Разработка и исследование спектрометров и биосенсорных аналитических устройств на принципе оптического кругового дихроизма с использованием биодатчиков на основе наноконструкций ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.05, кандидат наук Чулков, Дмитрий Петрович

• Чулков, Дмитрий Петрович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Чулков, Дмитрий Петрович

Содержание

Стр.

Введение

Глава 1. Разработка и исследование портативного полифункционального дихрометра (СКД-2МУФ)

1.1. Принцип работы дихрометра

1.2. Описание оптической системы дихрометра

1.3. Система регистрации дихрометра

1.4. Программное обеспечение дихрометра

Глава 2. Калибровка спектрометров кругового дихроизма с помощью полимерных оптически активных материалов

2.1. Актуальность проблемы и постановка задачи

2.2. Полимерные оптические активные материалы

2.3. ПОАМ как вторичные стандарты оптической активности

Глава 3. Разработка и исследование компактных одноволновых дихрометров70

3.1. Компактный одноволновый дихрометр (СКД-4)

3.2. Компактный одноволновый дихрометр (СКД-4М)

3.3. Программное обеспечение компактного дихрометра

3.4. Многофункциональная аналитическая система для определения характеристик КД ПОАМ

Глава 4. Разработка и исследование биосенсорных аналитических систем на основе разработанных дихрометров и ДНК-биодатчиков

4.1. Оптический биосенсор на основе полифункционального дихрометра и определение гепарина

4.2 Оптический биосенсор на основе полифункционального дихрометра и измерение концентрации дауномицина

4.3 Оптический биосенсор на основе одноволнового дихрометра

Заключение

Список сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов

Список литературы

Список рисунков

Список таблиц

Список формул

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и исследование спектрометров и биосенсорных аналитических устройств на принципе оптического кругового дихроизма с использованием биодатчиков на основе наноконструкций ДНК»

Введение

Наша жизнь диктует возрастающую с каждым годом необходимость разработки новых методов и приборов медицинской и экологической диагностики, контроля качества потребляемых продуктов питания, лекарственных препаратов для высокочувствительного и одновременно экспрессного определения в них опасных для здоровья и жизни соединений, "мишенью" которых является генетический материал клетки. К таким соединениям (генотоксикантам) относятся антибиотики, противоопухолевые и другие лекарственные препараты, тяжелые металлы, диоксины, наночастицы и т.п. соединения, которые следует определять в физиологических жидкостях (плазма крови, урина, вода и т.п.).

Решение этой проблемы традиционными методами и с помощью традиционной аналитической аппаратуры затруднено тем, что такое определение является процедурой дорогостоящей, требует значительного времени (сутки), необходимое оборудование стоит многие десятки тысяч долларов, работать на нем должен высококвалифицированный персонал, а чувствительность и избирательность определения биологически активных и токсичных соединений (БАС, или генотоксикантов) оказываются не всегда достаточными. По этой причине создание альтернативных экспрессных методов анализа биологических жидкостей и портативной высокочувствительной аналитической аппаратуры является исключительно важной и актуальной задачей.

Альтернативу традиционным методам составляют биосенсорные методы анализа, использующие чувствительные элементы (биодатчики) в комбинации с различного рода преобразователями. Биосенсорные технологии не обязательно лучше, чем не-биосенсорные методы, но тесная комбинация продуцирования сигнала и его детекции, возможность миниатюризации открывают новые широкие области их применений - это мониторинг непосредственно у постели больного, возможность быстрого, «он-лайнового» контроля качества фармпрепаратов, продуктов питания, в биотехнологической промышленности -

контроль и оптимизация технологических процессов, в экологическом мониторинге - обнаружение токсичных веществ немедленно, без доставки проб в лабораторию.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что большая часть коммерчески доступных в настоящее время биосенсорных аналитических устройств (биосенсоров) создана на основе ферментов. Однако развитие биосенсорики и биомедицины и решаемые в их рамках аналитические задачи расширяют горизонты для создания нового поколения биодатчиков, например, на основе молекул биополимеров, обладающих широкими аналитическими возможностями.

В последнее время большое внимание привлекает применение в биосенсорике оптически активных структур на основе частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК (далее ХЖКД ДНК, DNA cholesteric liquid-crystalline dispersion, или DNA CLCD), получаемых методом «фазового исключения» жестких линейных нативных двухцепочечных молекул ДНК низкой молекулярной массы (< 1-Ю6 Да) из водно-солевых растворов, содержащих нейтральные синтетические полимеры, в частности, полиэтиленгликоль (далее ПЭГ, или PEG). Такие частицы ХЖКД ДНК называют также «жидкокристаллические наноконструкции ДНК» («жидкие» НаК ДНК, liquid-crystalline nanoconstructions based on DNA, или DNA LC NaC) [1].

Особенности указанных выше частиц «жидких» НаК ДНК (Рис. 1) состоят в следующем:

1) полимер не входит в состав образующихся частиц «жидких» НаК ДНК;

2) для частиц «жидких» НаК ДНК характерно сохранение химической реакционной способности структурных элементов (азотистых оснований и других), высокая локальная концентрация молекул ДНК (до 400 мг/мл) и упорядоченное расположение соседних молекул ДНК;

Пары оснований

Сахара-фосфатные

Лпя

Б-20А

Один вэ слоев, образованных молекулами ДНК (для молекулярного упорядочения требуется осмотическое давлениерастворителя)

Если поляризованный свет проходит вдоль о си холестерической жидкокристаллической структуры ДНК, в спектре кругового дихроизма (КД) в области поглощения ДНК появляется интенсивная (аномальная) полоса

Двухцепочечиые (дц) молекулы ДНК в водно-солевом растворе

Наночастица холестерической жидкокристаллической дисперсии (жкд) ДНК; Диаметр - 10ЭА; N -10* молекул ДНК; Р - период спиральной холестерической закрутки. Молекулы полимера не входя т в состав частицы ХЖКД.

1. Спектр КД линейкой ДНК (В-формы) 2. Спектр КД жкд ДНК

Образование ХЖКД приводит к пространственной закрутке соседних слоев из молекул ДНК НК) и сопровождается появлением аномальной отрицательной (в случае ДНК) и положительной для РНК) полосы в спектре КД, расположенной в области поглощения азотистых оснований НК

Рис. 1. Схема формирования холестерической жидкокристаллической дисперсии (ХЖКД) ДНК (ДНК-биодатчика) и появления аномального сигнала кругового

дихроизма (КД) [2]

3) для частиц «жидких» НаК ДНК характерна спирально-закрученная («холестерическая») пространственная структура соседних слоев молекул ДНК, формирование которой сопровождается появлением оптической активности, проявляемой, в частности, в виде интенсивной (аномальной) полосы в спектре кругового дихроизма (КД) в области поглощения хромофоров ДНК (X ~ 270 нм) [2,25]. Стабильная амплитуда указанной аномальной полосы в спектре КД характеризует наличие спирально-закрученной пространственной структуры частиц «жидких» НаК ДНК.

Высокая локальная концентрация ДНК и «жидкостной» характер упаковки соседних молекул создают условия для быстрой диффузии разных химически и биологически активных соединений (далее БАС) в структуру частиц «жидких» НаК ДНК и их взаимодействия с ДНК. При этом некоторые соединения

образуют связи между парами оснований ДНК, а также могут встраиваться (интеркалировать) между ними, другие соединения, например, фиксируются вдоль сахарофосфатных цепей ДНК или другим образом. При этом любое взаимодействие БАС с ДНК отражается в спектре КД частиц «жидких» НаК ДНК, что позволяет установить способ фиксации молекул-«гостей» в структуре ДНК [2].

В частности, взаимодействие соединений-интеркаляторов с молекулами ДНК, образующими частицы «жидких» НаК ДНК, сопровождаемое встраиванием молекул интеркаляторов между парами оснований ДНК, приводит к появлению в спектре КД дополнительных аномальных полос КД в области поглощения хромофоров интеркалятора, интенсивность которых прямо связана с их концентрацией (Рис. 2).

ДЮРИЧГ»км (ЯШ* м-!?» ВИг.М т Чихотж-Иш

0 »¡».¡ихомо!» чтм имея!

1 Ц4ИЙ» ошм >« 21 *м

* ^ ; г»»»»™«-»!*«»**«

ЧУ

А - первоначальная ЖКД ДНК (170 мг/мл ПЭГ; 03 М КаС1;

0,01 М Иа-фосфатный буфер; рН 6.8)

В - после добавления порфина (С - 5.3х1(И М)

С- после добавления порфина и мнтоксянтрона (С 9.5x10 ' М)

НМ

300 350 400 450 500 550

600

650 700

Рис. 2. Спектр кругового дихроизма ЖКД ДНК, обработанной двумя соединениями, интеркалирующими между парами оснований ДНК и поглощающими свет на

разных длинах волн [2,3]

Спектральные особенности этих полос: знак, амплитуда и положение

максимума регистрируемого спектрометром сигнала КД, фиксируемые при

определенных условиях получения этого сигнала, также стабильны и характеризуют свойства частиц «жидких» НаК ДНК и комплексов «ДНК-интеркалятор».

Напомним, что круговой дихроизм возникает в результате преимущественного поглощения света одной поляризации со спирально-закрученной структурой хирального вещества или его асимметрическим центром. Плоскополяризованный свет можно представить состоящим из двух векторных циркулярно-поляризованных компонент, одна из которых закручена вправо (Ы) и поляризована в направлении движения по часовой стрелке, а другая - закручена влево (Ь), т.е. поляризована в направлении, противоположном ее движению. Компоненты с левой и правой круговыми поляризациями могут по-разному поглощаться при прохождении плоскополяризованного света через оптически активный образец. В этом случае возникает разность Де в коэффициентах экстинкции е для векторов с правой и левой круговыми поляризациями Де = - которую и называют круговым дихроизмом. Величина КД связана с поглощением вещества (оптической плотностью) А простым соотношением Де = (Ая - Аь)/(с1), где с - концентрация вещества (М/л); 1 - толщина кюветы (см). Спектр КД представляет собой зависимость величины Де от длины волны А,. В спектре КД в области поглощения оптически активных хромофоров, имеющихся в молекуле, присутствует экстремум, который в зависимости от соотношения между величинами еь и ея может быть либо положительным, либо отрицательным.

Изменение оптической активности биодатчика (вплоть до ее полного исчезновения) под действием БАС, регистрируемое при помощи портативного спектрометра КД (дихрометра), в определенных условиях прямо связано с концентрацией БАС в жидкости. Таким образом, наночастицы ХЖКД дц ДНК можно рассматривать как миниатюрные (размером 0,5 микрона) оптические биодатчики, меняющие свои характеристики «в ответ» на действие БАС.

Измерение концентрации БАС производится с помощью предварительно полученной с использованием известных концентраций определяемого соединения калибровочной кривой, представляющей собой зависимость величины изменения аномального сигнала, генерируемого биодатчиком, от концентрации находящегося с ним в контакте БАС. Результат каждого измерения можно представить на экране монитора в виде точки на калибровочной кривой с индикацией численного значения концентрации БАС, обнаруженной в исследуемой пробе.

Однако, несмотря на привлекательность использования пробирочной формы «жидких» НаК ДНК и комплексов «ДНК-интеркалятор» в качестве систем со стабильной характеристикой КД, у пробирочных форм наблюдается постепенное уменьшение оптической активности по мере их хранения, связанное с седиментацией частиц «жидких» НаК и, следовательно, неконтролируемым уменьшением их концентрации в растворе.

Проблема стабилизации свойств частиц «жидких» НаК ДНК была решена в ИМБ РАН за счет иммобилизации этих частиц в полимерном гидрогеле, созданном на основе макромономера полиэтиленгликоля (ПЭГ) [3]. В этом случае получают синтетический полимерный оптически активный материал (далее ПОАМ, РОАМ), содержащий разнесенные в массиве полимерного гидрогеля единичные частицы «жидких» НаК ДНК. Описанная иммобилизация не сопровождается нарушением пространственной структуры частиц «жидких» НаК ДНК и практически не влияет на исходную величину их аномальной оптической активности. При этом используемый полимерный гидрогель оптически прозрачен, может иметь любую удобную для экспериментатора форму, обеспечивает сохранение аномальной оптической активности размещенных в нем частиц «жидких» НаК ДНК, по меньшей мере, в течение 6 месяцев с момента приготовления (при соблюдении не очень жестких условий хранения), не токсичен, химически и биологически инертен к ДНК и проницаем для низкомолекулярных веществ. Проницаемость полимерного гидрогеля для

низкомолекулярных веществ открыла возможность для диффузии молекул разных соединений в гидрогель и последующего их взаимодействия с размещенными в гидрогеле молекулами ДНК, и, таким образом, в этих условиях сохраняется возможность включения определенных соединений, в частности, интеркаляторов, в состав частиц «жидких» НаК ДНК.

Спектр КД вышеуказанного ПОАМ, как и в случае пробирочной формы частиц «жидких» НаК ДНК и комплексов «ДНК-интеркалятор», характеризуется наличием двух аномальных полос, одна из которых расположена в области поглощения хромофоров ДНК на длине волны ~ 270 нм, а другая (дополнительная) полоса - в области поглощения хромофоров включенного в структуру частиц соединения, в частности, интеркалятора. Изменение оптической активности биодатчика (вплоть до ее полного исчезновения) под действием БАС, регистрируемое при помощи портативного спектрометра КД (дихрометра), в этом случае также прямо связано с концентрацией БАС в жидкости.

В ИМБ РАН разработан еще один способ получения стабильных частиц НаК ДНК. Этот способ заключается в формировании «сшивок», например, в виде наномостиков из чередующихся молекул антибиотика антрациклинового ряда, например, дауномицина, и ионов металла, например, меди (Си2+), между соседними молекулами ДНК как в одном, так и в соседних квазинематических слоях исходной жидкой НаК ДНК [2,3,4]. При получении частиц «твердых» НаК ДНК диффузионная подвижность соседних молекул ДНК исчезает и возникает жесткая трехмерная пространственная структура, основным фактором стабилизации которой является уже не осмотическое давление водно-полимерного раствора, а число и прочность наномостиков.

Вследствие наличия наномостиков такие «твердые» частицы НаК ДНК стабильны в широком интервале условий и способны существовать за пределами существования частиц лиотропной ХЖКД ДНК (Рис. 3).

Рис. 3. Образование «твердых» наноконструкций (НаК) ДНК [3]

Для частиц «твердых» НаК ДНК характерна, наряду с аномальной оптической активностью, проявляемой в спектре КД на длине волны 270 нм, дополнительная аномальная оптическая активность, проявляемая в видимом диапазоне спектра в области поглощения хромофоров антибиотика (А, ~ 515 нм), входящего в состав наномостиков. При этом уменьшение оптической активности (вплоть до полного исчезновения), сопровождающее разрушение наномостиков под действием БАС, для которых элементы наномостиков являются субстратом, прямо связано в определенных условиях с количеством указанных разрушений, то есть, с концентрацией БАС [6]. Эта особенность взаимодействий также открывает возможность для использования частиц «твердых» НаК ДНК в качестве сенсорного элемента (биодатчика) биоаналитических систем, используемых для обнаружения в анализируемых растворах БАС, "мишенью" которых являются указанные наномостики.

Недостаточная стабильность оптических свойств пробирочной формы частиц «жестких» НаК ДНК, обусловленная седиментацией этих частиц, устраняется уже известным путем - иммобилизацией частиц «твердых» НаК

ДНК в полимерном гидрогеле (Рис. 4). Гидрогели, содержащие НаК ДНК, получают способом, при котором метакрилатные макромономеры ПЭГ используют сначала для фазового исключения ДНК, т.е. для образования ХЖКД, а затем полимеризуют под действием радикальных инициаторов. ПОАМ, содержащий разнесенные в пространстве частицы «твердых» НаК ДНК, по принципу своего функционирования аналогичен ПОАМ рассмотренного выше типа с комплексами «ДНК-интеркалятор» и сохраняет свою аномальную оптическую активность в течение длительного времени (более года).

Иммобилизация частиц НаК ДНК практически ив влияет на величину их аномальной оптической активности

Спектр КД Еодносолееогораствора с наночастицаыи ДНК. "сшитыми' наномостиками (ОА1)-Си)

т щ ® » »

Рис. 4. Схематическое изображением ПОАМ, содержащего «твердые» НаК ДНК, и его спектр КД [2] Сднк = 39,33 мкг/мл; Спэг = 170 мг/мл; мол. масса ПЭГ = 4000 Да; 0,3 М №С1 + 10"2 М Иа+- фосфатный буфер; Сдду = 25,764-10"6 М. Толщина гидрогеля ~ 2,67 мм; Т = 22° С.

На практике аналитические возможности указанного выше биосенсорного метода определения наличия и концентрации БАС в жидкости с использованием ДНК-биодатчиков к моменту начала его разработки были ограничены, наряду с другими факторами, применением для регистрации аномального оптического сигнала КД дорогостоящих стационарных спектрометров кругового дихроизма

(спектрополяриметров (Jobin-Yvon, Mark III или Mark V; Jasco - 710-720, 810), имеющихся, как правило, только в специализированных научных лабораториях. Достоинствами этих приборов является их широкий рабочий диапазон, высокое спектральное разрешение и точность измерения длины волны. Однако, из этих достоинств, если рассматривать их с точки зрения применения для био сенсорного анализа, основанного на использовании комбинации продуцирующего сигнал КД биоспецифического датчика и детектора -преобразователя такого сигнала, одновременно вытекали главные недостатки приборов как регистраторов сигнала КД - их сложность и громоздкость, невысокая скорость сканирования длины волны, недостаточная чувствительность для регистрации малейших изменений величины оптического сигнала КД, высокая стоимость.

Практическая задача по определению БАС с использованием биодатчиков на основе ХЖКД ДНК была решена совместно ИМБ РАН и Институтом спектроскопии РАН (ИСАН), разработавшим модель портативного полифункционального дихрометра СКД-2 и изготовившим первые его образцы на рабочий диапазон 250-750 нм [5].

Дихрометр СКД-2 был построен по стандартной схеме спектрометра КД, но, в отличие от спектрополяриметра J-710/720, имел селектор в виде построенного по схеме Черни-Тернера одинарного монохроматора с дифракционной решеткой, закрепленной на валу двигателя оригинального быстродействующего электродинамического (гальванометрического) привода, обеспечившего возможность ее поворота и установки в широком спектральном диапазоне с высокой относительной точностью (~10"4) и быстродействием (0,2

__с). Такое конструктивное решение позволило по меньшей мере в десять раз

сократить время перестройки и селекции требуемой длины волны светового потока при уменьшении энергопотребления. Исходя из необходимости разработки портативного устройства, спектральное разрешение монохроматора было оптимизировано, число его оптических элементов для увеличения

пропускания сведено к минимуму, что привело к упрощению конструкции дихрометра в целом, его компактности, мобильности, простоте обслуживания. В частности, удалось обеспечить максимальный световой поток, используя источник света (Хе лампу) относительно небольшой мощности (150 Вт), благодаря чему исчезла необходимость в охлаждении устройства водой или газообразным азотом. Несмотря на то, что габариты дихрометра (Рис. 5) были в 3 раза меньше габаритов коммерческих дихрометров известных фирм, а вес меньше в 5-7 раз, детектирующая способность портативного дихрометра ЛА/А оказалась лучше в 2 раза (здесь ЛА - разность поглощения в образце право- и левополяризованного по кругу излучения).

Рис. 5. Дихрометр СКД-2

В соответствии с биосенсорным способом определения БАС, исследуемую жидкую пробу «пробирочной формы» получали, смешивая раствор содержащей БАС анализируемой жидкости в полимере с раствором ДНК в полимере, т.е. с жидкокристаллической дисперсией ДНК. Для получения сигнала КД оптическую кювету с жидкой пробой помещали в дихрометр и через нее пропускали циркулярно поляризованное излучение с противоположно направленными векторами поляризации (Рис. 6) [7].

При испытаниях созданное на основе ДНК-биодатчиков и дихрометра биосенсорное аналитическое устройство (оптический биосенсор) показало возможность проведения прямого экспресс-анализа содержащих БАС жидкостей и высокую чувствительность определения БАС (10"7 ч- 10"14 М/л),

сравнимую с чувствительностью традиционных аналитических приборов, а

также низкие эксплуатационные расходы, обусловленные простотой

/

конструкции дихрометра [5,8,9]. Можно добавить, что на биосенсоре совместной разработки ИМБ РАН и ИСАН обычный клинический лаборант мог научиться работать за 3-5 дней.

/ кювета - бйодатчик в контакте ~ ^с БАС жидкой пробы'

!еЗ

ии

дихромвтр

^ /

/

МХ

П Мкп

/ -.. ^ ^ - ь

* ■' * 6С ш

Компьютер , с установленным на нем ПО #

'■ШвшшШ ШЙВШЫШШ 'шШмШШ

ъшжттжШь

СР

г'гшущщ.ш'Ш/Ш'Ч

^ЛГ' л. / , / * * /*< < 'О У'/'. . ///-г Л

Рис. 6. Структурная схема оптического биосенсора:

ИИ - источник излучения; МХ - монохроматор; П - поляризатор; Мкп - модулятор круговой поляризации; ТКО - терморегулируемый юоветный отсек; СР - система регистрации

Оптический биосенсор на основе ДНК-биодатчиков и портативного дихрометра не имел аналогов по принципу действия, новизна разработки была подтверждена патентами РФ, США, ЕС, Германии, Японии, золотыми медалями международной инновационной выставки "Еигека-ВгиББек^ОО 1" и Президиума РАН (2002 г.), Гран-при и дипломом Второго конкурса российских инноваций (2003 г.), дипломом Торгово-промышленной палаты РФ (2006 г.).

В 2004 г. Экспериментальный завод научного приборостроения РАН (г. Черноголовка Московской обл.) по документации ИСАН изготовил опытную партию дихрометров СКД-2 в количестве десяти приборов, быстро разошедшихся по научным лабораториям биомедицинского и биохимического профиля Московского региона. В том же году прибор был зарегистрирован как универсальный анализатор жидкости на принципе кругового дихроизма в Государственном реестре средств измерений (№26900-04). В дальнейшем (2005-2006 гг.) дихрометр СКД-2 был несколько усовершенствован, в результате чего его рабочий диапазон был расширен в УФ область до 220 нм.

Решение проблемы стабилизации физико-химических свойств биодатчиков путем создания гидрогеля, содержащего в своем составе частицы НаК ДНК, повлекло за собой разработку ИСАН еще одной версии портативного дихрометра (СКД-3), которая учитывала специфический характер биодатчиков гелевого/пленочного типа.

На сегодняшний день аналитические возможности упомянутых выше оптических биосенсоров (дихрометров с использованием ДНК-биодатчиков) продемонстрированы и оценены на примере определения более 60 наименований БАС пятнадцати разных классов [3]. В их ряду большое число противоопухолевых натуральных и полусинтетических соединений антрациклиновой, антрахиноновой и платиновой групп, полиаминокислоты, многие полипептиды и протеины, В SA, общий белок, у -глобулин, аскорбиновая кислота, клеточные метаболиты, фосфор-органические соединения (гербициды и др.), генотоксиканты растительного происхождения, физические факторы (лазерное, УФ облучение), наночастицы металлов.

Тем не менее, по истечении довольно продолжительного периода эксплуатации дихрометров СКД-2 и его модификации СКД-2М (как с использованием ДНК-биодатчиков, так и без них) со стороны пользователей прибора поступили пожелания по дальнейшему расширению рабочего диапазона прибора в УФ область с увеличением потока излучения в этой области (для проведения исследований белков), по обеспечению более высокой устойчивости прибора к внешним воздействиям, повышению точности установки температуры пробы в кювете и снижению величины остаточного сигнала КД из-за напряжений в окнах кюветы, по совершенствованию программного обеспечения. Кроме того, современные технологии изготовления электронных узлов давно позволяли встроить электронику отдельного блока термостатирования кюветы в оптический блок дихрометра без увеличения его габаритов.

Все эти предложения, фактически означающие необходимость модернизации дихрометра с целью расширения его функциональных

возможностей, точности измерения и повышения надежности работы в целом, возможно было реализовать только на пути использования современной элементной базы и новых физико-технических решений, составивших суть разработки новых моделей портативных дихрометров, как полифункциональных, так и специализированных [21-23].

Целью данной диссертационной работы является исследование возможностей метода кругового дихроизма и биодатчиков на основе наноконструкций ДНК для высокочувствительной регистрации спектров КД биологически активных и токсичных соединений (БАС) и создания высокоэффективных биоаналитических устройств (оптических биосенсоров) для применений в биомедицине, фармакологии, экологии, пищевой промышленности.

Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Провести модернизацию портативного полифункционального спектрометра кругового дихроизма (КД) для работы с биодатчиками, содержащими наноконструкции ДНК, и биосенсорного анализатора (оптического биосенсора) на их основе для определения БАС в жидкости.

2. Исследовать спектры кругового дихроизма полимерных оптически активных материалов на основе наноконструкций ДНК для использования их в качестве дополнительных (вторичных) стандартов для тестирования и калибровки дихрометров и характеризации биологически активных соединений (БАС).

3. Исследовать особенности спектров КД биодатчиков на основе наноконструкций ДНК при их взаимодействии с различными БАС для обоснования разработки специализированных компактных одноволновых спектрометров кругового дихроизма.

4. Разработать и исследовать различные версии компактного одноволнового дихрометра и оптических биосенсоров на их основе для детекции и определения наличия и концентрации в жидкости различных БАС.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Разработан и исследован портативный полифункциональный дихрометр с расширенным в УФ область до 200 нм рабочим диапазоном, приспособленный для высокочувствительной регистрации спектров КД БАС с помощью биодатчиков, содержащих наноконструкции ДНК, и на его основе реализована портативная биосенсорная аналитическая система (оптический биосенсор) биомедицинского назначения для определения в жидкости наличия и концентрации БАС.

2. На основе исследования особенностей спектров КД полимерных оптически активных материалов (ПОАМ), содержащих наноконструкции ДНК, показана возможность использования ПОАМ в качестве дополнительных (вторичных) стандартов оптической активности на достаточно большом наборе дискретных длин волн в УФ- и видимой областях спектра для тестирования и калибровки спектрометров кругового дихроизма и характеризации БАС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чулков, Дмитрий Петрович, 2013 год

Список литературы

1. Yevdokimov Yu.M., Salyanov V.l., Skuridin S.G. Nanostructures and Nanoconstructions Based on DNA.- Boca Raton-London-New York: CRC Press (Taylor & Francis Group), 2012.- 228 p.

2. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Семенов C.B., Скуридин С.Г. Жидкокристаллические дисперсии и наноконструкции ДНК / Под ред. Ю.М. Евдокимова.- М.: Радиотехника, 2008.- 294 с.

3. Евдокимов Ю.М, Салянов В.И., Скуридин С.Г.; Наноструктуры и наноконструкции на основе ДНК / Под ред. Ю.М. Евдокимова.- М.: САЙНС-ПРЕСС, 2010.- 254 с.

4. Yu.M.Yevdokimov, V.I.Salyanov, S.G.Skuridin, S.V.Semenov, O.N.Kompanets. The CD spectra of Double-Stranded DNA Liquid-Crystalline Dispersions / Ed. Yu.M.Yevdokimov.- Nova Science Publishers, Inc., 2011.-103 p.

5. Компанец O.H. Портативные оптические биосенсоры для определения биологически активных и токсичных соединений // УФН.- 2004.- №174.- С.686-690.

6. С.Г. Скуридин, В.А. Дубинская, В.А. Быков, Ю.М. Евдокимов Биосенсорные тест-системы для направленного поиска генотоксикантов и оценки безопасности наноматериалов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.- 2012.- № 1,- С.98-105.

7. Пат. 2107280 (РФ). Способ определения в анализируемой жидкости биологически активного вещества и устройство для его осуществления / Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Чернуха Б.А., Михайлов E.JL, Компанец О.Н., Романов С.Н., Колосов В.В. //Б. И.- 1998.

8. Компанец О.Н., Евдокимов Ю.М. Оптические биосенсоры генотоксикантов на основе наноконструкций ДНК и портативных дихрометров // УФН.- 2009.- №179.- С.329-334.

9. Ю.М. Евдокимов, О.Н. Компанец. Биодатчики на основе дц ДНК и оптические биосенсоры // Сборник материалов Ш Евразийского конгресса по

медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010».- М.: МГУ, 2010.- Т.4.- С.13-16.

10. G.C. Chen and J.T. Yang. Two-Point Calibration of Circular Dichrometer with d-10-Camphorsulfonic Acid//Analytical Lett.- 1977.- V.10, №14.- P.l 195-1207.

11. P.H. Schippers, H.P.J.M. Dekkers. Direct Determination of Absolute Circular Dichroism Data and Calibration of Commercial Instruments // Anal. Chem.- 1981.-№53.- P.778.

12. T.Takakuwa, T. Konno, H. Meguro. A New Standard Substance for Calibration of Circular Dichroism: Ammonium d-10-camphorsulfonate // Anal. Sci.- 1985.- V.I.-P.215-225.

13. D.F. DeTar. Suggested Preliminary Standards for Calibration of Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichoroism Instruments // Anal. Chem.- 1969.- V.10, №11.-P.1406-1408.

14. T. Konno, H. Meguro, and K. Tuzimura. D-Pantolactone as a Circular Dichroism (CD) Calibration // Anal. Biochem.- 1975.- V.67.- P.226-232.

15. K. Tuzimura, T. Konno, H. Meguro, M. Hatano, T. Murakami, K. Kashiwabara, K. Saito, Y. Kondo, and T.M. Suzuki. A Critical Study of the Measurement and Calibration of Circular Dichroism // Anal. Biochem.- 1977.- V.81.- P.167-174.

16. В.М.Гусев, О.Н.Компанец, M.А.Павлов, Д.П.Чулков, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин. Наноконструкции ДНК для тестирования и калибровки спектрометров кругового дихроизма // Наукоемкие технологии.- 2013.- №4.-С. 68-76.

17. Заявка № 2013123106/22(034127). Способ калибровки спектрометров кругового дихроизма / Гусев В.М., Компанец О.Н., Павлов М.А., Чулков Д.П., Евдокимов Ю.М, Скуридин С.Г. // Б. И.- 2013.

18. Заявка № 2013128637/22(042650). Многофункциональная аналитическая система для определения характеристик оптического сигнала кругового дихроизма биологически активного материала / Гусев В.М., Компанец О.Н., Павлов М.А., Чулков Д.П., Евдокимов Ю.М, Скуридин С.Г. // Б. И.- 2013.

19. В.М. Гусев, Ю.М. Евдокимов, О.Н. Компанец, М.А. Павлов, С.Г. Скуридин, Д.П.Чулков. Биологически активные материалы на основе наноконструкций нуклеиновых кислот и калибровка спектрометров кругового дихроизма // Сборник материалов V Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (ТКМФ-5, г.Троицк М.о., 4-8 июня 2012 г.).-2012.- Т.2.- С.26-28.

20. В.М.Гусев, О.Н.Компанец, А.М.Павлов, М.А.Павлов, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин. Компактный биосенсор биологически активных веществ на основе гелевого ДНК-биодатчика и одноволнового дихрометра // Альманах клинической медицины.- М.: МЗСР РФ, 2008.- Т.ХУП, Ч.2.- С.311-312.

21. Ф. В. Верещагин, В. М. Гусев, Ю.М. Евдокимов, О. Н. Компанец, А. М. Павлов, М. А. Павлов, С.Г. Скуридин, Д. П. Чулков. Портативный дихрометр новой биосенсорной аналитической системы биомедицинского назначения на основе ДНК-биодатчиков // Биомедицинская радиоэлектроника.- 2013.- №3.-С.58-68.

22. В.М.Гусев, С.Ф.Кольяков, О.Н.Компанец, А.М.Павлов, М.А.Павлов, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин. Портативная биосенсорная аналитическая система медицинского назначения на базе полифункционального дихрометра СКД-2МУФ // Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010».- М.: МГУ, 2010.- Т.4.- С.165-168.

23. В.М.Гусев, О.Н.Компанец, А.М.Павлов, М.А.Павлов, Д.П.Чулков, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, В.А.Дубинская. Компактная биосенсорная аналитическая система медицинского назначения на базе одноволнового дихрометра СКД-4 // Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010».- М.: МГУ, 2010.- Т.4.- С.169-172.

24. Маркетинговое исследование рынка оборудования и реагентов для определения количества гепарина в крови / Маркетинговая группа «Текарт».- М., 2009.

25. Евдокимов Ю. М., Сычев В. В. Принципы создания наноконструкций с использованием молекул нуклеиновых кислот в качестве строительных блоков // Успехи химии.- 2008.- №77.- С. 194-206.

26. Пат. № 1481974 (РФ). Жидкокристаллический датчик для скрининга биологически активных веществ и препаратов, взаимодействующих с двухцепочечными молекулами нуклеиновых кислот / Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Поздняков В.Н.. // Б. И.- 1991.

27. Пат. № 2032895 (РФ). Жидкокристаллический биодатчик для определения биологически активных веществ / Скуридин С.Г., Рыбин В.К., Евдокимов Ю.М. //Б. И.- 1995.

28. Пат. № 2123008 (РФ). Способ определения гепарина / Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Скуридин С.Г. // Б. И.- 1999.

29. Пат. № 2139933 (РФ). Молекулярная конструкция на основе жидкокристаллической дисперсии нуклеиновой кислоты как интегральный биодатчик и способ ее создания / Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Мчедлишвили Б.В., Быков В.А., Спенер Ф., Палумбо М. // Б. И.- 1999.

30. Patent No.: US 6,246,470 В1 (USA). Method for determination of a biologically active substance in an analyzed liquid and device for its realization / Evdokimov Ju.M., Skuridin S.G., B.A.Chernukha B.A., Mikhailov E.L., Kompanets O.N., Romanov S.N., Kolosov V.V. // United States Patent Bulletin.- 2001.

31. Пат. № 2169770 (РФ). Жидкокристаллическая дисперсия на основе комплекса (нуклеиновая кислота - хитозан) как интегральный датчик и способ ее создания / Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Скуридин С.Г.. // Б. И.- 2001.

32. Patent DE 10035709 С 2 (German). Vorrichtung und Verfahren zur Erfassung und Bestimmung von biologish aktiven Substanzen / Kompanets O.N., Evdokimov I.M., Spener F. // A.S.- 2002.

33. Пат. № 92959 (РФ). Дихрометр для определения биологически активного вещества в жидкостях, гелях и пленках / Гусев В.М., Кольяков С.Ф., Компанец О.Н., Павлов А.М., Павлов М.А., Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г. // Б. И.- 2010.

34. Пат. № 92960 (РФ). Дихрометр для определения биологически активного вещества в анализируемой жидкости / Гусев В.М., Кольяков С.Ф., Компанец О.Н., Павлов А.М., Павлов М.А., Евдокимов Ю.М., Скуридин СЛ7/ Б. И.- 2010.

35. О.Н.Компанец, В.М.Гусев, С.Ф.Кольяков, М.А.Павлов, А.М.Павлов, Д.П.Чулков, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, В.А.Дубинская. Разработка и создание оптического биосенсора медицинского назначения с использованием биодатчиков на основе наноконструкций ДНК и компактного одноволнового дихрометра для контроля оптических свойств биодатчиков и детекции биологически активных и токсичных соединений // Тезисы докладов конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».- М., 2009.- С.232-233.

36. О.Н.Компанец, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, В.М.Гусев, М.А.Павлов, А.М.Павлов, Д.П.Чулков, С.Ф.Кольяков. Разработка технологии определения биологически значимых соединений и лекарств в биологических жидкостях (на примере противоопухолевых антибиотиков) с помощью компактного оптического биосенсора // Тезисы докладов конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».- М., 2010.- С.254-255.

37. О.Н.Компанец, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, В.М.Гусев, М.А.Павлов, Д.ПЛулков. Компактный оптический биосенсор на основе ДНК-биодатчиков и дихрометра и оценка с его помощью влияния наночастиц на свойства биологических объектов // Тезисы докладов конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».- М., 2011,- С.295-297.

38. Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, В.М.Гусев, О.Н.Компанец, М.А.Павлов, Д.П.Чулков. Биосенсорная технология экспрессного определения в жидкости биологически активных соединений на основе гелевых ДНК-биодатчиков и портативного дихрометра // Тезисы доклада научной конференции, посвященной обсуждению итогов реализации федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы».- М.: МИСиС, 2013.-С. 143-144.

39. Д.ПЛулков, В.М.Гусев, О.Н.Компанец, М.А.Павлов. Компактный одноволновый дихрометр СКД-4М для биосенсорного аналитического устройства на основе наноконструкций ДНК // Тезисы доклада ежегодной Всероссийской научной школы-семинара «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине 2013».- Саратов, 2013.

40. Итоговый отчет о научно-исследовательской работе «Разработка нового биосенсорного метода экспрессного определения в жидкости генотоксикантов и компактного биоаналитического устройства (биосенсора) для его реализации» по государственному контрактуй 02.512.11.2217 от 04 июля 2008 г. в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (2009 г.).

41. Промежуточный отчет по НИОКР: «Разработка биосенсорного аналитического устройства (биосенсора) для определения концентрации гепарина в жидкости» (Шифр «2011-2.7-527-012») по государственному контракту от «13» октября 2011 г. № 14.527.12.0012 (Заказчик - Минобрнауки).

42. Скуридин С.Г., Дубинская В.А., Рудой В.М., Дементьева О.В., Захидов СТ., Маршак Т.Л., Кузьмин В.А., Попенко В.И., Евдокимов Ю.М. Действие наночастиц золота на упаковку молекул ДНК в модельных системах // ДАН.-2010.- Т.432, №6, июнь.- С.838-841.

Список рисунков

Стр.

1. Рис. 1. Схема формирования холестерической жидкокристаллической дисперсии (ХЖКД) ДНК (ДНК-биодатчика) и появления аномального сигнала кругового дихроизма (КД)..................................................5

2. Рис. 2. Спектр кругового дихроизма ЖКД ДНК, обработанной двумя соединениями, интеркалирующими между парами оснований ДНК и поглощающими свет на разных длинах волн.......................................6

3. Рис. 3. Образование «твердых» наноконструкций (НаК) ДНК.............10

4. Рис. 4. Схематическое изображением ПОАМ, содержащего «твердые» НаК ДНК, и его спектр КД..................................................................11

5. Рис. 5. Дихрометр СКД-2...........................................................13

6. Рис. 6. Структурная схема оптического биосенсора:...........................14

7. Рис. 1-1. Структурная схема дихрометра..........................................23

8. Рис. 1-2. Принципиальная оптическая схема дихрометра.....................25

9. Рис. 1-3. Функциональная схема дихрометра СКД-2МУФ.....................26

Ю.Рис. 1-4. Источник излучения в сборе (слева) и «домик» для

широкополосной ксеноновой лампы................................................30

11.Рис. 1-7. Монохроматор в сборе.....................................................37

12.Рис. 1-8. Фотоэластический модулятор на основе склейки брусков из кристаллического и плавленого кварца............................................41

13.Рис. 1-9. Терморегулируемый кюветный отсек с регулируемым усилием прижатия стенок разъёмного отсека к кварцевой кювете......................42

14.Рис. 1-10. Экспериментальный образец дихрометра (СКД-2МУФ) без кожуха....................................................................................44

15.Рис. 1-11. Блок-схема алгоритма программы выполнения измерений......47

16.Рис. 2-1. Спектр КД водного раствора КСК в УФ области..................51

17.Рис. 2-2. Шкала длин волн в спектре КД ряда соединений в свободном виде (жирные линии ) и включенных в структуру частиц «жидкой» НаК ДНК, иммобилизированных в составе ПОАМ (пунктирные линии).......55

18.Рис. 2-3. Спектры КД в области 220-230 нм водного раствора п-пропиламмониевой соли d-10-камфорсульфоновой кислоты C10H1604S (КСК), использованного в качестве стандарта КД в УФ диапазоне, с максимумом КДЛА290 На длине волны 290,5 нм (кривая 1), и ПО AM, имеющего в своем составе частицы НаК ХЖКД ДНК, использованного в качестве дополнительного стандарта КД в УФ диапазоне, с минимумом КДДА270 на длине волны 270 нм (кривая 2).........................................61

19.Рис. 2-4. Экспериментальный спектр КД ПОАМ, имеющего в своем составе частицы «жидких» НаК комплекса «ДНК-SYBR Green», с минимумами КДДА270 и КДАА50° На длине волны 270 нм и 500 нм, соответственно: кривая 3 - спектр КД ПОАМ, содержащего в полимерном гидрогеле частицы «жидких» наноконструкций, обработанных красителем «SYBR Green»; Спэг=170 мг/мл; мол.масса ПЭГ = 4000 Да; 0,3 М NaCl + 10-2 М Na+ - фосфатный буфер; кривая 4 - спектр исходного полимерного гидрогеля, размеры образца гидрогеля 7x3x25 мм;..............................65

20.Рис. 2-5. Экспериментальный спектр КД образца ПОАМ (кривая 5), имеющего в своем составе частицы «жестких» НаК ДНК, «сшитых» наномостиками в результате их обработки растворами дауномицина и меди.......................................................................................68

21.Рис. 3-1. Функциональная схема дихрометра СКД-4...........................73

22.Рис. 3- 2. Фото фотодиода с предусилителем без защитного кожуха........75

23.Рис. 3-3. Компактный дихрометр (СКД-4..........................................77

24.Рис. 3-4. Фото изготовленного образца дихрометра СКД-4М................78

25.Рис. 3-5. Основные окна графического интерфейса пользователя программного обеспечения дихрометра СКД-4М...............................81

26.Рис. 3-6. Многофункциональная система - вариант А..........................88

27.Рис. 3-7. Многофункциональная система - вариант Б............................89

28.Рис. 3-8. Макет многофункциональной аналитической системы (вариант А)............................................................................................90

29.Рис. 4-1. Кинетические кривые изменения оптической активности при 515 нм биодатчика на основе частиц ХЖКД ДНК, "сшитых" хелатными мостиками (ДАУ-Cu), при обработке их раствором гепарина разной концентрации [41].......................................................................98

30.Рис. 4-2. Калибровочная зависимость для определения концентрации гепарина в жидкости методом кругового дихроизма при помощи биодатчика на основе наноконструкций ДНК (размер красных точек на калибровочной зависимости соответствует среднему разбросу значений величины АА520отн ).................................................................100

31.Рис. 4-3. Спектр КД ХЖКД ДНК, сформированной в водно-солевом растворе ПЭГ (кривая 1), и этой же дисперсии, обработанной дауномицином. АА - амплитуда аномальных полос в спектре КД.........103

32.Рис. 4-4. Калибровочная кривая для определения концентрации ДАУ в анализируемой пробе:................................................................104

33.Рис. 4-5. Спектры КД НаК ДНК в составе равновесно набухшего гидрогеля, помещенного в водно-солевой раствор, содержащий ДАУ, ионы Си2+ и гомоцистеин, как функция времени обработки НаК ДНК гомоцистеином [40]:..................................................................106

34.Рис. 4-6. Зависимости величины относительного сигнала кругового дихроизма (АА/ААтах), генерируемого гелевым биодатчиком на основе НаК ДНК на длине волны ~ 520 нм, от времени его обработки гипорамином [40]:.....................................................................110

35.Рис. 4-7. Зависимость величины АА/ААтах от концентрации гипорамина, соответствующая 10-минутной обработке гелевого биодатчика на основе НаК ДНК гипорамином.............................................................111

36.Рис. 4-8. Спектры КД гидрогеля, содержащего частицы НаК ДНК, до (кривая 1) и после (кривые 2-4) обработки его аскорбиновой кислотой...113

37.Рис. 4-9. Динамика разрушения НаК ДНК под действием гомоцистеина (1, 2) и гепарина (3, 4) в составе гидрогеля в исходном (1, 3) и набухшем (2, 4) состояниях..............................................................................114

Список таблиц

Стр.

1. Таблица 1-1. Основные характеристики полифункционального дихрометра (СКД-2МУФ................45

2. Таблица 4-1. Коэффициенты диффузии некоторых БАС в гидрогелях........115

Список формул

1. 2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10. 11. 12. 13.

1.1). 1.2)

1.3)

1.4)

1.5)

1.6)

1.8).,

1.9).,

1.10) 1.11) 2.1) .,

Стр. Стр. Стр.

31 14. (2.3)...... ... 62 27. (3.6) ..... ... 84

. 31 15. (2.4)...... ... 62 28. (3.7) ..... ... 84

. 31 16. (2.5)...... ... 62 29. (3.8) ...... ... 84

. 32 17. (2-6)...... ... 62 30. (3.9) ...... ... 85

. 32 18. (2.7)...... ... 62 31. (3.10).... 85

. 32 19. (2.8) ...... ... 62 32. (3.11).... 85

. 32 20. (2.9)...... ... 65 33. (3.12).... 85

. 32 21. (2.10).... 68 34. (3.13).... 85

. 32 22. (3.1) ...... ... 83 35. (3.14).... .. 85

33 23. (3.2) ...... ... 83 35. (3.15).... .. 85

33 24. (3.3) ...... ... 84 37. (3.16).... .. 86

61 25. (3.4) ...... ... 84 38. (3.17).... .. 86

62 26. (3.5) ...... ... 84 39. (3.18) .... .. 86

40. (3.19).... .. 86