Разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Курчева, Светлана Александровна

• Курчева, Светлана Александровна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Курчева, Светлана Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Природные очаги и заболеваемость туляремией.

1.2. Микробиология возбудителя туляремии.

1.2.1. Основные биологические свойства туляремийного микроба

1.2.2. Антигены возбудителя туляремии и их применение в иммунодиагностике этой инфекции.

1.3. Иммунодиагностика туляремии.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в опытах.

2.2. Лабораторные животные, использованные в экспериментах

2.3. Полевой и клинический материал.'

2.4. Аппаратное оснащение исследований.

2.5. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле.

2.5.1. Определение электрофоретической подвижности белковых фракций.

2.6. Методы контроля антигенов и сывороток.

2.7. Выделение иммуноглобулинов.

2.8. Получение и контроль иммунофлуоресцирующих конъюга-тов.

2.9. Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов

2.10. Количественное определение белка.

2.11. Лиофилизация биологического материала.

2.12. Характеристика реагентов, используемых для получения магноиммуносорбентов.

2.13. Методы математической иVстатистической обработки материалов

3 Стр.

Глава 3. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ ПЫЖ^ЕНА ТиЬАЯЕтК И ТУЛЯРЕМИЙНЫХ АНТИСЫВОРОТОК

3.1. Получение специфических туляремийных антигенов и их характеристика

3.2. Разработка схем иммунизации для получения туляремийных гипериммунных сывороток

Глава 4. РАЗРАБОТКА ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ

ДИАГИОСТИКУМОВ. .;.

4.1. Диагностикум эритроцитарный туляремийный антигенный

4.2. Диагностикум эритроцитарный туляремийный иммуногло-булиновый

4.3. Разработка стандартного образца ФГУЗ СтавНИПЧИ Роснотребнадзора сыворотки диагностической туляремийной адсорбированной сухой.;.

Глава 5. ПОЛУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И ИММУНО-ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА . ^. ■.

5.1. Получение флуоресцирующих иммуноглобулинов для индикации возбудителя туляремии .-------------------.

5.2. Получение иммунопероксидазных конъюгатов для выявления РгапсшеИа ийагеюш и сывороточных антител против и возбудителя туляремии в иммуноферментном методе анализа

Глава 6. РАЗРАБОТКА ИММУНОМАГНИТНЫХ СОРБЕНТОВ ДЛЯ МОНИТОРИНГА ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ В

ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЬГ.

6.1. Конструирование тест-системы магноиммуносорбентной для выявления возбудителя туляремии в ИФА.

4 Стр.

6.2. Разработка критериев контроля качества экспериментальных серий тест-системы диагностической магноиммуносор-бентной для выявления возбудителя туляремии методом ИФА.

6.3. Мониторинг объектов окружающей среды на наличие возбудителя туляремии с применением МИС и технических средств для работы с ними.

Глава 7. ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ РАЗРАБОТАННЫХ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя»

Актуальность проблемы.

Туляремия - природно-очаговая инфекция, относящаяся к особо опасным инфекционным болезням, крупные вспышки и спорадические случаи которой периодически регистрируются во многих странах мира, в том числе в России (Никифоров В:В., Кареткина Г.Н., 2007; Splettstoesser W.D., Tomaso Н:, A1 Da-houk S. et al., 2005). I

Природные очаги туляремии, отличаются длительностью существования, I стойкостью и способностью проявлять активность через много лет эпизоотического и эпидемиологического спокойствия. Особенностью эпидемиологии туляремии является большое разнообразие источников, носителей, переносчиков, факторов передачи возбудителей, механизмов заражения, входных ворот инфекции (Олсуфьев Н.Г., 1975; Новиков H.JL, Попов В.П., Жуков В.И. с соавт., 2003; Онищенко Г.Г., Дроздов И:Г., Федоров Ю.М. с соавт., 2005; Онищен-ко Г.Г., 2006; Онищенко Г.Г., Смоленский В.Ю., 2009 и др.).

Возбудитель туляремии обладает высокой экологической пластичностью ,и вследствие этого высокой устойчивостью- в объектах окружающей среды, способностью переживать, неблагоприятные условия. Туляремийному микробу свойственна высокая степень вирулентности: инокуляция или ингаляция 10-15 бактерий приводит к развитию инфекционного процесса у практически 100 % инфцированных людей. Поэтому по своим биологическим свойствам отнесен к высшей категории «А» среди наиболее опасных патогенных микроорганизмов — потенциальных агентов биологического оружия (Мещерякова И.С., Демидова Т.Н., Горшенко В.В., 2007; Куница Т.Н., Мека-Меченко Т.В., Некрасова JI.E. с соавт., 2011; Dennis D.T., Inglesby T.V., Henderson D.A. et al., 2001).

Важной задачей в борьбе с бактериальными инфекциями, в том числе и туляремией, является обнаружение и идентификация возбудителя, решение которой обеспечивается широким арсеналом методических приемов: от классических методик микробиологического тестирования до современных иммуноди-агностических, характеризующихся экспрессностью, высокой специфичностью и чувствительностью, возможностью их использования при исследовании материала, непригодного для бактериологического анализа (МУ 3.1.2007-05; Никифоров В.В., Кареткина Г.Н., 2007; Девдариани З.Л., Терешкина Н!Е., 2010).

Диагностика туляремии складывается из индикации и идентификации возбудителя или его специфических антигенов и определения' сывороточных антител у человека и* восприимчивых животных, при» этом, как правило; на1 практике предпочтение отдается иммунодиагностике; характеризующейся экс-прессностью, высокой> специфичностью, и чувствительностью. К настоящему времени для> диагностики туляремии отечественными: и зарубежными учеными предложено значительное количество^ эффективных иммунодиагностических тестов. Однако большая их часть - экспериментальные разработки' (Сыро-ва H.A., Терешкина HiE., Девдариани З.Л., 2008).

В! связи со сказанным; исследования, направленные на совершенствование и разработку туляремийных иммунодиагностикумов, налаживание производственного выпуска сертифицированных препаратов, не утрачивают своей актуальности.

Цель исследования,— разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для; идентификации Francisella (F.) tularensis и лабораторной диагностики туляремии.

Основные задачи исследования:

1. Осуществить подбор штаммов F. tularensis для получения специфических антигенов (водорастворимый' белковый' комплекс и липополисахарид (ЛПС)).

2. Получить специфические, высокоактивные гипериммунные сыворотки при различных схемах иммунизации, кроликов-продуцентов* и выделить из них иммуноглобулины,класса G (IgG).

3. Разработать производственную биотехнологию получения эритроци-тарных туляремийных диагностикумов (иммуноглобулинового и антигенного) и разработать стандартный образец (СО) ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора сыворотки диагностической туляремийной.

4. Получить флуоресцирующие иммуноглобулины для идентификации возбудителя туляремии в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) и иммунопе-роксидазные конъюгаты для выявления Р. Шагетгв и сывороточных антител против возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе (ИФА).

5. Разработать иммуномагнитные сорбенты (МИС) для мониторинга возбудителя туляремии в объектах окружающей среды. 6. Провести лабораторные и полевые испытания разработанных медицинских иммунобиологических препаратов; (МИБП), определить их диагностическую ценность.

Научная новизна; работы;. Разработанные методические подходы и приемы по извлечению антигенного' материала, получению иммунных сывороток и выделению иммуноглобулинов; оптимизация параметров конъюгации ли-гандов и маркеров, лигандов и твердофазных носителей позволяют, унифицировать биотехнологию производства МИБП для; диагностики туляремии и индикации ее возбудителя: диагностикумов эритроцитарных, тест-систем иммуно-ферментных, иммуноглобулинов- диагностических флуоресцирующих, тест-системы диагностической магноиммуносорбентной. Для мониторинга открытых водоемов на наличие возбудителя туляремии с применением МИС сконструировано техническое устройство «Аквадиамаг», на которое получен патент РФ на полезную модель № 64784 от 10.07.2007 г. «Установка для микробиологического мониторинга объектов.водной среды».

Теоретическая и; практическая значимость работы. Проведенные исследования по конструированию иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и детекции ее возбудителя, базирующиеся на особенностях антигенной структуры туляремийного микроба и иммунного ответа животных при инъецировании его антигенов, свойствах матриц биотической и абиотической природы, позволили составить алгоритм микробиологических и биотехнологических манипуляций процесса производства и контроля различных туля-ремийных диагностических препаратов.

Разработаны производственные биотехнологии изготовленижряда МИБП для идентификации Р. Ш1агет1я и диагностики туляремии, стабильно отвечающие требованиям, предъявляемым к диагностическим и индикационным препаратам. На все разработанные МИБП составлена нормативная? документация: промышленный регламент (ПР) № 1879-07 и фармакопейная статья предприятия (ФСП) № 9168-08 на диагностикум эритроцитарный тулярёмийный антигенный жидкий; ПР'№ 1313-03 и ФСП № 9169-08 на диагностикум эритроцитарный тулярёмийный иммуноглобулиновый жидкий; получены, регистрационные удостоверения от Федеральной службьь по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФСР 2011/10270 от 05.03.2011 г. и № ФСР 2011/10271 от 05.03:2011 г., соответственно; пусковой регламент (ПУР) № 01897080-07-09 и Технические условия<ТУ) 9388-010-018978-2009 на Набор реагентов тест-системы диагностической; для выявления? возбудителя- туляремии в иммуноферментном анализе (протокол № 7 от 09.06.2009 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора), № ФСР12010/06744 от 05.02.2010 г.; СО № 001-9389-2008 ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора сыворотки диагностической I гуляремийной адсорбированной сухой (одобрен Ученым советом и утвержден директором института, протокол № 4 от 16.04.2009 г.); ПУР № 01897080-10-10 и ТУ 9389-017-01897080-2010 на иммуноглобулины диагностические туляремийные флуоресцирующие (протокол № 6 от 28.05.2010 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора); ПУР № 01897080-04-09 и ТУ 9388-006-17897080-2009 на тест-систему диагностическую магноиммуносорбентную для выявления* возбудителя туляремии в иммуноферментном: анализе (протокол № 4 от 16:04.2009 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора).

Основные положения^выносимые на защиту:

1. Разработанные биотехнологии обеспечивают получение высококачественного биологического сырья, пригодного для производства туляремийных МИБП.

2. Сконструированные эритроцитарные, иммуноферментные, иммуноф-луоресцентные, магноиммуносорбентные туляремийные диагностикумы отвечают требованиям, предъявляемым к диагностическим и индикационным препаратам.

3. Лабораторные и полевые испытания разработанных туляремийных МИБП демонстрируют их высокую чувствительность, специфичность,.соответствие нормативной документации, что позволяет наладить производство сертифицированных препаратов.

Апробация* работы. Результаты диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине Военно-медицинской академии «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения- и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (Ставрополь, 2010); III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения'биологической безопасности» (Оболенск, 2011).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной- в рамках

НИР (№№ Госрегистрации 01.2008 02135; 01.2009 52158; 01.2009 52157) и федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)», контракт № 117-Д от 11.08.2009 г., отражено в 11 научных работах, две из которых опубликованы в журналах, рекомендуемых «Перечнем ВАК».

Структура и* объем работы. Диссертация изложена на 187 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, шести глав

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Курчева, Светлана Александровна

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения белковых спектров водорастворимых антигенов и их свойств определены три производственных штамма возбудителя туляремии разных подвидов: Р. ы1агеж\5 543/6 (тесНаазгШма), Р. tularensis БсЬи (пеагсНса), Р. ш1агет1Б 503/840 (Ио1агсНса), из которых получен по разработанной нами схеме полигрупповой белковый антиген.

2. Предложены производственные схемы иммунизации, позволяющие получать высокий иммунный ответ практически у 100 % кроликов-продуцентов. Определены наиболее эффективные методы выделения иммуноглобулинов класса в из гипериммунных сывороток и их очистки для различных групп диагностических препаратов.

3. Разработана биотехнология производства эритроцитарных туляре-мийных антигенного и иммуноглобулинового диагностикумов (№ ФСР 2011/10270 и № ФСР 2011/10271), а также стандартного образца ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора сыворотки диагностической туляремийной, используемой в качестве контрольной при постановке серологических реакций и входящей в комплекты наборов диагностикумов.

4. Унифицирована биотехнология изготовления туляремийных имму-нопероксидазных конъюгатов для выявления антигенов и сывороточных антител. Набор реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в ИФА зарегистрирован в Росздравнадзоре (№ ФСР 2010/06744).

5. Определены биотехнологические параметры изготовления туляре- ' мийных флуоресцирующих иммуноглобулинов, обеспечивающие рабочее разведение препарата 1:16-1:32: рН~ реакционной смеси - 9,5, нагрузка ФИТЦ -20 мг на 1 г белка, температура 20 °С при четырехчасовом контакте белка с красителем.

6. Многочисленные лабораторные испытания изготовленных серий эритроцитарных, иммунофлуоресцентных, иммуноферментных препаратов показали их соответствие разработанным параметрам качества и требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим препаратам. Диагностическая ценность названных МИБП подтверждена исследованиями различного полевого материала (клещи, грызуны, вода открытых водоемов), собранного в Ставропольском и Краснодарском краях, Карачаево-Черкесской республике.

7. Сконструированный аффинный сорбент с магнитными свойствами на основе алюмосиликатной матрицы и поликлональных туляремийных антител обладает высокой специфической активностью и специфичностью, что подтверждено полевыми испытаниями, демонстрирующими возможность исследования проб с высокой степенью загрязнений биотической и абиотической природы, низкой концентрацией патогена, при этом чувствительность модифицированного ИФА повысилась на два-три порядка по сравнению с традиционным анализом, и это позволило увеличить число положительных находок более чем в шесть раз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция остается актуальной проблемой в инфекционной патологии человека. Возбудитель туляремии F. tu-larensis, циркулируя в природных очагах, может вызвать значительные вспышки заболевания, что представляет серьезную проблему для практического здравоохранения. Туляремия характеризуется различными механизмами и путями передачи возбудителя, лихорадкой, интоксикацией, образованием лимфаденитов, полиморфизмом клеточных проявлений, затяжным течением (Олсуфьев Н.Г., 1975; Гусева Е.В., Дудникова И.С., 2001; Refersen J.M., Schriefer М.Е., 2005). Природные очаги туляремии отличаются стойкостью, постоянными эпизоотическими и эпидемиологическими проявлениями (Мещерякова И.С., 2002).

Эпидемическими особенностями туляремии является высокая (практически 100 %) восприимчивость организма человека п]эи минимальных инфицирующих дозах возбудителя и множественность механизмов, заражения. Вдыхание всего 10 клеток F. tularensis может вызвать заболевание человека, что обусловлено высоким уровнем вирулентности и инфекциозности. Эти характеристики возбудителя туляремии определили его место в высшей катеi гории «А» патогенных агентов бактериального оружия (Воробьев A.A., 2001; Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridse S.R. et al., 2002; Thomson N., Cerdeno-Tarraga A., Bentley R., 2005).

Г.Г. Онищенко (2005) отмечает, что «система здравоохранения и причастные государственные структуры должны быть готовы к обнаружению и ликвидации последствий вспышки, вызванной любым биологическим агентом, включая традиционные и экзотические виды микроорганизмов». Для этого существующая система государственного эпидемиологического надзора и борьбы с инфекционными болезнями должна быть вооружена комплексом эффективных и адекватных диагностических препаратов и методов для индикации и i идентификации возбудителей.

Для обнаружения возбудителя туляремии в объектах окружающей среды и в клинических образцах используют биологические, бактериологические, иммуносерологические, молекулярно-биологические методы исследования (МУ 3.1.2007-05). При этом следует отметить, что большинство иммунодиагно-стических тестов — экспериментальные разработки.

При производстве диагностических препаратов необходимым условием является получение высококачественного антигенного и антительного материала.

Для извлечения-наиболее полного антигенного комплекса из микробов с сохранением нативности биополимеров мы избрали, щадящий режим дезинтеграции микробных клеток с помощью ультразвуковой установки в сочетании с водно-солевой экстракцией и последующим осаждением белка.

Сравнительное изучение методом диск-электрофореза в ПААГ антигенной структуры водорастворимых комплексов семи штаммов F. tularensis, относящихся' к разным подвидам,, дал о возможность выбрать три штамма: F. tularensis 543/6 (mediaasiatica), F. tularensis Schu (nearctica) и F. tularensis 503/840 (holarctica), из которых изолирован полигрупповой водорастворимый антиген.

Иммунные туляремийные сыворотки получили по разработанным нами схемам иммунизации кроликов-продуцентов, используя иммунокорректоры феракрил, тималин, циклофосфан, тимоген; обладающие различным, механизмом действия, иммуногеном при этом служил и полигрупповой туляремийный водорастворимый антиген и ЛПС.

При определении специфичности полученных гипериммунных туля-ремийных сывороток на гетерологичных штаммах микроорганизмов в непрямой реакции иммунофлуоресценции наблюдалось свечение на два-три креста у представителей рода Brucella, вследствие чего возникла необходимость в сорбции неспецифических антител. Для этой цели мы применили алюмосили-катный антигенный магноиммуносорбент. Таким образом, нами получено высококачественное биологическое сырье, пригодное для производства различных иммунобиологических препаратов.

До сих пор остаются актуальными и широко используются в диагностике туляремии простые, достаточно чувствительные, не требующие применения специальной аппаратуры и поэтому общедоступные серологические тесть»х? в частности, РНГА, РПГА, РНАт. Нами налажен производственный выпуск д^аг-ностикумов эритроцитарных туляремийных — антигенного и им-муноглобулинового (№ ФСР 2011/10270 и № ФСР 2011/10271, соответственно), при этом оптимальная биотехнология их изготовления заключается в след^ую щем: концентрация формалинизированных эритроцитов - 20 %, темперагэгура связывания эритроцитов с сенситином (при его ^ нагрузке в 200 мкг/мл) — полигрупповым водорастворимым белковьш туляремийным антигеном либо фракционированными октановой кислотой - 45 °С, рН раствора - 6,0 в течение 18 ч. Для использования в качестве положительной контрольной сыворотки; црИ постановке серореакций с этими диагностикумами нами разработан стандартный образец предприятия (СО) сыворотки диагностической туляремийной; адсорбированной сухой (регистрационный номер 001-9389-2008). Эта сывор>отка входит в комплекты наборов диагностикумов эритроцитарных туляремийных.

Исследования по конструированию диагностикума эритроцитарногчэ ту-ляремийного антигенного при использовании ЛПС в качестве сенситина Показали, что при его нагрузке в 100- мкг/мл титры РНГА достигали не тиенее 1:20480, и это свидетельствовало о достаточно высокой чувствительности препарата и возможности использования ЛПС при изготовлении антигенного эрит-роцитарного диагностикума.

При разработке иммуноглобулинов диагностических туляремийных флуоресцирующих нами изучены различные условия конъюгации иммуноглобулинов класса О, выделенных различными способами, с ФИТЦ: значение рН реакционной смеси (8,5; 9,0; 9,5), нагрузка красителя (20 мг и 25 мг ца 1 г белка), время его контакта с белком (1 ч; 2 ч; 4 ч; 12 ч), температурный режим конъюгации (4±1 °С; 20±1 °С; 37±1 °С). Отмечено, что после добавления ^красителя в первые минуты происходит снижение рН на 0,3-0,5, при этом значительная часть ФИТЦ не вступает в реакцию с белком. В связи с этим необходимо проводить контроль показателей рН и их корректировку после добавления красителя и через 30 мин после начала метки. Наилучшие серии конъюгатов получены при значении рН реакционной смеси — 9,5, нагрузке ФИТЦ— 20 мг на 1 г белка, температуре 20 °С и четырехчасовом контакте белка с красителем. Специфическая активность препаратов всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром 1:32 — 1:64 при исследовании мазков гомологичных штаммов. Оценка физико-химических свойств флуоресцирующих иммуноглобулинов, специфичности, чувствительности показала их соответствие требованиям, предъявляемым к подобным препаратам.

При использовании высокоактивных ^О, выделенных из туляремийных гипериммунных сывороток с помощью ПЭГ-6000, получены иммунопе-роксидазные . конъюгаты, рабочий титр которых составил 1:200 — 1:400, чувствительность по водорастворимому антигену — 50-100 нг/мл, по корпускулярному антигену - 5х104-1х105 м.к./мл. Все серии полученных конъюгатов для ИФА дали отрицательные результаты с гетерологичными штаммами, что свидетельствовало об их специфичности. Названные конъюгаты входят в «Набор реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе (ЙФА)», который зарегистрирован в Росзд-равнадзоре (№ ФСР 2010/06744).

Важным условием повышения г чувствительности и специфичности методов диагностики является селективное концентрирование возбудителя инфекции с последующей постановкой экспресс-анализов^ так как чаще всего в исследуемом материале концентрация возбудителя ниже порога чувствительности метода диагностики. С этой целью нами разработаны композиционные магнитные иммуносорбенты на основе поликлональных туляремийных < ^О. В качествесфуктурных единиц, формирующих остов кремнезема, использовали алюмосиликат, модифицирование поверхности которого осуществляли в присутствии полиглюкина и вторичного алкилсульфата натрия. Полученный иммуносорбент использован для проведения иммуномагнитной сепарации возбудителя туляремии и детекции его в иммуноферментном анализе, при этом в качестве твердой фазы вместо полистироловых микропланшет, традиционно используемых при постановке. ИФА, применяли разработанный нами магнитоуправляемый иммунный сорбент при постановке «сэндвич»-варианта этого метода. '

При постановке сочетанного метода МИС+ИФА искомый инфект, содержащийся в исследуемом материале, специфически взаимодействовал с IgG против антигенов F. tularensis, иммобилизованными на МИС. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляли с помощью «Набора реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в ИФА».

При проведении ИФА с помощью МИС туляремийные микробы, обнаруживались в концентрации, эквивалентной по ОСО 42-28-85Г1, 1,0x102 — 1,0x10 м.к./мл. Все изготовленные серии МИС не выявляли в ИФА гетероло-гичные штаммы микроорганизмов в концентрации, эквивалентной? по ОСО 42-28-85П, 1,0x105 м.к./мл и выше. Время постановки ИФА с применением МИС , составило 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18-ти часовую сенсибилизацию микропланшет - 20-21 ч. При этом значительно увеличивался? срок хранения сенсибилизированной твердой фазы (с 10 дней до двух лет и более), чувствительность модифицированного ИФА повышалась, на два-три порядка по сравнению с общепринятым ИФА. .

Разработанный нами аффинный кремнеземный микрогранулированный сорбент с магнитными свойствами имеет большую величину сорбционной емкости за, счет развитой поверхности и специфического лиганда, обладает стандартностью. структурных характеристик, механической прочностью, химической и микробиологической устойчивостью.

Применение МИС позволяет на этапе подготовки пробы путем многократных. промываний сорбента с фиксированным на. нем инфекционным агентом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым, исключая их отрицательное влияние на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген, что повышает специфичность и чувствительность методов экспресс-анализа, а также достоверность как положительных, так и отрицательных результатов.

Разработанный нами туляремийный МИС входит в набор тест-системы диагностической магноиммуносорбентной для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе. Названная тест-система включена в сетевой график разработки и внедрения препаратов* для диагностики особо опасных инфекционных болезней на 2012 г.

В итоге проведенных исследований составлена^ принципиальная^ схема производства туляремийных МИБП, которая складывается из последовательных стадий и, операций, характерных для каждого конкретного препарата; и определены критические контрольные точки на этапах производства (рисунок 27).

Диагностическую .ценность, разработанных, нами МИБП подтвердили многочисленные лабораторные испытания и исследования полевого материала,. собранного в Ставропольском и Краснодарском краях, Карачаево-Черкесской республике:; 3271. экземпляров клещей; 40 *грызунов, 12 проб воды открытых водоемов.

Таким образом, проведенные исследования позволили унифицировать, биотехнологию: производства иммунобиологических препаратов для идентификации F. tularensis и диагностики туляремии (Алиева Е.В., Тараш A.B., Афанасьева Е.Е. с соавт., 2006; Курчева С;А., 20М, 201Та)^Иолученные;намитуля-ремийные МИБП пользуются постоянным спросом и применяются в лабораторной практике Федеральными государственными учреждениями-«Центры гигиены и эпидемиологии», противочумными учреждениями Роспотребнадзора (научно-исследовательскими институтами, станциями и отделениями); и они входят в перечень, укомплектования диагностическими препаратами и расходными материалами, специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ) согласно Приказу № 330 от 22Л К2007 г. М31и- соцразвития^РФ;«©^регламенте функционирования СПЭБ».

Характеристика сырья, вспомогательных материалов и полупродуктов

К; ЛБТК

Выращивание биомассы бактерий

Стерилизация Ki.K-i, В

Микробная биомасса - Дезинтеграция м.к , экстракция; очистка L

АНТИГЕНЫ И

Водорастворимые белковые, ЛПС (и др.)

Для иммунизации

Для конъюгации

С ферментом

Ki,K4,K5; В

Иммунная сыворотка

1

Сорбция сыворотки * Аффинный сорбент 4

Иммуноглобулины (IgG) Выделение иммуноглобулинов

Конъюгирование f .

С флуоресцирующим красителем

Иммуноферментные (для ИФА) Г I

Полиакриламидный гель или органокремнеземная основа с магнитным материалом (матрица)

-Тштг тпрмгппЛ

И м му нофлу орес-центные (для РИФ) I

К+Дз; В

Эритроцитарные (для РИГА, РПГА, РНАт)

Розлив в ампулы, флаконы Лиофилизация

Сорбенты, магноиммуносор-бенты

KJCs; В

К4Д5; В; ЛБТК

Этикетировка, упаковка

Хранение готовой продукции

Рисунок 27 - Схема процесса производства и контроля туляремийных иммунобиологических диагностических препаратов

Обозначения: К-К5 - критические контрольные точки: К- входной контроль, Ki - контроль чистоты культуры, К2 -контроль специфичной стерильности, Кз - количественный контроль, К4 -контроль специфичности, К5 - контроль специфической активности; В - внутренний контроль; ЛБТК - контроль, производимый лабораторией биологического и технологического контроля предприятия

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Курчева, Светлана Александровна, 2011 год

1. Абусуева A.C., Арбулиева Е.У., Хаиров С.Г. Сравнительная оценка различных диагностикумов в РПГА при бруцеллезе // ЖМЭИ. 1999. — № 4. -С. 98-100.

2. Аграновская E.H., Карпенкова Н.И. Вопросы прикладной иммунологии. Ленинград, 1967. - С. 144-157.

3. Айманова О.Я. Усовершенствование методов производства эрит-роцитарных препаратов для диагностики особо« опасных инфекций: автореф. дис. . канд. мед. наук. — Саратов. -1986. 22'с.

4. Унификациям разработка диагностических тест-систем для мониторинга возбудителей бактериальной и вирусной природы / Е.В. Алиева; A.B. Таран, Е.Е. Афанасьева и'др. // Вестник СГУ. 2006. - Вып: 47, ч. 2. - С. 236-242.

5. Обнаружение возбудителя туляремии у больных с помощью реакции иммунофлуоресценции! / Е.В. Ананова, Л.С. Каменнова, И.С. Мещерякова и др.«// ЖМЭИ. 1989. - Т. 4. - С. 46-^19.

6. Аронова Н.В., Павлович Н.В. Фазовые вариации липополисахарида Francisella tularensis npn инфекции человека // ЖМЭИ: — 2005. — № 4. — С. 8—12.

7. Аронова Н.В., Павлович Н.В. Использование препаратов липополисахарида Francisella tularensis в точечном твердофазном' иммуноферментном анализе // ЖМЭИ. 2000. - № 5. - С. 75-78.

8. Афанасьев E.H. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): автореф. дис. . д-ра мед. наук. — Ростов, 2000: —45 с.

9. Афанасьев E.H. Сравнительная характеристика антигенной структуры бактерий рода Brucella: автореф. дис. . канд. мед. наук. — Саратов, 1984. -20 с.

10. Безсмертный В.Е., Горшенко В.В., Попов В.П. К оценке эпидемиологической ситуации по туляремии в Российской* Федерации // Проблемы особо опасных инфекций. 2008. - № 2 (96). - С. 8-12.

11. Современное состояние природный очагов чумы, сочетанных с другими инфекционными болезнями на территории Ставропольского края /I

12. Вельская Н.А., Митина B.C., Вейнблат В.И. Микрометод фракционирования и идентификация белков // Лаб. дело. — 1972. -№ 10. — С. 514-616.

13. Бельская Н.А., Митина B.C., Вейнблат В.И. Микрометод фракционирования и идентификации белков бактерий // Материалы Северо-Кавказской биохим. конф. Махачкала, 1970. - С. 270-271.

14. Благовещенский В.А., Степанченок-Рудник Г.И:, Жулина JI.B. Изучение химического состава экстрактов культур Б.Ц.Ж., подвергшихся обработке ультразвуком, и выделение из них растворимого антигена // ЖМЭИ. 1961. -№3.-С. 17-22.

15. Богоявленская Л.Б. Стандартизация диагностических реагентов на модели О-сальмонеллезных сывороток: автореф. дис. . д-ра биол. наук. М., 1973.-45 с.

16. Васенин А.С., Вейнблат В .И., Самойлова Л.В. О* перекрестном иммунитете против чумы и туляремии // ЖМЭИ. 1980. - № 2. - С. 49-52.

17. Веренинова Н.К., Олли В.Д. К вопросу о стимулирующем действии цистина на рост туляремийного микроба // Тр. ин-та «Микроб». — Саратов, 1951.-Вып. 1.-С. 257-259.

18. Веренинова Н:К., Урода. Л.А. К вопросу об общности антигенов у Y. pestis и F. tularense // Тр. ин-та «Микроб». Саратов, 1951. — Вып. 1. -С. 110-114.

19. Воробьев A.A. Оценка вероятности использования биоагентов в качестве биологического оружия // Эпидемиол. и инф. болезни. — 2001. — № 6. — С. 54-56.

20. Гайдамович С .Я., Клисенко Г.А., Шаноян Н.К. Реакция агглютинации сенсибилизированных антителами эритроцитов вирусом колорадской клещевой лихорадки // Вопросы вирусол. — 1974. — № 2. С. 169.

21. Гайский H.A. Живая туляремийная вакцина // ЖМЭИ. 1944'. — № 12.-С. 14—19.

22. Гайский H.A. Туляремийный'вирус-вакцина, ее получение и применение // Иркут. противочумн. ин-т. 1948. - Изд. 1. - 70 с.

23. Гайский H.A. Туляремийный вирус-вакцина, ее получение и применение // Иркут. противочумн. ин-т. — 1948. Изд. 2. — 11'1 с.

24. Гайский H.A., Эльберт Б.Я. О механизме инфекции, и иммунитета, при экспериментальной туляремии. Сообщ. IL // ЖМЭИ. 1946. — № 12. — С. 37-39. '

25. Гайский.Н.А., Эльберт Б.Я.О механизме инфекции и иммунитета при экспериментальной туляремии. Сообщ. IV // ЖМЭИ. 1946. - № 12. - С. 42.

26. Гофман И.Л. Опыт производственного изготовления сывороток к типовым и групповым антигенам шигелл Флекснера // Кишечные нвоздушнока-пельные инфекции. М., 1969. — С. 511—518.

27. Григорьева Г.И. Мембраны и мембранные белки в сравнительной характеристике стафилококков: автореф. дис. . канд. биол. наук. — Пущино, 1980.-21 с.

28. Гуревич Г.А., Кудрявцев A.A., Фихте Б.А. Инженерно-физические^ аспекты и феноменология процессов дезинтеграции микроорганизмов // Дезинтеграция микроорганизмов: материалы Всесоюзн. конф. по дезинтеграции микроорганизмов. Пущино-на-Оке, 1972.-С. 15-51.

29. Гусева Е.Д., Дудникова Н.С. Туляремия Владимир.: Изд-во ОКНИИ и MC ВНИИЗЖ, 2001. - 40 с.

30. Атлас Природного очага туляремии, степного типа на Северном Ка:вказе / Л.В. Дегтярева, A.B. Антонов, Н.И. Тихенко и др.. Ставрополь, 2005. -— 54 с.

31. Влияние тимических иммуномодуляторов на систему циклических нуклеотидов Т- лимфоцитов селезенки при вакцинации БЦЖ / C.B. Демидов, А.П. Костромин, Е.Ф. Чернушенко и др. // Проблемы туберкулеза: 1990. — № 10.-С. 63-65.

32. Анализ заболеваемости туляремией на территории Российской Федерации в 2001-2004'гг. / Т.Н. Демидова, В.В. Горшенко, В.П. Попов и др. // Сб. науч. тр. кафедры эпидемиологии РМАПО. — 2006. Т.8. — С. 265-273.

33. Анализ эпизоотической ситуации по туляремии на территории Российской Федерации в 2001-2005 гг. / Т.Н. Демидова, И.С. Мещерякова,

34. B.И. Жуков и др. // Материалы IX съезда Всерос. науч.-практич. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. — М.: Санэпидмедиа, 2007. — Т. 3.-С. 167-168.

35. Доморадский И.В. Возбудители пастереллезов и близких к ним заболеваний. -М.: Медицина, 1971. 228 с.

36. Дорофеев K.A. О классификации возбудителя туляремии: сб. науч. работ Читинского института эпидемиол. и микробиол. 1947. - Вып. 1.1. C. 170-180.

37. Егорова Л.С., Дунаев Н.Б. Применение метода флюоресцирующих антител для обнаружения возбудителя туляремии в органах экспериментально зараженных животных // Журн. микробиол. — 1973. — № 10. — С. 135- 136.

38. Получение мембранных стафиллококков и их ферментативная и белковая характеристика / В. А. Ермаченко и др..- М. 1978 г. - С. 74.

39. Ефременко В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. — Ставрополь: Ставрополье, 1996. —131 с.

40. Пат. RU 64784' U1. Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды / В.И! Ефременко, A.JI. Столяров, Э.М. Игуменов и др..-№2006144331/22; 12.12.2006; опубл. 10:07:2007, Бюл. № 19:-2 с.

41. Жарникова И.В: Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей: , автореф. дис. . д-ра биол. наук. Ставрополь, 2004. - 39 с.

42. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс-диагностики различных заболеваний / И.В: Жарникова, И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев и др. // Вестник Российской военно-медицинской академии. — 2008. № 2 (22), приложение, ч. 1. - С. 180-181.

43. Калитина Т.А'. Кожная аллергическая реакция как показатель иммунитета при туляремии: дис. канд. мед. наук. -М;, 1953. 109 с.

44. Каральник Б.В. Научные основы изготовления!эритроцитарных ди~ агностикумовУ/ ЖМЭИ. 1977. - № 4 - С. 29:

45. Каральник Б!В; Теоретическое обоснование принципов стандартизации эритроцитарных диагностикумов // Материалы межинстит. науч. конф. памяти Л.А. Тарасевича. Москва, 1967. — С. 225! ,

46. Каральник Б^В:, ЦаревскийЮ.П., Шамардин В.А. Эритроцитарные белковые диагностикумы. — Алма-Ата: Наука,1982; — 148?с.63:. Карпенко В.В;, Сачков В.Ж Обезболивание животных в эксперименте: метод, рек. М., 1985. — 53 с.

47. Способ стимуляции антителообразования у животных / Е.Г. Кирдей, Н.М. Пинигина, С.Н. Тюменцев и др. // А.С. СССР № 1390836. 1986:

48. Коннова A.M. О полном антигене туляремийного микроба // Тр. Ростов-на-Дону гос. науч.-исслед. противочумного ин-та. 1959. - Т. XI. Вып. 2. — С. 205-215.

49. Корн М.Я; Основные физические представления о люминесценции и методика, исследования препаратов, обработанных люминесцентными сыворотками // Иммунолюминесценция в медицине / под ред. Е. Р: Левиной. М.: Me-1 дицина, 1977.-С. 240: ,

50. Иммуноглобулиновый пенициллиназный конъюгат. для выявления антигена возбудителя туляремии / Д.Ы. Куанбаев, О.Б. Чемиров; Г.А; Темира-лиеваидр. //Лаб. дело.- 1990.-№1.-С. 44-46. .

51. Куделина Р.И, Ананова E.B. Применение иммунофлуоресцентного метода с целью обнаружения; возбудителя- туляремии в развивающихся куриных эмбрионах // ЖМЭИ; 1975; - №10. - С. 18-221

52. Кузнецова Е.М., Шепелев И. А'., Волох О. А. Структурно. функциональная характеристика, основных антигенов! Francisella tularensis // Проблемы особо опасных инфекций;,—2009К—ВыпПОО^—C. 45-49i

53. Курчева G.A. Разработка биотехнологии производства иммунодиаг-ностических препаратов для выявления возбудителя туляремии? // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». 2011. - № 3. - G. 52-55.

54. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы, иммунитета. М.: Медицина, 1985.-255 с. . . .

55. Ларионова Л.В. Химический состав и- некоторые биологические свойства водно-солевого экстракта туляремийного микроба // Актуальные проблемы и задачи биохимии, диагностики и иммунопрофилактики особо опасных инфекций. Саратов, 1991.-С. 106-110.

56. Реакция пассивной гемагглютинации в:реакции нейтрализации антител при некоторых инфекциях / М.И. Леви и др. // ЖМЭИ. 1962. - № 10. -С. 40-45.

57. Методические рекомендации по тактике эпизоотологического обследования природного очага; туляремии Центрального Предкавказья в современных условиях / Б.И: Левченко, Л.В. Дегтярева, Н.И. Тихенко и др.. Ставрополь, 2009. - 24 с.

58. Лопаткин О.Н:, Кронгауз И.В. Получение и изучение чистых вых антител к термостабильным споровым антигенам В: cereus и В. ап1 Профилактика природно-очаговых инфекций: тез. докл. Всесоюзн. науч тич. конф.-1983.-С. 308-310. '

59. Максимов A.A. Природные очаги туляремии в СССР. -- М.; • Изд Академии Наук СССР, 1960. 192 с.

60. Меньшов~Ж№, Шмутёр;М;Ф^ Формалинизация1эритро с пом' . щыо мешалки // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов; 196S>— ^ С. 202-203. ' ■ ! ■ ' '

61. Мещерякова И.С. Туляремия: современная эпидемиология: вакцИнопрофилактика // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2010: ~---. ^1. С. 17-22. • , ; ., . ' :

62. Мещерякова? И.С., Родионова И;В., Кормилицина М:И: П^^гзгогенные микроорганизмы рода Francisella // Материалы науч.-практич. конф»100.лет. образования* противочумной; службы>России. Саратов, — х 21. С. 84-85. :

63. Использование иммуноферментного метода ELISA для1 выявления возбудителя туляремии / И.С. Мещерякова, H.G. Умнова, K.JI. Шаханина и др. // ЖМЭИ. 1988. - № 2. - С. 109-112.

64. Мещерякова И;С. Антигенное строение штаммов туляремийного микроба различной степени вирулентности // Журн. гиг., эпидемиол., микро-биол., иммунол. 1970. - Т. 14, №> 4. - С. 420-429.

65. Мещерякова И.С. Антигены*туляремийного микроба;, их серологическая характеристика и применение в реакции пассивной гемагглютинации: дис. . канд:.мед; наук.- MV19681-134;с:

66. Мирошниченко: М.А. Некоторые эпидемиологические особенности-туляремии в Ставропольском крае// Вопр. эпизоотологии и эпидемиол.: тр. на-уч.-исслед. противочумн. ин-та Кавказа и? Закавказья: Ставрополь: Ставр. правда, 1960. - Вып.4. - С. 149-157.

67. Подъем эпизоотической активности природного очага туляремии степного типа в Ставр01 юльском крас и его эпидемические последствия / A.A. Некрасов и др. // ЖМЭИ. 1985. - № 2. - С. 88-92.

68. Никифоров В.В;, Кареткина Г.Н. Туляремия: от открытия до наших дней // Инф. болезни. 2007. - Т.5^ № 1. - С. 67-76;.

69. Проблемы эпизоотологического надзора за природными очагами туляремии/ H.JI; Новиков, В;П. Попов, В.И. Жуков и др. // Материалы IX съезда ВОЭМП-М.,2003.-Т. 3. С. 210-211.

70. Носков Ф^С. Флуоресцирующие антитела и их применение в вирусологии // Респираторные вирусные инфекции. JI;, 1969. — С. 217-242.

71. Об итогах работы Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в 2005 году и задачах на 2006 г. -М., 2006.-С. 42-43.

72. Олсуфьев Н.Г. Современное состояние и перспективы развития исследований по »природной-очаговости туляремии // Природно-очаговые болезни человека. -М., 1979. С. 41-46.

73. Олсуфьев Н.Г., Емельянова О.С. Об антигенной структуре Bacterium tularensis Me Coy and Chapín // Журн. гиг., эпидемиол., микробиол. и иммунол. -Прага, 1957. -№ 1.-С. 305-314.

74. Туляремия / под ред. H.F. Олсуфьева, Г.П. Руднева. М.: Медгиз, 1960: — 460 с.

75. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М:: Медицина, 1975.-416с.

76. Онищенко Г.Г. Борьбам инфекционными болезнями! — приоритетная тема председательства Российской* Федерации на саммите «Группы восьми»-в 2006 г. // ЖМЭИ. 2006. - № 7. - С. 3-7.

77. Онищенко FX. Меры по- противодействию биологическому терроризму в Российской Федерации // ЖМЭИ. 2005. - № 4. - С. 33-37.

78. Онищенко Г.Г. Инфекционные болезни — важнейший фактор биоопасности»// ЖМЭИ. 2003. - № 3. - С. 4-16.

79. Онищенко Г.Г. Контроль и ликвидация' инфекционных заболеваний — стратегическое направление здравоохранения // ЖМЭИ. 2002. — №-4. — С. 3-16:

80. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др.. -М.: Мир, 1997. С. 86, 112, 147.

81. Остерман JI.A. Очистка иммуноглобулина типа IgG // Исследованиебиологических макромолекул электрофокусированием; иммуноэлектрофорезомсiи радиоизотопными«методами. Иммуноэлектрофорез*. М.: Наука, 1983. - Ч. П -С. 107-109.

82. Павлова И.Б., Мещерякова И:С., Емельянова О.С. Изучение ультратонкой структуры двух географических разновидностей туляремийного микро— ба различной степени вирулентности // Журн. гиг., эпидемиол., микробиол. иммунол. 1967. - Т. 11, №*3. - С. 290-296.

83. Видо- и родоспецифические антигенные эпитопы липополисахариг дов Francisella tularensis / H.B. Павлович, H.B. Аронова, H.H. Оноприенкс и др. // Мол. ген. микробиол. вирусол. 2000. - № 3. - С. 7—12.

84. Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н. Фосфатазная и. пенициллиназн; активности, как, стабильные признаки* для дифференциации расовой принад^ лежности Francisella tularensis // ЖМЭИ. 1992. - № 11-12. - С. 5-7.

85. Пашов Т.В. Эпизоотология туляремии свиней и дифференциальна диагностика туляремии5 и бруцеллеза // Докл. Всесоюзн. ордена Ленина акад сельхоз. наук им. В:И. Ленина. — 1950. — № 7. — С. 19-22.

86. Плавильщиков H.H. Определитель Насекомых. Краткий определитель наиболее,распространенных насекомых Европейской* части России. — М.: 'Гопикал, 1994. 544 с.

87. Померанцев Б.И. Паукообразные иксодовые клещи (Ixodidae). Фауна СССР. М.; Л.: Из-во Академии наук, 1950. - Т. IV, Вып: 2. - 223 с.

88. Практическая химия белка / пер. с англ. / под ред. А. Дарбре — М: Мир, 1989.-С. 22-23.126: Приказ Министерства Здравоохранения РФ от 14.04.1999 г. № 125. Об усилении мероприятий по туляремиш -Mi, 1999:!

89. Приказ МЗ СССР № 1179 от 10 октября* 1983 г. Об. утверждении нормативов затрат, кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения. — М., 1983.

90. Родионова И.В. Сравнительное биохимическое исследованиенекот-рых ферментных систем и антигенных комплексов географических рас туляре-мийного микроба: автореф. дис: . канд. мед. наук.-М., 1967. 19 с.

91. Родионова И.В., Захаренко В.И. Антигенный состав белков наружной мембраны туляремийного микроба // Мол. ген., микробиол. и вирусол. — 1990. — № 11.-С. 8-16.

92. Родионова И.В., Шипицина Г.К. Иммунохимичекая характеристика двух географических разновидностей туляремийного микроба // Биохимия. — 1967. Т. 32, № 6. - С. 1161-1168.

93. Романова-JI.M". Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики: автореф. дис. . докт. биол. наук. — Ставрополь, 2008. — 36 с.

94. Скопинская С.Н., Ярков С.П., Храмов E.H. Применение липосомаль-ного иммуноанализа для выявления антител к возбудителям^ туляремии, холеры, брюшного тифа, сапа? и мелиоидоза // Пробл. особо4 опасн. инф. — 2007. — №2 (94).-С. 67-71.1

95. Скуч-Д., Уест Д.Основы аналитической химии. М.: Мир, 1979-— Т. 1.-С. 71-73.

96. Научные основы* производства'диагностических препаратов (Сыворотки для идентификации энтеробактерий) / В.В. Смирнов, В.Я. Чаплинский, З.М: Андреева и др. Киев: Наукова« Думка, 1980: - 195с.

97. Станиславский Е.С. Бактериальные структуры и'их антигенность. — М.: Медицина, 1971. 220>с.

98. Суворов'C.B., Вольферц A.A., Воронкова М.М. Чумоподобные лим-фодениты в районе Астрахани // Вестн. микробиол., эпидемиол. и паразитол. — 1928. T. VII, Вып. 3. - С. 293-299.

99. Суворов C.B., Вольферц A.A., Воронкова М.М.' Чумоподобные лимфадениты в низовьях Волги летом 1926 г. // Тр. I Всесоюзн. противочумн. со-вещ., 1927. Саратов, 1928. - С. 90-101.

100. Сухарь В.В". Гликолипидный состав штаммов Francisella tularensis различной степени аттенуации // Микробиол. журн. — 1993. № 55 (1). — С. 8—12.

101. Сухарь,В.В. Изучение антигенного состава некоторых штаммов туляремийного микроба. Сообщение II // Журн. микробиол. 1966. - № 8. -С. 104.

102. Сухарь B.B. Химическая и биологическая характеристика антигенов туляремийного микроба: автореф. дис. . канд. мед. наук. — Ростов-на-Дону, 1988.- 18 с.

103. Сухарь В.В., Непомнящая Н.Б. Липополисахаридный 0-а.нтиген Francisella tularensis // ЖМЭИ. 2009. - № 5. - С. 110-113.

104. Сучков Ю.Г., Канатов Ю.В. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов иммунными гамма-глобулинами // Журн. микробиол. — 1965. -№ 8.- С. 63.

105. Сырова H.A., Терешкина З.Я., Девдариани З.Л. Современное состояние иммунодиагностики туляремии // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов, 2008. Вып. 97. - С. 12-15.

106. Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П. Методы статистической обработки результатов серологических реакций // Журн. микробиол. 1969. -№ 10.-С. 26-31.

107. О полном антигене туляремийного микроба / И.С. Тинкер, A.M. Дрожевкина, A.M. Коннова и др. // Тр. Астраханской противочумной станции. 1955. - Вып. I. - С. 135-149.

108. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявлениявозбудителей особо опасных и других инфекций: автореф. дис. . д-ра мед. наук. Ставрополь, 1996. - 57с.

109. Разработка рациональной биотехнологии получения диагностических иммунных сывороток / И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, Е.В. Жданова и др. // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. — .N® 2 (22), приложение, ч. 1. — С. 210-211.

110. Фихте Б.А. Дезинтеграция микроорганизмов. Задачи и перспективы // Дезинтеграция микроорганизмов: материалы Всесоюзн. конф. по дезинтеграции микроорганизмов. Пущино-на-Оке, 1972. — С. 5—14.

111. Фонталин JI.H., Певницкий Л.А. Иммунологическая толерантность. —1. М., 1978.-282 с.t

112. Хавинсон В.Х., Мороз В.Г. Тималин — иммуномодулирующий препарат из тимуса // Тимус и его влияние на организм. — Томск: Изд-во Томского университета, 1982. С. 201-203.

113. Хатеневер Л.М., Грунтфест М.Ю. Серологическая характеристика материала туляремического очага и получение агглютинирующих F. tularesnsis сывороток // ЖМЭИ. 1934. - № 2. - С. 76-80.

114. Изучение биохимических, антигенных и протективных свойств внешней мембраны возбудителя туляремии / B.C. Хлебников, И.Р. Головлев, Д.П. Кулевацкий и др. // Мол. ген., микробиол. и вирусол. — 1991. — J^ 7. — С. 15-20.

115. Определение антигенной детерминанты превентивных моноклональ-ных антител, специфичных к липополисахариду Francisella tularensis / B.C. Хлебников и др. // Микробиол. журн. 1993. — № 1. - С. 83-87.

116. Черепахина И.Я., Козловский В.Н., Ефанова Е.А. Динамика образования антител к вакцинному штамму Francisella tularensis при различных схемах иммунизации // Микробиол. журн. 1990. - Т. 52, № 2. - С. 89—93.

117. Цыбин Б.П., Таран И.Ф. Оценка диагностических свойств бруцеллезного антигенного эритроцитарного диагностикума // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1976. - Вып. 6 (52). - С. 26-30.

118. Шамардин В.А., Каральник Б.В. Способ получения эритроцитарного диагностикума // АС СССР, № 634749 от 11.07.77, Б.И. № 44, 1978.

119. Шаханина K.JI. Иммуносорбенты и их использование для выделения чистых антител // Биохим. и биофиз. микроорганизмов. — Горький, 1981. — Вып. 9.-С. 15-23.

120. Шаханина K.JI. Методы контроля и стандартизации люминесцирую-щих антител // Люминесцирующие антитела (в изучении патогенных микроорганизмов). М.: Медицина. - 1972. - С. 31—49.

121. Шаханина К.JI. Современные методы приготовления люминесци-рующих сывороток // Иммунологический анализ. М.: Медицина. - 1968. -С. 202-223.

122. ПТварцман Я.С., Синицын В.А. Реакция непрямой гемагглютинации (обзор литературы) // ЖМЭИ. 1961. - № 9.- С. 97-102.

123. Ультразвуковая дезинтеграция бруцелл / Н.Г. Шин, и др. // Изв: А. Н. Каз. ССР. Сер. биол., 1973. -№ 1. - С. 68-71.

124. Шипицина Г.К. О корреляции химического-* состава специфических веществ туляремийного микроба и его вирулентности // Изменчивость микроорганизмов и бактериология: тез. докл. конф. — М., 1958. — С. 63-641

125. Шипицина Г.К., Емельянова О.С. О зависимости между химическим составом специфических веществ туляремийного микроба и вирулентностью культуры // Докл. АН СССР, 1956. Т. 109, № 2. - С. 365-368.

126. Шипицина Г.К. О химическом составе антигенных веществ возбудителя туляремии. ДАН СССР, 1955.-Т. 105, №2. -С. 315-318.

127. Шипицина Г.К. Химический состав и биологические свойства антигенного комплекса возбудителя туляремии: автореф. дис. . канд. биол. наук. — М., 1955.-10 с.

128. Штибен В.Д., Бабич И.К. Определитель бактерий, патогенных для человека. М:, 1955. - 546 с.

129. Шторц X. Иммунофлуоресценция // Иммунологические методы. -М.: Медицина, 1987. С. 128-148.

130. Штуцер М.И. Отдифференцировании бруцеллеза^(мальтийской лихорадки-и туляремии) при помощи кожной реакции // ЖМЭИ. — 1936. — Т. XVII, №2.-С. 184-187.

131. Эльберт Б.Я., Гайский H.A. О механизме инфекции и иммунитета при экспериментальной туляремии. Сообщ. I // ЖМЭИ. -1941. —№ 12. С. 35-37.

132. Эльберт Б.Я., Гайский H.A. О механизме инфекции и иммунитета при экспериментальной туляремии. Сообщ. III // ЖМЭИ. — 1941. — № 12. -С. 39-41.

133. Эльберт Б.Я., Гайский Н.А. О механизме инфекции и иммунитета при экспериментальной туляремии. Сообщ. V // ЖМЭИ. 1941. — J4fe 12. — С. 42-^45.

134. Эльберт Б.Я., Гайский Н.А. О механизме инфекции и иммунитета при экспериментальной туляремии. Сообщ. VII // ЖМЭИ. 1941. — JSfe 12- — С. 47-49.

135. Эльпинер И.Е. О механизме действия ультразвуковых волн микроорганизмы // Микробиология. — 1955. Т. 24. - Вып. 3. — С. 371—381.

136. Использование микроточечного 5 иммуноферментного-анализа. с визуальной индикацией для определения туляремийных антител / С.В. Юров, С.Ю. Пчелинцев, С.С. Афанасьев и др:. ЖМЭИ. - 1991. - № 3. - С. 61--64.

137. Prairie dog to human tularemia transmission, Texas 2002 / S. .¿^rvashia,i

138. J.M. Petersen, C. Lindy et al. // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol. 10. - P. 483-486.

139. Avrameas S.M., Ureal J'. Methode de marquage d antigene et d amrtiicorps avec des enzymes et sons application en* immunodiffusion // C. R. Acad. Sci CD)- — 1966. Vol. 2. - №-26. - P. 2543-2545.

140. Avrameas S.M. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehy«<zie: iase of the conjugates for detections of antibodies // Immunochemistry. 1969. —^ V-ol. —■ № 1. — P. 43-52.

141. Detection of diverse new Francisella like bacteria in enviror3r^ca.exital samples / S.M. Barns, C.C. Grow, R.T. Okinaka et al. // Appl Environ. Micrcz^>t>iol- — 2005. - Vol. 71, № 9. - P. 5494-5500.

142. Studies on the immunization of white mice against infections with Bacterium tularense / J.F. Bell, C.L. Larson, W.C. Wicht et al. // J. Immunol. 1952. — Vol. 69.-P. 515-524.

143. Field detection of Francisella tularensis / B. P. Berdal, R. Mehl, H. Haa-heim et al. // Scand. J. Infect. Dis. 2000. - № 32 (3). - P. 287-291.

144. Bergey D.H. Berrgey's Manual of Determinative Bacteriology. — 1936; 1948; 1957.

145. A reveas immunodiffusion assay for antibody protein concentration in antisera or conjugates to human IgG / E.H. Beuntner et al. // Standartization in immunofluorescence. Oxford. : Blackwell Scientific Publ, 1970. - Pat. 2. - P. 165-169.

146. Bevander L., Maeland J.A., Naess A.I. Agglutinins and antibodies to F. tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia // J. Clin Microbiol. 1988. - № 26. - P. 433-437.

147. Boyden S.V. The adsorption, of proteins treated with tannic acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera // J. Exp. Med.-1951. № 93. — P. 107— 120.

148. Carlisle H.N., Hinchliffe V., Saslaw S. Immunodiffusion studies with Pas-teurella tularensis antigen rabbit antibody systems // J. Immunol. - 1962. - Vol. 89. -P. 638-644.

149. Center for Disease Control and Prevention. Tularemia. United States. 1990-2000 // Morb. Mortal Wkly Rep. - 2002. - Vol. 51. - P. 182-184.

150. Assembly of type IV pili in Francisella tularensis and role in virulence / S. Chakroborty, M. Monfett, T.M. Maie et al. // Tularemia Meeting Abstract. MBL Marin biological Laboratory. USA, 2006. - P.SC.

151. Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus // J. Gen. Virol. — 1977. Vol. 36, № 3. - P. 475—483.

152. Coons A.H., Kaplan M.H. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. 1950.-V. 91, № l.-P. 81-89.

153. Cowlay S.C., Myltseva S.V., Nano F.E. Phase variation in Francisella tularensis affecting intracellular growth, lipopolysaccharide antigenicity and nitric oxide production // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 20 (4). - P. 867-874.

154. Immunohistochemical demonstration of Francisella tularensis in lesions of cats with tularemia / B.M. DeBey, G.A. Andrews, M.C. Chard-Bergst et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 2002. - Vol. 14 (2). - P. 162-164.

155. Tularemia as biological weapon: medical and public health management / D.T. Dennis, T.V. Inglesby, D.A. Henderson et al. // JAMA, 2001. № 285. -P. 2763-2773.

156. Downs C.M., Bond G.C. Studies on the cultural characteristics of Pasteu-rella tularensis // J. Bacteriol. 1935. - Vol. 30, № 5. - P. 485-490.i

157. Eigelsbach H.T., McGann V.G. Genus Francisella // Bergey's manual of systematic bacteriology / Eds. N.R. Krieg, J.G. Holt- Baltimore, 1984. Vol. 1. — P. 394-399.

158. Fomsgaard A. Antibodies to LPS: some diagnostic and protective aspects // AMPIS Suppl. 1990. - №-18. - P. 1-38.

159. Francis E., Evans A.C. Agglutination, cross-agglutination and agglutinin absorption in tularemia // Publ. Health Rep: 1926. - Vol. 41. - P. 1273-1295. .

160. Francis E. Fermentation of sugars by Bacterium tularensis // J: Bact. — 1942. Vol. 43, № 3. - P: 343-346:

161. Problems in identification of Francisella philomiragia associated'with fatal bacterimia in patient with chronic granulomatous disease / A. Friis-Moller et al. // J. Clin Microbiol: 2004. - Vol. 42, № 4. - P. 1840-1842.

162. Production and character ization of lipopolysaccharide of F. tularensis / M. Fulop,* T. Webber, RJ. Manchee et al. // J. Clin Microbiol! 1991. - № 29 (7). -P.1407-1412.

163. Fulthorpe A.M. Tetanus antitoxin titration by haemagglutination // J-. Hyg. -1957.-Vol. l.-P. 46.

164. Gaspar A. J., Tresselt H.B*, Ward M:K. New solid medium for enhanced growth»of Pasteurella tularensis // J. Bact. 1961. - Vol. 82. - P. 564-569.

165. Gijs M.A. Magnetic particle handling Microsystems for miniaturized analytical applicatons // Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol'. Soc. 2007. - P. 4088-4089.

166. Gil H., Benach J.L., Thanassi D.G. Presnce of pili on the surface of Francisella tularensis // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 3042-3047.

167. Goldman M. Fluorescent antibody method // New York, 1968.- 242 p.

168. HuelsewefoB:, .EhrictitRI, MarschallTL Ji As simple andirapidlproteihsarray based method for the simultaneous detection of biowarfare agents // Proteomics. — 2006. Vol. 6 (10). - P. 2972-2981

169. Biofilm Formation by Francisella tularensis / Ph. Ireland; M.S. Lever, R.W. Titball et al. // Tularemia Meeting Abstract. MBL Marin biological laboratory. USA, 2006. -P. 219A.

170. GomparativeAnalysisofPCRversusCulture for Diagnosis of Ulcerogla-dular Tularemia / A. Johansson, L. Berglund, U. Eriksson? et al;. // J; of clinical microbiology.-2000:-Voh 38, №1.-P: 22-26.

171. Magnetic monosized polymer for fast and specific fractionation:of humen mononuclear cells / T. Lea et al. // Scand. J: Immunol. 1985. - Vol. 22, № 21 -P. 207-216.

172. Maurer H: (Maypep Г.) Диск-электрофорез. Теория и; практика электрофореза в полиакриламидном геле. М.: Мир, 1971. - 248 с.

173. Мс Coy G.W. A-plague-like disease of rodents // Pub. HealthBull. 1911'. -№43.-P. 53-71.238: Mc Coy G.W., Chapin C.W. Bacterium,tularense the cause of plague-like disease of rodents // Pub. Health Bull: 1912. - № 53. - Pi 17 -23.

174. Mizuhara M. Relationship between terminal oxidation: systems and« virulence of Pasteurella tularensis // Jinsen Igaku. 1961. - Vol. 16. - P. 855.

175. Mollaret H., Knapp W. Report (1966-1970) of the Subcommitee on Pasteurella, Yersinia and Francisella of the International Committee on nomenclature ofI

176. Bacteria//Int: J: systemBäct: 1971. -Voll 21. -PI 1571

177. Immunochemical characterisation of Brucella lipopolysaccharides and polysaccharides / E. Moreno, S. Speth, L.M. Jones etal. // Infect Immun. — 1981. -Vol. 31, № 1. P. 214-222.

178. Ormsbee R., Bell F., Larson C.L. Stadies of Bacterium tularense antigens. I. The isolation, purification and biologic activity of antigen preparations from Bacterium tularense//J; Immunol. 1955. - Vol. 74, № 5. - P. 351-358.

179. Ormsbee R., Larson C.L. Stadies on Bacterium antigens. II. Chemical and physicaf characteristics of protective antigen preparation// J. Immunol. 1955. -Vol. 74, № 5. - P. 359-370.

180. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gel // Arkiv for Kemi. Mineral. О Ged. 1949. - Vol. 261, № 14. - P. 1-9.

181. Parnas J. (Парнас Ю;) Антигенные и иммунологические взаимоотношения между бруцеллами и F. tularensis // Здравоохранение Белоруссии. — 1967. № 7. — С. 56-57.

182. Parnas J., Burdzy K., Cegielko M. Studies on the antigenic structure of Pasteurella tularensis with the aid of gel precipitation and Electrophoresis // Bull. Acad. Pol. Sci. Biol. 1961. - V. 7. - P. 295-298.

183. Parnas J., Burdzy K., Cegielko M. Dalsze badania nad budowa antigeno-wa paleczek Brucella brucei i Pasteurella // Acta Microbiol. Pol. 1962. - Vol. II. -P. 33-42.

184. Evaluation of primary binding assays for presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in argentina / P.S. Paulo et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. -2000. Vol. 7 (5). - P. 31-828.

185. Peruski A.H., Peruski L.F. Immunological methods for detection and identification of infectious disease and biological warfare agents // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003 -Vol. 10, № 4. - P. 506-513.

186. Peruski A.H., Johnson 3rd L.N., Peruski L.F.Jr. Rapid and sensitive detection of biological warfare agents using time-resolved fluorescence assay // J. Immunol. Methods. -2002. Vol. 263, № 1-2. - P. 35-41.

187. Petersen J.M., Schriefer M.E. Tularemia: emergence/re-emergense // Vet. Res. 2005. - Vol. 36, № 32. - P. 455-467.

188. Novel modification of lipid A of Francisella tularensis. / N.J. Phillips, B. Schilling, M.K. McLendon et al. // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72, № 9. -P. 5340-5348.

189. Poison A., Potgieter G.M., Largier J.E. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weigh // Biochem. Biophis. Acta. — 1964. -Vol. 82.-P. 463—475.

190. Role of wbt locus of Francisella tularensis in lipopolysaccharide O-antigen biogenesis and pathogenicity / C. Raynand, K.L. Meibom, V.A. Lety et al. // Infect. Immun. 2007. - Vol. 75, № 1. - P. 536-541.

191. Characterization and sequencing of respiratory burst-inhibiting acid phosphatase from Francisella tularensis / T.J. Reily, G.S. Baron, F. Nano et al. // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271, № 18. - P. 10973-10983.

192. Characterization of recombinant Francisella tuiarensis acid phosphatase A / T.J. Reily, R.L. Felts, M.T. Henzi et al. // Protein Exp. Purif. 2006. - Vol. 145. -P. 134-141.

193. Ribeiro M.A., Romero E.C., Brandao A.P. Evaluation of diagnostic test for human leptospirosis//Draz. J. Med. Biol. Res. 1996. - Vol. 29, № 8.-P. 773777. ; '

194. Ribi E., Shepard C. Morphology of bacterium tularens during its growth cycle in liquid medium as revealed by the electron microscope // Exp. Cell: Res. — 1955. Vol. 8. - P. 474-487.

195. Public health assesment of potential biological terrorism agents / L.D. Rotz et al. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8. - P. 225-230.

196. Characterization and classification of strains of Francisella tuiarensis isolated in the Central Asian focus of the Soviet Union and; in Japan / G. Sandstrom, A. Sjostedt, M. Forsman etal;. // J; Clin. Microbial; 1992. - Vol. 30, № 1. -P. 172-175. ' '

197. Sjostedt A. Virulence, determina and protective antigens of Francisella tuiarensis // Curr. Opin. Microbiol. 2003. - № 6. - P. 66-71.

198. Slcrodzki E. Characterystyka szczepow B. tularense wyhodowanych w Polsce w latach 1952-1953 // Biuletin Inst. Med: Morskiej w Gdañsku. 1957. Vol. VIII ('/4). — P. 51-56.

199. Smith K.O., Gehl W.D. Magnetic transfer devices for use in solid-phase radioimmuno assays and enzym-linked immunosorbent assay // J. Infect. Diss. — 1977. Vol. 136. - P. 5328-5336.

200. Diagnostic procedures in tularemia with special focus on molecular and immunological techniques / W.D. Splettstoesser, H. Tomaso , S. A1 Dahouk et al. // J. Vet. Med. Infect. Dis. Vet. Public. Health. 2005. - Vol. 52, № 6. - P. 249-261.

201. Stavitsky A.B. Haemagglutination and haemagglutination-inhibition reactions with tannic acid and bis-diazotired benzidine-protein-conjugated erythrocytes-// Immunological Methods / Ed. J.F. Ackroyd - Oxford. - 1964. - 363 p.

202. Steibuch G., Andran R. The isolation of IgG from imanalion serra with the acid of capr,ilic // Arch. Of Biochem. Stray and Biophys. 1969. - Vol. 139. — P. 279-284.

203. Protein heterogeneity of Francicella tularensis: detection of proteins with antigenic determinants. / J. Stulik, J. Gerna, H. Kovarova et al. // Folia-microbial. -Praha, 1989. № 34 (4). - P. 316-323.

204. Evolution^ of subspecies of Francisella tularensis / K. Svensson, P: Lars-son, D. Johansson*et al. // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187, № 11. - P. 3903-3908:

205. Tarnvik A\y Priebe H.S., Grunow R. Tularemia'in Europe: an epidemiological overview // Scand. Ji Infect. Dis. 2004. - Vol. 36, № 5. - P: 350-355."

206. Titball R.W., Johansson A., Forsman M. Will the enigma of Francisella tularensis virulence soon-be solved ? // Trends in Micro biology. — 2003. — Vol. 11, №3.-P: 118-128.

207. Thomson N., Cerdeno-Tarraga A., Bentley S. Massive attack // Nat. Rev. Microbiol. 2005. - Vol. 3, № 8. - P. 586-587.

208. Vidziunaite R., Mikulskis P., Kulis J: Ghemiluminescent immunoassay (CLIA) for the detection of brucellosis and'tularemia antigens // J. Biolumim Chemi-lumin. 1995. Vol. 10, № 4. - P. 199-203.

209. Vinogradov E., Perry M.B., Conlan J.W. Structural analysis of Francisella tularensis lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol. 269. - P. 6112-6118.

210. Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisation des Garugster-ments Enolase // Biochem. Z. 1941. - Vol. 310. - P. 384-421.

211. Weber R., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis // J-. Biol. Ghem. — 1969. -Vol. 244. 16. -P. 4406-4412.

212. Weinbach R. Die Verwendbarkeit formolbehandelfer Erythrocyten als Antigentrager in der indirecten Haemagglutinatin // Schweiz. Z. Allg. Path. 1959. -Vol. 22.-P. 1.

213. Weller T.H., Coons A.H. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagated in vitro // Proc. Soc. Exp. Biol. 1954. -Vol. 86.-P. 789-794.

214. An outbreak of Francisella tularensis in captive prairie dogs: an immuno-histochemical analysis / N.S. Zeidner et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 2004. -Vol. 16, №2.-P. 150-152.