака, прототрофные по ауксину, характеризовались более интенсивным ростом на селективной среде по сравнению с исходным штаммом, что коррелирует с изменением жизнеспособности клеток в популяции.

Ауксиннезависимая клеточная линия диоскореи способна расти на среде без ауксина, в отсутствие ауксина и кинетина, а также резистентна к 5-МТ и высоким (гербицидным) концентрациям экзогенного ауксина.

Ауксиннезависимая линия табака имеет аналогичные признаки, но характеризуется кинетинзависимостью. Кроме того, ауксиннезависимая линия табака потеряла способность к морфогенезу в условиях, вызывающих массовый стеблевой морфогенез в исходном штамме.

9. Определено, что активность глутамин- и аммоний-зависимых форм антранилатсинтетазы в прототрофных по ауксину клетках диоскореи значительно выше и не столь чувствительна к ингибированию триптофаном, как в ауксотрофных по ауксину клетках. Обе культуры способны одинаково активно образовывать ИУК. Уровень активности ОИУК в обоих вариантах в цикле выращивания практически одинаковый

На основании изучения метаболизма меченых предшественников и ИУК в прототрофной и ауксотрофной по ауксину линиях диоскореи определено, что у прототрофного по ауксину клона, по-видимому, сильнее развит механизм защиты клеток от гиперауксиноза, чем у ауксотрофного клона. Благодаря этому, избыток антранилата превращается в гликозид антраниловой кислоты, а не в предшественник

I г ни - 'г'к» Л '»Ш

ИУК-триптофан.

10. При сравнительном изучении дыхания клеток штаммов диоскореи, различающихся по интенсивности роста и синтезу стероидных гликозидов, впервые показано, что клетки высокопродуктивного мутантного штамма (ИФРДМ0.5) имеют более эффективно работающую энергетическую систему, чем исходный штамм (ИФРД1). Это выражается в менее интенсивном дыхании клеток и в меньшей активности альтернативной оксидазы в клетках мутанта. У мутантного штамма лучше работает цитохромный путь переноса электронов. Можно предположить, что обнаруженная нами перестройка дыхательной цепи митохондрий мутанта может быть связана с большей интенсивностью его роста и продуктивностью, в частности, с энергозависимым синтезом терпеноидов и стероидов.

11. Получены высокопродуктивные, перспективные для практического использования штаммы и клоны культивируемых клеток растений-продуцентов стероидных соединений: диоскореи дельтовидной, аюги туркестанской, юкки славной. Некоторые штаммы диоскореи способны к росту на питательной среде простого состава. Получены ауксиннезависимые клоны табака и диоскореи, резистентные к 5-МТ клоны диоскореи и люцерны, резистентные к ПФФА клоны люцерны. Среди клонов люцерны выявлены варианты с повышенной активностью пероксидазы. Полученные нами мутанты широко используются в экспериментальной работе различных научно-исследовательских учреждений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение генетических процессов, в том числе, мутагенеза на уровне популяций соматических клеток in vitro позволяет подойти к планомерному отбору биохимических мутантов, интересных для фундаментальных исследований и для практики.

Исследования особенностей действия мутагенов на клетки растений in vitro немногочисленны. Возможно, это связано с особенностями культивируемых растительных клеток: их генетической, цитогенетической и цитоморфологической гетерогенностью, медленным ростом и асинхронностью размножения, а также недостаточной разработанностью методических подходов (Шамина, 1988).

Изучение экспериментального мутагенеза в культуре изолированных клеток растений развивается в нескольких направлениях:

1. Определение чувствительности культивируемых растительных клеток к действию различных мутагенных факторов;

2. Анализ цитогенетических изменений клеток in vitro после действия мутагенных факторов;

3. Анализ мутационной изменчивости в популяциях культивируемых клеток, селекция спонтанных и индуцированных биохимических мутантов и их дальнешее изучение.

Исследования, начатые еще в 60-70гг показали, что химические мутагены на несколько порядков могут превышать генетическую активность радиации, часто обладают более специфичным и тонким действием на клетки.

Приоретет открытия большинства известных в настоящее время ' химических мутагенов, в том числе, высокоэффективных, к которым относятся и нитрозоалкилмочевины, принадлежат советсткому генетику л.

•.• • •.'•.'■•.ИХ .В гб'" li-ft', 'к: : ■■ /i

И.А.Рапопорту и его школе. Мы использовали в своей работе эффективный химический мутаген Ы-нитрозо-Ы-метилмочевину (N-HMM). Высокая мутагенная активность нитрозоалкилмочевин и, в том числе, N-HMM, показана впервые И.А.Рапопортом на дрозофиле (Рапопорт, 1962) и подтверждена многочисленными исследованиями, выполнеными на вирусах, бактериях, водорослях, грибах, дрожжах, растениях, культуре клеток млекопитающих.

Изучение летального и мутагенного действия N-HMM на соматические клетки растений in vitro было начато нами на культуре клеток диоскореи (Каранова и др., 1973) и в Чехословакии на культуре клеток табака (Opatrny, 1973). Было показано, что N-HMM оказывает на клетки растений in vitro такое же действие, как и на интактные организмы.

Определить мутагенный эффект на уровне соматических клеток in vitro достаточно сложно. Это прежде всего связано с трудностью, а иногда невозможностью проведения генетического анализа, так как, несмотря на тотипотентность растительных клеток, не все они после длительного культивирования сохраняют способность к морфогенезу. Делаются попытки найти подходящие тесты для анализа мутагенеза на уровне соматических клеток растений in vitro.

Многие авторы, изучая чувствительность растительных клеток к мутагенам, используют ростовые тесты. Мы в своем исследовании при анализе летального действ^ супермутагена N-HMM на культивируемые клетки различных видов растений с целью определения диапазона генетически активных доз при построении кривых "доза - эффект" также использовали ростовой тест.

Одна из задач экспериментального мутагенеза - изучение реакции биологических систем на действие мутагена и интерпретация кривых "доза эффект". Выбор доз мутагенов является одним из актуальных вопросов в индуцированном мутагенезе, по-скольку физиологический (летальный) и генетические эффекты: выход мутаций и их спектр зависят как от концентрации мутагена в растворе, так и от времени воздействия (Лебедь, 1968, Рапопорт, Домрачева, 1971, Зоз, 1971, Демченко и др., 1973, Каранова и др., 1973, Opatrny, 1973, Серова, 1975). Вопрос о рациональности в селекции сильных и слабых доз мутагенов является спорным. Если одни авторы рекомендуют использовать жесткие дозы при которых выживаемость обработанных растений составляет 5%, то другие предпочитают средние или слабые дозы (Gaul, 1965). Как правило, при высоких дозах мутагенов чаще возникают редкие мутации. При слабых дозах отмечается много малых или микромутаций, которые довольно часто представляют интерес для практической селекции. По-видимому, в зависимости от поставленной задачи, можно использовать, как высокие, так и низкие дозы мутагенов (Зоз, 1968). i

В связи с выше сказанным, нами было исследовано действие N-HMM в широком диапазоне доз: от 0,1 до 32 мМ час на культуру клеток растений -продуцентов биологически активных веществ (БАВ): Dioscorea deltoidea,

Yucca gloriosa и Ajuga turkestanica - продуценты стероидных соединений; , wY. •• i к j. .Л> i 'oniü

Strophanthus gratus - сердечных гликозидоз и Medicago sativa - возможный источник пероксидазы. При этом менялась концентрация мутагена, а экспозиция воздействия всегда была одна - 1 час. Это позволило сравнить полученные на разных объектах кривые "доза - эффект". В изученном диапазоне доз было обнаружено стимулирующее, ингибирующее, сублетальное и летальное действие N-HMM на рост культивируемых клеток указанных видов растений, что идентично наблюдениям на интактных организмах.

•:■■•,'. . I ,| л , : l С i . . • . '.: . • • ' ■ - -.1 1 ЛЯ

Нами, на уровне культивируемых растительных клеток, впервые был обнаружен эффект стимуляции роста после воздействия малых доз N-НММ (Каранова и др., 1973).

Усиление роста под действием коротковолнового излучения было ранее детально изучено Л.А.Бреславец (Бреславец, 1946), Н.В.Тимофеевым-Ресовским и Н.А.Порядковой (Тимофеев-Ресовский, Порядкова, 1956), B.C. Андреевым (Андреев, 1963).

Эффект стимуляции после обработки малыми дозами химических мутагенов наблюдали многие авторы при работе с интактными организмами (Демченко, 1968, Матвеенко, 1968; Рапопорт идр., 1971, Ульянов и др., 1973, Шуппе, Шевцова, 1973, Градова и др., 1973, Эйгес, 1975, Брокш, Серова, 1980) и это нашло, как указывает И.А.Рапопорт (Рапопорт, 1968) "подтверждение в 40 НИИ и опытных станциях, которые вели исследования в содружестве с Центром по химическому мутагенезу и ИХФ АН СССР".

Стимулирующее действие N-HMM на культивируемые клетки изученных нами видов растений выражалось в увеличении интенсивности роста. При этом клеточные популяции быстрее проходили свой онтогенез в цикле выращивания (Каранова и др., 1973, 1986). Доказана чувствительность клеток к мутагену в зависимости от физиологического состояния: для суспензионных культур клеток диапазон стимулирующих доз шире, чем для культур, растущих на агаризованной среде (Каранова, Шамина, 1975, Каранова и др., 1973).

Впервые было показано, что характер дозовых кривых и количественный эффект стимуляции разный у различных генотипов и зависит также от анализируемого признака и возраста культуры. Было определено, что доза с максимумом стимуляции у разных генотипов своя. Наиболее "горячая" доза - 0,5 мМхчас.

Было обнаружено, что в диапазоне малых доз может быть несколько пиков стимуляции и спадов. Эти "волны" выявляются при уменьшении шага дозы и равном интервале доз. Таким образом, нами впервые обнаружен волновой характер действия №НММ на рост культивируемых клеток растений (Каранова и др., 1993).

Необходимо отметить, что наблюдалось также некоторое усиление роста после действия отдельных средних и высоких доз М-НММ. Полученные нами результаты говорят о том, что использование 1-2 доз недостаточно для заключения о характере действия мутагенов.

Ранее волновой характер зависимости ряда хозяйственно-ценных признаков от дозы 1Ч-НММ показали на гаплоидах картофеля В.Л.Брокш и Р.Я.Серова (Брокш, Серова, 1980), а также на лиственнице А.Ф.Беликова (Беликова, 1982). Природа этого явления пока не выяснена. Возможно есть связь с процессами репарации и циркадными ритмами биологических процессов.

После обработки пограничными со стимулирующими дозами, ингибирующими рост в нулевом пассаже дозами М-НММ, в следующих пассажах оказалось возможным получение также интенсивно растущих вариантов.

Проведенный нами цитоморфологический анализ показал, что интенсивный рост коррелирует с высокой митотической активностью, то есть с активной клеточной пролиферацией, а не растяжением (Каранова и др., 1973, Кагапоуа, БЬатта, 1978).

После обработки изученных нами культур клеток различных видов практически ценных растений стимулирующими и пограничными с ними ингибирующими дозами Ы-НММ получены штаммы и клоны, достоверно превосходящие исходные штаммы по интенсивности роста в течение 1 длительного времени культивирования:71 Ъ нашем исследовании впервые приводятся доказательства генетического контроля изменений этого количественного признака после воздействия разных доз N-HMM на культивируемые клетки растений. Для выяснения природы изменений количественного признака "интенсивность роста" (на примере каллусных - —с ко^иош^о) а культур клеток диоскореи) нами впервые были применены статистические i методы количественной генетики (Каранова и др., 1975).

Большинство количественных признаков имеют полигенную природу, то есть контролируются многими генами, которые расположены либо в одной хромосоме, либо в нескольких разных хромосомах. Полигены, как известно, определяют непрерывный характер изменчивости. "Интенсивность роста" культивируемых клеток растений также количественный полигенный признак. В клеточных популяциях соматических клеток in vitro отмечается достаточно высокий уровень спонтанного мутационного процесса, вклад в который имеют как изменение числа и структуры хромосом (Фролова, Шамина, 1974, Karanova, Shamina, 1978, Кунах, 1977, Шамина, 1988), так и генные мутации (Каранова, 1977, Долгих, 1984, Шамина, 1988). Обработка мутагенами индуцирует новые мутации (Sung, 1976, Karanova, Shamina, 1976, Каранова, 1977, Шамина, 1988, Сидоров, 1989), что увеличивает их давление. Как спонтанные, так и индуцированные мутации могут иметь, как положительное, так и отрицательное влияние на фенотипическое проявление принака "интенсивность роста" культивируемых растительных клеток. Однако при увеличении "давления мутаций", особенно микромутаций, возрастает вероятность изменения связи между признаками, определяющими продуктивность, в положительном направлении.

Убедительно показана на уровне целых организмов индукция мутаций не только высокими, но и нйзкими, стимулирующими рост, дозами химических мутагенов (Рапопорт и др., 1971, Эйгес, 1975). На интактных растениях с помощью статистических методов установлено, что низкие дозы мутагенов значительно повышают генетическую изменчивость различных количественных признаков (высота растений, длительность вегетационного периода, вес 1 ООО зерен и др.).

В ряде работ обсуждаются возможности применения методов количественной генетики с целью изучения генетического контроля гетерозиса, роста и развития клеточных культур in vitro (Barancelli et al., 1973; Landa and Kocourek, 1973, Buiatti et al, 1974 Novak & Kubalakova, 1977). Авторы отмечают однородность условий выращивания изолированных культур, что позволяет вычленять генетическую компоненту, определяющую степень выражения сложных признаков in vitro.

В наших экспериментах контрольный и полученные после обработки разными дозами N-HMM клеточные штаммы также росли в одинаковых условиях. Достоверные различия между штаммами по интенсивности роста в течение длительного времени могут быть, по-видимому, следствием мутационного гетерозиса (Рапопорт, 1968, Каранова и др., 1975). Отобранные гетерозиготные генотипы, как и в модельных опытах с Brassica oleracea (Baroncelli et al., 1973, Buiatti et al., 1977) и Capsicum annuum (Novak & Kubalakova, 1977) могут иметь более благоприятное соотношение и уровень эндогенных фитогормонов. Это, в свою очередь, приводит, по-видимому, к изменению интенсивности ростовых процессов и структуры клеток. Длительное сохранение генетических изменений в популяции клеток обусловлено, вероятно, отсутствием рекомбинации и сегрегации генома в потомстве клеток на соматическом уровне.

Все это имеет большое значение для получения штаммов с повышенной продуктивностью, так как продуктивность культивируемых i; if растительных клеток определяется стабильным ростом и биосинтезом

• V биологически активных веществ. Особый смысл это имеет в тех случаях, когда мало известны пути и регуляция биосинтеза интересующих исследователей БАВ, то есть когда трудно подобрать селективные условия для отбора вариантов с измененной регуляцией биосинтеза соответсвующего вещества. Следуя именно такой логике, нами была получена серия мутантов диоскореи, юкки и живучки с повышенным уровнем биосинтеза стероидных I соединений.

Другим стандартным тестом генетической изменчивости популяций соматических клеток растений in vitro является цитогенетический. При цитогенетическом анализе клеточных популяций раувольфии, обработанной азотистым ипритом, продемонстрирована их стабилизация на определенном уровне плоидности (Ковалева и др., 1972).

Нами впервые показаны динамика и скорость этого процесса при культивировании штаммов и клонов диоскореи, полученных после обработки клеток разными дозами N-HMM, растущих в виде суспензии или каллусной культуры на стандартной или селективной средах (Каранова, 1977; Karanova, Shamina, 1978). Темп стабилизации популяций на определенном уровне плоидности зависел от дозы мутагена, условий выращивания и состава питательной Среды. После обработки ингибирующей дозой N-HMM и, особенно, при помещении такой популяции в условия селективной Среды (например, в отсутствие 2,4-Д) стабилизация популяции наступала гораздо скорее. Мы полагаем, что при этом, возможно, отбирались клетки, обладающие наибольшей жизнеспособностью, более коротким клеточным циклом в данных условиях культивирования (Bayliss, 1973, Singh et al., 1975, Смоленская, 1993), а клетки, несущие летальные мутации, при высокой дозе гена в (полиплоидных клетках) элиминировались.

1 ПО i i; i '

Отбор в клеточных популяциях in vitro по морфологическим и физиологическим признакам осуществляется, в первую очередь, за счет генных мутаций, хромосомных перестроек и эпигенетических изменений. В силу коррелятивных зависимостей такой отбор приводит к изменению многих клеточных признаков. Наболюдаемое при этом изменение числа хромосом, вероятно, не специфично (Бахтин, 1976). На неспецифичность изменения уровня плоидности указываю! факты стабилизации клеточных популяций растений in vitro после воздействия самых разнообразных факторов: высоких концентраций NaCl (Кулиева и др., 1975) и 2,4-Д (Каллак, Ярвекюльг, 1968)^4действия мутагенов (Ковалева и др., 1972, Атанасов, 1976, Karanova, Shamina, 1978, Глеба, 1979). Однако в некоторых работах показано, что у культур клеток разных видов растений в одинаковых селективных условиях отбираются клетки одинакового модального класса. Например ауксинавтотрофность коррелирует с триплоидией культуры клеток табака (Fox, 1963) креписа (Sacristan, 1967) и раувольфии (Ковалева и др., 1972). В этих условиях, вероятно, идет отбор клеток с качественно новым модальным классом (Бахтин, 1976). На основании анализа литературы и наших экспериментальных результатов можно предположить, что, по-видимому, существует генетический контроль процесса стабилизации клеточных популяций in vitro на определенном уровне плокдности (Каранова, 1977, Шамина, 1988).

Развитие методов клонирования и разработка селективных сред позволили выявлять генные мутации на уровне гетерогенных клеточных популяций соматических клеток растений.

Мы впервые определили на культуре клеток растений, что для формирования жизнеспособного клона, то есть способного к репродукции, клетка должна пройти не менее 9 циклов деления (Каранова, 1977). Это wsfcn'h. ft К , tl iMirV: ■. ■ :Ai-'fS 'У'-Ш важно знать для определения выживаемости растительных клеток in vitro в генетических экспериментах.

К началу наших исследований (1971 год) достаточно хорошо была освоена система отбора клеток, резистентных к различным токсическим факторам. Были начаты разработки сред для отбора ауксотрофных мутантов. В некоторых лабораториях были получены интересные в теоретическом и практическом отношении клеточные линии с измененным метаболизмом. Некоторые из них были изучены в биохимических и генетических экспериментах (Carlson, 1973, Widholm, 1972, Lescure, 1973, Maliga et al., 1973, Muller, Gräfe, 1975, Muller, Gräfe, Mendel, 1978).

Однако существовала проблема количественного анализа мутационного процесса в популяциях соматических клеток растений in vitro, что является серьезной теоретической задачей, решение которой важно для планомерного отбора биохимических мутантов, а также для доказательства наследственной природы наблюдаемых изменений признаков на уровне популяций соматических клеток растений in vitro. Нами впервые, параллельно и независимо от Sung (Sung, 1976) было выполнено такое исследование (Karanova, Shamina, 1976, Каранова, 1977, Каранова и др., 1978). Sung показана индукция мутаций в системе резистентности к 5-МТ на культуре клеток моркови под действием НГ, а нами индукция мутаций показана на культуре клеток диоскореи и табака в системе прототрофности -ауксотрофности по фитогормонам под действием N-HMM. Позже нами дана количественная характеристика индуцированного мутационного процесса в системе резистентности к 5-МТ и ПФФА под действием N-HMM на культуре клеток люцерны (Каранова, Урманцева, 1996). Как в опытах Sung, так и в наших экспериментах, показана зависимость величины индукции от дозы У 180 a i i. мутагена, сохранение измененного признака в стабильных клонах в отсутствие селективных условий.

Нами, на основании анализа результатов в опытах по индукции наследственных изменений, выявленных в селективной системе прототрофности - ауксотрофности по фитогормонам, впервые для культивируемых клеток растений было определено максимальное значение темпа спонтанных наследственных изменений на клетку за генерацию. При условии-, что исходные соматические клетки лиоскореи не v несли генетических изменений, позволяющих им расти на среде без ауксина, и вновь возникающие изменения не имели селективных преимуществ в ходе дальнейшего размножения, темп спонтанных стабильных изменений составил не более 2x10"6 на клетку за генерацию.

В отличие от Sung, мы использовали не только ингибирующие, но и стимулирующие рост дозы мутагена. И в опытах на люцерне особенно наглядно была впервые доказана на уровне соматических клеток in vitro, индукция мутаций не только ингибирующими, но и стимулирующими дозами N-HMM. Ранее, как уже упоминалось, под действием также стимулирующей рост дозы N-HMM нами были получены стабильные мутанты с повышенным синтезом стероидных соединений на культуре клеток диоскореи (Каранова и др., 1986, Бутенко и др., 1989), культуре клеток юкки (Джаошвили и др. 1989, Гогоберидзе, 1995) и живучки (Закирова, 1993).

Как было показано в опытах на люцерне, частота индуцированых 5-МТг и ПФФАГ вариантов была ниже, чем частота индуцированных, прототрофных по ауксину вариантов диоскореи. Возможно, это связано со специфичностью системы отбора. Селективные Среды, содержащие 5-МТ и ПФФА, были использованы нами для отбора вариантных клеточных линий люцерны, с повышенной активностью пероксидазы. Такие варианты были получены.

Примерно одна треть из числа проанализированных клонов имела Н повышенную активность фермента. Клон с повышенной активностью i Г пероксидазы (в 2,3 раза выше активности фермента в исходном штамме) был i

• V I отобран на среде с 5-МТ после обработки клеток люцерны N-HMM в дозе 8 мМхчас (Каранова, Урманцева, 1996). В этих опытах нами была подтверждена высокая мутагенная эффективность N-HMM, показанная ранее на многих интактных организмах и культуре клеток млекопитающих. 1

Популяция соматических клеток in vitro является своеобразной генетической системой, при работе с которой встает непростая задача: идентификация изменений на соматическом уровне и доказательство их генетической природы. Появление нового признака может быть следствием адаптации клеток к создаваемым селективным условиям, либо результатом регуляторных процессов, аналогичных тем, которые происходят в онтогенезе при дифференцировке клеток (так называемых эпигеномных изменений) или мутаций. В ряде обзоров (Street, 1975, Шапиро, Варшавер, 1976, Maliga et al., 1976) обсуждаются основные критерии для определения мутационной природы вновь возникающих наследуемых изменений соматических клеток:

1. Наследуемость (или стабильность) наблюдаемых изменений, их сохранение при размножении Клеток в неселективных условиях, сохранение признаков вторичными культурами, полученными от растений-регенерантов.

2. Случайный характер возникновения наследуемых вариантов в клеточной популяции, что устанавливается специальными методами (например, флуктуационным тестом).

3. Идентификация измененного продукта гена.

4. Низкая частота встречаемости и индукция наследуемых изменений мутагенами с различным механизмом действия (радиация, д \ химические агенты). Выход мутантов должен находиться в зависимости от дозы мутагена. 5. Установление генетической природы наследуемых изменений путем гибридологического анализа.

Мы в своих исследованиях показали наследуемость (или 1 стабильность) наблюдаемых изменений, их сохранение при размножении i v клеток в неселективных условиях, а также при реклонировании в селективных условиях. Определена низкая частота встречаемости примерно Iff6) и индукция наследуемых изменений мутагеном с

Ь ' 1 известным механихмом действия (N-HMM). Выход мутантов находился в зависимости от дозы мутагена. Дальнейшее физиологическое и биохимическое исследование вариантов также подтверждает их генетическую природу.

На основании анализа литературы и полученных нами результатов можно сказать следующее:

- Альтернативные по потребностям в фитогормонах клоны диоскореи и табака, полученные нами, оказались интересной модельной системой , для выяснения природы • I гормононезависимости культивируемых растительных клеток. Впервые, на мутантах диоскореи и табака, индуцированных N-НММ, показано, что этот признак может иметь не только эпигенетическую (как это обсуждалось в литературе для "привыкших" (habituated) гормононезависимых штаммов растений in vitro), но и мутационную природу. При отборе в одинаковых селективных условиях могут быть получены генетически ; различные, ауксиннезависимые клоны. Это определяется генотипом (видом растения); возрастом культур, и, как следствие, их разными цитофизиологическими особенностями, генетической ! i i гетерогенностью клеточных популяций растений in vitro, а также дозой мутагена.

Ауксиннезависимость - сложный признак. Физиологическое изучение полученных нами мутантных клонов показало, что ауксиннезависимость клеток диоскореи, определяется, вероятно, изменением фермента антранилат-синтетазы, а также изменением системы временной инактивации избыточных индолов. Ауксиннезависимость мутантного клона табака, также индуцированная N-HMM, может быть связана, по-видимому, с изменением ферментативного комплекса окисления ИУК (ОИУК). Взаимосвязь и взаимодополнение путей инактивации (окисления и конъюгирования в ауксиннезависимых клетках), дает клетке надежную систему, не позволяющую свободному ауксину, к которому растительная клетка чувствительна, превысить некоторый пороговый для данного типа клеток, уровень. В случае, когда ауксин не разрушается системой ОИУК, резко возрастает роль конъюгирования. ¡r> fj , -. * " ' ' " « '*• ',•.• ' • '•;')•

Можно предположить, что в мутантных клетках высших растений, по fx. . .¡У: сравнению с грибами (N. crassa) и бактериями {Е. coli) метаболизм индолов более разветвлен, что, возможно, повышает его стабильность.

В отношении продуктивного по росту и биосинтезу стероидов штамма диоскореи ИФР ДМ0,5, полученного после обработки исходного штамма стимулирующей рост дозой мутагена, получены принципиально новые данные, свидетельствующие в пользу мутационных изменений в клетках, способствующие их большей продуктивности. Нами обнаружена перестроцщ дыхательной цепи митохондрий, что связано, по-видимому\ как с большей интенсивностью роста, так и с энергозависимым синтезом стероидов (Шугаева и др., 1996).

Ранее, при изучении мутантных штаммов диоскореи, полученных нами, определен состав сапонинов (Васильвева, 1988, Ворьбьев, 1991, Носов, 1992). Показано, что все штаммы содержат 4 фитостерина: ситостерин, стигмастерин, кампестерин и холестерин и 4 сапонина: протодиосцин, дельтозид (агликон диосгенин) и их 258-аналоги (агликон ямогенин). Таким образом, установлена уникальность состава стероидов в культуре клеток растений (в интактном растении диоскореи не обнаружены 258-сапонины) и тотипотентность растительной клетки in vitro (протодиосцин характерен для листьев растения диоскореи, дельтозид - для корневища). Показано практически полное отсутствие спиростаноловых сапонинов для штамма ИФР ДМ0,5 и незначительное их содержание (менее 2-3% от общего содержания сапонинов) для остальных штаммов. Установлено, что штаммы различаются по количественному содержанию сапонинов. В штамме ИФР ДМ0,5 наибольшее содержание фуростаноловых сапонинов - до 12% (Каранова и др., 1986, Носов, 1992).

В исследованиях по влиянию сверхнихнизких температур и выяснения условий для криосохранения тех же штаммов диоскореи, определена их разная устойчивость к этим условиям (Попов, 1998). Наибольшей жизнеспособностью обладает штамм ИФР ДМ0,5, самый продуктивный мутант, имеющий только фуростаноловые сапонины (Каранова и др., 1986, Носов, 1992), измененную структуру дыхательной цепи (Шугаева и др., 1996), более развитый эндоплазматический ретикулум и структуру активно секретирующей клетки (Князьков и др., 1994).

Как уже указывалось, в процессе изучения летального и мутагенного действия N-HMM на культивируемые клетки разных видов растений, нами л ' были отобраны перспективные для практического использования и фундаментальных исследований клеточные штаммы и клоны:

- диоскореи: с повышенной интенсивностью роста и биосинтеза стероидов (лучший мутантный штамм в 7 раз превосходит исходный' штамм, а в ряде случаев и корневица целых растений); растущие на простых питательных средах;

- живучки: с повышенной интенсивностью роста и синтеза стероидов (лучший штамм в 20 раз продуктивнее исходного штамма);

- юкки: с повышенной интенсивностью роста и синтеза стероидов (лучшие штаммы и клоны в 3 раза продуктивнее исходного штамма;

- люцерны: с большей интенсивностью роста и активностью пероксидазы (лучший клон имеет в 2,3 раза более высокую активность пероксидазы);

- строфанта, с большей интенсивностью роста;

- табака, клон прототрофный по ауксину имел очень интенсивный рост.

Некоторые из этих штаммов и клонов способны к дезагрегированному росту в виде клеточных суспензий: Они изучены в условиях лабораторного выращивания, что может быть использовано при разработке технологии промышленного культивирования клеток лекарственных растений. В этом отношении наиболее изучены штаммы диоскореи, особенно штамм ИФР ДМ0,5. Для него разработан регламент, который может быть использован в биотехнологической промышленности (Носов, 1992, Липский, 1993). Этот штамм передан для внедрения на Покровский завод биопрепаратов (Носов, 1992).

Из высокопродуктивного мутанта диоскореи ИФР ДМ0,5 получен препарат фуростаноловых сапонинов - "дельтостим" и показана его биологическая активность. Высокая биологическая активность в сочетании с химической стабильностью и низкой токсичностью делают препарат весьма перспективным для широкого применения в медицине и сельском хозяйстве (Васильева, Пасешниченко, 1995).

Созданные штаммы и методические разработки нашли применение в экспериментальной работе различных научно-исследовательских учреждений России (ИФР РАН; Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН; Институт биохимической физики РАН, Москва; ВНИИ Биотехника Главмикробиопрома, Москва, СИФИБР СО РАН, Иркутск; Грузии (Институт биохимии растений Гр АН, Тбилиси); Узбекистана (Институт химии растительных веществ АН РУЗ, Ташкент); Чехии (Институт экспериментальной ботаники, Прага) и др. -пу:

I с4

Общий итог исследования

Отбор мутантных клеток, как в селективных, так и в неселективных условиях, зависит от жизнеспособности (выживаемости) таких клеток, а значит, от их способности к пролиферации, росту. В случае невозможности создать специфические селективные условия для отбора мутантных клеток (то - есть разложить фенотип на более элементарные признаки . для ступенчатого отбора) имеет смысл использовать мягкие условия мутагенеза, использовать небольшие, стимулирующие рост дозы мутагенов, которые не нарушают грубо клеточный гомеостаз (как на генном, хромосомном, так и метаболическом уровне), но тем не менее индуцируют генные, или точковые мутации в полигенах, контролирующих большинство количественных признаков, в том числе, ростовых и метаболических.

В наших исследованиях показан плейотропный эффект генетических г ! изменений, индуцируемых и малыми, стимулирующими рост, дозами 14-НММ. При этом наблюдается широкий спектр положительно измененных признаков, определяющих продуктивность, как по росту, так и по синтезу БАВ (то - есть связанных, как с первичным, так и вторичным метаболизмом); признаков, связанных с гормононезависимостью культивируемых растительных клеток и др.

В тех же случаях, когда с помощью специфических селективных условий возможно выявить генетические изменения, определяющие элементарные составляющие признаки общего ростового фенотипа (выживаемости клеток), имеет смысл, по-видимому, увеличивать дозы мутагена с целью повышения частоты генетических изменений, определяющих тот, или иной признак, так как в более жестких условиях отбора частота встречаемости измененных вариантов в контроле низка.

С целью повышения эффективности мутагенеза и последующего отбора по интересующим признакам, связанным с продуктивностью клеток т \п1го, которая определяется, как интенсивностью роста, так и интенсивностью биосинтеза вторичных веществ, целесообразно использовать мутагены в широком диапазоне доз, а не 1-2 дозы, так как в наших исследованиях выявлен волновой (или полимодальный, по терминологии разных авторов) характер ростовых реакций (то - есть выживаемости, а значит летального эффекта) на разные, в том числе, малые дозы мутагена. А "+" и "-" эффекты по росту (даже очень близких по величине доз) определяются разными генетическими и физиологическими причинами.

Таким образом разработана методология получения мутантных штаммов культивируемых клеток растений с комплексом ценных физиологических призников с использованием методов экспериментального мутагенеза и клеточной селекции. а Л -г- ЛК-1V. 1 !'

ПОЛУЧЕННЫЕ АВТОРОМ ШТАММЫ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК

1. Штаммы и клоны Оюъсогеь с1еко1Леа:

ИФР ДМ0,5. Получен после обработки клеток исходного штамма стимулирующей рост дозой Ы-ИММ. Имеет более интенсивный, чем исходный штамм, рост, более крупные клетки, богатые включениями. Содержание гликозидносвязанного диосгенина и фуростаноловых сапонинов в 4-7 раз более высокое, чем в исходном штамме и превосходит их содержание в корневищах растений. Спектр стероидов аналогичен интактному растению. Отличается более эффективно работающей энергетической системой, что выражается в менее интенсивном дыхании и меньшей активности альтернативной оксидазы. У него лучше работает цитохромный путь переноса электронов. Из фуростаноловых гликозидов, выделенных из клеток этого штамма, получен препарат "Дельстим" и показана его разнообразная биологическая активность и химическая стабильность (Васильева, Пасешниченко, 1995). Штамм депонирован в

Российскую коллекцию клеток высших растений под номером 6.

• !

ИФР ДМ1 - Отличается более интенсивным ростом, получен после обработки клеток исходного штамма стимулирующей рост дозой 1Ч-НММ. Имеет измененный спектр стероидов. Штамм депонирован в Российскую коллекцию клеток высших растений под номером 8.

ИФР ДМвА'К1" - ауксиннезависимый клон, получен после обработки клеток исходного штамма ингибирующей рост дозой Ы-НММ. Имеет интенсивный раст на среде без 2,4-Д, резистентен к высоким гербицидным концентрациям экзогенного ауксина и 5-метилтриптофана. Имеет большую активность антранилат-синтетазы. Имеет измененный спектр стероидов. й • 1 оп

Штамм депонирован в Российскую коллекцию клеток высших растений под номером 7.

ДМТГА" - резистентный к 5-метилтриптофану гормоннезависимый клон. Получен при отборе из клеток клона ИФР ДМ8А"К+ на среде с 5-метилтриптофаном. ¡

2. Клоны Yucca gloriosa 3 клона, получены после обработки клеток исходного штамма малыми дозами N-HMM. Имеют более интенсивный рост, чем исходный штамм. Содержание стероидных гликозидов более чем в 3 раза превосходит их содержание в исходном штамме.

3. Штамм Ajuga turkestanica Получен после обработки клеток исходного штамма малой дозой N-НММ. Имеет интенсивнй рост и в 20 раз более высокое содержание экдистероидов, чем исходный штамм. Имеет содержание экдистероидов на уровне интактных растений.

4. Клоны Medicago sativa К-1, К-3, К-ПФФАК 1, K-MTR. 1, K-MTR. 2, K-MTR. 3, K-MTR. 4. Перечисленные клоны получены либо после высева на стандартную среду без обработки N-HMM (К1, КЗ), либо после обработки разными дозами N-HMM и высева на Среды с аналогами аминокислот: 5МТ и ПФФА. Все полученные клоны отличаются более интенсивным ростом, чем исходный штамм и имеют большую активность пероксидазы от 50% (клон К1) до 2,3 раза большую (клон КМТГ4). Этот клон передан в группу коллекции отдела Биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН.

5. Клоны Strophantus gratus После обработки клеток малыми дозами N-HMM получено 4 клона с более интенсивным ростом, чем исходный штамм. \

6. Клон МсоНапа ХаЬасит Аусиннезависимый клон, полученный после обработки ингибирующей рост дозой Ы-НММ. Отличается от исходного штамма более интенсивным ростом. Строго цитокининзависимый. Резистентен к высоким, гербицидным концентрациям экзогенного ауксина. Поддерживается в пересадочной культуре группы коллекции отдела Биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН.

Всего в результате проведенной работы с применением методов индуцированного мутагенеза и клеточной селекции получено и охарактеризовано 20 штаммов и клонов, представляющих интерес для фундаментальных исследований и практического использования.

Т 1

•!.'<ГПИ1 С ИОД«4';. и ь

V (I

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Каранова, Светлана Лаврентьевна, 1999 год

1. Андреев B.C. Генетический механизм радиостимуляции растений. В сб.: Предпосевное облучение семян сельскохозяйственных культур. М., Изд-во АН СССР, 1963, с.26.

2. Андреева В.А. Фермент пероксидаза. Участие в защитном механизме растений. М., Наука, 1988, 128с.

3. Атанасов А.И. Исследование морфогенетических способностей ткани и культуры клеток сахарной свеклы Beta vulgaris L. с целью практического использования в генетике и селекции. Автореф. дисс. . канд. биол. наук., София, 1976.

4. Ауербах Ш. Проблемы мутагенеза. М., Мир, 1978, 463с.

5. Беликова А.Ф. Особенности мутагенной стимуляции у лиственницы сибирской. В сб.: Улучшение культурных растений и химический мутагенез. М., Наука, 1982, с.225.

6. Бойкова В.В., Корхов В.В., Пасешниченко В.А. Контрацептивная активность дельтонина из Dioscorea deltoidea. Растительные ресурсы, 1990, т.28, N1, с.185.

7. Бреславец Л.П. Растения и лучи Рентгена. М., Изд-во АН СССР, 1946.1. Ч х/

8. Бродский В.Я. Трофика клетки., М., Наука, 1966.

9. Брокш В.Л., Серова Р.Я. Характер изменчивости гаплоидов картофеля при действии 1Ч-нитрозо-.Ч-метилмочевины. Бюлл. МОИП, 1980, вып.99, с.48.

10. Булгаков В.П. Культуры трансформированных и трансгенных клеток растений как источник продуктов вторичного метаболизма. Автореф. дисс. докт. биол. наук. М., РХТУ, 1996, 41с. Бурлакова Е.Б. Эффект сверхмалых доз. Вестник РОС АН, 1994, т.64, N5, с.425.

11. Бутенко Р.Г., Володарский А.Д. Специфика антигенов в цикле клеточныхпревращений в культуре тканей табака. Физиология растений, 1967, т. 14, N6, с.965.

12. Бутенко Р.Г., Воробьев A.C., Носов A.M., Князьков И.Е. Синтез,1 Iнакопление и локализация стероидных гликозидов в клетках разных1.лштаммов Dioscorea deltoidea Wall. Физиология растений, 1992, т.39, N6, с. 1146.

13. Волкова Л.А., Попов A.C., Носов A.M., Бутенко Р.Г. Сохранение биосинтетического потенциала клетками диоскореи (Dioscorea deltoidea Wall.) после криогенного хранения. Докл. АН СССР, 1982, т.265, N2, с.504.

14. Воллосович Н.Е., Воллосович А.Г., Ковалева Т.А., Шамина З.Б., Бутенко• Т i

15. Газарян И.Г., Веревкин А.Н., Фечина В.А., Урманцева В.В., Скрипниковi

16. А.Ю. Пероксидазы культивируемых клеток люцерны. Докл. РАН, 1992, т.326, N1, с.198. Гамбург К.З. Биохимия ауксинов и его действие на клетки растений.

17. Гогоберидзе М.К., Мамаладзе М.Н., Джаошвили М.Р., Каранова С.Л.,•i i

18. Пхеидзе Т.А., Сулаквелидзе Ц.П. Характеристика суспензионной культуры клеток Yucca gloriosa L. Физиология растений, 1988, т.35, N2, с.378.

19. Гуськов В.А. Метаболизм ауксинов в растениях и его регуляция. Итогинауки и техники. Сер. Физиология растений, т.8., ВИНИТИ, М., 1991,i156с.

20. Демченко С.И. Длительная стимуляция и возможный механизм ее индукции химическими мутагенами. В сб.: Химические супермутагены в селекции. М., Наука, 1975, с.118.

21. Демченко С.И. Особенности мутационной и модификационной изменчивости, вызываемой химическими мутагенами у растений. Дисс. докт. биол. наук. Л., ЛГУ, 1984, 392с.

22. Долгих Ю.И. Генетическая изменчивость по признаку температурочувствительности в культуре клеток женьшеня. Автореф. дисс. . канд. биол. наук, М., ЙОГ, 1986, 19с.

23. Дридзе И.Л., Хадеева Н.В., Майсурян А.Н. Получение клеточных линий табака, толерантных к некоторым стрессовым факторам. Физиология растений, 1990, т.37., N5.

24. Ермолова И.Е., Шамина З.Б., Бутенко Р.Г. Характеристика резистентных кi5.метилтриптофану клеточных линий диоскореи. Физиологияj . "''J jv растений, 1987, т. 34, N6, с.11.

25. Жолкевич В.Н., Бутенко Р.Г., Бычкова Г.С., Пейсахзон Б.И. О месте энергетической разрядки в митотическом цикле Panax ginseng С.А.Меу. ДАН СССР, 1974, т.217, N5, с.11.

26. Жолкевич В.Н., Бутенко Р.Г., Писецкая Н.Ф. Соотношение между теплоотдачей, потреблением кислорода и митотической активностью в культуре изолированной ткани Panax ginseng. Физиология растений, 1971, т.18, N4, с.761.

27. Загоскина Н.В. Особенности метаболизма фенольных соединений в гетеротрофных и фотомиксотрофных каллусных культурах, чайного растения (Camellia sinensis L.). Автореф. дисс. . докт. биол. наук, М., ИФР РАН, 1997, 49с.tч 201

28. Зоз H.H. Задачи и проблемы химической селекции растений. В сб.:

29. Ильинская Л.И., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Биохимические аспекты индуцированной устойчивости и восприимчивости растений.s 202

30. Итоги науки и техники ВИНИТИ, сер. Защита растений. М., ВИНИТИ, 1991, т.7., 192с.

31. Каллак Х.И., Ярвекюльг Л.Я. О морфологической и цитогенетической- I

32. Каранова С.Л. Индуцированный мутагенез в культуре соматических клеток Dioscorea deltoidea Wall. Автореф. дисс. . канд. биол. наук, М., ИБР АН СССР, 1977, 27с.

33. Каранова С.Л. Количественный мутагенез в системе прототрофность -ауксотрофность по ауксину в культуре соматических клеток табака. Тез. докл. Ill Be. конф. Культура клеток растений. Абовян, 1979, с. 174.

34. Каранова С. Л. Селекция резистентных к 5-МТ и одновременно гормононезависимых клеток диоскореи. Тез. докл. Ill Be. конф. Культура клеток растений. Абовян, 1979, с. 172.

35. Каранова С.Л., Джаошвили М.Р., Гогоберидзе М.К. Изучение летального и мутагенного действия N-HMM на культуры клеток стероидсодержащих растений. Тез. докл. Вс. конф. по генетике соматических клеток в культуре. М., 1986, с.24.

36. Каранова С.Л., Макарова P.B., Кефели В.И. Физиологические особенности генетически маркированной ауксиннезависимой клеточной линии Dioscorea deltoidea. Тез. докл. Ill Вс. конф. Культура клеток растений. Абовян, 1979, с. 173.

37. Каранова С.Л., Носов A.M., Пауков В.Н., Шамина З.Б. Продуктивность различных клеточных линий диоскореи дельтовидной. В сб.: Культура клеток растений и биотехнология, М., Наука, 1986, с.83.

38. Каранова С.Л., Чхиквишвили И.Д., Васильева И.С., Пасешниченко В.А. Изучение роста и биосинтеза стероидов в различных клеточных линиях Dioscorea deltoidea Wall. Тез докл. Вс. конф. Новые направления биотехнологии, Пущино, 1986.

39. Каранова С.Л., Шамина З.Б., Бутенко Р.Г. Индуцированная генетическая изменчивость культуры соматических клеток диоскореи дельтовидной in vitro. Прототрофность по фитогормонам. Генетика, 1978, т14, N6, с.987.1. J ;

40. Каранова С.Л., Шамина З.Б., Бутенко Р.Г. Волновой характер летального действия N-HMM на культивируемые клетки растений. Тез. докл.

41. Конф. по генетике соматических клеток в культуре, М., 1993, с. 12.I

42. Кежелите Д.М. Характеристика популяции клеток Dioscorea deltoidea Wall в суспензонной культуре. В сб.: Культура клеток растений, Киев, Наукова Думка, 1978, с.37.

43. Кефели В.И. Природные ингибиторы роста и фитогормоны, М., Наука, 1974, 253с.

44. Князьков И.Е., Лобакова Е.С., Носов A.M. Определение локализации1. V У|стероидных гликозидов в культуре клеток Dioscorea deltoidea на основе изучения их ультраструктуры. Физиология растений, 1994, т.41, N6, с.896.v.' J! . !,,!■. ' iiX'J;■■ i Iii.

45. Корхов В.В., Бойкова В.В., Пасешниченко В.А., Васильева И.С., Носов

46. A.M. Способ стимуляции овуляции у животных. Авт. свид. заявка N4487637/14. Положительное решение от 30 марта 1992 г.

47. Кретович В.Л., Северная Т.А., Бутенко Р.Г. Характеристика малат- и глютаматдегидрогеназы культуры ткани табака. ДАН СССР, 1969, т.188, N3, с.707.

48. B.Г. Летальное и мутагенное действие 1Ч-нитрозо-К-метилмочевины на Blaceslea trispora thaxleu продуцент каротиноидов. В сб.:7i i ■

49. Эффективность химических мутагенов в селекции. М., Наука, 1976, с.43.

50. Кулиева Ф.Б., Шамина З.Б. Сравнительное цитогенетическое изучениеt *культуры ткани креписа при различных условиях культивирования. Физиология растений, 1972, т.22, N1, с. 134.

51. Мадуленко E.H., Емец В.И., Пак В., Васильева И.С., Пасешниченко В.А.j; . • •

52. Модулятор растительного происхождения из культуры клетокядиоскореи дельтовидной. Тез. докл. I Вс. иммунологического съезда, М., Медицина, 1989, с.306.

53. Культура клеток растений и биотехнология, М., Наука, 1986, с.76.•

54. Осипова Е.А. Вариабельность роста и синтеза стефарина в клоновых( у гаи ' 1 ' ' 1 : •■' ^Jпопуляциях Stephania glabra. Автореф. дисс. . канд. биол. наук, М.,1. ИФР РАН, 1997,25с.

55. Осипова E.H., Попов Ю.Г., Шамина З.Б. Получение индивидуальныхклонов стефании и их характеристика. Физиология растений, 1992,т.29, N2, с.392.?

56. Пасешниченко В.А., Шитабе Гусева А.Р. Фотометрический метод определения свободного и гликозидносвязанного диосгенина в корневищах диоскореи дельтовидной. Прикладная биохимия и микробиология, 1972, т.8, N1, с.92.

57. Першина J1.A. Феногенетика мутантов гороха (Pisum sativum) с измененной структурой стебля. Автореф. дисс. . канд. биол. наук, Новосибирск, СО АН СССР, 1976.

58. Плохинский H.A. Алгоритмы биометрии. Москва, МГУ, 1967.

59. Плохинский H.A. Биометрия, Москва, МГУ, 1970.

60. Попов A.C. Физиология криоустойчивости и криосохранения культивируемых in vitro клеточных штаммов растений. Автореф. дисс. . докт. биол. наук, М., ИФР РАН, 1998, 49с.

61. Рапопорт И.А. 85% мутаций в половой хромосоме под влиянием нитрозо-алкилмочевин. ДАН СССР, 1962, т. 146, N6, с. 1418.1. Д: г* *

62. Рапопорт И.А. Двойная генетическая стимуляция, индуцированная супермутагенами. В сб.: Мутационная селекция, М., Наука, 1968, с.230.

63. Рапопорт И.А., Домрачева А.Г. Повышение частоты обратных мутаций под влиянием N-HMM в 100 ООО раз. В сб.: Химический мутагенез и селекция, М., Наука, 1971, с.Т8.

64. Рапопорт И.А., Домрачева А.Г., Лебедь Э.С., Кескинова Д.В., Коваленко

65. Д. В. Эффект стимуляции, возникающей при воздействии химическими мутагенами на некоторые актиномицеты и грибы. В сб.: Химический мутагенез и селекция, М., Наука, 1971, с.29.

66. Редичкина Т.Д., Каранова С.Л. Физиологическая характеристика1.Vиндуцированной N-HMM ауксиннезависимой клеточной линииiтабака. Тез. Ill Be. конф. Культура клеток растений. Абовян, 1979, с.175.

67. Рекославская Н.И. Индолилацетаспарагиновая кислота при культивировании суспензии растительных клеток. Автореф. дисс. . канд. биол. наук, М., ИФР АН СССР, 1977, 22с.v: п •. 208 !, . b • .- ■ t' • i .

68. Рекославская Н.И., Гамбург К.З. Метаболизм ИУК в нормальных и автономных культурах растительных тканей. Физиология растений, 1975, т.22, N5, с. 1025.

69. Решетняк О.В. Сравнительное исследование панаксозидов в культуре клеток и корнях женьшеня. Автореф. дисс. . канд. фарм. наук, М., НИИ Фармации МЗРФ, 1998, 24с.

70. Садвакасова Г. Г., Кунаева P.M. Некоторые физико-химические и физиологические свойства пероксидазы растений. Физиология и биохимия культурных растений, 1987, т. 19, N2, с. 107.

71. Саркисова М.А. Культура ткани диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea Wall) как продуцента стероидных сапонинов. Дисс. . канд. биол. наук, М., ИФР АН СССР.

72. Серова Р.Я. Влияние концентрации и экспозиции при воздействии N-НММ на семена Arabidopsis thaliana (Mey). IV. Зависимость эффектов Mi от режима обработки. В сб.: Химические супермутагены в селекции. М., Наука, 1975, с.71.

73. Сидоренко П.Г. Некоторые аспекты цитологических исследований культур тканей и клеток растений. В сб.: Культура изолированных органов, тканей и клеток растений, М., Наука, 1970, с. 169.

74. Сидоров В.А. Клеточная селекция мутантов растений и их использование. Автореф. дисс. . докт. биол. наук, Киев, Ин-т Физиологии иVгенетики, 1989, 33с.

75. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев, Наукова Думка, 1990, 280с.

76. Смоленская И.Н. Пролиферация клеток двух линий суспензионной культуры клеток Dioscorea deltoidea. Тез. докл. II Межд. конф. Биология культивируемых клеток растений и биотехнология, Алма-Ата, 1993, с.31.1. Ч '

77. Тимофеев-Ресовский Н.В., Порядкова A.A. О радиостимуляции растений. Ботан. журнал, 1956, т.41, N11, с. 1620.1.

78. Фролова JT.B., Шамина З.Б. Кинетика искусственно культивируемой клеточной популяции бобов. Цитология, 1978, т.20, с.661.

79. Шамина З.Б. Генетическая, изменчивость в популяциях соматических клеток растений в культуре. Автореф. дисс. . докт. биол. наук, Л., ЛГУ, 1988, 34с.

80. Шамина З.Б. Стратегия получения мутантных штаммов клеток растений -продуцентов биологически активных веществ. Физиология растений, 1994, т.41, N6, с.879.!

81. Шамина З.Б., Бутенко Р.Г., Тарасов В.А. Цитологическое изучение1. 1культуры ткани табака. Генетика, 1966, т.7, с.70.

82. Физиология растений, 1991, т.40, N3, с.420.i У

83. Шугаева H.A., Шугаев А.Г., Каранова С.Л., Выскребенцева Э.И., Бутенко Р.Г. Изучение дыхания в альтернативных по биосинтезу стероидов клеточных штаммах Dioscorea deltoidea Wall. Тез. докл. Межд. конф.1.гпоев, памяти акад. А.А.Баева, М., 1996, с.41.

84. Belianskaya S.Z., Volkova Z.A., Shamina Z.B. The integration of general peroxidase activity in rice clones. // Int. Workshop on Peroxidase biotechnology and application. 25-29 June, 1997, St. Petersburg, Russia, p. 51.

85. Bergmann Z. A new technique for isolating and cloning single cells of higher plants. Nature, 1984, v. 184 N4686, p. 648.i V.

86. Bergmann Z. Growth and division of single cells of higher plants in vitro. J.

87. Gen. Physiol., 1960, 43, p. 841. Berlin J., Widholm J. Correlation between Phenilalanyne Ammonialiase1. T i

88. Activity and Phenolic Biosyntesis in p-fluorophenylalanine Sensivity and Resistant Tobacco and Carrot Cell Cultures. // Plant Physiol. 1977. v.59.

89. N4,p550. : 1 P * "•• : : ': ^ f;

90. Blakelly L.M., Steward F.C. Growth induction in cultures of Haplopappus gracilis. 1. The behavior of the cultured cells. Amer. J. Bot., 1961, 48, p. 351.

91. Buiatti M., Baroncelli S., Bennici A., Pagliai M. Genetic of growth and differentiation "in vitro" of Brassica oleracea var.botrytis. II An in vitro and in vivo analysis of a diallel cross. // Z. Pflanzenzuchtg, 1974. 72, p. 269.

92. Butenko R.G., Popov, A.S., Volkova L.A., Chernyak N.D., Nosov A.M. Recovery of cell cultures and their bisyntetic capacity storage of Dioscorea deltoidea and Panax ginseng cells in liquid nitrogen // Plant Sci. Let. 1984. v.33, N3. p. 285.

93. Caplin S.M., Steward F.C. A technique for the controlled growth of excisedplant tissue in liquid media under aseptic conditions. Nature, 1949, v. 163,• ip. 920.

94. Genet., 1974, v. 8, p. 267. Chaleff R.S., Carlson P.S. In vitro selection for mutants of higher plants. Jn:

95. Genet. Manipulat. Plant Material, N.Y.-London, 1975, p. 351. Dubois J. Analyse quantitative de la croissance d'une culture de cellules du silene alba (Miller). E.H.L. Krause Bull. Sci. Bot. France, 1975, v. 122, N7-8, p. 269.

96. Durmishidze S.V., Gogoberidze M.K, Mamaladze M.N. Regeneration of Plants from Callus Tissue of Yucca gloriosa L. Z.Pflanzenphysiologie, 1983, v.l 11, N2, p.179.

97. Earle D., Torrey J. Colony formation by isolated convolvulus cells planted by defined media. Plant Physiol., 1965, v. 40, N3, p. 520.

98. Eriksson T. Studies on the growth requirements and growth messurements of cell cultures of Haplopappus gracilis. Physiol. Plant., 1965, v. 18, p. 976.

99. Evans V.L., Earle W.R., Sanford K.K., Shannon J.E., Walta H.K. The preparation and handing of replicate tissue cultures for quantitative studies. J. Nat. Cancer Inst., 1951, v. 11, p. 907.

100. Fox J.E. Growth factor requirements and chromosome number in tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 1963, v. 16, N4, p. 793.

101. Fugita Y. Shikonin: Production by Plant (Lithospermum erythrorhizon) Cell Cultures // Biotechnology in Agriculture and Forestry. Medicinal and Aromatic Plants 1. Berlin ets.: Sprinje'r-Verlag, 1988, v.4, p.225.

102. Gadgil V.N., Gadgil D.R. Suspension culture of cells of Hollghock (Althaes rosea) crown gall tissue. In; Tissue culture. Proceed, of Seminar held in Baroda India, 1965, p. 315.

103. Galston A.W., Dalberg Z.J. The Adaptive Formation and Physiological Significance of Indoleacetic Acid Oxidase // Amer. J. Bot. 1954. v.41, N5, p.373.

104. Galun E., Vardi A. Citrus protoplasts in studies of cell genetics and morphogenesis: isolation culture, mutagenesis and emryoid differentiation. Abstr. XII Int. Bot. Congr., Leningrad, 1975, p. 289.

105. Ganapathy P.S., Hildebrandt A.C., Riker A.J. Dissociation of higher plant tissues in cultures. Am. J. Bot. 1964, v. 51, p. 669.

106. Gaspar Th., Penel CI., Torpe T., Greppin H. Peroxidase 1970-1980. A survey of Their Biochemical and Physiological Roles in Higher Plants. Geneve: Univers. de Geneva, Centre de Botanique, Switzerland, 1982, p. 324.

107. Gauthered R.Z. Le culture des tissue vegetaux. Paris, 1959, p. 864.1.214/

108. Gey G.O. On improved technique for massive tissue culture. Amer. J. Cancer, 1933, v. 17, p. 752.

109. Gleba J.J. Micropropagation culture of tobacco plant from singl mesophylljprotoplasts. Naturwissenschaften, 1978, v. 65, p. 158.i

110. Karanova S.L., Shamina Z.B. Chemical mutagenesis in Dioscorea deltoidea Wall somatic cell culture. In: Use of Tissue Culture on Plant Breeding. Olomouc CSSR; 1976, p. 325.• .<. . 'iti •! y

111. Cultivated in Bioreactors // Planta Medica. 1989, v.55., N4, p.409.

112. Kutacek M., Opatrny Z., Vackova K., Kefeli V.J., Butenko R.G., Karanova

113. Mawson B.J. Cyanide-Resistant, Alternative Pathway Respiration in Guard

114. Cell Protoplasts of Vicia Faba // Can. J. Bot. 1994. v.72, N2, p. 150. Mehta A.R. Nutritional and morphogenesis studies with callus and suspention cultures derived from root. Ph. D. Thesis, Univ. of Wales, 1963, p. 125.

115. Proc. IV IFS: Ferment. Technol. Today, 1972,p. 681.

116. Novak F.I., Kubalakova M. Quantitative analysis of in vitro callus growth in

117. Capsicum anumum L. // Symposium: Biometric-Genetic Methods in Planti

118. Breeding. Ledmice na Morave (Czechoslovakia). 1977. Onken D., Onken D. Zur Rohstoffproblematic der Steroid hormon Synthesen. //

119. Dioscorea deltoidea // Biotechnology in Agriculture and Forestry, vol.32.3 i .i e 218

120. Cryopreservation of plant Germpasm. et Bajaj J.P.C. Berlin-Heidelberg. Springer, 1996, p. 487. n ;. M : su^ o

121. Reinert J. Growth of single cells from migher plants on synthetic media. Nature, 1963, v. 200, N4901, p. 90.

122. Reinert J. Growth of single cells from Haplopappus gracilis and Vitis vinifera on synthetic madia. In: Proc. Int. Conf. on plant tissue culture. Ed. White, California, 1965, p. 393.

123. Reinert J. Dissociation of cultures from Picea glauca in to small tissues fragments and single cells. Science, 1966, v. 123, p. 457.

124. Robins R.J., Walton N.J., Hamill J.B., Parr A.J., Rodes M.J.C. Strategies for the Genetic Manipulation of Alkaloid-Producing Pathways in Plants // Planta Medica. 1991, v.57, N1, p27.

125. Rajasekhar E.W., Edwards M., Wolson S.B., Street H.E. Studies on the Growth in culture of plant cells. XI The influence of shating rate on the growth of suspension cultures. J. Exp. Bot., 1971, v. 22, p. 107.

126. Rose D., Martin S.N. Parametare for growth measurement in suspension cultures of plant cells. Canad J. Bot., 1974, v. 52, N4, p. 903.

127. Sacristan M.D., Wendh-Gallitelli M.F. Transformation to Auxin-Auto trophy and It's Reversibility in a Mutant Line of Crepis capillaris Callus Culture. Molec. Gen. Genetics, 1971, v. 110, p. 355.

128. Simpkins J., Street H.E. Studies on the growth in culture of Plant Cells. VII Effects of kinetin on the carbohydrate and nitrogen metabolism of Acer pseudoplatanum L. cells growth in suspension culture. J. Exp. Bot., 1970, v. 21, N66, p. 170.

129. Singh B.D., Harvey B.L., Kao K.N., Miller R.A. Karyotipic changes and selection pressure in Haplopappus gracilis suspension culture. // Can. J. Genet. Cytol. 1975, v.17, p. 109.

130. Steingrover E. The relationship between cyanide-resistant root respiration and the storage of sugars in the tarroot in Daucus carota L. // J. Exp. Bot.(. : '.• ' :' « 1 ,! ' riot!1981. v.32. N130. p.911.•3 !: ■

131. Steward F.C. Growth induction in explanted cells and tissues metabolic andimorphogenetic manifestations. In: Synthesis of Molecular and Cellular Structure. Ed. D.Rudnick, Ronald Press, N.Y., 1961, p. 193.1.-1 ^

132. Steward F.C., Caplin S.M., Miller F.K. Investigations of growth and metabolism of plant cells. I New techniques for the investigation of metabolism, nutrition and growth in undifferentiated cells. Ann. Bot. 1952, v. 16, p. 58. * : ! , : : ^ ' " : '

133. Sutton-Jones B., Street H.K. Studies on the growth in suspension culture.j

134. Changes in fine structure of Acer pseudoplatanum L. J. Exp. Bot., 1968, v. 19, N58, p. 114.

135. Urmantseva V., Volkova L., Lipsky A., Chaianova S. Biotechnological molecular and physiological aspects of plant repoxidases. Ed. J. Lobarzewski. Geneve. Univ. Geneve, 1991, p. 501.

136. Vardi A., Raven D. Cross-Feeder Experiments between Tobacco and Orange Protoplasts. Z. Pflanzenphysiol., 1976, Bd. 7-8, p. 350.

137. Vankova R., Hsiao K.C., Bonman C.H., Baudinova A. Effects of Synthetic Cytokinins on Levels of Endogenous Cytokinins and Respiration Patterns of Beta vulgaris Cells in Suspension // J. Plant Growth Regulation. 1991, v.10, N4, p. 197.

138. Vanemmeric W.A.M., Wagner A.M., Vanderplas L.H.W. A Quantitative Comparison of Respiration in Cells and Isolated Mitochondria from Petunia Hybrida Suspension Cultures. A High Yield Isolation Procedure // J. Plant Physiology. 1992. v. 139. N4. p.390.

139. Vasil T.K., Hildebrandt A.C., Riker A.J. Growth and tissue formation from isolated single tobacco cells in rnicroculture. Amer. J. Bot., 1964, v. 51, N6, p. 2.

140. Venketeswaran S. Growth studies on Vicia faba in tissue cultures. I Establishment of culture. Phytomorphol., 1962, v. 12, N3, p. 300.

141. Venketeswaran S., Chen P.K. Nutritional factors affecting growth friability and lignification of suspension cells of higher plant cells. Ganad. J. Bot., 1964, v. 42, p. 1279.r

142. White Ph. A Hanabook of plant tissue culture. The yaques Cattell. Press, col., 1943, v. 4, p. 791.

143. Widholm J.M. Anthranilate synthetase from 5-methyltryptophan susceptible and resistant cultured Daucus carota cells. Biochem. Biophys. Acta., 1972, v. 279, p. 48.

144. Widholm J.M. Selection and characterisation of cultured carrot and tobacco* "I i / •,. « „cells resistant to lysine, methionine and proline analoge. Can. J. Bot., 1976, v. 54, p. 1523.

145. Widholm J.M. Relation between Auxin Autotrophy and tryphophanaccumulation in cultured plant cells. Planta, 1977, v. 134, N2, p. 103.221

146. Winkler M.N., Maroson B.J., Torpe T.A. Alternative and Cytochrome Pathway Respiration During Shoot Cotyledons // Physiol. Plantarum. 1994, v. 90, N1, p. 144.

147. Zenk M.H., El-Shagi H., Schulte U. Anthraqhinon Protection by Cell Suspension Cultures of Morinda cirifolia // Planta Medica, 1975, v.41, Suppl., p.79.