Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, доктор медицинских наук Микшис, Наталья Ивановна

• Микшис, Наталья Ивановна
• доктор медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Микшис, Наталья Ивановна

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные факторы патогенности и иммуногенности сибиреязвенного микроба и их генетическая детерминация

1.2. Сибиреязвенные вакцины - прошлое, настоящее и будущее 41 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, бактериофаги и плазмиды, использованные в работе

2.2. Питательные среды, реактивы и лабораторные животные

2.3. Методы исследования

2.3.1. Определение видовых признаков В. аШкгаЫя

2.3.2. Определение способности к синтезу капулы сибиреязвенных культур

2.3.3. Определение протеолитической, гемолитической активности, способности к пигментсинтезу и сорбции конго, красного

2.3.4. Микроскопическое исследование клеток штаммов В. аШЬгаш

2.3.5. Определение способности сибиреязвенных культур к споруляции

2.3.6. Определение стабильности свойства аспорогенности

2.3.7. Приготовление споровой взвеси

2.3.8. Определение ЛД50 бациллярных штаммов для морских свинок, беспородных белых мышей и мышей линии ВАЬВ/с

2.3.9. Определение иммуногенности штаммов и препаратов белка

2.3.10. Методы генетического обмена - трансдукция, конъюгация штаммов В. anthracis, трансформация бациллярных штаммов

2.3.11. Элиминация плазмид, транспозонный мутагенез

2.3.12. Выделение плазмидных ДНК штаммов В. anthracis и

В. subtilis

2.3.13. Рестрикция ДНК плазмид '

2.3.14. Конструирование гибридной плазмиды с клонированным геном pag сибиреязвенного микроба

2.3.15. Определение стабильности гибридных плазмид in vitro и in vivo

2.3.16. Метод полимеразной цепной реакции

2.3.17. Исследование белкового состава культуральных фильтратов'

2.3.18. Выделение и очистка Sap

2.3.19. Выделение и очистка ЕА

2.3.20. Выделение и очистка ПА из рекомбинантного штамма В. anthracis

2.3.21. Определение концентрации белка в препаратах

2.3.22. Получение иммунных сывороток и специфических антител к ПА и белкам S-слоя

2.3.23. Биохимические и электронно-микроскопические методы идентификации белков S-слоя

2.3.24. Иммунохимические реакции - иммуноблот, рекция радиальной преципитации, дот-анализ, твердофазный ИФА

2.3.25. Статистические методы '

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЭФФЕКТИВНЫХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ

3.1. Поиск дополнительных факторов патогенности и иммуногенности В. anthracis хромосомной детерминации

3.1.1. Изучение феномена популяционной гетерогенности штаммов В. anthracis по экспрессии хромосомных признаков

3.1.2. Выяснение влияния отдельных спонтанных хромосомных мутаций на вирулентность В. anthracis

3.1.3. Экспериментальная оценка влияния экспрессии протеоли-тической активности на иммуногенность штаммов возбудителя сибирской язвы '

3.2. Получение набора спонтанных и1 индуцированных мутантов

В. anthracis с нарушенной способностью к образованию спор

ГЛАВА 4. ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ БЕЖОВ S-СЛОЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

4.1. Селекция эффективных продуцентов белка S-слоя - Sap

4.2. Получение очищенных препаратов белков S-слоя сибиреязвенного микроба

4.3. Идентификация выделенных белков в качестве компонентов S-слоя. В. anthracis

4.4. Определение иммуногенного потенциала белков S-слоя возбудителя сибирской язвы

ГЛАВА 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ БАЦИЛЛЯРНЫХ ШТАММОВ С КЛОНИРОВАННЫМ ГЕНОМ СИНТЕЗА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

5.1. Разработка подходов к созданию рекомбинантных штаммов, продуцирующих протективный антиген В. anthracis

5.2. Конструирование гибридных плазмид, содержащих ген pag

5.3. Получение стабильных рекомбинантных штаммов с высокой продукцией протективного антигена сибиреязвенного микроба

ГЛАВА 6. КОНСТРУИРОВАНИЕ АСПОРОГЕННОГО РЕКОМБИ-НАНТНОГО ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

6.1. Получение стабильного аспорогенного рекомбинантного штамма В. аШкгаЫз, продуцирующего протективный антиген

6.2. Оптимизация технологии выделения и очистки протективного антигена из аспорогенного рекомбинантного штамма В. аШкгаЫэ

ГЛАВА 7. ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БАЦИЛЛЯРНЫХ ШТАММОВ И СИНТЕЗИРУЕМЫХ ИМИ ИММУНОГЕННЫХ АНТИГЕНОВ

7.1. Оценка иммунологической эффективности рекомбинантных штаммов с клонированным геном

7.2. Характеристика защитных свойств рекомбинантного протективного антигена

7.3. Перспективы практического использования белков Б-слоя возбудителя сибирской язвы, рекомбинантных штаммов В. аШИгаЫБ и синтезируемого ими протективного антигена

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов»

Актуальность исследования. Bacillus anthracis — грам-положительный, спорообразующий микроорганизм, вызывающий опасное зооантропонозное инфекционное заболевание, поражающее восприимчивых животных и людей. Ежегодно практически во всех регионах мира, и особенно в странах Азии, Африки, Южной Америки и Европы, регистрируются многочисленные случаи сибиреязвенной инфекции. До 60 годов прошлого столетия падеж сельскохозяйственных животных от сибирской язвы достигал катастрофического уровня. Так в Иране в 1931 г. и 1944 - 1945 гг. погибло в общей сложности 2 млн. овец, что составило 15 % поголовья страны (Шляхов Э.Н., 1960). G введением-вакцинации и распространением профилактических ветеринарно-санитарных и агрохимических мероприятий наметилась тенденция к улучшению ситуации. Однако даже при условии поддержания относительного благополучия на эндемичных территориях, вспышки сибиреязвенной инфекции возникают постоянно, нанося серьезный экономический ущерб (Галкин В.В. с соавт., 2007):

Эпидемическая обстановка по сибирской язве находится в прямой зависимости от эпизоотической ситуации (Бургасов П.Н., 1984). Заражение человека происходит обычно при контакте с заболевшими животными или инфицированными продуктами и сырьем животного происхождения. От пути проникновения возбудителя зависит симптоматика и острота инфекционного процесса. Для аэрогенного заражения характерен высокий уровень летальности, достигающий при неблагоприятных условиях 85 - 100 % (Brachman Р. et al., 1966; Albrink W. et al., 1960; Sirisanthana T. et al., 1984). Гастроинтестинальная форма занимает промежуточное положение по тяжести течения заболевания. При проникновении микроба через кожу на' первое место выходят местные воспалительные и некротические реакции, вместе с тем, описаны случаи сибиреязвенного карбункула со смертельным исходом (Макаров Н.И. с соавт., 1963). При отсутствии или недостаточности профилактических мероприятий на эндемичной' территории сибиреязвенная- инфекция может стать причиной массовых заболеваний людей. На фоне пренебрежения к мерам профилактики инфекции в Зимбабве в

1978 - 1979 гг. произошла крупнейшая вспышка сибирской язвы, охватившая почти 10 тысяч человек и унесшая около 450 жизней (Davies J., 1982, 1983, 1985).

Данные мониторинга за развитием эпидемической ситуации в России свидетельствуют о неуклонном росте неблагополучных по сибирской язве территорий — около 35 тысяч к настоящему времени (Онищенко Г.Г., 2008). Расширение нозоареала патогенного микроорганизма, способного длительно сохраняться и накапливаться в окружающей среде, может привести к увеличению эпидемических проявлений сибиреязвенной инфекции. Возникновению чрезвычайных ситуаций в России способствуют тенденции к снижению масштабов иммунизации сельскохозяйственных животных и населения- групп риска, ухудшению надзора за скотомогильниками, отсутствию должного ветеринарного контроля за поступающим в продажу или на производство сельскохозяйственным сырьем (Черкасский Б.Л. с соавт., 2002). В'период с 2003 по 2007, гг. было зарегистрировано 43 подтвержденных случая заболевания сибирской язвой людей, из них 3-е летальным исходом (Государственный доклад, 2007; Онищенко Г.Г., 2008). П овышение уровня заболеваемости отмечалось в 2004 году- 16 случаев в 5 областях Российской1 Федерации, что в 2,7 раза больше показателя предыдущего года (Ясинский A.A. с соавт., 2005). В 2005 и 2006 гг. по данным официальной статистики Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека зарегистрировано, соответственно, 12 и 6 случаев сибирской язвы у людей (Информационный бюллетень "ЗНиСО", 2007).

Высокая патогенность сибиреязвенного микроба в сочетании с уникальной устойчивостью споровых форм к воздействию факторов внешней среды, ставят его в разряд крайне опасных биологических агентов, имеющих потенциальную угрозу применения в качестве оружия массового поражения (Spencer R., Wilcox М., 1993; Redmond С . et al., 1998; Spencer R., LightfootN., 2001). Осуществленная в 2001 году рассылка контаминированной спорами В. anthracis корреспонденции вызвала панику среди населения США и привела к гибели пяти человек от легочной формы заболевания. Всего за время «почтового» терроризма было одиннадцать подтвержденных случаев ингаляционной формы сибирской язвы и столько же - кожной (Jernigan J. et al., 2001; Bush L. et al., 2001; Brachman P.; 2002).

Учитывая легкость аэрозольного распространения возбудителя сибирской язвы и длительность его сохранения в окружающей среде, нельзя недооценивать последствий техногенных катастроф на объектах повышенной биологической опасности. Ярким подтверждением тому явился произошедший в 1979 году в Свердловске прецедент проникновения контагиозных спор В. anthracis через систему вентиляции. Распространение спор в-радиусе нескольких километров стало причиной массовой заболеваемости людей и животных с высоким процентом летальности (Безденежных И.С., Никифоров В.Н., 1980; Abramova F. et al., 1993; Meselson M. et al, 1994; Walker D. et al., 1994).

В системе ветеринарных и медико-санитарных мер, направленных на обеспечение эпидемиологического благополучия по сибирской язве, центральное место принадлежит вакцинации сельскохозяйственных животных и людей. Рекомендованные для иммунопрофилактики живые вакцины получены в середине прошлого столетия классическими способами аттенуации вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы. Преимущество живых сибиреязвенных вакцин - создание длительного и напряженного иммунитета. Однократное подкожное введение одной дозы распространенной в мире ветеринарной вакцины В. anthracis Sterne 34F2 защищает животных от заражения возбудителем сибирской язвы в течение года (Turnbull Р., 1991). В России живая вакцина на основе штамма В. anthracis СПАЛ используется для профилактики сибирской язвы у людей. После однократного накожного применения СТИ-1 адаптивный иммунитет формируется у 50 - 60 % вакцинированных и сохраняется до 5 месяцев только в 15 % случаев. Двукратная схема иммунизации повышает эффективность до 87,5 % (Онищенко Г.Г. с соавт., 1999). В практике ветеринарной медицины применяется штамм В. anthracis 55, полученный специалистами.Всесоюз-ного научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии на основе природного бескапсульного изолята'(Гаврилов В.А. с соавт., 1997). Существенным недостатком живых вакцин является относительно высокий уровень реактогенности (ТигпЬиИ Р. а1., 1986; Гуте В. а1., 1990; 81ерапоу А. еХ а1., 1996). Побочные эффекты связаны с воздействием на макроорганизм токсичных продуктов жизнедеятельности вакцинных штаммов.

Молекулярные механизмы сохранения иммуногенности и снижения вирулентности аттенуированных культур стали понятны после установления плаз-мидной детерминации синтеза основных факторов патогенности и иммуногенности В. апйггаск (ШкеБеИ Р. е! а1., 1983; вгееп В. е1 а1., 1985; исЫёа I. й а1., 1985). Геном возбудителя сибирской язвы включает высокомолекулярные реп-ликоны - рХ01 (182 т.п.н.) и рХ02 (93,5 т.п.н.). Как правило, аттенуация сопровождается элиминацией плазмиды рХ02, обусловливающей синтез капсулы. Отсутствие капсулы, защищающей микробную клетку от фагоцитоза, приводит к неспособности штамма вызывать развитие специфического инфекционного процесса в организме хозяина. Репликон рХ01 содержит детерминанты суа и 1е/, кодирующие синтез протективного антигена (ПА), отечного и летального факторов» (Октака Л. е1 а1., 1999): Отечный и летальный факторы, взаимодействуя-с протеолитически активированным ПА, формируют токсичные комплексы, вызывающие специфические структурные и функциональные изменения в макроорганизме (Ьерр1а Б., 1991). Вместе с тем, иммуногенный потенциал ПА сибиреязвенного микроба послужил основанием для создания на его основе химических вакцин.

Используемые в США и странах Западной Европы антигенные препараты менее реактогенны, чем вакцинные штаммы. Тем не менее, химические вакцины, ввиду особенностей технологии получения их компонентов из аттенуированных культур В. аШкгаЫя, неизбежно содержат минимальные примеси отечного и летального факторов (ТигпЬиИ Р. е! а1., 1991). Именно с данными продуктами связывают аллергические реакции, возникающие почти у 30 % вакцинированных в США людей. Описаны случаи некроза тканей на месте введения химической вакцины (8\уап8оп-В1еагтап В., Кгеп2е1ок Е., 2001). Бесклеточные вакцины индуцируют выработку антител в высоких титрах и в ранние сроки, но для поддержания напряженного иммунитета необходимы частые ревакцинации.

Непродолжительность защиты отчасти объясняется выраженной протеолитиче-ской деградацией ПА во время выделения, очистки и хранения.

В России для специфической профилактики сибирской язвы у людей и животных разработана комбинированная вакцина, представляющая собой композицию спор вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 и бесклеточного препарата ПА адсорбированного на геле гидроокиси алюминия (Садовой Н.В. с соавт., 1998; Кожухов В.В. с соавт., 2002). После изучения свойств сертифицированного препарата, сообщалось о его эффективности. В* ряде случаев уровень защиты экспериментальных животных превышал эффект от применения каждого из ее компонентов в отдельности (Пименов Е.В. с соавт., 2002): В ходе клинических испытаний у 80 % вакцинированных лиц отмечали сохранение напряженного иммунитета в течение 8 мясяцев (Шевцов А.Н. с соавт., 2007). Реактогенность комбинированной' вакцины определяется, в основном, свойствами входящего в нее штамма В. anthracis СТИ-1.

Перспективы создания нового поколения сибиреязвенных вакцинных препаратов связаны с современными достижениями биологической науки: новыми научно-методологическими подходами, углубленным изучением механизмов экспрессии и регуляции генов иммуногенности и вирулентности В. anthracis. Исследования в этой области в России и за рубежом направлены главным образом на повышение эффективности и снижение реактогенности вакцинных препаратов.

Опыт изучения генетических основ физиологии многих условно-патогенных и патогенных бактериальных видов показывает, что в инфекционном и иммунологическом процессах участвуют продукты как плазмидных, так и хромосомных генов, а также системы, координирующие их взаимодействие. В составе хромосомы возбудителя сибирской язвы идентифицированы детерминанты, продукты которых могут участвовать в обеспечении вирулентности микроорганизма (Fouet A. et al., 2000; Read T., Fraser С., 2003; Gat О. et al., 2005). Хромосомными генами кодируется синтез белков S-слоя В. anthracis (Etienne-Toumelin I. et al., 1995; Mesnage S. et al., 1997; Mock M., Fouet A., 2001). Внимание ученых к паракристаллическим поверхностным структурам вызвано вероятностью наличия у них иммуногенных свойств (Дебабов В.Г., 2004; Sleytr U., Messner P., 1988). По данным осуществленных на модели сибиреязвенного микроба биоинформационных и протеомных анализов белки S-слоя занимают прочное положение в перечне потенциальных иммуногенов хромосомной детерминации (Ariel N. et al., 2003; Chitlaru Т. et al., 2004; Gat О. et al., 2006).

Одним из наиболее развиваемых генетических и молекулярно-биологических направлений вакцинологии является клонирование детерминант синтеза факторов иммуногенности в гомо- и гетерологичных системах с целью создания живых вакцин и продуцентов протективных антигенов.

Кодирующий синтез ПА ген pag клонировали в штаммах различных бактериальных видов: Escherichia coli (Алимов А.П., Павлов В.М., 1995; Vodkin М., Leppla S., 1983; Gupta Р. et al., 1999; Chauhan V. et al., 2001); B. subtilis (Тедиков B.M., Добрица А.П., 1993; Ivins В., Welkos S., 1986; Baillie L. et al., 1998(a)); B. anthracis (Barnard J., Friedlander A., 1999; Cohen S. et al., 2000); Francisella tn-larensis (Дармов И.В: с соавт., 1999); Salmonella typhimurium (Coulson N. et al., 1994; Garmory Hf. et al., 2003; Stokes M. et al., 2007) и Lactobacillus casei (Zegers N. et al, 1999). В качестве экспрессирующих систем предлагались также вирусы (Iacono-Connors L. et al., 1991) и трансгенные растения (Azhar А. et al., 2002; Hull А. et al., 2005; Chichester J. et al., 2007). Однако далеко не во всех случаях удалось решить проблемы стабилизации гибридных молекул и оптимизации параметров экспрессии клонированных генов.

Современные достижения биологической и медицинской науки открывают новые возможности для целенаправленного создания профилактических препаратов. Конструирование вакцин должно проводиться с учетом полученных знаний о структуре антигенов и кодирующих их генов, молекулярных механизмах патогенетических и иммунных процессов. Все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы, целью которой является: разработка комплексного подхода к созданию средств специфической профилактики сибирской язвы на основе рекомбинант-ных технологий.

Задачи исследования:

1. На основании экспериментальных данных о факторах иммуногенности и патогенности возбудителя сибирской язвы хромосомной детерминации создать коллекцию оптимальных реципиентов для генетического конструирования штаммов-продуцентов биологически-значимых антигенов сибиреязвенного микроба.

2. Сконструировать стабильные авирулентные рекомбинантные штаммы-продуценты протективного антигена В. anthracis. Оценить эффективность продукции протективного антигена штаммами с клонированным геном pag.

3. Разработать подходы для безопасных и экологичных промышленных технологий получения протективного антигена сибиреязвенного микроба. Сконструировать стабильный аспорогенный.рекомбинантный штамм-продуцент протективного антигена, перспективный для производства основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.

4. Оптимизировать экспериментальную схему выделения и очистки протективного антигена, синтезируемого генно-инженерным продуцентом. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантного протективного антигена, осуществить его биохимическую и иммунохимическую характеристику. В экспериментах in vivo показать возможность применения рекомбинантного протективного антигена для осуществления специфической профилактики сибирской язвы.

5. Оценить иммуногенный потенциал белков S-слоя В. anthracis. Получить эффективные продуценты экскретируемого компонента S-слоя. Выделить, очистить, идентифицировать и охарактеризовать протеины Sap и ЕА1.

6. Изучить иммуногенность и остаточную вирулентность генно-инженерных штаммов в сравнении с лицензированными, препаратами живых сибиреязвенных вакцин. Оценить перспективы рекомбинантных штаммов в плане создания на их основе менее реактогенных живых вакцин.

7. Определить основные направления использования генетически сконструированных штаммов и синтезируемых ими биологически значимых белковых продуктов.

Научная новизна исследования:

С учетом фундаментальных знаний о факторах патогенности и иммуно-генности сибиреязвенного микроба и применением рекомбинантных технологий разработана комплексная экспериментальная система, включающая: а) протеа-зодефицитные и аспорогенные реципиентные штаммы В. а пЖгаЫя; б) сконструированные на их основе стабильные, эффективные и безопасные продуценты иммуногенных антигенов; в) перспективные для создания ареактогенной химической вакцины препараты протективного антигена- и компонентов» Э-слоя; г) генно-инженерный, штамм В. аШкгаЫэ, являющийся» прототипом менее реакто- • генной'живой сибиреязвенной'вакцины.

Впервые получены стабильные и эффективные генно-инженерные продуценты ПА на основе бесплазмидных производных отечественных вакцинных штаммов В. аМЬгаш СТИ-1 и В. апИггаЫБ 55.

Разработаны условия безопасной и экологичной технологии производства химической сибиреязвенной вакцины. Сконструирован не образующий спор стабильный рекомбинантный авирулентный штамм В. апЖгаыБ, продуцирующий ПА в 4 - 5 раз больше, чем вакцинные штаммы В. агйкгаЫБ СТИ-1 и В. аШкгаыз 55. Установлено, что двукратная иммунизация кроликов дозой 50 мкг очищенного препарата ПА, выделенного из аспорогенного рекомбинантного штамма В. аШкгасш 55ЛТПА-18ро~, обеспечивает защиту 100 % животных от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма В. аШкгаЫБ 81/1.

В экспериментах на лабораторных животных показана перспективность использования рекомбинантного штамма В. аЫЬгаыя СТИАТПА-1 для создания менее реактогенной и эффективной живой сибиреязвенной вакцины. Однократная иммунизация морских свинок дозой 5 • 107 спор сконструированных штаммов В. anthracis СТИЛТПА-1 и В. subtilis WB600IIA-1 вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к протективному антигену. Генно-инженерные штаммы не обладают остаточной вирулентностью для морских свинок и мышей линии BALB/c.

Впервые у штаммов возбудителя сибирской язвы обнаружены различия в продукции in vitro одного из белков S-слоя - Sap. Среди природных изолятов и аттенуированных производных В. anthracis обнаружены культуры, не продуцирующие Sap в среду выращивания. Показано, что условия температурной элиминации плазмид в лабораторных условиях способствуют возникновению спонтанных Sap" мутаций.

На' основании изучения вирулентности изогенных производных В. anthracis 81/1 установлено; что спонтанные мутации, приводящие к сочетанно-му нарушению протеолитической, гемолитической- активности, пигментсинтеза и пигментсорбции не вызывают значительного изменения патогенно сти штаммов В. anthracis. Спонтанные мутации, приводящие к смене фенотипа со споро-образующего на аспорогенный, сопровождаются снижением- почти на два порядка степени патогенности штамма для беспородных белых мышей. Результаты изучения вирулентности спонтанных аспорогенных мутантов, инсерционно-го Spo" мутанта и сконструированного Spo+ трансдуктанта свидетельствуют о влиянии на патогенность продуктов генов, находящихся в непосредственной близости от генов spo оперона или в функциональном взаимодействии с ними.

В основу эффективной селекции протеазодефицитных и аспорогенных штаммов В. anthracis положена выявленная корреляция экспрессии хромосомных признаков - протеолиза, гемолиза, пигментсорбции, пигментсинтеза и спорообразования.

Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена 7 патентами Российской Федерации на изобретения: №-2321628 - реком-бинантный.штамм В. anthracis СТИАТПА-1 (pUB110PA-l) - продуцент протек-тивного антигена сибиреязвенного микроба; № 2321629 - аспорогенный рекомбинантный штамм В. anthracis 55ДТПА-1 Spo" (pUBllOPA-1) - продуцент про-тективного антигена сибиреязвенного микроба; № 2180349, № 2180916, № 2180917 и № 2180350 — аспорогенные штаммы В. anthracis, являющиеся продуцентами- сибиреязвенных антигенов или реципиентами для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов; № 2193597 - способ получения аспорогенных штаммов В. anthracis.

Практическая ценность и формы внедрения:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирована-система штаммов В. anthracis, необходимая для изучения1 генетической детерминации факторов патогенности и иммуногенности возбудителя- сибирской* язвы, направленного конструирования продуцентов* биологически-значимых макромолекул, лабораторного и промышленного получения иммуногенных антигенов. сибиреязвенного микроба. Она включает 25 бациллярных штаммов, в том числе: а)-стабильные и .эффективные рекомбинантные продуценты ПА сибиреязвенного микроба, - В. anthracis СТИЛТПА-1 (КМ96), В. anthracis 55ДТПА-1 (КМ95) и В. subtilis WB600IIA-1 (КМ199); б) аспорогенный рекомбинантный продуцент ПА - В. anthracis 55ATIIA-lSpo" (КМ97); в) продуценты белка S-слоя (Sap) - В. anthracis Sterne HI и В. anthracis 71/12Н2 (КМ87 и КМ88); г) коллекцию реципиентных бесплазмидных штаммов для экспериментов по генетическому конструированию - В. anthracis 55ÀT (КМ92(2)) и его аспорогенный мутант (КМ92(3)), аспорогенный мутант В. anthracis СТИЛТ (КМ91), инсерци-онный аспорогенный мутант В. anthracis SterneAT (КМ90), спонтанный и ин-серционный Sap" мутанты В. anthracis SterneAT (КМ93 и КМ94); д) коллекцию из 11 изогенных штаммов В. anthracis - ди-, моно- и бесплазмидных производных В. anthracis 81/1 (КМ86(1-11)), различающихся по степени выраженности хромосомных признаков: протеолитической, гемолитической активности, способностей к- сорбции и синтезу пигмента, спорообразованию; е) спонтанные аспорогенные мутанты вакцинных штаммов В. anthracis Sterne 34F2 и В. anthracis 55 (КМ89 и КМ92).

Перечисленные штаммы использовались при выполнении НИР "Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (2001 - 2002 гг.), "Разработка и совершенствование средств и методов профилактики и лечения опасных и особо опасных заболеваний" (2002 - 2004 гг.) в рамках Федеральных целевых научно-технических программ: «Создание методов и средств защиты населения и среды обитания от опасных и особо опасных патогенов в чрезвычайных ситуациях природного и техногенного характера", "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники". С применением депонированных штаммов проведены: хоздоговорная НИР с НИИ микробиологии МО1 РФ - "Получение аспорогенных производных вакцинных штаммов В. anthracis" (2000J г.), а также плановые НИР: "Изучение хромосомных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы" (1997 - 2001 гг.), "Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (2002 - 2004 гг.), «Использование препаратов протективного антигена и белков S-слоя для создания средств диагностики и профилактики сибирской язвы» (2006-2008 гг.). Аспорогенные штаммы В. anthracis (КМ89-92) применялись при проведении научно-технических разработок, проводимых в ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт МО РФ» и ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора».

Материалы диссертации вошли в практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней», утвержденное руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (12.12.07 г.).

По материалам диссертации составлены методические документы, одобренные Ученым советом и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб»: пособие для научных сотрудников - «Выделение в популяциях Bacillus anthracis фенотипов, различающихся по протолитической, гемолитической активности, способности к сорбции пигмента и спорообразованию» (30.04.99 г.); методические рекомендации - «Комплекс методических подходов к определению продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба» (17.04.07 г.) и «Селекция штаммов сибиреязвенного микроба, продуцирующих белок Sap S-слоя» (27.06.07 г.).

Материалы диссертации представлены в лекционных циклах по генетике бактерий - на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов при РосНИПЧИ «Микроб», на биологическом факультете Саратовского Государственного университета имени Н.Г. Чернышевского и биотехнологическом факультете Саратовского Государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова

Основные положения, выносимые на защиту:

1. С применением комплексного подхода, учитывающего дополнительные сведенияю факторах иммуногенносш и патогенности anthracis и:использующего рекомбинантные технологии, создана экспериментальная система^ для: конструирования сибиреязвенных вакцин;. Ее компонентами являются: коллекция протеазодефицитных и аспорогенных бёсплазмидных производных вакцинных штаммов В. anthracis\ генно-инженерные бациллярные штаммы, с высокой продукцией биологически активного протективного антигена, в том, числе: -стабильный аспорогенный продуцент; очищенные препараты рекомбинантного протективного антигена и белков S-слоя сибиреязвенного микроба; высокоим-муногенный штамм В. anthracis с клонированным геном pag.

2. Рекомбинантные штаммы В. anthracis СТИАТПА-1, В. anthracis 55АТПА-1 и В. subtilis WB600IIA-1 - безопасные, стабильные и эффективные продуценты протективного антигена сибиреязвенного микроба. Генно-инженерные штаммы не содержат детерминанты синтеза основных факторов вирулентности возбудителя, сибирской язвы, сохраняют биологические свойства при пассировании в селективных условиях, и секретируют в пять раз больше иммуногенного антигена, чем вакцинные культуры В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55.

3. Генно-инженерные штаммы с гибридным репликоном pUBllOPA-1 обладают высокой иммунологической эффективностью. Однократная иммунит зация.биомоделей (мьипей линии BALB/c, морских свинок) дозой 3 - 5 • 10 спор рекомбинантных штаммов В. anthracis СТИАТПА-1и В. subtilis WB600IIA-1 вызывает развитие напряженного иммунитета с высокими значениями титров антител к протективному антигену и эффективно защищает от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы.

4. Рекомбинантный аспорогенный штамм В: anthracis 55ATTIA-l(Spo") при пассировании in vitro не реверсирует к спорообразующему фенотипу и в селективных условиях сохраняет способность к репликации гибридной' плазмиды, определяя концепцию, экологичной- и безопасной технологии производства-химической, сибиреязвенной вакцины. Генно-инженерный штамм синтезирует биологически активный протективный антиген - двукратная иммунизация дозой-. 50 мкг очищенного рекомбинантного< продукта обеспечивает защиту 100 % кроликов- от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма возбудителя сибирской язвы.

5. Белки S-слоя В. anthracis являются дополнительными факторами им-муногенности хромосомной детерминации на основании изучения протектив-ных свойств очищенных белковых препаратов и изогенных Sap+ и Sap" штаммов В. anthracis. Спонтанные или индуцированные мутации в штаммах В. anthracis, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, сопровождаются снижением на 1 - 3 порядка степени их патогенности для белых мышей.

Апробация, работы. Материалы диссертации представлялись на международных конференциях: 3-й международной конференции по сибирской язве (Плимут, Великобритания, 1998), 2-ой международной конференции по-молекулярной биологии Bacillus cereus, Bacillus anthracis и Bacillus thuringiensis (Taoc, Нью-Мексико, США, 1999), 1-ой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва,-2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государствучастников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), Межгосударственной научно-практической конференции «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); на Российских конференциях: 2-ой Всероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1998); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век» (Саратов, 2004); IX Всероссийской научно-практическая конференция-"Молодые ученые в медицине" (Казань, 2004); XX Российской конференции по электронной, микроскопии (Черноголовка, 2004); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); Российском медицинском форуме "Фундаментальная наука и практика" (Москва, 2006); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов» и паразитологов'(Москва, 2007); а также на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию. НИИ микробиологии- МО РФ (Киров, 1998), на ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2000-2008).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 48 научных публикациях, из которых 12 статей в рекомендованных ВАК изданиях, 16 тезисов в сборниках международных и Российских конференций, 7 патентов.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 66 отечественных и 250 зарубежных источников. Общий объем диссертации составляет 297 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 47-ю рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Микшис, Наталья Ивановна

выводы

1. С учетом фундаментальных знаний о факторах патогенности и имму-ногенности возбудителя сибирской язвы и применением рекомбинантных технологий разработаны экспериментальные основы для решения проблемы совершенствования сибиреязвенных вакцин. Многокомпонентная система включает: коллекцию реципиентных штаммов В. anthracis для генетического конструирования, представленную бесплазмидными производными с низкой активностью протеолитических ферментов, нарушением экскреции белка Sap и отсутствием способности к образованию спор; высокоиммуногенные и низкореактогенные генно-инженерные бациллярные штаммы; спорообразующие и аспорогенные рекомбйнантные продуценты протективного антигена; высокоочищенные белковые препараты протективного антигена и белков S-слоя сибиреязвенного микроба.

2: На основе протеазодефицитных бесплазмидных производных бациллярных штаммов созданы генно-инженерные продуценты - В. anthracis СТИДТПА-1, В. anthracis 55ДТПА-1 и В. subtilis WB600IIA-1, по уровню >синте-за протективного антигена (80 - 90 мкг/мл) пятикратно превосходящие вакцинные культуры В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55. Рекомбйнантные штаммы содержат структурный ген pag в составе гибридного репликона pUB110PA-l; (6,5 т.п.н.) и стабильно сохраняют биологические свойства при пассировании in vitro и in vivo.

3. Сконструированные генно-инженерные штаммы обладают высокой иммунологической эффективностью: в иммунизирующей дозе (3 • 107 спор) они обеспечивают защиту мышей линии BALB/c от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы. Однократная иммунизация морских свинок дозой 5 • 107 спор штаммов В. anthracis СТИДТПА-1 и В. subtilis WB600IIA-1 вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к протективному антигену. Штаммы с клонированным геном pag не обладают остаточной вирулентностью для мышей линии BALB/c и морских свинок, в отличие от вакцинных культур В. anthracis 55 и В. anthracis СТИ-1. Созданный на основе В. anthracis СТИ-1 штамм В. anthracis СТИЛТПА-1 является прототипом менее реактогенной живой сибиреязвенной вакцины.

4. Для создания безопасных и экологичных технологий производства сибиреязвенных профилактических и диагностических препаратов сконструирован аспорогенный рекомбинантный авирулентный продуцент протективного антигена - В. anthracis 55ATIIA-l(Spo"). Штамм стабильно наследует гибридный репликон pUB110PA-l, не реверсирует к спорообразующему фенотипу и характеризуется низкой активностью протеолитических ферментов. Уровень продукции ПА аспорогенным рекомбинантом составляет около 80 мкг/мл.

5. Оптимизирована экспериментальная схема выделениями очистки протективного антигена^ синтезируемого генно-инженерными продуцентами. Из аспорогенного штамма В. anthracis 55ATIIA-l(Spo") получен препарат протективного антигена, перспективный в качестве основного компонента химической!-сибиреязвенной вакцины. Двукратная* иммунизация дозой 50 мке очищенного рекомбинантного протективного антигена обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма В. anthracis 81/1.

6. Бесплазмидные производные штаммов В. anthracis при культивироi. вании in vitro различаются по способности к экскреции белка S-слоя - Sap. Получены экспериментальные доказательства нарушения продукции Sap у штамма В. anthracis СТИДТ. В качестве источников белка Sap предложены протеа-зонегативные штаммы В. anthracis SterneATPrt" и 2Ш вакцина Ценковского pf Prt\ На основании изучения протективных свойств очищенных препаратов белков S-слоя и изогенных Sap+ и Sap" штаммов В. anthracis установлено, что белки Sap и ЕА1 являются дополнительными иммуногенными факторами сибиреязвенного микроба при определяющей роли протективного антигена.

7. Получены высокоочищенные препараты белков S-слоя сибиреязвенного микроба - Sap и ЕА1. Протеины идентифицированы как компоненты S-слоя В. anthracis на основании молекулярных масс, выявленной паракристаллической ультраструктуры, особенностей аминокислотного состава, иммунореак-тивности и локализации на поверхности клетки.

8. На основании результатов экспериментов по моделированию вирулентности установлено, что спонтанные или индуцированные Бро" мутации в штаммах В. апОггаск приводят к снижению на 1 - 3 порядка степени их пато-генности для белых мышей. Выяснено отсутствие влияния экспрессии хромосомных признаков протеолиза, гемолиза, пигментсорбции и пигментсинтеза на вирулентность сибиреязвенного микроорганизма.

Заключение

Сибирская язва - особо опасное зооантропонозное заболевание, характеризующееся тяжестью течения и высокой летальностью. Уникальная способность Bacillus anthracis длительно сохраняться в окружающей среде, вследствие чрезвычайной резистентности спор к воздействию внешних факторов, приводит к накоплению в природе естественных резервуаров патогенного микроорганизма. В условиях недостаточности или отсутствия профилактических мероприятий на эндемичной территории сибиреязвенная инфекция может стать причиной массового заболевания людей и животных (Davies J., 1985). Один из факторов поддержания эпидемического благополучия по сибирской язве - вакцинация восприимчивых животных и населения групп риска.

Наиболее длительный, и напряженный иммунитет создают живые сибиреязвенные вакцины. Однако существенным их недостатком является-реактоген-ность. В' настоящее время в практике здравоохранения и ветеринарии, используются вакцинные штаммы. В. anthracis, являющиеся моноплазмидными (рХ01+рХ02") производными вирулентных культур. Установлено, что в процессе аттенуации происходит элиминация репликона рХ02, детерминирующего синтез капсулы. В отсутствие капсулы сибиреязвенный микроб чувствителен к фагоцитозу и при попадании в макроорганизм не способен реализовать свой патогенный потенциал. За развитие иммунного ответа отвечает ПА, входящий в состав кодируемого детерминантами pXOl экзотоксина бинарного действия. Помимо ПА, сибиреязвенный токсин представлен ОФ и ЛФ, участвующими в патогенезе заболевания и вызывающими основные структурные и функциональные изменения в инфицированном организме (Leppla S., 1991).

Лицензированные химические вакцины менее реактогенны, тем не менее, содержание в них минимальных примесей ОФ и ЛФ неизбежно, ввиду сложности разделения белковых компонентов токсина, имеющих близкие значения молекулярных масс. Аллергические реакции возникают почти у 30 % людей, вакцинированных антигенными препаратами (National communicable disease center, 1970; Turnbull P. et al., 1986).

Достижения биологической и медицинской наук за последние несколько десятилетий изменили представления о средствах специфической профилактики инфекционных болезней. Развитие иммунологии, генетики и биохимии позволило ученым приблизиться к разгадке тайн природы о клеточных и молекулярных механизмах взаимодействия макро- и микроорганизмов. В этих условиях аттенуированные штаммы и нестандартизованные химические препараты утрачивают свою актуальность. В конструировании вакцин нового поколения на первый план вышли рекомбинантные технологии. Принцип клонирования детерминант иммуногенности. в гомо- и гетерологичных системах используется для создания живых, субъединичных и ДНК-вакцин.

Отвечающие современным требованиям профилактические препараты должны разрабатываться с учетом всего арсенала накопленных знаний о структуре; свойствах, молекулярной природе,, генетической детерминации, путях синтеза и регуляции факторов патогенности и иммуногенности инфекционного агента;.как основных, обуславливающих развитие пато- и иммуногенезов, так w дополнительных, оказывающих влияние на выраженность взаимодействия с макроорганизмом.

Основные факторы патогенности и иммуногенности сибиреязвенного микроба - полиглютаминовая капсула и бифункциональный экзотоксин с входящим в его состав ПА, кодируются плазмидными генами. Однако обычно в инфекционном и иммунологическом процессах участвуют также микробные продукты хромосомной детерминации. В отношении возбудителя сибирской язвы имеются единичные экспериментальные подтверждения этого утверждения (Fouet A. et al., 2000; Read T., Fraser С., 2003; Gat О. et al., 2005). В большинстве других случаев высказывались лишь предположения о существовании хромосомных продуктов, вовлеченных в реализацию1 патогенных и иммуногенных свойств В. anthracis.

Одной из первых задач настоящего исследования было осуществление поиска еще не идентифицированных факторов патогенности и иммуногенности сибиреязвенного микроба, детерминируемых хромосомными генами. Прежде всего, нас интересовал прикладной аспект - перспектива получения оптимального реципиентного штамма В. anthracis для генетического конструирования продуцирующего ПА бациллярного рекомбинанта.

Внимание было обращено на признаки протеолиза, гемолиза, пигмен-тсорбции, пигментсинтеза и спорообразования возбудителя сибирской язвы, по версиям разных авторов коррелирующих с вирулентностью (Цыганкова О.И., 1993; Еремин С.А. с соавт., 1999; Uchida I., 1985; Koehler Т.' et al., 1992; Worsham P., Sowers M., 1993).

Протестировав 14 штаммов В. anthracis, выявили гетерогенность их популяций, выражающуюся в одновременном присутствии клонов с «полярной» и промежуточной экспрессией перечисленных признаков. Отмечен координированный характер изменения свойств. Клоны хорошо сорбирующие пигмент из среды роста, как правило, обладали высокой активностью протеолитических, гемолитических ферментов и синтезировали желтый пигмент - фенотип Prt+Hly+CR+Ydp+. Отсутствие способности к сорбции конго красного сочеталось с нарушением протеолиза, гемолиза, пигментсинтеза - фенотип Prt"Hly"CR"Ydp". С признаком пигментсорбции коррелировала частота обнаружения аспороген-ных клеток. Н аиболее высокой она была в потомстве клонов, имеющих ярко-красную окраску на среде с конго красным. Утрата способности к образованию спор сопровождалась также изменением культуральных свойств - морфологии колоний и характера роста в жидких питательных средах.

В ходе экспериментов было установлено, что гетерогенность популяций штаммов В. anthracis является следствием диссоциации отдельных клонов, хорошо сорбирующих конго красный, расщепляющих белковые субстраты и ли-зирующих эритроциты (Prt^Hly^CR*). Образование промежуточных форм укладывается в понятие фенотипической изменчивости (Головлев Е.Л., 1998). Появление стабильных при пассировании in vitro и in vivo вариантов Prt'Hly'CR" Ydp" или Prfflly'CR'Ydp'Spo", скорее всего, результат мутационных событий, завершающих диссоциацию типичного штамма возбудителя сибирской язвы.

Обнаружено различие состава популяций природных вирулентных (преобладание фенотипа Prt+Hly+CR+Ydp+) и аттенуированных (преобладание фенотипа Prt'Hly'CR'Ydp" или Prt+Hly"CR"Ydp"Spo~) культур сибиреязвенного микроба. Как оказалось, штаммы В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis Wright представлены исключительно клетками с нарушениями функций протеолиза белковых субстратов, гемолиза эритроцитов, сорбции пигмента и пигментсинтеза (PrtfHly" CR'Ydp"). Вероятно, в процессе лабораторного культивирования в популяциях природных культур В', anthracis активизируются процессы диссоциации, и происходит накопление клеток различных фенотипов. Случайная селекция клонов при аттенуации иногда заканчивается выделением стабильной формы с измененными свойствами. По-видимому, диссоциация имеет место и в природе. Пример тому - атипичные "почвенные" штаммы с низкой активностью протео-литических ферментов (Еременко Е.И., 1997). Природные процессы имеют адаптивный характер. Для выживания, вне организма хозяина сибиреязвенному микробу нет необходимости в экспрессии ряда свойств.

Популяционные соотношения количеств клонов с разной экспрессией хромосомных признаков не зависели от присутствия собственных репликонов сибиреязвенного микроба. Для установления этого факта использовали 8 изо-генных систем, содержащих ди-, моно- и бесплазмидные штаммы В. anthracis. На основании полученных результатов сделали вывод, что плазмидные гены не участвуют в координации признаков протеолиза, гемолиза, синтеза и сорбции пигментов.

Определение механизмов сочетанного изменения свойств заслуживает дальнейшего теоретического осмысления и экспериментального развития. Однако, исходя из задач исследования, приоритет был отдан определению корреляции экспрессии хромосомных признаков с вирулентностью возбудителя сибирской язвы.

С этой целью на основе природного изолята В. anthracis 81/1 сконструировали систему изогенных штаммов, различающихся по составу плазмид и способности к деградации белковых субстратов, гемолизу эритроцитов, пигментсорбции, пигментсинтезу и спорообразованию. Сравнивали вирулентность клонов с диаметрально противоположными фенотипами - РгГН1у~С1ГУс1р~8ро+, РЛ4Н1у+СБ1нТс1р+8ро+ и РЛ+Н1у+СК+Уёр+8ро". Диплазмидные производные тестировали на модели морских свинок, моноплазмидные (рХ01"рХ02+) - белых мьппей. Так как в панели сравнения присутствовали Бро" варианты, для заражения лабораторных животных использовали только вегетативные культуры.

Показатели ЛД50 в группе диплазмидных штаммов существенно не различались. Вирулентность изогенного производного с сочетанными нарушениями хромосомных признаков оказалась даже в 2 раза выше вирулентности исходного варианта - Рг^^СК^Ус^Зро4".

В группе моноплазмидных производных отмечали резкое снижение вирулентности у аспорогенного штамма. Значение его ЛД50 для белых мышей было в 85 раз выше (или в 1778 - для другой партии животных), по сравнению с тем же показателем изогенного спорообразующего варианта. Вирулентности клонов с фенотипамиРгГН1у~С11"Ус1р~8ро+ и Рг^1у+СК+Ус1р+8ро+ существенном образом не отличались.

Таким образом, сочетанное нарушение способностей к протеолизу, гемолизу, сорбции и синтезу пигментов - признаков, ассоциируемых ранее с вирулентностью возбудителя сибирской язвы, не приводит к значительному изменению ЛД50 для лабораторных животных (морские свинки, белые мыши). Спонтанные мутации, приводящие к изменению фенотипа на Бро", сопровождаются снижением на 2 - 3 порядка уровня патогенности моноплазмидных производных для белых мышей.

Для того, чтобы определить является ли обнаруженный факт общей тенденцией иди единичным случаем, осуществили генетическое моделирование вирулентности. Во-первых, в бесплазмидный аспорогенный вариант изогенной коллекции с помощью трансдукционного переноса ввели репликон рХ02 из до-норного штамма В. аШкгаЫБ. В экспериментах на белых мышах степень патогенности Бро" трансдуктанта была в 63 раза меньше степени патогенности аналогичной контрольной спорообразующей конструкции. Восстановление функции образования спор посредством трансдукционной передачи хромосомных генов приводило к повышению показателя ЛД50 приблизительно до уровня контрольного штамма. Во-вторых, сконструировали транспозонный аспорогенный мутант и, после генетической передачи в него репликона рХ02, определили значения ЛД50 для белых мышей. В результате Бро" вариант обладал в 10 раз меньшей вирулентностью, чем Эро* контроль.

Все вышеизложенное позволило заключить, что аспорогенные мутанты, спонтанные и индуцированные, характеризуются сниженной вирулентностью по сравнению со спорообразующими аналогами. Иными словами - мутации, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, затрагивают детерминанты, вовлеченные в реализацию патогенных свойств сибиреязвенного микроба. И хотя, не образующие спор штаммы В. аШИгаЫБ, ввиду значимости споровых антигенов для иммуногенеза, не имеют больших перспектив в плане создания менее реактогенных живых вакцин, они обладают явными преимуществами в качестве безопасных продуцентов иммуногенных антигенов.

Поэтому следующим этапом-исследования было получение аспорогенных производных на основе вакцинных штаммов В. аШИгасгБ. Принцип селекции Бро" мутантов базировался на использовании обнаруженной ранее корреляции хромосомных признаков. На модели вирулентного изолята В. амкгаыз 81/1 заметили, что Бро" мутанты чаще выделяются в потомстве клонов, хорошо сорбирующих конго красный. Аспорогенные культуры имеют иную морфологию колоний - они гладкие блестящие и полупрозрачные (в Б-форме), тогда как обычно у сибирезвенного микроба - шероховатые, матовые и плотные (в Я-форме). В жидких питательных средах Бро" клоны образуют равномерное помутнение, а обычно - придонный осадок.

В связи с этим процедура отбора клонов с нарушенной функцией спорообразования выглядела следующим образом. Сначала в популяции штамма В. аШИгаш выделяли диссоциирующий клон с фенотипом Рг1+Н1у+СЯ+, для этого использовали питательную среду с добавлением конго красного. Затем культуру диссоциирующего клона засевали в бульон и несколько раз пассировали с целью накопления спонтанных мутантов. После пассажей отбирали колонии с атипичной морфологией. На заключительном этапе исследовали характер роста в жидкой среде, микроскопическую картину окрашенных клеточных мазков и жизнеспособность культур после прогрева в установленном режиме.

Исходя из перспектив использования в качестве продуцентов сибиреязвенных антигенов или основ для их генетического конструирования, наибольший интерес представляли Spo" варианты вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1, Sterne 34F2 и 55, а также их бесплазмидных производных - В. anthracis СТИАТ, SterneAT и 55ÀT. Однако диссоциирующие представители присутствовали в популяциях лишь части перечисленных штаммов. От содержания клеток с фенотипом. Prt4Hly+CR+ зависела результативность селекции аспорогенных клонов. В популяциях штаммов В. anthracis Sterne 34F2 и SterneAT (31,4 и 45 % клеток Prt+Hly+CR+ фенотипа) уже после третьего пассажа образовывалось достаточное для*случайного выбора количество не образующих спор мутантов. Для культур В. anthracis 55 и 55АТ (15 и 8 % клеток Prt+Hly+CR+ фенотипа) потребовалось около 20 - 30 пересевов, чтобы достичь необходимого результата. Выделить спонтанные аспорогенные мутанты штаммов В. anthracis СТИЧ и СТИАТ не удалось, ввиду однородности их состава - 100 % клеток обладали стабильным фенотипом Prt'Hly'CR".

Для получения аспорогенных производных бесплазмидных штаммов с сочетанными нарушениями признаков протеолиза белковых субстратов, гемолиза эритроцитов, пигментсорбции и пигментсинтеза применили альтернативный путь - индуцирование мутации за счет инсерции транспозона в последовательность хромосомных генов. Температурочувствительный вектор pLTV3ts, содержащий Тп917, вводили в клетки В. anthracis СТИАТ и SterneAT (спонтанный мутант Prt'Hly'CR") и осуществляли транспозицию с одновременной элиминацией векторной плазмиды. Клональный анализ транспозантов обоих штаммов показал высокий уровень диссоциации.

В процессе пассажей на питательных средах Spo" вариант штамма В. anthracis СТИДТ утратил способность к росту в присутствии селективных антибиотиков, но сохранил свойство аспорогенности. Данное обстоятельство не позволило связать Spo" фенотип со вставкой транспозона. Возможно, причина в дестабилизации, прилегающей к месту инсерции транспозона, хромосомной области.

Итак, в результате проведенных экспериментов удалось получить не образующие спор штаммы - В. anthracis Sterne 34F2Spo" (КМ89), В. anthracis 55Spo~ (KM92), В. anthracis CTHATSpo" (KM91), В. anthracis StemeATPrt'Spo" (KM90) и В. anthracis 55ATSpo" (KM92(3)). Аспорогенность перечисленных культур сохранялась при культивировании in vivo, in vitro и после длительного хранения. Электронная микроскопия негативно окрашенных образцовой ультратонких срезов ни в одном из случаев*не выявила характерных структур, соответствующих какой-либо из пяти стадий'образования спор. Вероятно, функциональный,блок в аспорогенных производных произошел на начальной стадии.

Моноплазмидные Spo" варианты сибиреязвенных штаммов^ могут быть использованы как экологичные и безопасные продуценты сибиреязвенных антигенов, бесплазмидные - в качестве основ для их генетического конструирования. Преимущество практического применения аспорогенных культур заключается в нивелировании риска контаминации рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы. Необходимо отметить, что почти все полученные штаммы, за исключением В. anthracis КМ89, характеризуются низкой активностью протеолитических ферментов, что крайне важно для потенциальных продуцентов белковых антигенов. Протеоли-тическая активность бациллярных штаммов является серьезной проблемой получения и очистки ПА сибиреязвенного микроба:

Исходя из деградирующего действия собственных протеаз in vitro, возник вопрос — может ли экспрессия признака протеолиза влиять на функциональную активность ПА in vivo? Для ответа на него провели эксперименты с привлечением двух групп изогенных штаммов. Одна включала Prt'Hly'CR" и Prt+Hly+CR+ фенотипы моноплазмидного (рХ01+рХ02") производного природного изолята В. anthracis 81/1, другая — такие же варианты вакцинного штамма В. anthracis Sterne 34F2. Морских свинок иммунизировали однократно споровыми взвесями тестируемых культур в дозах - 1,25 • 105 и 8 • 105 жизнеспособных спор - для изо-генных вариантов на основе вирулентного и вакцинного штаммов, соответственно. Через 21 день после иммунизации биомоделей заражали тест-культурой В. anthracis 2-ая вакцина Ценковского. Взвесь спор тест-штамма вводили в возрастающих дозах от 10 до 10 спор. По окончанию экспериментов подсчитывали значения» ЛД50 тест-заражающего штамма и индексов иммунитета изучаемых культур, вычисляемых как отношение значений ЛД50 тест-штамма для иммунизированных и интактных морских свинок.

В результате, индексы иммунитета Prt+ производных вирулентного и вакцинного штаммов даже несколько превосходили показатели протективности изогенных Prt" культур - в 8,0 и 1,3 раз, соответственно. На этом основании был сделан вывод, что высокая активность протеолитичесих ферментов, приводящая к деградации ПА in vitro, не снижает его функциональную активность in vivo. С другой стороны, в поствакцинальный период от иммунизирующей дозы про-теазопозитивных производных штаммов В. anthracis Sterne 34F2 и 81/1 пало, соответственно, три и две морские свинки из 20-ти. На введение споровой взвеси протеазонегативных культур было по одному случаю летального исхода. Таким образом, собственные протеазы сибиреязвенного микроба могут несколько повышать протективность синтезирующих их штаммов, выступая, по-видимому, в роли дополнительных антигенов. В то же время, их функциональная активность ассоциируется с более высоким уровнем летальности иммунизированных биомоделей.

Обе эти тенденции подтверждают данные сравнительного изучения про-тективных свойств еще одного вакцинного штамма - В. anthracis СТИ-1, характеризующегося нарушенной способностью к деградации белковых субстратов. Ввиду отсутствия у него протеазопозитивного изогенного варианта, о чем упоминалось выше, сравнение проводили с Prt+ и Prt" производными на основе

В. anthracis Sterne 34F2. В тех же условиях опыта индекс иммунитета В. anthracis СТИ-1 оказался еще меньше (приблизительно в 5 раз) чем у Prt" варианта В. anthracis Sterne 34F2. Летальности морских свинок в поствакцинальный период в этом случае отмечено не было.

Неожиданный интерес возник в связи с обнаруженным различием протек-тивной активности двух протеазонегативных культур. Не является ли причиной почти пятикратного превышения индекса иммунитета штамма В. anthracis Sterne 34F2 (Prt") наличие у него дополнительных иммуногенных антигенов? Подтвердить или исключить такую вероятность на данном этапе исследования не представлялось возможным. Однако в продолжение темы появились оригинальные предположения.

Опыт работы со штаммами В. anthracis Sterne34F2 и В. anthracis СТИ-1 показывает, что, несмотря на принадлежность к одному виду, они имеют некоторые фенотипические отличия. В. anthracis Sterne34F2 обладает высокой активностью протеолитических и гемолитических ферментов, в то время как для В. anthracis СТИ-1 отмечено резкое снижение способности к протеолизу и гемолизу. На твердых питательных средах штамм В. anthracis СТИ-1 формирует более крупные колонии, а в бульоне образует конгломерат клеток, плохо разбивающийся при встряхивании и оседающий на дно пробирки в виде «комочка ва-. ты». Осадок бульонной культуры В. anthracis Sterne34F2 рыхлый и при встряхивании вызывает равномерное помутнение среды.

Наше внимание привлекло сообщение французких авторов, занимающихся исследованием S-слоя сибиреязвенного микроба, о фенотипических особенностях штаммов В. anthracis, дефектных по синтезу одного из компонентов поверхностной паракристаллической структуры. Как известно, S-слой возбудителя сибирской язвы представлен двумя белками - Sap и ЕА1. Их синтез детерминируется генами sap и eag, расположенными один за другим на хромосоме возбудителя сибирской язвы. In vitro микроорганизм сначала синтезирует Sap, затем в течение стационарной фазы происходит замещение Sap на ЕА1, а освобождающийся протеин выходит в супернатант. Сконструированные I. Etienne-Toumelin et al. (1995) и S. Mesnage et al. (1997) Sap" мутанты штамма В. anthracis Sterne34F2 отличались от Sap+ клонов более крупными колониями, способностью к оседанию в бульоне в виде комочков и образованию очень длинных клеточных цепочек. Мы провели сравнительное микроскопическое исследование штаммов В. anthracis Sterne34F2 и В. anthracis СТИ-1. Клетки выращивали в одинаковых условиях в жидкой питательной среде. Изучение с помощью светового микроскопа показало, что средняя длина микробной цепи, представленной клетками В. anthracis СТИ-1, более чем в двадцать раз превосходит таковую штамма В. anthracis Sterne 34F2.

На основании совпадений феноменологий было сделано предположение, что у вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 нарушена* экскреция протеина S-слоя - Sap. Сравнение белковых профилей концентрированных культуральных фильтратов штаммов В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis Sterne34F2 продемонст-рирвало их различие. В> супернатанте В. anthracis СТИ-1 отсутствовал белок с электрофоретической подвижностью,-, соответствующей молекулярной массе протеинов S-слоя возбудителя сибирской язвы (94 кДа).

Обращает на себя* внимание, что практически все зарубежные работы по детальному исследованию паракристаллического S-слоя проводились на штамме В. anthracis Sterne 34F2 или его производных. Применительно к этой модели была установлена закономерность, согласно которой элиминация плазмиды pXOl приводит к 10 - 20-кратному повышению синтеза белка Sap, что объясняется наличием в составе данного репликона регуляторных областей - atxA и pagR, отвечающих, помимо прочего, за репрессию гена sap (Mignot T. et al., 2003). Протестировав 9 бесплазмидных штаммов сибиреязвенного микроба, выявили 5 культур непродуцирующих Sap в среду культивирования. В их числе находился и бесплазмидный вариант В. anthracis СТИ-1. Как видим, нарушение способности к экскреции белка Sap - совсем не уникальное событие. Возможно, оно является следствием спонтанных Sap" мутаций, происходящих в процессе многочисленных пассажей культур возбудителя сибирской язвы или элиминации плазмид.

Анализ результатов белкового электрофореза концентрированных куль-туральных фильтратов выявил также штаммы, активно экскретируюгцие белок Sap - В. anthracis SterneAT, 55АТ, 2-ая вакцина Ценковского (71/12) pf. Ввиду подверженности компонентов S-слоя сибиреязвенного микроба протеолитиче-ской деградации, селектировали Prtf варианты перечисленных культур. Низкая активность собственных протеаз полученных продуцентов позволит минимизировать потери белкового продукта в процессе его выделения и очистки.

Для выделения препаративных количеств белка S-слоя сибиреязвенного микроба, экскретируемого в среду выращивания (Sap), культуру В. anthracis 71/12pfPrf засевали в S-бульон и инкубировали при температуре 37 °С с аэрацией в. течение 18 часов. После периода инкубации клеточную массу осаждали центрифугированием, а супернатанты фильтровали. Хроматографическую очистку проводили с использованием, различных носителей - сефарозы CL-4B, Macro Prep 50Q h пщроксиапатитаг (Farchaus J. et al., 1995). В'результате было получено несколько серий препарата Sap с концентрацией от 1,0 до 1,4-мг/мл. Выход белкового продукта составил 60 - 80 мг на 1 литр исходной культуры.,

Для выделения компонента S-слоя, прочно связанного с клеточной- стенкой (ЕА1), использовали штамм В. anthracis СТИАТ. Его культуру выращивали в ВШ-бульоне при температуре 37 °С с аэрацией в течение 18 часов. После периода инкубации микробную взвесь центрифугировали, клеточную массу ре-суспендировали в экстрагирующем буфере. Разделение белков SDS-экстракта проводили при помощи разработанной методики двухэтапной ионообменой хроматографии на гидроксиапатите. В результате получили препарат ЕА1 с концентрацией белка 1 мг/мл. Выход составил 80 мг протеина ЕА1 на 1 литр исходной культуры. Идентификацию выделенных белков в качестве компонентов! S-слоя сибиреязвенного микроба осуществляли биохимическими, электронно-микроскопическими и иммуноэлектронно-микроскопическими методами исследования.

Как известно, S-слои микроорганизмов состоят из регулярно организованных протеиновых или гликопротеиновых субъединиц. Ультраструктуру белковых препаратов, полученных из культурального фильтрата штамма В. anthracis 71/12pfPrt" и клеточного SDS-экстракта штамма В. anthracis СТИАТ, исследовали с помощью электронного микроскопа. Образцы предварительно диализовали, фиксировали и негативно окрашивали. При нанометровом разрешении (в 1,5 - 2 ■ 10б раз) удалось выявить характерное для S-слоя регулярное строение белка - паракристаллическую решетку с упорядоченным расположением цилиндрических пор. Их диаметр составил ~ 7 - 10 нм. Такие же структуры описаны авторами; ранее проводившими исследование S-слоя В. anthracis (Etienne-Toumelin I. et al., 1995; Mesnage*S. et al., 1998; Couture-Tosi E. et al., 2002). Сканирующая атомно-силовая электронная микроскопия, позволяющая получать трехмерные изображения поверхности неконтрастированных биологических объектов, продемонстрировала способность тестируемых протеинов формировать упорядоченную структуру с выраженной периодичностью и волнообразной симметрией.

Для белков S-слоев различных микроорганизмов выявлены определенные соотношения аминокислот: значительное количество (40 - 60 %) неполярных; равные доли (по 15%) кислых и основных; отсутствие (или наличие долей процента) метионина и цистеина (Sleytr U., 1978, 1997; Sara М., Sleytr U., 1996, 2000). Аминокислотный анализ выделенных нами протеинов показал содержание неполярных аминокислот у Sap - 53,5 % , у ЕА1 - 43,3 %. Соотношение кислых и основных для Sap - 16,3 и 20 %, а для ЕА1 - 17,3 % и 18,8 %. Метио-нин и цистеин в обоих белковых препаратах обнаружены не были.

Локализацию антигенов Sap и ЕА1 на поверхности клеток подтверждали иммуноэлектронной микроскопией со специфичными мечеными антителами. Для этого кроликов иммунизировали очищенными белками Sap и ЕА1. Из кроличьих сывороток получали иммуноглобулины и метили их коллоидным золотом. Иммуносорбцию осуществляли на клеточных образцах 18-часовых культур штаммов В. anthracis SterneAT и СТИАТ.

После взаимодействия с антителами к ЕА1 клетки обоих штаммов были почти сплошь покрыты непроницаемой для электронов меткой. Разреженность метки по краю позволяла различать ее отдельные частицы. Субъективно, анти-ЕА1 антитела более выраженно реагировали с поверхностным антигеном штамма В. anthracis СТИДТ, что, вероятно, связано с особенностью его S-слоя, представленного белком ЕА1. Меченые антитела к Sap активно сорбировались на поверхности клеток В. anthracis SterneAT и в межклеточном пространстве -на конгломератах экскретируемого штаммом белка. В препаратах В. anthracis СТИАТ частицы коллоидного золота равномерно распределялась в поле зрения в виде единичных включений или небольших скоплений, специфической сорбции антител не отмечалось.

Иммунореактивность выделенных препаратов определяли также постановкой иммуноблота с кроличьими антителами к белкам S-слоя. Кроме очищенных протеинов в реакции иммуноблота исследовали культуральные фильтраты штаммов В. anthracis СТИАТ и SterneAT. После окрашивания нитроцеллю-лозной мембраны положительную реакцию взаимодействия' со специфичными антителами к Sap и ЕА1 регистрировали для обоих белковых образцов и куль-турального фильтрата штамма В. anthracis SterneAT (на уровне электрофорети-ческой подвижности, соответствующей молекулярной массе 94 кДа). Образования иммунных комплексов в препарате культурального фильтрата штамма В. anthracis СТИАТ не отмечалось. Имевшие место перекрестные реакции между антигенами S-слоя возбудителя сибирской язвы объясняются высокой степенью их сродства.

На основании изложенного выше, протеины, выделенные из штаммов В. anthracis 71/12pfPrt" и В. anthracis СТИАТ, по молекулярной массе, формируемым ультраструктурам, аминокислотному составу и расположению на клеточной поверхности идентифицированы как компоненты S-слоя сибиреязвенного микроба - Sap и ЕА1. Высказанное нами предположение о нарушении у штамма В. anthracis СТИАТ продукции белка Sap подтвердилось данными иммуноэлек-тронной микроскопии и иммуноблота со специфичными антителами.

Изучение протективности очищенных препаратов Sap и ЕА1 проводили на модели морских свинок. Лабораторных животных иммунизировали очищенными препаратами Sap, ЕА1, и для сравнения - вакцинным штаммом В. ап-thracis. Контрольных животных оставляли интактными. Антигены вводили подкожно двукратно в дозе 25 и 50 мкг в сочетании с полным адьювантом Фрейнда. Иммунизацию споровой культурой В. anthracis Sterne 34 F2 осуществляли однократно в дозе 1 • 10б спор. После периода, необходимого для формирования иммунитета (21 день), биомоделей заражали штаммом В. anthracis 2a* вакцина Ценковского в возрастающих дозах 1 • 102 — 1 * 107 КОЕ.

В результате, значения ЛД50 тест-заражающей культуры для морских свинок, иммунизированных белками Sap и ЕА1, оказались в 36,9 и 3,3 больше, чем тот же показатель для интактных животных. Преимущество в защитной способности в данном эксперименте принадлежало Sap. Иммуногенность вакцинного штамма, продуцирующего ПА, вполне предсказуемо почти на три порядка превышала иммуногенность белковых препаратов. Однако обращало на себя внимание, что даже в отсутствие основного иммуногена сибиреязвенного микроба, компоненты S-слоя- в определенной степени защищали лабораторных животных.

Изучение влияния белков S-слоя на развитие иммунного статуса in vivo осуществляли с использованием изогенной системы Sap+ и Sap" вариантов В. anthracis SterneAT. Ранее мы предположили, что нарушение экскреции Sap у штамма В. anthracis СТИ-1 - следствие спонтанных Sap" мутаций, возникающих в процессе культивирования микроорганизма или элиминации плазмид. Обычно элиминация собственных репликонов возбудителя сибирской язвы происходит при экстремальной для вегетативной формы микроорганизма температуре - 42 -43 °С. Смоделировав в опыте соответствующие условия, осуществили поиск спонтанных Sap" мутантов в популяции одного из вновь полученных бесплаз-мидных клонов. Прямая селекция по культурально-морфологическим признакам (как было предложено ранее) дала положительный результат. В данном случае для отбора 4-х спонтанных мутантов было протестировано всего 100 произвольных клонов. Отсутствие продукции белка Sap подтверждали данными белкового электрофореза, иммуноблота и иммуноэлектронной микроскопии.

Для изучения влияния Sap" мутации на протективные свойства микроорганизма репликон pXOl из донорного штамма В. anthracis передали посредством конъюгации в изогенные антибиотикорезистентные реципиенты на основе исходного штамма В. anthracis SterneAT и его спонтанного Sap" мутанта - В. anthracis SterneATSap+Smr и В. anthracis SterneATSap"Smr. Морских свинок иммунизировали однократно споровыми взвесями трансконъюгантов в концентрации 1 • 10б КОЕ. Через 21 день опытных и контрольных животных заражали культурой В. anthracis 2a51 вакцина Ценковского. Индекс иммунитета штамма на основе Sap" мутанта оказался в 3 раза меньше индекса иммунитета Sap+ варианта. То есть, in vivo белок S-слоя способен усиливать протективную активность продуцирующего ПА штамма сибиреязвенного микроба.

В; совокупности результаты, полученные при изучении защитных свойств белковых препаратов Sap и ЕА1, а также изогенных Sap+ и Sap" штаммов В. anthracis, дают основания, расценивать компоненты S-слоя возбудителя сибирской язвы как дополнительные факторы иммуногенности хромосомной детерминации. Это обстоятельство необходимо учитывать при селекции или, конструировании штаммов'сибиреязвенного микроба, претендующих на роль живых вакцин. Проблемы^ с иммунологической эффективностью живой вакцины В. anthracis СТИ-1 отчасти могут быть объяснены дефектностью штамма по синтезу секретируемого протеина S-слоя.

В создании вакцин нового поколения приоритет отдается рекомбинант-ным технологиям. Генетическое конструирование позволяет манипулировать детерминантами синтеза и регуляции факторов иммуногенности и патогенности микроорганизмов, оказывая опосредованное действие на те или иные звенья иммуно- и патогенезов. Трудности возникают на пути обеспечения выраженной экспрессии клонированных генов и стабильности воспроизведения чужеродной генетической информации.

В успешном конструировании безопасных продуцентов иммуногенных антигенов немаловажную роль играет выбор реципиентной культуры и векторной плазмиды. На наш взгляд, для клонирования гена pag оптимальными системами являются протеазодефицитные бациллярные штаммы. Исходя из перспектив использования рекомбинантных штаммов для промышленного производства ПА, поиск реципиентов остановили на генетически охрактеризованном штамме близкородственного бактериального вида - В. subtilis WB600, и бес-плазмидных производных вакцинных штаммов В. anihracis СТИ-1 и В. anthracis 55. В качестве вектора, способного стабильно функционировать в составе бациллярных штаммов, решили использовать плазмиду pUBllO, характеризующуюся мультикопийностью, небольшим размером и наличием надежного селективного маркера.

С целью введения гибридной ДНК на основе pUBllO в клетки реципи-ентных штаммов оптимизировали методику электростимулируемой трансформации. Определили возможность применения сред с сибиреязвенным у-глобулином для селекции рекомбинантных клонов на основе В. anthracis. Выбрали стратегию клонирования, при которой донором гена pag явился штамм возбудителя, сибирской язвы, содержащий pXOl.

Выделенную из штамма В. anthracis Sterne 34F2 плазмиду pXOl обработали ферментом Ваш HI. Образовавшиеся рестрикты, размером от 4 до 25 т.п.н., разделили электрофоретически. Присутствующий среди фрагментов ДНК участок (6 т.п.н), содержащий ген pag (Vodkin M., Leppla S., 1983), элюировали из агарозного геля и лигировали с векторной плазмидой pUBllO. Лигированный материал передали при помощи электростимулируемой трансформации в реци-пиентные клетки В. anthracis СТИДТ. Антибиотикорезистентные клоны селектировали на среде с сибиреязвенным у-глобулином. Для трансформантов с положительной реакцией диффузионной преципитации изучали белковый состав культуральных фильтратов и плазмидные профили выделенных ДНК. После нескольких пассажей в селективных условиях был отобран клон, стабильно наследующий гибридный репликон. Рестрикционный анализ сконструированной плазмиды pUBllOPA (~10,5 т.п.н.) показал ее соответствие теоретически возможному варианту включения фрагмента pXOl в вектор pUBllO. По данным белкового электрофореза и реакции преципитации на среде с сибиреязвенным углобулином рекомбинантный штамм В. anthracis СТИАТПА продуцировал ос-1 новной иммуноген сибиреязвенного микроба на уровне вакцинной культуры В. anthracis СТИ-1. Прецеденты создания более эффективных рекомбинантных штаммов-продуцентов ПА (Ivins В., Welkos S., 1986; Cohen S. et al., 2000) предопределили продолжение экспериментов.

Как. известно, в процессе трансформации бациллярных штаммов с высокой частотой образуются делеционные производные гибридных молекул ввиду особенностей механизмов проникновения экзогенных молекул ДНК в компетентные клетки бацилл (Щелкунов С., 1994; Hahn J., Dubnau D., 1985). Вероятно, с подобными рекомбинационными, событиями мы столкнулись, пытаясь переклонировать фрагмент, несущий ген pag. Векторную плазмиду, стратегию клонирования и реципиентный штамм использовали те же, что и в первом случае. Однако при осуществлении селекции на среде с у-глобулином были обшн ружено несколько клонов, дающих необычно большие зоны диффузионной преципитации - почти в 10 раз превышающие значения, установленные для штаммов В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis СТИАТПА. Интересно, что только часть селектированных трансформантов активно синтезировала ПА. Совершенно неожиданно среди изолированных рекомбинантов с большими зонами' преципитации выявили клоны, продуцирующие белок S-слоя - Sap. Напомним, что реципиентный штамм не экскретировал Sap. .

Детерминация синтеза белков S-слоя осуществляется хромосомными генами, а регуляция - локализованными на pXOl областями atxA и pagR. Возможно,^ нашем случае в процессе клонирования произошли рекомбинации, затронувшие область негативной регуляции генов pag и sap - pagR область, находящуюся в, непосредственной близости от структурного гена pagA (Hoffmaster А., Koehler Т., 1999(a); Mignot Т. . et al., 2003). В то же время, восстановление способности к экскреции белка S-слоя у части трансформантов свидетельствует об интактности гена в штамме В. anthracis СТИАТ и вовлеченности в мутационный процесс структур, отвечающих за секрецию антигена.

Определяя электрофоретическую подвижность гибридных ДНК, обнаружили репликон, размером 6,5 т.п.н., что на 4 т.п.н. меньше ожидаемого значения. Рестрикционный анализ ДНК плазмиды, обозначенной как риВ110РА-1, выявил протяженную делецию, распространяющуюся на нуклеотидные последовательности рЦВПО и, возможно, область pag. Наличие клонированного гена подвердили, осуществив ПЦР с праймерами на последовательности детерминанты синтеза ПА. Положительными следствиями произошедшей в рЦВ110РА-1 делеции стали, с одной стороны— стабильное функционирование генетической конструкции в составе клеток В. апМгаЫя, с другой - высокий уровень продукции ПА штаммом В. аМкгасгй СТИАТПА-1, содержащим риВ110РА-1.

Успешный опыт воспроизвели на других реципиентах. Гибридный репликон риВ110РА-1 выделили из штамма В. аЫкгаыз СТИАТПА-1 и электрости-мулируемой трансформацией передали в штаммы^. апЖгаЫБ 55АТРг1" и В.г. яиЬйШ \УВ600. Изолированные трансформанты по результатам проведенного тестирования содержали плазмиду рЦВПОРА-1 и локализованный в ее составе ген ра%. Клонированный ген хорошо экспрессировался в бациллярных клетках.

При помощи биохимических (белковый электрофорез концентрированных культуральных фильтратов) и иммунохимических (реакция радиальной диффузной преципитации, иммуноблот, дот-анализ и твердофазный ИФА) методов исследования осуществили сравнительную оценку секреции ПА реком-бинантными штаммами и вакцинными культурами. Необходимые для иммунохимических реакций анти-ПА антитела получали из сывороток кроликов, иммунизированных очищенным препаратом ПА, выделенным из штамма В. аШгаыя СТИАТПА-1. В результате проведенных исследований все генно-инженерные конструкции, вне зависимости от реципиентной основы, обладали одинаково высоким уровнем продукции ПА. В этой связи, необходимо вспомнить, что в эксперимент были взяты только реципиенты с низкой активностью протеолитических ферментов. На основании данных дот-анализа установлено, что продукция ПА штаммами В. апЖгаая СТИАТПА-1 и В. аШЬгаш 55АТПА-1 в 10 и 6 раз превышала его секрецию клетками соответствующих вакцинных культур - В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55. С помощью ИФА определены количественные показатели продукции ПА: 80 - 90 мкг/мл — для рекомбинантов, и 15-20 мкг/мл - для вакцин. Высокая продукция ПА рекомбинантными штаммами с pUBllOPA-1, является следствием увеличения, числа копий гена pag за счет мультикопийности вектора, а также делеции в pagR области, отвечающей за негативную регуляцию синтеза ПА.

Очень важной характеристикой генно-инженерных штаммов, претендующих на роль продуцентов иммуногенных антигенов, является стабильность наследования приобретенной генетической информации. В этой связи; для сконструированных штаммов В. anthracis СТИАТПА-1, В. anthracis 55АТПА-1 и В. subtilis WB600IIA-1 изучали стабильность репликации гибридной плазми-ды in vitro и in vivo. Пассирование культур рекомбинантных штаммов в присутствии селективного антибиотика не приводило к' утрате репликона* pUBllOPA-11. В отсутствие селективного давления^ всех штаммов отмечалипостепенное нарастание темпов элиминации гибридной плазмиды после третьеi» го суточного пассажа. Наибольшей стабильностью в этих условиях обладал штамм В. antracis СТИАТПА-1, наименьшей - В. subtilis WB600. После трехкратных пассажей рекомбинантных культур in vivo все исследованные культуры содержали плазмиду pUBllOPA-1. Стабильность гибридного репликона, на наш взгляд, обеспечена правильным выбором вектора pUBl 10 и делецией сравнительно большой части нуклеотидных последовательностей в результате ре-комбинационных изменений.

Совокупность свойств созданных штаммов В. anthracis СТИАТПА-1, В. anthracis 55АТПА-1 и В. subtilis WB600IIA-1 обуславливает их перспективность в качестве рекомбинантных продуцентов ПА сибиреязвенного микроба. Они могут быть использованы как для лабораторного, так и промышленного получения ПА, так как обладают высоким уровнем продукции ПА, низкой активностью протеолитических ферментов и стабильны при пассировании in vitro и in vivo. По сравнению с вакцинными штаммами В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis

55 рекомбинантные культуры секретируют в 5 раз больше иммуногенного антигена.

В настоящее время источниками иммуногенного антигена возбудителя сибирской язвы являются аттенуированные культуры В. anthracis. Выделяемый из них продукт, используемый для- производства сертифицированных профилактических и диагностических сибиреязвенных препаратов, содержит множество примесей. В их числе присутствуют белки ОФ и ЛФ, имеющие близкие к ПА значения молекулярных масс. Количественный и качественный состав продуктов жизнедеятельности микроорганизма в подобных промышленных образцах не подлежит стандартизации, в то время как по современным требованиям-в химических вакцинах могут присутствовать только- полностью охарактеризованные компоненты, с установленным механизмом действия1 (World health- organization,' 1998). Зарубежными исследователями-предложены эффективные рекомбинантные продуценты ПА (Baillie L., Lestlie W., 2001; Ivins В. et al, 2002)? Разработка улучшенных химических вакцин на основе синтезируемых ими ре-комбинантных антигенов находится на стадии.-доклинических испытаний (Little S. et al., 2004, 2005, 2007; World health organization, 2005). В России достойной альтернативы аттенуированным штаммам В. anthracis создано не было. Преимущества использования сконструированных нами рекомбинантов в качестве эффективных источников получения высокоочищенного белкового продукта, обладающего протективными свойствами, очевидны.*

В соответствии с современной концепцией технология производства, химических сибиреязвенных вакцин должна не только отвечать требованиям биологической безопасности, но и быть экологичной. Имея в виду данное обстоятельство, на следующем этапе исследования поставили задачу создания реком-бинантного продуцента ПА, промышленное и лабораторное культивирование которого не будет сопряжено с риском контаминации помещений-и-оборудования спорами возбудителя сибирской язвы, чрезвычайно устойчивых к действию факторов внешней среды и дезинфицирующих агентов. Единственные зарубежные прототипы аспорогенных бациллярных рекомбинантных продуцентов

ПА (Ivins В., Welkos S., .1986; Worsham РГ, Sowers M., 1999) при всех своих досг тоинствах имели один общий недостаток — высокую активность протеолитиче-ских ферментов, что создавало определенные проблемы в процессе выделения и очистки белкового антигена. Отечественных аналогов: не существовало, за исключением полученных нами аспорогенных: штаммов на основе аттенуиро-ваннных культур В. anthracis,синтезирующих все три компонента сибиреязвенного токсина.

С целью конструирования? стабильного аспорогенного рекомбйнантного штамма В. anthracis с высоким уровнем продукции ПА и низкой активностью , протеолитических ферментов, осуществили генетическую передачу гибриднош нлазмиды pUBl lOPA-1 в; аспорогенный протеазодефицитный бесплазмидный» реципиентный штамм: В. anthracis 55ATPrt"Spo". Исследование изолированных антибиотикорезистентных, трансформантов на наличие рекомбйнантного ренли-кона pUBllOPA-l,. клонированного гена pag и активность. протеолитических ферментов во всех случаях дало ожидаемые результаты. В процессе изучения стабильности трансформаитов было отобрано три клона, срхраняющих гибридную плазмиду в селективных условиях и в течение нескольких пассажей (не более 3-х суток) на средах без антибиотика.

Сравнительную оценку уровней, продукции ПА аспорогенными трансформантами проводили с помощью белкового электрофореза, концентрированных препаратов культуральных фильтратов, реакции радиальной диффузной преципитации и дот-анализа с анителами к ПА. По результатам всех тестов¡Spo" рекомбинанты секретировали больше ПА, чем исходный штамм anthracis 55. Один из клонов по уровню продукции ПА соответствовал спорообразующим генно-инженерным штаммам. На основании данных твердофазного ИФА клетки Ä aw^racw 55ATnA-l(Spo:) экскретировали около 80 мкг/мл ПА.

На модели данного штамма оптимизировали технологию выделения и очистки рекомбйнантного ПА. Прежде всего, внесли некоторые коррекции в процесс культивирования. В исследовательских целях ■ штамм В. anthracis 55ÄTTIA-l(Spo") выращивали на богатой питательной среде (S-бульоне) в атмосфере с повышенным содержанием СОг, то есть, моделируя условия секреции ПА in vivo. Для промышленных масштабов среда с высоким содержанием дорогостоящих фирменных компонентов - триптона и дрожжевого экстракта, слишком 'затратаа. В качестве альтернативы S-бульону предложен бульон Хоттинге-ра-с: добавлением дрожжевого аутолизата. Наиболее важным оказалось наблюдение, что в отличие от культур, содержащих pXOl, продукция ПА рекомби-нантными штаммами с pUBllOPA-1 (в том числе и аспорогенным) не зависит от СОг, ввиду отсутствия у них области, детерминирующей синез СОг - зависимого транскрипционного регулятора - AtxA (Koehler Т. et al., 1994; Hoffmaster А., Koehler Т., 1997; Mignot Т. et al., 2003).

Выделение; ПА осуществляли из 24 часовой бульонной! культуры: В. anthracis 55ATIIA-l(Spo"), выращенной с аэрацией при/ температуре 37 °С. Культуральный фильтрат концентрировали в 10 раз и очищали при помощи ионообменошхроматографии на Macro Prep-50Q,s затем -вновь концентрировали,", в 10 раз и проводили гель-фильтрацию с использованием Sephacryl-HR300. На заключительном этапе препарат опять концентрировали в 10 раз и фильтровали. В результате удалось, достичь почти полного освобождения- образца от сопутствующих примесей: Специфичность выделенного белка; подтверждали: постановкой реакции иммуноблота с антителами к ПА. Выход составил 12,8 мг> препарата ПА на 1 литр культуры аспорогенного рекомбинатного штамма.

Получение высокоочищенного препарата ПА, не содержащего сопутствующих антигенов сибиреязвенного микроба, является важным шагом на пути конструирования профилактических, и диагностических сибиреязвенных препаратов, отвечающих современным требованиям.

То, что сконструированные , бациллярные штаммы эффективно продуцируют ПА, было убедительно ¡ продемонстрировано предыдущими экспериментами. В í задачи^ заключительного раздела исследования входило изучение биологических свойств рекомбинантного ПА. Нам предстояло ответить на вопрос -способен ли белок, кодируемый клонированным геном pag, обеспечивать полноценную защиту лабораторных животных от заражения диплазмидным штаммом В. аШкгаЫз!

Оценку протективной активности генно-инженерных штаммов проводили с использованием различных биомоделей. Иммунизацию осуществляли однократно, подкожно. Иммунизирующая доза тестируемых штаммов для мышей линии ВАЬВ/с составила 3 • 107 спор, морских свинок - 5 • 107. Через 21 день опытных и интактных животных заражали тест-штаммом В. амИтЫя 2-ая вакцина Ценковского в возрастающих дозах. На основании экспериментальных данных подсчитывали ЛД50 тест-культуры и индексы иммунитета штаммов.

На модели мышей линии ВАЬВ/с тестировали культуры В. аШкгасЬ СТИДТПА-1, В. anth.ra.cis 55ДТПА-1 и В. быЬПШ WB600ПA-l в сравнении с вакцинными препаратами В. апМгаЫБ СТИ-1 и В. апМгаш 55. В поствакцинальный период пало 50 % линейных мышей, иммунизированных штаммом В. аШкгаЫБ 55. Препарат В. аШкгаыБ СТИ-1 в иммунизирующей дозе вызвал развитие летального процесса у одной особи. Рекомбинантные штаммы не обладали остаточной вирулентностью. Ввиду превышения допустимого порога летальности при иммунизации, индекс иммунитета и ЛД50 для штамма В. аШкгаЫБ 55 не определяли. Значение ЛД50 тест-штамма для интактных мышей составило 6,8 ■ 103 спор, а для мышей, иммунизированных рекомбинантными культурами - почти на два порядка выше - 6,8 • 105 спор - для В. апМгаЫя СТИДТПА-1; 4,6 • 105 - для В. зиЪйШ ^УВ600ПА-1; и 3,2 • 105 спор - для В. ап-Иггаси 55ДТПА-1. Тот же показатель ЛД50 для контрольного штамма В. аМЬ.гас\8 СТИ-1 оказался сопоставимым со значениями, установленными для рекомбинантов - 8,6 • 105 спор тест-штамма. Соответственно, индексы иммунитета распределились в следующем порядке: для В. ашИтЫя СТИ-1 - 125,9; В. аШкгаск СТИДТПА-1 - 100,0; В. быЫШб ^УВ600ПА-1 - 68,1; для В. аШкгаси 55ДТПА-1 - 46,4.

На модели морских свинок изучали протективную активность штаммов В. аШкгаск СТИДТПА-1 и В. хиЪНШ \УВ600ПА-1 в сравнении с вакциной В. ап-(кгаыъ СТИ-1. В поствакцинальный период от иммунизирующей дозы штамма

В. anthracis СТИ-1 пало семь животных из двадцати взятых в эксперимент (35 %). Летальности лабораторных животных, иммунизированных рекомби-нантными штаммами, отмечено не было. Для интактных животных значение ЛД50 тест-штамма составило 1,3 ■ 103 спор. Для морских свинок, иммунизированных штаммами В. anthracis СТИАТПА71 и В. subtilis WB600IIA-1, этот показатель оказался на 4 порядка выше - 3,2 • 10 спор. Вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1 обеспечивал более эффективную защиту морских свинок - ЛД50 о тест-штамма - 2 ■ 10 спор. Индекс иммунитета коммерческой вакцины составил 158480. Индексы иммунитета штаммов В. anthracis СТИАТПА-1 и В. subtilis WB600IIA-1 оказались одинаковыми - 25117, при требовании не менее 20000 для культуры, претендующей на роль сибиреязвенной вакцины. С одной стороны, различие в значениях индексов иммунитета рекомбинантов и контрольного штамма объяснимо техническими особенностями подготовки спор в лабораторных и промышленных условиях. С другой, оно может являться следствием отсутствия у генно-инженерных штаммов детерминант, обуславливающих синтез ОФ и ЛФ (Pezard С. et al., 1995).

Для подтверждения способности рекомбинантных штаммов вызывать иммунологическую перестройку в организме иммунизированных животных, определяли динамику титра антител. В иммуноферментном анализе исследовали сыворотки крови, взятые на 24-е, 28-е, 32-е и 36-е сутки после введения им дозы 5 • 107 спор тестируемых штаммов В. anthracis СТИАТПА-1 и В. anthracis СТИ-1. Кроме того, исследовали напряженность иммунитета через два, три, три с половиной и четыре месяца от начала эксперимента. Проанализировав данные, полученные для двух групп животных (по три особи на штамм), выявили следующие закономерности. Титры анти-ПА антител у морских свинок, иммунизированных штаммом В. anthracis СТИАТПА-1, в среднем были выше, чем у биомоделей вакцинированных В. anthracis СТИ-1. В случае рекомбинантного штамма В. anthracis СТИАТПА-1 титр антител к ПА нарастал к 36-му дню. В случае В. anthracis СТИ-1 максимальный титр отмечали на 32-е сутки, к 36-му дню происходило некоторое его уменьшение. Начиная с 2 месяцев после иммунизации, титры анти-ПА антител в обеих группах постепенно снижались до средних значений 1:1024 - для вакцинного штамма, и 1:512 - для рекомбинант-ного. В таком соотношении они оставались до конца 4-го месяца наблюдения.

Все вышеиложенное свидетельствует о высокой иммунологической эффективности сконструированных штаммов. Однократная иммунизация споровой взвесью рекомбинантной культуры в дозе 3 или 5 • 107 спор обеспечивает защиту лабораторных животных почти на уровне вакцинного препарата В. anth.ra.cis СТИ-1. Генно-инженерные штаммы способны индуцировать развитие иммунного статуса макроорганизма, характеризующегося длительностью и высокими титрами-антител к ПА. Рекомбинантные штаммы выгодно отличаются от контрольных вакцинных препаратов, ввиду отсутствия у них остаточной вирулентности в отношении использованных в экспериментах биомоделей. На основании сравнения индексов иммунитета, первенство в обеспечении защиты лабораторных животных принадлежит штамму В. аЫкгаш СТИДТПА-1. На-наш взгляд, его "родословная" в сочетании с приобретенными в результате генетического конструирования преимуществами являются основанием расцени вать данный, рекомбинантный штамм как прототип эффективной и безопасной сибиреязвенной вакцины.

Помимо определения иммуногенных свойств рекомбинантных штаммов^ изучали протективную активность белкового препарата ПА, выделенного из ас-порогенного продуцента В. аМкгаы8 55ДТПА-1(8ро"). Лабораторных животных (кроликов) иммунизировали очищенными сибиреязвенными антигенами - ПА и ЕА1, в сочетании с полным адьювантом Фрейнда. Белок Б-слоя ЕА1 добавляли в некоторых случаях к ПА, исходя из его иммуногенногенного и иммуномоде-лирующего действия. Инъекции осуществляли парентерально, двукратно с интервалом в 14 дней. Кроликам первой группы вводили по 50 мкг ПА, второй -по 50 мкг каждого из белков - ПА и ЕА1, третьей - 5*- 107 спор штамма В. аыЬгаа.8 СТИ-1 (однократно). Контрольную группу оставляли интактной. В конце поствакцинального периода определяли титры антител к ПА в сыворотках крови иммунизированных животных. Результаты иммуноферментного анализа свидетельствовали о формировании напряженного иммунитета во всех случаях. Выявлены более высокие титры анти-ПА антител у кроликов, иммунизированных белковыми препаратами. Через 21 день после последней инъекции животных заражали 50 ЛД50 высоковирулентного штамма В. аШЬга&$ 81/1. Все интактные особи пали от сибиреязвенной инфекции на третьи сутки. Кролики, иммунизированные ПА или ПА + ЕА1, а также споровой взвесью вакцинного штамма - выжили. Признаков заболевания не отмечали ни в одном из случаев.

Способность рекомбинантного ПА в сравнительно небольшой дозировке обеспечивать защиту 100% био моделей от заражения вирулентным штаммом В. an.ihra.cis предопределяет главное направление его практического использования - создание средств специфической профилактики сибирской язвы. Высо-коочищенный белковый препарат с ярко выраженными протективными свойствами по праву претендует на роль основного компонента современной химиче-> ской вакцины. Существенный уровень защиты лабораторных животных при одновременном введении ПА и белка Б-слоя* является серьезным поводом для продолжения работ по совершенствованию рецептуры сибиреязвенной вакцины.

Таким образом, проведенные нами исследования заложили прочный фундамент в успешное решение актуальной задачи получения эффективных и аре-актогенных сибиреязвенных вакцин, соответствующих реалиям и возможностям 21-го века.

Преимущества использования генно-инженерных продуцентов заключаются в безопасных и экологичных технологиях получения ПА сибиреязвенного микроба. На основе очищенного рекомбинантного иммуногенного антигена возможно создание менее реактогенных химических вакцин. Сконструированный штамм В. ап^гаш СТИАТПА-1 является оптимальной моделью для улучшенной живой сибиреязвенной вакцины. Экономический эффект от внедрения соответствующих профилактических препаратов будет связан с повышением эффективности вакцинации против сибирской язвы и снижением частоты возникновения побочных реакций.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Микшис, Наталья Ивановна, 2009 год

1. Александров Н.И., Гефен Н.Е., Будак А.П., Рунова В.Ф., Езепчук Ю.В., Бажинов А.Г. Изучение реактогенности химической депонированной сибиреязвенной вакцины на небольших группах людей // Журн. микробиол., эпидемиол, и иммунобиол. 1963(a). - №3.- С. 32-34.

2. Александров Н.И., Гефен Н.Е., Тапочко К.Г.,.Гарин Н.С., Сергеев

3. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. 180 с.

4. Бакулов И.А, Гаврилов В.А., Селиверстов В.В. Сибирская язва (Антракс), новые страницы в изучении "старой" болезни. Владимир: Посад, 2001. -280 с.

5. Бакулов И.А., Гаврилов В.А. Оценка эффективности 10-летнего применения вакцины против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИ ВиМ // Ветеринария; 1994. - №8. - С.11-15.

6. Безденежных И.С., Никифоров В.Н. Эпидемиологический анализ заболеваний сибирской язвы в Свердловске // Журн. микробиол., эпидеми-ол. и иммунобиол. 1980. - № 5. - С.111-113.

7. Безносов М.В. Выделение и изучение специфических антигенов Bacillus anthracis с целью конструирования диагностических и профилактических препаратов // Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1997. -22 с.

8. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. М., 1984.-212с.

9. Васильев Н.Т., Пименов Е.В., Кожухов В.В., Строчков Ю.И., Зубов В.В. Перспективы создания сибиреязвенных вакцин нового поколения // Иммунология. 1999. - №3. - С. 5-8.

10. Гаврилов В.А.; Числов Ю.В.; Николайчук Л.Ф. Способ изготовления вакцины против сибирской язвы животных // Патент РФ № 2095409 (C12N1/20, C12N3/00, А61К39/07, C12N1/20). М.: Государственный реестр изобретений РФ; 10.11.1997.

11. Галкин В.В., Локтионова М.Н., Симонова Е.Г., Хадарцев О.С. Проблемы безопасности сибиреязвенных скотомогильников // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2007. - № 6. - С. 54 - 57.

12. Гинсбург H.H. Живые вакцины. М.: Медицина, 1969. 336с.

13. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ. М.: «Мир», 1988. - 538 с.

14. Головлев Е.Л. Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998. - №2. - С. 149-155.

15. Государственный доклад: О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2006 году. М.: Федеральный центр гигиены и1 эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. - 360 с.

16. Дебабов В.Г. S-слои бактерий и архей как объект бионанотехноло-гий // Молекулярная биология. 2004. - Т. 38. - № 4. - С. 578-591.

17. Дыкман Л.А. Развитие методологии' иммуноанализа почвенных ассоциативных бактерий' с использованием препаратов коллоидного золота // Ав-тореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, ,1996. - 24 с.

18. Еремин С.А., Никифоров А.К., Костюкова Т.А., Микшис Н.И. Изучение способности штаммов возбудителя сибирской язвы к редукции метилено-вого синего // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. - № 4. - С. 91-92.

19. Здоровье населения м среда обитания.Информационный; бюллетень. 2007. - №1. - С. 50 -51.

20. Инструкции и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и леченшо сибирской язвы у людей. М., 1980: - 65 с.

21. Ипатенко НШ. Сибирская язва: М.: Колос, 1996; 335 с.

22. Кисличкина О.Н., Фурсов В.В., Дорожко Г.Ю. //Тез. докл. VI Все-росс. съезда микробиол., эпидемиол; паразитол. М:, 1991. - Т. 2. - С. 179.

23. Кожухов ВВ., Пименов Е.В:,СероглазовВ.В.,.Юдников В.А., Меновщиков В .А.Способ получения- сухой комбинированной сибиреязвенной вакцины // Патент РФ № 2181294 (А61 КЗ 9/07, С12N1/04): М.: Государственный реестр изобретений РФ; 20.04.2002.

24. Коннов Н.П., Байбурин В.Б., Волков ЮЛ, Кузнецов; О.С. Сканирующая туннельная микроскопия возбудителей ООН // Проблемы О0И: Саратов. - 2002. - № 1 (13). - С: 90-95. .

25. Маниатис Т.,, Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярноеклонирование; Пер. с англ.- М:: Мир, 1984.-479 е., ' •

26. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., СтепановчА.В1'и др. Микробиологическая диагностика сибирскойязвы. -М.: ВУИМЦ МЗ РФ, 1999. 222 с.40; Медуницын Н. В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 1999. 272 с.

27. Медуницын Н: В. Вакцины будущего: // Эпидемиология и инфекционные болезни: 1998.-№ 6; - С. 4-8.

28. Онищенко Г.Г. О мерах совершенствования мероприятий по ирофиглактике сибирской язвы в Российской Федерации. Постановление № 41 Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 27.06.2008. 5 с.

29. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н:В., Харечко А. Т., Василь-ев^П1Г., Садовой^НШ^.Кожухов В-В; Сибирская язва: актуальные аспекты;микробиологии; эпидемиологии, клиники,. диагностики, лечения и профилактики -М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999; 447 с.

30. Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей (МУ 3.3.1.1112-02): Методические указания. М., 2002. - 47с.

31. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.:Наука, 1985. 536 с.

32. Практическая химия белка. Пер.- с англ. /Под ред. А. Дарбре. М.:t1. Мир, 1989.-629 с.

33. Северина Л.О. Бактериальные S-слои // Микробиология. 1995. - Т. 64-№6.-С. 725-733.

34. Селянинов Ю.О. Сибирская язва. Биологические и генетические свойства возбудителя и технология получения ассоциированных вакцин на основе штамма 55-ВНИИВВиМ // Автореф. дис. . доктора биол. наук. Покров, 2007.

35. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. -358 с.

36. Степанов A.C. Разработка основ генетического анализа возбудителя сибирской-язвы: Дис. докт. мед. наук. Саратов, 1992. - 333 с.

37. Степанов A.C., Гаврилов C.B., Пузанова О.Б., Григорьева Т.М., Азизбекян P.P. Трансдукция плазмид бактериофагом GP54 Bacillus anthracis // Молекул, генетика, микробиол., вирусол. 1989 (а). - №.1- С. 14-19.

38. Степанов А.С., Пузанова О.Б., Гаврилов С .В., Брандзишевский Ю.В., Братин И:В., Анисимов П.И. Трансдукционная.и коньюгационная передача плазмиды рХ02 Bacullus anthracis // Молекул, генетика,- микробиол., виру-сол. 1989 (б).- №12. - С.39-43.

39. Тамарин А.Д., Спицын Н.А. Производство- сибиреязвенной вакцины СТИ. Сб. работ НИИ эпидемиол. и гигиены-Красной Армии. М., Медгиз, 1946.- С.153-171.

40. Терентиев Ф. А. Сибирская язва животных и борьба с ней. М.: Сель-хозгиз, 1946. 62 с.

41. Тучков И. В., Куличенко А.Н., Норкина О.В., Дроздов И.Г. Детекция штаммов сибиреязвенного микроба с использованием полимеразной цепной реакции // Генет., микробиол., и совершенствование методов лаб. диагн. особо опасных инф. Саратов, 1991. - С. 89-91.

42. Фримель Г. Иммунологические методы: Пер. с англ. М.: Медицина, 1987. - 472 с.

43. Хайкинсон М.Я., Рабинович П.М., Степанов А.И: Модели трансформации Bacullus subtilis плазмидной ДНК // Докл. АН СССР. М. - 1982(a). - Т. 265.-№5.-С. 1264-1267.

44. Хайкинсон М.Я., Рабинович П.М., Степанов А.И. Роль прямых и инвертируемых повторов-в трансформации Bacullus subtilis плазмидной ДНК // Докл. АН СССР: М. - 1982(6). - Т. 265. - №4: - С. 975-978.

45. Цыганкова О.И. Гемолитическая и протеолитическая активность сибиреязвенного микроба: Дисс.канд. мед. наук. Ставрополь, 1993. - 179 с.

46. Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М.: «Интерсэн», 2002. 384 с.

47. Шляхов Э.Н. Сибиреязвенная аллергия. Кишинев, Картя Молдовеняска, 1968, 188 с.

48. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия: Учеб. пособие: В 2 ч. -Новосибирск: изд-во Новосиб. Ун-та, 1994. 304 с.

49. Ясинский^ А.А., Котова Е.А., Перевощикова А.А., Скворцова Е.Г.,t

50. Лазикова Г.Ф. Эпидемиологическая ситуация в Российской Федерации в 2004 г. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2005. - № 2(21). - С. 6 - 13.

51. Abramova F., Grinberg L., Yampolskaya О., Walker D. Pathology of in-halational anthrax in 42 cases from the S verdlovsk оutbreak of 1979 / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 2291-2294.

52. Akaike Y., Ando K., Moritani J. Some biological properties and virulence of Bacillus anthracis // Bull. Nat. Inst. Animal Health. 1962. - V. 44. - P. 8-12.

53. Albrink W., Brocks S., Biron R., Kopel M. Human Ingalation Anthrax: A Report of fhree fatal Cases // Amer. J. Path. 1960. - V.36. - № 4. - P. 457-472.

54. Antelmann H., Williams R., Miethke M., Wipat A., Albrecht D., Har-wood C., Hecker M. The extracellular and cytoplasmic proteomes of the non-virulent Bacillus anthracis strain UM23C1-2 // Proteomics. 2005. - V. 5. - P. 3684-3695.

55. Azhar A., Singh S., Anand K., Bhatnagar R. Expression of protective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccine against anthrax // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - V. 299. - № 3 - P.345-351.

56. Baillie L. Past, imminent and future human medical countermeasures for anthrax // J. Appl. Microbiol. 2006. - V. 101. - № 3. - P. 594-606.

57. Baillie L., Leslie W. Vaccine production of the Bacillus anthracis protective antigen // United States Patent № US6267966 (C12N15/31; A61K39/07; C12R1/125) 2001.

58. Baillie L., Hebdon R., Flick-Smith H., Williamson D. Characterisation of the immune response to the UK human anthrax vaccine // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003. - V. 36. - № 1 - 2. - P. 83 - 86.

59. Baillie L., Moir A., Manchee R. The expression of the protective antigen of Bacillus anthracis in Bacillus subtilis II J. Appl. Microbiol. 1998(a). - V. 84. -№5. -P. 741-746.

60. Baillie L., Moore P;, McBride B. A heat-inducible Bacillus subtilis bacteriophage phi 105 expression system for the production of the protective antigen of Bacillus anthracis IIFEMS Microbiol. Lett. 1998(6). - V. 163. - №1. - P. 43-47.

61. Baillie L., Townend T., Walker N., Eriksson U., Williamson D. Characterization of the human immune response to the UK anthrax vaccine // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2004. - V. 42 - № 2. - P. 267-270.

62. Barnard J., Friedlander A. Vaccination against anthrax with attenuated recombinant strains of Bacillus anthracis that produce protective* antigen // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - № 2. - P. 562-567.

63. Bartkus J., Leppla S. Transcriptional regulation of the protective antigen of Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1989. - V. 57. - P. 2295-2300.

64. Beal F., Taylor M., Thorne C. Rapid lethal effect in rats of a third component found upon fractionating the toxin of Bacillus anthracis II J. Bacteriol. 1962. -t V. 83.-P. 1274-1280.

65. Beauregard K., Collier R., Swanson J. Proteolytic activation of receptor-bound anthrax protective antigen on macrophages promotes its internalization // Cell. Microbiol. 2000. - V. 2. - P. 251-258.

66. Bourgogne A., Drisdale M., Hilsenbeck S., Peterson S., Koehler T.

67. Global effect of virulence gene regulators in a Bacillus anthracis strain with both virulence plasmid II Infect. Immun. 2003. - V. 71. - №. 5. - P. 2736 - 2743.

68. Brachman P. Bioterrorism: an update with a focus on anthrax // Am J. Epidemiol. 2002. - V. 155. - P. 981-987.

69. Brachman P., Gold H., Plotkin S., Fekety F. Field evalution of a human anthrax vaccine. Amer. J. Publ. Hlth. - 1962. - V. 52. - № 4. - P. 632-645.

70. Brachman P., Kaufmann A., Dalldorf F. Industrial inhalation anthrax // Bacteriol. Rev. 1966. - V. 30. - № 3. - P. 184-219.

71. Bragg T., Robertson D. Nucleotide sequence and analysis of the lethal factor gene (lef) from Bacillus anthracis II Gene. 1989. - V. 81. - P. 45-54. - '

72. Brigidi P., Rossi E., Bertarini M. Genetic transformation of intact cells of Bacillus subtilis by electroporation // FEMS Microbiol. Let. 1990. - V. 67. - P. 135138.

73. Brossier F., Sirard J., Guidi-Rontani C., Duflot E., Mock M. Functional analysis of the carboxy-terminal domain of Bacillus anthracis protective antigen // In- "* feet. Immun. 1999. - V. 67. - № 2. - P. 964-967.

74. Brossier F., Weber-Levy M., Mock M., Sirard J. Role of toxin functional domains in anthrax pathogenesis // Infect. Immun. 2000. - V. 68. - № 4. - P. 17811786.

75. Bush L. Abrams B., Beall A. et al. Index case of fatal inhalational anthrax due to bioterrorism in the United States // N. Engl. J. Med. 2001. - V. 345. - P. 16071610.

76. Campbell J., Clement K., Wasserman S., Donegan S., Chrisley L., Kotloff K. Safety, reactogenicity and immunogenicity of a recombinant protective antigen anthrax vaccine given to healthy adults // Hum. Vaccin. 2007. - V. 3. - № 5.-P. 205-211.

77. Candela T., Mignot T., Hagnerelle X., Haustant M., Fouet A. Genetic analysis of Bacillus anthracis Sap S-layer protein crystallization domain // Microbiol. -2005. V. 151.-№5.-P. 1485- 1490.

78. Candela T., Fouet A. Bacillus anthracis CapD belonging to the gamma-glutamyltranspeptidase family is required for the covalent anchoring of capsule to peptidoglycan // Mol. Microbiol. V. 57. - № 3. - P. 717-726.

79. Candela T., Mock M., Fouet A. Cap E, a 47 amino acid peptide, is necessary for Bacillus anthracis poly glutamate capsule synthesis // J. Bacteriol. 2005. -V. 187. - № 22. - P: 7765-7772.

80. Cartwright M., M cChesney A., J ones R. V accination-related a nthrax i n three llamas // Am. Vet. Med. Assoc. 1987. - V. 191. - P. 715 716.

81. Cataldi A., Labruiere E. Genetic study of toxin expression in Bacillus anthracis II In: P.C.B.Turnbull (ed.), Proc. Int. Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Winchester, England. 1989. - P. 60-61. :

82. Cataldi A., Labruiere E. Mok M. Construction and, characterization of a protective antigen deficient Bacillus anthracis strain // Mol. Microbiol. - 1990. - V. 4.-№7.-P. 1111-1117.

83. Centers for Disease Control and Prevention. Use of Anthrax Vaccine in the United States: recommendations of the Advisory Committee on Immunization* Practices (ACIP) // Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2000. - V. 19. - P. 5-7.

84. Chabot D., Scorpio A., Tobery S., Little S., Norris S., Friedlander A. Anthrax capsule vaccine protects against experimental infection // Vaccine. 2004. -V. 23. -№ l.-P. 43-47.

85. Chauhan V., Singh A., Waheed S., Singh S., Bhatnagar R. Constitutive expression of protective antigen gene of Bacillus anthracis in Escherichia coli II Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 283. - № 2. - P. 308-315.

86. Chichester J., Musiychuk K., de la Rosa P., Horsey A., Stevenson N., Ugulava N., Rabindran S., Palmer G., Mett V., Yusibov V. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis II Vaccine. 2007. - V. 25. - № 16. - P. 31113114.

87. Dai Z., Kóehler T. Regulation of anthrax toxin activator gene (atxA) expression in Bacillus anthracis: temperature, not CC^/bicarbonate, affects AtxA synthesis // Infect. Immun. 1997v.- V. 65: - №7. - P: 2576 - 2582.

88. DaivZ., Sirard J., Mock Mi, Kochler T. The atxA gene product activates transcription of the anthrax toxin genes-and is essential for virulence // Mol. Microbio^-1995. V. 16. - P: 1171-1181.

89. Davies J. A major epidemic of anthrax in Zimbabwe. Part II // Cent. Af-ric. J. Med. 1983. V.29. P. 8-12.

90. Davies J. A major epidemic of anthrax in Zimbabwe. The experience at the Beatrice Road Infectious Diseases Hospital, Harare. // Cent. Afric. J. Med, 1985. -V.31.-P. 176-180.

91. Davies J. A major epidemic of anthrax in Zimbabwe. The spread of the epidemic in Matabeleland, Midlands and Mashonaland provinces during the period November, 1978 to October, 1980 // Cent. Afric. J. Med. 1982. - V. 28. - № 12. - P. 291-298.

92. Dretzen G., Bellard M., Sasson-Corsi P., Chambon P. A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels // Anal. Bio-chem. 1980. - V. 112. - P. 295-299.

93. Drysdale M., Bourgogne A., Hilsenbeck S., Koehler T. AtxA controls Bacillus anthracis capsule synthesis via acpA and a newly discovered regylator acpB II J. Bacterid. 2004. - V. 186. - № 2. - P. 307-315.

94. Escuyer V., Duflot E., Sezer O., Danchin A., Mock M. 1988. Structural homology between virulence-associated bacterial adenylate cyclases. // Gene. 1988. -V.71.-P. 293-298.

95. Etienne-Toumelin I., Sirard J., Duflot E., Mock M., Fouet A. Characterization of the Bacillus anthracis S-Layer: cloning and sequencing of the structural gene 11 J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - № 3. - P. 614 - 620.

96. Ezzell J., Abshire T. Immunological analysis of cell-associated antigens of Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1988. - V. 56. - №2. -P: 349 -356.

97. Farchaus J., Ribot W., Downs M., Ezzell J. Purification and characterization of the major surface array protein; from the avirulent Bacillus anthracis delta Sterne-1 //J; BacterioK 1995;.-V. 177. № 9; - P. 2481 -2489;

98. Farchaus J., Ribot W., Jendrek S.,.Eittle Si Fermentation, purification; and characterization ofprotective antigen from a recombinant, avirulent strain oiBacillus anthracis II Appl. Environ-. Microbiol. 1998. - V. 64. - № 3. - P. 982-991.

99. Friedlander A., Pittman P., Parker G. Anthrax vaccine:, evidence for safety and efficacy against inhalational anthrax // JAMA. 1999 - V. 282. - P. 2104—, 2106.

100. GafO;,,Grosfeld H:, Ariel N; Search for^ ah^racw potential vac-. cine candidates by a functional genomic-serologic screen // Infect. Immun. 2006: -V. 74. - №'7. — P.3987 - 400Г: '

101. Gat O:, Grosfeld H., Shafferman A. In vitro screen of bioinformatically selected Bacillus anthracis vaccine candidates by coupled transcription; translation, and immunoprecipitation analysis // Methods Mol. Biol: 2007. - V. 375. - P. 211233.

102. Gat O., Mendelson I., Ghitlaru Т., Ariel N., AltboumfZ^, Levy H., Weiss S., Grosfeld H., Cohen S., Shafferman A. The solute-binding component of a putative Mn(II) ABC transporter (MntA) is a nove\ Bacillus anthracis virulence determinant //

103. Mol. Microbiol. -2005. -V. 58. № 2. - P. 533-551.

104. Gerhardt P. Cytology of Bacillus anthracis II Fed. Proc. 1967. - V. 26. -P. 1504-1517.

105. Gladstone G. Immunity of anthrax: protective antigen present in cell-free culture filtrates // Brit. J. Exp. Pathol. 1946. - V. 27. - P. 393-410.

106. Green B., Battisti L., Koehler T., Thorne C., Ivins B. Demonstration of capsule plasmid in Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1985. - V. 49. - № 2. - P. 291 - 297.

107. Gu M., Leppla S., Klinman D: Protection against anthrax toxin by vaccination with a DNA plasmid encoding anthrax protective antigen // Vaccine. 1999. -V. 17. -№4.-P. 340-344.

108. Guidi-Rontani C., Pereira Y., Ruffi'e S., Sirard J., Weber-Levy M., Mock M. Identification and characterization of a germination operon on the virulence plasmid pXOl of Bacillus anthracis II Mol. Microbiol. 1999. - V. 33. - P. 407-414.

109. Guidi-Rontani C., Weber-Levy M., Mock M., Cabiaux V. Translocation of Bacillus anthracis lethal5 and odema factors across endosome membranes // Cell. Microbiol. 2000. - V. 2. - P. 259-264.

110. Guignot J., Mock M., Fouet A. AtxA activates the transcription of genes harbored by both Bacillus anlhracis virulence plasmids // FEMS Microbiol. Lett. -1997. V. 147. - P. 203-207.

111. Gupta P., Waheed S., Bhatnagar R. Expression and purification of the recombinant protective antigen of Bacillus anthracis II Protein Expr. Purif. 1999. - V. 16. - № 3. - P. 369-376.

112. Hadjifrangiskou M., Chen Y., Koehler T. The alternative sigma factor sigmaH is required for toxin gene expression by Bacillus anthracis II J. Bacterid. -2007.-V. 189. -№5.-P. 1874-1883.

113. Hahn J., Dubnau D. Analysis of plasmid deletional instability in Bacillus subtilis //J. Bacteriol. 1985. - V. 162. - P. 1014-1023.

114. Hahn U., Aichler M., Boehm R., Beyer W. Comparison of the immunological memory after DNA vaccination and protein vaccination against anthrax in sheep // Vaccine. 2005. - V. 24. - № 21. - P. 4595 - 4597.

115. HahnU., Alex M., Czerny C., Bohm R., B eyer W. P rotection o f mice against challenge with Bacillus anthracis STI spores after DNA vaccination // J. Med. Microbiol. 2004". - V. 294. - № 1. - P! 35-44.

116. Hanna P. Anthrax pathogenesis and host response // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1998. - V. 225. - P. 13-35.

117. Hoffinaster A., Koehler T. Autogenous regulation of the Bacillus anthracis pag operon. // J. Bacteriol. 1999(a). - V. 181. - P. 4485-4492.

118. Hoffinaster A., Koehler T. Control of virulence gene expression in Bacillus anthracis //J. Appl-. Microbiol. 1999(6). - V. 87. - P. 279-281.

119. Hoffinaster A., Koehler T. The anthrax toxin activator gene atxA is associated with C02-enhanced non-toxin gene expression in Bacillus anthracis II Infect. Immun. -1997. -V. 65. P. 3091-3099.

120. Holt S., Leadbetter E. Comparative ultrastructure of selected aerobic spore-forming bacteria: a freeze-etching study // Bacteriol. Rev. 1969. - V. 33. - P. 346-378.

121. Hull A., Criscuolo C., Mett V., Groen H., Steeman W., Westra Hi, Chapman G., Legutki Bl, Baillie L., Yusibov V. Human-derived,, plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax // Vaccine. 2005. - V. 23. - P. 2082

122. Ivins B., Welkos S. Cloning* and expression of Bacillus anthracis protective antigen in Bacillus subtilis II Infect. Immun. 1986. - V. 54. - P. 537-542.

123. Ivins B., Welkos S., Little S., Crumrine M., Nelson G. Immunization against anthrax with Bacillus anthracis protective antigen combined with adjuvants II Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - № 2. - P. 662-668.

124. Ivins B., Worsham P., Friedlander A., Farchaus J., Welkos S. Method of making a vaccine // United States Patent № US2002034512 (C12N15/75; C12N15/74). 21.03.2002.

125. Jendrek S., Little S., Hem S., Mitra G., Giardina S. Evaluation of the compatibility of a second generation recombinant anthrax vaccine with aluminum-containing adjuvants // Vaccine. 2003. - V. 21. - P. 3011-3018.

126. Klein F., Hodges D., Mahlandt B., Jones W., lleines B., Lincoln R. Anthrax toxin: causative agent in. the death of rhesus monkeys // Science:. 1962. -V:i38i - № 3547. -¥■: 1331- 1333;.

127. Klimpel' K., Arora-N., Leppla S . Anthrax toxin lethal factor contains a zinc metalloprotease: consensus sequencerwhich is required^for lethaFtoxin; activity // Moli Microbiol: 1994. - V. 13: - P. 1093-1100.

128. Kobiler D., Gozes Y., Rosenberg H;, Marcus D., Reuveny S., Altboum Z. Efficiency of protection of guinea pigs against infection withBacillus anthracis spores by passive immunization // Infect. Immun. 2002. - V. 70. -№ 2. - P. 544-560.

129. Koehler T., Dai Z., Kaufman-Yarbray M. Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen gene: GO2 and a trans-acting element activate: transcription from one of two promoters. // J: Bacterid. 1994. - V. 176. - P. 586 - 595.

130. Koprowski H. Old and new prescriptions for infectious diseases and the newest recipes for biomedical products in plants // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 2002. - V. 50. - №. 6. - P. 365-369.

131. Koya V., Moayeri M., Leppla S., Daniell H. Plant-based vaccine: mice immunized with chloroplast-derived anthrax protective antigen survive anthrax lethal toxin challenge // Infect. Immun. 2005. - V. 73. - № 12. - P. 8266-8274.

132. Lee J., Hadjipanayis A., Welkos S. Venezuelan equine encephalitis virus-vectored vaccines protect mice against anthrax spore challenge // Infect. Immun. -2003. V. 71. - № 3. - P. 1491-1496.

133. Leppla S. Anthrax toxin edema factor: a bacterial* adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations in eukaryotic cells // Proc. Natl. Acad.- Sci. USA. 1982.-V. 79. - P. 3162-3166?

134. Leppla S. Anthrax toxins. In Bacterial Toxins and Virulence Factors in Disease, ed. J. Moss, B. Iglewski, M. Vaughan, A. Tu. New York/Hong Kong: Basel, 1995.-V. 8.-P. 543-572.

135. Leppla S. Production and purification of anthrax toxin // Methods Enzy-mol. 1988. - V. 165. - P. 103-116.

136. Leppla S. The anthrax toxin complex. In: Alouf J. and Freer J., Sourcebook of bacterial protein toxins, London: Academic Press., 1991. P. 277-302.

137. Lereclus D., Mahillon J., Menou G., Lecadet M. Identification of Tn4430, a transposon of Bacillus thuringiensis functional in Escherichia coli II Mol. Gen. Genet. 1986. - V. 204. - P. 52-57.

138. Lerner E. Biomimetic nanotechnology // The Industrial Physicist. 2004. -V. 8.-P. 16-19.

139. Linkoln R., Fish D. Anthrax toxin: In: T. Montie, S. Kadis, S. Ajl:, Microbial Toxins HI, New York, 1970. P: 361-414.20K Little S., Ivins B: Molecular pathogenesis of Bacillus anthracis infection II Microbes Infect. 1999: - V. 1. - P. 131-139.

140. Little S., Ivins B., Fellows P!, Pitt M., Norris S., Andrews G. Defining a serological correlate of protection in rabbits ; for a recombinant anthrax vaccine // Vaccine. 2004. - V. 22. - P. 422-430:

141. Little S., Ivins Bl, Webster W., Fellows P.", Pitt M., Norris S., Andrews G. Duration of protection of rabbits after vaccination with Bacillus anthracis recombinant protective antigen vaccine // Vaccine. 2006. - V. 24. - № 14. - P. 2530 - 2536.

142. Little S., Ivins B., Webster W., Norris S., Andrews G. Effect of aluminum hydroxide adjuvant and formaldehyde in'the formulation of rPA anthrax vaccine // Vaccine. 2007. - V. 25. - № 15. - 2771-2777.

143. Makino S., Sasakawa G., Uchida N., Terakado N., Yoshikawa M. Glon-ing and'CC>2 dependent expression of the genetic region for encapsulation from Bacillus anthracisHMol; Micobiolï - 1988Î - V. 2:.-№î7. -P:.371-376^

144. Makino S., Uchida N.j Terakado N, Sasakawa C,-Yoshikawa M; Molecu-làr characterizations andsproteimanalysesv of cap region which is-essential for encapsulation m Bacillus anthracis II J; Bacteriol. 1989. -V. 171.- P. 722-730: " '

145. Meselson M., Guillemin J., Hugh-Jones M. The Sverdlovsk anthrax outbreak of 1979 // Science. 1994. - V. 266. - P. 1202-1208.

146. Mesnage S, Fouet A. Plasmid-encoded autolysin in Bacillus anthracis: modular structure and catalytic properties // J. Bacterid. 2002. - V. 184. - № 1. - P. 331-334.

147. Mesnage S., Tosi-Couture E., Gounon P.', Mock.M!, Fouet A. The capsule and. S-layer: two independent and yet compatible macromolecular structures in Bacillus anthracis II J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - № 1. - P. 52-58.

148. Mesnage S., Tosi-Couture E., Mock M. Gounon P., Fouet A. Molecular characterization of the Bacillus anthracis main S-layer component: evidence that it is the major cell-associated antigen // Mol. Microbiol. 1997. - V. 23. - № 6. - P. 1147-1155.

149. Mesnage S., Tosi-Couture E., Mock M., Fouet A. The S-layer homology domain as a means for anchoring heterologous proteins on the cell surface of Bacillus anthracis II J. Appl. Microbioli 1999(a). - V. 87. - P. 256-260.

150. Mesnage S., Weber-Levy M., Haustant M., Mock M., Fouet A. Cell surface-exposed tetanus toxin" fragment C produced by recombinant Bacillus anthracis protects against tetanus toxin // Infect. Immun. 1999(b). - V. 67. - № 9. - P: 48474850.

151. Meynell E., Meynell G. The roles of serum and1 carbon dioxide in capsule formation by Bacillus anthracis // J. Gen. Microbiol. 1964. - V. 34. - P. 153-164.

152. Mignot T., Denis B., Couture-Tosi E., Kolsto A., Mock M., Fouet A. Distribution of S-layers on the surface of Bacillus cereus strains: phylogenetic origin and ecological pressure // Environ. Microbiol. 2001. - V. 3. - № 8. - P. 493-501.

153. Mikesell P., Ivins B:, Ristroph J:, Dreier T. Evidence for plasmid-mediated toxin production in^aaV/Mi anthracis II Infect. Immun. 1983. - V. 39. - P: 371-376.

154. Miller J., McBride B*, Manchee R., Moore P., Baillie L. Production and purification of recombinant protective antigen and protective efficacy agamst Bacillus anthracis II Lett.Appl. Microbiol: 1998. - V. 26. - № V. - p. 56-60.

155. Milne J., Blanke S., Hanna P., Collier R. Protective antigen-binding domain of anthrax lethal factor mediates translocation of a heterologous protein fused to its amino- or carboxy-terminus // Mol. Microbiol. 1995. - V. 15. - P. 661-666.

156. Mock M., Fouet A. Anthrax II Microbiol. Rev. 2001'. - V. 55. - P. 647671.

157. Mock M., Labruy'ere E., Glaser P., Danchin A., Ullmann A. Cloning and expression of the calmodulin-sensitive Bacillus anthracis adenylate cyclase in Escherichia coli // Gene. 1988. - V. 64. - P. 277-284.

158. Pavlov V., Tedikov V., Mokrievich A . Cloning of on pXOI and paggene of Bacillus anthracis in Francisella tularensis. In; Proc. Int; Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Winchester, England, 1995; -P: 108-109:

159. Park Y., Lee J., Hung C., Wu T., Kim T. Enhancement of antibody responses to^Bacillus anthracis-protective antigen^^^ domain-IV by useroficalreticulinias'-a chimeric molecular adjuvant // Infect. Immun. 2008. - V. 76. - № 5. - P: 19521959. •

160. Perkins S., Flick-Smith H., Garmory H:, Essex-Lopresti A., Stevenson F., Phillpotts R. Evaluation of the VP22 protein for enhancement of a DNA vaccine against anthrax // Genet. Vaccines Ther. 2005. - V. 3. - № 1. - P: 3.

161. Petosa C., Collier R., Klimpel^ K., Leppla S., Liddington R. Crystalistructure ofthe anthrax toxin protective antigen // Nature. 1997. - V. 385. - P. 833-838.

162. Read T.D., Peterson S.,' Tourasse N. et al. The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to-closely related bacteria // Nature: 2003. - V. 423.-P. 81-86. \

163. Redmond C., Pearce M., Manchee R. Deadly relic of the Great War // Nature. 1998. -V. 393. -P. 747-748.,

164. Robertson D., Leppla S. Molecular cloning and expression in Escherichia coli of thelethal factor, gene of Bacillus anthracis II Gene. 1986. - V. 44. - P. 71-78.

165. Sara M.-, Sleytr U. Biotechnology and biomimetic with crystalline bacterial cell surface layers (S-layers) // Micron. 1996. - V. 27. - P. 141-156.

166. Sara M., Sleytr U. S-layer proteins // J. Bacteriol. 2000? - V. 182. - P. 859-868.

167. Schaffer C., Messner P. The structure of secondary cell wall polymers: how Gram-positive-bacteria stick their cell walls together // Microbiol. 2005. - V. 151.-P. 643-651.

168. Singh Y., Leppla S., Bhatnagar R., Friedlander A. Bases of cellular sensitivity and resistance to anthrax lethal toxin. In: P.C.B.Turnbull, Proc. Int. Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Winchester, England, 1989. P. 51.

169. Singh1 Y., Ivins B., Leppla S. Study of immunization against anthrax with the purified recombinant protective antigen of Bacillus anthracis II Infect. Immun. -1998. V. 66. - № 7. - P. 3447-3448.

170. Singh Y., Klimpel K., Arora N., Sharma M., Leppla^ S. The chymotryp-sinsensitive site, FFD315, in anthrax toxin protective antigen is required for translocation of lethal factor // J: Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 29039-29046.

171. Sirard J., Mock M., Fouet A. The three Bacillus anthracis toxin genes are coordinately regulated by bicarbonate and temperature // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. -P. 5188-5192.

172. Sirisanthana. T., Navachareon N., Tharavichitkul P., Sirisanthana V., Brown A. Ontbreak of oral-oropharyngeal anthrax: An unusual manifestation of human infection with Bacillus anthracis II Am. J. Trop. Med. Hyg. 1984. - V. 33. - № l.-P. 144-150.

173. Sleytr U. Basic and applied S-layer research: an overview // Microbiol. Rev. 1997. - V. 20.-P. 5-12.

174. Sleytr. U. Regular array of macromolecules bacterial »cell walls: structure, chemistry, assembly and function // Int. Rev. Cytol. 1978. - V. 53. - P.' 1-64.

175. Sloat B., Cui Z. Nasal immunization with a dual antigen anthrax vaccine induced strong mucosal and systemic immune responses against toxins and bacilli // Vaccine. 2006. - V. 24. - P. 6405-6413.

176. Sloat B., Cui Z. Nasal immunization with anthrax protective antigen protein adjuvanted with polyriboinosinic-polyribocytidylic acid induced strong'mucosal, and systemic immunities II Pharm Res. 2006. - V. 23. - № 6: - P.11217-1226:

177. Sloat B., Shaker D., Le U., Cui Z. Nasal immunization with the mixture of PA63, LF, and a PGA conjugate induced strong antibody responses against all three antigens // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2008. - V. 52. - № 2. - P. 169 -179.

178. Smith H., Keppie J., Stanley J. The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. The specific toxin produced by Bacillus anthracis in vivo // Br. J. Exp. Pathol. 1955. - V. 36. - P. 460-472.

179. Spencer R., Lightfoot N. Preparedness and response to bioterrorism // J. Infect. 2001.-V.43.-P.104-110.

180. Spencer R., Wilcox M. Agents of biological warfare // Rev. Med. Microbiol. 1993. - V. 4. - P. 138-143.

181. Stanley J., Smith H. Purification.of factor I'and recognition of third factor of the anthrax' toxin //J. Gen.Microbiol. 1961- - V. 26. - P. 49-66.

182. Stanley J., Smith H. The three factors of anthrax toxin: their immuno-genicity and lack of demonstrable enzyme activity // J. Gen. Microbiol. 1963. - V. 31.-P. 329-327.

183. Stepanov AM arinin LP omerantsev A., Staritsin N. Development o f novel vaccines against anthrax in man // J. Biotechnol: 1996. - Vol: 44. - P. 155160.

184. Sterne M. Avirulent anthrax vaccine // Onderstepoort J. Vet. Sci. Animal-Ind. 1937. - V. 21. - P. 41-43:

185. Stulke J.' Regulation-of virulence in Bacillus anthracis: the phosphotransferase system transmits the signals // Mol. Microbiol. 2007. - V.63. - № 3. - P. 626-628.

186. Swanson-Biearman B., Krenzelok E. Delayed life-threatening reaction to anthrax vaccine // J. Clin. Toxicol. 2001. - V. 39: - № 1. - P. 81-84.

187. Thorne C. Biochemical properties and virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis II Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1960. - V. 88. - P: 1024 - 1033.

188. Thorne C. Genetic and physiological studies of Bacillus anthracis related to development of* an improved, vaccine. In: Annu. Progr. Rep. Univ. Mass. -1989.-P: 1-58.

189. Thorne C. Transduction in Bacillus cereus and'Bacillus anthracis II Bac-teriol. Rev. 1968. - V. 32. - P. 358 - 361.

190. Thorne C., Monlar D. D-aminoacid transamination in Bacillus anthracis II J. Bacteriol. 1955. - V. 70. - P. 420-426.

191. Tippets M:, Robertson« D. Molecular cloning and1 expression of Bacillus anthracis edema factor toxin gene: a calmodulin-dependent adenylate cyclase // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - № 5. - P. 2263 - 2266.

192. Towbin H., S taehelin T., G ordon J. E lectrophoretic transfer of p roteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979: - Vol. 76. - P: 4350-4354.

193. Turnbull P: Anthrax vaccines: past, present and future // Vaccine. 1991. - V. 9. - P. 533-539.

194. Turnbull P., Broster M., Carman J. Development of antibodies to protective antigen and lethal factor components of anthrax toxin in humans and guinea pigs and their relevance to protective immunity // Infect. Immun. 1986. - V. 52. - P. 356363.

195. Uchida I., Sekizake T., Hashimoto K., Terakado N. Association of the incapsulation of Bacillus anthracis with* 60 megadalton plasmid // J. Gen. Microbiol. 1985. - V. 131. - P. 363-367.

196. Uchida I., Hornung J., Thorne C., Klimpel K., Leppla S. Cloning and characterization-of a gene whose product is a trans-activator of anthrax toxin synthesis // J. Bacteriol. 1993(a). - V. 175. - P. 5329 -5338.

197. Uchida P., Makino-S., Sasakawa C., Yoshikawa M., Sugimoto C., Tera-kado N. Identification of a novel gene, dep, associated with depolymerization of the capsular polymer in Bacillus anthracis II Mol. Microbiol. 1993(6). - V. 9. - P.' 487496.

198. Uchida E, Makino S., Sekizaki T., Terakado N. Cross-talk to the genes for capsule synthesis of Bacillus anthracis by atxA, the gene encoding íra/w-activator anthrax toxin synthesis // Mol. Microbiol. 1997. - V. 23. - P. 1203-1213.

199. Vetter S., Schlievert P. The two-component system Bacillus respiratory response A and B (BrrA-BrrB) is a virulence factor regulator in Bacillus anthracis II Biochemistry. 2007. - V. 46. - № 25. - P. 7343-7352.

200. VietriN., Marrero R., Hoover T., WelkosS. Identification and,characterization of a trans-activator involved in the regulation of encapsulation by Bacillus anthracis II Gene. 1995'. - V. 152. - P. 1-9:

201. Vodkin M., Leppla S. Cloning of the protective antigen gene'of Bacillus anthracis II Cell. 1983. - V. 34. - P. 693-697.

202. Walker D., Yampolska O., Grinberg L. Death at Sverdlovsk: What we learned? // Am. J. Pathol: 1994. - V. 144. - № 6. - P. 1135-1141.

203. Watson J., Koya V., Leppla S., Daniell H. Expression of Bacillus anthracis protective antigen in transgenic chloroplasts of tobacco, a non-food/feed crop // Vaccine. 2004*. - V. 22. - № 31-32. - P. 4374-4384.

204. Welkos S: Plasmid-associated virulence factors of non-toxigenic (pXOl-) Bacillus anthracis II Microb.Pathog. 1991. - V. 10. - P. 183-198.

205. Welkos S., Keener T., Gibbs P. Differences in susceptibility of inbred mice to Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1986. - Vol. 51. - P. 795-800.

206. Welkos S., Little S., Friedlander A. Fritz D, Fellows P.et al. The role of antibodies to Bacillus anthracis and anthrax toxin components in inhibiting the early stages of infection by anthrax spores //Microbiol. 2001. - Vol. 147. - P: 1677-1685.

207. Welkos S., Lowe J;, Eden-McCutchan F., Vodkin M., Leppla S., Schmidt J. Sequence and analysis of the DNA encoding protective antigen of Bacillus anthracis II Gene. 1988. - V. 69. - P. 287-300.

208. Williams D., Turnbough C. Surface layer protein EA1 is not a component of Bacillus anthracis spores but is a persistent contaminant in spore preparations // J. Bacterid. 2004. - V. 186. - № 2. - P. 566-569.

209. Williamson E., Bennett A., Perkins S., Beedham R., Miller J., Baillie L. Co-immunisation with a plasmid DNA cocktail primes mice against anthrax and plague II Vaccine. 2002. - V. 20. - № 23-24. - P. 2933-2941.

210. World, health organization. Emerging and other communicable diseases, surveillance and control. Guidelines for the Surveillance and Control of Anthrax in Human and Animals. 3rd edition. /WHO/EMC/ZDI/98.6 1998. - 109 c.

211. World health organization. State of the art of vaccine research and development. ww.who.int/vaccines-documentsAVHO/IVB/05.XX. 2005. - 88 c.

212. Worsham P., Sowers M. Isolation of an asporogenic (spoOA) protective antigen-producing strain of Bacillus anthracis II Canad. J. Microbiol. 1999. - V. 45. -P. 1-8.

213. Wright G. Influence of spermine and related substances on susceptibility of Bacillus anthracis to lyzozyme // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1961. - V. 108.- P. 740-742.

214. Wright G., Green T., Kanode R. Studies on immunity in anthrax. Immunizing activity of alumprecipitated protective antigen. J. Immunol. - 1954. -V. 73.- №6.- P. 387-391.

215. Wu X., Lee W., Tran L., Wong S. Engineering a Bacillus subtilis expres- . sion-secretion system with a strain defecient in six extracellular proteases. // J. Bacte-riol. -1991. V. 173. - P. 4952- 4958.

216. Xu L., Frucht D. Bacillus anthracis: a multi-faceted role for anthrax lethal toxin in thwarting host immune defenses // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2007. - V. 39. - № 1. - P. 20-24.

217. Xu Q., Zeng M. Detoxified 1 ethal toxin as a p otential mucosal v accine against anthrax // Clin. Vaccine Immunol. 2008. - V. 15. - № 4. - P. 612-616.

218. Zeng M., Xu Q., Pichichero M. Protection against anthrax by needle-free mucosal immunization with human anthrax vaccine // Vaccine. 2007. - V. 25. - № 18.-P. 3588-3594.

219. Zwartouw H., Smith H. Polyglutamic acid from Bacillus anlhracis grown in vivo: structure and aggressin activity // Biochem. J. 1956. - V. 63. - P. 437-454.