Промышленная технология производства биологических препаратов для диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук в форме науч. докл. Безгин, Вячеслав Михайлович

• Безгин, Вячеслав Михайлович
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1999

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Безгин, Вячеслав Михайлович

Актуальность проблемы. В структуре инфекционных болезней животных туберкулез и лейкоз крупного рогатого скота по своему социальному и экономическому значению занимают особое место. Значительный ущерб эти заболевания наносят скотоводству в связи с большой чувствительностью животных к этим болезням и длительностью эксплуатации.

Эффективность противоэпизоотических и профилактических мероприятий при туберкулезе и лейкозе крупного рогатого скота в значительной степени зависит от своевременной постановки диагноза и удаления больных животных из оздоравливаемых стад, так как они являются основным источником возбудителей болезней (В.Е. Щуревский, 1980; Н.П. Овдиенко, В.А. Шаров« Э.С. Плотников, 1982; В.А. Бусол, М.И. Гулюкин, 1988; П.Н. Смирнов и др., 1998).

Во всех странах, где регистрируют туберкулез, эффективность диагностики обеспечивается применением аллергического метода с использованием специфического биопрепарата - туберкулина. В диагностике лейкоза крупного рогатого скота широко применяют реакцию иммунодиффузии в агаровом геле (РИД), которая принята в качестве основного диагностического теста, регламентирующего международную и внутреннюю торговлю племенными животными, спермой, эмбрионами, а также при проведении оздоровительных мероприятий (М. Шваних, 1996; А.Н. Шаров, B.C. Тырина, JI.A. Ерощенко, Й.С. Шевырев и др., 1996; В.П. Шишков, Л.Г. Бурба, А.Ф. Валихов, 1988,1996).

Одним из ведущих биопредприятий, производящих препараты диагно--—-"кого профиля, является Государственная Курская биофабрика, производ-\ч мощности которой позволяют ежегодно выпускать около 400 млн. доз 'атов для диагностики лейкоза и туберкулеза крупного рогатого скота. , ,ует отметить, что на изготовителе диагностикумов туберкулеза и лейкоза -их огромная ответственность за их качество, так как по данным Департа-:;та ветеринарии Минсельхозпрода РФ туберкулез и лейкоз крупного рогато-~ ешта последние годы занимают ведущее место в структуре инфекционной патологии животных (В.М. Авилов, В.М. Нахмансон, 1995; В.М. Авилов, В.Ф. Пылинин, Н.П. Овдиенко, В.А. Ведерников, 1997).

Сложность биологическйх систем, применяемых в биотехнологических производствах, заключается в многостадийности технологий, а также необходимости оптимизации и строгой организации производственных процессов.

Поэтому совершенствование промышленной технологии изготовления препаратов для диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, а также решение проблемы охраны окружающей среды при их производстве остаются актуальными (В.П. Шишков, Г.Ф. Коромыслов, Л.Г. Бурба, 1991; В.И. Литвинов, A.M. Моррз, В.Я. Гергерт, 1996).

Цель работы.- Целью наших исследований было разработать научные и практические основы промышленного производства новых и усовершенствования существующих технологий получения препаратов для диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота*

Основные задачи исследований.

1. Разработать типовую промышленную технологию изготовления туберкулина ППД (protein purified derivative) для млекопитающих в стандартном разведении.

2. Разработать научно обоснованный способ производства качественно нового,, стандартизированного ло молекулярной.массе, туберкулиНас использованием ультрафильтрации.

3. Изучить зависимость качества туберкулина ПГ1Д для млекопитающих от производственных штаммов, используемых в его получении.

4. Оптимизировать условия культивирования микобактерий туберкулеза бычьего вида при промышленном производстве туберкулинов.

5. Изучить процесс электродиализного обессоливания растворов туберкулина и внедрить в производство промышленную технологию.

6. Разработать промышленную технологию приготовления сублимированной питательной среды для ускоренного выделения микобактерий туберку^ леза из биоматериала животных.

7. Разработать технологию промышленного изготовления сублимированного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС) для РИД.

8. Разработать промышленную технологию культивирования клеток почки эмбриона овцы (ПЭО), хронически инфицированных вирусом лейкоза, в промышленных ферментерах и выделения антигена вируса лейкоза с использованием процессов ультрафильтрации.

9. Разработать нормативную документацию на изготовление туберкули-нов ППД для млекопитающих и наборов для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

10. Представить экологическую характеристику разработанных технологий производства диагностикумов.

Научная новизна. Впервые разработана промышленная технология производства:

- туберкулина ППД в стандартном разведении (патент № 2031656 «Способ получения туберкулина», 1992 г.);

- туберкулина ППД для млекопитающих с использованием методов ультрафильтрации (патент № 2045959 «Аллерген для диагностики туберкулеза и способ его получения», 1992 г. и патент № 2035914 «Способ получения туберкулина», 1993 г.);

- наборов для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии (патент № 2020960 « Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота», 1992 г.);

- питательной среды для ускоренного выделения микобактерий туберкулеза из биоматериала животных (ФАСТ-ЗЛ).

Впервые изучен процесс электродиализного обессоливания растворов туберкулина и разработана его промышленная технология (патент №2031656 «Способ получения туберкулина», 1992 г.), позволяющая существенно интенсифицировать процесс изготовления диагностикума.

Изучены иммунобиологические свойства ППД туберкулинов для млекопитающих в едином разведении и разработана технология стабилизации растворов туберкулина.

Разработана методика концентрирования и стандартизации туберкуло-протеина по молекулярной массе и дана иммунобиологическая характеристика препарата.

Изучено влияние производственных штаммов М. bovis и М. tubereulosis на качественные характеристики туберкулина ППД для млекопитающих. Показана высокая специфичность и активность моноштаммного препарата. и гг Ангмтыл I „

Разработана технология выделения и концентрирования вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы определена действующими Нормативно-техническими документами (НТД) на технологию изготовления (технологические инструкции) и контроль (технические условия, государственный стандарт), рассмотренными и утвержденными в установленном порядке.

Результаты исследований включены в:

Инструкцию по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих», утвержденную Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 30.12.85 г;

- «Временную инструкцию по изготовлению и контролю набора для серологической диагностики лейкоза КРС в РИД», утвержденную Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 25.05.87 г;

- ГОСТ 16739-88 «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих»;

- Технические условия 10-19-442-87 «Набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота»;

- Технические условия 46-21-902-85 «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих»;

- «Инструкцию по изготовлению аллергена сухого очищенного комплексного из атипичных микобактерий (KAM)», утвержденную директором ВГНКИ ветпрепаратов 02.10.93 г.;

- Дополнения и изменения к «Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих», утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 02.10.87 г.;

- Изменения и дополнения к «Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного ППД для млекопитающих», утвержденные ГУВ при Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию 04.04.90 г. и 10.12.90 г.;

- «Инструкцию по изготовлению среды питательной ФАСТ-ЗЛ», утвержденную директором Государственной Курской биофабрики и директором ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных 12.04.96 г. и 16.04.96.;

- Технические условия 9385-106-00494185-96 «Среда питательная ФАСТ-ЗЛ».

Освоено серийное промышленное производство диагностикумов и питательной среды на Государственной Курской биофабрике. По разработанным технологиям произведено 3591 млн. доз туберкулина, 223,3 млн. доз наборов для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, 70,8 тыс. доз питательной среды ФАСТ-ЗЛ для ускоренного выделения микобактерий туберкулеза из биоматериала от животных.

Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на:

- секции «Эпизоотология и профилактика инфекционных болезней животных», Отделения ветеринарии ВАСХНИЛ, 1987 г., г. Курск;

- заседании Ученого Совета ВИЭВ, 1990 г.;

- заседании рабочей группы по вопросам туберкулеза и бруцеллеза Отделения ветеринарной медицины ВАСХНИЛ, 1991, г. Москва;

- Международном экологическом форуме «Современные экологические проблемы провинции», 1995 г., г. Курск;

- 5-й Всероссийской конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов», 1996 г., г. Москва;

- Всероссийской научно-производственной конференции «К 100-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России», 1996 г., г. Курск;

- Всероссийской 'научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с лейкозом сельскохозяйственных животных и птиц» 1997 г., г. Москва;

- заседаниях Научно-технического Совета Государственной Курской биофабрики, 1990-1998 гг.;

- научной сессии Российской Академии сельскохозяйственных наук «Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России», 1998 г., г. Москва.

Публикации результатов исследований. Основные положения и выводы отражены в восьми нормативно-технических документах* утвержденных ГУ В МСХ СССР (Госагропрома СССР, Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию), а также в 31 научной статье и сообщениях, пяти патентах на изобретения и 12 рационализаторских предложениях.

Основные положения, выносимые на защиту. На защиту выносятся:

- материалы разработки промышленной технологии изготовления ту-беркулинов;

- результаты усовершенствования существующей технологии промышленного изготовления и разработки экологически безопасной технологии изготовления ППД туберкулина;

- оптимальные условия электродиализа растворов туберкулина;

- основные материалы разработки промышленной технологии изготовления наборов для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии;

- технология получения питательной среды для ускоренного выделения микобактерий туберкулеза из патологического материала.

Объем и структура доклада. Научный доклад изложен на 51 странице машинописи, содержит 11 таблиц и рисунков включает следующие разделы: общая характеристика работы; материалы и методы исследований; результаты собственных, исследований; выводы и практические предложения; список опубликованных работ, в которых отражены основные материалы научного доклада.

Материалы и методыиссл«дования

Работа выполнена в 1981-1998 гг. в научно-производственных подразделениях Государственной Курской биофабрики и в лаборатории молекулярной биологии и биохимий ВИЭВ в соответствии с тематическими планами:

-ВИЭВ, по Государственной научно-технической программе 0.69.05 «Разработать и внедрить систему государственных мероприятий по эффективной профилактике, лечению и снижению заболеваемости депрессиями кроветворения и лейкозами человека и сельскохозяйственных животных и птиц», заявкой МСХ СССР от 15 июня 1984 года на разработку и освоение продукции «Набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота»,

- ВГНКИ ветпрепаратов, по заданию 02.06.07 М «Провести испытания туберкулина, изготовленного с применением мембранной технологии, разработать НТД» (1991 г.) и согласно постановления ГКНТ №179 от 03.05.79 г. «Отобрать и стандартизировать эффективные штаммы для производства жидких очищенных туберкулинов. Разработать количественные методы контроля этих препаратов»;

- ежегодными планами НИР и ОКР Государственной Курской биофабрики.

В работе использовали следующие штаммы микобактерий и клеточные культуры: 1 ■

- штамм Mycobacterium bovis «Valle»; штамм Mycobacterium bovis «8»; штамм Mycobacterium bovis «14»; штамм Mycobacterium tuberculosis «192»; штамм Mycobacterium tuberculosis «ДТ/СТ»;

- перевиваемую линию клеток почки эмбриона овцы, хронически инфицированных вирусом лейкоза КРС.

За основу при изготовлении опытных серий туберкулинов ППД были взяты: «Инструкция по изготовлению и контролю сухого очищенного туберкулина (ППД) для млекопитающих», утвержденная Главветупром МСХ СССР 10.12.1970 г., «Инструкция по изготовлению и контролю сухого очищенного (ППД) туберкулина для млекопитающих», утвержденная Главветупром МСХ СССР 30.12.85 г.

Контроль опытных, опытно-промышленных и производственных серий туберкулинов па соответствие требованиям действующей нормативной документации проводили на базе отдела биологического контроля Государственной Курской биофабрики. Контроль биологической активности туберкулинов. осуществляли на здоровом и больном туберкулезом, крупном рогатом скоте в хозяйствах Ставропольского края, Саратовской и Курской областей, рекомендованных Главным управлением ветеринарии МСХ СССР и МСХ России. В качестве контрольных серий при определении биологической активности и специфичности препаратов использовали утвержденные ВГНКИ ветпрепаратов контрольные серии сухого очищенного ППД туберкулина для млекопитающих №№ 43, 29, 28, 14, 9 изготовленные Государственной, Курской биофабрикой соответственно 02.06.77 г., 13.10.83 г., 25.09.86 г., 01.03.90 г., 15.02.96 г. При оценке реактогенности, биологической активности, видовой специфичности опытных, опытно-промышленных и производственных серий туберкулинов, изготовленных различными способами, в опытах использовано 1300 морских свинок, 1084 здорового и 1146 больного туберкулезом крупного рогатого скота.

Биохимические исследования культуралыюй жидкости и туберкул,илов проводили в Центральной исследовательской лаборатории Курской биофабрики и в лаборатории молекулярной биологии и биохимииВИЭВ. Для выращивания микобактерий использовали синтетическую питательную среду Курской биофабрики. Для культивирования перевиваемой линии клеток ПЭО, хронически инфицированных вирусом лейкоза КРС, применяли среды Игла, 199, гидролизат лактальбумина, ферментативный гидролизат мышечных белков (ФГМС), стерильную сыворотку крови северных оленей и лошадей. При изучении химического состава и физико-химических свойств полученных препаратов были использованы следующие методы: определение общего белка макрометодом Къельдаля, определение содержания нуклеиновых кислот по фосфору (Ф.М. Орлову 1973), весовой метод определения сухого остатка и золы, колориметрический метод определения полисахаридов (О.Д. Кушманова, Г.М. Ивченко, 1974), концентрацию липидов определяли после экстрагирования их эфир-но-этанольной смесью (Ю.Б. Филиппович, Т.А. Егорова, Г.А. Севастьянова, 1982), протеолитическую активность ферментов оценивали по расщеплению казеина (Негру-Водэ, 1973), гель-фильтрацию проводили на колонке 1,6 х 49 см с сефадексами и акриламид-агарозными гелями (Л.А. Зильбер, 1968), используя систему для жидкостной хроматографии фирмы «ЛКБ» (Швеция), ультрафильтрацию осуществляли на кассетной системе «Пелликон» фирмы «Милли-пор» (США). При отработке промышленных технологий изготовления диагно-стикумов использовали: химические реакторы емкостью 250-5000 литров, центрифуги К-70Д, электродиализатор «Родник-ЗМ», холодильные столы ХА-650/40 и НС700/50, сублимационные аппараты ТГ-50.4, установки ультрафильтрационные УПЛ-06 и УПВ-6, с аппаратами разделительными АР-0,2 и АР-2 с полыми волокнами ВПУ-15ПА и ВПУ-ЮОПА, промышленные автоклавы^ ферментеры «Гироген-300» и «Гироген-600» фирмы «Хемап» (Швейцария), фильтродержатели ФС-7, РФ-39, УСФ-293, низкотемпературные холодильники «Сгеп1ап(1» (Германия), микроскопы МБН-3, МБИ-6 и другое оборудование. В работе использовали бактериологические, вирусологические, серо

РОССИЙСКАЙ ГОСУДАРСТВЕН!-! БИБЛИОТЕК?-. логические и биохимические методы исследования, изложенные в соответствующих разделах. Достоверность полученных результатов оценивали с использованием критерия Стьюдента (H.A. Плохинский, 1980) и критерия знаков (Н.П. Ашмарин, A.A. Воробьев, 1962; Шевченко и соавт., 1970).

Собственные исследования I. Разработка промышленной технологии изготовления туберкулинов 1.1. Изучение влияния производственных штаммов на качество ту-беркулипов

Качество туберкулина в значительной степени зависит от штаммов мико-бактерий туберкулеза, которые используются для его получения. В разных странах приготовление туберкулина для млекопитающих ведется с использованием штаммов М. bovis и М, tuberculosis. Целью работы являлось проведение сравнительной оценки качества туберкулина, изготовленного с применением трех штаммов М. bovis и двух штаммов М. tuberculosis (полиштаммный туберкулин) и диагностикума для изготовления которого использован один штамм М. bovis (моноштаммный туберкулин).

При проведении испытаний использовали 9 серий моноштаммных туберкулинов, изготовленных по типу сухого очищенного (ППД) туберкулина, согласно технологической инструкции, утвержденной ГУВ МСХ СССР 10.12.70 г. Их активность при проверке на сенсибилизированных морских свинках соответствовала 50000 МЕ/мг Международного стандарта РРД-S. Аллергены испытывали на здоровом, больном туберкулезом и сенсибилизированном нетуберкулезными микобактериями крупном рогатом скоте. Дополнительно проводили качественную оценку специфичности туберкулинов в лабораторных условиях на морских свинках, инфицированных смесью атипичных микобактерий -М. Kansasii, М. scrofulaceum и M.intracellulare, взятых в равных количествах, сенсибилизированных М. bovis (штамм БЦЖ) и М. avium. При оценке видовой специфичности использовали полиштаммный и моноштаммный тубер-кулины для млекопитающих, ППД туберкулин для птиц и комплексный аллерген из атипичных микобактерий (KAM).

Крупному рогатому скоту аллерген вводили с помощью безигольного инжектора внутрикожно, на левой и правой сторонах шеи, однократно в дозах: туберкулины для млекопитающих и для птиц по 10000 ME, KAM 1350 ЕД в 0,2 мл растворителя. Реакцию на введение препаратов учитывали через 72 часа и. оценивали ее по утолщению кожной складки на месте введения. Реагирующими считали тех животных, у которых происходило утолщение кожной складки на 2 мм и более.

Морским свинкам вводили по «круговой» общепринятой для определения активности аллергенов схеме, одновременно все четыре аллергена внутрикожно в дозах: туберкулины - по 40 ME, KAM - поЮ ЕД в объеме 0,1 мл. Реакцию учитывали через 24 часа и оценивали ее по величине среднего диаметра папулы, образующейся на месте введения аллергена.

Результаты испытания аллергенов на морских свинках, сенсибилизированных различными микобактериями, представлены в табл. 1.

Таблица

Сравнительная оценка активности туберкулинов, изготовленных из различных штаммов микобактерий

Сенсибилизирующий агент Число сенсибилизированных животных N (число реагирующих животных) , -X + пГх (интенсивность реакции в мм.)

Туберкулины

Поли-штаммиый Моно-штаммный Для птиц KAM

Смесь атипичных микобактерий (М. Kansas«, М. scrofulaceum и М. intracellular«).^ И

9,5+1,3 7,8 + 0,6 8,4 + 0,6 11,5 + 0,

М. avium

8,7+1,0 8,0 13,0 + 0,7 12,9 + 0,

М. bovis . 11 11 И

БЦЖ) 10,8 + 0,7 11,5+0,6 9,1 + 1,4 ' 8,6 + 0,

Видовую специфичность аллергенов оценивали по формуле Magnusson (1962), которая предложена для изучения степени антигенного родства мико-бактерий: SPD = (Аа + Bb) - (Ab + Ва), где SPD - показатель видовой специфичности, Аа, ВЬ - средняя интенсивность реакций у животных, сенсибилизированных соответственно а и Ь, на гомологичные аллергены А и В; Ab, Ва -средняя интенсивность реакций у животных, сенсибилизированных соответственно b и а, на гетерологичные А и В.

При отсутствии различий в антигенной структуре, в данном случае видовой специфичности, SPD равен приблизительно нулю. Величина показателя SPD возрастает соответственно увеличению степени антигенных различий ми-кобактерий. При SPD ^ 3 мм разница считается существенной.

При проверке испытуемых туберкулинов на 170 животных из хозяйств, благополучных по туберкулезу, у которых ранее не отмечалось неспецифической сенсибилизации, ни в одном случае каких-либо изменений на месте введения препарата не обнаружено. Сравнительная оценка активности исследуемых туберкулинов на 241 животном из хозяйств Ставропольского края, неблагополучных по туберкулезу, показала, что 236 коров реагировали на моноштаммный туберкулин. Из них 235 реагировали одновременно на полиштаммный туберкулин. У 5 коров реакций не было.

Средняя интенсивность реакции на моноштаммный туберкулин составила (11,4 ± 0,5) мм, на полиштаммный -(11,6 ± 0,5) мм: У реагирующих на оба туберкулина в 43 случаях интенсивность реакции была одинаковой на оба препарата, у 96 коров реакции были выражены в большей степени на полиштаммный туберкулин, у других 96 - на моноштаммный, что указывает на полное отсутствие различий в проявлении реакций на эти аллергены у скота, больного туберкулезом.

Исследования, проведенные на 438 головах крупного рогатого скота, свободного от туберкулеза, однако сенсибилизированного нетуберкулезными ми-кобактериями, показали, что из числа животных, которые имели выраженную реакцию на KAM, реагировали на полиштаммный туберкулин 60 %, на моноштаммный - 50 %. Реакция на KAM была более выражена, чем на каждый из испытуемых туберкулинов.

Результаты испытания показали, что у этих животных полиштаммиый аллерген вызывает достоверно более выраженную реакцию (р < 0,05).

При оценке реакции у морских свинок, сенсибилизированных атипичными или птичьими микобактериями, показатель видовой специфичности (SPD) для полиштаммного туберкулина составил соответственно 4,2 и 6,0; для моно-штаммного - 6,6 и 7,4. У животных, сенсибилизированных атипичными микобактериями, этот показатель для туберкулина птиц составил 3,2.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что все использованные в исследованиях аллергены обладают видовой специфичностью: на гомологичный аллерген реагируют больше животных и с более выраженной интенсивностью реакции. Наиболее высокая видовая специфичность установлена у моно-штаммного туберкулина.

Таким образом, было установлено, что туберкулин, изготовленный из одного штамш М. bovis «8» обладает высокой специфичностью, активностью и по видовой специфичности превосходит туберкулин, приготовленный из штаммов М. bovis и М. tuberculosis. С учетом результатов исследований, проведенных нами совместно с А.Н. Шаровым, B.C. Тыриной, В.А. Алехиным с 1982 года при производстве туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих стал использоваться только один штамм М. bovis «8».

По усовершенствованной технологии Государственной Курской биофабрикой выпущено 3591 млн. доз туберкулина для млекопитающих, отличающегося от ранее выпускаемых препаратов более высокой видовой специфичностью.

1.2. Оценка некоторых методов и режимов культивировапия мико-бактерий туберкулеза при производстве туберкулина очищенного для млекопитающих и их влияние на иммунобиологические и биохимические характеристики препарата

В условиях промышленного производства туберкулина очищенного ППД для млекопитающих при культивировании микобактерий бычьего вида на жидкой синтетической питательной среде имеют место случаи диссоциации R-формы культуры в S-форму. При этом наблюдаются изменения, характеризующиеся увлажнением бактериальной пленки на поверхности питательной среды, появлением свисающих от нёе ослизненных тяжей, значительной оналесценци-ей питательной среды уже на 20-30 сутки культивирования. При пересевах микобактерий На картофельную среду Павловского наблюдается рост мелкозернистых, увлажненных, блестящих колоний. В мазках из такой культуры, окрашенных по Цилю-Нильсену, наряду с кислотоустойчивыми бактериями обнаруживали большое количество неокрашенных клеток. Согласно нормативно-технической документации при обнаружении диссоциации исходной культуры микобактерий она выбраковывается и в производстве не используется, что влечет за собой значительные финансовые потери.

Для выяснения причин, вызывающих диссоциацию культур в процессе производства, изучали влияние таких факторов, как:

- pH питательной среды;

- концентрация L-аспарагина, являющегося основным источником азота для М. bovis, изготовленного по технологии НПО «Биолар» - (Латвия) из малеинового ангидрида и L-аспарагина, произведенного из фумаро-вой кислоты в Венгрии;

- присутствие D-изомеров аспарагина в питательной среде;

- использование для производственного засева матриксной расплодки разных генераций с различной скоростью роста.

Проведенными исследованиями было установлено, что оптимальной для выращивания микобактерий на синтетической питательной среде является слабокислая среда с рН-6,5. В слабощелочной среде скорость роста микобактерий замедляется. Однако, изменение pH питательной среды не влияло на диссоциацию R-формы М. bovis в S-форму. Нам не удалось установить причину диссоциации микобактерий и при сокращении количества L-аспарагина в питательной среде до 20 %. Но было отмечено, что рост микобактерий в первых 3-4 генерациях замедлялся из-за адаптации культуры к новым условиям обитания. В посевах М. bovis на синтетическую питательную среду с D - и L-аспарагином (в равных долях) отмечалось замедление развития культуры с последующей ее гибелью на 15-20 сутки культивирования.

Характер роста четырнадцати последовательных пассажей культуры М. bovis на синтетической питательной среде с L-аспарагином, полученным разными способами из малеинового ангидрида или из фумаровой кислоты (контрольный) при 8 - недельном культивировании, не изменялся. После стерилизации культур автоклавированием накопление бактериальной массы в куль-туральной жидкости испытуемой среды составило 1,8 ± 0,4% , ш = 0,2, при этом отмечено некоторое увеличение количества бакмассы начиная с шестой генерации культуры от 1,5 до 2,1 %. В контрольной питательной среде накопление бакмассы составило 1,5 ± 0,2%. Концентрация белка в испытуемой среде составляла 56,7 ± 6,4 мг% , 6 = 10,6; m = 2,9, что практически не отличалось от такового показателя в контрольной среде 55,8 ± 7,2мг%. Выход готового препарата с одного литра питательной среды составил в опыте 682,8± 145,9 доз, ö ~ 172,4; m = 61,6 и 680 ± 180 доз в контроле. Существенной зависимости этого показателя от числа генераций культуры не отмечено. Концентрация белка в полученном туберкулине составляла 79,8 ± 3,7%,<5= 4,9, m = 1,6; полисахаридов - 8,3 ± 3,5%,6= 4,6; m = 1,5, липидов - 4,7 ± 1,9%6= 2,5; ш = 0,8, РНК-0,09 ± 0,06%, 6 = 0,08; m = 0,02. При этом биохимические показатели контрольных серий практически не отличались от испытуемых. Проверка испытуемых серий туберкулина на интактных морских свинках и здоровом крупном рогатом скоте показала, что препарат не обладает реактогеиными свойствами. При оценке сравнительной активности туберкулинов, проведенной на 230 головах больного туберкулезом крупного рогатого скота, из 12 серий испытуемого туберкулина 8 серий по активности соответствовали контрольной серии препарата, а 4 серии превосходили контрольную серию по интенсивности вызываемой ими реакции у больных животных. По количеству животных в группах, реагирующих на испытуемые и контрольную серии туберкулина, статистически достоверной разницы не установлено. Результаты сравнительной оценки интенсивности реакции, учитываемой по толщине кожной складки у больного туберкулезом крупного рогатого скота на испытуемые и контрольную серии препарата, показывали равноценную интенсивность реакции при применении всех 12 серий туберкулина.

Опыты по применению в качестве матриксной производственной рас-плодки культур микобактерий разных генераций и культур, обладающих различной скоростью роста, позволили установить зависимость диссоциации производственных культур от количества их генераций на синтетической питательной среде.

При культивировании на синтетической питательной среде М. bovis с первой по четырнадцатую генерации, культуры образовывали на поверхности среды нежную сухую складчатую пленку на 14-15 сутки культивирования, а культуры последующих генераций образовывали сплошную пленку на 8-12 сутки и к 14-15 суткам пленка становилась грубой, в последующих генерациях такой культуры наблюдали рост микобактерий в S-форме.

Аналогичные результаты получены при использовании для производственных посевов культур в ранних (4-8) генерациях, которые образовывали на поверхности синтетической питательной среды характерную для матриксной культуры пленку уже на 7-10 сутки, при этом культуры последующих генераций уже к-20-30 суткам культивирования давали характерные для S-форм изменения. ' " В мазках из колоний S-форм, окрашенных по Цилю-Нильсеиу, обнаруживали до 10 % видоизмененных, некислотоустойчивых микобактерий.

Биохимический состав и биологическая активность ППД-туберкулинов, полученных из фильтратов культуральной жидкости R- и S-форм микобактерий практически не отличались, однако при определении видовой специфичности туберкулинов, изготовленных из диссоциированных форм М. bovis, установлено снижение видовой специфичности препарата до 20 %.

По результатам проведенных нами совместно с В.Е. Козловым, E.H. Солодовым, В.А. Алехиным, Н.Т. Гречкиной, К.Н. Ауштровой исследований в нормативно-техническую документацию на производство туберкулина очищенного ППД для млекопитающих внесены изменения, направленные на недопущение диссоциации производственной расплодки и ограничение количества допустимых последовательных генераций матриксной и производственной ра-илодки.

1.3. Изучение процесса электродиализного обсссоливания растворов туберкулина и его масштабирование в технологии изготовления биопрепарата

Одной из проблем при промышленном производстве очищенного ППД туберкулина является удаление остаточного сульфата аммония из раствора белков. Применение диализа связано с расходом больших объемов очищенной охлажденной воды (10 тыс. м3/год) при низкой производительности и использовании исключительно ручного труда. Кроме того, при очистке туберкулинов методом диализа в течение длительного времени (от 48 до 50 часов) происходит бактериальная контаминация растворов белка,, что в последующем влияет на появление протеазной активности в растворах туберкулопротеина.,

Усовершенствование технологии получения туберкулинов было направлено на разработку электродиализа для освобождения растворов туберкулинов от сульфата аммония. Электродиализный метод успешно используют для очистки сточных вод различных химических и гальванических производств, а также в пищевой и фармацевтической промышленности (Мазитов Ю.А. 1976; Медведев И.Н., Нефедова Г.В., Смагин В.Н. и др., 1985; Конарев A.A., Прохода Е.Ф., Данисевич М.И. и др., 1996).

Однако в литературе нет сведений использования электродиализа для освобождения от сульфата аммония биологических систем, в частности, растворов туберкулинов. После очистки растворов туберкулинов методом диализа ос-, таточная концентрация сульфата аммония в растворе белков составляет от 0,02 до 0,03 %, что обеспечивает его удельную электропроводность (от 5 до 7) ■ 10~

Ом"' • м"1, аналогичную водопроводной воде. Более глубокое обессоливание раствора может быть достигнуто электродиализом.

При изучении возможной степени обессоливания при сохранении приемлемого выхода по току установлено, что с повышением степени обессоливания раствора туберкулина заметно снижается эффективность использования тока, а следовательно, повышается энергоемкость процесса. Так, при степени обессоливания 94 % энергоемкость процесса составляет 180 Вт-ч-л"1, а при степени обессоливания 98,6 или 99,7 % она возрастает до 282 и 330 Вт-ч-л"' соответственно. Остаточная концентрация сульфата аммония в растворе после электродиализа при степени обессоливания 99,6-99,7% составляет от 0,014 до 0,017 %, а удельная электропроводность (от 4 до 4,5)-] О 2 Ом*1 • м'-1 ,что существенно ниже по сравнению с диализом. При этом достигается приемлемый выход по току от 58 до 60 %.

Электродиализ раствора сульфата аммония протекает с большим выходом по току, чем его обессоливание в присутствии туберкулинов с высокой молекулярной массой, составляющей от 104 до 105 дальтон. Это позволяет предположить, что исследуемые белки образуют адсорбционные слои на поверхности раздела мембрана/раствор, затрудняющие массоперенос сульфата аммония через мембраны, но не снижающие показатели процесса в течение длительной эксплуатации мембран. По удельной электропроводности растворов туберкулинов в ходе электродиализа контролировали окончание процесса, так как на конечной стадии электродиализа наблюдается линейная зависимость удельной электропроводности раствора белков от концентрации в нем соли (рис. 1).

Электродиализной очистке подвергали производственные растворы туберкулинов с различным содержанием в них сульфата аммония. Концентрация последнего изменялась от 2,1 до 4,4 %. При этом было установлено, что электродиализ протекает с большим выходом по току при возрастании концентрации соли в растворе в исследованном интервале. При этом снижается энергоемкость процесса и удельная производительность аппарата.

Обессоливание растворов туберкулинов с меньшим содержанием сульфата аммония от 2,1 до 3,2 % целесообразно проводить при меньшей плотности тока - 0,5 А/дм2.

В результате проведенных экспериментальных исследований подобраны оптимальные условия для электродиализного обессоливания раство-(К-10) Ом'1-м

Рис 1. Зависимость удельной электропроводности раствора туберкулина от концентрации сульфата аммония при температуре + 20 °С ров туберкулинов от сульфата аммония, обеспечивающие выход по току от 65 до 76% и энергоемкость процесса от 232 до 250 Вт.ч/л: плотность тока от 0,5 до 1,0 А/дм2, температура от 15 от 20°С, линейная скорость раствора в камерах обессоливания от 2,3 до 3,0 см-с"1 и степень обессоливания от 99,5 до 99,7%, которые были апробированы на пилотной установке с целью масштабирования процесса, получения данных для проектирования и создания промышленной электродиализной установки (табл. 2). Из табл. следует, что выход по току и удельная производительность аппарата практически не зависят от масштабирования процесса и составляют соответственно от 52 до 76 % и от 2,0 до 4,0 л/м2 ч. Наибольший выход по току сульфата аммония достигается при плотности тока 0,5 А/дм2 и концентрации соли в растворе от 4,0 до 4,4%. При этом энергоемкость процесса составляет от 250 до 260 Вт-ч-л1, а качество туберкулинов соответствует требованиям ТУ 46-21-902-85.

Таблица

Сравнительные результаты по электродиализной очистке растворов туберкулинов на лабораторной и пилотной установках

Лабораторная установка Пилотная установка

Степень обессоли-вания % Выход по току, % Удельная производительность, л/м2 ч Степень обессоли-вания % Выход по току, % Удельная производительность, л/м" ч

99Д 72,5 5,6 99,0 74,0 5,

99,4 52,2 4,0 99,3 55,4 4,

99,7 52,0 4,0 99,7 52,4 4,

99 4 65,0 4,2 99,3 64,8 4,

99,7 59,0 3,9 99,6 60,0 4,

99,7 76,0 2,1 (¡=0,5 А/дм3) 99,7 75,6 2,0 0=0,5 А/дм2) - модельный раствор сернокислого аммония - концентрация сульфата аммония в растворе белков 4,0 %

По результатам исследований электродиализного удаления сульфата аммония из раствора туберкулина на лабораторной и пилотной установках на Курской биофабрике, разработана технология очистки туберкулинов и создана промышленная установка с использованием электродиализатора «Родник-ЗМ».

Удаление сульфата аммония из производственных растворов туберкулина, содержащих 1,0-1,2% белка и 2,1-4,5% сульфата аммония, проводили методом электродиализа в многокамерном аппарате - электродиализаторе фильтрпрессного типа, состоящего из чередующихся мембран типа МК-40 и МА-40, с промежуточными рамами из паронита и сепараторами-турбулизаторами. Катодом служила пластина из нержавеющей стали марки Х18Н10Т с рабочей поверхностью 1,0 дм2, анодом - платинированный титан с той же площадью.

Очищаемый раствор туберкулинов из промежуточной емкости насосом прокачивали через камеры обессоливания электродиализатора по замкнутому циклу с определенной линейной скоростью, регулируемой в интервале (от 0,5 до 3,0) см с"1. Одновременно через камеры концентрирования из промежуточной емкости насосом прокачивали водопроводную воду по замкнутому циклу с линейной скоростью 1,5 см-с"!. Электродиализ проводили при температуре от 15 до 20 °С. Этот температурный режим поддерживали подачей в рубашки промежуточных емкостей холодной воды из термостата.

После обеспечения циркуляции раствора туберкулинов и «концентрата» через электродиализатор на его электроды подавали постоянный ток, соответствующий плотности тока от 0,5 до 2,0 А/дм2. Окончание электродиализа определяли при температуре +20 °С по величине удельной электропроводности (от 4 до 6)'Ю*2 Ом"'-м"'.

Таким образом, был исследован процесс электродиализного обессоливания растворов туберкулинов от сульфата аммония и на основании полученных результатов разработана его технология, которая внедрена в промышленное производство туберкулинов на Курской биофабрике. Внедрение в производство туберкулинов, приготовленных на основе электродиализной технологии обессоливания р&створов белков, позволило интенсифицировать процесс очистки (вместо 48-50 по существующей диализной технологии процесс протекает за 22,5 часа), сократить количество сточных вод в 18-20 раз и улучшить условия труда за счет механизации процесса.Технология отработанная нами совместно с A.A. Коноревым, Н.С. Шевыревым, В.Е. Козловым, Л.Д. Ничвеевой, E.H. Солодовым, является частью патента № 2031656, РФ, «Способ получения туберкулина», 1992 г.

1.4- Разработка типовой промышленной технологии изготовления ППД-туберкулина для млекопитающих в едином разведении.

Изучение иммунобиологических свойств диагностикума при длительном хранении

Производственный цикл изготовления туберкулина длителен и энергоемок, при этом используют большие объемы экологически вредной трихлорук-сусной кислоты (ТХУК). Энергоемкость изготовления биопрепарата резко возрастает из-за необходимости сублимационной сушки. Кроме того, при производстве сухого туберкулина, из-за накопления в воздухе пылевых частиц ту-беркулопротеина, происходит аллергизация персонала биофабрики. Сухой туберкулин необходимо выпускать в комплекте с растворителем. При этом вдвое возрастают затраты на транспортировку препарата. Приготовление раствора туберкулина в едином разведении непосредственно в хозяйствах часто связано с нарушением методики получения стандартного раствора требуемой биологической активности.

Как свидетельствуют Е. Zawets, J.L. Meinick, Е.А. Adelberg (1980), в мировой практике при использовании туберкулинов приоритет отдается препаратам в стандартном растворе со сроком годности, достаточным для их использования.

Поэтому в процессе наших исследований решались задачи экологической безопасности изготовления Туберкулина, увеличения его выхода из куль-турального фильтрата, получения стандартного диагностикума в едином разведении, сохраняющего свои иммунобиологические свойства при длительном хранении.

Мембранная технология при изготовлении туберкулина применялась в разных странах (Seibert F., 1949; Affronti L., Ling A. et al., 1988; Collins F., Lamb J.R., Joang D.B., 1988). Исследователи отмечали высокие диагностические свойства полученных препаратов, однако эти работы носили экспериментальный характер.

Нами, совместно с Н.С, Шевыревым, Л.Д. Ничвеевой, E.H. Солодовым, В.Е. Козловым, А.АГПриневым и др. (патент № 2035914, 1993 г.) предложена промышленная технология получения туберкулина из культуральиого фильтрата предварительно сконцентрированного на половолоконных установках УПВ-6 с аппаратами разделительными АР-2, включающими полые волокна ВПУ-15ПА и имеющими номинально отсекаемую молекулярную массу (НОММ) 15 кДа.

В процессе десятикратного концентрирования происходило относительное снижение содержания в препарате низкомолекулярных примесей.

При более высокой степени концентрирования наблюдались значительные потери белка. Уменьшение же степени концентрирования при последующем осаждении белка вызывало увеличение расхода ТХУК.

Увеличение концентрации культуральиого фильтрата в 10 раз соответственно снижало количество ТХУК, необходимой для осаждения белка. Во столько же раз уменьшалось количество едкого натра, необходимого для последующей нейтрализации надосадочной жидкости, подлежащей утилизации.

Концентрирование культуралыюй жидкости позволило достичь экономии дефицитных и дорогостоящих химреактивов, улучшить санитарно-гигиенические условия труда, уменьшить загрязнение окружающей среды.

Из полученного концентрата культуральной жидкости М. bovis белок осаждали 50 % раствором ТХУК.

При разработке промышленной технологии изготовления ППД туберкулина в едином разведении нами было установлено снижение концентрации белка и биологической активности препарата в процессе его хранения.

Значительное снижение концентрации белка и падение активности в препаратах туберкулина в едином разведении могло быть связано с сорбцией белков на стекле флаконов, с разрушением белка при хранении или с воздействием ферментов, находящихся в растворе туберкулина.

При изучении возможности сорбции туберкулопротеина на внутренней поверхности флаконов было установлено, что в процессе хранения растворов туберкулина при температуре 25 °С количество органических веществ и общего азота не изменялось, в то же время концентрация белка и соответственно белкового азота снижалась. При этом содержание остаточного азота увеличивалось. Таким ^образом, было установлено, что азотсодержащие компоненты туберкулина не исчезают из раствора.

Таблица

Характеристика органических веществ, белка и азота в растворе туберкулина при разных условиях хранения (п=8)

Наименование пробы Биохимические показатели

Концентрация органических веществ, мг/мл Концентрация белка, мг/мл Концентрация общего азота, мг% Концентрация остаточного азота, мг%

Исходная проба 10,60 + 0,45 8,03 + 0,27 154,10 ±0,90 25,60 + 0,

Проба после хранения при 4 °С в течение 21 суток 10,73 + 0,32 7,22 + 0,19 154,10 + 1,00 38,50 ± 0,

Проба после хранения при 25 "С в течение. 21 суток 10,70 + 0,40 5,21 ±0,20 154,10 ± 1,00 70,65 ±0,

В этих исследованиях не было установлено сорбции белка на стекле и выявлен факт расщепления белков ППД туберкулина. При определении характера расщепления белка (химического или ферментативного) изучали сохранение концентрации белка и биологической активности туберкулина в автоклави-рованных препаратах с разной концентрацией фенола, глицерина и хлористого ндтра. В результате проведенных экспериментов установлено, что автоклавиро-ванный белок во всех вариантах растворителей сохранялся в растворе в постоянной концентрации, при этом активность туберкулина не снижалась. Эти данные дали возможность предположить, что расщепление белка происходит под воздействием ферментов.

Следует отметить, что на нестабильность растворов ПИД туберкулина уже указывали в своих работах S. Philip et al. (1978), Е. Javets et al. (1980), S. Landi, H.R. Held (1983). При этом первые объясняли основную причину нестабильности растворов туберкулина сорбцией белков на стенках флаконов, а вторые - денатурацией туберкулопротеина за счет окисления его кислородом воздуха. Проведенные нами исследования показали, что основной причиной расщепления белков в туберкулинах являются протеолитические ферменты, источником которых может быть микрофлора, контаминирующая белковый раствор в процессе его осаждения, переосаждения и диализа. Последующая стерилизующая фильтрация раствора освобождала препарат от бактерий, но ферменты оставались в нем. Опыты по прямому определению протеазной активности в растворах туберкулина подтвердили их способность расщеплять белки (например казеина). Степень расщепления раствора туберкулопротеина при хранении оценивали методом гель-хроматографии. Хроматограмма ППД туберкулина имела 3 пика. Белок свежеприготовленного раствора ППД в основном выходил во втором пике, это соответствовало белкам с молекулярной массой (М.М.) от 30 до 60-103 дальтон. При хранении препарата, белки ППД туберкулина рест-риктировались и хроматограмма постепенно изменялась - основная масса белков выходила уже в третьем пике, содержащем низкомолекулярные белки (М.М. < 104 дальтон). В своей работе мы не ставили цель определить конкретный тип протеиназ, участвующих в расщеплении белков, но вопрос их инактивации при промышленном производстве диагностического препарата является очень актуальным. Учитывая термолабильность присутствующих в растворах туберкулина протеиназ, нами определено влияние температурной обработки белка на стабильность препарата при хранении. При этом установлено, что 1-8 часовое кипячение туберкулинов стабилизировало белок при хранении. Прогрев в течение 15-40 мин. лишь замедлял расщепление белка, причем обнаруживалась обратная зависимость: чем короче период температурного воздействия, тем меньше белка оставалось в пробе в процессе хранения.

Очень важным для промышленного производства представляется факт снижения концентрации белка туберкулина ППД при длительном (более 4 час.) прогреве. В этих условиях происходит денатурация туберкулопротеина, а биологическая активность препарата снижается на 10-15%. Учитывая отрицательное влияние воздействия высокой температуры на структуру белка туберкулина ППД, нами был разработан режим термоинакгивирования протеиназ при промышленном изготовлении туберкулина в едином разведении. Концентрация белка и его активность при этом оставались в процессе хранения постоянными.

Исходя из результатов проведенных исследований, нами совместно с Н.С. Шевыревым, Л.Д. Ничвеевой, E.H. Солодовым, В.Е. Козловым, A.A. Сорокиной, В.А. Алехиным, А.Н. Шаровым, B.C. Тыриной, Н.К. Буковой разработана типовая промышленная технология изготовления туберкулина очищенного для млекопитающих в едином разведении, которая схематически изображена на рис. 2.

С 1989 по 1999 гг. Курской биофабрикой выпущено 1078 млн. доз туберкулина очищенного для млекопитающих в едином разведении. Все изготовленные серии успешно прошли биологический контроль па соответствие требованиям ТУ 46-21-902-85 и выпущены для практического применения. Рекламаций на качество биопрепарата предприятие-изготовитель не получало.

При разработке типовой промышленной технологии изготовления ППД туберкулина требуется экспресс-контроль содержания белков на различных этапах получения туберкулопротеина. Для определения концентрации белка в стандартных растворах туберкулина при анализе готовой продукции используют метод Къельдаля. Однако этот метод требует значительных временных затрат, поэтому не может быть использован при экспресс-анализе растворов белка в процессе производства препарата. Значительные количества органических примесей и пептидов в культуральной жидкости не позволяют применять другие известные методы определения концентрации белка - биуретовую реакцию и рефрактометрию, как недостаточно чувствительные. Результаты анализов, выполненных методом Лоури и Бредфорда, находятся в прямой зависимости от аминокислотного состава исследуемого белка. Поглощение в УФ-области применимо только к растворам известных белков в стандартных буферных системах при отсутствии в них органических примесей.

Учитывая эти обстоятельства, нами совместно с Л.Д. Ничвеевой, В.Е. Козловым, Н.С. Шевыревым разработан фотометрический метод определения концентрации белков в разбавленных растворах, основанный на измерении оптической плотности рассеивающих взвесей (Д = 2 — I, где I - коэффициент пропускания) после перевода белков анализируемого образца в нерастворимое состояние при добавлении ТХУК. Содержание белка в испытуемых растворах устанавливается с помощью калибровочной кривой, построенной по пробе с известной концентрацией белка. Постановка реакции заключается в добавлении к предварительно разбавленной пробе равного количества 20 % раствора ТХУК. При этом в течение одной минуты образуется стабильная мелкодисперсная взвесь. Оптическая плотность взвеси, измеренная на фотоэлектроко-лориметре при длине волны

Д,=540 нм, прямо пропорциональна концентрации белка.

Чувствительность метода достаточно велика и в наших опытах лимитировалась характеристиками фотоэлектроколориметра КФК-2. Достоверно концентрации белка определяли в интервале 0,02-0,2 мг/мл.

Однако, при работе с растворами белка, имеющими концентрации 0,3мг/мл и более, сразу после добавления ТХУК начинается быстрое образование хлопьевидного осадка, что исключает возможность измерения оптической плотности. Поэтому с целью определения концентрации белка в концентрированных растворах необходимо проводить предварительное разведение проб.

Рис. 2. Графическая схема типовой технологии изготовления туберкулина очищенного для млекопитающих.

Разработанный экспресс-фотометрический метод успешно применяется на Курской биофабрике при проведении научно-исследовательских работ и определении белка в сырье, полуфабрикатах и готовых туберкулинах.

1.5. Усовершенствованный способ получения «УФ-туберкулина очищенного для млекопитающих» с использованием мембранной технологии

Широко применяемый для диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных туберкулин очищенный для млекопитающих, представляет собой очищенные от полисахаридов и ингредиентов питательной среды белки культуральной жидкости микобактерий туберкулеза бычьего вида. Белок из культурального фильтрата осаждают ТХУК, сернокислым аммонием с последующей очисткой его путем многократных переосаждений указанными реактивами или этанолом и другими растворителями. Такая методика применяется во многих странах мира, осуществляющих изготовление препарата. При этом полученный туберкулин представляет собой смесь фракций разной молекулярной массы: от низкомолекулярных пептидов до высокомолекулярных белковых соединений. На различных технологических этапах происходят большие потери белка. Эти потери составляют (по отношению к исходному содержанию белка в культуральном фильтрате): при осаждении ТХУК до 42 %, сульфатом аммония до 30 %, при диализе до 4 %. Применение при производстве препарата агрессивных химических веществ, сбрасываемых затем в канализацию, оказывает неблагоприятное воздействие на окружающую среду.

Задачей наших исследований было получение туберкулина, состоящего из наиболее активной и специфичной части белкового спектра культуральной жидкости возбудителя туберкулеза бычьего вида. При этом предусматривалось, чтобы технологический процессе был непрерывным и не применялись химические реактивы для осаждения белковой фракции. Нами в соавторстве с Н.С. Шевыре.вым, В.Е. Козловым, Л.Д. Ничвеевой, E.H. Солодовым, А.Н. Шаровым, Н.К. Буковой, B.C. Тыриной была исследована возможность получения туберкулина для млекопитающих с помощью ультрафильтрационного фракционирования культуральной Жидкости штамма М. bovis «8», выращенного на синтетической питательной среде Курской биофабрики. Работу проводили на кассетной системе «Пелликон» фирмы «Миллипор» (США) и установках УПВ-6 на полых волокнах. Для отделения крупномолекулярной полисахаридной фракции применяли кассеты с мембранами типа РТНК с НОММ (100 ± 10) кДа. При ультрафильтрационном разделении культуральной жидкости М. bovis на мембране РТНК фильтрат содержал 90 % белков культуральной жидкости, а в концентрате накапливались крупномолекулярные полисахариды. При этом степень концентрирования равнялась 50.

Концентрат, содержащий соединения с молекулярной массой более 100 кДа, отбрасывали, а пермеат с соединениями менее 100 кДа фракционировали на полых волокнах ВПУ-15ПА с задерживающей способностью (15 * 1,5) кДа. В процессе десятикратного концентрирования происходило относительное снижение содержания в препарате низкомолекулярных соединений, а концентрат содержал туберкулопротеин с молекулярной массой от 15 до 100 кДа. Из фракций культуральной жидкости с молекулярной массой более 100 кДа и от 15 до 100 кДа было изготовлено по 5 серий туберкулина в виде стандартных растворов, содержащих в 1 см3 - 1 мг белка, (0,85+0,25) % хлорида натрия, (10+0,25) % глицерина и (0,3+0,015) % фенола. Полученные серии туберкули-нов подвергли стерилизующей фильтрации и расфасовали во флаконы вместимостью 10 и 20 см3. Белковая фракция культуральной жидкости с молекулярной массой менее 15 кДа оказалась непригодной для приготовления туберкулина, так как содержала низкую концентрацию этих белков , а также большое количество солей и компонентов синтетической питательной среды, которые должны быть удалены из готового препарата. Поэтому дальнейшие исследования по получению туберкулина из белковой фракции с молекулярной массой менее 15 кДа не проводили.

Все изготовленные серии туберкулинов с разной молекулярной массой оценивали на активность в сравнении с референтной серией туберкулина ППД для млекопитающих в соответствии с ГОСТ ¡6379-88 «Туберкулин очищенный

ППД) для млекопитающих» и на видовую специфичность в соответствии с ТУ 10-19-518-87 «Аллерген сухой очищенный комплексный из атипичных мико-бактерий (KAM)», Результаты исследований отражены в табл. 4.

При оценке туберкулинов с молекулярной массой от 15 до 100 кДа, проведенной на морских свинках, сенсибилизированных культурой БЦЖ, установлена их биологическая активность (49500±500) ME/мл, что составляет от 99 до 100 % активности референс-серии туберкулина. Таким образом изготовленные серии диагностикума по активности соответствовали требованиям ГОСТ. Сравнительная оценка активности туберкулинов, содержащих белковые фракции молекул.ярной массой более 100 кДа, в сравнении с референтной серией ППД туберкулина для млекопитающих показала, что содержание МЕ в испытуемых препаратах практически одинаково и составляет от 49500 до 50000 МЕ з в 1 см

Таблица

Биологическая характеристика туберкулинов, полученных из фракций культуральной жидкости с разной молекулярной массой серии Молекулярная масса туберкулина, кДа Биологическая активность (МЕ/см3) Коэффициент активности видовой специфичности

1-5 Более 100 от 49500 до 50000 от 0,99 до 1,00 от 1,05 до 1,

6-10 От 15 до 100 от 49500 до 50000 от 0,99 до 1,01 от 0,80 до 0,

И Контрольная рефе-ренс-серия ППД туберкулина для млекопитающих 50000 1,00 1,

Видовая специфичность туберкулинов, содержащих белковые фракции с молекулярной массой менее 100 кДа, оказалась более выраженной, чем препарата с молекулярной массой более 100 кДа. При этом количество морских свинок, сенсибилизированных атипичными микобактериями и реагирующих на введение туберкулина, было меньше в 1,5 раза, а кожная реакция у этих животных была слабее в 1,2 раза.

Таким образом было установлено, что активность белков культуральной жидкости М. bovis не зависит от молекулярной массы, а видовая специфичность туберкулопротеина повышается с уменьшением молекулярной массы белка. Следовательно, удаление из туберкулина гликопротеидной фракции с молекулярной массой более 100 кДа повышает его видовую специфичность. Целесообразность удаления из туберкулина крупномолекулярных белковых фракций была нами доказана совместно с Е.В. Масловым и В.Е. Козловым при изучении иммуногенной активности различных фракций туберкулина ППД для млекопитающих. При этом было установлено, что при гель-фильтрации туберкулина очищенного для млекопитающих основная масса белков выходит во втором хроматографическом пике.

Крупномолекулярная фракция туберкулина, соответствующая первому пику при гель-фильтрации, составляет менее 6 % всех белков. До 15 % белка выходит в третьем пике.

Методами прямого и конкурентного ИФА определяли количество антител к различным фракциям туберкулина ППД в сыворотке крови телят до и после туберкулинизации. Было установлено, что антитела к белкам туберкулина обнаруживались у телят уже после первого введения туберкулина ППД. При этом показано, что эти антитела реагировали в основном с фракцией туберкулина ППД, соответствующей при гель-фильтрации крупномолекулярным белкам первого пика. Менее выраженная реакция наблюдалась при взаимодействии антител с белками, элюированными во втором белковом пике, низкомолекулярные белки третьего пика не обладали серологической активностью.

Результаты исследования свидетельствуют о значительных различиях в индукции гуморального иммунного ответа различными фракциями туберкулина ППД, что подтверждает целесообразность удаления из него крупномолекулярной фракции белков, которая обладает выраженной антигенной активностью и снижает качество препарата.

В результате проведенных работ была предложена технология получения «УФ-туберкулина», защищенная патентом Российской Федерации № 2045959, 1992 г. Технология получения препарата схематически изложена на рис. 3.

Рис 3. Графическая схема технологии изготовления «УФ-туберкулина» для млекопитающих

2- Разработка промышленной технологии изготовления питательной среды ФАСТ-ЗЛ для ускоренного выделения микобактерий туберкулеза из биологических материалов

Для выделения микобактерий требуются элективные питательные среды, в основном плотные яичные среды Левенштейна-Иенсена, Гельберга, Петрань-яни, Финн-2 и другие. Основным недостатком этих питательных сред является то, что первичный рост микобактерий бычьего вида появляется через 1-2 месяца, кроме того, рост микобактерий медленный и скудный.

В 1996 году JI.M. Ходуном, JT.B. Погуляевой, JI.A. Таллер, Н.И. Овеяно-вым предложена питательная среда для выделения и культивирования микобактерий туберкулеза из биоматериалов животных. Среда получила название ФАСТ-ЗЛ. Она готовится на основе среды Гельберга с добавлением жидких углеводородов и обладает повышенными ростовыми свойствами, это обстоятельство повышает эффективность лабораторной диагностики туберкулеза у животных. При посеве биоматериала от животных, инфицированных возбудителем туберкулеза бычьего или человеческого видов, видимый рост культур на среде ФАСТ-ЗЛ появляется через 10-20 суток после посева. Плотные яичные питательные среды Гельберга, Петраньяни, Левенштейна-Йенсена готовят непосредственно в ветеринарных лабораториях согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных». Питательная среда ФАСТ-ЗЛ рекомендована Департаментом ветеринарии МСХиП РФ в качестве элективной питательной среды при диагностике туберкулеза животных. Однако «Наставлением по диагностике туберкулеза животных»(1986 г.) и Дополнением к нему (1995г.) не определены показатели качества питательных сред и методы их контроля. Кроме того, питательную среду ФАСТ-ЗЛ готовили и использовали только в нативиом виде. Поэтому нами совместно с Л.М. Ходуном, А.Н. Шаровым, Н.С. Шевыре-вым, Н.Т. Гречкиной, H.H. Дорохиным разработана промышленная технология изготовления питательной среды ФАСТ-ЗЛ в лиофилизированном виде. При оптимизации технологических режимов изготовления питательной среды нами регламентированы требования к химическим ингредиентам, подготовке компонентов питательной среды, их стерилизации. Определена последовательность и режимы смешивания ингредиентов в больших объемах. Предложена технология оптимальной стерильной расфасовки жидкой среды во флаконы вместимостью 200 мл по 50 мл (13 доз). Разработаны режимы стабилизации биологических свойств среды методом сублимационной сушки. Перед высушиванием флаконы с жидкой средой в кассетах замораживали в низкотемпературных холодильниках типа НС при температуре от минус 40 до минус 50 °С в течение 18-20 ч. Терморежим замораживания контролировали температурными датчиками, помещенными во флаконы. Затем кассеты с замороженным материалом перегружали в предварительно подготовленный сублиматор ТГ-50.4. После герметизации сублиматор вакуумировали до остаточного давления от 100 до 250 мкм. ртутного столба. Сублимация проходила в автоматическом режиме. Давление в камере при сублимации и подогреве продукта до температуры досушивания равной 25 °С поддерживали на уровне 200 мкм. ртутного столба. Время сублимации и досушивания составляло 20 ч. Общая продолжительность сушки была от 46 до 48 часов. По окончании процесса высушивания камеру заполняли сухим очищенным воздухом. Флаконы в стерильных условиях закрывали пробками АБ, одевали алюминиевые колпачки и обкатывали на закаточных полуавтоматах.

Разработанная технология обеспечивает выпуск стерильной, стандартизированной по ростовым свойствам, лиофильно высушенной питательной среды ФАСТ-ЗЛ. Основные показатели качества среды и требования к ней изложены в разработанных нами ТУ 9385-106-00494185-96, по которым с 1996 года Курская биофабрика начала ее серийный выпуск.

3. Разработка новой промышленной технологии изготовления антигена BJI для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии и ее техническая реализация

Известные методы получения антигенов ВЛ КРС, как правило, характеризуются особыми условиями культивирования вируссодержащих клеток, повышенными требованиями к составу питательных сред, а также многооперационным концентрированием антигенов.

Реакция иммунодиффузии в геле позволяет использовать в качестве антигена белковую субстанцию, выделенную из фильтрата при культивировании перевиваемой линии клеток ПЭО, хронически инфицированных вирусом лейкоза КРС. На Курской биофабрике нами совместно с А.Ф. Валиховым, A.A. Сорокиной, Н.С. Шевыревым, В.Е. Козловым, Н.В. Киселевым, Л.И. Рыбниковой, О.Ю. Коноревым, В.М. Вороновой отработана оригинальная промышленная технология, позволяющая получать высокоактивный и специфичный антиген ВЛ для РИД.

В качестве вируссодержащей культуры использовали линию клеток ПЭО. В проведенных нами исследованиях было установлено, что использование для размножения клеток ПЭО традиционных питательных сред - Игла и 199 с гид-ролизатом лактальбумина не всегда обеспечивает получение диагностикума требуемого качества. Коммерческие серии гидролизатов, как правило, нестандартны по своему составу и в большинстве случаев имеют повышенное содержание белка, что оказывает отрицательное влияние на качество получаемого антигена. Для решения этой проблемы был отработан состав питательной среды не содержащий гидролизата лактальбумина, но обогащенный аминокислотами, L-глютамином и витаминами. Это позволило в значительной степени повысить ростовые свойства культуры и ее антигенпродуцирующую способность.

Сравнительные исследования качества сывороток крови различных животных (лошадей, северных оленей, крупного рогатого скота), применяемых для производства антигена ВЛ КРС, позволили установить, что сыворотка крови северных оленей после термообработки в лучшей степени удовлетворяла требованиям культуры клеток почки эмбриона овцы и обеспечивала более высокий уровень продукции вирусного антигена.

Традиционный метод размножения клеточных культур в монослое (стационарным и роллерным способами) достаточно хорошо отработан на предприятиях биологической промышленности и, тем не менее, он сопряжен с определенными технологическими трудностями. Требуется большое число биобутылей, роллерных установок, значительные площади термостатных помещений,, моечных комнат и т.д. Для решения этой проблемы нами были применены ферментеры, типа «Гироген 300» и «Гироген 600» (фирмы «Хемап», Швейцария), позволяющие осуществлять размножение клеточных культур в монослое роллерным способом на стеклянных трубках («Гироген 300» содержит 134, «Гироген 600» - 268 трубок из стекла «Пирекс»), Ростовая поверхность трубок составляет для «Гирогена-300» -17 м2, для «Гирогена 600» - 34 м2. Для культивирования клеток ПЭО в ферментерах использовали те же питательные среды, что и для выращивания клеток в бутылях. При этом была оптимизирована посевная концентрация клеток, которая составила (от 40 до 80)-104/мл. Поддержание заданного значения pH в пределах от 7 до 7,2 осуществляли автоматической подачей в «Гироген» воздуха или углекислоты. Обеспечение оптимальной температуры культивирования осуществляли также с помощью автоматического режима посредством подогрева рубашки «Гирогена» водой из термостата с соответствующей температурой. Культивирование клеток проводили со скоростью вращения трубок от 8 до 10 оборотов в час, в течение 7-10 суток, в зависимости от используемых пассажей клеток и накопления антигена вируса лейкоза в культуральной жидкости.

Отработанные технологические режимы культивирования клеток в ферментерах, порядок подготовки ферментеров к эксплуатации, их мойки и стерилизации изложены в разработанной нами технологической документации. Размножение клеточной культуры ПЭО в ферментерах позволило стандартизировать антиген ВЛ КРС по серологической активности.

При крупномасштабном производстве антигена ВЛ КРС его выделение и концентрирование из больших объемов культуральной жидкости вызывает определенные трудности. На первых этапах наших исследований мы применяли метод преципитации антигена с помощью раствора сульфата аммония и осаждения этанолом. Следует отметить, что оба метода оказались малопригодными при промышленном производстве диагностикума. Освобождение растворов антигена от сульфата аммония диализом сопровождалось денатурацией отдельных фракций белков и выпадением их в осадок на стенках полупроницаемой мембраны, что затрудняло процесс обессоливания и приводило к значительным потерям препарата. Препараты антигена, полученные этим методом, плохо растворялись в процессе их использования. Осаждение антигена с помощью этанола снижало его выход, при этом расходовались большие объемы спирта. В дальнейших исследованиях для получения антигена ВЛ КРС мы применили метод ультрафильтрации сначала на установке «Пелликон» (фирмы «Миллипор») с кассетами РТвС 00005, а затем на ультрафильтрационных установках отечественного производства УПВ-6 с полыми волокнами ВПУ-15ПА. Для осветления культуральной жидкости (освобождения от клеточного детрита) использовали центрифугирование при 1500-3000 g в течение 30 минут и температуре от 18 до 20 °С. Кроме того, опытным путем были подобраны титановые фильтры с диаметром пор от 1 до 4 мкм, которые обладали хорошей фильтрационной способностью и полностью удовлетворяли требованиям технологии. Осветление культуральной жидкости с помощью предварительной фильтрации в значительной степени повышало производительность ультрафильтрации в отработанном нами режиме. Фильтрат концентрировали на полых волокнах ВПУ-15ПА, при этом удалялись белки с молекулярной массой менее 15 кДа.

Одним из основных показателей качества диагностикума лейкоза является сохранение его биологической активности в течение срока хранения. Поэтому перед нами стояла задача оптимизации режимов стабилизации препарата методом сублимационной сушки (в зависимости от объема расфасовки, температурного режима процесса сублимации, содержания белка в исходном препарате и др). Работы по изысканию оптимальных режимов стабилизации биологической активности антигена BJI КРС проводились совместно с A.A. Сорокиной, H.H. Дорохиным, В.Е. Козловым, Н.С. Шевыревым. Для отработки режима использовали ресуспендированный фосфатным буфером концентрат культу-ральной жидкости, полученный методом ультрафильтрации и расфасованный во флаконы по 5 см3. Перед высушиванием кассеты с флаконами, содержащими антиген BJI, помещали в низкотемпературные холодильники типа ZA или НС и замораживали до 45 °С в течение 6-8 ч. при постоянной работе вентилятора. Температуру в процессе замораживания контролировали датчиками, помещенными во флаконы (температурный график представлен на рис. 4). После этого кассеты с замороженным материалом загружали в предварительно подготовленную сублимационную установку, подсоединяли необходимые датчики. Сублимацию осуществляли в вакуумсушильных аппаратах промышленного типа ТГ-50.4 и LZ-45. После загрузки сублиматор герметизировали и вакуумиро-вали до остаточного давления в камере , составляющего от 100 до 280 мкм рт.ст. Сублимация проходила в автоматическом режиме, согласно разработанного нами графика сушки (рис. 5). Давление в камере при сублимации и подогреве продукта до температуры досушивания (25 °С) поддерживали на уровне 280 мкм ртутного столба. При этом время сублимации и досушивания составляло не менее 18 ч. Общая продолжительность высушивания составляла от 48 до 50 ч. После окончания процесса высушивания камеру заполняли сухим очищенным воздухом или азотом. Флаконы закрывали пробками УЛ-1 в сублиматоре, а пробками АБ в настольном боксе, накрывали алюминиевыми колпачками и обкатывали на закаточном полуавтомате;

При оптимизации условий сублимационной сушки было установлено, что на содержание остаточной влажности (в пределах от 1 до 3 %) в сублимированном препарате существенную роль оказывает концентрация белка в исходном материале, а также использование для укупорки флаконов разных модификаций пробок АБ или УЛ-1. Было отмечено, что при высушивании в аппарате ТГ-50.4, где подогрев осуществляется с помощью глизантина, а флаконы укупориваются пробками УЛ-1 прижимными плитами без прерывания технологического процесса, остаточная влажность была ниже,

-10 -20 -30 -40

Температура материала в центре кассеты -Температура в холодильной камере

Рис. 4 Температурный график замораживания антигена вируса лейкоза КРС (кассеты дистанциированы по высоте)

Рис. 5 График

Сушки антигена вируса лейкоза КРС, расфасованного в ленициллиновые флаконы по 5 мл чем при высушивании в аппарате LZ-45, где подогрев осуществлялся с помощью электрических тенов, а укупоривание пробками АБ в настольном боксе. Дальнейшими исследованиями установлено, что серологическая активность высушенного препарата не снижается в процессе лиофилизации и сохраняется в течение 5 лет (срок наблюдения). Антиген BJ1 КРС, стабилизированный сублимационной сушкой, удобен для практического применения и транспортировки в любое время года.

Набор для диагностики лейкоза крупного рогатого скота включает в себя разбавитель, специфическую преципитирующую сыворотку (СПС), отрицательную контрольную сыворотку (ОКС), положительную контрольную сыворотку (ПКС), слабоположительную контрольную сыворотку (СПКС), положительную контрольную сыворотку с антителами к антигену BJ1 р-24 (ПКС р-24), солевую смесь агара (ССА), разбавитель ССА. Технология изготовления антигена ВЛ КРС схематически представлена на рисунке 6. Она позволяет выпускать в промышленном масштабе до 40 млн. доз антигена для РИД в год и выявлять антитела в сыворотке крови животных как к внутреннему полипептиду ВЛ КРС р-24, так и к оболочечному гликопротеиду вируса - gp51. РИД в геле агара с: использованием антигена ВЛ и в настоящее время остается единственным диагностическим методом, используемым в ветеринарной практике, по результатам которош проводятся оздоровительные и профилактические мероприятия в неблагополучных по лейкозу хозяйствах. Внедрение в производство отработанной в условиях биофабрики технологии промышленного производства ди-агностикума лейкоза КРС позволило обеспечивать в полном объеме потребности ветеринарной службы России и стран СНГ в этом препарате.

Разработанный способ получения антигена BJI КРС защищен патентом Российской Федерации № 2020960, 1992 г. В период с 1985 по 1999 гг. биофабрикой выпущено 223,3 млн. доз диагностикума (табл. 5).

Рис. 6.

Схема промышленной технологии изготовления антигена ВЛ КРС

Таблица 5.

Объем производства наборов для серологической диагностики лейкоза КРС на Государственной Курской биофабрике.

Год Изготовлено диаг-ностикума, (млн.доз) Количество серий Средний объем серии, (тыс.доз)

1985 0,13 3 43,

1986 0,19 2 95,

1987 1,66 8 207,

1988 10,09 36 280,

1989 17,76 60 296,

1990 21,63. 72 300,

1991 30,21 109 277,

1992 29,63 103 287,

1993 16,76 59 284,

1994 23,53 100 235,

1995 24,25 85 285,

1996- 13,34 50 266,

1997 15,44 53 291,

1998 18,68 69 270,

Всего . 223,30 809 276,

4. Экологическая характеристика разработанных технологий производства диагностикумов ;»

Одной из основных задач современного биологического производства является его экологическая безопасность, недопущение попадания во внешнюю среду даже минимальных количеств производственных вредных веществ. Поэтому в процессе проведения научно-исследовательских работ мы уделяли особое внимание сокращению или полному исключению из технологии процессов, оказывающих неблагоприятное воздействие на окружающую среду.

В связи с тем, что в производстве туберкулина используют патогенные микобактерии, технологическими режимами предусматриваются условия, предотвращающие загрязнение микобактериями рабочей зоны и их выброс в окружающую среду. Для обеспечения таких условий нами разработаны «Правила требований техники безопасности, производственной санитарии, охранно-карантинного и ветеринарно-санитарного режимов на Курской биофабрике».

В процессе исследований по подбору оптимальных штаммов микобакте-рий, используемых в производстве туберкулина очищенного для млекопитающих, наряду с получением моноштаммного туберкулина, обладающего большей видовой специфичностью; из технологии исключено четыре штамма, в том числе два штамма возбудителя туберкулеза человеческого и два бычьего вида. Это существенно повысило безопасность работы по культивированию мико-бактерий туберкулеза.

При изготовлении туберкулина на различных стадиях технологического процесса, связанных с выделением белковых фракций, диализом, сублимационной сушкой возможно попадание различных количеств аллергена и химических ингредиентов в окружающий воздух и воздействие их на работающих. Поэтому, разрабатывая типовую промышленную технологию изготовления тубер-кулинов для млекопитающих, мы предложили и внедрили в промышленное производство способ получения туберкулина в едином разведении, при этом исключили из технологии процесс сублимационной сушки, способствующий загрязнению воздуха рабочей зоны пылевыми частицами туберкулопротеина. Промышленная технология электродиализа туберкулина на установке «Родник-ЗМ» позволила не только сократить расход охлажденной очищенной воды на 10 тыс. м3 в год, но и сократило время протекания открытого технологического процесса-диализа с 48 до 4 ч., что способствовало резкому сокращению попадания аллергизирующих веществ в рабочую зону.

Использование метода концентрирования культуральной жидкости М. bovis на ультрафильтрационных установках позволяет снизить в 10 раз расход ТХУК и тем самым сократить сброс со сточными водами этого эколотически вредного вещества. Также нами предложен и внедрен Способ нейтрализации раствора ТХУК 40 % раствором гидроксида натрия.

Наиболее перспективной в обеспечении экологической безопасности при производстве туберкулинов является технология изготовления УФ-туберкулинов с использованием мембранной технологии, которая обеспечивает закрытую систему технологических процессов ультрафильтрации. Это позволяет получать туберкулин не только стандартизированный по молекулярной массе, но и исключить из технологии до 10 тонн ТХУК и 15 тонн сернокислого аммония в год, что существенно улучшает экологический фон при производстве туберкулинов.

Несмотря на то, что возбудитель лейкоза крупного рогатого скота относится по патогенности к четвертой группе микроорганизмов, при разработке промышленной технологии изготовления антигена ВЛ КРС мы особое внимание уделяли недопущению попадания вирусного материала в Окружающую среду. С этой целью отработана аппаратурная технология крупномасштабного культивирования клеток ПЭО, хронически инфицированных вирусом лейкоза КРС в ферментерах «Гироген-300» и «Гироген-600», позволившая осуществлять технологию культивирования и последующую стерилизацию вируссодер-жащего материала в закрытой системе, исключающей попадание вируса лейкоза КРС в окружающую среду.

Отходы производства, содержащие живой вирус лейкоза, не использованные в процессе приготовления конечного продукта, инактивировали 0,2 М раствором гидроокиси натрия, до поступления их в канализационную систему.

Разработанная мембранная технология ультрафильтрационного концентрирования культуральной жидкости на установках УПВ-6 взамен метода осаждения, исключает использование в технологии сернокислого аммония - источника аммонийного азота, количество которого строго лимитируется в сточных водах.

Разработка и внедрение в производство диагностикумов туберкулеза и лейкоза КРС современных природоохранных технологий, наряду с организацией мониторинга состояния окружающей среды, осуществляемого санитарно-гигиенической лабораторией биофабрики, и проведением систематического контроля за состоянием здоровья персонала предприятия позволяют существенно повысить экологическую безопасность современного биотехнологического производства.

Выводы

1. Разработана типовая современная промышленная технология производства туберкулина очищенного ППД для млекопитающих, обеспечивающая:

- сохранение высокой активности и видовой специфичности диагности-кума, полученного на основе одного штамма микобактерий бычьего вида; г применение ультрафильтрационного концентрирования .культурапь-ной жидкости перед выделением туберкулопротеина;

- использование экономичного процесса электродиализного обессоли-вания раствора туберкулопротеина на промышленной установке «Род-ник-ЗМ»;

- стабилизацию биохимических и биологических свойств туберкулина в едином разведении при длительном хранении.

2. Туберкулин очищенный ППД для млекопитающих, изготовленный из одного штамма микобактерий бычьего вида, активен и по своей видовой специфичности превосходит туберкулин, в производстве которого использованы одновременно штаммы микобактерий бычьего и человеческого видов.

3. Установлена зависимость диссоциации М. bovis из R- в S- форму при промышленном культивировании микобактерий от количества их генераций на синтетической питательной среде. Диссоциация культур М. bovis снижает видовую специфичность туберкулинов, изготовленных на основе этих культур.

4. Разработана промышленная технология электродиализного обессоли-вания растворов туберкулопротеина от сульфата аммония, которая позволяет в 10 раз интенсифицировать процесс производства препарата и в 18 раз снизить расход очищенной воды при сохранении биологической активности диагности-кума.

5. Предложен экспресс-метод фотоэлектроколориметрического определения концентрации белков в разбавленных растворах, чувствительность которого составляет 0,01 мг/мл.

6. Впервые разработана мембранная технология получения «УФ-туберкулина» очищенного для млекопитающих, позволяющая осуществлять его стандартизацию по молекулярной массе.

7. Установлено, что биологическая активность белков культуральной жидкости М. bovis не зависит от их молекулярной массы. Низкомолекулярные белки обладают более выраженной видовой специфичностью. Высокомолекулярная гликопротеидная фракция туберкулина с молекулярной массой более 100 кДа индуцирует у животных синтез специфических антител и снижает видовую специфичность диагностикума.

8. Разработана и внедрена в промышленное производство технология изготовления специфичного антигена для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии. Технология предусматривает: использование оптимизированной питательной среды с сывороткой крови северных оленей или лошадей, аппаратурное культивирование клеток линии ПЭО, хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота в промышленных ферментерах «Гироген-300» и «Гироген-600», концентрирование и стандартизацию антигена BJI с использованием мембранных методов, сублимационную сушку антигена.

9. Впервые разработана промышленная технология, оптимизированы условия изготовления и сублимационной сушки элективной питательной среды ФАСТ-ЗЛ, которая позволяет осуществлять ускоренную индикацию микобак-терий - возбудителей туберкулеза в патологическом материале.

10. Разработанные и внедренные в производство новые промышленные технологии изготовления диагностикумов туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота позволяют существенно повысить экологическую безопасность современного биотехнологического производства.

Практические предложения

По результатам исследований разработана и утверждена в установленном порядке нормативно-техническая документация на промышленное изготовление и контроль диагностикумов туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота:

- «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих», ТУ 46-21-90285, ГОСТ 16739-88, инструкция по изготовлению и контролю, утверждена ГУВ МСХ СССР 30.12.85 г., дополнения и изменения инструкции по изготовлению и контролю, утвержденые ГУВ Госагропрома СССР 02.10.87 г., ГУВ при Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию 04.04.90г. и 10.12.90г.;

- «Аллерген сухой очищенный комплексный из атипичных микобакте-рий (KAM)», инструкция по изготовлению, утверждена директором ВГНКИ ветпрепаратов 02.10.93 г.;

- «Набор для серологической диагностики лейкоза КРС в РИД» ТУ 1019-442-87, Временная инструкция по изготовлению и контролю, утверждена ГУВ МСХ СССР 25.05.87 г.;

- «Среда питательная ФАСТ-ЗЛ», ТУ 9385-106-00494185-96, инструкция по изготовлению, утверждена директором Государственной Курской биофабрики и директором ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных 12.04.96 и 16.04.96 г.

Промышленные технологии изготовления диагностикумов туберкулеза и лейкоза КРС внедрены на Государственной Курской биофабрике.