Разработка и совершенствование методов иммуноферментной диагностики классической чумы свиней тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Бьядовская, Ольга Петровна

• Бьядовская, Ольга Петровна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бьядовская, Ольга Петровна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения о КЧС.

Морфологические и физико-химические свойства вируса КЧС.

Антигенные свойства вируса КЧС.

Патогенез и клинические формы.

Эпизоотологические особенности КЧС.

Иммунитет и специфическая профилактика.

2.2. Диагностика классической чумы свиней.

Выделение инфекционного вируса.

Обнаружение вирусного антигена.

Выявление противовирусных антител.

2.3. Применение ИФА при диагностике КЧС.

Теоретические основы ИФА.

ИФА в диагностике КЧС.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы и методы.

3.1.1. Материалы.

3.1.2. Серологические и иммунохимические методы исследования.

3. 2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.2.1. Разработка и оптимизация непрямого иммуноферментного метода для выявления антител к вирусу КЧС в сыворотках крови свиней.

3.2.2. Выявление антител в непрямом варианте ИФА методом одного разведения.

3.2.3. Сравнительная оценка результатов выявления антител к вирусу КЧС в непрямом варианте ИФА и в реакции нейтрализации.

3.2.4. Сравнительная оценка результатов исследования сывороток крови свиней в Н-ИФА и с помощью Chekit-ИФА

3.2.5. Определение чувствительности и специфичности непрямого варианта ИФА.

3.2.6. Иммунологический мониторинг поголовья свиней в хозяйствах Российской Федерации на основе непрямого варианта ИФА.

3.2.7. Разработка «сэндвич»-варианта непрямого иммуноферментного анализа для обнаружения вируса КЧС.

3.2.8. Разработка непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 для выявления вируса КЧС в вируссодержащих пробах.

3.2.9. Определение специфичности и чувствительности разработанной тест-системы на основе блокирующего варианта ИФА.

3.2.10. Обнаружение вируса КЧС в патологических материалах с помощью блокирующего варианта ИФА.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и совершенствование методов иммуноферментной диагностики классической чумы свиней»

Актуальность темы. Классическая чума свиней (КЧС) опасное инфекционное заболевание, характеризующееся высокой контагиозностью и летальностью [85]. Возбудителем заболевания является вирус рода Pestivirus семейства Flaviviridae. К этому роду относят также вирусы диареи крупного рогатого скота (ВД КРС) и пограничной болезни овец (ВПБО).

Эпизоотии КЧС наносят серьезный экономический ущерб, так как сопровождаются гибелью большого числа животных. В настоящее время для искоренения КЧС в мире существует два основных подхода: первый - полное уничтожение больных и контактировавших животных и второй метод - убой больных животных и вакцинация всего поголовья свиней [25,63]. Первый метод борьбы реализуется в странах ЕС и США. В России и странах СНГ для профилактики и борьбы с инфекцией осуществляют поголовную вакцинацию с использованием живых вакцин на основе аттенуированных штаммов вируса КЧС.

В связи с этим остаются актуальными проблемы своевременной диагностики КЧС. Быстрая постановка диагноза в случае возникновения заболевания обеспечивает проведение в сжатые сроки соответствующих мероприятий по ликвидации и предотвращению дальнейшего распространения заболевания.

Диагноз на КЧС ставят на основании комплекса показателей с использованием эпизоотологических, клинических и лабораторных методов. Диагностическое значение этих методов различно и зависит от характера течения болезни. При этом необходимо, чтобы клинический диагноз был подтвержден лабораторными методами, так как острая форма КЧС может быть схожа с африканской чумой свиней, болезнью Ауески, септическим сальмонеллезом, пастерел'лезом и рядом других инфекций. Диагноз часто запаздывает и инфицированные стада могут быть источником для дальнейшего распространения вируса. Следовательно, при подозрении на КЧС диагноз должен быть быстро подтвержден лабораторно.

Существующие в настоящее время традиционные методы лабораторной диагностики КЧС (иммунофлюоресценция, реакция нейтрализации) требуют наличия культуры клеток, длительны по времени постановки и трудоемки. Кроме того, тесное антигенное родство вируса КЧС с другими пестивирусами затрудняет диагностику КЧС и требует решения задач направленных на совершенствование существующих и на разработку новых методов диагностики, которые являлись бы более чуствительными, специфичными, экономичными, простыми в исполнении. Внедрение современных методов диагностики диктуется необходимостью создания автоматизированных систем анализа для проведения массовых исследований. Именно к таким методам и относят иммуноферментный анализ (ИФА).

Разработка иммуноферментных тест-систем позволяет расширить возможности выявления специфических антител и открывает перспективы устранения многих технических проблем лабораторной диагностики. В условиях поголовной вакцинации животных против КЧС, применение тест-систем на основе ИФА позволяет определять уровень материнских антител, проводить оценку напряженности иммунитета.

К методам лабораторной диагностики КЧС помимо определения антител в сыворотках крови свиней, относятся и методы выявления антигена вируса КЧС. Обнаружение вируса КЧС в биологических материалах традиционно основано на применении прямого обнаружения вирусного антигена в органах инфицированных животных методом иммунофлюоресценции, а также выделении инфекционного вируса КЧС в культуре клеток свиней (РК-15, SK-6) [18]. Однако, эти методы не всегда пригодны для проведения массовых исследований, достаточно длительны и трудоемки. Как показали эпизоотии КЧС в Бельгии, Германии, Дании (19992001г.) существует потребность в экспресс методах диагностики [52,53]. Одним из путей решения этой проблемы может стать усовершенствование различных вариантов иммуноферментных методов для выявления антигена вируса КЧС.

В настоящее время для диагностики КЧС используются различные варианты постановки ИФА. За рубежом выпускаются готовые коммерческие диагностические наборы производства фирм SYNBIOTICS (Франция), CYPRESS (Бельгия), «Dr. Bommeli A.G.» (Швейцария), в которых используются моноклональные антитела, что в итоге определяет высокую себестоимость проводимых исследований. Кроме того, применение в некоторых наборах вирусного антигена, полученного из инфицированных культур клеток, не гарантирует безопасность проведения анализа.

Стабильность диагностического антигена и безопасность его применения можно достигнуть за счет использования рекомбинантных вирусных белков, аналогов антигенных детерминант нативного вируса КЧС. Одним из таких белков является поверхностный гликопротеин Е2 (др55) вируса КЧС, индуцирующий образование значительной части вируснейтрализующих антител при заражении или вакцинации живой вакциной. Уровень антител к белку Е2 адекватно отражает общий уровень нейтрализующих антител к вирусу КЧС [102].

Таким образом, создание отечественных иммуноферментных тест-систем, использующих рекомбинантный белок Е2 вируса КЧС, является актуальной задачей.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы явилась разработка непрямого варианта ИФА для определения уровня антител к вирусу КЧС в сыворотках крови свиней и непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА для выявления антигена вируса КЧС в вируссодержащих материалах с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: 1) разработать тест-систему на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к вирусу КЧС в сыворотках крови свиней методом одного разведения, для чего необходимо:

- оптимизировать условия проведения реакции;

- установить критерии количественной и качественной оценки результатов реакции;

- провести сравнительный анализ данных, полученных методом ИФА с результатами базовой реакции - реакции нейтрализации и СНЕК1Т-ИФА;

- провести с помощью разработанной тест-системы иммунологический мониторинг свинопоголовья.

2) разработать тест-систему на основе непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА для выявления антигена вируса КЧС в пробах вируссодержащих материалов, для чего необходимо:

- получить иммуноспецифические компоненты и оптимизировать условия постановки реакции;

- установить критерии качественной и количественной оценки результатов реакции;

- оценить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы относительно Serelisa -ИФА;

- провести сравнительную оценку разработанной тест-системы для обнаружения вируса КЧС с референтными тестами при исследовании проб патологического материала.

Научная новизна. Разработана отечественная иммуноферментная тест-система с применением в качестве антигена рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС, полученного методом экспрессии в клетках E.coli, для определения уровня антител к вирусу КЧС в сыворотках крови свиней методом одного разведения.

Определены пороговые значения для для проведения качественной оценки результатов реакции.

Изучена диагностическая ценность разработанного нами непрямого варианта ИФА, представленного в сравнении с реакцией нейтрализации и иммуноферментными коммерческими тест-системами.

Проведен анализ данных ИФА, полученных при иммунологическом мониторинге свинопоголовья с использованием разработанной тест-системы.

Разработан метод выявления антигена вируса КЧС в вируссодержащих пробах, основанный на проведении непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА.

Оценены чувствительность и специфичность разработанного метода.

Проведено сравнение разработанной тест-системы с референтными тестами для выявления антигена вируса КЧСв пробах патологического материала.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований разработаны тест-системы на основе ИФА, использующие в качестве антигена рекомбинантный белок Е2 вируса КЧС для определения антител и антигена вируса КЧС в пробах сывороток крови свиней и вируссодержащих материалах.

Разработаны, прошли комиссионные испытания, одобрены ученым советом, утверждены директором института следующие методики: «Методика выявления антител к вирусу классической чумы свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного белка gp55 (Е2)»;

Методика выявления антител к вирусу классической чумы свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного белка gp55 (Е2) при тестировании проб в одном разведении»;

Методика выявления антигена вируса классической чумы свиней в непрямом жидкофазном блокирующем варианте иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного вирусного белка Е2».

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях: «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (Владимир, 2000г.), «Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота» (Владимир, 2002г.), на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1999-2001 годах.

Основные положения выносимые на защиту. Результаты выявления антител к вирусу КЧС в сыворотках крови свиней с помощью непрямого варианта ИФА при тестировании проб в одном разведении с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС.

Результаты сравнения непрямого варианта ИФА с реакцией нейтрализации и Chekit-ИФА при ретроспективной диагностике КЧС, определении иммунного статуса и оценке эффективности вакцинации животных.

Данные по выявлению антигена вируса КЧС в вируссодержащих пробах с помощью разработанной тест-системы на основе непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА, с использованием иммобилизованного на планшете рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС.

Результаты сравнения блокирующего варианта ИФА и реакции иммунофлюоресценции при обнаружении антигена вируса КЧС в образцах патологических материалов и в инфицированных вирусом КЧС культурах клеток.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ. Исследования по диссертационной работе выполнены в 1998 - 2002 гг. во Всероссийском научно - исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ, Г.Владимир).

Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах, иллюстрирована 22 таблицами и 15 рисунками. Список использованной литературы включает 140 источников, из которых 108 иностранные.

Автор выражает искреннюю благадорность научному руководителю, к.б.н. В.Г. Андрееву и сотрудникам института: д.в.н. Т.З. Байбикову, д.в.н. В.Л. Узюмову, к.б.н. С.В.Безбородовой, Н.С. Мудрак, А.А. Луговскому, Л.А. Быковой, к.в.н. В.Ф. Ковалишину, И.А.Пронину, глав.техн. О.Г. Андреевой, А.Б. Смирнову, Зинковскому Ю.В., Филиной А.Ю. - за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы и оформлении диссертации. и

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Общие сведения о классической чуме свиней Чума свиней или классическая чума свиней (КЧС) распространена во всем мире и признана вирусным заболеванием, приносящим значительный ущерб свиноводству [5,85,122]. Первые описания КЧС, согласно Hanson, относятся к 1810 году [46]. В 1903 г. Дорсет и Швайнитц установили вирусную природу КЧС. На протяжении более 100 лет это инфекционное заболевание не потеряло своей актуальности и значимости [46]. Несмотря на то, что болезнь достаточно хорошо изучена и накоплен положительный опыт работы по искоренению КЧС во всем мире, пока не удается предотвратить эпизоотии болезни.

Возбудителем заболевания является вирус, принадлежащий к роду Pestivirus семейства Flaviviridae. Термин пестивирус впервые ввел в 1973 г. М. Хорзинек с целью группировки антигенно родственных, оболочечных, РНК-содержащих вирусов: классической чумы свиней (ВКЧС), диареи КРС (ВДКРС) и пограничной болезни овец (ВПБО). Все пестивирусы имеют сходный спектр восприимчивых хозяев. Вирус КЧС может передаваться крупному рогатому скоту и мелким жвачным. Однако, несмотря на их способность преодолевать видовой барьер, пестивирусы слабо реплецируются в гетерологичных хозяевах. Ранее пестивирусы относили к семейству Togoviridae. Накопленные со временем данные об организации генома и стратегия репликации свидетельствуют о фундаментальных различиях , на основании которых в 1985г. большинством авторов было одобрено выделение их в самостоятельное семейство, включающее род Pestivirus. В 1990г. на 8 Интернациональном Вирусологическом конгрессе в Берлине «Международный комитет по таксономии вирусов» утвердил эту классификацию [64].

Мофологические и физико-химические свойства вируса КЧС Вирус КЧС (ВКЧС) - мелкий оболочечный вирус с однонитчатой РНК позитивной полярности. Вирионы сферической или овальной формы диаметром 40-45 нм (53±14). Нуклеокапсид 25-35нм икосаэдрического типа симметрии, покрыт суперкапсидной оболочкой. Коэффициент седементации

140-180 S, плавучая плотность -1,16-1,20 г/см3. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, детергентам, разрушается трипсином. Стабилен при рН-6,0-9,0. При 60°С инактивируется через 10 минут. Низкие температуры его консервируют, в замороженном виде вирус сохраняется несколько лет [7,17,27,51].

В последние годы с помощью современных методов изучены молекулярные характеристики вируса [54]. Было установлено, что геном вируса представлен однонитчатой инфекционной РНК размером 12,5 тысяч нуклеотидных оснований, с коэффициентом седементации - 40-45S. Имеет одну открытую трансляционную рамку считывания, кодирующую синтез полипротеина, который состоит из 4000 аминокислот и подвергается протеолитическому расщеплению вскоре после трансляции [7]. В результате белок предшественник расщепляется на зрелые структурные и неструктурные белки [125].

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ВД КРС и ВПБО выявил высокий уровень гомологии как на нуклеотидном, так и на аминокислотном уровнях. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей показал, что гомология между штаммами ВД КРС -86%, между штаммами ВКЧС -93%, между ВД КРС и ВКЧС- 70%. Уровень гомологии на нуклеотидном уровне составляет : 76% между ВДКРС штамма NADL и Osloss; 66% между ВДКРС штамма NADL и ВКЧС штамма Alfort; 88% между ВКЧС штамма Alfort и Brescia (Collet Н.С.) [41]. Однако следует отметить, что уровень перекрестной нейтрализации вирусов довольно низок [45].

Положение генов структурных белков на геноме пестивирусов установлено с помощью компьютерного анализа и идентификацией этих белков с помощью моноклональных антител [131,135]. В настоящее время в структуре РНК вируса КЧС идентифицированы гены следующих белков: неструктурного белка Р23, являющегося автопротеазой (NP20); нуклеокапсидного белка «С» (р14); трех гликопротеинов вирионной оболочки, обозначаемых Е0 (др44/48), Е1(дрЗЗ), Е2(др55); неструктурных белков р125, р10, р133, р130 (функции которых до конца не выяснены [83,117]. Локализация перечисленных генов приведена на рисунке 1.

-5' 3'

N с Е0 Е1 Е2 Р7 NS2-3 NS4A NS4B NS5A-B р23 р14 др44/48 дрЗЗ др551 Р80/125

Структурные белки Неструктурные белки

Рис.1 Предположительная структура генома и номенклатура белков вируса КЧС

Примечание: р23 - вирусная аутопротеаза; р14- нуклеокапсидный белок; др44/48, дрЗЗ, др55-белки вирусной или клеточной оболочки; р80/125- консервативный антиген (вирусная протеаза)

Антигенные свойства вируса КЧС

На основании биологических и эпизоотологических данных, а также результатов реакции нейтрализации с использованием поликлональных антител можно различать пестивирусы. Однако выявление более тонких антигенных различий и эпитопное картирование структурных белков возможно только с помощью моноклональных антител (МАт). Были получены различные клоны гибридом, преципитирующие структурные белки из лизата клеток, инфицированных ВКЧС, ВД КРС и рекомбинантным вирусом, экспрессирующим различные белки пестивирусов.

Было установлено, что наибольшей межвидовой гомологией (свыше 80%) обладают неструктурные белки, в частности р125/80. Гликопротеины Е1 и Е2 в вирусной оболочке сгруппированы в бисульфидно связанные гетеродимеры и гомодимеры, а локализация Е0 остается до конца не выясненной [103]. Поскольку в культуральной среде обнаруживают значительные количества Е0 можно предполагать, что данный гликопротеин либо ковалентно связан с димером Е1/ Е2 , либо его связь с билипидным слоем вириона слабее,чем у Е1 и Е2. Гликопротеин Е0 обладает рибонуклеазной активностью, функциональное значение которой не выяснено.

Гликопротеины пестивирусов содержат наряду с участками, консервативными для всех представителей рода, вариабельные последовательности. Гомология белка Е2 ВД КРС и Е2 ВКЧС составляет порядка 65%. В связи с этим МАт, специфичные к различным эпитопам пестивирусных гликопротеинов, узнают или широкий спектр вирусных вариантов, или проявляют четкую внутривидовую специфичность. К последнему типу относятся и вируснейтрализуюицие МАт, что указывает на видовую специфичность данных эпитопов.

Образование специфичных антител, как показано Weiland et.al. [129] индуцируют, в основном, два гликопротеина ЕО и Е2, а также неструктурный белок р125/80. Вируснейтрализующей активностью обладают преимущественно антитела к Е2, этот белок играет главную роль в формировании протективного иммунитета против вируса КЧС [102,128].

В связи с этим он имеет и важное диагностическое значение. Поскольку белок Е2 играет решающую роль в создании протективного иммунитета, были проведены интенсивные исследования по изучению его структуры. На основании данных [130], полученных с использованием панели из 13 МАт была построена модель основного иммунодоминантного участка. Согласно этой модели, в структуре данного участка имеется 13 эпитопов, формирующих 4 антигенных домена: А, В, С и Д. По нейтрализующей активности и консервативности, домен А подразделяется на субдомены: А1( А2 и А3. Субдомены A-i и А2 консервативны более чем для 90% штаммов КЧС, но только одно МАт из субдомена Ai являлось нейтрализующим. Ни один из эпитопов А3 и доменов В, С и Д не являются консервативными, но только МАт против доменов В и С нейтрализуют вирус.

Эпитопы были картированы Van Rijn Р.А. et. а. [98] с использованием спонтанных делеционных мутантов штамма Brescia. Выяснено, что эпитопы доменов В и С локализуются в N-концевой части Е2. Неконсервативный субдомен А3, по всей вероятности, локализован между доменами В/С и гидрофобным регионом, который является высококонсервативным для всех пестивирусов. Консервативные субдомены к^ и А2 расположены вблизи С-концевой части этого гидрофобного региона, который локализован в центральной части аминокислотной последовательности Е2. В дальнейших работах этими же авторами [99,133] была установлена более детальная локализация доменов и эпитопов. Все домены распологались между 690 и 866 аминокислотами.

На основание результатов исследований Е2 с помощью МАт была предложена двухкомпонентная структура данного белка. Один из компонентов содержит высококонсервативные домены А и Д, в то время как другой -домены В и С. Такая структура Е2 была подтверждена дальнейшими исследованиями [111]. Модель антигенной структуры гликопротеина Е2 представлена на рисунке 2.

Вирусные гликопротеины, особенно присутствующие на внешней оболочке вириона и поверхности инфицированных вирусом клеток, играют главную роль в течении инфекции и представляют собой значимые мишени для индукции иммунной реакции хозяина. Многочисленные опыты показали, что после иммунизации свиней рекомбинантным вирусом осповакцины, экспрессирующим все структурные белки (р14, др44, дрЗЗ, др55) ВКЧС была получена полная защита животных после контрольного заражения вирулентным штаммом.

Рекомбинантный вирус, не содержащий большей части гена gp55 (Е2) ВКЧС, не вызывал образование нейтрализующих антител, но индуцировал защитный иммунитет [102,103]. Кроме того, в работах целого ряда авторов [34,35,36] показано, что однократная вакцинация свиней маркированной субъединичной Е2 вакциной уже через 2 недели защищает животных от заражения ВКЧС, и свиньи остаются защищенными от клинической формы КЧС от трех недель до шести месяцев после вакцинации [89]. Опыты на кроликах с введением рекомбинантного вируса F1c2, F1c3 (клонированного из штамма К), имеющего биологические и иммуногенные свойства родительского штамма, показали, что через 14 дней после введения у животных имеются вируснейтрализующие антитела [49]. При этом у животных образуются антитела только к белку Е2, а не к другим белкам вируса КЧС, тогда как, при заражении вирулентным вирусом спектр вирусспецифических антител значительно шире.

О - гидрофобная АА рщ - полярная незаряженная АА

А - заряженная АА О - цистеин - мутация

MAR-варианта

СООН

Рис.2 Предполагаемая антигенная структура белка Е2 вируса КЧС.

Примечание: отдельными символами обозначены гидрофобные, полярные незаряженные, заряженные аминокислоты и цистеин.

Поэтому, наличие антител к другим вируспецифическим белкам, например к ЕО (др44/48), должно свидетельствовать о контакте животного с нативным вирусом КЧС.

Таким образом, создание субъединичной вакцины на основе рекомбинантного белка Е2 в комплексе с разработкой иммуноферментных методов определения антител к различным белкам нативного вируса (Е0-Е2), может решить проблему дифференциации больных (переболевших) и вакцинированных животных. Использование рекомбинантных белков для таких тест-систем создает определенные преимущества и открывает широкие перспективы для совершенствования методов диагностики КЧС.

Патогенез и клинические формы

Контагиозная болезнь свиней, вызываемая вирусом КЧС, наносит большой экономический ущерб животноводческим хозяйствам. Характеризуется лихорадкой, поражением кровеносной и кроветворной систем, крупозным воспалением легких и крупозно-дифтерическим воспалением толстого кишечника [55]. Диагноз КЧС ставят на основании комплекса показателей с использованием эпизоотологических, клинических, патологоанатомических и лабороторных методов. Диагностическое значение их зависит от течения болезни. Различают 3 формы течения болезни КЧС: острую, хроническую и персистентную (атипическую). Все они сопровождаются патологоанатомическими изменениям, которые очень вариабельны и зависят от течения болезни и наличия осложнений секундарной инфекцией (сальмонеллез, пастереллез). Наиболее типичные измнения встречаются у подсвинков и взрослых животных.

Острая (септическая) форма чумы протекает обычно без осложнений вторичной инфекцией, характеризуется повышением температуры тела до 40,5-41 °С, угнетением, слабостью; развивается гнойный конъюктивит, кожа ушей, живота окрашена в багрово-красный цвет, видны точечно-пятнистые кровоизлияния. Наиболее характерные изменения встречаются в лимфоузлах, селезенке и почках. Случаи типичной острой формы чумы свиней могут быть диагностированы с приемлемой точностью на основе анамнеза, клинического и патологоанатомического изучения. Несмотря на характерные признаки острой формы КЧС, рекомендовано, чтобы и в этом случае клинический диагноз был подтвержден в лаборатории. Это обьясняется тем, что острая форма КЧС может быть схожа с африканской чумой свиней, болезнью Ауески, септическим сальмонеллезом, стрептококовой инфекцией и др.

Хроническая форма характеризуется продолжительным течением болезни (несколько недель или месяцев), тяжелым крупозно-дифтероидным поражением желудочно-кишечного тракта, гнойно-фибринозным воспалением легких и плевритом, потерей веса. При этом появляются благоприятные условия для развития вторичных инфекций. В последнее время стало появляться субклиническое и хроническое течение, характеризующееся нарушением функции воспроизводства (бесплодие, аборты, мертворождение), что свидетельствует о заражении плодов через плаценту.

Данные, полученные при экспериментальном заражении вирусом КЧС супоросных свиноматок показывают, что плод должен быть инфицирован за 65 дней до опороса, чтобы возникла персистентная инфекция [44]. Инфекционный вирус можно выделять из крови и большинства тканей, а животные могут жить в течение нескольких месяцев и постоянно выделять вирус. Клинические признаки могут быть минимальными или полностью отсутствовать. Очевидно, что такие поросята могут играть важную роль при передаче ВКЧС в полевых условиях; их выявление и элиминация -необходимая мера в борьбе с КЧС.

В противоположность хронической форме, при персистентной КЧС-инфекции не обнаруживают ни специфических антител, ни комплексов антиген-антитело. Пренатальные и ранние неонатальные КЧС-инфекции могут индуцировать иммунологическую толерантность. При этом механизмы ее развития до конца не ясны.

Предполагается, что за возникновение хронической и персистентной инфекции ответственны слабовирулентные штаммы вируса КЧС. В отличии от острой формы, при хронической и атипической формах КЧС практически невозможно установить диагноз по клинической картине вследствии широкой вариабельности клинических признаков и патологических поражений [63,126]. Из-за трудностей, возникающих при распознавании этих форм КЧС, диагноз часто запаздывает, и инфицированные стада могут быть источником для дальнейшей диссиминации вируса.

Эпизоотологические особенности КЧС

Общепризнанным является тот факт, что КЧС для стран с интенсивной системой разведения свиней считается одной из наиболее экономически важных болезней, а в ветеринарно- санитарном плане - одной из наиболее трудно ликвидируемых эпизоотий. Хотя резервуары вируса, пути передачи и распространения хорошо известны, практический опыт показывает, что ч осуществить комплекс защиты страны и хозяйства от заноса возбудителя, а тем более ликвидировать возникновение эпизоотии чрезвычайно трудно [112].

В большинстве неблагополучных пунктов (откормочные, подсобные хозяйства) возникновение болезни связано с закупкой и ввозом животных больных КЧС, использованием необезвреженных пищевых отходов; установлена связь с «местной» инфекцией чумы среди диких кабанов. Терпстра [112] отмечает, что в замкнутых хозяйствах современного типа человек является единственным наиболее важным фактором передачи вируса от стада к стаду, тогда как в хозяйствах с небольшим поголовьем свиней ответственность несет транспорт и ввоз инфицированных животных. Поэтому необходимо проводить вирусологическое и серологическое обследования для подтверждения или исключения возможности заражения скрытой инфекцией с ферм, занимающихся разведением свиней [121].

Иммунитет и специфическая профилактика

Животные-реконвалесценты приобретают стойкий иммунитет, продолжающийся несколько лет. Пассивный иммунитет непродолжителен -10 -12 дней. Иммунитет при КЧС обусловлен наличием вируснейтрализующих антител (ВНА). Иммунные реакции, направленные на цитолиз инфицированных клеток, не «работают» при КЧС из-за отсутствия экспрессии вирусспецифических белков на клеточной поверхности. Однако формирование резистентности к заражению у вакцинированных свиней происходит до выявления ВНА. Лейкоциты и лимфоциты иммунизированных свиней способны лизировать аутогенные клетки-мишени (лейкоциты), интегрировавшие вирионы КЧС. Поэтому вероятен тот факт, что в защите КЧС наряду с нейтрализацией вируса антителами важную роль играют иммунологические реакции, опосредуемые клетками, в частности естественными киллерами и цитотоксическими лимфоцитами [124].

В настоящее время для искоренения КЧС в мире используют два основных подхода: без применения вакцинных препаратов и с их применением [25,63]. Первый из них реализуется в странах Западной Европы. В связи с тем, что переболевшие и вакцинированные животные имеют одинаковый спектр вирусспецифических антител, в этих странах полностью отказались от вакцинации, целиком полагаясь на диагностические методы и строгие ветеринарно-санитарные меры. Данный подход предполагает уничтожение всех больных и подозреваемых в заражении, а также имеющих антитела к вирусу КЧС животных. Использование данного подхода в рамках Национальной программы борьбы с КЧС в США привело к полному искоренению этого заболевания в стране.

Другой подход характерен для России и некоторых стран Восточной Европы, где в условиях высокой концентрации животных в свиноводческих хозяйствах вакцинация необходима. При наличии эпизоотического течения болезни широкое применение вакцин вполне оправдывает себя [97]. До 1967 года профилактика КЧС основывалась на применении кристаллвиолетвакцины, которая, несмотря на ряд недостатков, в свое время играла положительную роль в санации хозяйств [9]. С 70-х годов в арсенале средств специфической профилактики КЧС первое место занимают живые вакцины из штамма К и ЛК. С помощью живых вирусвакцин можно создавать специфическую защиту от заболеваний и гибели 100% вакцинированных свиней уже через 48 часов после однократного внутримышечного введения ее в дозе 6,0 lg ИмД50 /гол [20]. Вакцина может быть с успехом использована для обрыва инфекции в неблагополучных хозяйствах и до минимума сократить экономический ущерб [28].

Однако, общепризнанным является существующее противоречие в вакцинопрофилактике: вакцинация свиноматок создает колостральный иммунитет у приплода, который припятствует формированию у поросят достаточно эффективного иммунного ответа на вакцину. Ослабление колострального иммунитета с возрастом поросят и слабый иммунный ответ на вакцину после прививки создает ситуацию, когда самая чуствительная возрастная группа молодых животных не защищена против вируса [32].

Таким образом, существующие проблемы вакцинопрофилактики объективны и требуют своего решения.

Независимо от стратегии борьбы с инфекцией, эффективная диагностика КЧС-один из решающих факторов успешной борьбы с данной болезнью [60]. Своевременная постановка диагноза в случае возникновения КЧС обеспечивает проведение соответствующих мероприятий по ликвидации в наиболее сжатые сроки и предотвращение дальнейшего распространения заболевания.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Бьядовская, Ольга Петровна

5.ВЫВОДЫ

1. Разработан вариант непрямого иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу классической чумы свиней, использующий в качестве антигена рекомбинантный белок Е2 вируса КЧС, при тестировании сывороток крови свиней методом одного разведения. Оптимизированы условия проведения реакции, определены допустимые критерии качественной оценки результатов.

2. Специфичность и чувствительность разработанной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА относительно референтного теста (РН) составляет 96,5% и 95,9%, а в сравнении с CHEKIT-ИФА - 97,6% и 98,6%, соответственно.

3. В процессе изучения динамики пассивного гуморального иммунитета у поросят, полученных от вакцинированных за 30-40 дней до опороса свиноматок с помощью разработанной тест-системы было установлено, что максимальное значение процента позитивности (85%) наблюдалось на 7-15 день и затем постепенно снижалось до минимального положительного значения (30%) у 40-45 дневных поросят.

4. Изучены особенности формирования поствакцинального гуморального иммунитета у серонегативных подсвинков, привитых живой вирусвакциной КЧС штамма «СИНЛАК». Используя разработанную тест-систему показано, что на 21 день после вакцинации уровень антител достигал значений 5,35,5 log 2 в РН и 45-65 %П в Н-ИФА. Через 14 дней после контрольного заражения уровень антител возрастал до 5,5-6,5 log2 в РН и 62-96 %П в Н-ИФА.

5. Установлено, что уровень антител у поросят на 21 день после первой вакцинации вирусвакциной КЧС штамма «ЛК» повышается до 60-65% (процент позитивности), а после ревакцинации - до 95% (процент позитивности).

6. Разработана тест - система на основе непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА для выявления антигена вируса КЧС в вируссодержащих материалах, использующая иммобилизованный на планшете рекомбинантный белок Е2 вируса классической чумы свиней.

Определены оптимальные условия постановки реакции, установлен позитивно-негативный порог, разграничивающий неспецифическую (процент ингибиции меньше 20%) и специфическую (процент ингибиции больше 30) реакцию.

7. Сравнение результатов, полученных при использовании непрямого блокирующего варианта ИФА и Serelisa-ИФА показало, что чувствительность и специфичность разработанной тест-системы составляли 96% и 95,3%, соответственно.

8. Непрямой жидкофазный блокирующий вариант ИФА позволяет обнаруживать антиген вируса КЧС в образцах патологического материала и в инфицированных вирусом культурах клеток, а также определять уровнь накопления вируса КЧС в отдельных органах и тканях инфицированных животных. Разработанная тест-система позволяет обнаруживать в пробах вируссодержащего материала антиген вируса КЧС в пределах 103,5-Ю5'0ККИД5о/мл.

6.ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются: «Тест-системы для определения антител и антигена вируса КЧС в пробах сыворотки крови свиней и вируссодержащем материале, в которых в качестве антигена используется рекомбинантный белок Е2 вируса КЧС»

Иммуноферментные тест-системы одобрены ученым советом института, утверждены директором ВНИИЗЖ и рекомендуются для оценки напряженности поствакцинального иммунитета и для выявления антигена вируса КЧС в вируссодержащих материалах и культурах клеток, зараженных вирусом КЧС.

Кроме того, предлагаются для использования: «Методика выявления антител к вирусу классической чумы свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного белка gp55 (Е2)»;

110

Методика выявления антител к вирусу классической чумы свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного белка gp55 (Е2) при тестировании проб в одном разведении»;

Методика выявления антигена вируса классической чумы свиней в непрямом жидкофазном блокирующем варианте иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного белка Е2» :

Методики проверены в комиссионных опытах, одобрены ученым советом и утверждены директором института.

Ill

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бьядовская, Ольга Петровна, 2002 год

1. Антитела. Методы / Под ред. Д.Кэтти.- М.: Мир, 1991.- 382 с.

2. Багрецов В.Ф., Зелютков Ю.Г. Использование метода ИФА для выявления антител к вирусу чумы свиней // Сб. науч. тр. / Витебск, вет. ин-т.- 1992.-Т.20.-С.4-5.

3. Вишняков И.Ф., Куриннов В.В., Яшин А.Т. Некоторые особенности КЧС, затрудняющие ее диагностику: Обзор литературы РФ // Ветеринария.1985.-№9.-С.29-31.

4. Вишняков И.Ф.,Куриннов В.В.,Яшин А.Т.,Олейник Л.Я. Усовершенствование и разработка средств и методов диагностики чумы свиней // Эпизоотол. и меры борьбы с инфек. болезнями животных.-Новосибирск,1985.- С. 152155.

5. Вишняков И.Ф., Мищенко Н.К., Куриннов В.В. и др. Классическая чума свиней// Ветеринария.-1998.-№11.-С.21-27.

6. Вишняков И.Ф. Диагностика классической чумы свиней //Ветеринария.1986.-№3.-С.27-30.

7. Вишняков И.Ф., Цыбанов С.Ж. Молекулярная биология пестивирусов II Вестн. РАСХН.-1996.-№3.-С.70-73.

8. Волкова М.А. Разработка и применение иммуноферментных тест-систем для определения антител к вирусу ССЯ-76 и оценки качества вируссодержащего сырья: Дис. канд. биол. наук.-Владимир, 1999.-151 с.

9. Джупина С.И. Классическая чума свиней. Эпизоотический процесс и его контроль,-М.,2001.-172 с.

10. Дудникова Е.К. Разработка и применение ИФА для выявления противоящурных антител в сыворотках крови животных:

11. Дис.канд.вет.наук,- Владимир, 1997.-161 с.

12. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа.-М.: Высшая школа, 1991.-288с.

13. Ильясова Г.Х., Юсупов Р.Х. Прямой метод ИФА для выявления антител к вирусу КЧС // Тез.секц. и стенд.сообщ. всесоюз.иммунол.съезда. Сочи. 1517 ноября, 1989.-М., 1989.-Т.1 .-С.217.

14. Ильясова Г.Х., Юсупов Р.Х., Барсков В.Г. Индикация вируса классической чумы свиней методом иммуноферментного анализа // Вирусные болезни с.-х. животных: Тез. докл. всерос. науч.-практ. конф.- Владимир, 1995.-С.42.

15. Куриннов В.В. Средства и методы дифференциальной лабораторной диагностики классической чумы свиней // Вестн. РАСХН.-1999.-№3.-С.55-59.

16. Куриннов В.В., Вишняков И.Ф., Хухоров И.Ю. Современные эпизоотические, патогенетические и диагностические особенности классической чумы свиней II Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Матер, науч. конф. ВНИИВВиМ.- Покров, 1992.-Ч.1.-С.75-86.

17. Луговская Н.В. Совершенствование методов диагностики инфекционного бронхита кур: Дис.канд. биол.наук. -Владимир,2001.-142 с.

18. Лыска В.М., Куриннов В.В., Вишняков И.Ф. Метод иммунопероксидазного монослоя для обнаружения антител к вирусу КЧС // Вирусные болезни с.-х животных : Тез. докл. всерос. науч.-практ.конф.- Владимир, 1995.-С.45.

19. Малярец П.В., Гусева Е.В., Ануфриева Т.А. Классическая чума свиней: Обзор литературы.-Владимир, 1995.-58С.

20. Непоклонов Е.А., Алипер Т.И., Ленева И.А. Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней // Вопр. вирусологии.-1998.-№4.-С.152-158.

21. Непоклонов Е.А., Алипер Т.И., Ленева И.А. Применение моноклональных антител для изучения вируса КЧС // Вопр. вирусологии.-1999.-№2.-С.54-60.

22. Новиков Б.В., Илькиев Р.П., Семенихин А.Д. Содержание Ig М, G антител, нейтрализующих вирус КЧС в сыворотках крови подсосных свиноматок и поросят // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат.науч.конф. ВНИИВВиМ.-Покров,1992.-Ч.1.-С.128-129.

23. Практическая химия белка / Под ред. А.Дарбре.-М.: Мир.-1989.-621 с.

24. Селянинов Ю.О. Оценка иммуногенности рекомбинантного вируса осповакцины экспрессирующего структурные белки вируса КЧС // Акт.вопр.вет.:Тез. докл.1 науч.-практ. конф. факт. вет. мед. НГАУ.-Новосибирск,1997.-С.75-76.

25. Сергеев В.А. Тогавирусы // Вирусные вакцины.-Киев,1993.-С.292-294.

26. Собко А.И., Прискока В.А., Синицын В.А., Кирилов В.И. Метод иммуноферментного анализа для диагностики классической чумы свиней // 36. Стат.наук-практ. конф.: Збереженюто молодняка с/г тварин-запорука розвитку твариннцтво Укражи.-Харьков,1994.-С.61-62.

27. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Чума свиней // Вирусные болезни животных.-М.,1998.-С.111-135.

28. Хухоров И.Ю., Куриннов В.В., Вишняков И.Ф. Оценка поствакцинального иммунитета против классической чумы свиней в условиях свиноводческих хозяйств // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.:Матер, науч. конф. ВНИИВВиМ Покров, 1992.-Ч.1.-С.93-99.

29. Хухоров И.Ю., Вишняков И.Ф., Лыска В.М., Трапезникова Т.М. Реакция нейтрализации флюоресцирующих бляшек при диагностике классической чумы свиней II Ветеринария.-1991 .-№6.-С.26-28.

30. Цибезов В.В., Богданова B.C., Забережный А.Д., и др. Применение рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней для иммунизации животных // Вопр. вирусологии.-2000.-№2.-С.36-41.

31. Цыбанов С.Ж., Куриннов В.В., Вишняков И.Ф., Семенихин А.Л. Современные достижения в изучении пестивирусов // Ветеринария.-1995.-№3.-С.14-18.

32. ЗЗ.Чермашенцев В.И., Попов В.И. Динамика колострального иммунитета против классической чумы у подсосных поросят // Вопр. вет. вирусол.,микробиол.,эпизоотол.:Матер.науч. конф. ВНИИВВиМ.-Покров,1992.-С.82-85.

33. Afshar A. Application of peroxidase labelled antibody assays for detection of porcine IgG antibodies to hog cholera and bovine viral diarrhea viruses // J.Virol. Meth.-1989 Vol.23,№3.- P.253-262.

34. Bouma A., De Smit A.J.,De Kluijver E.P. et. al. Efficacy and stability of a subunit based on glycoprotein E2 of classical swine fever virus // Vet. Microbiol. -1999.-Vol.66.-P.101-114.

35. Bouma A., De Smit A.J., De Jong. et. al. Determination of the onset of the herd-immunity induced by E2 sub-unit vaccine aganist classical swine fever virus // Vaccine .-2000.-Vol.18,- P. 1374-1381.

36. Bruschke C.J.,Moormann R.J., van Oirschot J.T., van Rijn P.A. A subunit vaccine based on glycoprotein E2 of bovine virus induces fetal protection in sheep against homologous challenge // Vaccine.-1997.-Vol.15.-P. 1940-1945.

37. Buonavoglia C. Falcone E., Pestalozza S. et. al. A rapid serum neutralization test in microplates for the detection of antibodies to hog cholera virus // J. Virol. Meth.-1989.-Vol.23, №1 .-P.77-79.

38. Carbrey E.A. Diagnostic Procedures // Classical Swine Fever and Related Virllnfections.-Boston,1988.-P.99-114.

39. ClavijoA., Zhou E.-M., Vydelingum S., Heskert R. Development and evaluation of a novel antigen capture assay for the detection of classical swine fever virus antigens // Vet. Microbiol.-1998.-Vol.60.-P.155-168.

40. Collet H.C. Molecular genetics of pestiviruses // Comp.lmmun. Microbiol.-Infect. Dis.- 1992. -Vol.15. P. 145-154.

41. Colijn E.O., Bloemraad M., Wensvoort G. An improved ELISA for the detection of serum antibodies directed aganist classical swine fever virus // Vet. Microbiol.-1997.-Vol.59.-P. 15-25.

42. Dekker A., Wensvoort G., Terpstra C. Sex antigenic groups within the genus pestivirus as identified by cross- neutralization assays // Vet. Microbiol.-1995.-Vol.47.-P. 34-56.

43. Depner K.R., Muller Т., Lange E. et. al. Tpansient CSFV infection in wild boar piglets partially protected by meternal antibodies // Dtsch tierarztl Wschr.-2000.-Bd. 107.-S.66-68.

44. Deregt D., Bolin S.R., Heckert R.A., Loewen K.G. Monoclonal antibodies to bovine viral diarrhea virus: cross-reactivities to field isolates and hog cholera virus strains // Canad.J.Vet. Res.-1994.-Vol.58, №1.- P.71-74.

45. Dorset M. De Schweinitz E.A. New facts concerning the etiology of hog cholera // U.S. Bur. Anim. Ind. Ann. Rep.-1984 -V.20.-P.157-162.

46. De Smit A.J., Eble P.L., De Kluijver E.P. et. al. Laboratory decision-making during the classical swine fever epidemic of 1997-1998 in the Netherlands // Prev. Vet. Med.-1999.-Vol.42, №3/4.- P. 185-199.

47. De Smit A.J., Eble P.L., De Kluijver E.P. et.al. Laboratory experience during the CSFV epizootic in the Netherlands // Vet. Microbiol.-2000.-Vol.73, №2/3.-P. 197-208.

48. De Smit A.J., Van Gennip H.G., Miedema G.K. et. al. Recombinant (CSF) virus derived from retain their avirulent and immunogenic characteristies // Vaccine-2000.- Vol.18.-P.2351 -2358.

49. Edwards S., Moennig V., Wensvoort G. The development of an international reference panel of monoclonal antibodies for the differentiation of hog cholera virus from other pestivirusess // Vet.Microbiol.-1991 .-V.29.-P. 101-108.

50. Edwards S. Survival and inactivation of classical swine fever virus // Vet. Microbiol-2000.- Vol.73, №2/3.- P.175-181.

51. Edwards S., Fukusho A., Lefevre P.C. et. al. Classical swine fever: the global situation // Vet. Microbiol.- 2000.-Vol.73, №2/3.- P.103-119.

52. Elber A.R., Stegeman A., Moser H. et. al. The classical swine fever epidemic 1997-1998 in Netherlands: descriotive epidemiology // Prev. Vet. Med.-1999.-Vol.42, №3/4.- P. 157-184.

53. Einzmann P.-J. Molecular biology of the virus // Classical Swine Fever and Related Virul lnfections.-Boston,1983.- P.81-98.

54. Erickson G. Hog cholera // Vet. Diagn. Virology / Ed. A.E. Castro, W.P. Heushele.-St. Louis, 1992.-P.228-230.

55. Gay В., Chappuis C., Coulibaly C.O.Z., et.al. Comparative analysis of monoclonal antibodies against pestiviruses : report of an international workshop // Vet. Microbiol.-1989.-V.20.-P. 123-129.

56. Greiser-Wilke l.,Moenning V., Coulibaly C.O.Z. et.al. Identification of conserved epitopes on a hog cholera virus protein II Arch. Virol.-1990.-Vol.11, №3/4.-P.213-225.

57. Hammond J.M., McCoy R.J., Jansen E.S. et.al. Vaccination with a singl dose of a recombinant porcine adenovirus expressing the classical swine fever virus gp55(E2) gene protects pigs against classical swine fever // Vaccine.-2000.-Vol.18.- P.1040-1050.

58. Harkness J.W. Classical swine fever and its diagnosis: A current view II Vet. Rec.-1985.-Vol.116, №11. P.288-293.

59. Hayhow C.S. Development of antigen capture ELISA for detection of Enterovirous in commercial turkeys // Avian Dis.-1993.-Vol.37. P.375-379.

60. Have P. Detection of antibodies against swine fever virus by enzyme-linked immunosorbent assay ELISA //Acta Vet. Scand.-1984.-Vol.25.-P.462-465.

61. Hog cholera ( Classical swine fever) II OIE. Manual of Standarts for Diagnostic Tests and Vaccines. 2-nd ed.-Paris, 1992.-P. 109-122.

62. Horzinek M.C., Pestiviruses taxonomic perspectives // Arch. Virol.-1991.-V.3.-P.1-5. '

63. Hess R.G., Coulibaly C.O.Z., Greiser-Wilke I. et.al. Identification of hog cholera viral isolates by use of monoclonal antibodies to pestiviruses // Vet. Microbiol. 1988.-Vol.16,№4.-P.315-321.

64. Hulst M.M., WestraD.F., WensvoortG., Moorman R.J.M. Glycoprotein E1 of hog cholera virus expressed in insect cells protect swine from hog cholera // J. Virol.-1993.-Vol.67.-P.5435-5442.

65. Jensen M. Detection of antibodies aganist hog cholera virus and bovine diarrhea virus in porcine serum. A comparative examination using CF, PLA, NPLA assay

66. Acta. Vet. Scand.-1981.-Vol.22.-P.85-98.

67. KadenV., Steyer H., Strebelow G. et.al. Detection of low virulent CSFV in bload of experimentally infected animals: comparison of different methods //Acta. Virol.- 1999. -Vol.46,№6.-P.373-380.

68. Koenen F., Gay A., Leferbavre J. et al. Evalution of the complex trapping blocking-ELISA in serological survey during the Belgian classical swine fever epizootic in 1990 //Vet. Rec.-1992.-Vol.131.-P.396.

69. Konig M., LengsfeldT., Pauly T. et.al. Classical swine fever virus: independent induction of protective immunity by two structural glycoprotein // J. Virol.-1995.-Vol.69.-P.6479-6486.

70. Kosmidou A., Buttner M., Meyers G. Isolation and characterization of cytopathogenic classical swine fever virus (CSFV) // Arch. Virol.-1998. -Vol. 143.-P. 1295-1309.

71. Kosmidou A, Ahl R.,Weiland E. Differentiation of classical swine fever virus (CSFV) strains using monoclonal antibodies against structural glycoproteins // Vet.Microbiol.-1995.-V.47.-P.111-118.

72. Kumagai Т., Shimizu Т., Ikeda S. etal. A new in vitro method (END) for detection and measurements of hog cholera virus and its antibody by means of effect of HCV on Newcastle diseases // J. lmmunol.-1961.-Vol.87,№3.-P.245-256

73. Laevens H., Koenen F., Deluyker H., De Kruif A. Experimental infection of slaughter pigs with classical swine fever virus: transmission of the virus, course of the disease and antibody response // Vet. Rec.-1999.- Vol.145, №9.-P.243-248.

74. Lai S.S., Ho W.G. Application of monoclonal antibody on DOT immunoassay for the detection of hog cholera viral antigens and antibodies // J.Chin. Soc. Vet. Sci.-1989.-Vol. 15, №1.4P.19-25.

75. Laude H. Hog cholera virus : Art and fact //Ann. Rech. Vet.-1987.-Vol. 18, №2.-P.127-138.

76. LeforbanY., Edwards S., Ibata G. etal. A blocking ELISA to differentiale hog cholera virus antibody in pig sera from those due to other pestiviruses //Ann. Rech. Vet.-1990.-Vol.21.-P.119-129.

77. Liess В. Serology // Classical Swine Fever and Related Viral Infections. -Boston, 1988.-P. 115-142.

78. Loken Т., Krogsrud J., Larsen I.L. Pestivirus infections in Norway serological investigation in cattle, sheep and pigs //Acta. Vet. Scand.-1991.-Vol.32, №1.-P.27-34.

79. Lowing P., Ibata G., Needham J., Paton D. Classical swine fever virus diversity and evoluation // J.Gen. Virol.-1996.-Vol.77, V.6.-P.1311-1321.

80. Mc Claren M.L., Lillywhite J.E., Andrew C.S. Indirect enzyme linkes immunosorbent assay (ELISA): Practical aspects of standartization and quality control // Med. Lab. Sci.-1981.-Vol.38.-P.245-251.

81. Meyers G., Sterk R.,Tautz N. et.al. Molecular biology of Pestiviruses and comparison with HCV // Viral Hepailis and River Disease.-Tokyo ets, 1994.- P. 106-110.

82. Mittelholezer C., Moser C., Tratschin J.D., Hofmann M.A. Porcine cells persistenly infected with classical swine fever virus protected from pestivirus induced cytopathiс effect // J.Gen. Virol.-1998.-Vol.79,№12.-P.2981-2987.

83. Moenning V. Characteristics of the virus // Classical Swine Fever and Relatedlnfections7 E3^B7Tiess.-Lancaster,1988.-P.55-80.

84. Moenning V. Pestiviruses: review // Vet. Microbiol.- 1990.-Vol.23.-P.34-35.

85. Moening V., Schaegemon G., Dahle J., et.al. A new approach for the diagnosis of hog cholera // Dtsch. tierarztl. Wschr.-1990.-Bd.97.-S.91-93.

86. Moening V. Introduction to classical swine fever: virus, disease and control policy // Vet. Microbiol.-2000.-Vol.73,№2/3.-P.93-102.

87. Moormann R.J., Bouma A., Kramps J.A. et.al. Development of a classical swine fever virus subunit marker vaccine and companion diagnostic test // Vet. Microbiol.-2000.-Vol.73.-P.209-219.

88. Moormann R.J., Warmerdam P., Van der Meer B.et. al. Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera virus strain Brescia and mapping of the genome protein E1 //Virology.-1990.-Vol.177.-P. 184-198.

89. Moser C., Ruggli N., Tratschin J.D., Hofman M.A. Detection antibodies against classical swine fever virus in swine sera by indirect ELISA using recombinant envelope glycoprotein E2 // Vet. Microbiol.-1996.-Vol.51.-P.41-53.

90. Muller V. A., Depner K.P., Liess B. Evalution of a gp55(E2) recombinant-based ELISA for the detection of antibodies indused by classical swine fever virus // Dtsch. tierarztl. Wschr.-1996.-Bd.103.-S.451-453.

91. Paton D.J., Ibata G., Edwarda S., Wensvoort G. An ELISA detecting antibody to conserved pestivirus epitopes // J.Virol. Meth.-1991.- Vol.31, №2/3.-P.315-324.

92. Paton D.J., Sands J.J., Lowings J.P. et al. A proposed division of the pestivirus genus using monoclonal antibodies, supported by cross-neutralization assays and genetic sequencing//Vet.Res.-1995.-Vol.26.-P.92-109.

93. Pearson J. B. Hog cholera diagnostic techniques II Compar. Immunol. Microbiol. Infect. Dis.-1992.-Vol. 15, №3.-P.213-219.

94. Penzes Z., Meszaros I. Comparison of different computational methods for measuring antibodyies to avian Infectious bronchitis virus in singl serum dilution //Acta. Vet. Hungarica.-1992.-Vol.40.-P.311-321.

95. Rivera V.B., Gualandi G.L., Ferrari M.et al. The lapinized Chinese (LC) strain of hog cholera virus (HCV) protects pigs aganist experimental infection with-virulent HCV// Microbiol. 1990.-Vol.13,№3.- P. 185-189.

96. Van Rijn P.A., Miedema G.K.W., Wensvoort G. et al. Antigenic structure of hog cholera virus // J. Virol. -1999.-Vol.68.-P.3934-3942.

97. Van Rijn P.A., Bossers Д., Wensvoort G., Moorman R.J.M. Classical Swine fever virus (CSFV) envelope glycoprotein E2 contaning one structural unit protect pigs from lethal CSFV challenge// J.Gen. Virol.-1996.-Vol.77.-P.2737-2745.

98. Ruggli N., Moser C., Hofman M.A., Tratschin J.D. Expression of recombinant glycosylated and nonglycosylated protein E2 of classical swinefever virus for diagnostic purposes // 3 Cong. Europ. Soc. Vet. Virol.-Interiaken, Switzerland, 1994.-P.4-14.

99. Rumenapf Т., MeyersG., Stark R., Thiel H.-J. Hog cholera virus characterization of specific antiserum and identification of cDNA clones // Virol.- 1989.- Vol.171 ,№1.-P.18-27.

100. Rumenapf Т., MeyersG., Stark R., Thiel H-J. Structural protein of hog cholera virus expressed by vaccinia virus: further characterization and induction of protective immunity// J. Virol.-1991.-Vol.65.-P.589-597.

101. Rumenapf Т., MeyersG., Stark R., Thiel H-J. Molecular characterization of hog cholera virus // Arch. Virol.-1991.- Suppl.3.-P.7-18.

102. Rumenapf Т., Weiland E., Ahl R., Stark R. et.al. A second envelop glycoprotein mediates neutralization of a pestiviruses, hog cholera virus // J.Virol.-1992.-Vol.66.-P.3677-3682.

103. Saunders G.C. Development and evaluated of an enzyme labeled test for the rapid detection of hog cholera antibodies // Am.J.Vet. Res.-1977.-Vol.38,№1.-P.21-25.

104. Schagemann G., Greiser-Wilkel., LiessB. A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological detection of antibodies aganist European hog cholera virus II Tierarztl. Prax.-1991.-Bd.19.-S.54-57.

105. Schrijver R.S., Kramps J.A. Critical factors affecting the diagnostic reliability of enzyme-linked immunosorbent assay formats // Rev. Sci. Tech. Off Int Epiz.-1998.-Vol. 17.-P.550-561.

106. Shannon A.D., Morrissy C., et al. Detection of hog cholera virus antigens^ irTexfDerimentally infected pigs using an antigen capture ELISA // Vet. Microbiol.-1993.-Vol.34.-P.233-248.

107. Snyder D.B., Marquardt W.W., Mallison E.T., RussecE. Rapid serological profiling by enzyme linked immunosorbent assay. 2. Comparison of computation methods for measuring antibody titers in a singl serum dilution // Avian Dis.-1982.-Vol.27.-P.474-484.

108. Stair E.L., Rhodes M.B., Aiken J.M. et.al. A hog cholera virus fluorescence antibody system . Its potential use in stady of embryonic infection II Proc. Soc. Exptl. Biol. Med.-1963.-P.113.

109. Stark R., Rumenapf Т., Meyers G., Thiel H.-J. Genomic localization of hog cholera virus glycoproteins // Virology.-1990.-Vol.174,№1.- P.286-289.

110. Terpstra C. Epizootiology of hog cholera // Classical Swine Fever and Related Viral Infections. -Boston,1988.-P.201-216.

111. Terpstra C., Bloemroad M., GieLkens A.L.J. The neutralizing peroxidase-linked assay for detection of antibody against swine fever virus //Vet. Microbiol.- 1984.-Vol.9.-P. 113-120.

112. Terpstra C., Wensvoort G. Influence of the vaccination regime on the herd immune response for swine fever// Vet. Microbiol.- 1987.-Vol.13,№2.-P.143-151.

113. Terpstra C., Wensvoort G. Natural infection of pigs with bovine viral diarrhoea virus associated with signs resembling swine fever // Res. Vet. Sci.- 1988.-Vol.45, №2.-P.137-142.

114. Terpstra C., Wensvoort G. The protective value of vaccine induced neutralizing antibody titres in swine fever // Vet. Microbiol.-1988.-Vol.16, №2.-P. 123-128.

115. Thiel H.-J., Stark R., Rumenapf Т., Meyers G. Hog cholera virus: molecular composition of virions from a pestivirus // J.Virol.-1991 .-Vol.65.-P.4705-4712.

116. Trautwein G. Patology and pathogenesis of the disease // Classical Swine Fever and Related Viral Infections.-Boston, 1988.-P.27-54.

117. Vanderhallen H., Mittelhozer C., Hofmann M.A., Koenen F. Classical swine fever virus is genetically stable in vitro and in vivo // Arch. ViroL-1999.-Vol.144.- P.1669-1677f

118. Vannier P., Colcanop M., Camera R. et. al. Study of the origin of an epizootic of classical swine fever//J.Vet. Med. Sci.B.-1986.-Bd.33,№4.-S.294-302.

119. Van Oirshot G.T. Description of the virus infection // Classical Swine Fever and Related Viral Infections.-Boston, 1988.-P. 1-25.

120. Van Oirshot G.T. Effect of infections with swine fever virus an immunefunction.3. Antibody response to lipopolysaccharide and sheep red blood cells II Vet.Microbiol.-1983.-Vol.8,№1.-P.97-103.

121. Van Oirshot J.T., De Jong D., Huffels N.D. Effect of infections with swine fever virus on immune functions. 2. Lymphocyte subpopulations // Vet. Microbiol. -1983.-Vol.8,№1.- P.81-95.

122. Van Oirshot J.T., Terpstra G. Hog cholera virus // Virus Infections of Porcines.-Amsterdam, 1989.-P. 113-130.

123. Van Oirshot G.T. Hog cholera // Diseases of Swine.- Ames, Iowa, 1994 -P.274 -285.

124. Van Oirshot J.T. Diva vaccines that reduce virus transmission II J. Biotechnol.-1999.-Vol.73.-P. 195-205.

125. Weiland E., Ahl R., Stark R. etal. A second envelop glycoprotein mediates neutralization of a pestivirus, hog cholera virus II J. Virol.-1992. -Vol.66.-P.3677- 3682.

126. Weiland E., Stark R., Hass B. et al. Pestivirus glycoprotein wich induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide linked heterodimer // J. Virol. -1990.-Vol.64,№8.- P.3563-3569.

127. Weiland F., Weiland E., Unger G. et al. Localization of pestivirus envelope proteins E(rns) and E2 at the cell surface and on hog cholera virus with monoclonal antibodies // J. Gen. Virol.-1999.-Vol.80.-P. 1157- 1165.

128. Wensvoort G. Topografical and functional mapping of the epitopes on Hog cholera virus with monoclonal antibodies // J.Gen.Virol.-1989.-Vol.70.-P.2865-2876.

129. Wensvoort G., Bloemroad M., Terpstra С. An enzyme immunoassay monoclonal antibodies and detecting specifically antibodies to classical swine fever virus // Vet. Microbiol.-1988.-Vol.17.-P.129-140.

130. Wensvoort G., Boonstra J., Bodzinger B.G. Immunoaffiniti purification and characterization of the envelope protein E1 of hog cholera virus// J.Gen.Virol.-1990.-Vol.71 ,№3.-P.531-540.

131. Wensvoort G., Terpstra C., Coonstra J. et al. Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their Use in laboratory diagnosis //Vet. Microbiol.-1986.-Vol.12,№2.-P. 101-108.

132. WensvoortG., TerpstraC., de Kluijver E.P. et al. Antigenic differentiation of pestivirus strains with monoclonal antibodies against hog cholera virus // Vet. Microbiol.- 1989.-Vol.21, №1.-P.9-20.

133. Wong M.L., Liu J.J., Chang Y., Chang T.J. Expression of the glycoprotein E2 of the classical swine fever virus in E.coli // J. Vet. Med. Sci.-1998.-Vol.60.-P.541-544.

134. Zegers J.J.W., Horzinek M.C. Some properties of bovine viral diarrhoea virus and their RNAs // Commis. Europ. Commun. EUR 5904 En.-1977.-P.52-57.

135. Zhou Y., Moenning V., Coulibaly C.O.Z. et al Differentiation of hog cholera and bovine virus diarrhoea viruses in pig using monoclonal antibodies // J. Vet. Med 1989.-Vol.36,№1.-P. 76-80.

136. Van Zijl M.,Wensvoort G., Keuyver E., et al. Live Attenuated Pseudorabies Virus Expressing Envelope Glycoprotein E2 of Hog Cholera Virus Protected Swine Against both Pseudorabies and Hog Cholera // J.Virol. 1991.-Vol.65.-P.2761-2765.к о Й И 1

137. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РФ

138. ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ животных

139. СОГЛАСОВАНО Заместитель'Ди^ек^ора по НИР В.М.Захаров 2000г.1. Статута А.Гусев 2000г.1. МЕТОДИКА

140. ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ В НЕПРЯМОМ ВАРИАНТЕ ИММУНОФЕРМЕНТИОГО АНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА gp 55( Е2)1. Авторы:

141. О.П.Бьядовская, вед. биол. лаб. №13 О.Г. Андреева, главн.техн. лаб. № 13 С.В. Безбородова, м.и.с. лаб. № 13 В.Ф. Ковалишин, с.н.с. лаб. №13 В.Г. Андреев, зав.лаб. № 13

142. Рассмотрена и одобрена Ученым советом ВНИИЗЖ « О 40 2000г. протокол № 9§ 8 » 1от 27 сентября 2000 г. г. Владимир

143. О проведении комиссионной проверки методики выявления антител к вирусуклассической чумы свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа сиспользованием рекомбинантного белка gp55(E2).

144. Составлен комиссией в составе:

145. Байбиков Т.З.- председатель комиссии, заведующий лабораторией,доктор ветеринарных наук, Андреев В.Г.- заведующий лабораторией, кандидат биологических наук,

146. Егорова А.И. старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных--------------------------наук,------------

147. Камалова Н.Е.- старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук,

148. Андреева О.Г.- главный технолог, Бьядовская О.П.- ведущий биолог, Канылина А.В.- ветврач.

149. Результаты качественной оценки сывороток крови свиней, исследованных в непямом варианте ИФА сравнивали с результатами референтного теста-реакцией нейтрализации(РН) и коммерческого теста Chekit-CSF-Sero( Бг.ВоттеН,Щвейцария) .

150. Результаты исследований сывороток крови свиней на наличие антител к вирусу классической чумы свиней в непрямом варианте ИФА, в реакции нейтрализации и с помощью коммерческого теста Chekit-CSF-Sero (Бг.ВоттеН,Щвейцария) представлены в таблице 1.