Пути усовершенствования питательных сред, используемых в технологии производства медицинских и ветеринарных пробиотиков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Конькова, Надежда Константиновна

• Конькова, Надежда Константиновна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Конькова, Надежда Константиновна

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Современный рынок пробиотиков для нормализации микробиоценозов человека и сельскохозяйственных животных

1.1.1. Роль микробиоценозов в физиологическом статусе живого организма

1.1.2. Пробиотики, применяемые в медицинской практике

1.1.3. Пробиотики для лечения сельскохозяйственных животных

1.2. Некоторые особенности технологии производства пробиотиков на основе лактобактерий

1.2.1. Характеристика основных производственных культур лактобактерий

1.2.2. Физиологические потребности лактобактерий в отношении среды культивирования

1.2.3. Роль лактобактерий в реализации лечебного эффекта пробиотических препаратов

1.3. Питательные среды как основа технологии производства эффективных лактосодержащих пробиотиков

2. Собственные исследования

2.1. Объекты, методы и объем исследований

2.1.1. Характеристики производственного штамма Ь.рЬтагиш 8Р-АЗ

2.1.2. Питательные среды для культивирования производственного штамма Ь.р1ап1агит 8Р-АЗ 52 2.1.2.1. Способы получения питательных основ

2.1.2.2. Методы приготовления питательных сред

2.1.3. Микробиологические методы

2.1.3.1. Биотехнология культивирования штамма Ь.р1агйагит 8Р-АЗ

2.1.3.2. Методика определения живых микробных клеток

2.1.4. Биохимические методы

2.1.4.1. Методика определения концентрации пептидов

2.1.4.2. Метод определения рН исследуемых растворов

2.1.4.3. Методика определения аминного азота

2.1.4.4. Метод выделения свободных аминокислот

2.1.4.5. Метод определения аминокислотного состава

2.1.4.6. Метод определения массовой доли влаги

2.1.4.7. Способ высушивания питательной основы 63 2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Сравнительная характеристика питательных сред, используемых в производстве пробиотиков, по биохимическим показателям

2.2.1.1. Сравнительная характеристика питательных основ

2.2.1.2. Сравнительная характеристика питательных

2.2.2. Влияние состава питательной среды на физиологию штамма Ь.ркгйагит 8Р-АЗ 76 2.2.2.1. Изучение влияния состава питательных сред на кинетику роста Ь.р1агЛагат 8Р-АЗ и динамику потребления энергетического субстрата

2.2.2.2. Изучение динамики потребления свободных аминокислот в процессе культивирования 82 2.2.3. Совершенствование биотехнологии получения препаратов на основе молочнокислых бактерий

2.2.3.1. Разработка состава питательной среды для глубинного культивирования лактобактерий

2.2.3.2. Биотехнология получения сухой формы гидролизата обезжиренного молока

2.2.4. Опыт применения модификации питательной среды и гидролизата обезжиренного молока сухого для получения пробиотиков медицинского и ветеринарного назначения

Обсуждение результатов Выводы

Практические предложения

Библиографический указатель использованной литературы Приложение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пути усовершенствования питательных сред, используемых в технологии производства медицинских и ветеринарных пробиотиков»

На современном этапе проблемы экологии и ее влияние на здоровье людей и животных выходят на передний план интересов как в науке, так и непосредственно в практике здравоохранения и ветеринарии.

Качество окружающей среды в значительной мере определяет уровень здоровья населения вообще и состояние микробиоценозов, отражающих и влияющих на здоровье, в частности. Это относится к широкому спектру факторов окружающей среды, как естественных, так и искусственного происхождения, обусловленного, в первую очередь, большим объемом поступления загрязнений в окружающую среду и низким уровнем контроля промышленных, сельскохозяйственных, бытовых и прочих отходов. Как показывают эпидемиологические исследования, даже при невысоких уровнях этих воздействий в организме человека могут развиваться выраженные изменения.

В последние годы повсеместно ухудшается качество питьевой воды. Наиболее распространенными загрязняющими веществами являются нефтепродукты, фенолы, соединения железа и другие отходы предприятий черной и цветной металлургии, газовой, угольной, лесной промышленности, сельского и коммунального хозяйства, поверхностных стоков с прилегающих территорий. Существенное влияние на содержание биогенных и органических веществ оказывают сельскохозяйственные угодья, пастбища и животноводческие фермы, где до настоящего времени широко применяются различные антибиотики. Ухудшение качества воды не только ведет к увеличению вспышек кишечных инфекций, но существенно влияет на микробиоценоз в организме вообще, что при определенных обстоятельствах может привести к нежелательным последствиям.Широкое применение антибиотиков в животноводстве и ветеринарии привело в последние годы к тому, что стала отмечаться высокая степень "загрязнения" пищевых продуктов антибиотиками. Так, тетрациклиновые антибиотики обнаруживаются в 11% образцов мяса и мясных продуктов, пенициллин — в 33% и стрептомицин — в 25% образцов молока (18).

Массовое, часто бесконтрольное применение антибиотиков без всяких к тому необходимых показаний, иногда под влиянием навязчивой рекламы и публикаций в немедицинской литературе, также способствует повышению аллергизации и развитию дисбиотических изменений в организме.

Нарушения в микробиоценозе кишечника наступают задолго до клинических проявлений и служат предвестником отклонений в клинико-физиологическом статусе организма. При клинических проявлениях дисбиотических изменений в кишечнике наиболее часто происходит угнетение иммунобиологических сил организма и повышается восприимчивость к инфекционным заболеваниям. Широкое распространение дисбактериозов большинство авторов справедливо считает одним из важнейших условий, приводящих к ныне наблюдаемому увеличению частоты и тяжести острых и хронических заболеваний (50).

При развитии дисбиотических изменений наряду с угнетением иммунобиологической активности организма, снижается выработка лизоцима и других факторов неспецифической защиты, что, в свою очередь, способствует развитию аллергических проявлений. г Известно, что нормальная микрофлора, проявляя антагонистическую активность по отношению к патогенным и гнилостным микроорганизмам, является важным фактором, препятствующим развитию инфекций, и обеспечивающим физиологическую нормализацию живого организма. Одно из активно развивающихся направлений современной микробиологии связано с использованием представителей нормофлоры для получения, так называемых, пробиотических препаратов, обладающих способностью восстанавливать естественные микробиоценозы человека и животных, и обеспечивать профилактический и лечебный эффект (2,3,9, 16,19).

Есть все основания утверждать, что в двадцать первом веке пробиотики в значительной степени потеснят на рынке традиционные фармакологические препараты, особенно те из них, которые применяют с профилактической целью. Более того, развитие индустрии функционального питания позволит каждому избрать диету, включающую ежедневное потребление продуктов с необходимыми для него характеристиками. Это, в конечном счете, будет способствовать сохранению физического и духовного здоровья как отдельного человека, так и человеческой популяции в целом (96).Многолетние исследования в условиях промышленного животноводства и птицеводства на территории Нижегородской области показали, что широкое внедрение кормовых бактерийных добавок пробиотического действия («Бифилакт», «Лактобактерин», «СТФ», «Ветолакт»), направленных на восстановление естественного биоценоза организма и повышение общей резистентности, покрытие белкового и витаминного дефицита, является эффективным и экономически целесообразным (20,21).

Увеличивающийся интерес к производству пробиотиков заставляет поднимать все новые вопросы совершенствования технологии и повышения качества препаратов, которые необходимо осмыслить и решить. По существу долговременное введение пробиотика - весьма активного биологического агента, представляет собой прямое вмешательство в экосистему человека и животных (9).

При создании и усовершенствовании уже выпускающихся лечебных бактерийных препаратов необходимы дальнейшие исследования по изучению свойств производственных штаммов, отработке технологических режимов производства, разработке эффективных и экономичных питательных сред.

Конструирование новых фармакопейных форм лечебных препаратов на основе биомассы живых микроорганизмов клеток в состоянии анабиоза, также требует развертывания изысканий оптимальных технологических параметров. При этом сохраняет свою актуальность и приобретает еще более ответственное значение задача подбора способов накопления биомассы.

Не вызывает сомнений то, что лечебное действие препаратов зависит от их качества и стабильности сохранения полезных свойств на протяжении срока годности препарата. Качество бакпрепаратов, в свою очередь, формируется на этапах их изготовления и зависит от стандартности и питательной ценности сред, применяемых для глубинного культивирования микроорганизмов, стандартности и оптимальности технологического процесса получения биомассы для любых форм пробиотиков как жидких, так и сухих. Нестандартность хотя бы одной из перечисленных технологических стадий приводит к изготовлению нестандартного по своим биологическим свойствам препарата, что отрицательно сказывается на лечебном эффекте препаратов.

В условиях расширения спроса на бактерийные препараты особое значение приобретают доступные, стандартные и экономичные питательные среды, используемые для глубинного культивирования продуцентов при получении пробиотических препаратов. Питательная среда, по-существу, является основой бактерийных препаратов.

Качественный и количественный состав питательной среды определяет ее способность обеспечивать наиболее эффективный путь наращивания биомассы бактерий, сохранять жизнеспособность клеток в процессе хранения препарата, а также влияет на его лечебное действие, обуславливая накопление биологически активных метаболитов.

Таким образом, качество пробиотических препаратов и эффективность биотехнологии их производства зависит в первую очередь от успешного выбора питательной среды.

Все вышеизложенное и определило выбор темы и направление наших исследований.

Цель работы. Сравнить по биохимическим и ростовым свойствам питательные среды, используемые в технологии производства пробиотиков и усовершенствовать технологию их приготовления. В задачи наших исследований входило:

- изучить аминокислотный состав питательных основ и сред, традиционно используемых для промышленного получения пробиотиков;

- исследовать динамику потребления энергетического субстрата и свободных аминокислот в процессе глубинного культивирования бактерий на примере штамма Ь.ркг^агит 8Р-АЗ на средах разного состава;

- изучить влияние состава питательной среды культивирования на кинетику роста культуры при глубинном культивировании на примере штамма Ь.р1а^агит 8Р-АЗ для оптимизации состава питательной среды культивирования штаммов лактобактерий;

- разработать нормативно-техническую документацию на получение сухой формы питательной основы гидролизата обезжиренного молока.

Научная новизна. Впервые определен полный аминокислотный состав питательных сред Мозера-Рогоза-Шарпа, казеиново-дрожжевой и молочно-солодовой, используемых в производстве пробиотиков, содержащих лактобактерии. Разработана казеиново-дрожжевая среда для культивирования лактобактерий. Разработана технология получения сухой формы гидролизата обезжиренного молока, используемого в качестве основы питательных сред.

Практическая значимость. Усовершенствована технология получения пробиотиков на основе лактобактерий в части получения питательных сред культивирования. Получена сухая форма питательной основы, которая пригодна для использования при производстве пробиотических препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Питательные среды, используемые для культивирования лактобактерий в производстве пробиотиков, существенно не отличаются по количественному и качественному составу аминокислот.

2. Разработанная казеиново-дрожжевая модифицированная питательная среда для культивирования лактобактерий, по своим ростовым свойствам является адекватной заменой сред, традиционно используемых в производстве пробиотиков, более технологичной в приготовлении и экономически выгодной.

3. Разработанная сухая форма гидролизата обезжиренного молока является стандартной по свойствам и эффективной питательной основой сред, пригодных для производства пробиотиков, содержащих лактобактерии.

Пути реализации. Результаты исследований могут быть использованы для разработки и получения пробиотиков, содержащих лактобактерии, а также возможно других видов молочнокислых бактерий.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в статьях, приоритетность результатов подтверждена положительным решением на выдачу патента. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: конференции «Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии», г.Махачкала, 1990 г.;

Всероссийской научно-практической конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых, специфическими средствами профилактики», г.Пермь, 1993 г. научно-практической конференции «Диагностика, профилактика и лечение гнойно-септических заболеваний лекарственными средствами, выпускаемыми НПО «Иммунопрепарат», г. Уфа, 1993 г. научной конференции, посвященной 70-летию Нижегородского НИИЭМ «Естественные факторы защиты в профилактике и лечении экологически обусловленных заболеваний», г.Н.Новгород, 2000 г. научно-практической конференции «Проблемы ветеринарии на рубеже веков», г.Н.Новгород, 2001 г.

Внедрение. Результаты исследований внедрены на Нижегородском государственном предприятии по производству бактерийных препаратов. Организовано производство опытных партий сухой формы гидролизата обезжиренного молока, используемого в качестве основы производственных питательных сред. Разработаны и согласованы в центре Госсанэпиднадзора

Нижегородской области технические условия ТУ 9385-002-01898748-01 и технологическая инструкция на производство и методы контроля ТИ 9385-002-01 на сухую форму гидролизата обезжиренного молока. Получено положительное решение по формальной экспертизе заявки на патент на казеиново-дрожжевую питательную среду (2001120857/13 (022211)) Разработано изменение к регламенту производства № 731-98 препарата «Лактобактерин сухой и в таблетках». пробиотиков для коррекции и сельскохозяйственных животных

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Конькова, Надежда Константиновна

1. Определен полный аминокислотный состав питательных основ и сред, используемых при получении лактосодержащих пробиотиков: ферментативных гидролизатов казеина и обезжиренного молока; автолизата пекарских дрожжей; экстрактов говяжьей печени, солода ячменного, пептона сухого ферментативного.1.1. Все питательные основы содержат достаточно полный набор аминокислот, определяющих питательную ценность белка. Исключение составляет цистеин, который не содержится в экстракте солода ячменного, гидролизатах казеина и обезжиренного молока. Пролин не содержат гидролизаты казеина и обезжиренного молока. Экстракт печени говяжьей не содержит аргинина.1.2. По суммарному содержанию свободных аминокислот из изученных экстрактов наиболее богатым является дрожжевой автолизат. Гидролизат казеина в сравнении с гидролизатом обезжиренного молока содержит аминокислоты в большей концентрации.2.Питательные среды, традиционно используемые для получения лактосодержапдих пробиотических препаратов сбалансированы по качественному и количественному составу аминокислот.2.1. По суммарному содержанию свободных аминокислот, наиболее богата казеиново-дрожжевая среда (8,61 г/л) и наименее - мол очно солодовая (3,11 г/л).2.2 Содержание «существенных» аминокислот в исследуемых средах было практически одинаково, на уровне 30 %, и только молочно-солодовая содержала «существенных» аминокислот до 50 %.З.В процессе культивирования штамма L.plantarum 8Р-АЗ на среде МРС-1 происходит накопление свободных аминокислот в культуральной жидкости на конечном этапе культивирования, на среде КД их количество остается на том же уровне.4.Состав питательной среды культивирования влияет на кинетические показатели роста культуры, значения которых могут быть критерием оптимального состава питательной среды.4.1. Удельная скорость роста штамма L.plantarum 8Р-АЗ на среде MPC-1 составила 0,31±0,02 ед.опт.пл/час, на среде КД была ниже и составила

0,2±0,02 ед.опт.пл/час; время удвоения биомассы на среде МРС-1 составило

2,22±0,4 час на среде КД было больше - 3,45±0,4 час; на среде МРС-1 содержание живых микробных клеток было выше и составило 13,7±1,7 млрд/мл, на среде КД - 8,3±1,0 млрд/мл. Потребление энергетического субстрата 40% раствора глюкозы на среде КД в 2,1 раза превосходило потребление на среде МРС-1.4.2.По ростовым свойствам: по удельной скорости роста, времени удвоения биомассы, количеству живых микробных клеток в мл, потреблению энергетического субстрата, среда КД не является адекватной заменой среды МРС-1.4.3 Предложенная казеиново-дрожжевая модифицированная среда (КДМ), в состав которой дополнительно не добавлен цистеин и содержание дрожжевого автолизата снижено от 0,65л до 0,1л на 1л среды, апробирована в производстве препарата «лактобактерин сухой». С использованием данной среды получены серии препарата, соответствующие по характеристикам действующей фармакопейной статье на «лактобактерин сухой».Концентрация живых микробных клеток в лечебной дозе препарата соответствовала нормативной.4.4. Казеиново-дрожжевая питательная среда успешно использована в технологии производства жидкого ветеринарного препарата «Ветолакт».5. Сухая форма гидролизата обезжиренного молока, полученного методом распылительного высушивания, пригодна для использования в качестве основы питательных сред культивирования лактобактерий при получении лактосодержащих эубиотиков, биологически активных добавок к пище, продуктов лечебно-диетического питания, а также при проведении исследований микрофлоры кишечника.6. Внедрение на Нижегородском государственном предприятии по производству бактерийных препаратов - фирме «Имбио» усовершенствованных питательных сред и основ для культивирования лактобактерий подтвердило их востребованность и эффективность. На этапе подготовки среды культивирования на 39% снижены трудозатраты, и на

31% их себестоимость.Практические предложения:

1. Разработанная модификация казеиново-дрожжевой питательной среды (КДМ) может использоваться для производства пробиотиков на основе молочнокислых бактерий как более технологичная и экономичная.2. Утверждены и согласованы с Нижегородским государственным санитарно-эпидемиологическим центром Нижегородской области Технические условия ТУ 9385-002-01898748-01 и технологическая инструкция на производство и методы контроля ТИ 9385-002-01 гидролизата обезжиренного молока и изменение к регламенту производства № 731-98 на лактобактерий сухой и в таблетках.3. Разработанная технология изготовления и контроля казеиново дрожжевой питательной среды и гидролизата обезжиренного молока освоена на Нижегородском государственном предприятии по производству бакпрепаратов - фирме «ИмБио» и может использоваться на других биотехнологических производствах.4. Полз^ены положительные отзывы на опытные партии гидролизата обезжиренного молока, апробированные в составе сред культивирования штаммов лактобактерий в лаборатории микробиоценозов и конструирования пробиотиков Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии.5. Пройдена формальная экспертиза заявки (№ 2001120857/13 (022211)) на выдачу патента Российской Федерации на казеиново-дрожжевую среду для культивирования штаммов лактобактерий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Конькова, Надежда Константиновна, 2002 год

1. Антипов В. А. Биологические препараты симбионтных микроорганизмов и их применение в ветеринарии // Сельское хозяйство за рубежом. - 1981. - № 2. - С.43.

2. Бондаренко В.М., Рубакова Э.И., Лаврова В.А. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы прапаратов пробиотиков // Ж. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1998.-№ 5.- С. 109.

3. Буланцев А.Л., Липницкий A.B., Тихонов Н.Г. Микробиоценоз кишечника человека и перспективы коррекции дисбиозов с помощью пробиотиков // Поволжский экологический вестник.-1998.- № 5.-С.364.

4. Богородский С.Э., Желтов В.А. и др. // Препарат обладающий иммуностимулирующим действием.-A.C. 2101020.-С 1.- 1998.

5. Бактериальный штамм Bacillus coagulans. Его применение в качестве пробиотического агента. WO 93/14187, С 12 N 1/20. РЖ ИСМ 46-0195.

6. Бакулина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова Н.Г., Полушкина А.Ф., Печоркина Н.И. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии //. Ж.Биотехнология.- 2001.- № 2.- С.48.

7. Банникова A.A. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности.- М.- 1975.- С.224.

8. Баталова Т.А., Лазарева Н.И., Голубева Л.М. Коррекция нормофлоры кишечника человека // В сб. Диагностика, профилактика и лечение гнойно-септических заболеваний лекарственными средствами, выпускаемыми НПО «Иммунопрепарат» Уфа.-1993.- С.- 14.

9. Беляев Е.И. Пути усовершенствования препаратов нормализующих микрофлору кишечника. // В сб. Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция.- Горький.- 1988.- С.75-76.

10. Берги. Краткий определитель бактерий.- М «Мир».- 1980.- С.352.

11. Бовкун Г.Ф., Семенихина В.Ф., Ткачев Н.Ф. Лечебное действие бификорма при микроэкологических нарушениях кишечника у телят. // Ветеринария. 1999. - № 4. - С.38-40.

12. Бруснигина Н.Ф., Зиминых Н.В., Быкова С.А., Власенко M.A. Характеристика условно-патогенных микроорганизмов при острых и хронических заболеваниях кишечника. //В сб. Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция.- Горький.- 1988.-С.-41.

13. Виолин Б., Клондайк на окраине фармрынка. Тематический обзор.// Ж. Ремедиум .- № 3.- М.- 2001.- С. 1-2.

14. Войткевич А.Ф. Применение ацидоцильных культур в животноводстве. // Доклады ВАСХМИА 1984.- С.45.

15. Воронин B.C., Ставцева Л.Я., Грязнева Т.И. Профилактика и лечение при диарее новорожденных телят. // Ветеринария. -1990. В.З.- № 3. С.14.

16. Гончарова Г.И. Изучение бифидобактерий, разработка препарата «Сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечныхзаболеваниях детей первого года жизни / Автореф. дис. канд. биол. наук.- М- 1970.- С. 16.

17. Гостищева Н.М., Карликанова С.Н. // Использование сухих питательных сред для микробиологического контроля в молочной промышленности.- М.- 1980.- С.2-5.

18. Грачева И.М. Дисбактериозы и суперинфекции, причины их возникновения, диагностика, лечение. // Ж. Лечащий врач.- 1999. № 1. -С.6.

19. Григорьева Г.И., Жирнов В.А., Пугачева H.A., Семьяшов В.В., Белянина Ю.К. Пробиотические препараты как фактор повышения естественной резистентности организма животных // В кн.: Ветеринарная наука на рубеже веков.- Н.Новгород.- 2000.-С. 40.

20. Григорьева Г.И., Кульчицкая М.А. Экология организма как система оздоровления // Тезисы докл. Международной конференции посвященной памяти акад. РАМН и АМТН РФ И.Н.Блохиной.-2000.-С.13.

21. Дворкин Г.А. Дисбактериоз и токсикообразование при диарее телят. // Сб.научн.тр.Белорусского НИИ животноводства. Минск. - 1986. -Вып. 16. - С. 146.

22. Думенин Н.В., Шахов А.Г., Антипова Г.А. и др. Бифидобактерин для лечения и профилактики диспепсии и гастроэнтеритов. // Свиноводство. 1977. - № 8. - С.32-33.

23. Жданов П.И. Применение споробактерина жидкого поросятам. // Ветеринария.- 1994.- № 7.- С.41-43.

24. Жирков И.Н. Братухин И.И. Применение пробиотика РАС для коррекции дисбактериозов у телят. // Ветеринария.- 1999.- № 4.-С.40-42.

25. Заблудовский A.JL, Штемберг A.C., Домашнев И.В. и др. //Способ получения пробиотика для ветеринарии. Патент РФ 2084233 А 61 К 35/66.- 1997.

26. Зароза В.Г. Этиология, диагностика и профилактика желудочно-кишечных заболеваний у телят. // Сельское хозяйство за рубежом. -1983.-№ 12.-С.38.

27. Зитаре И.К. Бактериальная флора кишечника здоровых и больных колибактериозом новорожденных телят и ее нормализация бифидобактерином: Автореф.дисс. канд.вет.наук. Тарту. - 1983. -С.14.

28. Заявка РФ № 97101801/13, А 61 К 35/74. Композиционный состав для получения таблеточной формы эубиотика биоспорина. // БИ № 13-. 1999.-С.4.

29. Ивановский A.A. Новый пробиотик бактоцеллолактин при различных патологиях у животных. // Ветеринария.- 1996.- № 11.-С.34-35.

30. Ивановский A.A., Вепрева Н.С., Зимирева В.В., Лагунова О.Н. Способ получения пробиотика для ветеринарии.//Патент Ф2084233 А 61 К 35/66- 1997.

31. Исакова Д.М., Пескова Л.И., Ядрова О.И., Елашина Е.В.Штамм бактерий Streptococcus lactis, используемый при промышленном производстве пробиотика для молодняка жвачных животных.// Патент РФ 21536531 А 61 К 35/74 М.- 2000.

32. Исакова Д.М. Сухой пробиотик для жвачных животных «Руменолакт».// Патент РФ 93036410 А 61 К 35/66 .- М- 1996.

33. Исакова Д.М., Бухачева И.Б. Штамм бактерий Streptococcus faecium, используемый для борьбы с дисбактериозами сельскохозяйственных животных. // Патент РФ 2154233 А 61 К 35/74- М.- 2000.

34. Карпов В.М. Препарат бактерин-SL. // Ветеринария.- 1987.- № 7.-С.45.

35. Квасников В.И., Нестеренко O.A. Молочнокислые бактерии и пути их использования Наука.- 1975.- С.388.

36. Коваленко Н.К., Наумова С.А., Головач Т.Н. Адгезия микробных клеток лактобактерий к эпителию кишечника сельскохозяйственных животных. // Микробиологический журнал.- 1990.- т.52.-№ 3.- С.76.

37. Клемпарская H.H., Шальнова Г.А. Аутофлора как индикатор радиоционного поражения. М.- Медицина.- 1979.- С.210.

38. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии.-М.- 1950.- С.56-58.

39. Красильникова Б.Н. К вопросу о химизме гомоферментативного молочнокислого брожения и его изменение в зависимости от состава среды: Автореф.канд.дисс.- М.- Медицина.- 1989.- С.205.

40. Куваева И.В. Обмен веществ организма и кишечная микрофлора.-М.- Медицина.- 1977.-С.-78.

41. Литвяков Н.В. Современные проблемы фундаментальной и клинической медицины.- Томск.- 1999.- С.22-23.

42. Ленцнер A.A. Некоторые результаты изучения лактобацилл микрофлоры человека.// Мат.5-й конф. НИИМЭГ.- 1969.- Таллин.-С.7-8.

43. Ленцнер A.A. Некоторые результаты исследования лактобацилл микрофлоры человека, получ. на каф.Тартусского университета.// Уч.записки Тарт.гос.ун-та.- 1966.- Тарту.- 191.- С.55.

44. Лебедева М.Н., Гончарова г.И., Лизько H.H. Современные аспекты нормы и патологии кишечной микрофлоры.// ЖМЭИ.- 1974.- № 9.-С.- 38.

45. Ленцнер A.A., Ленцнер Х.Н. Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция.// Респ.сб. научных трудов Под ред. И.Н.Блохиной, К.Я.Соколовой.- Горький.- Мед.институт.- 1988.-С.12.

46. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. МУК 4.1/4.2.588 96.- М.- 1998.С.-74.

47. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М.- 1977.С.-5.

48. Метаболизм микроорганизмов. Практикум под ред. проф.Н.С.Егорова. Москва. - 1986. - С.233.

49. Маянский А.Н. Дисбактериоз: иллюзии и реальность //Ж. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.- т. 2.-№ 2.- 2000.- с.8.

50. Мозгов И.Е. Бактериальные препараты: фармакологические стимуляторы в животноводстве. М.- Колос.- 1964.

51. Наставление по применению мази «Биосептин» в ветеринарии-1998.-С.2.

52. Наставление по применению препарата СТФ-1/56 жидкого для профилактики алиментарного заражения возбудителями сальмонеллезов, лечения и предупреждения. -1998.-С.-2.

53. Наставление по применению ветома -3 в ветеринарии № 13-52/1317.- 1998.-С.-1.

54. Петров В.Ф., Сафронова Г.М. Получение биологически активных препаратов-новое направление исследований в НПО « Биомед» // Ж. Микробиология, эпидемиология и иммунология.-№2.-1998.-С.95.

55. Патент РФ 2130316 А 61 К 35/74 Лечебно-профилактический препарат «Бактиспорин».- // БИ № 14.-1999.

56. Патент СССР 1723117, С 12 N 1/20. Штамм бактерий Bacillus pulvifaciens, используемый для изготовления лечебно-профилактического препарата против бактериальных инфекций у животных.- //БИ № 12.-1992.

57. Панин А.Н., Серых Н.И., Малик Е.В., Вершинина И.Ю. Штамм бактерий B.globosum, используемый для приготовления пробиотического препарата для ветеринарии. A.C. 2031937.- // БИ № 9,- 1995.

58. Патент РФ 2129432, А 61 К 35/74. Биопрепарат субтикол для профилактики и лечения инфекционных болезней. // БИ № 12.-1992.

59. Патент СССР 1824194, А 61 К 35/74. Способ повышения продуктивности и сохранности поросят в возрасте 30-120 дней. // БИ №24.-1993.

60. Патент СССР 1824193, А 61 К 35/74 Способ заживления операционных ран и профилактики гнойно-хирургических инфекций у свиней. // БИ № 24.-1993.

61. Патент РФ 2035186, А 61 К 35/66. Профилактический биопрепарат споролакт. // БИ № 14.-1995.

62. Патент РФ 1563699, А 61 К 35/74 Способ профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных. // БИ № 18.-1990.

63. Патент РФ 1723116, С 12 N 1/20 Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения препарата для профилактики и лечения воспалительных процессов и аллергических заболеваний. // БИ № 12.-1992.

64. Патент РФ 2122026, С 12 N 1/20 Штамм Bacillus subtilis ТРАС, резистентный к тетрациклину, рифампицину, ампициллину и стрептомицину, обладающий антибактериальной активностью по отношению к патогенным видам микроорганизмов. // БИ № 32.-1998.

65. Патент РФ 2115725, С 12 N 1/20 Штамм Bacillus subtilis РАС,грезистентный к рифампицину, ампициллину и стрептомицину,обладающий антибактериальной активностью по отношению к патогенным видам микроорганизмов. // БИ № 20.-1998.

66. Патент СССР 1648975, С 12 N 1/20 Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения молочного продукта, предназначенного для лечения диатеза, дисбактериоза и бактериальных инфекций. // БИ № 18.-1991.

67. Перминова Н.Г., Жуков А.Ю., Тимофеев И.В., Палецкая Т.Ф. Спид и родственные проблемы.//Русский журнал ВИЧ- 1999.-Т.З. -С.78.

68. Петровская А.Г. Микрофлора человека в норме и патологии.- М.-Медицина.- 1976.- С.217.

69. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника.- М.- Наука.- 1984.- С. 144.

70. Подберезный В.В. Эндобактерин при лечении коров, больных маститом. // Ветеринария.- 1993.- № 8.- С. 12.

71. Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Ханина Г.И., Хамиева М.П. Принципы разработки фармакопейных форм бактерийных препаратов для коррекции микрофлоры организма человека. // Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция.- Горький.-1988.- С.86.

72. Препараты для профилактики и лечения расстройств желудочно-кишечного тракта у сельскохозяйственных животных. WO 88/06619, С 12 N 1/00 // РЖ ИСМ 4-65-89.

73. Работнова И.Л, Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. «Наука».-1979.-С.6.

74. Ратникова И.А., Гаврилова H.H., Колоколова H.H. Идентификация антибиотических веществ молочнокислых бактерий.// Ж. Биотехнология.- 1995.- № 5-6.- С. 19-20.

75. Рахманов P.C. Питательная среда для роста бифидо- и лактобактерий. Патент РФ 2158302, С № 1/20 М- 2000.

76. Скоупс Р. Методы очистки белков.- М.- 1985.- С.341.

77. Смирнов В.В. Антибиотики и /или пробиотики // Лшування та д1агност.-1998.- № 2.- С. 8.

78. Созаева И.Г. Коррекция дисбиоза влагалищного биотопа споровым пробиотиком биоспорином // Автореферат дис.канд. мед. наук.-1999.-С. 15.

79. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ.-Киев.- Наук. Думка.- 1982.- С.- 12.

80. Соколова К.Я., Соловьева И.В. Дисбактериозы.- Н.Новгород.- 1999.-С.70.

81. Соколова И.В., Соловьева И.В. Формирование микробиоценозов человека в условиях экологического прессинга.// Естественные факторы защиты в профилактике и лечении экологически обусловленных заболеваний.- Н.Новгород.-2000.-С. 31.

82. Сорокулова И.Б., Смирнов В.В., Резник С.Р. и др. Профилактический биопрепарат субалин. Патент РФ 2035185, А 61 К 35/66 // БИ № 14.1995.

83. Субботина М.Д., Тимченко В.Н., Мартынкин A.C., Орлова В.А. и др. Дисбактериоз кишечника у детей и микроэкологические подходы к его корреции. //Методические рекомендации.- Санкт-Петербург.-1997. С.-72.

84. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. Мир микробов.- Т.З.- 1979.-С. 229-230.

85. Терновская JI.H., Калинина Т.Э., Шепелев Ф.П., Костина Н.И., Малина И.А. Способ получения гидролизата творога для приготовления питательных сред. Патент РФ 94018505 С 12// БИ № 1/20 -М- 1996.-С.12.

86. Тиняков В.Г., Гучок Ж.Л., Усков В.И., Вашурин O.A. Способ получения бактериально-ферментного препарата. Патент РФ 93031946 С 12 // БИ№ 1/20 М- 1996.

87. Тоом М.А. О методике определения видовой принадлежности штаммов лактобацилл.//Мат. 5 конф.- Таллин.- НИИЭМТ.- 1964.-С.16.

88. Тоом М.А. О значении некоторых физиологических свойств лактобацилл при определении их видовой принадлежности.// Учен.зап. ТГУ.- 1965.- №11.- С.178.

89. Тюрин М.В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл. Дисс.канд.мед.наук.- М.- 1990.-С. 10.

90. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии.-М.-Мир.- 1981.- С.845.

91. Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов. ФС 42-344 ВС-90.-С. 12.

92. Химический состав пищевых продуктов.- М.- Пищепром.- 1979.

93. Шендеров Б.А., Манвелова М.А. Эубиотики как основа функционирования питания человека. // Сборн.материалов научн.практ.конф. Актуальные проблемы инфекционной патологии. С.-Петербург. - 1993. - С.47.

94. Шендеров Б.А., Корнива С.А., Левченко Т.А., Головина Н.М. Питательная среда для наращивания биомассы бифидобактерий и лактобактерий. Патент РФ 2061037 С 12// БИ № 1/20- М.- 1996.

95. Шендеров Б.А., Манвелова М.А. Способ получения гомопробиотического бактерийного препарата, содержащего живые молочнокислые бактерии. Патент РФ 2146288 А 61 К 35/74. // БИ № 12.-2000.

96. Шендеров Б.А.,Скиба Н.Э.,Манвелова М.А., Степанчук Ю.Б. Способ получения кисломолочного продукта.// А.С. 95114016.- БИ № 1.1996.

97. Штамм бактерий Bacillus sp.-компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергий А.с.№ 4465884/13, SU 1710575 AI, С 12 N1/20, А 61 К 35/74//БИ. №5-1992.

98. Ali D., Lacroix C.,Thuault D., Bourgeois C.M., Simard R.E. Characterization of diacetin B, a bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. Lactis bv.diacetylactis UL720.//J.Microbiol.- 1995.- № 9.- P.- 841845.

99. Amrane A., Prigent Y. Lactic acid production rates during the different growth phases of Lactobacillus helveticus cultivated on whey supplemented with yeast extract // Biotechnol. Lett. 1998. - 20, № 4. -P.379-383.

100. Bertazzoni M.E., Benni A., Bonamini E., Cinguetti M., Zoppi G. Different probiotics and in testinal microflora in antibiotic treated children // Microb. Ecol. Health and Disease. 1998. - № 3-4. P.202-222.

101. De Vuyst Luc, Callewaert Raf, Pot Bruno. Characterization of the antagonistic activity of Lactobacillus amylovorus DCE 471 and largescale isolation of its bacteriocin amylovorin L 471 // Syst. And Appl. Microbiol. 1996. - 19. - № 1. - P. 19-20.

102. Fernandez-Espla M.D., Fox P.F., Martin-Hernandez M.C. Purification and characterization of a novel serine aminopeptidase from lactobacillus casei S. casei IFPL 731.//J.Agr. and Food Chem. 1997.-45.- № 5.- P.-1628-1630.

103. Garro Marisa S., De Valdez Graciela F., Oliver Guillermo, de Giori Graciela S. Purification of a-galactosidase from Lactobacillus fermentum // J.Biotechnol. 1996. - 45, № 2. - P. 103-109.

104. Gobbetti M., Fox P.F., Stepaniak L. Esterolytic snd lipolytic activities of mesophilic snd thermophilic Lactobacilli.// J.Food Sci.- 1996.- 8.- № 2.-P.127-130.

105. Hirano R., Hirano M., Oooka M. Dosako S. Lactoperoxidase effects on rheological properties of yogurt // J.Food Sci.- 1998. 63. - № 1.- P. 3538.

106. Kaneuchi C., Seki M., Komagata K. Production of succinic acid from citric acid and related acids by L.strains // Apple, and Environ. Microbiol. 1988. - 54. - № 12. - P.3050-3056.

107. Kisla D., Uunluturk A. A new type of fermented milk product manufactured by L. acidophilus, L. casei, L. longum // Adi. Food Sci. -1998.-20 -.№ 1.-P.32- 34.

108. Kleynmans Ulrich, Heinzl Hannsjory Lactobacillus suebicus sp.nov an obligately heterofermentative Lactobacillus species isolated from fruit mashes // Syst. and Appl. Microbiol. 1989. - 11. - № 3. - P.270-275.

109. Kennes, Veiga C., Naveau. Kinetics of growth of Lactobacillus plantarum with glucose, organic acids (malate, citrate, acetate) and ethanol//. Biotechnol. Lett. -1995.- 17.- № 9.- P.-904-908.

110. Kulozik U. Physiological aspects of continuous lactic acid fermentations at high dilution rates // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1998. - № 5. -P.506-510.

111. McDonald L.C., Fleming H.P., Hassan H.M. Acid tolerance of Lenconostoc mesenteroides u L.plantarum //Appl. and Environ. Microbiol. 1990. - 56. - № 7. - P.2110-2122.

112. Monvtel M., Labadie J. Specific Nutritional Reguirevents of Lactobacilli spp. From Meat // Zbl.Bacteriol. 1986. B. 183. - P. 25- 27.

113. Monter U., Kula M. Effect of nutrient composition on enzymi acitivity of a lact. acid bacterium // Forum Microbiol. 1990. - 13. - № 1. - P.84-88.

114. McFarland L.U., Elmer G.W. Pharmaceutical probiotics for the treatment of anaerobic and other infictions // Anaerobe. 1997. - №2-3. - P. 12-14.

115. Nemeth A., Gasparik-Reichardt J., Farkas J., Balogh E., Andrassy E. Identification and characterization of bacteriocins produced by lactic acid bacteria // Fleischwirtschaft. 1996. - 76, № 10. - P. 1011-1043.

116. Palencia P.F., Martin-Hernandez C., Lopez-Fandino Rosina, Pelaez Carmen. Proteolytic activity of Lactobacillus casei subsp. Casei IFPL 731 in a model cheese system // J.Agr.and Food Chem. 1997. - № 9. -P.3701-3707.

117. Rawls Rebecca I. Optimistic about antisense // Chem.and Eng. News. -1997.-№22.- P.32-36.

118. Ruiz-Barba J.L., Jimenez-Diaz R. Availability of essential B-group vitamins to Lactobacillus plantarum in green olive fermentation brines// Appl.and Environ. Microbiol.- 1995.- 61.- № 4.- P. 1295-1297.

119. Sanz Yolanda, Toldra Fidel. Purification and characterization of an aminopeptidase from lactobacillus sake. //J.Agr.and Food Chem.- 1997. -45. №5.-P. 1550-1552.

120. Sasaki Masahiro, Bosman Boukje W.,Tan Paris S.T. Comparison of proteolytic activities in various lactobacilli.// J.Dairy Res.- 1995.- 62.- №4.- P.600-601.

121. Snell Esmound E. Nutrition research with lactic acid bacteria a retrospective view // Annu. Rev. Nutr.- Vol. 9/- 1989.-P. 2-5.

122. Tan P.S.T., Bosman B.W., Sasaki M. The proteolytic enzymes of Lactobacillus helveticus.// Impacts Appl. Microbiol. And Biotechnol. -1995. P.63-67.

123. Thompson J.K., McConville К J., Mcreynolds Christine, Moorhouse

124. D., Collins M.A. Mutations to antibiotic resistance occur during the stationary pahse in Lactobacillus plantarum ATCC 8014 // Microbiology. 1997. - 143, № 6. -P.1941-1944.

125. Trahan L., Hiran S., Bareil M. Preparation and purification of xylitol 5 phosphale from all extract of L.casei С1-16 // Appl. and Environ Microbiol. - 1988. - 54. - № 2. - P.571-580.

126. Van Hiey-De-Boer K.A., Hageman P.J. Probiotic nutritional preparation // Патент № 0904784. Биол. № 99/13. - C.10-13.

127. Сырье и основные материалы 25-82 24-32

128. Вспомогательные материалы 0-04 0-04

129. Транспортно-заготов. расходы 0-39 0-36

130. Возвратные отходы (вычит.)

131. Основная зарплата производственных рабочих 11-20 6-80

132. Дополнит, з/плата производственных рабочих

133. Отчисления на соцстрах с зарплаты производственных рабочих 4-10 2-48

134. Расходы на подготовку и освоение производства

135. Расходы на содержание и эксплуатацию оборудования10.

136. Цеховые расходы 33-60 20-40

137. Цеховая себестоимость 75-15 54-40

138. Общезаводские расходы 31-36 19-04

139. Фабрично-заводская себестоимость 106-51 73-44

140. Внепроизводственные расходы

141. Полная себестоимости 106-51 73-4417. Оптовая цена / / 140 9518. НДС // . / 14 0-50