Пуринергическая регуляция нервно-мышечной передачи тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Соколова, Елена Михайловна

• Соколова, Елена Михайловна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Соколова, Елена Михайловна

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ___стр.

1.1. Актуальность исследования _5

1.2. Цель и задачи исследования_6

1.3. Положение, выносимое на защиту_7

1.4. Научная новизна__7

1.5. Научно-практическая ценность_8

1.6. Апробация работы_8

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

ПУРИНЫ И ИХ РЕЦЕПТОРЫ: ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ В ОРГАНИЗМЕ

2.1. Хранение и высвобождение АТФ_11

2.2. Метаболизм АТФ _12

2.3. Классификация пуринергических рецепторов_14

2.3.1.1. Классификация Р1 рецепторов__15

2.3.1.2. Агонисты и антагонисты аденозиновых рецепторов_16

2.3.1.3. Характеристика вторичных посредников аденозиновых рецепторов_17

2.3.1.4. Распространение в организме и функциональная роль аденозиновых рецепторов.

Ах рецепторы_______20

А2а рецептор ы__21

Взаимодействие между А\ и А2а рецепторами_24

А2ь рецепторы_25

А3 рецепторы_______26

2.3.2.Классификация Р2 рецепторов^_27

2.3.2.1. Распространение в организме и функциональная роль пуриновых рецепторов

Р2Х рецепторы _28

Р2У рецепторы_31

2.3.2.2. Агонисты и антагонисты Р2 пуриноцепторов_36

2.3.2.3. Характеристика вторичных посредников Р2У рецепторов_37

2.4. Возможные механизмы регуляции нервно-мышечной передачи аденозином_38

2.5. Пресинаптические эффекты: АТФ или аденозин_40

2.6. Постсинаптические эффекты АТФ_

44

З.ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объект исследования________47

3.2. Ванночка. Система перфузии_____47

3.3. Растворы_____48

3.4. Микроэлектроды_49

3.5. Усилительная и регистрирующая аппаратура_49

3.6. Стимуляция двигательного нерва__50

3.7. Анализ вызванной секреции медиатора_51

3.8. Анализ спонтанной квантовой секреции медиатора_51

3.9. Анализ амплитудно-временных параметров составного потенциала действия нервного окончания____52

3.10. Статистическая обработка экспериментальных данных_53

4.РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Пресинаптические эффекты АТФ и аденозина_55

4.1.1. Влияние АТФ и аденозина на многоквантовые ТКП_55

4.1.2. Влияние АТФ и аденозина на амплитудно-временные характеристики миниатюрных ТКП _59

4.2. АТФ и аденозин - два различных модулятора нервно-мышечной передачи_63

4.2.1. Эффекты антагонистов Р1 рецепторов_63

4.2.2. Эффекты антагонистов Р2 рецепторов_66

4.2.3. Аддитивность эффектов АТФ и аденозина_70

4.3. Эффекты продуктов гидролиза АТФ на нервно-мышечную передачу_73

4.3.1. Влияние продуктов расщепления АТФ на многоквантовые ТКП в условиях редкой стимуляции________73

4.3.2. Влияние АТФ и продуктов ее расщепления на ритмическую активность нервно-мышечного синапса_76

4.4. Тип рецептора АТФ____79

4.4.1. Влияние селективных агонистов и антагонистов Р2Х рецепторов_79

4.4.2. Влияние рН на эффекты АТФ_81

4.4.3. Влияние АТФ на потенциал действия нервного окончания_84

4.4.4. Эффекты УТФ на много квантовые ТКП_86

4.5. Постсинаптические эффекты АТФ и аденозина_88

4.5.1. Влияние АТФ на постсинаптическую мембрану_88

4.5.2. Влияние аденозина на постсинаптическую мембрану_92

4.5.3. Зависимость постоянной времени спада от амплитуды многоквантовых ТКП при действии Mg2+, аденозина и АТФ_93

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ_96

ЗАКЛЮЧЕНИЕ_107

6. ВЫВОДЫ_108

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ_110

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Химические соединения: АТФ - аденозин 5'-трифосфорная кислота; АДФ - аденозин 5'-дифосфорная кислота; АМФ - аденозин 5'-монофосфорная кислота; УТФ - уридин 5'-трифосфорная кислота;

РРАОБ - пиридоксальфосфат-6-азафенил-2',4'-дисульфоновая кислота; ВРСРХ - 1,3-дипропил-8-циклопентилксантин;

а,Р-метиленАТФ - а,Р-метилен аденозин 5'-трифосфат (модификация в молекуле АТФ трифосфатной группы).

Электрофизиологичесие термины:

ТКП - ток концевой пластинки;

МТКП - миниатюрный ток концевой пластинки.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пуринергическая регуляция нервно-мышечной передачи»

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность исследования. В последнее время накопились данные о том, что АТФ, помимо внутриклеточной роли как макроэргического соединения, может принимать участие в межклеточной передаче сигналов [Burnstock & King, 1996; Burnstock, 1996b; Abbracchio, 1997], выступая как трансмиттер [Edwards et at, 1992], или как котрансмиттер [Burnstock & King, 1996; Redman & Silinsky, 1996]. Особый интерес в этом вопросе представляет нервно-мышечный синапс, для которого прямым методом регистрации было установлено выделение АТФ в синаптическую щель во время стимуляции двигательного нервного окончания [Redman & Silinsky, 1996]. Эти данные делают вполне обоснованным предположение о том, что АТФ может выступать в роли эндогенного модулятора нервно-мышечной передачи. Действительно, еще в 1975 году было показано, что в нервно-мышечном соединении экзогенная АТФ подавляет синаптическую передачу [Ribeiro & Walker, 1975]. Однако во всех последующих работах предполагалось, что механизм угнетающего действия АТФ основан на непрямом эффекте, в результате гидролиза АТФ до пресинаптически активного аденозина [Ribeiro & Sebastiao, 1987; Meriney & Grinnell, 1991; Redman & Silinsky, 1994]. Аденозин, действительно, известен как агент, который ингибирует спонтанную и вызванную секрецию нейротрансмиттера [Ginsborg & Hirst, 1972]. Более того, было предположено, что именно эндогенный аденозин опосредует синаптическую депрессию во время ритмической стимуляции двигательного нерва [Meriney & Grinnell, 1991; Redman & Silinsky, 1994].

С другой стороны, исследования последних лет показали широкое распространение как ионотропных Р2Х рецепторов, так и G-белок связанных метаботропных P2Y рецепторов во многих тканях организма, включая нервно-

мышечную систему [Burnstock & Kennedy, 1985; Chen et al., 1995; Collo et al., 1996]. Таким образом, согласно последним данным литературы, вероятность собственного эффекта АТФ в нервно-мышечном синапсе довольно высока. Недавно [Robitaille, 1995] появились новые данные о том, что скорость деградации эндогенной АТФ до аденозина в нервно-мышечном синапсе, в сравнении со скоростью гидролиза ацетилхолина, относительно невысока. Для синапсов ресничного ганглия было установлено прямое действие АТФ на пресинаптическую терминаль через ионотропные Р2Х рецепторы [Sun & Stanley, 1996]. Эти данные литературы, а также наличие синтезированных в последнее время агонистов и антагонистов рецепторов АТФ [Ziganshin et al, 1994], и послужили основанием для более детального исследования влияния АТФ и ее производных на функцию нервно-мышечного синапса.

1.2. Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было изучение модулирующей роли пуринергических соединений в регуляции синаптической передачи в нервно-мышечном синапсе. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить пресинаптические эффекты АТФ и продуктов ее гидролиза в нервно-мышечном синапсе.

2. Исследовать действие пуринергических соединений на постсинаптическую мембрану.

3. Изучить влияние АТФ и ее производных на проведение ритмических серий импульсов через нервно-мышечный синапс.

4. Исследовать влияние антагонистов Р1 и Р2 рецепторов на пресинаптические эффекты АТФ и аденозина.

5. Установить подтип (Р2Х или Р2У) пресинаптических рецепторов, опосредующих действие АТФ на секрецию медиатора.

1.3. Положение, выносимое на защиту:

В нервно-мышечном соединении АТФ способна ингибировать секрецию трансмиттера через собственный рецептор на пресинаптической мембране, отличный от рецептора для аденозина и относящийся к Р2У подтипу. В соответствии с этим, АТФ, так же как аденозин, может выступать в качестве эндогенного пресинаптического нейромодулятора в нервно-мышечном соединении.

1.4. Научная новизна. В настоящем исследовании впервые было показано, что АТФ, высвобождающаяся вместе с ацетилхолином из синаптических везикул в нервно-мышечном синапсе, может модулировать секрецию ацетилхолина через собственный пуриноцептор, отличный от пресинаптического аденозинового рецептора. Установлена аддитивность действия АТФ и аденозина на секрецию медиатора, что предполагает реализацию их эффектов через различные внутриклеточные сигнальные механизмы. Выяснено, что пресинаптические ингибиторные эффекты АТФ в нервно-мышечном синапсе не зависят от рН. Впервые выявлено, что УТФ является агонистом пресинаптических пуриноцепторов в нервно-мышечном синапсе и способна оказывать угнетающее влияние на секрецию ацетилхолина. Установлена сравнительная активность широкого круга агонистов пресинаптических пуриноцепторов в их влиянии на секрецию ацетилхолина из двигательного нервного окончания. Показано, что пресинаптические пуриновые рецепторы в нервно-мышечном соединении относятся к Р2У подтипу. Впервые исследовано влияние АТФ и продуктов ее гидролиза на кратковременную пресинаптическую пластичность,

проявляющуюся в условиях ритмической активности. Новыми являются данные по влиянию пуринергических соединений на постсинаптическую потенциацию. В частности, установлено, что экзогенная АТФ устраняет явление потенциации, что позволяет думать, что и эндогенная АТФ, выделяемая в виде котрансмиттера, способна участвовать в формировании кратковременной постсинаптической пластичности в синапсе.

1.5. Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют наши представления о функциональной организации двигательного нервного окончания. Эти данные вскрывают новые пути модуляции синаптической передачи на пресинаптическом уровне. Результаты проведенного исследования позволяют по-новому взглянуть на роль АТФ в нервно-мышечном синапсе, где она может выступать эндогенным модулятором синаптической передачи, а ее фармакологические аналоги могут быть использованы в качестве средств для целенаправленной регуляции секреторного процесса через Р2 рецептор на двигательном нервном окончании.

1.6. Апробация работы. Основные результаты доложены на 9 Международном симпозиуме по холинергическим механизмам (Майнц, Германия, 1995), I (IX) Международном совещании по эволюционной физиологии (С.-Петербург, 1996), на Всероссийской конференции «Растущий организм, адаптация к возрастающей физической нагрузке» (Казань, 1996), на конференции молодых ученых по холинергическим и пуринергическим механизмам (Казань, 1996,1997), на Международной конференции «Модуляция синаптической передачи» (Париж, 1997), на 3 Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997), 17 Съезде

физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), на Российской конференции «Физиология сигнальных молекул» (Москва, 1998), V Всероссийской школе «Актуальные проблемы нейробиологии (Казань, 1998), на заседаниях кафедры нормальной физиологии КГМУ (1998) и кафедры анатомии, физиологии и охраны здоровья человека КГПУ (1998).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ПУРИНЫ И ИХ РЕЦЕПТОРЫ: ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ В ОРГАНИЗМЕ

Помимо хорошо известной роли АТФ как внутриклеточного энергетического субстрата, к настоящему времени получены убедительные данные о том, что АТФ может выполнять функцию возбуждающего нейротрансмиттера в центральной [Evans et al., 1992] и периферической [Burnstock et al., 1985] нервной системе. Еще в 1972 году Burnstock предположил, что АТФ может выполнять роль эффектора в автономных неадренергических и нехолинергических процессах проведения возбуждения. Пуринергические синапсы описаны во многих органах и тканях, они широко представлены в желудочно-кишечном тракте, в мочевом пузыре, семявыносящем протоке, пищеводе, матке, трахее, а также в центральной нервной системе. Кроме того, АТФ является котрансмиттером, сопровождающим ряд классических нейромедиаторов и выделяется при активации пре- и постсинаптической мембраны в синаптическую щель. Можно предположить, что в таких синапсах АТФ выполняет модулирующую роль в синаптической передаче. Одно из первых предположений о модулирующей роли АТФ и родственных соединений в холинергической передаче в сердце было высказано Т.М. Тур паевым (1965). Однако для нервно-мышечного синапса такая возможность изучена недостаточно. Настоящий обзор данных литературы и собственных экспериментальных результатов позволяет считать, что в нервно-мышечном синапсе АТФ может выполнять двойную модулирующую роль, самостоятельно влияя на функциональное состояние пре- и постсинаптической мембраны и являясь источником другого модулятора синаптической передачи - аденозина.

2.1. Хранение и высвобождение АТФ

В настоящее время содержание АТФ вместе с ацетилхолином в синаптических везикулах является общепризнанным фактом. Соотношение между содержанием АТФ и ацетилхолина в синаптической везикуле в ЦНС составляет 1:7 [Abbracchio, 1997], в эмбриональных мышцах цыпленка это соотношение соответствует 1:6 [Hume & Honig, 1986]. Кроме АТФ вместе с ацетилхолином в везикуле могут содержаться и другие нуклеотиды: ГТФ, УТФ, АДФ, диаденозин-фосфаты [Zimmermann, 1994]. Помимо того, что АТФ упакована в синаптических везикулах вместе с ацетилхолином, показано, что она высвобождается вместе с ним в ответ на нервный импульс [Silinsky, 1975]. Количество адениновых нуклеотидов, высвобождаемых при стимуляции седалищного нерва лягушки, составляет примерно 0,15x10"12 моль/л на одиночный стимул [Cunha & Sebastiao, 1993]. По данным других авторов синаптическая концентрация АТФ после нервного импульса может колебаться от 3-10x10"6 моль/л [Silinsky & Redman, 1996] до 25x10"6 моль/л [Ribeiro et al, 1996], а в работе Hume & Honig (1986) указывается, что концентрация АТФ может достигать 50х10"6 моль/л. Прямым свидетельством того, что АТФ высвобождается вместе с ацетилхолином при электрической стимуляции нервного окончания, стали эксперименты с использованием детекторных фрагментов мембран симпатических нейронов морской свинки [Silinsky & Redman, 1996]. Мембрану, содержащую ацетилхолиновые и АТФ-ионные каналы, обрабатывали гексаметонием, чтобы предотвратить никотиновые ответы. При стимуляция диафрагмального нерва было зарегистрировано синхронное открывание АТФ-каналов в приближенных к нервному окончанию фрагментах мембран (на расстоянии 10 мкм от нервного окончания) с латентным

периодом менее 5 мс, что явилось ярким доказательством синхронного выброса АТФ вместе с ацетилхолином.

В экспериментах, где использовалась электрическая стимуляция иннервированной скелетной мышцы, было установлено, что половина от общего выброса нуклеотидов происходит из нервной терминали, а вторая половина - из мышечного волокна [Israel et al., 1976; Smith, 1991; Cunha & Sebastiao, 1993]. В адренергическом синапсе соотношение АТФ/норадреналин гораздо более низкое, и появление АТФ в синаптической щели после стимуляции нерва происходит преимущественно за счет выброса АТФ из мышцы [Kurz et al., 1994]. Можно предположить, что в тех синапсах, где высоко соотношение АТФ/нейротрансмиттер в синаптической везикуле, появление АТФ со стороны пресинаптической мембраны имеет огромное физиологическое значение.

2.2. Метаболизм АТФ

В последующем, высвободившаяся в синаптическую щель АТФ, подвергается ферментативному расщеплению. Ферменты, ответственные за последовательность превращений АТФ, являются мембраносвязанными комплексами, их присутствие на экстраклеточной стороне мембраны показано в нейрональных, глиальных и эндотелиальных клетках. Инактивация АТФ включает в себя цепочку последовательного вовлечения экто-АТФаз, экто-АДФаз, и экто-5'-нуклеотидазы, которая производит гидролиз АМФ в аденозин. Эту цепочку в общем виде можно представить как:

ИМФ

АТФ -> АДФ -> АМФ

инозин

аденозин

[ШЬеп-о & а1, 1996].

Существует несколько путей катаболизма АТФ, включающих различные

1). АТФаза АТФ -> АДФ + Ф

2). АТФ-дифосфогидролаза (апираза) АТФ АМФ + 2Ф

3). Аденилат-киназа (АТФ:АМФ-фосфотрансфераза, миокиназа) АТФ + АМФ -> 2 АДФ

4). АТФ-пирофосфатаза АТФ АМФ + ФФ

5). Аденилат-циклаза АТФ цАМФ + ФФ

(Ф - неорганический фосфат, ФФ - неорганический пирофосфат)

В основном наиболее распространенным путем катаболизма АТФ на внеклеточной стороне мембраны являются примеры реакций 1-3. Существование реакции 4 показано лишь в некоторых тканях, а реакция 5 специфична для внутриклеточного образования цАМФ.

Интересным отличием пуринергического синапса от холинергического является то, что АДФ, АМФ, и в значительно большей степени аденозин высокоэффективные агонисты для различных типов пуриноцепторов, в то время как продукты гидролиза ацетилхолина значительно менее активны, или даже не

ферменты:

активны в сравнении с самим ацетилхолином. Более того, АТФ оказывая свои эффекты через Р2 пуриноцепторы, может приводить к тем же изменениям, что и аденозин, вызывающий сходные эффекты чрез Р1 пуриноцепторы, затрудняя правильную интерпретацию результатов [21§апзЫп е1 а!., 1994].

Кроме существования мембраносвязанных комплексов ферментов, ответственных за метаболизм АТФ, в 1997 году Тос1огоу и соавторы показали, что при стимуляции симпатического нерва морской свинки, помимо АТФ высвобождаются еще и растворимые нуклеотидазы. Они также способны расщеплять АТФ до аденозина. Подобное высвобождение специфических нуклеотидаз совместно с АТФ может представлять еще один механизм окончания действия медиатора, необходимого для эффективного контроля проведения возбуждения через синапс.

2.3. Классификация пуринергических рецепторов

Эффекты АТФ и продуктов ее гидролиза опосредуются пуринергическими рецепторами - пуриноцепторами. Международным Союзом Фармакологов (ШРНА11) в 1996 году была рекомендована классификация пуринергических рецепторов по следующему типу: в случае известных фармакологических характеристик и аминокислотной структуры рецептора предложено его написание с заглавной буквы, в то время как при известных лишь фармакологических свойствах рекомендовано написание типа рецептора в виде нижнего индекса, например: Р2у1 , а для рецепторов с известной аминокислотной последовательностью - написание строчными буквами (р2у, р2х). По этой классификации пуриновые рецепторы подразделяются на два семейства: Р1 и Р2.

PI тип преимущественно активируется аденозином и в меньшей степени АМФ и АДФ, а Р2 тип пуриноцепторов - пуриновыми и пиримидиновыми нуклеотидами.

2.3.1.1. Классификация PI рецепторов

Аденозин-чувствительные PI рецепторы в дальнейшем были разделены на классы в зависимости от чувствительности к различным аденозиновым аналогам. Для Ai такой ряд по мере убывания силы агонистов составляют следующие соединения:

(-)-1Ч6-[(К)-фенилизопропил]аденозин (К-Р1А)>5'-этилкарбоксамидоаденозин (ОТСА)>(+)-М6-[(8)-фенилизопропил]аденозин (S-PIA) [Stiles, 1997]. Для А2 последовательность другая: ÑECA > R-PIA > S-PIA. А2 рецепторы подразделяется на 2 подкласса «А» и «В». Кроме того, в 1992 году был выделен третий класс аденозиновых рецепторов - А3 рецептор [Zhou et al., 1992].

В настоящее время Ai рецепторы клонированы из различных источников, включая человека, крысу, кролика и быка [Olah & Stiles, 1995; Palmer & Stiles, 1995). В основном структура этих клонов и экспрессируемые ими белки одинаковы, каждый белок состоит из ~326 аминокислот с молекулярным весом 36000-37000 дальтон. Фармакологически эти рецепторы сходны, за исключением Ai рецепторов быка. А2 класс был клонирован также от различных видов. Рецепторы А2а подкласса состоят из большего количества аминокислот - 410-412, и соответственно масса белка больше - около 45000 дальтон. А2Ь рецептор был клонирован из библиотек генов крысы и человека и экспрессирован во многих клетках [Olah & Stiles, 1995]. Этот рецептор значительно меньше А2а и ближе по размеру к Ai и Аз. Впервые предположение о существовании двух подклассов А2 рецептора было высказано в 1983 году Daly с соавторами на основании различий в

силе агонистов в различных тканях. А2а рецептор проявлял значительно более высокую аффинность для большинства агонистов, в то время как, у А2ь аффинность для тех же самых веществ была значительно ниже. Структура и свойства А3 рецептора были выяснены только благодаря техникам клонирования. Рецептор имел удивительные особенности: аффинность для агонистов была чрезвычайно низка и порядок последовательности силы агонистов значительно отличался от других рецепторов. Кроме того, была очень низка аффинность и для антагонистов ксантинового ряда (алкилксантиновые соединения являются хорошо известными аденозиновыми антагонистами для Ai и А2 классов аденозиновых рецепторов).

2.3.1.2. Агонисты и антагонисты аденозиновых рецепторов

Агонисты аденозиновых рецепторов, являющиеся по большей части исключительно производными аденозина, имеют антиаритмические [Belardinelli et al., 1996], церебропротективные [von Libitz, 1997], кардиопротективные [Liu et al., 1997] свойства, реализуемые через Ai тип рецепторов, а также гипотензивные и антипсихотичесие эффекты [Bridges et al., 1988], осуществляемые через А2а рецепторы. А3 агонисты способны быть церебропротективными агентами [Jacobson et al., 1995b] и возможно регулируют иммунную функцию и участвуют в процессах воспаления [Sajjadi et al., 1996].

СНА (1\1б-циклогексиладенозин) и соответствующие N6-замещенные аденозиновые аналоги являются селективными агонистами Ai рецепторов. Последним из синтезированных селективных агонистов для Ai стал RG 14718: с IC50 = 6 пМ и в 2000 раз большей чувствительностью к Ai, чем к А2а рецепторам [Fink et al., 1992]. NECA был признан первым агонистом семейства А2 рецепторов,

хотя и не являлся избирательным в отношении Ai и А2. Первым селективным А2а агонистом был синтезирован CGS 21680С (ТМ^-з амещенный аналог NEC A). IB-MECA и DBXRM (1,3 дибутилксантин-7-рибизид-5'-1Ч-метилкарбоксамид) - были описаны как селективные А3 агонисты. Что касается селективных агонистов А2Ь, то они до сих пор не найдены. Соответственно, принято считать, что рецепторные механизмы более чувствительные к NECA, чем к другим известным агонистам для Ai, А2а и Аз, являются А2Ь механизмами.

Теофиллин (1,3-диметилксантин), кофеин (1,3,7-триметилксантин) и другие 8-замещенные алкилксантиновые и арилксантиновые соединения являются неселективными антагонистами аденозиновых рецепторов, это: СРХ или DPCPX -1,3-дипропил-8-циклопентилксантин, KFM 19, KW 3902. KF 17837 и CSC (8-(3-хлоростирил)кофеин) являются ксантиновыми антагонистами, селективными для А2а рецепторов. Для А2ь пока не установлены селективные антагонисты, хотя аллоксазин считается в 10 раз селективнее для А2ь, чем для At и А2а [Daly & Jacobson, 1995], энпрофиллин также был охарактеризован как селективный антагонист А2Ь. Среди нексантиновых антагонистов известны CGS 15943 (9-хлоро-2-(2-фурил)[1,2,4]триазоло[1,5-с]квиназолин-5-амин) и CP ([1,2,4]триазоло[4,3-а]квиноксалин), SCH (пиразоло[4,3-е]триазоло[1,5-с]пиримидин) синтезирован как селективный для А2а рецептора.. Для А3 рецепторов известны три непуриновых класса соединений: флавоноиды, 1,4-дигидропиридиновые производные и триазолоквиназолины.

2.3.1.3. Характеристика вторичных посредников аденозиновых рецепторов

Более 20 лет назад было обнаружено, что физиологические эффекты аденозина опосредуются через специфические мембранные белки. Впоследствии

аденозиновые рецепторы были идентифицированы как семейство G-белок связанных рецепторов [Fredholm & Hedqvist, 1979; Dunwiddie, 1985, 1990; Greene & Haas, 1991; Stone, 1991]. Множество исследований последних лет было посвящено выявлению типа G-белков, с которыми связаны аденозиновые рецепторы, и тому, какие эффекторные системы ими модулируются (см. таблицу 1).

Таблица 1. Системы вторичных посредников аденозиновых рецепторов

Рецептор G-белок Эффект

А, Ца 1,2,3 аденилат-циклаза

Gqa T фосфолипаза С

Go« Т К+ каналы

А2а GSa Т аденилат-циклаза

А2ь Gsa Т аденилат-циклаза

Т Са2+ каналы

А3 Gja 2,3 •1 аденилат-циклаза

Т фосфолипаза С

(из работ Fredholm & Hedqvist, 1979; Freissmuth и др., 1991; Stone, 1991)

Как видно из таблицы, Ai рецепторы взаимодействуют с G-белками, чувствительными к токсину коклюша (G¡ 1,2,3 и G0 в рекомбинантных системах). Но осуществляются ли эти связи in vivo до сих пор не установлено. В исследованиях, посвященных регуляции G-белков установлено, что активация Ai рецепторов может изменять активность G¡cq и G¡a2. Является ли это изменение результатом прямого взаимодействия рецептора с G-белком, или же другие молекулы должны взаимодействовать с G-белками, не установлено. Не ясно также, может ли Ai рецептор взаимодействовать с Gq-белками, не проявляя при этом чувствительность

к токсину коклюша. Для Ai четко установлена связь с тремя эффекторными системами: аденилат-циклазной, фосфолипазой С и калиевыми ионными каналами [Olah & Stiles, 1995; Palmer & Stiles, 1995].

Известно, что А2а рецепторы взаимодействуют с Gs-белками, которые, в свою очередь опосредуют активацию аденилат-циклазы. А2ь рецептор тоже связан с Gs-белками и либо усиливает аденилат-циклазную активность, либо открывает кальциевые каналы. В клетках эритролейкемии человека Са2+ входящий ток осуществляется по независимому от коклюшного токсина пути, причем, даже если этот процесс осуществляется через Gs белки, то он не влияет на активность аденилат-циклазы [Feoktistov et al., 1994]. Предполагается, что Gq-белки в тучных клетках человека играют роль в связывании А2ъ рецептора с фосфолипазой Ср, так как этот процесс не является зависимым от коклюшного и холерного токсина [Feoktistov & Biaggioni., 1995]. Показано, что рекомбинантный А2ь рецептор из ооцитов Xenopus активирует Са2+-зависимую хлорную проводимость, предположительно, через стимуляцию фосфолипазы С [Yakel et al., 1993].

Наконец, А3 рецептор может связываться с G;«2 и G¡a3 белками [Palmer et al, 1995]. Этот тип рецептора преимущественно тормозит аденилат-циклазу и стимулирует фосфолипазу С. Этот механизм чувствителен к токсину коклюша, что говорит в пользу взаимодействия этого типа рецепторов с Gj-белками, нежели с Gq. Хотя некоторыми авторами указывается [Palmer et al., 1995], что А3 рецепторы способны взаимодействовать и с Gq-белками.

2.3.1.4. Распространение в организме и функциональная роль аденозиновых рецепторов A j рецепторы

Ai рецепторы широко распространены как в центральной, так и в периферической нервной системе. В ЦНС Ai встречаются в: коре головного мозга [Spignoli et al., 1984], стриатуме [Brown et al, 1990; Abbracchio et al., 1992], гиппокампе [Burke & Nadler, 1988; Sebastiao et al., 1990; Dilorio et al., 1991; Sebastiao & Ribeiro, 1992; Cunha et al., 1994a,c], зубчатом ядре [Cunha et al., 1994c], радужной оболочке глаза [Fuder et al., 1992]. В гиппокампе их концентрация в САЗ области выше, чем в СА1 [Cunha et al, 1994а]. На периферии Ai рецепторы представлены в нервно-мышечном соединении [Ginsborg & Hirst, 1972; Ribeiro & Walker, 1973; Correia-de-Sa & Ribeiro, 1994b; Sebastiao et al., 1995], в семявыносящем протоке [Goncalves & Queiroz, 1993] и пресинаптических окончаниях разных нервов.

Тормозные эффекты аденозиновых Ai рецепторов в различных структурах являются хорошо установленными и общепризнанными. Эти ингибиторные воздействия, возможно, вовлечены во множество когнитивных процессов и поведенческих реакций. Существует по крайней мере 4 способа, посредством которых аденозин может ингибировать освобождение нейротрансмиттеров:

1). Воздействие на стадии процесса высвобождения медиатора, предшествующие входу Са2+, то есть на мобилизацию и подход синаптических везикул к активным зонам.

2). Возможен более прямой механизм: регуляция входа Са2+ через потенциалозависимые кальциевые каналы, расположенные рядом с активными зонами. Установлено, что а субъединица G0 -белка уменьшает вход Са2+ через N

тип Са2+ каналов [Offermanns & Schultz, 1994; Shapiro et al., 1994] и увеличивает его вход через Q тип Са2+ каналов [Wheeler et al., 1994]. В то время как а субъединица Gs белка непосредственно облегчает открывание некоторых L каналов [Hamilton et al., 1991] и косвенно (возможно через цАМФ-зависимое фосфорилирование) облегчает вход Са2+ через Р тип каналов [Mogul et al., 1993].

3). Аденозин может самостоятельно менять зависимость процесса высвобождения медиатора от Са2+ через изменение аффинности места связывания для Са2 , возможно, через белок, такой как синаптотагмин [Dunwiddie & Fredholm, 1997].

4). Аденозин, гиперполяризуя нервное окончание [Bennett & Но, 1991] или предотвращая проведение нервных импульсов от аксона к терминалям [Wall, 1995], способен, таким образом, косвенно тормозить потенциалозависимое открывание пресинаптических Са2+ каналов.

Последние попытки проанализировать эффекты аденозина в разнообразных синаптических системах привели к мнению, что существует далеко как не один механизм, по которому аденозин может модулировать высвобождение медиатора. Вполне возможно, что в одном и том же синапсе могут параллельно запускаться несколько путей регуляции выброса медиатора.

Л2а рецепторы

А2я рецепторы идентифицированы в стриатуме и в структурах базальных ганглиев [Jarvis et al., 1989; Wan et al., 1990; Nonaka et al., 1994], гиппокампе [Wan et al., 1990; Sebastiao et al., 1992; Cunha et al., 1994a], коре больших полушарий [Wan et al., 1990; Weaver, 1993], одиночном ядре [Barraco et al., 1993], в нервно-мышечном соединении [Correia-de-Sa et al., 1991], норадренергических окончаниях [Goncalves et al., 1993], в интрамуральных нейронах кишечника [Chrishtofi et al.,

1994], сетчатке [Blazynski et al., 1993] и каротидном синусе [Weaver, 1993]. Активация А2а рецепторов может увеличить высвобождение некоторых нейротрансмиттеров, таких как ацетилхолин, глутамат, норадреналин. Высвобождение ГАМК может как увеличиться, так и снизиться. Сведения о модуляции высвобождения различных медиаторов аденозиновыми А2 рецепторами представлены в таблице 2.

Таблица 2. Модуляция высвобождения нейротрансмиттеров аденозиновыми А2 рецепторами

Нейротрансмиттер Эффект на секрецию Подтип рецептора

Ацетилхолин Тстриатум а2а

Тгиппокамп а2а

Тнервно-мышечное соединение а2а

Ткора а2

Т(базальный уровень) кора а2

Глутамат Тодиночное ядро а2а

Тгиппокамп а2а

Ткора больших полушарий а2

Аспартат Ткора больших полушарий а2

ГАМК Тбледный шар (срезы) а2а

^бледный шар (синаптосомы) а2а

Тстриатум А2а

^кора больших полушарий а2а

Дофамин Тстриатум а2

ТРС 12 клетки а2

Норадреналин Тсемявыносящий проток А2а

^хромаффинные клетки а2ь

(цитировано по БеЬаэйао й а1., 1996)

Одно из первых свидетельств того, что активация А2 рецептора может увеличивать выброс медиатора, было получено в холинергической системе коры головного мозга [8р1§поН е1 а1., 1984]. Позднее было показано, что селективный А2 агонист СОБ в низких концентрациях (наномоли) усиливает секрецию ацетилхолина из стимулируемой электрическим током нервной терминали [Соггаа-ёе-Ба е1 а1., 1991]. Активация А2а рецепторов может также модулировать возбудимость нейронов, синаптическую пластичность и даже локомоторную активность и поведенческие реакции. Способность А2а взаимодействовать с другими рецепторами, такими как: дофаминовые рецепторы (Б) и Б2), с аденозиновыми Аь СОКР рецепторами, метаботропными рецепторами для глутамата и никотиновыми облегчающими ауторецепторами - расширяет круг возможностей аденозина в участии нейронных функций и коммуникаций. Опосредованные аденозином эффекты могут иметь определенный терапевтический интерес в тех участках, где выявлена высокая концентрация А2а рецепторов. В ЦНС это касается стриатума (болезнь Паркинсона и хорея Хантингтона) и лимбической системы (шизофрения). Несомненный практический интерес представляют центральные эффекты аденозина на респирацию. Увеличение активности хеморецепторов при воздействии на них аденозина представляется важным в предотвращении остановки дыхания во время сна. Вполне возможно, что именно аденозин отвечает за внезапную смерть у новорожденных. Хеморецепторы новорожденных являются незрелыми, и аденозин, возможно, опосредует

центральные тормозные эффекты респирации. На периферии взаимодействие А2а рецепторов с другими системами, регулирующими высвобождение ацетилхолина из нервной терминали, может оказаться важным в развитии различных дефицитов секреции ацетилхолина, например, различных миастенических синдромов [Sebastiao et al., 1996].

Взаимодействие между A¡ и А2а рецепторами

В нервно-мышечном соединении диафрагмального нерва крысы эндогенный и экзогенный аденозин способен активировать оба подтипа (Ai и А2а) аденозиновых рецепторов. В работе Correia-de-Sa с соавторами (1993) указывалось, что высокие концентрации эндогенного аденозина способны потенциировать секрецию медиатора, и, скорее, активируют А2а рецепторы, а низкие - угнетают секрецию, активируя A¡ рецепторы. Такая же закономерность выявляется во время ритмической активности: при высокой частоте стимуляции нерва (5 Гц) происходило увеличение высвобождения [3Н]ацетилхолина, а в случае низких частот - наоборот. Очевидно, высокая частота стимуляции приводила к большему количеству высвобожденных пуринов, что отражалось в смещениях равновесия в рецепторной Ai/A2a системе. Подобные результаты были достигнуты при исследовании агонистов Ai и А2а рецепторов в CAI области гипппокампа [Cunha et а!., 1994а]. Активация А2а рецепторов низкими концентрациями CGS маскировала способность CPA, Ai агониста, ингибировать возбуждение в гиппокампе. Это говорило о возможности взаимодействия между Ai-ингибиторными и А2а-возбуждающими рецепторами в гиппокампе, а также о том, что эффекты Ai могут быть замаскированы при одновременной активации А2а рецепторов. Еще один интересный вывод был сделан из этих исследований: активация А2а рецепторов в

гиппокампе может усиливаться из-за снижения тонической стимуляции Ai рецепторов эндогенным аденозином, что может происходить в процессе старения, когда наблюдается увеличение количества мест связывания для А2а при параллельном снижении количества мест связывания для Аг рецепторов в гиппокампе и коре головного мозга [Cunha et al., 1995b],

Известно также о способности Aj рецепторов маскировать эффекты A2a.[Abbracchio et al., 1992]. Десенситизация Ai рецепторов в стриатуме сопровождается ускорением А2а опосредованного увеличения аденилат-циклазной активности. Установлено также, что Ai и А2а рецепторы способны взаимодействовать на пресинаптическом уровне в нервно-мышечном соединении [Correia-de-Sa & Ribeiro, 1994b]. Ai ингибиторные влияния усиливаются в присутствии А2а антагонистов, и А2а возбуждающие эффекты увеличиваются при введении Ai антагонистов.

Л2ь рецепторы

Предполагается, что А2ь рецепторы широко распространены в структурах головного мозга [Lee & Reddington, 1986], они также были обнаружены в сетчатке [Mcintosh & Blazynski, 1994], астроцитах [van Calker et al., 1979; Peakman & Hill, 1994]. Лишь недавно были раскрыты потенциально важные функции А2ь рецепторов. Они вовлечены в регуляцию тонуса гладких мышц, роста клеток, нейросекреции и интестинальных функций, получены доказательства их вклада в патофизиологический процесс развития астмы. Возможно, что блокада А2ь рецепторов теофиллином в тучных клетках может быть одним их механизмов терапевтического воздействия при лечении астмы. Если эта гипотеза окажется верной, то А2ь рецептор будет мишенью для создания новых противоастматических

препаратов. И хотя в целом аффинность А2ь агонистов существенно ниже, чем для других типов аденозиновых рецепторов, это не относится к антагонистам. На данный момент наиболее селективным антагонистом для А2ь рецепторов [Feoktistov et al., 1998] считается энпрофиллин, являющийся антиастматическим препаратом.

Аз рецепторы

У человека А3 рецепторы найдены в легких, печени, сердце, почках и, в меньшей, степени в головном мозге и половых железах [Linden, 1994]. Исследование А3 рецептора с помощью синтезированных агонистов и антагонистов показало, что он обладает, помимо особенных фармакологических свойств, также интересными биологическими эффектами в ЦНС, сердечнососудистой системе и в процессах воспаления. А3 рецепторы потенциально вовлечены в апоптозис (запрограммированную смерть клетки). Разнообразные эффекты А3 агонистов in vitro и in vivo являются двойственными и противоположными (цитотоксичными и защитными) в зависимости от уровня активности рецептора [Jacobson, 1998]. Наномолярные концентрации селективных агонистов имеют тенденцию к защитному действию, в то время как, микромолярные - часто токсичны. Что касается антагонистов, то во многих культурах клеток они оказывают токсическое воздействие. Подобный эффект предполагает, что состояние тонической активации А3 является необходимым и низкий уровень рецепторной активности имеет защитную природу. Чтобы объяснить, как высокие дозы агониста предпочтительно способствуют, нежели препятствуют апоптозису, приходится предположить различную степень активации разных систем вторичных посредников тем же самым рецептором при высоких и

низких концентрациях. Участие Аз рецепторов в апоптозисе предполагает, что как агонисты, так и антагонисты могут оказаться необходимыми в лечении заболеваний, где цитотоксичный эффект нежелателен (дегенерация нервов), так и наоборот, необходим (онкологические заболевания и воспалительные процессы) [Kohno et al., 1996; Sajjadi et al., 1996., Bouma et al., 1997; Yao et al., 1997]. A3 антагонисты могут оказаться полезными и при лечении астмы. Острое предъявление А3 антагонистов или хроническое введение агонистов, оказывается, защищает клетки мозга в модели глобальной ишемии [von Lubitz et al., 1997]. Эти результаты могут оказаться полезными в терапевтических подходах предотвращения разрушительных последствий инсульта. А3 агонисты в низких концентрациях являются потенциально полезными в качестве кардиопротективных агентов. Они имеют более продолжительное действие и обладают меньшими побочными эффектами, не вызывая гипотермии и гипотензии, как, например, Ai агонисты [Liu et al, 1994; Stambaugh et al., 1997].

2.3.2. Классификация P2 рецепторов

P2 тип пуриноцепторов имеет свои подтипы - это Р2Х (ионотропные рецепторы) и P2Y (метаботропные). Р2Х рецепторы - это катион-селективные ионные каналы, отвечающие за быстрые ответы АТФ [Edwards et al., 1992; Evans et al., 1992; Dubyak & El-Moatassim, 1993], в то время как P2Y являются связанными с G-белками и опосредуют медленные эффекты [Charest et al., 1985; Boyer et al., 1989, 1993; Yamada et al., 1992]. Известно 7 классов P2X рецепторов и 8 P2Y [Abbracchio, 1997]. Р2Х строго специфичны к пуриновым нуклеотидам, a P2Y показывают различную чувствительность к пуринам и пиримидинам.

2.3.2.1 .Распространение в организме и функциональная роль пуриновых

рецепторов

Р2Х пуриноцепторы

Токи, возбуждаемые АТФ в ЦНС, имеют те же характеристики, что и токи через ионотропные рецепторы, опосредованные другими нейротрансмиттерами (например, глутаматом, ацетилхолином, серотонином). Эксперименты с использованием методики быстрой смены омывающих растворов доказали, что ионные каналы АТФ открываются через миллисекунды после аппликации АТФ [Abbracchio, 1997]. Сходство с ранее охарактеризованными ионотропными каналами для ацетилхолина или глутамата включает в себя и быструю кинетику, и катион-неселективность, и, в некоторых типах каналов, способность к быстрой десенситизации. Высокая проницаемость канала Р2Х рецептора для Са2+ (его вклад во входящий ток составляет около 5%) сходна с таковой для канала гомомерного ацетилхолинового рецептора (а7), для АМРА и NMDA типов глутаматного рецептора [Surprenant et al., 1995]. Различные подтипы Р2Х рецепторов являются сходными в аминокислотной последовательности, но выявляется их значительное различие в фармакологии и по частоте встречаемости в организме. В таблице 3 представлены все известные на текущий момент Р2Х рецепторы в ЦНС.

Таблица 3. Экспрессия в ЦНС клонированных Р2Х рецепторов

Подтип Р2Х рецептора Характеристики Экспрессия в ЦНС

Р2Х1 канал, 1ыа/К/Са Низкая, в мозжечке, стриатуме гиппокампа, коре

Р2Х2 канал, 1ха/к Высокая, в зрительных буграх, стриатуме гипоталамуса, гиппокампе, в коре, мозжечке, миндалине

Р2Х3 канал, 1ыа/к не известна

Р2Х4 канал, 1иа/к в мозжечке (клетки Пуркинье), коре, таламусе, гипоталамусе, спинном мозге

Р2Х5 канал, 1ка/К/Са Очень низкая

Р2Х6 канал, 1на/К/Са Высокая, в мозжечке, зрительных ядрах, коре, гиппокампе и таламусе, эпендиме |

Р2Х7 канал, 1наЛС/Са в микроглии 1

(цитировано по АЬЬгассЫо, 1997)

Для Р2Х1 рецептора активность агонистов убывает в следующем порядке: 2-МеБАТР > АТФ> а,р-метиленАТФ. 0,5 - 5x10"6 моль/л 2-МеБАТР или а,р-метиленАТФ является эффективной концентрацией, а повторное введение агонистов приводит к прогрессирующему снижению амплитуды ответов. Этот тип рецепторов найден во многих периферических нейронах и интрамуральных ганглиях [АЬЬгассЫо, 1997]. По результатам гибридизационного анализа (исследование встречаемости мРНК для Р2Х1 в различных структурах) транскрипты этого вида пуриноцептора определены в мозжечке и с меньшей частотой в стриатуме, гиппокампе и коре [ЕасЫ й а1., 1995].

При исследование Р2Х2 рецепторов в культуре клеток феохромоцитомы крысы оказалось, что концентрация АТФ и 2-MeSATP для достижения порогового ответа должна быть выше в 10-20 раз, а а,р-метиленАТФ не вызывает синаптических токов [Giniatullin et al., 1996]. Хотя в последних исследованиях указывалось, что полного эффекта АТФ можно добиться при смещении рН в кислую сторону [King et al., 1996]. В связи с этим, интересным представляется подход для разделения подтипов Р2Х рецепторов, предложенный Stoop с соавторами (1997). В этой работе указывалось, что все подтипы Р2Х рецепторов обладают чувствительностью к сдвигу рН, но лишь у Р2Х2 пуриноцепторов происходит увеличение амплитуды синаптических токов при закислении и сильная депрессия при защелачивании среды. У остальных подтипов Р2Х (P2Xi, Р2Х3, Р2Хд) наблюдалась обратная тенденция. Кроме того, Р2Х2 рецептор не подвержен десенситизации при повторных введениях агонистов, этим он отличается от Р2Х] . На основании этих данных авторы работы предложили классифицировать Р2Х рецепторы на основе их чувствительности к рН, способности к десенситизации, эффективности агониста а,Р-метиленАТФ и антагониста PPADS. Р2Х2 подтип представлен в ЦНС: в зрительных буграх, зубчатой извилине, стриатуме, гипоталамусе, гиппокампе, миндалине, коре, в мозжечке [Brake et al., 1994].

Третий подтип пуриноцепторов - Р2Х3 был клонирован относительно недавно [Chen et al., 1995; Lewis et al., 1995]. Так как он достаточно редко встречается в ЦНС, его возможная роль в центральных нейронах пока не установлена. Этот подтип рецептора представлен исключительно в сенсорных С волокнах, поэтому возникло предположение об участии этого подтипа рецептора в проведении болевых сигналов в ЦНС.

При клонировании четвертого подтипа Р2Х» пуриноцепторов были обнаружены его удивительные свойства. Кроме того, что этот рецептор является самым распространенным в ЦНС, все известные антагонисты Р2 пуриноцепторов (сурамин, PPADS, реактив blue 2) не эффективны в его блокировании, а даже наоборот, потенциируют ответ на аппликацию агонистов [Во et al., 1995; Collo et al., 1996]. P2X4 рецептор распространен в высокой концентрации в клетках Пуркинье, коре, таламусе, гипоталамусе, в спинном мозге, интересным является также его перекрытие с местами распространения Р2Хб пуриноцептора.

Еще два подтипа P2Xs и Р2Х6 имеют фармакологические свойства, сходные с Р2Х2 и Р2Хф Они не подвержены десенситизации или десенситизируются очень медленно и не отвечают на а,р-метиленАТФ [Collo et al., 1996]. Р2Хб, как и Р2Х4, не блокируется антагонистами (сурамином и PPADS). Гибридизационный анализ, проведенный Collo с соавторами (1996) показал, что P2Xs экспрессируется лишь в мезенцефалических ядрах, Р2Х4 и Р2Х6 являются доминирующими рецепторами в ЦНС, а Р2Х2,как и Р2Х> и Р2Х6 наиболее распространены в спином мозге (см. таблицу 3). В последнее время появились сообщения о клонировании еще одного Р2Х рецептора - Р2Х7 [Surprenant et al., 1996]. Этот рецептор в основном экспрессирован в макрофагах и микроглии. Агонистом этого подтипа является бензоилАТФ, которая запускает цитолитическую активность клеток, в результате которой в мембране формируется большая пора.

Р2 Y пуриноцепторы

В настоящее время установлено, что все P2Y рецепторы, экспрессируемые в головном мозге млекопитающих, преимущественно принадлежат к 3 подтипам: P2Yi_3. Причем клетки глии, особенно астроглиальные

клетки, экспрессируют в основном метаботропные Р2У рецепторы, в отличие от нейронов, где встречаются как Р2Х, так и Р2У рецепторы [АЬЬгассЫо е1 а1., 1995а; Неагу е! а1., 1996; Во1е§о е! а1., 1997]. Задача разделения подтипов Р2У рецепторов является сложной, поскольку пока не существует селективных антагонистов для выделения подтипов. Только для некоторых подтипов доступны селективные агонисты, коммерческие препараты агонистов не являются абсолютно чистыми, препараты трифосфатов загрязнены присутствием дифосфатов и наоборот. Кроме того, продукты гидролиза трифосфатов взаимодействуют с друг с другом и осуществляют обратную связь с каскадом реакций ферментативного расщепления. Тем не менее, несмотря на все сложности, было определено 7 подтипов Р2У пуриноцепторов (см. таблицу 4).

Таблица 4. Экспрессия клонированных Р2У рецепторов в ЦНС

Подтип Р2У рецепторов Характер истики Экспрессия в ЦНС

Р2У1 О-белок связанный рецептор (Ф ЛС р/ИТФ/Са2+) Конечный мозг, промежуточный мозг, средний мозг, мозжечок

Р2У2 О-белок связанный рецептор (ФЛСр/ИТФ/Са2+) в мозге мыши, не определены в мозге крысы и человека

Р2У3 О-белок связанный рецептор (ФЛСр/ИТФ/Са2+) в зрелом мозге цыпленка

Р2У4 О-белок связанный рецептор (ФЛСр/ИТФ/Са2+) не определены

Р2У5 не определены не определены

Р2Уб О-белок связанный рецептор (ФЛСр/ИТФ/Са2+) не определены в мозжечке и больших полушариях

(цитировано по АЬЬгассЫо, 1997)

Первым клонированным P2Y рецептором стал P2Yi рецептор. Его фармакологическая характеристика (возможные агонисты и антагонисты) представлена в таблице 5. Для этого подтипа пуриноцептора характерна нечувствительность к уридиновым нуклеотидам, в то время как ответы на адениновые нуклеотиды являются высокоспецифичными (IC50 значения составляют наномоли) [Webb et al., 1993]. 2-MeSATP и АТФ усиливают аккумуляцию ИТФ, не влияя на аденилат-циклазу. В качестве конкурентного антагониста этого подтипа был установлен PPADS (как и для многих Р2Х рецепторов). Гибридизационный анализ показал высокую частоту встречаемости в ЦНС мРНК для P2Yi. Этот рецептор широко представлен в ЦНС цыпленка в различных ядрах конечного, промежуточного и среднего мозга, а также в клетках внешнего и внутреннего гранулярного слоев мозжечка и клетках Пуркинье [Webb et al., 1994].

Фармакологическая характеристика P2Y2 пуриноцептора показывает одинаковую чувствительность этого рецептора как к аденинам, так и к уридинам (см. таблицу 5). Этот рецептор широко распространен в головном мозге мыши, у человека он встречается значительно реже, что верно и для крысы [Lustig et al., 1993; Parr et al., 1994; Rice et al., 1995]. Подобное различие может быть либо отражением видоспецифичности данного подтипа рецептора, либо различной чувствительностью использованных техник при определении распространения этого рецептора разными авторами.

P2Y3 рецептор активируется преимущественно УТФ и АДФ, порядок действия его агонистов представлен в таблице 5. Этот рецептор широко представлен в спинном и головном мозге преимущественно в период развития, и

может играть значительную роль в процессах формирования и становления ЦНС [Webb et al., 1996а].

P2Y4 рецептор был клонирован из плаценты человека [Communi et al., 1996]. УТФ и УДФ являются полными агонистами для этого рецептора, увеличивая концентрацию ИТФ, в то время как АТФ и АДФ выступают в качестве частичных агонистов. По этой причине рецептор носит название «уридинового рецептора» [Communi et al., 1996]. По данным других авторов АТФ является даже антагонистом этого рецептора [Nguyen et al., 1995]. Filtz с соавторами (1997) показал, что УТФ не является агонистом данного рецептора, а АТФ обладает способностью полного агониста, несмотря на то, что ее активность в 50 раз ниже активности УТФ. Авторами объясняется, что подобные различия в фармакологических характеристиках могли произойти из-за различного уровня рецепторной экспрессии.

По поводу распространения Р2У5 рецептора практически ничего не известно. Предполагается, что он, как и Р2Уз. может участвовать в процессе развития ЦНС. Фармакологическая характеристика рецептора представлена в таблице 5.

Было осуществлено клонирование Р2У6 рецептора из гладкой мышцы аорты [Chang et al., 1995]. Активация рецептора приводила к увеличению внутриклеточной кальциевой концентрации в ответ на аппликацию агонистов. Этот подтип рецептора также является УТФ-селективным.

Таблица 5. Агонисты и антагонисты клонированных P2Y рецепторов

Рецептор Селективные агонисты Селективные антагонисты

P2Y1 2-Ме8АТР>АДФ>АТФ не УТФ, не УДФ Сурамин, рА2=6 PPADS, рА2=6

P2Y2 УТФ=АТФ не 2-MeSATP, не УДФ, не АДФ Сурамин, рА2=4.3 не PPADS

P2Y3 АДФ>УТФ>АТФ=УДФ не определены

P2Y4 УТФ>АТФ не АДФ, не УДФ, не 2-MeSATP не сурамин не PPADS

P2Y5 АТФ>АДФ>2-Ме8АТР»УТФ, а,Р-метиленАТФ не определены

P2Y6 УДФ>АДФ>2-Ме8АТР не УТФ, не АТФ не определены

P2Y7 АТФ>АДФ=УТФ не определены

цитировано по (Abbracchio, 1997) и Boarder & Hourani (1998)

Огромное значение АТФ как сигнальной молекулы и продуктов ее гидролиза было предположено Burnstock еще в бОх и 70х годах. В отличие от уже во многом установленной роли адениновых нуклеотидов, физиологическая значимость регулируемого высвобождения уридиновых нуклеотидов пока не выяснена [Goetz et al., 1971; Richards et al., 1993; Enomoto et al., 1994]. Тот факт что, по крайней мере два P2Y рецептора (Р2Уб и P2Y4), селективно активируются уридиновыми нуклеотидами, является сильной поддержкой гипотезы о

функциональном значении уридиновых нуклеотидов. Синтез специфических селективных антагонистов и агонистов может помочь в ответе на вопрос о роли этих соединений в организме.

2.3.2.2. Агонисты и антагонисты Р2 пуриноцепторов

При использовании синтезированных аналогов пуриновых нуклеотидов необходимо принимать во внимание их потенциальную возможность тормозить активность эктонуклеотидаз, то есть, способность косвенно изменять эффективность эндогенной АТФ. Кроме того, исследуемые рецепторы проявляют разную чувствительность к различным агонистам в зависимости от того, в структуре какой ткани исследуется рецептор. Все вместе взятое осложняет использование тех или иных агонистов [Williams & Burnstock, 1997].

Почти все агонисты Р2 рецепторов являются производными аденозин- или уридин-5'-трифосфата. Фармакологический профиль синтезированных агонистов представляет модификации трифосфата (а,(3-метиленАТФ, ATPyS или UTPyS), рибозы 2' или 3' (2'-деокси-АТФ, 2',3'-изопропилиден-АМФ, З'-бензиламино-З'-деоксил-АТФ), пуринов в положении углерода С2 (2-MeSATP) или С8 (8-(6-аминогексиламино)АТФ), и пуринов в позиции N6 (Ыб-метилАТФ).

Антагонистами Р2 пуриноцепторов являются PPADS (пиридоксальфосфат-6-азафенил-2',4'-дисульфоновая кислота), реактив blue 2, а также сурамин. Все эти вещества не обладают селективностью - они не различают между Р2Х и P2Y рецепторами. Так, например, сурамин не лишен недостатков - он является блокатором экто-АТФаз, эктонуклеотидаз, различных протеинкиназ и не различает между Р2Х и P2Y рецепторами. По последним сообщениям сурамин, кроме того, может выступать в качестве ингибитора связывания с G-белком, проникая внутрь

клетки [Stone, 1998]. Было продемонстрировано, что селективность PPADS по отношению к Р2Х в 10-20 выше, чем P2Y, но вскоре установили, что он так же является антагонистом некоторых подтипов P2Y рецепторов.

2.3.2.3. Характеристика вторичных посредников P2Yрецепторов

G-белок связанные пуриноцепторы в ЦЫС сопряжены с различными системами вторичных посредников. Известны по крайней мере 3 системы, с которыми могут взаимодействовать эти рецепторы: через фосфолипазу С, через аденилат-циклазу и через систему тирозин-киназы. Наиболее часто встречаемым сигнальным путем, активируемым P2Y рецепторами, является активация фосфолипазы С. При активации P2Y пуриноцепторов астроглии происходит мобилизация Са2+ из внутриклеточных депо через инозитол-трифосфатный цикл, что предполагает реализацию эффектов через фосфолипазу С. Экспрессирование двух подтипов P2Yi и P2Y2 в клеточных линиях показало, что оба этих рецептора могут активировать фосфолипазу С [Filtz et al., 1994; Lazarowski et al., 1995]. Способность активировать фосфолипазу С показана и для P2Y6 рецептора, селективного для УТФ [Lazarowski & Harden, 1994].

P2Y рецепторы способны оказывать прямое ингибиторное воздействие на систему аденилат-циклазы. Эффекты, опосредованные P2Y рецепторами, часто, хотя и не всегда, являются чувствительными к токсину коклюша, что предполагает вовлечение Gi/G0 белков. В некоторых случаях наблюдается частичная блокада токсином коклюша, что предполагает участие системы Gq/Gn белков в реакциях P2Y рецепторов [Bruner & Murphy, 1993]. Существует несколько сообщений о стимуляции цАМФ P2Y рецепторами. Подобный эффект может осуществляться непрямым путем через активацию простагландинов, которые действуют через Gs-

связанные рецепторы [Post et al., 1996]. Однако есть и свидетельства прямого взаимодействия с Gs-белками, ведущего к активации аденилат-циклазы. В сообщении Communi с соавторами (в печати) как раз указывалось на увеличение уровня цАМФ при активации Р2Уц рецепторов в СНО-К1 клетках.

P2Y рецепторы могут осуществлять свои эффекты еще через одну систему вторичных посредников, а именно, через систему каскада тирозин-киназозависимого митоза и рецептора тирозин-киназы. Установлено, что P2Y рецепторы оказывают влияние на митоз во многих типах клеток: это гладкомышечные клетки сосудов, клетки эндотелия, мезаглиальные клетки [Schulz-Luhoff et al., 1992; van Daele et al., 1992; Wang et al., 1993]. Митоз и продукция простагландинов были отмечены в ответ на введение УТФ и АТФ в мезаглиальных клетках. Скорее всего, оба этих эффекта опосредованы тирозин-киназой [Huwiler & Pfeilschifter, 1994]. Возможны 3 способа регуляции митоза P2Y пуриноцепторами через тирозин-киназу: прямая активация каскада реакций тирозин-киназы Ру субъединицами G белка, через фосфолипазу С и через продукцию фактора роста (в эту цепочку также включена фосфолипаза С) и активацию им рецептора тирозин-киназы.

2.4. Возможные механизмы регуляции нервно-мышечной передачи аденозином

Многочисленные исследования, проведенные с целью изучения модуляции механизма высвобождения нейротрансмиттеров, однозначно показали, что аденозин играет немаловажную роль в этом процессе. Огромное количество разнообразных рецепторных систем в той или иной степени регулируются эндогенным аденозином, источником которого является как пресинаптическая, так и постсинаптическая клетка. В нервно-мышечном соединении эффекты аденозина

опосредуются через пресинаптические Ai аденозиновые рецепторы [Ribeiro et al, 1996]. В принципе, многочисленные механизмы могут быть вовлечены в депрессорное влияние аденозина на секрецию ацетилхолина (см. гл. Ai рецепторы). В гиппокампе аденозин увеличивает калиевую проводимость, снижая, таким образом, возбудимость клеток [Gerber et al., 1989]. Что касается нервно-мышечного синапса холоднокровных, то аденозин не влияет на потенциал действия нервного окончания [Silinsky & Solsona, 1992] и на калиевые токи в двигательном нервном окончании [Silinsky et al., 1990]. В дорзальном ганглии аденозин влияет на высокопороговые потенциалозависимые Са2+ каналы [Dolphin et al., 1986; Gross et al, 1989]. To же справедливо для пирамидных клеток СА1 [Scholz & Miller, 1991] и САЗ областей гиппокампа [Mogul et al., 1993], предполагая несколько иной механизм влияния аденозина, а именно, его прямое воздействие на потенциалозависимые Са2+ каналы, контролирующие секрецию медиатора. Для мотонейронов мыши также было показано, что аденозин вызывает ингибирование N типа кальциевых каналов на пресинаптической мембране [MynliefF & Beam, 1994]. Механизмы действия аденозина, не связанные с влиянием на Са2+ токи, были предположены для гиппокампа крысы [Scholz & Miller, 1992] и нервно-мышечного синапса лягушки [Hunt et al., 1992; Silinsky & Solsona, 1992]. В норме нервно-мышечная депрессия у лягушки не зависит от изменений входа Са2+, а, скорее, отражает снижение способности Са2+ запускать процесс секреции медиатора [Silinsky, 1981, 1984; Silinsky & Solsona, 1992]. Таким образом, делается вывод о том, что эндогенный аденозин оказывает пресинаптическое депрессорное воздействие на нервно-мышечную передачу у холоднокровных, через механизм независимый от входа кальция и отстоящий во временной шкале от процесса секреции ацетилхолина [Redman & Silinsky, 1994]. Различия в механизме

пресинаптического влияния аденозина у теплокровных (мышь, крыса) и холоднокровных (лягушка) могут объясняться как видовыми различиями животных, то есть экспрессией разных видов кальциевых каналов на пресинаптической мембране у различных животных, так и наличием одного типа канала, но с разными фармакологическими свойствами [Mynlieff & Beam, 1994].

Поскольку последние исследования показали существование множества подтипов Са2+ каналов (как аденозин-чувствительных, так и аденозин-нечувствительных), вносящих вклад в Са2+ ток, ответственный за осуществление процесса секреции нейротрансмиттера, требуется заново оценить ранее предложенные механизмы модуляции выброса медиатора аденозином. Таким образом, вопрос о механизме влияния аденозина на нервно-мышечную передачу у холоднокровных остается открытым.

2.5. Пресинаптические эффекты: ЛТФ или аденозин?

Длительное время попытки продемонстрировать специфические эффекты АТФ были затруднены общепризнанным фактом быстрого превращения АТФ экто-АТФазами до аденозина, который вместо усиления возбуждения ингибирует его проведение [Scefner & Chiu, 1986]. Вплоть до 90х годов появлялись лишь единичные сообщения о возбуждающем влиянии АТФ в центральных нейронах [Krishtal et al., 1987]. Первое доказательство участия АТФ в процессах возбуждения было получено при исследовании нейронов ресничного ганглия морской свинки [Evans et al., 1992; Silinsky et al., 1992], когда было установлено, что антагонист Р2 рецепторов - сурамин, способен подавлять именно АТФ-индуцированные токи, но не токи, вызванные ацетилхолином. В 1983 году Salt & Hill показали, что сенсорные нейроны крысы в хвостатом ядре тройничного нерва отвечают на АТФ

41 í

увеличением частоты спонтанной активности. Исследования Ules с соавторами в 1993 году продемонстрировали, что норадренергические нейроны крысы (в голубом пятне), содержащие ингибиторные аденозиновые рецепторы [Scenfner & Chili, 1986; Regenold & liles, 1990], отвечают также на введение стойких аналогов АТФ увеличением частоты спонтанной активности. Сама АТФ не приводила к значительным изменениям частоты, но при введении дополнительно с ней в омывающий раствор антагонистов аденозиновых рецепторов, наблюдалось увеличение спонтанной активности. На основании этого было высказано предположение о балансе между эффектами, опосредованными возбуждающими Р2 рецепторами, и эффектами ингибиторных аденозиновых рецепторов (из-за расщепления АТФ до аденозина). Впоследствии в этих же нейронах при использовании методик внутриклеточного отведения потенциалов [Harms et al., 1992] и пэтч-клампа [Shen & North, 1993] было подтверждено, что активация Р2 пуриноцепторов вызывает входящий ток и деполяризацию мембраны клетки. Исследование вызванных и миниатюрных синаптических токов в средней уздечке у крысы [Edwards et al., 1992] обнаружило их нечувствительность к блокаторам глутамата и ацетилхолина. Токи блокировались лишь сурамином и десенситизирующим агонистом АТФ рецепторов - а,ß-метиленАТФ. АТФ, содержащаяся вместе с глутаматом в пресинаптических терминалях гиппокампа, усиливает его постсинаптическое действие, либо через метаботропный P2Y рецептор, либо через эктопротеинкиназу, которая в свою очередь фосфорилирует мембранные белки связанные с глутаматным рецептором [Chen et al., 1994]. Синергический эффект АТФ с глутаматом может играть решающую роль в индуцировании долговременной потенциации, и соответственно, в процессах

научения и памяти. Все вышеизложенное является свидетельством непосредственного участия самой АТФ в проведении возбуждения в ЦНС.

Что касается нервно-мышечного соединения, то до сих пор общепринятой точкой зрения является то, что экзогенная АТФ модулирует синаптическую передачу в результате расщепления до пресинаптически активного аденозина [Ribeiro & Sebastiao, 1987; Meriney & Grinnell, 1991; Redman & Silinsky, 1994]. Действительно, экзогенный аденозин ингибирует как вызванную, так и спонтанную активность. В связи с этим предполагается, что именно эндогенный аденозин вызывает депрессию синаптических токов во время ритмической активности нерва [Meriney & Grinnell, 1991; Redman & Silinsky, 1994]. Согласно этим предположениям АТФ в нервно-мышечном соединении выполняет роль только источника аденозина. С другой стороны, в работах на эмбриональных и развивающихся синапсах показано, что именно АТФ модулирует синаптическую передачу [Mozrzymas & Ruzzier, 1992; Fu, 1994; Liou & Fu, 1995a; Lu & Fu, 1995b], Таким образом, вышеизложенные данные о непосредственном влиянии самой АТФ на различные рецепторные системы в ЦНС оставляют место гипотезе о прямой модуляции АТФ нервно-мышечной передачи.

АТФ, оказывая влияние через Р2 тип пуриноцепторов, а аденозин через Р1 тип, вызывают сходные эффекты, затрудняя интерпретацию результатов. Поэтому, для разделения эффектов АТФ от эффектов ее производных, очень важным представляется фармакологический подход с использованием блокаторов различных стадий ее ферментативного превращения. Кроме того, для холинергического синапса, где АТФ является котрансмиттером и модулятором синаптической передачи, необходимым является выяснить скорость превращения АТФ в аденозин, и, соответственно, участие как самой АТФ, так и продуктов ее

гидролиза в регуляции проведения возбуждения в синапсе. Smith в 1991 году показал, что 5x10"5 моль/л АТФ в скелетной мышце превращается в аденозин за 2 минуты [Smith, 1991]. Но более точная оценка роли экто-АТФазы и 5'-нуклеотидазы требует, к сожалению, пока еще недоступных данных о плотности содержания этих ферментов на экстраклеточной мембране и их скорости оборота.

Для ацетилхолинэстеразы холинергического синапса эти значения известны. Они

2 1

составляют 600 мест связывания ацетилхолинэстеразы на 1 мкм и 9,500 с" соответственно [Anglister et al, 1994]. Ввиду специализации нервно-мышечного соединения для ацетилхолина, скорость оборота ацетилхолина должна быть значительно выше, чем соответствующие значения для системы АТФ - экто-АТФаза/5'-нуклеотидаза. Кинетика ферментативного превращения АТФ имеет большое значение, так как установлено, что 5'-нуклеотидаза не только имеет значительно меньшую активность по сравнению с экто-АТФазой и экто-АДФазой, но и находится под тормозным влиянием АТФ и АДФ [Zimmermann, 1994]. Эта отрицательная обратная связь отодвигает во времени процесс образования аденозина, продлевая, таким образом, эффекты АТФ. В связи с этим интересными являются данные, представленные Ribeiro с соавторами (1996), о временном ходе деградации АТФ и появлении продуктов ее метаболизма для нервно-мышечного синапса лягушки. АТФ (10"5 моль/л) апплицировалась в ванночку в присутствии ингибитора захвата аденозина дипиридамола. Пик концентрации АДФ (около 4x10" 6 моль/л) приходился на 5 мин после аппликации АТФ, пик АМФ (около 3x10"6 моль/л) - на 15 -20 мин, аденозин в концентрации 10"6 моль/л появлялся лишь на 15-20 минуте и его концентрация достигала максимума (около 1,5-1,7х10~б моль/л) на 120 минуте. В связи со всем выше перечисленным нам кажется, что скорость превращения АТФ в аденозин должна быть подвергнута переоценке. Тем более,

что в работе Robitaile (1995), посвященной исследованию типа пуриноцепторов в перисинаптических Шванновских клетках нервно-мышечного соединения лягушки, было показано, что только эндогенная АТФ участвует в Са2+ сигнализации глиальных клеток после ее высвобождения вместе с ацетилхолином. Robitaile установил, что блокада рецепторов АТФ в глиальных клетках уменьшает и задерживает Са2+ сигналы в ответ на стимуляцию двигательного нерва.

2.6. Постсшшптические эффекты АТФ

Если на пресинаптическом уровне АТФ и ее производные оказывают преимущественно ингибирующее воздействие на секрецию медиатора (см. вышеупомянутые работы), то постсинаптический эффект имеет, по-видимому, обратный знак [Akasu et al, 1981; Igusa, 1988; Lu & Smith, 1991]. Есть основания полагать, что АТФ способна потенциировать ответы постсинаптической мембраны на ацетилхолин, хотя механизмы и физиологическая роль такого эффекта еще далеки от разрешения. Особенно ярко потенциирующий эффект представлен в эмбриональных и развивающихся синапсах. АТФ изменяет кинетику канала, увеличивая время открытого состояния и частоту открывания низкопроводимого ацетилхолинового канала, который представлен лишь в эмбриональных мышечных волокнах [Fu, 1994; Fu, 1995]. Подобный эффект АТФ ограничивается ранними стадиями эмбриогенеза. Во взрослых синапсах крысы АТФ увеличивает частоту открывания ацетилхолиновых каналов, не влияя на время открытого состояния, а продукты гидролиза АТФ (АДФ, АМФ, аденозин) оказываются не активными [Lu & Smith, 1991]. Вероятно, АТФ может непосредственно активировать ионный канал холинорецептора. Это предположение было выдвинуто на основании экспериментов, проведенных на культуре мышечных клеток Xenopus [Igusa, 1988] и

на нервно-мышечном препарате крысы [Mozrzymas & Ruzzier, 1992]. Однако не выяснено место связывания молекул АТФ с ацетилхолиновым каналом, хотя, возможно, существует механизм внутримембранного взаимодействия между ацетилхолиновыми и пуринергическим рецепторами. Вполне вероятно, что на ранних стадиях синаптогенеза может быть перекрытие мест связывания для лигандов на никотиновом рецепторе, так как установлено, что никотиновый рецептор имеет экстраклеточные места связывания АТФ [Carlson & Raftery, 1993]. АТФ, увеличивая чувствительность постсинаптической мембраны к нейротрансмиттеру, участвует в процессах постсинаптической пластичности. Можно предполагать, что потенциирующий эффект эндогенной АТФ, выделяемой совместно с ацетилхолином, может модулировать передачу физиологических команд от мотонейрона к скелетной мышце на постсинаптическом уровне. Одно из проявлений постсинаптической пластичности - феномен постсинаптической потенциации. Этот феномен заключается в постсинаптическом взаимодействии квантов медиатора, приводящем к локальному повышению концентрации медиатора. Это проявляется в замедлении скорости спада второго тока концевой пластинки при парной стимуляции двигательного нерва [Magazanik et al, 1984], а также в увеличении амплитуды ТКП. Это происходит за счет повышения количества односвязанных комплексов (в результате увеличения локальной концентрации ацетилхолина при ингибированной ацетилхолинэстеразе) с более высокой вероятностью последующей активации, чем свободный рецептор. Такой механизм обеспечивает задержку связанного ацетилхолина в синаптической щели, что может вызывать удлинение временного хода синаптических ответов.

Возможно, АТФ может напрямую влиять на холинорецептор и менять его кинетику взаимодействия с ацетилхолином, повышая сродство холинорецептора к

ацетилхолину, что отражается в увеличении длительности ТКП. Очевидно, эффект продления ТКП будет развиваться лишь при высокой концентрации АТФ и быстрой скорости перфузии, так как мы можем иметь дело как с ингибиторным влиянием АТФ через пресинаптические пуриноцепторы, так и постсинаптическим потенциирующим, имея ввиду баланс между пре- и постсинапсом и участие системы ферментативного расщепления АТФ, и, как следствие, дополнительного депрессирующего влияния аденозина через пресинаптические А1 пуриноцепторы.

Совершенно не изучено влияние АТФ на десенситизацию холинорецепторов постсинаптической мембраны. Если АТФ действительно увеличивает сродство холинорецептора к ацетилхолину, то это должно приводить к ускоренному переходу рецепторов в состояние десенситизации. Известно, что десенситизацию можно вызвать как экзогенным хо л и но м и мети ком [КЫго1Щ ег а1., 1997а, 1998], так и в результате действия эндогенного ацетилхолина [Гиниатуллин и др., 1986; СНшаШШп е1 а1., 1989]. Причем десенситизация находится под контролем систем внутриклеточных посредников [КЫгои§ е1 а1., 1998], что позволяет предположить вполне вероятную модуляцию процесса десенситизации через метаботропный рецептор для АТФ.

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объект исследования

Эксперименты проводили на изолированном нервно-мышечном препарате холоднокровных седалищный нерв - портняжная мышца лягушек Rana ridibunda и Rana temporaria. В экспериментах использовалось 386 лягушек, которых содержали в холодильнике при температуре 3-5°С. Под эфирным наркозом лягушек декапитировали и снимали кожный покров. Затем выделяли портняжную мышцу от дистального конца, взяв сухожилие на лигатуру, до места вхождения нерва в мышцу. Далее вскрывали брюшную полость, брали на лигатуру седалищный нерв у места вхождения в спинной мозг и отпрепаровывали до места вхождения в мышцу. Для предотвращения сокращений мышцы осуществляли поперечное рассечение мышечных волокон [Волкова и др., 1975].

Препараты отмывали от крови в течение 10 минут в 2-3 сменах раствора и помещали в ванночку, фиксируя мышцу с помощью микрохирургических игл на диске из смолы Sylgard (США).

3.2. Ванночка и система перфузии

Ванночка, где размещался нервно-мышечный препарат, была выполнена из органического стекла и имела рабочую емкость 2 мл. Водяная "рубашка" ванночки соединялась резиновыми трубками с "рубашками" переходных стаканчиков перфузионной системы и с ультратермостатом U-15 (Германия) для обеспечения термостатирования растворов. Эксперименты проводили при температуре 20±2°С. Каждая из трех пар емкостей перфузионной системы состояла из основного стаканчика (емкостью 250 мл) и переходного (емкостью 50 мл), соединенных

поливиниловыми трубками таким образом, что скорость перфузии в течение эксперимента оставалась постоянной. Поливиниловые трубки от переходных стаканчиков сходились к переключателю протока, а на трубке, идущей к ванночке, имелся винтовой зажим для регуляции скорости протока. Во всех проведенных экспериментах скорость перфузии растворов через ванночку составляла 3 мл/мин. Из ванночки растворы откачивались активно с использованием микрокомпрессора "Скалярий". Контроль за температурой проводили с помощью микротермодатчика, помещенного непосредственно в ванночке, в растворе, на расстоянии 0,5 - 1 см от мышцы.

3.3. Растворы

В течение эксперимента через ванночку с находящимся в ней нервно-мышечным препаратом непрерывно перфузировали раствор для холоднокровных следующего состава (в ммоль/л): NaCl - 115,0; KCl - 2,5; СаСЬ - 1,8; NaHCCb -11,0; pH раствора поддерживали на уровне 7,2-7,4. Для ингибирования ацетилхолинэстеразы использовали обратимый ингибитор прозерин (Serva, США) в концентрации 3-5x10"6 моль/л. Прозерин находился в проточном растворе в ходе всего эксперимента.

Дозы и концентрации используемых агонистов и антагонистов пуринергических рецепторов: в экспериментах применяли АТФ (Sigma) в концентрации 10"5-10"3 моль/л, АДФ (Sigma) в концентрации 10"4 моль/л; АМФ (Sigma) - 10"4 моль/л, аденозин (Sigma) - 10"5-10"3 моль/л, PPADS (Sigma) - 10-50х10"6 моль/л, конканавалин A (Sigma)- 0,1 мг/мл, сурамин (Sigma) 10"4 моль/л, а,Р-метиленАТФ (Sigma) 10'4 моль/л, УТФ (Sigma) 10"4 моль/л, теофиллин (Sigma) 10"3 моль/л, DPCPX (Sigma) 10'7 моль/л.

3.4. Микроэлектроды

Внутриклеточное отведение токов концевой пластинки производили с помощью микроэлектродов из стекла "Пирекс", заполненных 2,5 моль/л раствором КС1 и имеющих входное сопротивление 3-5 £Юм [Костюк, 1960]. Для внеклеточной регистрации синаптических ответов микроэлектроды заполняли 22,5 моль/л раствором КаС1 или раствором Рингера, внеклеточные микроэлектроды имели сопротивление 1-2 ГЮм. Микроэлектроды изготавливали из трубок диаметром 1,5-1,8 мм, содержащих микрокапилляры [Казанский, 1973], на полуавтоматической микрокузнице. Заполненные раствором микроэлектроды укрепляли с помощью держателя и с противоположного конца в микроэлектрод вставляли серебряную проволочку, покрытую слоем хлористого серебра, что обеспечивало отсутствие поляризации в ходе эксперимента.

Индифферентный электрод представлял собой аналогичную неполяризующуюся систему без микроэлектрода, которая помещалась в специальном гнезде ванночки, сообщающемся с основной камерой. Держатели активных электродов закрепляли в микроманипуляторах ММ-1, что позволяло путем микроперемещений под контролем бинокулярного микроскопа МБС-9 вводить кончик микроэлектродов в область концевой пластинки мышечного волокна. При этом расстояние между местами вкола потенциального и токового микроэлектродов не превышало 10-50 мкм.

3.5. Усилительная и регистрирующая аппаратура

Активный потенциальный и индифферентный электроды соединяли с усилителем биопотенциалов. Используемая конструкция усилителя позволяла измерять сопротивление электрода и компенсировать потенциал кончика

микроэлектрода. Активный токовый электрод соединялся с системой фиксации мембранного потенциала, представляющей собой усилитель обратной отрицательной связи. Система фиксации потенциала позволяла фиксировать мембранный потенциал в диапазоне -200 - +50 мВ в полосе 0-2,5 кГц. С усилителя и системы фиксации потенциала сигнал параллельно подавался на цифровой вольтметр Ф-4214, осциллограф С1-83, и на интерфейсную плату персонального компьютера Pentium 100. Частота квантования составляла 5-20 мкс на точку. Зарегистрированные экстраклеточные сигналы после фильтрации (0-10) кГц усиливали и подавали на вход 10 разрядного АЦП. Частота квантования составляла 5 мкс на точку. Последующее измерение параметров токов концевой пластинки и миниатюрных токов концевой пластинки осуществляли с помощью оригинальной программы (автор программы - Лайков Т.В.). Эта программа позволяла рассчитать амплитуду сигналов, время роста от 10% до 90% от максимальной амплитуды. Спад сигналов и скорость спада, на участке 80-20% от максимальной амплитуды аппроксимировался экспонентой по методу наименьших квадратов и рассчитывалась постоянная времени спада.

3.6. Стимуляция двигательного нерва

Для непрямого раздражения нервно-мышечного препарата нерв располагали на серебряных электродах, в отдельной герметической увлажненной камере, изолированной от ванночки, в которой помещалась мышца. Герметизацию отсека с нервом осуществляли тонкой пластиной, покрытой слоем вазелина. Стимулирующие электроды соединялись с выходными клеммами изолирующего трансформатора электростимулятора ЭСЛ-2. Для регистрации токов концевой пластинки нерв раздражали прямоугольными импульсами сверхпороговой

амплитуды длительностью 0,2-0,4 мс с частотой 0,03 Гц. Использовали также парную стимуляцию нерва с межимпульсным интервалом 100 мс.

Поскольку естественной формой функционирования нервно-мышечного синапса является передача серии импульсов, применяли также ритмическую стимуляцию с частотой от 10 Гц до 60 Гц.

Для регистрации потенциалов действия нервного окончания и экстраклеточных токов концевой пластинки стимуляцию двигательного нерва осуществляли прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0,20,4 мс супрамаксимальной величины с частотой 0,5 Гц.

3.7. Анализ вызванной секреции медиатора

Вызванную квантовую секрецию оценивали по амплитудно-временным параметрам вызванных токов концевой пластинки. Для отведения токов концевой пластинки потенциальный и токовый микроэлектроды фокусировали и вводили в область концевой пластинки мышечного волокна. Накопление и усреднение токов концевой пластинки производили с помощью персонального компьютера с периодом опроса 5-20 мкс на точку. Расчет параметров спада токов концевой пластинки производили при помощи оригинальной программы.

3.8. Анализ спонтанной квантовой секреции медиатора

Спонтанную квантовую секрецию оценивали по амплитудно-временным параметрам миниатюрных токов концевой пластинки. Для отведения миниатюрных токов концевой пластинки потенциальный и токовый микроэлектроды вводили в область концевой пластинки мышечного волокна, сигналы пропускали через фильтр в полосе 1 Гц - 2,5 кГц и регистрировали с

помощью компьютера. Отбор миниатюрных токов концевой пластинки производился по превышению пороговой амплитуды сигнала. В большинстве случаев усреднялись по 50-100 сигналов. Дальнейший анализ параметров миниатюрных токов концевой пластинки проводился на персональном компьютере. В каждой из таких серий экспериментов производился контроль на гомогенность популяции миниатюрных токов концевой пластинки. С этой целью проводился набор около 100 миниатюрных токов концевой пластинки с индивидуальным анализом каждого сигнала.

3.9. Анализ амплитудно-временных параметров составного потенциала действия нервного окончания

Для анализа потенциала действия нервного окончания брали следующие параметры: амплитуду потенциала действия, полуширину потенциала действия и истинную синаптическую задержку. Амплитуду зарегистрированных экстраклеточных сигналов выражали в мВ. Амплитуда потенциала действия измерялась как максимальная величина натриевой компоненты потенциала действия нервного окончания. Полуширина потенциала действия измерялась как временной интервал на середине натриевой и калиевой компоненты потенциала действия, и выражалась в мкс. Величину истинной синаптической задержки измеряли как временной интервал между пиком потенциала действия нервного окончания и началом фазы роста (20% от максимального значения ТКП) постсинаптического ответа, выражали в мкс. Для анализа этих параметров регистрировали от 250 до 500 потенциала действия.

Микроэлектрод под визуальным контролем подводили и плотно прижимали к проксимальной части наиболее крупной нервной терминали, 3-5 мкм

от начала миелинизированной части аксона. В этой области регистрировались трехкомпонентные потенциалы действия нервного окончания [Зефиров, Халилов, 1985; МаПаП, 1984; БЬакшапоуа, (Л а!., 1994].

3.10. Статистическая обработка экспериментальных данных

Для статистической обработки экспериментальных данных использовали параметрический критерий Стьюдента тест) для попарно связанных вариант. Расчет средних величин производился по формуле:

где п - число парных измерений, Е- математическая сумма, с1 - выборочная средняя между попарно связанными вариантами сравниваемых групп 1иТ, а разность с/, = X/ -у,. В этом случае выборочная дисперсия будет равна:

Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента, коэффициент t рассчитывали по формуле

П

п—1

ошибка средней рассчитывалась по формуле:

й

Использовали уровень значимости 0,05.

отличий между двумя популяциями, равный

Для непараметрических данных, когда не делалось предположения о распределении в генеральной совокупности, использовался непараметрический критерий Вилкоксона. В качестве контрольной величины принималось и - полное число инверсий в двух выборках. Если гипотеза была верна, то II не должно было слишком сильно отклоняться от своего математического ожидания:

2

От гипотезы отказывались, если

Нл 'Нп

и———■ 2

больше определенного иа на уровне значимости 0,05, в этом случае две выборки относятся к разным генеральным совокупностям.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 4.1. Пресинаптические эффекты АТФ и аденозина

4.1.1. Влияние АТФ и аденозина на многоквантовые ТКИ

В первой серии экспериментов исследовали влияние АТФ и аденозина на многоквантовые токи концевой пластинки (ТКП). В контроле при потенциале фиксации -40 мВ (I = 20+2 °С) и частоте стимуляции двигательного нерва 0,03 Гц амплитуда ТКП составляла 155±34 нА (п=19 синапсов). После аппликации АТФ наблюдалось снижение амплитуды много квантовых ТКП (рис. 1). Так, АТФ в концентрации 10"4 моль/л к 10 минуте снижала амплитуду ТКП до 65±4% (п=11, Р<0,05) от контрольного значения. Аденозин в той же концентрации уменьшал амплитуду ТКП к 10 минуте до 70±3% (п=16, Р<0,05). Таким образом, снижение амплитуды при действии АТФ и аденозина в этой концентрации было равноэффективным. Причем, как для АТФ, так и для аденозина падение амплитуды было обратимым при отмывке физиологическим раствором. В высокой концентрации (10"3 моль/л) падение амплитуды при аппликации аденозина составило 62+3% (п=11, Р<0,05), то есть депрессорный эффект аденозина был выражен существенно меньше, чем у АТФ в той же концентрации. АТФ вызывала падение амплитуды ТКП до 43±9% (п=10, Р<0,05). На рис. 2 представлена концентрационная зависимость эффектов АТФ и аденозина в диапазоне концентраций от 10"5 до 10"3 моль/л.

В экспериментах с ингибированной ацетилхолинэстеразой снижение амплитуды под действием как АТФ, так и аденозина было сопоставимо с таковым при интактной ацетилхолинэстеразе, что говорило об отсутствии

А

2 мс

а

б

контроль аденозин отмывка

контроль АТФ

отмывка

100 -

80 -

н

§

60 -

40 -

I 20 -

0

>4 К

0

1

и к

со о

и

а пЗ

©

Н

С

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Соколова, Елена Михайловна, 1999 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бухараева Э.А., Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A. Влияние холинергических соединений на спонтанное квантовое освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки. // Нейрофизиология. - 1986. - том 18. - N5. - стр. 586-593.

2. Волкова И.Н., Никольский Е.Е., Полетаев Г.И. Блокирование потенциалов действия и сокращения скелетной мышцы лягушки поперечным рассечением. // Физиол. журнал СССР. - 1975. - том 61. - N9,- стр. 1433-1436.

3. Волкова И.Н., Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A. Связано ли пресинаптическое действие карбахолина с активацией постсинагггической мембраны? // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. -1981. - том 91. -N4. - стр. 393-396.

4. Гиниатуллин P.A., Бальцер С.К., Никольский Е Е., Магазаник Л.Г. Исследование постсинаптической потенциации и десенситизации в нервно-мышечном синапсе лягушки, вызванных ритмической стимуляцией двигательного нерва. // Нейрофизиология. - 1986. - том 18. - N5. - стр. 645-654.

5. Гиниатуллин P.A., Швецов А.Б., Талантова М.А. Особенности функционирования холинергического синапса после нарушения гидролиза медиатора. // В кн.: Вопросы нейробиологии / Под ред. Волковой И.Н. - Казань, 1987,- стр. 21-28.

6. Гиниатуллин P.A., Хазипов Р.Н. Развитие десенситизации при ритмической активности синапса и в ходе генерации одиночного сигнала. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1989. - N12,- стр. 654-657.

7. Гиниатуллин P.A., Хазипов P.H. Особенности действия ионов кальция на миниатюрные токи концевой пластинки после ингибирования ацетилхолинэстеразы. //Нейрофизиология. - 1990. - том 22. - N4,- стр. 556-559.

8. Гиниатуллин P.A., Хазипов Р.Н. Токи концевой пластинки при физиологическом уровне квантовой секреции и после потенциации освобождения медиатора 4-аминопиридином. // Нейрофизиология. - 1991. - том 23. -N1. - стр. 48-56.

9. Гиниатуллин P.A. Повторная активность в двигательных нервных окончаниях: модуляция двухвалентными катионами, ритмической активацией и холинергическими агентами. // Нейрофизиология. - 1992,- том 24. - N4,- стр. 387-395.

10. Гиниатуллин P.A., Швецов А.Б. Влияние квантового состава, мембранного потенциала и плотности холинорецепторов на временное течение токов концевой пластинки крысы в условиях ингибирования ацетилхолинэстеразы. // Нейрофизиология. - 1992а. - том 24. - N3. - стр. 269-279.

11. Гиниатуллин P.A., Талантова М.В. Физиологическая роль десенситизированных рецепторов в скелетной мышце. // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 1995. -N4. - стр. 578-581.

12. Гиниатуллин P.A., Талантова М.В. Роль десенситизированных холинорецепторов в развитии постсинаптической потенциации. // Нейрофизиология. - 1995а. -N5/6,- стр. 361- 367

13. Гиниатуллин P.A., Соколова Е.М. Влияние пуринергических соединений на постсинаптическую потенциацию в нервно-мышечном синапсе. // Тез. докл. I (IX) Межд. совещ. по эволюционной физиологии. - С.Петерб. - 1996. - стр. 4748.

14. Гиниатуллин P.A., Магазаник Л.Г. Десенситизация постсинаптической мембраны, вызванная спонтанной квантовой секрецией медиатора. // Росс, физиол. журнал. - 1997. - том 83. -N3. - стр. 67-72.

15. Гиниатуллин P.A., Магазаник Л.Г. Играет ли физиологическую роль десенситизация холинорецепторов в нервно-мышечном синапсе? // Росс, физиол. журнал. - 1998. - N1/2. - стр. 3-20.

16. Гиниатуллин, Е.М. Соколова. Модулирующая роль АТФ в нервно-мышечном синапсе. //Росс, физиол. журнал. - 1998а. - N10. - стр. 1132-1138.

17. Земскова С.Н., Эдер К., Гиниатуллин P.A., Зефиров А.Л., Хазипов Р.Н. Ранние постденервационные изменения свойств постсинаптической мембраны мышечного волокна амфибий. // Физиол. журн. СССР. - 1991. - том 77. - N2. -стр. 57-65

18. Зефиров А.Л., Халилов И.А. Особенности электрической активности в различных участках нервного окончания лягушки. // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 1985. - том 49. - N1. - стр. 7-10.

19. Зефиров А.Л. Расположение и функционирование точек освобождения медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки. // Нейрофизиология. - 1985. - том 17. - N2. - стр. 152-160.

20. Казанский В.В. Методика изготовления "самозаполняющихся" микроэлектродов. // Физиол. журнал СССР. - 1973. - том 59. - N6. - стр.695-696.

21.Ковязина И.В., Гиниатуллин P.A., Никольский Е.Е., Выскочил Ф. Эффекты ингибирования ацетилхолинэстеразы в нервно-мышечных синапсах с разным исходным функциональным состоянием. // Нейрофизиология. - 1996. - том 28. -N4/5. - стр. 263-267.

22. Костюк П.Г. Микроэлектродная техника. - Киев: Наукова думка, 1960. - 175с.

23. Магазаник Л.Г. О механизме десенситизации постсинаптической мембраны мышечного волокна. //Биофизика. - 1968. - том 13. - N1. - стр. 199-203.

24. Магазаник Л.Г., Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A. Зависимость скорости спада токов концевой пластинки от величины квантового состава и предшествующей синаптической активности. // Докл. АН СССР. - 1983. - том 271. -N3.-стр. 489-492.

25. Магазаник Л.Г., Гиниатуллин P.A. Влияние изменений мембранного потенциала и температуры на постсинаптическую потенциацию в нервно-мышечном соединении лягушки. // Нейрофизиология. - 1986. -том 18. - N4. - стр. 512-518.

26. Никольский Е.Е., Гиниатуллин P.A. Пресинаптическое действие карбахолина на нервно-мышечный препарат лягушки после перерезки двигательного нерва. // Докл. АН СССР. - 1984. - том 284. - N6. - стр. 250-252.

27. Соколова Е.М., Гиниатуллин P.A., Зиганшин А.У.. Возможная роль АТФ в процессах постсинаптической пластичности. // Тез. докл. Всерос. симп. и школы-семинара молодых ученых и учителей: Проблемы адаптации растущего организма к физической и умственной нагрузке. - Казань. - 1996. - стр. 90-91.

28. Соколова Е.М., Чикаев В.Ф., Гиниатуллин P.A., Агаджанян С.И. Влияние антисептиков ЭХАРа и хлоргексидина на функциональное состояние периферического нервно-мышечного аппарата. // Каз. Мед. Журнал. - 1997. -том 78. -N2.-стр. 107-110.

29. Соколова Е.М., P.A. Гиниатуллин. Действие АТФ и аденозина на токи концевой пластинки лягушки. // Тез. докл. научно-практ. конф. молодых ученых КГМУ. -Казань. - 1997а. - стр. 49.

30. Турпаев Т.М. Участие макроэргов в регуляции активности холинорецептивной субстанции. //Журн. эвол. биохим. и физиол. - 1965,- том 1. - N6. - стр. 500-506.

31. Хазипов Р.Н., Гиниатуллин Р.А. Влияние ионов магния на функциональное состояние постсинаптической мембраны через модуляцию уровня неквантовой секреции медиатора. //Нейрофизиология. - 1992,- том 24. - N1,- стр. 97-100.

32. Шарифуллина Э.З., Талантова М.В., Соколова Е.М., Афзалов Р. А. Влияние верапамила и проадифена на развитие десенситизации, вызванной эндогенным ацетилхолином. // Тез. докл. Всерос. симп. и школы-семинара молодых ученых и учителей: Проблемы адаптации растущего организма к физической и умственной нагрузке. - Казань. - 1998. - стр. 84.

33. Abbracchio М.Р., Fogliatto G., Paoletti A.M., Rovati G.E., Cattabeni F. Prolonged in vivo exposure of rat brain slices to adenosine analogs: selective desensitization of Ai but not ha receptors. // Eur. J. Pharmacol. Mol. Pharmacol. - 1992. - vol. 227. - pp. 317-324.

34. Abbracchio M.P., Burnstock G. Purinoceptors: Are there families of P2X and P2Y purinoceptors? // Pharmacol. Ther. - 1994. - vol. 64. - pp.445-475.

35. Abbracchio M.P., Ceriti S., Burnstock G., Cattanebi F. Purinoceptors on glial cells of the central nervous system: functional and pathological implications. // Adenosine and adenine nucleotides: from molecular biology to integrative physiology / Ed. Belardinelli L., Pelleg A. - Norwell (MA): Kluwer Academic. - 1995. - pp. 271-280.

36. Abbracchio M.P. ATP in brain function. // Purinergic approaches in experimental therapeutics / Ed. Jacobson K.A., Jarvis M.F. - London: Wiley-Liss. Inc. - 1997. - pp. 383-404.

37. Akasu Т., Hirai R., Koketsu K. Increase of acetylcholine receptor sensitivity by adenosine triphosphate: a novel action of ATP on ACh-sensitivity. // Br. J. Pharmacol. - 1981.-vol. 74. - pp. 505-507.

38. Anderson C.R., Stevens C.F. Voltage-clamp analysis of acetylcholine induced endplate current fluctuation at frog neuromuscular junction // J.Physiol.(Lond). - 1973. -vol. 235. - pp. 655-691.

39. Anglister L., Stiles J.R., Salpeter M.M. Acetylcholinesterase density and turnover number at frog neuromuscular junctions, with modelling of their role in synaptic function. //Neuron. - 1994. -N12. - pp. 783-794.

40. Barraco R.A., Ergene E., El-Ridi M. Purinergic receptors in the nucleus tractus solitarius mediate distinct cardiorespiratory response patterns. // Drug. Dev. - 1993. -vol. 28. - pp. 309-314.

41. Bean B.P. Pharmacology and electrophysiology of ATP-activated ion channels. // TiPS. - 1992. - vol. 13. - pp. 87-90.

42. Belardinelli L., Curtis A.B., Bertolet B. Binding of the novel nonxanthine A2a adenosine receptor antagonist [3H]SCH58261 to coronary artery membranes. // Circ Res. - 1996. - vol. 79. - N6. - pp. 1153-60.

43.Bennet M.R., Ho S. Probabilistic secretion of quanta from nerve terminals in avian ciliary ganglia modulated by adenosine. // J. Physiol. (Lond). - 1991. - vol. 440. - pp. 513-527.

44. Blazynski C., Mcintosh. Characterization of adenosine A2 receptors in bovine retinal membranes. // Exp. Eye Res. - 1993. - vol. 56. - pp. 585-593.

45. Bo X., Zhang Y., Nassar M., Burnstock G., Schoepfer R. A P2X purinoceptor cDNA conferring a novel pharmacological profile. // FEBS lett. - 1995. - vol. 375. - pp. 129133.

46. Boarder M.R., Hourani S.M. The regulation of vascular function by P2 receptors: multiple sites and multiple receptors. // TiPS. - 1998. - vol. 19. - pp. 99-107.

47. Bolego C., Ceruti S., Brambilla R., Puglisi L., Cattanebi F., Burnstock G., Abbracchio M.P. Characterization of the signalling pathways involved in adenosine-tri-phosphate and basic fibroblast growth factor-induced astrogliosis. // Br. J. Pharmacol. - 1997. -vol. 121. -N8. - pp. 1692-1696.

48. Bouma M.G., Jeunhomme T.M., Boyle D.L., Dentener M.A., Voitenok N.N., van den Wildenberg F. A., Burman W.A. Adenosine inhibits neutrophil degranulation in activated human whole blood: involvement of adenosine A2 and A3 receptors. // J. Immunol. - 1997. - vol. 158. - -pp. 5400-5408.

49. Boyer J.L., Downes C.P., Harden T.K. Kinetics of activation of phospholipase C by P2 purinergic receptor agonists and guanidine nucleotides. // I. Bioi. Chem. - 1989. - vol. 264. - pp. 884-890.

50. Boyer J.L., Lazarowski E.R., Chen X-H, Harden T.K. Identification of P2Y-purinergic receptor that inhibits adenylyl cyclase but does not activate phospholipase C. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1993. - vol. 267,-pp. 1140-1146.

51. Brake A.J., Wagenbach M.J., Julius D. New structural motif for ligand-gated ion channels defined by an ionotropic ATP receptor. // Nature. - 1994. - vol. 371. - pp. 519-523.

52. Bridges A.J., Bruns R.F., Ortwine D.F., Priebe S.R., Szotek D.L., Trivedi B.K. N6 [2-(3,5-dimethoxyphenyl)-2-(methylphenyl)ethyl]adenosine and its uronamide derivatives. Novel adenosine agonists with both high affinity and high selectivity for the adenosine A2 receptor. // J. Med. Chem. - 1988. - vol. 31. - pp. 1282-1285.

53. Brown S.J., James S., Reddington M., Richardson P.J. Both Ai and A2a purine receptors regulate striatal acetylcholine release. // J. Neurochem. - 1990,- vol. 55. - pp. 31-38.

54. Bruner G„ Murphy S. UTP activates multiple second messenger systems in cultured rat astrocytes. //Neurosci. Lett. - 1993. - vol. 162. - pp. 105-108.

55. Burger R.M., Lowenstein J.M. Preparation and properties of 5'-nucleotidase from smooth muscle of small intestine. // J. Biol. Chem. - 1970. - vol. 245. - pp. 6274-6280.

56. Burke S.P., Nadler J.V. Regulation of glutamate and aspartate release from slices of the hippocampal CA1 area: effects of adenosine and baclofen. // J. Neurochem. - 1988. -vol. 51. - pp. 1541-1551.

57. Burnstock G. Purinergic nerves. // Pharmacol. Rev. - 1972. - vol. 24. - pp. 509-581.

58. Bumstock G., Kennedy C. Is there is a basis for distinguishing two types of P2 -purinoceptors? // Gen. Pharmacol. - 1985. - N16. - pp. 433-440.

59. Burnstock G., King B.F. The numbering of cloned P2 purinoceptors. // Drug Dev. Res. - 1996. - vol. 38. - pp. 67-71.

60. Burnstock G. Purinoceptors: Ontogeny and phylogeny. // Drug Dev. Res. - 1996a. -vol. 39. - pp. 204-242.

61. Carlson B.J., Raftery M.A. Specific binding of ATP to extracellular sites on Torpedo acetylcholine receptor. // Biochemistry. - 1993. - vol. 32. - pp. 7329-7333.

62. Chang K., Hanaoka K., Kumada M., Takuwa Y. Molecular cloning and functional analysis of a novel P2 nucleotide receptor. // J. Biol. Chem. - 1995. - vol. 270. - pp. 26152-26158.

63. Charest R., Blackmore P.F., Exton J.H. Characterization of responses of isolated rat hepatocytes to ATP and ADP. // J. Biol. Chem. - 1985. - vol. 260. - pp. 15789-15794.

64. Chen C-C., Akoplan A.N., Sivilotti L., Colquhoun D., Burnstock G., Wood J.N. A P2X purinoceptor expressed by a subset of sensory neurons. // Nature. - 1995. - vol. 377. - pp. 428-431.

65. Chen W., Hogan M.V., Wieraszko A., Pawlowska Z., Soifer D., Ehlich Y.H. NMDA-regulated ectoprotein kinase in hippocampal neurons: role in LTP. // Soc. Neurosci. Abstr. - 1994. - vol. 20. - p. 263.

66. Chrishtofi F.L., Baidan L.V., Fertel R.H., Wood J.D. Adenosine A2 receptor-mediated excitation of a subset of AH/type 2 neurons and deviation of cAMP levels in myentric ganglia of guinea-pig ileum. // Neurogastroenterof. - 1994. -N6. -pp. 67-78.

67. Collo G., North A.N., Kawashima E., Merlo-Pich E., Neidhart C., Surprenant A., Buell G. Cloning of P2X5 and P2X6 receptors and the distribution and properties of an extended family of ATP-gated ion channels. // J. Neurosci. - 1996. - N16. - pp. 24952507.

68. Communi D., Pirotton S., Parmentier M., Boeynaems J-M. Cloning and functional expression of a human uridine nucleotide receptor. //1. Biol. Chem. - 1996. - vol. 270. - pp. 30849-30852.

69. Communi D., Govaerts C., Parmentier M., Boeynaems J-M. // J. Biol. Chem. - 1998 (in press).

70. Correia-de-Sa P., Sebastiao A.M., Ribeiro J.A. Inhibitory and excitatory effects of adenosine receptor agonists on evoked transmitter release from phrenic nerve endings of the rat. //Br. J. Pharmacol. - 1991. - vol. 103. - pp. 1614-1620.

71. Correia-de-Sa P., Timoteo M.A., Ribeiro J.A. Functional consequences of inhibition of adenosine uptake and metabolism at the rat neuromuscular junction. // J. Neurochem. - 1993. - vol. 61. - S82B.

72. Correia-de-Sa P., Ribeiro J.A. Tonic A2a receptor activation modulates nicotinic autoreceptor function at the rat neuromuscular junction. // Eur. J. Pharmacol. - 1994. -vol. 271. - pp. 349-355.

73. Cunha R.A., Sebastiao A.M. Adenosine and adenine nucleotides are independently released from both the nerve terminals and the muscle fibres upon electrical stimulation of the innervated skeletal muscle of the frog. // Pflugers Arch. - 1993. -vol. 424. - pp. 503-510.

74. Cunha R.A., Johansson B., van der Ploeg I., Sebastiao A.M., Ribeiro J.A., Fredholm B.B. Evidence for functionally important adenosine A2a receptors in the rat hippocampus. // Brain. Res. - 1994. - vol. 649. - pp. 208-216.

75. Cunha R.A., Milusheva E., Vizi E., Ribeiro J.A., Sebastiao A.M. Excitatory and inhibitory effects of Ai and A2 adenosine receptor activation on the electrically evoked [3H]acetylcholine release from different areas of the rat hippocampus. // J. Neurochem. - 1994a. - vol. 63. - pp. 207-214.

76. Cunha R.A., Constantino M.D., Sebastiao A.M., Ribeiro J.A. Modification of Ai and A2a adenosine receptor binding in aged striatum, hippocampus and cortex of the rat. // NeuroReport. - 1995b. - vol. 6. - Nil. - pp. 1583-1588.

77. Daly J.W., Butts-Lamb P., Padgett W. Subclones of adenosine receptors in the central nervous system: interaction with caffeine and related methylxanthines. // Cell. Mol. Neurobiol. - 1983. - vol. 1. - pp. 69-80.

78. Dilorio P., Ballerini P., Cicarelli R., DiMuzio M., Traversa U., Caciagli F. Ai and A2 receptors involvement in controlling purine and acetylcholine release from rat hippocampal slices. //Nucleos. Nucleot. - 1991. -N10. - 1237-1238.

79. Dolphin A.C., Forda S.R., Scott R.H. Calcium dependent currents in cultured rat dorsal root ganglion neurons are inhibited by an adenosine analog. // J. Physiol. (Lond.). -1986.-vol. 373.-pp. 47-61.

80. Dubyak G.R., El-Moatassim C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. // Am. J. Physiol. - 1993. - vol. 265. - pp. 577606.

81. Dunwiddie T.V. The physiological role of adenosine in the central nervous system. // Int. Rev. Neurobiol. - 1985. - vol. 27. - pp. 63-139.

82. Dunwiddie T.V. Electrophysiological aspects of adenosine receptor function. // Adenosine and adenosine receptors / Ed. Williams M. - Clifton (NJ): Humana Press. -1990. - pp. 143-172.

83. Dunwiddie T.V., Fredholm. Adenosine neuromodulation. // Purinergic approaches in experimental therapeutics / Ed. Jacobson K.A., Jarvis M.F. - London: Willey-Liss. Inc. - 1997. - pp. 359-381.

84. Edwards F.A., Gibb A.J., Colquhoun D. ATP receptor-mediated synaptic currents in the central nervous system. //Nature. - 1992. - vol. 359. - pp. 144-147.

85. Enomoto K., Furuya K., Yamagishi S., Oka T., Maeno T. The increase in the intracellular Ca2+ concentration induced by mechanical stimulation is propagated via release of pyrophosphorylated nucleotides in mammary epithelial cells. // Pflugers. Arch. - 1994. - vol. 427. - pp. 533-542.

86. Evans R.J., Derkach V., Surprenant A. ATP mediates fast synaptic transmission in mammalian neurons. // Nature. - 1992. - vol. 357. - pp. 503-505.

87. Feltz A., Trautmann A. Interaction between nerve-released acetylcholine and bath-applied agonists at the frog end-plate. // J.Physiol.(Lond.). - 1980. - vol. 299. - pp. 533-552.

88. Feoktistov I., Murrey J. J., Biaggioni I. Positive modulation of intracellular Ca2+ levels by adenosine A2b receptors, prostacyclin, and prostaglandin El via a cholera toxin-

sensitive mechanism in human erythroleukemia cells. // Mol. Pharmacol. - 1994. -vol. 45. - pp. 1160-1167.

89. Feoktistov I., Biaggioni I. Adenosine A2b receptors evoke interleukin-8 secretion in human mast cells. An enprofylline-sensitive mechanism with implications for asthma. //J. Clin. Invest. - 1995. - vol. 96. - pp. 1979-1986.

90. Feoktistov I., Polosa R., Holgate S.T., Biaggioni I. Adenosine A2b receptors: a novel therapeutics target in asthma? // TiPS. - 1998. - vol. 19. - pp. 148-153.

91. Filtz T.M., Li Q., Boyer J.L., Nicholas R.A., Harden T.K. Expression of a cloned P2y purinergic receptor that couples to phospholipase C. // Mol. Pharmacol. - 1994. - vol. 46. - pp. 8-14.

92. Filtz T.M., Harden K., Nicholas R.A. Structure, pharmacological selectivity and second messenger signalling properties of G protein-coupled P2-purinergic receptors. // Purinergic approaches in experimental therapeutics / Ed. Jacobson K.A. and Jarvis M.F. - London: Wiley-Liss. Inc. - 1997. - pp. 39-53.

93. Fink C.A., Spada A.P., Colussi B„ Rivera L., Merkel L. Synthesis of a potent A1 selective adenosine agonist: N6-(l-R(3-chloro-2-thienyl)methyl)propyl)adenosine // Nucleosides Nucleotides. - 1992. - vol. 11. - pp. 1077-1088.

94. Fredholm B.B., Hedqvist P. Adenosine - a transsynaptic modulator of norephynephrine release ? // Catecholamines: basic and clinical frontiers / Ed. Usdin E., Kopin I.J., Barchas J.D. - New York: Pergamon Press. - 1979. - pp. 1146-1148.

95. Fredholm B.B., Abbracchio M.P., Burnstock G., Dubyak T., Harden K., Jacobson K.A., Schwabe U., Williams M. Towards a revised nomenclature for PI and P2 receptors. // TiPS. - 1997. - vol. 18. - pp. 79-82.

96. Freissmuth M., Schultz W., Linder M.E. Interactions of the bovine brain Ai-adenosine receptor with recombinant G-protein alfa-subunits. // J. Biol. Chem. - 1991. - vol. 266. -pp. 17778-17783.

97. Fu W-M. Potentiation by ATP of the postsynaptic acetylcholine response at the developing neuromuscular synapses in Xenopus cell culture. // J. Physiol. (Lond.). -1994. - vol. 477. - N3. - pp. 449-457.

98 Fu W-M. Regulatory role of ATP at developing neuromuscular junctions. // Prog. Neurobiol. - 1995. - vol. 47. -Nl. - pp. 31-44.

99. Fuder H., Brink A., Meincke M., Tauber U. Purinoceptor-mediated modulation by endogenous and exogenous agonists of stimulation evoked [3H]noradrenaline release on rat iris. //Naun. Schm. Arch. Pharmacol. - 1992. - vol. 345. - pp. 417-423.

100. Gerber U., Greene R.W., Hass H.L., Stevens D.R. Characterization of inhibition mediated by adenosine in the hippocampus of the rat in vitro. // J. Physiol. (Lond). -1989. - vol. 417. - pp. 567-578.

101. Giniatullin R.A., Khamitov Kh.S., Khazipov R„ Magazanik L.G., Nikolsky E E., Snetkov V.A., Vyskocil F. Development of desensitization during repetitive end-plate activity and single end-plate currents in frog muscle. // J.Physiol.(Lond). - 1989. -vol. 412.-pp. 113-122.

102. Giniatullin R.A., Khazipov R.N., Vyskocil F. Critical quantum content for shortening of endplate currents in the frog skeletal muscle. // Physiol.Res. - 1992. -vol.41. - N6. - pp. 254-256.

103. Giniatullin R.A., Khazipov R.N., Oranska T.I., Nikolsky E.E., Voronin V.A., Vyskocil F. The effect of nonquantal acetylcholine release on quantal miniature currents at mouse diaphragm. // J.Physiol.(Lond). - 1993. -vol. 466. - pp. 105-114.

104. Giniatullin R.A., Khazipov R.N., Vyskocil F. A correlation between quantal content and decay time of endplate currents in frog muscles with intact cholinesterase. // J. Physiol. (Lond). - 1993a. - vol. 466. - pp. 95-103.

105. Giniatullin R.A, Khiroug L.S., Talantova M.V., Nistri A. Fading and rebound of currents induced by ATP at PC12 cells.// Br. J. Pharmacol. - 1996. - vol. 119. - pp.

1045-1053.

106. Giniatullin R., Khiroug L., Sokolova E., Talantova M., Nistri A. Intracellular calcium keeps neuronal acetylcholine receptors in a desensitized state. // Abstr. Conference Internationale: La tramsmission synaptique et sa modulation. -Paris. -1997.-p. 31.

107. Giniatullin R.A., Talantova M.V., Vyskocil F. Desensitization shortens the high-quantal-content endplate current time course in frog muscle with intact cholinesterase. // J. Physiol. (Lond). - 1997. - vol. 502. - N3. - pp. 641-648.

108. Giniatullin R.A., Sokolova E.M. ATP and adenosine inhibit transmitter release at the frog neuromuscular junction through distinct presynaptic receptors. // Br. J. Pharmacol. - 1998. - vol. 124. - pp. 839-844.

109. Ginsborg B.L., Hirst G.D.S. The effects of adenosine on the release of transmitter from the phrenic nerve of the rat. // J. Physiol. (Lond). - 1972. - vol. 224. - pp. 611628.

110. Goetz U., DaPrada M., Pletsher A. Adenine-, guanine- and uridine-5'-triphosphonucleotides in blood platelets and storage organells of various species. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1971. - vol. 178. - pp. 210-215.

111. Goncalvez J., Queiroz G. Facilitatory and inhibitory modulation by endogenous adenosine of noradrenaline release in the epindymal portion of rat vas deferens. // Naun. Schm. Arch. Pharmacol. - 1993. - vol. 348. - pp. 367-371.

112. Greene R.W., Haas H.L. The elecrtophysiology of adenosine in the mammalian central nervous system. //Prog. Neurobiol. - 1991. - vol. 36. - pp. 329-341.

113. Gross R.A., MacDonald R.L., Ryan-Jastrow T. 2-chloroadenosine reduces the N calcium current of cultured mouse sensory neurons in a pertussis toxin-sensitive manner. //J. Physiol. (Lond.). - 1989. - vol. 411. - pp. 585-595.

114. Hamilton, B.R., Smith, D.O. Autoreceptor-mediated purinergic and cholinergic inhibition of motor nerve terminal calcium currents in the rat. // J. Physiol. (Lond.) -

1991. - vol. 432. - pp. 327-341.

115. Hamilton S.L., Codina J., Hawkes M.J., Yatani A., Sawada T., Strickland F.M., Froehner S.C., Spiegel A.M., Toro L., Stefani E., Birnbaumer L., Brown A.M. Evidence for direct interaction of Gsa with Ca2+ channel of skeletal muscle. // J. Biol. Chem. - 1991. - vol. 266. - pp. 19528-19535.

116. Harms L., Finta E.P., Tshopl M., Illes P. Depolarization of rat locus coeruleus neurons by adenosine 5'-triphosphate. //J. Neurosci. - 1992. - vol. 48. - pp. 941-952.

117. Hartzell H.C., Kuffler S.W., Yoshikami D. Post-synaptic potentiation: interaction between quanta of acetylcholine at the skeletal neuromuscular synapse. // J. Physiol. (Lond). - 1975. - vol. 251. - pp. 427-463.

118. Hume R.I., Honig M.G. Excitatory action of ATP on embryonic chick muscle. // J. Neurosci. - 1986. -N6. - pp. 681-690.

119. Hunt J.M., Wilfehrt H.M., Silinsky E.M. Adenosine inhibits the calcium-dependent acetylcholine secretion induced by ionomycin. // Soc. Neurosci. Abstr. -

1992.-vol. 18.-p. 636.

120. Hunt J.M., Silinsky E.M. lonomycin induced acetylcholine release and its inhibition by adenosine at frog motor nerve endings. // Br. J. Pharmacol. - 1993. - vol. 110. -N2. - pp. 828-832.

121. Huwiler A., Pfeilschifter J. Stimulation by extracellular ATP and UTP of the mitogen-activated protein kinase cascade and proliferation of rat renal mesangial cells. //Br. J. Pharmacol. - 1994. - vol. 1143. - pp. 1455-1467.

122. Igusa Y. Adenosine 5'- triphosphate activates acetylcholine receptor channels in cultured Xenopus myotomal muscle cells. // J. Physiol. (Lond). - 1988. - vol. 405. -pp. 169-185.

123. Hies P., Norenberg W. Neuronal ATP receptors and their mechanisms of action. // TiPS. - 1993. - vol. 14. - pp. 50-54.

124. Israel M., Lesbats, Meunier F.M., Stinnakre J. Postsynaptic release of adenosine triphosphate induced by single impulse transmitter action. // Proc. R. Soc. B. - 1976. -vol. 193. - pp. 461-468.

125. Jacobson K.A., Kim H.O., Siddiqi S.M., Olah M.E., Stiles G., von Libitz D.K.J.E. A3 adenosine receptors: Design of selective ligands and therapeutics prospects. // Drugs of the Future. -1995. - vol. 20. - pp. 689-699.

126. Jacobson K.A. Adenosine A3 receptors: novel ligands and paradoxical effects. // TiPS. - 1998. - vol. 19. - pp. 184-191.

127. Jarvis M.F., Williams M. Direct autoradiographic localization of A2 adenosine receptors in the rat brain using the A2-selective agonist, [3H]CGS 21680. // Eur. J. Pharmacol. - 1989. - vol. 168. - pp. 243-246.

128. Khakh B.S., Humphrey P.P.A., Surprenant A. Electrophysiological properties of P2x-purinoreceptors in rat superior cervical, nodose and guinea-pig coeliac neurones. // J. Physiol. (Lond). - 1995. - vol. 484. - pp. 385-395.

129. Khiroug L.S., Giniatullin R.A., Talantova M.V., Nistri A. Role of intracellular calcium in fast and slow desensitization of P2-receptors in PC 12 cells. // Br. J. Pharmacol. - 1997. - vol. 120. - pp. 1552-1560.

130. Khiroug L., Giniatullin R., Sokolova E., Talantova M., Nistri A. Imaging of intracellular calcium during desensitization of nicotinic acetylcholine receptors of rat chromaffin cells. //Br. J. Pharmacol. - 1997a. - vol. 122. - pp. 1223-1232.

131. Khiroug L., Sokolova E., Giniatullin R., Afzalov R , Nistri A. Recovery from desensitization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors of rat chromaffin cells is modulated by intracellular calcium through distinct second messengers. // J. Neurosci. - 1998. - vol. 18. - N7. - pp. 2458-2466.

132. Kidd E.J., Grahames C.B.A., Simon J., Michel A.D., Barnard E.A., Humphrey P.P.A. Localization of P2x purinoceptor transcripts in the rat nervous system. // Mol. Pharmacol. - 1995. - vol. 48. - pp. 569-573.

133. King B.F., Ziganshina L.E., Pintor J., Burnstock G. Full sensitivity of P2X2 purinoceptor to ATP revealed by changing extracellular pH. // Br. J. Pharmacol. -1996. - vol. 117. - pp. 1371-1373.

134. Kohno Y.Ji.X., Mawhorter S.D., Koshiba M., Jacobson K.A. Activation of A3 adenosine receptors on human eosinophils elevates intracellular calcium. // Blood. -1996. - vol. 88. - pp. 3569-3574.

135. Kreutzberg G.W., Heymann D., Reddington M. 5'-nucleotidase in the nervous system. // Cellular Biology of Ectoenzymes / Ed. Kreutzberg G.W. - Berlin: SpringerVerlag Berlin Heidelberg. - 1986. - pp. 148-164.

136. Krishtal O.A., Osipchuk Y.V., Shelest T.N., Smirnoff S.V. Rapid extracellular pH transients related to synaptic transmission in rat hippocampal slices. // Brain. Res. -1987. - vol. 436. - pp. 352-356.

137. Kurz A.K., Bultmann R., Driessen B., von Kugelgen I., Starke K. Release of ATP in rat vas deferens: Origin and role of calcium. // Naun. Schm. Arch Pharmacol. -

1994. - vol. 350. - pp. 491-498.

138. Lazarowski E.R., Harden T.K. Identification of uridine nucleotide-selective G-protein-linked receptor that activates phospholipase C. // J. Biol. Chem. - 1994. - vol. 269. - pp. 11830-11836.

139. Lazarowski E.R., Watt W.C., Stutts M.J., Boucher R.C., Harden T.K. Pharmacological selectivity of the cloned human P2U-purinoceptor: potent activation by diadenosine tetraphosphate. // Br. J. Pharmacol. - 1995. - vol. 116. - pp. 1619-1627.

140. Lee K.S., Reddington M. Autoradiographic evidence for multiple CNS binding sites for adenosine derivatives. // J. Neurosci. - 1986. - vol. 19. -pp. 535-549.

141. Lewis C., Neldhart S., Holy C., North R.A., Buell G., Surprenant A. Coexpression of P2X2 and P2X3 receptor subunits can account for ATP-gated currents in sensory neurons. //Nature. - 1995. - vol. 377. - pp. 432-435.

142. Linden J. Cloned adenosine A3 receptors: pharmacological properties, species differences and receptor functions. //TiPS. - 1994. - vol. 15. - pp. 298-306.

143. Liou J.C., Fu W.M. Additive effect of ADP and CGRP in modulation of acetylcholine receptor channel in Xenopus embryonic myocytes. // Br. J. Pharmacol. -

1995. - vol. 115. - N4. - pp. 563-568.

144. Liu G-S, Downey J.M., Cohen M.V. Adenosine, ischemia and preconditioning. // Cardiovasc. - 1994. - vol. 28. - pp. 1057-1061.

145. Lu B., Fu W.M. Regulation of postsynaptic responses by calcitonin gene related peptide and ATP at developing neuromuscular junction. // Can. J. Physiol. Pharmacol. - 1995. - vol. 73. -N7. -pp. 1050-1056.

146. Lu Z., Smith D.O. Adenosine 5'- triphosphate increases acetylcholine channel opening frequency in rat skeletal muscle. // J. Physiol. (Lond). -1991. - vol. 436. - pp. 45-56.

147. Lustig K.D., Shiau A.K., Brake A.K., Julius D. Expression cloning of an ATP receptor from mouse neuroblastoma cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. - vol. 90. - pp. 5113-5117.

148. Magazanik L.G., Nikolsky E.E., Giniatullin R.A. End-plate currents evoked by paired stimuli in frog muscle. //Pflug. Arch. - 1984. - vol. 401. -Nl. - 185-192.

149. Magazanik L.G., Snetkov V.A., Giniatullin R.A., Khazipov R.N, Changes in the time course of miniature end plate currents induced by bath applied acetylcholine. // Neurosci. Lett. - 1990. - vol. 113. -N3. - pp. 281-285.

150. Mallart A. Presynaptic currents in frog motor ending. // Pflug. Arch. - 1984. - vol. 400. - pp. 8-13.

151. Mcintosh H.H., Blazynski C. Characterization and localization of adenosine A2 receptors in bovine rod outer segments. // J. Neurochem. - 1994. - vol. 62. -pp. 992997.

152. Meriney S.D., Grinnell A.D. Endogenous adenosine modulates stimulation induced depression at the frog neuromuscular junction. // J. Physiol. (Lond). - 1991. - vol. 443. -pp. 441-455.

153. Mogul D.J., Adams M.E., Fox A.P. Differential activation of adenosine receptors decreases N-type but potentiates P-type Ca2+ current in hippocampal CA3 neurons. // Neuron. - 1993. -vol. 10. - pp. 327-334.

154. Mozrzymas J.W., Ruzzier F. ATP activates junctional and extrajunctional acetylcholine receptor channels in isolated adult rat muscle fibres. // Neurosci. Lett. -1992.-vol. 139.-pp. 217-220.

155. Mynlieff M., Beam K.G. Adenosine acting at an AI receptor decreases N-type calcium current in mouse motoneurons. // J. Neurosci. - 1994. - vol. 14. - N6. - pp. 3628-3634.

156. Neary J.T., Rathbone M.P., Cattanebi F., Abbracchio M.P., Burnstock G. Trophic actions of extracellular nucleotides and nucleosides on glial and neuronal cells. // TINS. - 1996. - vol. 19. - pp. 13-18.

157. Nguyen T., Erb L., Weismann G.A., Marchese A., Heng H.H.Q., Garrad R.C., George S.R., Turner J.T., O'Dowd B.F. Cloning, expression and chromosomal localization of the human uridine nucleotide receptor gene. // J. Biol. Chem. - 1995. -vol. 270. - pp. 30845-30848.

158. Nonaka H., Mori A., Ichimura M., Shinodu T., Yanagawa K., Shimada J., Kase h. Binding of [3H]KF 17837S, a selective adenosine A2 antagonist, to rat brain membranes. // Mol. Pharmacol. - 1994. - vol. 46. -pp. 817-822.

159. Offermanns S., Schultz G. Complex information processing by the transmembrane signalling system involving G proteins. // Naun. Schm. Arch. Pharmacol. - 1994. - vol. 350. - pp. 329-338.

160. Olah M.E., Stiles G.L. Adenosine receptor subtypes: Characterization and therapeutic regulation. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 1995. - vol. 35. - pp. 581606.

161. Palmer T.M., Stiles G.L. Review: Neurotransmitter receptors, VII. Adenosine receptors. //Neuropharmacol. - 1995. - vol. 34. - pp. 683-694.

162. Palmer T.M., Gettys T.W., Stiles G.L. Differential interaction with and regulation of multiple G-proteins by the rat A3 adenosine receptor. // I. Biol. Chem. - 1995a. -vol. 270. - pp. 16895-16902.

163. Parr C.E., Sullivan D M., Paradiso A.M., Lazarowski E.R., Burch L.H., Olsen J.C., Erb L., Weisman G. A., Boucher R.C., Turner J.T. Cloning and expression of a human P2U nucleotide receptor, a target for cyclic fibrosis pharmacotherapy. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. - vol. 91. - pp. 3275-3279.

164. Peakman M.C., Hill S.J. Adenosine A2b receptor-mediated cyclic AMP accumulation in primary rat astrocytes. // Br. J. Pharmacol. - 1994. - vol. 111. - pp. 191-198.

165. Rahamimoff R. A model for neuromuscular facilitation. // Soc. Adv. Sci. Israel. -1969. - vol. 8. - pp. 113166. Redman R.S., Silinsky E.M. ATP released together with acetylcholine as the

mediator of neuromuscular depression at the frog motor nerve endings. // J. Physiol. (Lond). - 1994. - vol. 477. - pp. 117-127.

167. Redman R.S., Searl T.J., Hirsh J.K., Silinsky E.M. Opposing effects of phorbol esters on transmitter release and calcium currents at frog motor nerve endings. // J. Physiol. (Lond.) - 1997. - vol. 501. - N1. - pp. 41-48.

168. Regenold J.T., Illes P. Inhibitory adenosine Ai -receptors on rat locus coeruleus neurons. An intracellular electrophysiological study. // Naun. Schm. Arch. Pharmacol. - 1990.-vol. 341.-pp. 225-231.

169. Ribeiro J. A., Walker J. Action of adenosine triphosphate on endplate potentials recorded from muscle fibres of the rat-diaphragm and frog sartorius. // Br. J. Pharmacol. - 1973. - vol. 49. - pp. 724-725.

170. Ribeiro J.A., Walker J. The effects of adenosine triphosphate and adenosine diphosphate on transmission at the rat and frog neuromuscular junctions. // Br. J. Pharmacol. - 1975. - vol. 54. - pp. 213-218.

171. Ribeiro J.A., Sebastiao A.M. On the role, inactivation and origin of endogenous adenosine at the frog neuromuscular junction. //J. Physiol. (Lond). - 1987. - vol. 384. -pp. 571-585.

172. Ribeiro A.J., Cunha R.A., Correia-de-Sa P., Sebastiao A.M. Purinergic regulation of acetylcholine release. // Prog. Brain Res. - 1996. - vol. 109. - pp. 231-241.

173. Rice W.R., Burton F.M., Fiedeldey D.T. Cloning and expression of the alveolar type II cell P2U-purinergic receptor. // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. - 1995. - N12. -pp. 27-32.

174. Richards S.M., Dora K.A., Rattigan S., Colquhoun E.Q., Clark M.G. Role of ■ extracellular UTP in the release of uracil from vasoconstricted hindlimb. // Am. J.

Physiol. - 1993. - vol. 264. - H233-H237.

175. Robitaille R. Purinergic receptors and their activation by endogenous purines at perisynaptic glial cells of the frog neuromuscular junction. // J. Neurosci. - 1995. - vol. 15. -pp. 7121-7131.

176. Sajjadi F.G., Takabayshi K., Foster A.C., Domingo R.C., Firestein G.S. Inhibition of TNF-a expression by adenosine. // J. Immunol. - 1996. - vol. 156. - pp. 3435-3442.

177. Salt T.E., Hill R.G. Excitation of single sensory neurons in the rat caudal trigeminal nucleus by iontophoretically applied adenosine 5'-triphosphate. //Neurosci. Lett. - 1983. - vol. 35. - pp. 53-57.

178. Scefner S.A., Chiu T.H. Adenosine inhibits locus coeruleus neurons: an intracellular study in a rat brain slice preparation. // Brain. Res. - 1986. - vol. 366. - pp. 364-368.

179. Scholz K.P., Miller R.J. Analysis of adenosine action on Ca2+ currents and synaptic transmission in cultured rat hippocampa! pyramidal neurons. // J. Physiol. (Lond.). -1991. - vol. 435. - pp. 373-393.

180. Scholz K.P., Miller R.J. Inhibition of quantal transmitter release in the absence of calcium influx by a G protein-linked adenosine receptor at hippocampal synapses. // Neuron. - 1992. - vol. 8. - pp. 1139-1150.

181. Schultz-Luhoff E., Zanner S„ Ogvilvie A., Sterzel R.B. // Am. J. Physiol. - 1992. -vol. 263. -F374-F383.

182. Schweitzer E. Coordinated release of ATP and ACh from cholinergic synaptosomes and its inhibition by calmodulin antagonists. // J. Neurosci. - 1987. - vol. 7. - pp. 2948-2956.

183. Sebastiao A.M., Stone T.W., Ribeiro J.A. The inhibitory adenosine receptor at the neuromuscular junction and hippocampus of the rat: antagonism by 1,3,8-substituted xanthines. // Br. J. Pharmacol. - 1990. - vol. 101. - pp. 453-459.

184. Sebastiao AM., Ribeiro J.A. Evidence for presence of excitatory A2 receptors adenosine receptors in the rat hippocampus. // Neurosci. Lett. - 1992. - vol. 138. - pp. 41-44.

185. Sebastiao A.M., Cunha R.A., Correia-de-Sa P., de Medonca A., Ribeiro J.A. Role of A2a receptors in the hippocampus and motor nerve endings. // Adenosine and adenine nucleotides: from molecular biology to integrative physiology / Ed. Bellardinelli L., Pelleg A. - Boston: Kluwer Academic Publishers. - 1995. -pp. 251261.

186. Sebastiao A.M., Ribeiro J.A. Adenosine A2 receptor-mediated excitatory actions on the nervous system. // Prog. Neurobiol. - 1996. - vol. 48. - pp. 167-189.

187. Shakirianova D.S., Zefirov A.L., Nikolsky E.E., Vyskocil F. The effect of acetylcholine and related drugs on currents at frog motor nerve terminal. // Eur. J. Pharmacol. - 1994. - vol. 263. - pp. 107-114.

188. Shapiro M.S., Wollmuth L.P., Hille B. Modulation of Ca2+ channels by PTX-sensitive G-proteins is blocked by N-ethylmaleimide in rat sympathetic neurons. // J. Neurosci. - 1994. - vol. 14. - pp. 7109-7116.

189. Shen K-Z., North R.A. Excitation of rat locus coeruleus neurons by adenosine 5'-triphosphate: ionic mechanism and receptor characterization. // J. Neurosci. - 1993. -vol. 13. - pp. 894-899.

190. Silinsky E.M. On the association between transmitter secretion and release of adenine nucleotides from mammalian motor nerve terminals. // J. Physiol. (Lond). -1975. - vol. 247. - pp. 145-162.

191. Silinsky E.M. On the calcium receptor that mediates depolarization-secretion coupling at cholinergic motor nerve terminals. // Br. J. Pharmacol. - 1981. - vol. 73. -pp. 413-429.

192. Silinsky E.M. On the mechanism by which adenosine receptor activation inhibits the release of acetylcholine from motor nerve endings. // J. Physiol. (Lond.). - 1984. -vol. 346. - pp. 243-256.

193. Silinsky E.M., Hunt J.M., Solsona C.S., Hirsh J.K. Prejunctional adenosine and ATP receptors. // Ann. NY Acad. Sci. - 1990. - vol. 603. - pp. 324-333.

194. Silinsky E.M., Solsona C.S. Calcium currents at motor nerve endings: absence of effects of adenosine receptor agonists in the frog. // J. Physiol. (Lond.). - 1992. - vol. 457.-pp. 315-328.

195. Silinsky E.M., Gerzanich V., Vanner S.M. ATP mediates excitatory synaptic transmission in mammalian neurons. //Br. J. Pharmacol. - 1992a. - vol. 106. - pp. 762763.

196. Silinsky E.M., Redman R.S. Synchronous release of ATP and neurotransmitter within milliseconds of a motor nerve impulse in the frog. // J. Physiol. (Lond). - 1996. -vol. 492. -N3. - pp. 815-822.

197. Smith D.O. Sources of adenosine released during neuromuscular transmission in the rat. // J. Physiol. (Lond). -1991. - vol. 432. - pp. 343-354.

198. Smith D.O., Lu Z. Adenosine derives from hydrolysis of presynaptically released ATP inhibits neuromuscular transmission. //Neurosci. Lett. - 1991a. - vol. 122. - pp. 171-173.

199. Spignoli G., Pedata F., Pepeu G. Ai and A2 adenosine receptors modulate acetylcholine release from brain slices. // Eur. J. Pharmacol. - 1984. - vol. 97. - pp. 341-342.

200. Stambaugh K., Jacobson K.A., Jiang J-L., Jiang B.T. A novel cardioprotective function of adenosine A1 and A3 receptors during prolonged simulated ischemia. // Am. J. Physiol. - 1997. - vol. 273. - H501-H505.

201. Stiles G.L. Adenosine receptor subtypes: New insights from cloning and functional studies. // Purinergic approaches in experimental therapeutics / Ed. Jacobson K.A., Jarvis M.F. - London: Wiley-Liss. Inc. - 1997. - pp. 29-37.

202. Stone T.W. Adenosine in the nervous system. - San Diego: Academic Press, 1991.

203. Stone T.W. Purines and receptors. // TINS. - 1998. - vol. 21. - N2. - pp. 51-52.

204. Stoop R., Surprenant A., North R.A. Different sensitivities to pH of ATP-induced currents at four cloned P2X receptors. // J. Neurophysiol. - 1997. - vol. 78. - pp. 18371840.

205. Sun X.P., Stanley E.F. An ATP-activated, ligand-gated ion channel on a cholinergic presynaptic nerve terminal. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1996. - vol. 93 - pp. 18591863.

206. Surprenant A., Buell G., North A.R. P2X receptors bring new structure to ligand-gated ion channels. // TINS. - 1995. - vol. 18. - pp. 224-229.

207. Surprenant A; Rassendren F; Kawashima E; North RA; Buell G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). // Science. -1996. - vol. 272. - pp. 735-738.

208. Talantova M.V., Giniatullin R.A., Sokolova E.M., Khabibullina N.K. Desensitized cholinoreceptors prevented the repetitive activation of postsynaptic membrane by acetylcholine under lower activity of acetylcholinesterase. // Abstr. 9th International symposium on cholinergic mechanisms. - Mainz. - 1995. -p. 25.

209. Todorov l.D., Mihaylova-Todorova S., Westfall T.D., Sheddon P., Kennedy C., Bjur R.A., Westfall D.P. Neuronal release of soluble nucleotidases and their role in neurotransmitter inactivation. //Nature. - 1997. - vol. 387. - pp. 76-79.

210. van Calker D., Muller M., Hamprecht B. Adenosine regulates via two different types of receptors, the accumulation of cyclic AMP in cultured brain cells. // J. Neurochem. -1979. - vol. 33. - pp. 999-1005.

211. van Daele P., van Coevorden A., Roger P.P., Boeynaems J-M. // Circ. Res. - 1992. -vol. 70. - pp. 82-90.

212. von Libitz D.K.J.E., Lin R.C-S, Jacobson K.A. Adenosine and acute treatment of cerebral ischemia and stroke - put out more flags. // Soc. Neurosci. - 1997. - vol. 23. -p. 1924.

213. Wall P.D. Do nerve impulses penetrate terminal arborizations ? A pre-presynaptic

control mechanism. // TINS. - 1995. - vol. 18. - pp. 99-103.

214. Wan W„ Sutherland G.R., Geiger J.D. Binding of the A2 receptor ligand [3H]CGS 21680 to human and rat brain: evidence for multiple affinity sites. // J. Neurochem. -

1990. - vol. 55. - pp 1763-1771.

215. Wang D-J., Huang N-N., Heppel L.A. // J. Cell. Physiol. - 1993. - vol. 153. - pp. 221-223.

216. Weaver D.R. A2a adenosine receptor gene expression in developing rat brain. // Mol. Brain. - 1993. - vol. 20. - pp. 313-327.

217. Webb T.E., Simon J., Bateson A.N., Smart T.G., King B.J., Burnstock G , Barnard E.A. Cloning and functional expression of a cDNA encoding a brain G-protein-coupled ATP receptor. // FEBS lett. - 1993. - vol. 324. - pp. 219-225.

218. Webb T.E., Simon J., Bateson A.N., Barnard E.A. Transient expression of the recombinant chick brain P2yi purinoceptor and localization of the corresponding mRNA. // Cell. Mol. Biol. - 1994. - vol. 40. - pp. 437-442.

219. Webb T.E., Henderson D., King B.F., Wang S., Simon J., Bateson A.N., Burnstock G., Barnard E.A. A novel G-protein-coupled P2 purinoceptor (P2Y3) activated preferentially by nucleoside diphosphates. // Mol. Pharmacol. - 1996. - vol. 50. - pp. 258-265.

220. Wheeler D.B., Randall A., Tsien R.W. Roles of N-type and Q-type Ca2+ channels in supporting hippocampal synaptic transmission. // Science. - 1994. - vol. 264. - pp. 107111.

221. Williams M., Burnstock G. Purinergic neurotransmission and neuromodulation: a historical perspectives. // Purinergic approaches in experimental therapeutics / Ed. Jacobson K.A., Jarvis M.F. - London: Wiley-Liss, Inc. - 1997. - pp. 3-26.

j 222. Yakel J.L., Warren R.A., Reppert S.M., North R.A. // Mol. Pharmacol. - 1993. - vol.

I

43.-pp. 277-280.

223. Yamada M., Hamamori Y., Yokoyama M. P2-purinoceptor activation stimulates phosphoinositide hydrolysis and inhibits accumulation of c-AMP in cultured ventricular myocytes. // Circ. Res. - 1992. - vol. 70. - pp. 477-485.

224. Yao Y., Sei Y., Abbracchio M.P., Kim Y-C., Jacobson K.A. Adenosine A3 receptor agonists protect HL-60 and U-937 cells from apoptosis induced by A3 antagonists. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1997. - vol. 232. - pp. 317-322.

225. Ziganshin A.U., Hoyle C.H.V., Bumstock G. Ecto-enzymes and metabolism of extracellular ATP. // Drug Dev. Res. - 1994. - vol. 32. - pp. 134-146.

226. Ziganshin A.U., Hoyle C.H.V., Lambrecht G., Mutscheler E., Baumert H.G., Burnstock G. Selective antagonism by PPADS at P2X -purinoceptors in rabbit isolated blood vessels. //Br. J. Pharmacol. - 1994a. - vol. 111. - pp. 923-929.

227. Zhou Q-L., Olah M.E., Johnson R. A., Stiles G.L., Civelli O. Molecular cloning and characterization of an adenosine receptor: The A3 adenosine receptor. // Proc. Natl. Sci. USA. - 1992. - vol. 89. - pp. 7432-7436.

228. Zimmermann H. Signalling via ATP in the nervous system // TINS. - 1994. - vol. 17-N10. - pp. 420-426.

229. Zucker R.S. Short-term synaptic plasticity. // Ann. Rev. Neurosci. - 1989. - vol. 12. -pp. 13-31.