Разработка и усовершенствование биологических препаратов для диагностики и специфической профилактики хламидиозов животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Евстифеев, Виталий Валерьевич

• Евстифеев, Виталий Валерьевич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Евстифеев, Виталий Валерьевич

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................... 17

2.1 Характеристика возбудителя хламидиоза и вызываемых им заболеваний................................................................... 17

2.2 Методы лабораторной диагностики хламидийных инфекций животных.............................................................................. 48

2.3 Меры борьбы с хламидийными инфекциями животных и их специфическая профилактика................................................. 62

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ................. 77

4 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ............................... 88

4.1 Разработка и усовершенствование средств ретроспективной диагностики хламидиоза животных.................................. 88

4.1.1 Разработка способа получения специфического хламидийного антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза животных...................................................................... 89

4.1.2 Усовершенствование «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных»..................................................................... 103

4.1.3 Разработка наборов для диагностики хламидиоза КРС и свиней вИФА на основе нового антигена....................................... 113

4.1.4 Разработка «Набора препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)»........ 148

4.2 Изучение биологических свойств и стандартизация производственных штаммов хламидий.............................. 179

4.3 Разработка и усовершенствование средств специфической профилактики хламидиоза животных............................... 191

/

4.3.1 Разработка и испытание инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота.............. 191

4.3.2 Усовершенствование «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной».................. 216

4.3.3 Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней......................................................... 248

4.3.4 Разработка ассоциированной вакцины против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней.......................................... 277

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................ 296

6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................. 323

7 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............... 325

8 СПИСОК ИЛЮСТРИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА............ 359

9 ПРИЛОЖЕНИЯ............................................................ 366

9.1 Приложение А1: Патент Российской Федерации на изобретение «Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных» №2485972, от 15.11.2011 г................ 367

9.2 Приложение А2: Патент Российской Федерации на изобретение «Вакцина для специфической профилактики крупного и

мелкого рогатого скота» №2301682, от 06.12.2005 г................ 369

9.3 Приложение АЗ: Патент Российской Федерации на изобретение «Вакцина для специфической профилактики хламидиоза

свиней» №2247577, от 20.12.2002 г..................................... 371

9.4 Приложение Б1: Инструкция по применению «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных»...................... 373

9.5 Приложение Б2: Технические условия «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» (ТУ 9388-020-004923742007)........................................................................... 374

У

9.6 Приложение В1: Свидетельство о государственной регистрации «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» №ПВР-1-2.7/02109.......................................................... 376

9.7 Приложение В2: Декларация о соответствии «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных»....................................... 377

^ 9.8 Приложение ВЗ: Сертификат соответствия «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» № РОСС RU.OBOl .Н00022... 378

9.9. Приложение Г1: Инструкция по применению «Набора

препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого

скота методом иммуноферментного анализа»........................ 379

9.10 Приложение Г2: Технические условия «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа» (ТУ 9388-009-00492374-2010)..... 380

/ 9.11 Приложение Д1: Инструкция по применению «Набора

препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом иммуноферментного анализа»........................................... 382

9.12 Приложение Д2: Технические условия «Набор препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом иммуноферментного анализа» (ТУ 9388-005-00492374-2011)................................. 383

9.13 Приложение El: Временное наставление по применению набора препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)...................................... 385

/ 9.14 Приложение Е2: Технические условия «Набор препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)» (ТУ 9388-005-00492374-01)............ 386

9.15 Приложение Ж: Стандарт ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» Штаммы

хламидий от крупного рогатого скота, овец и свиней

(СТО 00492374-004-2008)................................................ 388

9.16 Приложение 31: Технические условия «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» (ТУ 9384-002-00492374-2009)........................ 390

9.17 Приложение 32: Инструкция по применению вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной (08.04.2009 г.)............................................. 392

9.18 Приложение И: Свидетельство о государственной регистрации «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» №ПВР-1-1.8/02340 ............. 393

9.19 Приложение К: Извещение №1 об изменении ТУ 9384-00200492374-2009 «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная»............................... 394

9.20 Приложение Л1: Технические условия «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» (ТУ 9384-013-00492374-2014)........................ 395

9.21 Приложение Л2: Инструкция по применению вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной (30.06.2014 г.)............................................. 397

9.22 Приложение ЛЗ: Регистрационное удостоверение №002410 «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная»....................................... 398

9.23 Приложение Л4: Сертификат соответствия «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» №РОСС RU.OB01.B27619............................ 399

9.24 Приложение М1: Технические условия «Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная» (ТУ 9383003-00492374-00)............................................................. 400

9.25 Приложение М2: Временное наставление по применению вакцины против хламидиоза свиней инактивированной

^ эмульсионной.............................................................. 402

9.26 Приложение Н1: Свидетельство о государственной регистрации «Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная» №ПВР-1 -1.8/02339 ...................................... 403

9.27 Приложение Н2: Технические условия «Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная» (ТУ 9384001-00492374-2009)......................................................... 404

9.28 Приложение НЗ: Инструкция по применению вакцины против хламидиоза свиней инактивированной эмульсионной

/ (08.04.2009 г.)................................................................. 406

9.29 Приложение 01: Регистрационное удостоверение №002409 «Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная»......................................................................... 407

9.30 Приложение 02: Сертификат соответствия «Вакцины против хламидиоза свиней инактивированной эмульсионной» №РОСС RU.OB01.B27618............................................................. 408

9.31 Приложение ОЗ: Технические условия «Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная» (ТУ 9384/ 014-00492374-2014).................................................................... 409

9.32 Приложение 04: Инструкция по применению вакцины против хламидиоза свиней инактивированной эмульсионной

(30.06.2014 г.)................................................................. 411

9.33 Приложение П: Временное наставление по применению вакцины против парвовирусной и хламидиозной болезни

свиней, инактивированной и эмульгированной....................... 412

9.34 Приложение Р: Диплом «За разработку и внедрение диагностических наборов для диагностики хламидиоза

У

сельскохозяйственных животных».................................... 413

9.35 Приложение С: Диплом «За разработку и производство набора для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в

РСКиРДСК»................................................................ 414

х 9.36 Приложение Т: Диплом II степени «За разработку и внедрение в ветеринарную практику вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной, эмульсионной».................. 415

9.37 Приложение У: Диплом I степени за изобретение «Вакцина для специфической профилактики хламидиоза крупного рогатого скота»........................................................................... 416

9.38 Приложение Ф: Диплом III степени за биопрепарат «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная»............................................................... 417

У

У

/

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и усовершенствование биологических препаратов для диагностики и специфической профилактики хламидиозов животных»

1 ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований. Под хламидиозами в настоящее время понимают широкий спектр различных заболеваний диких, домашних и сельскохозяйственных животных, птиц и человека, вызываемых микроорганизмами семейства СЫатусИасеае из порядка СЫатусНа1е8. Объединенные этиологически эти заболевания различаются по характеру течения и клиническим признакам и в зависимости от тропизма возбудителя поражают практически все системы и органы, передаются между видами животных и человеку, что придает этой инфекции признаки классического зооантропоноза [29, 79, 137, 159].

Отсутствие специфичных и выраженных признаков заболевания хламидиозом, часто латентное течение с периодами обострения, недоступность для антибиотиков на внутриклеточной стадии биологического цикла и иммунологическая толерантность больного организма делают эту инфекцию особенно коварной и придают ей широкое распространение.

Анализ данных о действительном уровне .. распространённости хламидиоза и ущербе, наносимом здоровью людей, птицеводству и животноводству, доказывает, что болезнь представляет собой заслуживающую внимания проблему для здравоохранения и сельского хозяйства [52].

Избирательное поражение тканей, органов и систем при хламидиозе животных обусловлено возрастными, половыми особенностями и физиологическим состоянием организма и клинически проявляется в виде абортов у коров, овец, коз, свиней и лошадей; рождения нежизнеспособного и слабого молодняка; пневмоний, артритов, энтеритов, энцефаломиелитов и конъюнктивитов у телят, ягнят, жеребят и поросят. У быков-производителей часто наблюдается латентное течение в форме бессимптомного хламидионосительства с периодической элиминацией возбудителя

сопровождающейся развитием уретрита, орхита, простатита и балянопостита. При этом использование зараженной хламидиями спермы для осеменения коров и телок создают реальные предпосылки для массового распространения инфекции. У инфицированных животных развивается бесплодие, снижается продуктивность и племенная ценность [29, 146, 160,177].

На территориях с высокоразвитым животноводством актуальность хламидиоза возникает еще и в виде проблемы профессиональной патологии среди групп населения, по роду деятельности занятых в этой сфере. Распространение хламидиоза среди сельскохозяйственных животных и домашних птиц не редко приводит к заболеванию людей и значительным потерям поголовья животных, поэтому борьба с хламидиозом имеет народнохозяйственное значение [113]. К тому же проблема осложняется тем, что в медицине не существует средств активной иммунизации населения против хламидиоза, а антибиотики зачастую не дают продолжительного эффекта, что возлагает особую ответственность в этом аспекте на ветеринарную науку.

Учеными были описаны и изучены большинство хламидийных инфекций сельскохозяйственных животных, разработана диагностика и специфическая профилактика хламидиоза [22, 80, 96,. 169]. И хотя в этой области и были достигнуты значительные успехи, уровень имеющихся средств диагностики и специфической профилактики хламидиозов не удовлетворяют современным условиям.

Поэтому очевидно, что разработка и усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики хламидиозов с.-х. животных, а также их внедрение в ветеринарную практику остаются важнейшей задачей на современном этапе развития биологической науки.

У свиней, наряду с хламидиозом, по данным ряда авторов [10, 22, 73, 119], широко распространена парвовирусная инфекция.. Учитывая общность их клинического проявления, а также совместную этиологическую роль этих

возбудителей, представлялось целесообразным создание ассоциированной инактивированной вакцины против парвовирусной и хламидиозной инфекции свиней.

Степень разработанности проблемы. Изучение хламидиозов сельскохозяйственных животных ведется с середины прошлого века, когда McNutt [270] в 1940 году описал энцефалит крупного рогатого скота. За это время хламидиозы были описаны и изучены практически у всех видов животных [64, 159, 191].

В 80-90-е г. учеными были изучены биохимические, антигенные и генетические характеристики хламидийной клетки [208, 259, 280].

В дальнейшем были разработаны средства диагностики и специфической профилактики хламидиозов. В нашей стране крупный вклад в создание средств диагностики хламидийных инфекций внесли сотрудники лаборатории института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР, руководимой И.И. Терских. Ими был разработан оригинальный антиген для внутрикожной пробы у птиц, а также антиген (орнитозный) для РСК [146].

Крупный вклад в решение проблем диагностики хламидиоза внесли и вносят ученые ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). Х.З. Гаффаров, Р.Х. Хамадеев, Р.В. Боровик, P.A. Шафикова и другие. В 70-80-е годы прошлого века ими были разработаны и внедрены в ветеринарную практику диагностические наборы для РСК и РИФ. Хотя позднее предлагались различные современные средства и методы диагностики хламидиозов, такие как ИФА и ПЦР [39, 43, 55, 110], в повседневную практику ветеринарных лабораторий они до настоящего времени не вошли.

Одновременно с этим разрабатывались и средства специфической профилактики хламидиоза сельскохозяйственных животных. Были предложены и внедрены различные инактивированные эмульсионные вакцины против хламидиоза для рогатого скота и свиней. Наиболее эффективные и значимые из них были созданы Караваевым Ю.Д. [64], Щербань Г.П. [193], Хамадеевым Р.Х. [162]. Внедрение этих вакцин

позволило значительно улучшить эпизоотическую ситуацию по хламидиозу в стране и значительно ограничить его распространение. Но, к сожалению, применение разработанных эмульсионных вакцин на практике выявило ряд их недостатков, что было связано, в первую очередь, с высокой степенью вязкости и, как следствие, высокой реактогенностью этих вакцин.

Дальнейшее использование инактивированных эмульсионных вакцин требовало их усовершенствования и изыскания новых подходов к их конструированию, а так же создания ассоциированных вакцин для свиней, против парвовирусной инфекции, которая зачастую протекает совместно с хламидийной инфекцией и имеет схожие признаки.

Цели и задачи исследований. Цель исследований: создание новых и усовершенствование существующих средств диагностики и специфической профилактики хламидиоза сельскохозяйственных животных.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать технологию получения специфического хламидийного антигена обладающего высокой активностью и специфичностью при ретроспективной диагностике хламидийных инфекций у животных;

- на основе разработанного специфического хламидийного антигена усовершенствовать имеющиеся и создать новые средства диагностики хламидиоза;

- изучить иммунобиологические свойства и установить оптимальные требования к условиям культивирования, хранения и поддержания активности производственных штаммов хламидий с целью повышения качества биопрепаратов;

- усовершенствовать технологию изготовления вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота и разработать научную основу для методов лабораторного контроля качества коммерческих серий вакцины;

- испытать вакцину против хламидиоза крупного рогатого скота в производственных условиях, зарегистрировать её и внедрить в ветеринарную практику;

- разработать технологию производства и контроля качества вакцины против хламидиоза свиней, испытать опытно-промышленные серии в производственных условиях, зарегистрировать её и внедрить в ветеринарную практику;

- разработать технологию производства ассоциированной вакцины против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней и испытать её опытно-промышленные серии в лабораторных и производственных условиях.

Научная новизна. Разработана технология получения специфического хламидийного антигена, которая позволяет получать диагностикумы обладающие большей, по сравнению с аналогами, активностью и специфичностью. Научная новизна разработки подтверждена патентом РФ на изобретение №2485972. Технология получения антигена исключает использование ядовитых и аварийно-химически опасных веществ. К тому же предложенный способ является легко воспроизводимым, доступным, что открывает перспективу его промышленного производства.

Была изучена эффективность ретроспективной диагностики хламидиоза в РСК и ИФА с разработанным антигеном у сельскохозяйственных животных, в результате чего усовершенствован «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» и впервые на основе разработанного антигена созданы диагностические тест-системы «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом ИФА» и «Набор препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА».

Впервые разработана технология изготовления хламидийного эритроцитарного диагностикума на основе корпускулярного хламидийного антигена, который обладал высокой активностью и строгой специфичностью, что позволило создать на его основе экспресс-тест для серологического мониторинга хламидиоза - "Набор препаратов для диагностики хламидиозов животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)".

Изучены иммунобиологические свойства производственных штаммов хламидий и впервые разработан «Стандарт ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» штаммы хламидий от крупного рогатого скота, овец и свиней» СТО 00492374-0042008, в котором были определены требования к производственным штаммам хламидий и правила их контроля, использования и хранения.

Усовершенствована технология изготовления «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной». В её составе использован усовершенствованный масло-ланолиновый адъювант, использование которого позволило значительно улучшить её иммуногенные и реактогенные качества. В этих исследованиях впервые была доказана прямая зависимость между вязкостью, реактогенностью и иммуногенностью вакцины, а также установлены оптимальное соотношение антигена с адъювантом и оптимальная вязкость биопрепарата.

Усовершенствованная вакцина была испытана в производственных условиях: её применение в неблагополучных хозяйствах позволило добиться эпизоотического благополучия по хламидиозу. Научная новизна разработки вакцины подтверждена патентом РФ на изобретение №2301682.

Разработана «Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная. Её применение способствовало улучшению эпизоотической обстановки в свинокомплексах. Разработаны эффективные методы лабораторного контроля коммерческих серий вакцины против хламидиоза свиней (Патент №2247577 РФ на изобретение №2301682).

Впервые на основе штамма парвовируса свиней «У-97» и штаммов хламидий «РС-85» и «J1C-87» разработана и испытана ассоциированная «Вакцина против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней инактивированная эмульсионная».

Теоретическая и практическая значимость исследований. Результаты исследований представляют собой теоретическую и практическую ценность, так как дополняют научные знания о хламидиозах сельскохозяйственных животных и парвовирусной инфекции свиней.

Разработаны новые методы и подходы к конструированию ветеринарных диагностических препаратов и вакцин при хламидиозах животных.

В ходе выполнения исследований разработаны или усовершенствованы ряд биологических препаратов, в результате чего некоторые из них внедрены в ветеринарную практику:

- «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» (ТУ 9388-020-004923742007), Регистрационное удостоверение № ПВР-1-2.7/02109;

- «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом ИФА» (ТУ 9388-009-00492374-2010);

- «Набор препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА» (ТУ 9388-010-00492374-2010);

- «Набор препаратов для РНГА при диагностике хламидиоза животных» (ТУ 9388-005-00492374-01);

«Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» (ТУ 9384-002-00492374-2009), Регистрационное удостоверение № ПВР-1-1.8/02340;

«Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная» (ТУ 9384-003-00492374-2009), Регистрационное удостоверение № ПВР-1-1.8/02339;

- «Вакцина против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней инактивированная эмульсионная» (ТУ 9388-028-00492374-07).

Разработан Стандарт ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» «Штаммы хламидий от крупного рогатого скота, овец и свиней» СТО 00492374-004-2008 внедрение которого в процесс производства биологических препаратов повышает их качество.

Методология и методы исследований. Для достижения поставленной цели применяли комплексный подход с использованием целого ряда методов, согласно поставленным задачам: эпизоотологических, клинических,

патоморфологических, серологических, вирусологических,

бактериологических, физических и математических.

Более подробное описание методов и их использование в работе для решения конкретных задач приведено в разделе диссертации «Материалы и методы исследований».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ получения специфического хламидийного антигена и результаты его испытания для диагностики хламидиоза животных в РСК и ИФА.

2. Разработка новых и усовершенствование существующих средств лабораторной диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных, а именно тест-систем для РСК, ИФА и РИГА.

3. Изучение иммунобиологических свойств производственных штаммов хламидий и разработка «Стандарта ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» «Штаммы хламидий от крупного рогатого скота, овец и свиней» СТО 00492374-004-2008».

4. Усовершенствование технологии изготовления и методов лабораторного контроля «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной», а также результаты испытания её эффективности в лабораторных и производственных условиях.

5. Разработка технологии изготовления и методов лабораторного контроля «Вакцины против хламидиоза свиней инактивированной эмульсионной» и результаты испытания её эффективности в лабораторных и производственных условиях.

6. Технология изготовления ассоциированной «Вакцины против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней инактивированной эмульсионной» и результаты испытания её эффективности в лабораторных и производственных условиях.

Степень достоверности и апробация результатов. Статистическую обработку цифрового материала, полученного в трех сериях опытов,

проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стъюденту на персональном компьютере с использованием программного пакета Microsoft Excel 2007.

Основные результаты диссертации представлены и доложены на ежегодных отчетных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 1995-2015 гг.; Всероссийских и международных научных конференциях и симпозиумах (Казань 2003, 2004, 2005, 2007, 2011, 2012, 2013, Покров, 2008; Щелково, 2006, 2008; Харьков, 2013; Чикаго (США), 2010; Ираклион (Греция), 2011; Пиза (Италия), 2014).

Основные результаты докторской диссертации опубликованы в 97 печатных работах, в том числе 23 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, 74 статьи в материалах конференций; получено 3 патента РФ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Характеристика возбудителя хламидиоза и заболеваний им вызываемых.

Еще до нашей эры в древнеегипетских папирусах упоминается заболевание глаз, схожее с трахомой. Наиболее древняя книга медицины -папирус Эберса (XV век до н.э.) содержит описание болезни глаз, которая поражала страны Африки и Азии. Хоть мы и можем предполагать о таком далеком прошлом существования хламидий из древних источников, однако первые, научно подтвержденные сообщения, об инфекциях которые были вызваны микроорганизмами, названными впоследствии хламидиями, опубликованы в XIX веке. В 1882-1886 годах, в ряде европейских стран, при возникновении эпидемии, которая характеризовалась преимущественно атипичной пневмонией, была установлена взаимосвязь между заболеванием человека и болезнью попугаев из тропических стран [179]. Именно в это время заболевание получило название пситтакоз (psittacos - попугай). Далее было установлено, что эта инфекция может распространяться не только попугаями, но и другими видами птиц [111, 237]. В этой связи Терских И.И. [145] предложила именовать данную болезнь орнитозом (от греческого omis - птица), считая, что пситтакоз это лишь частный случай орнитоза.

Связь между хламидиями и трахомой впервые была доказана в 1907 г. Halberstaedter и Prowazek обнаружили внутриклеточные

цитоплазматические включения в эпителиальных клетках конъюнктивы больных трахомой людей. При окраске по Романовскому-Гимзе исследователи различали внутри включений мелкие фиолетово-красные тельца диаметром около 0,25 мкм и несколько более крупные образования, окрашивающиеся в синий цвет. По мнению авторов, синий цвет содержимого включений зависел от клеточных реактивных масс, плотно укутывающих элементарные тельца подобно мантии. Поэтому обнаруженные

внутриклеточные образования были выделены в особую группу микроорганизмов, названных Chlamydozoon (chlamys - мантия, zoon -животное). Вскоре такие же включения были обнаружены при негонококковой бленнореи и уретрите.

В тропических странах была известна паховая лимфогранулема -болезнь, поражающая паховые лимфоузлы. В 1942 году Rake и Jones [287] показали, что формы развития возбудителя и характер окрашивания лимфогранулемы аналогичны с таковыми возбудителя пситтакоза (орнитоза). Основываясь на этом, эти возбудители были условно объединены в группу пситтакоза-лимфогранулемы-трахомы (ПЛТ).

Первое естественное заражение сельскохозяйственных животных возбудителями группы ПЛТ было отмечено Мс Nutt [270] в 1940 году. Он доказал этиологическую роль данной группы возбудителей при энцефалите крупного рогатого скота. Он же в 1945 году выделил от свиней инфекционный агент неизвестной природы, который проявлялся при экспериментальном заражении артритом, перитонитом, плевритом, перикардитом [271]. Позже при сходной патологии выделен с помощью куриных эмбрионов подобный агент, который отнесли к организмам группы ПЛТ (хламидиям) и в условиях эксперимента воспроизвели у поросят заболевание, типичными для которого были перикардит, перитонит, у отдельных животных - артрит.

Stamp в 1950 году [302] изолировал возбудитель из влагалищной слизи абортировавшей овцы; воспроизведением болезни и изучением свойств возбудителя была доказана принадлежность его к группе пситтакоза-лимфогранулемы-трахомы (ПЛТ).

В последующие годы хламидиозная инфекция была описана у крупного рогатого скота, свиней, коз, кошек, собак, пушных зверей и других видов животных [30, 78, 189, 154, 64]. При этом было установлено, что два вида хламидии Clamydia psittaci и Chi. pecorum, являются основной причиной абортов у крупного рогатого скота, коз и овец.

В нашей стране эпизоотическая пневмония поросят хламидийной этиологии была описана в начале 60-годов Николаевой JI.B. с соавторами [100], а затем и рядом других исследователей [19, 50]. Об абортах хламидийной этиологии у свиней впервые сообщили Щербань Н.Ф. с сотрудниками [187]. Выделив возбудитель, авторы экспериментально воспроизвели аборты и мертворождения у свиноматок, вводя им парэнтерально хламидии.

Заболевания свиней хламидиозом регистрировалось в самых различных областях России и ближнего зарубежья [21, 27, 67, 71, 122, 131, 141, 158]. По данным Обухова И.Л. [108], хламидиозы занимают одно из ведущих мест инфекционной патологии у свиней.

Хламидии длительное время имели различные названия. На ранних этапах исследований нечеткость таксономической классификации возникла на уровне определения группы, к которой необходимо отнести данный микроорганизм. В 1966 году американский ученый Page пересмотрел все имеющиеся названия возбудителей группы ПЛТ и предложил выделить их в самостоятельный порядок и включить в единый род Chlamydia, используя за основу термин Chlamydozoon (от греческого chlamys - мантия, zoon -животное).

4 мая 1971 года таксономический комитет американского общества микробиологов закрепил за рассматриваемой группой микроорганизмов название «хламидии», а вызываемое ими заболевание стали называть «хламидиозами».

Дальнейшие исследования показали, их сходство с бактериями, особенно с риккетсиями: содержание нуклеиновых кислот, способ размножения на определенном этапе развития, чувствительность к сульфаниламидам и антибиотикам, наличие клеточной стенки, окрашиваются по Грамму (граммотрицательны) и т.д.

Однако, между хламидиями и риккетсиями существуют определенные различия: отсутствие собственного энергетического метаболизма и системы

переноса электронов у хламидий, риккетсии развиваются в клетках с пониженным метаболизмом, а хламидии, наоборот, развиваются в клетках с высоким уровнем обмена веществ. Риккетсии являются патогенными на всех стадиях развития, хламидии же на определенном этапе (ретикулярные тельца) не обладают инфекционностью [49, 274].

По решению Международной Ассоциации микробиологических обществ 1 января 1980 года хламидии были отнесены к бактериям отряда Chlamydiales, семейства Chlamydiaceae, рода Chlamydia.

Внутри рода хламидии были разделены на два вида: Chi. trachomatis и Chi. psittaci [283, 195].

Chi. psittaci объединял на уровне вида, штаммы возбудителей, ассоциируемые с орнитозом и пситтакозом, а также штаммы, выделенные от больных животных при различных хламидийных заболеваниях [284, 14].

Вид Chi. trachomatis включает патогенные для человека штаммы хламидий, вызывающие трахому - конъюнктивит (паратрахому) и венерическую лимфогранулему [285, 13]. В качестве критериев разделения рода были взяты: наличие или отсутствие гликогена во включениях, чувствительность или резистентность к некоторым противомикробным препаратам, а так же способность образовывать «компактные» или «диффузные» цитоплазматические включения. Но эти признаки задолго до утверждения вышеуказанной классификации были подвергнуты сомнению, так как выявлялись микроорганизмы, которым были присуще противоположные признаки. Позднее появились сообщения о выделении атипичного штамма (TWAR) при респираторном хламидиозе, который отличался от указанных видов морфологическими, серологическими и биохимическими свойствами.

Наиболее радикальные изменения произошли в систематике семейства Chlamydiaceae, в котором в настоящее время выделено два рода - Chlamydia и Chlamydophila. В 1992 году род разделен на 4 вида: Chi. trachomatis, Chi. psittaci, Chi. pneumoniae, Chi. pecorum.

Вид Chlamydia trachomatis встречается только у человека, в нем выявлены 18 антигенных вариантов: возбудители трахомы, венерической лимфогранулемы и урогенитальных хламидиозов человека. Серотипы А, В, Ва, С - возбудители трахомы, в настоящее время все еще являющейся гиперэндемическим заболеванием в странах третьего мира. Переносится через векторы (например, через мух) или через инфекцию, занесенную втиранием. Образование грубых рубцов ведет к потере зрения. Серотипы LI, L2 и L3 размножаются, прежде всего, в лимфоидной ткани и являются возбудителями тропической венерической болезни Lymphogranuloma venereum. Серотипы D, Е, F, G, Н, I, Y и К вызывают урогенитальные заболевания у человека, при этом заражение происходит при половом контакте, а у новорожденных при родах от инфицированной матери.

Вид Chlamydia psittaci часто регистрируется1 у птиц (включает возбудителей орнитоза и пситтакоза), в значительной степени распространен среди животных, поражает человека вызывает атипичную пневмонию, энцефаломиокардит, артрит, пиелонефрит. Вид Chi. psittaci включает не менее 13 сероваров.

Вид Chlamydia pneumonie вызывает острые респираторные заболевания, «мягкую» и атипичную пневмонию у человека. У вида Chi. pneumoniae в настоящее время определен единственный серовар.

Вид Chlamydia pecorum описан сравнительно недавно, изолирован от животных (овец, крупного рогатого скота), имеет сходство с Chlamydia psittaci, включает штаммы TWAR (The Taiwan Acute respiratory agents), IOL-207, KA и CWL. Роль этого вида в патогенезе заболеваний человека неизвестна [23, 135, 140].

Развитие молекулярной биологии привело к открытию новых микроорганизмов с подобным хламидийному геномом и с характерным для них циклом развития. Определение генома уже известных видов хламидий способствовало пересмотру их номенклатуры, согласно современным подходам геносистематики для описания бактериальных таксонов на уровне

видов, родов и семейств. Классификация хламидий и хламидиоподобных микроорганизмов основана на наличие более 95% гомологии в нуклеотидной последовательности генов 16SpPHK и 23 S рРНК для всех представителей рода и более 90% - семейства. Таким образом, ранее неклассифицированные микроорганизмы, имеющие сходный с хламидиями цикл развития, были выделены в четыре дополнительных семейства в составе порядка Chlamydiales - Chlamydiaceae, Parachlamydiaceae, Simkaniaceae, Waddliaceae. [227]. Наиболее радикальные изменения произошли в систематике семейства Chlamydiaceae, в котором в настоящее время выделено два рода: - Chlamydia и Chlamydophila [77].

Род Chlamydia включает три вида: Chlamydia trachomatis, Chlamydia muridarum, Chlamydia suis.

Chi. trachomatis является исключительно паразитом человека, вызывают трахому, венерическую лимфогранулему, урогенитальные заболевания, некоторые формы артрита, конъюнктивит и пневмонию новорожденных у человека; имеет два биовара: трахома (14 сероваров) и лимфогранулема венерум (4 серовара).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Евстифеев, Виталий Валерьевич, 2015 год

SN - -

Из результатов, приведенных в таблице видно, что с коммерческим антигеном из 33 сывороток в титре 1:5 и выше реагировало 11 (33%) проб, а с испытуемым антигеном положительную реакцию дали 20 (60 %) проб. При этом следует отметить, что титры антител с испытуемым антигеном, были несколько выше таковых с коммерческим антигеном. Так средний титр антител с коммерческим антигеном составил 1:7,2, а аналогичный показатель с усовершенствованным антигеном был 1:11,7, что выше в 1,6 раза.

Сыворотки крови иммунизированных против хламидиоза овец реагировали с обоими антигенами, но выявлялась существенная разница в титрах специфических антител. Так, с коммерческим антигеном титры хламидийных антител были на уровне 1:80, 1:80 и 1:20, тогда как с испытуемым антигеном аналогичные показатели были несколько выше -

1:320, 1:320 и 1:160 соответственно. В среднем титр антител у вакцинированных против хламидиоза овец с испытуемым антигеном превышал этот показатель по сравнению с коммерческим антигеном в 4,4 раза.

Сыворотка крови овцы, не вакцинированной против хламидиоза, в РСК с хламидийными антигенами не реагировала.

Таким образом, проведенные исследования позволили установить более высокую активность и специфичность предлагаемого антигена по сравнению с коммерческим для выявления специфических хламидийных антител в сыворотках крови животных в реакции связывания комплемента.

Полученные положительные результаты испытания специфического хламидийного антигена, изготовленного по новой технологии для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных, позволили нам расширить круг проводимых исследований. Начиная с 2006 и по 2012 годы все поступающие для исследования на хламидиоз в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» сыворотки крови животных параллельно исследовались с двумя антигенами, что позволило получить более объективную картину.

Для этих целей по новой технологии было изготовлено 15 серий антигена (таблица№10). Все серии антигена были активны (титр в РСК не менее 1:64) и специфичны, т.е. не наблюдалось перекрестных реакций с гетерологичными сыворотками крови. Так же не было выявлено случаев антикомплементарности антигенов.

В этот период в секторе по производству лечебных средств, а затем и в лаборатории вирусологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» с целью диагностики хламидиоза исследованию в РСК было подвергнуто 2985 сывороток крови крупного и мелкого рогатого скота, свиней и лошадей более чем из 90 неблагополучных по хламидийной инфекции хозяйств Республики Татарстан и других регионов России. Данные этих исследований обобщены в таблице №11.

Таблица №10 - Показатели активности антигенов изготовленных по новой технологии с 2006 по 2012 годы.

№ серии Активность антигена (титр в РСК со специфиической стандартной сывороткой крови) Активность сыворотки (титр специфической хламидийной сыоротки с антигеном Дата производства антигена (мес.год)

1 1:256 1:80 01.2006

2 1:256 1:40 03.2006

3 1:512 1:160 03.2007

4 1:128 1:40 09.2007

5 1:512 1:80 12.2007

6 1:256 1:80 04.2008

7 1:256 1:80 09.2008

8 1:256 1:160 01.2009

9 1:512 1:80 02.2009

10 1:64 1:40 01.2010

11 1:512 1:80 05.2010

12 1:512 1:160 02.2011

13 1:512 1:80 09.2011

14 1:128 1:80 12.2011

15 1:512 1:160 03.2012

Таблица №11 - Данные исследования сывороток крови сельскохозяйственных животных на хламидиоз в РСК двумя антигенами (Р<0,001).

Кол-во Количество исследован- Новый антиген Традиц. антиген

Год обследованных хозяйств Кол-во/процент положительных проб Кол-во/процент положительных проб

ных проб

2006 9 356 93/26 64/18

2007 12 495 154/31 121/24

2008 14 365 65/18 39/11

2009 8 335 63/19 32/10

2010 21 413 103/25 69/17

2011 16 685 98/14 55/8

2012 11 336 53/16 31/9

ИТОГО: 91 2985 629/21 407/14

Как видно из приведенных в таблице данных, в РСК, с использованием предлагаемого нами антигена, выявлена положительная реакция у 629 исследованных животных, что составило 21% из числа исследованных. Антиген, традиционно применяемый в составе набора для РСК, выявил всего 407 или 14% положительных проб из общего числа. Так, установлено, что с использованием предлагаемого антигена удавалась выявлять в 1,5 раза больше положительных результатов, чем при использовании коммерческого антигена, приготовленного по старому способу, что говорит о его более высокой активности.

При этом следует отметить, что реакция связывания комплемента с антигеном, изготовленным по новой технологии, была всегда воспроизводимой, а ее результаты были корректны и логичны. Нередко положительные результаты РСК подтверждались выделением возбудителя от больных животных на развивающихся куриных эмбрионах.

Так, например, после предварительного установления диагноза на хламидиоз в СХПК им. Вахитова Кукморского р-на, когда положительно на хламидиоз в 2008 году реагировало 4 из 20 проб в РСК с новым антигеном,

нам удалось выделить изолят возбудителя хламидиоза и идентифицировать его морфологическими, сероиммунологическими и вирусологическими методами. Аналогичные результаты были получены и в других хозяйствах: в АО «КВ-Агро» "Азалеево" Зеленодольского р-она РТ, АО «КВ-Агро», «Алькеево» Верхнеуслонского р-она РТ, «Серп Молот» Высокогорского рона РТ и других.

В дальнейшем, учитывая положительные результаты лабораторных исследований, предложенная нами технология получения антигена была использована при изготовлении «Наборов антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных», в результате с учетом требований Правил GMP (ГОСТ Р 52249-2009) разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация: технологические регламенты, ТУ и инструкции по применению [Приложения Б1, Б2].

В 2008 году, в соответствии с приказом Министерства сельского хозяйства РФ от 1 апреля 2005 года за №48 «Об утверждении правил государственной регистрации лекарственных средств для животных и кормовых добавок» и на основании проведенных нами исследований и разработанных, совместно с сотрудниками ФГУ «ВГНКИ», нормативных документов, регламентирующих изготовление, контроль и применение испытанного нами биопрепарата, «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных

животных» был впервые зарегистрирован Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору для применения на территории Российской Федерации от 3 марта 2008 года (Регистрационный № ПВР-1-2.7/02109) [Приложение В1].

В последующем применение наборов регламентировалось согласно Федеральному Закону Российской Федерации (ФЗ №61) «Об обращении лекарственных средств на территории Российской Федерации» от 12.04.2010 года.

В связи с новой редакцией Федерального закона (ФЗ №61) «Об обращении лекарственных средств на территории Российской Федерации» от 2012 года, диагностические средства, не имеющие непосредственного контакта с организмом животных, были исключены из перечня лекарственных средств и не подлежали обязательной регистрации и сертификации.

В связи со сроком окончания регистрации, в 2014 году «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» в измененном составе на основе разработанного нами антигена прошел процедуру декларации и сертификации в ФГБУ «ВГНКИ», что было подтверждено документально:

- «Декларация о соответствии» принятая на основании протокола испытаний №91/д-4.1.2/142 от 11.06.2014 ИЦ ФГБУ «ВГНКИ» (РОСС БШ. 0001/21ФВ02) [Приложение В2];

- Сертификат соответствия РОСС 1Ш.ФВ01.Н00022 на продукцию «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» [Приложение ВЗ].

В 2014 году «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» участвовал в конкурсе на поставку товаров для нужд субъектов РФ в соответствии с Федеральным законом от 5 апреля 2013 года №44-ФЗ «О контрактной системе в сфере закупок товаров, работ, услуг для обеспечения государственных и муниципальных нужд» и согласно государственному контракту №1052/25 с Министерством сельского хозяйства Российской Федерации от 08 июля 2014 года поставлялся во все субъекты РФ.

Всего, в течение 2014 года, на основе антигена, изготовленного по разработанной технологии, было произведено 3254 «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» которые были поставлены, согласно контракта, в 66 регионов Российской Федерации.

В течение срока применения наборов от потребителей не было получено жалоб на специфичность и активность компонентов набора и в ФГБУ «ВГНКИ» не поступало рекламаций на поставленную продукцию, что говорит о высоком качестве «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных».

4.1.3 Разработка наборов для диагностики хламидиоза КРС и свиней в ИФА на основе нового антигена.

Наиболее доступными средствами проведения мониторинга хозяйств на хламидиоз являются серологические методы, из которых в ветеринарии, на сегодняшний день, основным остается реакция связывания комплемента (РСК) с группоспецифическим хламидийным антигеном. К сожалению, этот метод имеет ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью, длительностью получения ответа и т.п.. К тому же у свиней постановка РСК осложняется тем, что в их крови циркулируют, как правило, так называемы «неполные» антитела, которые не связываются комплементом напрямую и приходиться ставить ингибирторный вариант РСК, что вдвойне усложняет работу.

Наиболее перспективным диагностическим тестом является иммуноферментный анализ (ИФА). Разработанный в 70-е годы прошлого столетия сегодня он получил широкое распространение в ветеринарной и медицинской диагностике. По чувствительности иммуноферментный анализ в 5-10 раз, а по специфичности в 2-3 раза превосходит РСК.

Практическое применение иммуноферментного метода для ретроспективной диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в нашей стране во многом сдерживается отсутствием доступных отечественных тест-систем и дороговизной импортных. Проблема состоит в том, что для проведения ИФА требуются антигены с высокой степенью очистки, а технологии их получения, как правило, дорогостоящи и не обладают промышленным масштабом.

В разделе 4.1.1 была описана разработанная нами технология изготовления специфического антигена хламидий, который позволял получать препараты с более высокой специфичностью и чувствительностью, чем антиген, ранее применяемый в РСК (Патент на изобретение №2485972 «Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных» приоритет изобретения от 15.11.2011 г.).

Исходя из этого, целью наших исследований явилось испытание полученного антигена для диагностики хламидиоза животных методом иммуноферментного анализа, создания, на его основе, коммерческих наборов препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота и свиней, их испытания и внедрения в ветеринарную практику.

4.1.3.1 Изучение возможности использования в ИФА для диагностики хламидиоза животных разработанного антигена

Для исследований использовали сыворотки крови КРС и свиней, полученные из не благополучных по хламидиозу животноводческих хозяйств РТ и других регионов РФ. Всего исследованию было подвергнуто 383 сыворотки крови КРС и 36 проб сывороток свиней из 33 хозяйств.

ИФА ставили в непрямом варианте по общепринятой методике. Для контроля использовали гипериммунную и заведомо отрицательную сыворотки крови КРС, проверенные в лаборатории методом РСК. Также для постановки ИФА использовали антивидовые конъюгаты производства ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Результаты ИФА оценивали инструментально на фотометре для микропланшет при длине волны 490 нм. Нами, в процессе опыта, были установлены оптимальные дозы рабочего разведения специфического антигена, пероксидазного коньюгата и оптимальное время экспозиции сывороток и конъюгата в термостате, соответственно 60 и 40 минут.

Результат реакции определяли по разности оптической плотности опытных и контрольных лунок. За положительный результат ИФА

принимали разницу в 2,1 раза (коэффициент специфичности) начиная с разведения сыворотки 1:100.

Для сравнения все пробы сывороток крови параллельно подвергались исследованию в РСК. Для постановки РСК использовали «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (№ РОСС 1Ш.ФВ01.В18712). Результаты оценивали визуально, по феномену гемолиза эритроцитов. Полное отсутствие гемолиза эритроцитов оценивали как положительную реакцию (4 креста), а полный гемолиз соответственно как отрицательную реакцию.

Данные по исследованию сывороток от крупного рогатого скота и свиней обобщены в таблицах №12 и №13 соответственно.

Таблица №12 - Результаты сравнительного исследования в РСК и ИФА сывороток крови КРС на хламидиоз (Р<0,001)

Наименование хозяйств Кол-во проб Положительно реагировало

в РСК в ИФА

1 2 3 4

ООО «Айтекс-Молоко» г. Волгоград (04.2009 г.) 28 11 15

ООО «Айтекс-Молоко» г. Волгоград (02.2009 г.) 26 15 7

СХПК «Волга» г. Ульяновск (02.2009 г.) 20 6 4

Агрофирма «Татарстан» Новошешминский р-он, РТ(04, 2009) 27 5 13

Ютазинский р-он, (апрель, 2009) 19 8 14

СПК «Колхоз Ключ-Сузгарьевский», Гузаевский р., Мордовия(04, 2009) 23 7 19

1. 2. 3. 4.

СХПК «им. Вахитова», Татарстан (апрель, 2009) 16 0 4

СХП «Алга-Шутай», Апастовский р-он РТ (октябрь, 2009) 5 0 0

СХП «Еналы-Юрмалы» Апастовский р-он РТ,(октябрь, 2009) 5 2 1

МТФ Нургалиев Апастовский р-он РТ, (октябрь, 2009) 6 0 0

ООО СХП «Еналы» д. Девленеев Апастовский р-он РТ,(10, 2009) 5 2 0

СХП «Табар-Чирки» Апастовский р-он РТ, (октябрь, 2009) 5 0 1

МТФ «Большие Кокузы» Апастовский р-он РТ,(октябрь, 2009) 5 0 1

МТФ «Азбаба» Апастовский р-он РТ (октябрь, 2009) 4 0 0

ООО СХП «Ибрагимовых» Апастовский р-он РТ,(октябрь, 2009) 4 0 1

МТФ «Нургалиевых» Апастовский р-он РТ, (октябрь, 2009) 4 0 0

ООО СХП «Алга», д. Тумаево Апастовский р-он РТ,(октябрь, 2009) 5 0 0

Д.Барашево,Апастовский р-он РТ (октябрь, 2009) 5 1 2

МТФ «Утямышев» Апастовский р-он РТ, (октябрь, 2009) 5 0 0

СХП «Барашево» Апастовский р-он РТ, (октябрь, 2009) 4 0 2

ООО СХП «Ибрагимовых» Апастовский р-он РТ,(октябрь, 2009) 5 0 2

СХП «Еналы-Юрмалы» Апастовский р-он РТ,(октябрь, 2009) 20 0 5

СХП «Еналы» д. Средний Балтай Апастовский р-он РТ,(октябрь, 2009) 28 6 7

Д. Табар-Чирки, Апастовский р-он РТ, (октябрь, 2009) 21 3 5

МТФ « Большие Кокузы» Апастовский р-он РТ,(октябрь, 2009) 23 5 11

1. 2. 3. 4.

СХП «Рахимова», д. Курмышево Апастовский р-он РТ,(октябрь, 2009) 21 3 4

СХП «Алга-Шутай» Апастовский р-он РТ, (октябрь, 2009) 15 0 4

СХП «Яхимова» МТФ 1 Курмашево Апастовский р-он РТ,(октябрь, 2009) 15 2 3

СХП «Тран» Апастовский р-он РТ (октябрь, 2009) 10 1 1

ООО СХП «Ибрагимов и К» Апастовский р-он РТ,(октябрь, 2009) 4 2 0

Итого: 383 79 (20,6%) 126 (32,9%)

Средняя величина титров (М±м) 8,2±0,3 605±2,2

В результате проведенных исследований нами установлено (Таблица №12), что из 383 сывороток крови КРС в РСК на хламидиоз реагировало 79 проб, что составило 20,6%, тогда как в ИФА реагировало 126 (32,9%) проб из представленных для исследования. Таким образом, в ИФА было выявлено в 1,7 раза больше положительных результатов чем в РСК. Титры специфических антител в РСК колебались в пределах 1:5 - 1:20, что соответствует иммунному фону неблагополучных по хламидиозу хозяйств. В ИФА этот показатель колебался в пределах 1:100 - 1:800. Следует отметить, в сравнительных опытах результаты ИФА показали хорошую совпадаемость с данными базовой реакции - РСК.

При исследовании в РСК и ИФА 36 проб сывороток крови от свиней (Таблица №13) в РСК реагировало 5 проб в титрах 1:5 - 10, а в ИФА 10 проб в титрах 1:100 - 6400. Таким образом, установлено, что в ИФА реагировало в 2 раза больше сывороток, чем в РСК. Такая существенная разница аналогичных исследований сывороток КРС, по-видимому, связанна с особенностями диагностики хламидиоза свиней в РСК. Дело в том, что в

сыворотке крови свиней образуются, так называемые, неполные антитела, которые в РСК не выявляются, а в ИФА их можно обнаружить.

Таблица №13 - Результаты сравнительного исследования в РСК и ИФА сывороток крови свиней на хламидиоз (Р<0,05)

Наименование хозяйств Кол-во проб Положительно реагировало

в РСК в ИФА

Агрофирма «Мордовский бекон», Мордовия (апрель, 2009) 16 0 4

ООО А.Ф. «Вамин-Аксу», Татарстан, (ноябрь, 2009) 20 5 6

Итого: 36 5 (13,8) 10 (27,7)

Средняя величина титров (М±м) 6±1,3 1090±202

В результате проведенных исследований установлено, что использованный нами антиген позволяет диагностировать хламидиоз крупного рогатого скота и свиней методом ИФА. При этом в ИФА испытуемый антиген показал высокую специфичность и большую, по сравнению с РСК, активность. Так в ИФА при диагностике хламидиоза КРС было выявлено в 1,7 раза, а при диагностике хламидиоза свиней в 2 раза больше положительных результатов.

Полученные данные позволили нам рекомендовать испытанный антиген для диагностики хламидиоза КРС и свиней в ИФА.

4.1.3.2 Разработка «Набора препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА».

Подбор компонентов тест-системы и отработка режимов постановки ИФА.

В результате успешных испытаний модифицированного экспериментального хламидийного антигена нами был разработан набор для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота непрямым методом ИФА.

Для комплектования набора были использованы следующие компоненты: твердая фаза для адсорбции антигена; специфический хламидийный антиген; контрольная положительная и контрольная отрицательная сыворотки крови крупного рогатого скота; антивидовые антитела, меченные ферментом; субстрат для выявления меченных АТ; стоп-реагент и растворы для разведения компонентов и промывания твердой фазы на разных этапах анализа.

В качестве твердой фазы нами были использованы полистироловые 96 луночные планшеты, на которые был адсорбирован специфический эфирный АГ с концентрацией белка 3,8 мкл/мл (оптимальная концентрация была установлена в результате ряда эксперементов). Время экспозиции составило 18 ч при +4°С.

Для выбора контролей мы исследовали несколько вариантов положительных хламидийных сывороток и сывороток, не реагирующих с хламидийным антигеном в РСК:

1.881- сыворотка полученная от иммунизированных животных;

2. 882 - хламидийная сыворотка КРС полученная от естественно инфицированных животных;

3. 8№ - эмбриональная сыворотка КРС;

4. 8Ы2 - телячья сыворотка КРС (телята возрасте до 2-х мес.);

5. 8Ш - отрицательная, полученная от клинически здорового КРС;

В качестве меченных антител использовали антивидовой комерческий конъюгат (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

Для выявления меченных АТ использовали раствор ОФД с 3% перекисью водорода. В качестве стоп-реагента применяли раствор серной кислоты.

Дальнейшим этапом стал подбор формы выпуска основных компонентов набора, для более выгодного их расхода и удобства при транспортировке, хранении и использовании.

С целью уменьшения расходов конъюгата проводили его лиофилизацию. Для этого в ампулу с фабричным конъюгатом (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) добавляли 2 мл буфера для разведения конъюгата. Полученный раствор разливали по ампулам в объеме 0,2 см и замораживали при температуре -60°С (т.о. разведение КГ было 1:10). После заморозки проводили лиофильную сушку на аппарате "Эдварде" по следующей схеме: -40°С в течение 2 часов, затем +0,5°С 2 часа и +25°С 2 ч. Т.о. разведение лиофилизированного КГ составило 1:10.

Следующим этапом стала лиофилизация контролей. Для лиофилизации были выбраны сыворотки :

Б8 - сыворотка полученная от иммунизированных животных;

8И - отрицательная, полученная от здорового КРС

Сыворотки были разлиты по ампулам в объеме 0,5 см3, затем заморожены при -60°С и лиофилизированны.

Растворы были концентрированы, расфасованы во флаконы из прозрачного стекла и плотно закрыты резиновыми крышками с металлическими колпачками. ОФД, в форме порошка, был расфасован по 4 мг и закрыт аналогично, затем флаконы обернули фольгой. В фольгу были так же завернуты флаконы с 3% перекисью водорода, т. к. эти компоненты теряют свою активность при попадании света.

ИФА ставили в непрямом варианте, используя полистироловые 96 луночные планшеты с плоским дном. Для выявления меченных АТ использовали раствор ОФД с 3% перекисью водорода. Для остановки реакции применяли раствор серной кислоты.

Также для постановки ИФА использовали антивидовые конъюгаты производства ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Учет результатов реакции проводили инструментально на спектрофотометре модели Bio-Rad Model 680, при длине волны 490. При этом использовали количественный метод.

Для оценки активности и специфичности антигена вычисляли коэффициент специфичности (К сп.) по отношению оптической плотности положительного контроля (ОП пол.) к отрицательному контролю (ОП отр.):

К сп..= ОП пол. / ОП отр.

Для оценки результата вычисляли критический уровень, который определяется как значение оптической плотности отрицательного контроля (ОП отр.) умноженное на 2:

ОП крит. = ОП отр. х 2

Результат считали положительным, если значение оптической плотности данного образца выше критического уровня (ОП крит. < ОП исп.).

Если оптическая плотность испытуемого образца меньше или равна оптической плотности отрицательного контроля (ОП исп. < ОП отр.), то результат реакции считается отрицательным.

Если оптическая плотность испытуемого образца больше оптической плотности отрицательного контроля и меньше или равна критическому уровню (ОП отр. < ОП исп. < ОП крит.) результат реакции считается сомнительным.

С целью оптимизации процесса постановки реакции, увеличения специфичности, чувствительности и уменьшения расхода реактивов, нами были установлены оптимальные разведения компонентов реакции, отработаны температурный и временной режимы проведения теста, а также выбраны рабочие растворы.

Для постановки реакции с предлагаемым специфическим антигеном хламидий было испытано несколько вариантов промывочных растворов, но наиболее четкие результаты регистрировались при применении ФБР-Т на гипертоническом растворе ЫаС1 (8,5%), с которым проводили дальнейшие исследования.

Для определения рабочего разведения, антиген с концентрацией белка 1000 мкг/мл использовали в двукратных последовательных разведениях от 1:16 до 1:1024 получая соответственно различную концентрацию белка. Антиген сорбировали на дне лунок полистироловых планшетов для

постановки ИФА. Конъюгат использовали в ,.5-х рабочих разведениях с

I

1:10000 до 1:20000 с шагом в 2000. Испытуемые и контрольные сыворотки крови первоначально титровали с 1:100 путем двукратных последовательных разведений. Каждый раз, одновременно, ставили контроль конъюгата с антигеном без сыворотки.

В ходе этих опытов было установлено, что наилучшие результаты теста удается получать при концентрации белка 3,8емкг/мл, что соответствовало разведению антигена 1:256, разведении сывороток начиная с 1:200 и рабочем разведении конъюгата 1:12000. В этом случае оптическая плотность отрицательных контролей была менее 0,2 ед., а значения положительных контролей всегда были больше 1,2 ед. ОП, при этом коэффициент специфичности, в отдельных случаях, достигал 11.

Для установления влияния температуры на сорбцию планшеты с внесенным антигеном выдерживали 18 часов при различных температурных режимах (+4°С, +20°С и +37°С). В аналогичных условиях проводили инкубацию других компонентов: сывороток и конъюгата. Так, было установлено, что оптимальной для адсорбции антигена оказалась температура +4°С, для сывороток - 60 минут при +37°С и конъюгата - 40 минут при +37°С.

Таким образом, были установлены следующие оптимальные условия проведения ИФА: на поверхности лунок полистироловых планшет

адсорбировали специфический хламидийный антиген с концентрацией белка 3,8 мкг/мл, в объеме 100 мкл, время экспозиции составило 18 ч при +4°С. Испытуемые и контрольные сыворотки вносили в первые лунки планшет в разведении 1:100 в объеме 100 мкл, предварительно во все лунки планшет внесли по 100 мкл ФБР-Т, и титровали начиная с разведения 1:200 и до 1:25600. Затем планшеты выдерживали в термостате (37°С) в течение часа. После трехкратного промывания твердой фазы рабочим раствором в объеме 200 мкл, в лунки планшет вносили пероксидазный КГ в рабочем разведении 1:800 по 100 мкл и выдерживали в термостате 40 минут. После трехкратного промывания ФБР-Т 200 мкл, в лунки планшет вносили субстрат по 100 мкл (4 мг ОФД + 10 мл ФЦБ + 0,14 мл 3% перекиси водорода), планшеты помещали в темное место на 10 - 15 минут, реакцию останавливали при появлении слабо-желтого окрашивания в отрицательном контроле внесением стоп-реагента в объеме 50 мкл. Учет результатов реакции проводили на спектрофотометре модели Bio-Rad Model 680, при длине волны 490.

Учитывая положительные результаты испытаний, на основе предложенного специфического хламидийного антигена был разработан «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» в состав которого вошли все необходимые компоненты для проведения анализа. Состав набора представлен в таблице №14.

Для удобства использования и транспортировки контрольные сыворотки и пероксидазный конъюгат были лиофилизированы, а растворы были концентрированы, расфасованы во флаконы из прозрачного стекла и плотно закрыты резиновыми крышками с металлическими колпачками. Флаконы с ОФД и перекисью водорода были обернуты фольгой для предотвращения доступа света.

На производство, контроль и применение опытных серий «Наборов препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» были разработаны и утверждены соответствующие нормативно-технические

документы: инструкция по изготовлению наборов, технические условия и инструкция по применению.

Таблица №14 - Состав «Набора препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА»

Наименование компонентов Способ фасовки Объем Кол-во

Паншеты с хламидийным антигеном полиэтилен 2

Контрольная положительная сыворотка крови коров (К+) Ампулы 0,5 см3 1

Контрольная отрицательная сыворотка крови коров (К-) Ампулы 0,5 см3 1

Концентрат фосфатно-буферного раствора с Твин-20 (ФБР-Т) Флаконы 50,0 см3 2

Буфер для разведения конъюгата (БРК) Флаконы 1,0 см3 1

Антитела к иммуноглобулину С (^в) быка меченные пероксидазой хрена (конъюгат) Ампулы 0,2 см3 1

Фосфатно-цитратный буфер (ФЦБ) Флаконы 10,0 см3 2

Ортофенилдиамин (хромоген), (ОФД) Флаконы 4,0 мг 2

Перекись водорода (Н202) 3% раствор Флаконы 2,0 см3 1

Серной кислоты 1М раствор (стоп-реагент) Флаконы 10,0 см3 2

Испытание специфичности и активности «Набора препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА».

Для испытаний был представлен образец «Набора препаратов для серологической диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом

иммуноферментного анализа (ИФА)» производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», серия №1, дата изготовления: 11. 2010 г.

Испытание компонентов набора проведено по следующим показателям:

- внешний вид компонентов набора;

- определение растворимости компонентов набора;

- определение активности хламидийного антигена, контрольной положительной сыворотки крови и пероксидазного антивидового конъюгата;

- определение специфичности хламидийного антигена, контрольных отрицательной и положительной сывороток крови.

В результате осмотра компонентов набора было установлено их соответствие заявленным нормам: планшеты для ИФА с сенсибилизированным хламидийным антигеном, закрыты крышками и обернуты в полиэтиленовую пленку, сыворотки и конъюгат представляют собой гомогенную аморфную массу, сыворотки светло-коричневого цвета, конъюгат - белого, ортофенилдиамин представляет собой мелкокристаллический порошок светло-жёлтого цвета. Растворы (БРК, ФЦБ, Н2С>2, стоп-реагент) - прозрачные бесцветные жидкости. Наличие примесей, хлопьев, плесени, трещин ампул и флаконов не обнаружено.

При определении растворимости контрольных положительной и отрицательной сывороток, а также конъюгата установлено, что они растворяются в течение 1-2 минут.

Для определения активности компонентов набора и их специфичности были использованы различные сыворотки крови КРС содержащие гомологичные и гетерологичные антитела к хламидийному антигену:

- Пробы сывороток крови КРС принадлежащего ООО ПД «Приволжье» Верхнеуслонского р-она РТ;

- Пробы сывороток крови КРС принадлежащего ООО ПД «Заволжье» Зеленодольского р-она РТ;

- Пробы сывороток крови КРС принадлежащих СХПК «им. Вахитова» вакцинированных против хламидиоза 05.01.2011 г. (4 мес.);

- сыворотка позитивная к вирусу герпеса 1 и ИРТ КРС («СНЕК1Т* TRACHITEST SERUM SCREENING» производства «ГОЕХХ laboratories» (США) от 30.06.2010 LOT R423 Art.Nr. IPT2220, Zul.-Nr.: BGAF-B 005);

- сыворотка КРС содержащая специфические антитела к вирусу ПГ-3 (ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК», Рег.№ ПВР-1-4.1/00830 серия № 1, дата изготовления 12.05.2010);

- сыворотка против пастереллеза, сальмонеллеза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита КРС (ФГУП «Армавирская биофабрика», серия №3, дата изготовления 04.2009);

- сыворотка антитоксическая поливалентная против сальмонеллеза телят (ФГУП «Армавирская биофабрика», Рег№ ПВР - 1-1.2/00919, серия №11, дата изготовления 10.2010);

- сыворотка специфическая преципитирующая лейкозная (ФГУП «Курская биофабрика», Рег№ ПВ -1-1.2/09966, серия № 95).

- контрольная положительная сыворотка крови из набора;

- контрольная отрицательная сыворотка крови из набора.

Все сыворотки крови были раститрованы путем двукратных последовательных разведений, начиная с разведения 1:200 до 1:1600 против специфического хламидийного антигена, сенсибилизированного в рабочем разведении 1:256 (3,8 мкг/мл) на планшетах, входящих в состав набора.

Результаты ИФА регистрировали на спектрофотометре при длине волны 490 нм.

Для сравнения все пробы сывороток крови параллельно подвергались исследованию в РСК с использованием «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (№ РОСС RU^B01.B18712). Результаты оценивали визуально, по феномену гемолиза эритроцитов.

Отсутствие гемолиза эритроцитов оценивали как положительную реакцию (4 креста), а полный гемолиз соответственно как отрицательную реакцию. Результаты проведенных испытаний обобщены в таблице №15.

Таблица №15 - Результаты постановки ИФА и РСК с гомологичными и гетерологичными к хламидийному антигену сыворотками крови.

Наименование хозяйств № пробы Результат (титр)

ИФА РСК

1. 2. 3. 4.

Пробы сывороток крови КРС принадлежащего ООО ПД «Приволжье» Верхнеуслонского р-она РТ 1 1:1600 отр.

2 1:1600 отр.

3 1:1600 1:10

4 1:800 1:20

5 1:1600 1:20

6 1:1600 отр.

7 1:800 1:20

8 1:800 1:10

9 1:1600 отр.

10 1:1600 1:10

Пробы сывороток крови КРС принадлежащего ООО ПД «Заволжье» Зеленодольского рона РТ 1 отр. Отр.

2 отр. Отр.

3 отр. Отр.

4 отр. Отр.

5 отр. Отр.

Пробы сывороток крови КРС принадлежащих СХПК «им. Вахитова» Кукморский р-он РТ. Вакцинированы против хламидиоза 05.01.2011 г. (4 мес.) 1 1:800 1:20

2 1:1600 1:5

3 1:1600 1:20

4 1:1600 1:10

5 1:1600 1:20

6 1:800 отр.

7 1:1600 1:20

8 1:1600 1: 10

9 1:800 отр.

10 1:1600 1:20

1. 2. 3. 4.

11 1:1600 1:20

12 1:1600 1:5

13 1:1600 1:10

14 1:1600 1:5

15 1:800 отр.

16 1:1600 отр.

17 1:400 1:20

18 1:1600 1:20

19 1:1600 1:20

20 1:1600 1:10

Итого реагировало положительно: 30 22

Гетерологичные к хламидийному антигену контрольные сыв-ки крови

Сыворотка позитивная к вирусу герпеса 1 и ИРТ КРС отр. Отр.

Сыворотка КРС содержащая специфические антитела к вирусу ПГ-3 отр. Отр.

Сыворотка против пастереллеза, сальмонеллеза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита КРС отр. Отр.

Сыворотка антитоксическая поливалентная против сальмонеллеза телят отр. Отр.

Сыворотка специфическая преципитирующая лейкозная отр. Отр.

Сыворотка контрольная положительная 1:1600 1:80

Сыворотка контрольная отрицательная отр. Отр.

В результате проведенных исследований установлено, что контрольная хламидийная сыворотка крови реагировала в ИФА и РСК положительно с титрами соответственно 1:1600 и 1:80. Контрольная отрицательная сыворотка крови реагировала в обоих тестах отрицательно.

Гетерологичные к хламидийному антигену сыворотки крови (сыворотка позитивная к вирусу герпеса 1 и ИРТ КРС, сыворотка КРС содержащая специфические антитела к вирусу ПГ-3, сыворотка против пастереллеза, сальмонеллеза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита КРС, сыворотка антитоксическая поливалентная против сальмонеллеза телят, сыворотка специфическая преципитирующая лепкозная) реагировали отрицательно с хламидийным антигеном как в ИФА, так и в РСК.

При исследовании 10 сывороток крови КРС, полученных из неблагополучного по хламидийной инфекции хозяйства (ООО ПД «Приволжье» Верхнеуслонского р-она РТ) в ИФА положительно реагировало 10 (100%) проб, тогда как в РСК только 6 (60%) проб.

Сывороки крови КРС, доставленные из благополучного по хламидиозу хозяйства (ООО ПД «Заволжье» Зеленодольского р-она РТ) реагировали отрицательно к хламидийному антигену в обоих тестах.

Исследование 20 проб сывороток крови, взятых от вакцинированных против хламидиоза животных, в ИФА показало 100% реакцию к хламидийному антигену. В РСК реагировало положительно только 16 (80 %) проб.

Таким образом, в результате проведенных комиссионных испытаний «Набора препаратов для серологической диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА)» была доказана специфичность и высокая активность его компонентов, а также большая, по сравнению с РСК, чувствительность.

Полученные результаты позволили рекомендовать испытанную тест-систему для диагностики хламидиоза КРС и оценки поствакцинального гуморального противохламидийного иммунитета в производственных условиях.

Лабораторное испытание «Набора препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА».

Отработанная методика постановки ИФА с предложенным хламидийным антигеном была использована в лабораторных условиях для диагностики хламидиоза у КРС из 20 неблагополучных хозяйств РТ и других регионов России. Всего исследованию было подвергнуто 372 сыворотки крови КРС. Все пробы параллельно были исследованы в РСК. Результаты этих исследований обобщены и представленны в таблице №16.

Таблица №16 - Результаты сравнительного исследования в РСК и ИФА сывороток крови крупного рогатого скота на хламидиоз (п=372, Р<0,05)

Наименование хозяйств Исследовано сывороток Положительно реагировало в

РСК ИФА

1. 2. 3. 4.

Лаишевский район ООО «Хаярби» с.Кирби 15 3 8

Башкорстан, Аургазинский район ООО «Дружба» 14 1 4

Агрофирма «Нуркеево» МТК Юлтимерово 18 2 5

РТ, Высокогорский район, отд. Мульма, ЗАО «Бирюли» 29 10 9

РТ, Кукморский р-он, СХПК им. Вахитова 10 3 9

РТ, Кукморский р-он, СХПК «Намус» 20 11 7

Марий-Эл, Мосолаева 7 1 1

Шапши «Серп и молот» 13 5 13

Лаишево ООО «Хаярби» с. Кирби 15 - 2

Самарская область Кинелевский Район, с. Красно-самарское 7 - 4

Чистопольский район «Юлдыз» 18 3 12

Кукморский район «Намус» 20 20 20

ЗАО «Булгар Арыш» Спасский район 17 - 2

ООО А/Ф «Татарстан» Высокогорский район 15 - 1

ООО А/Ф «Сарсазы» Чистопольский район 16 - 2

ООО «Намус» Кукморский район 28 6 23

КФК «Сулейманов» Нурлатский район 10 5 3

Верхнеуслонский район «Макулово» 51 10 6

1. 2. 3. 4.

Кукморский район «Намус» 19 18 19

Башкортостан Стерлиталинский район ГУ СП село «Рощинский» 21 - 3

Ютазинский район ООО «Нур-Агро» 26 14 15

Итого реагировало кол-во (%) 103 (27,1%) 167 (44,8%)

Среднеарифм. величина титров (М±м) 13,4±0,3 325,6±2,2

Как видно из результатов проведенных исследований в ИФА с хламидийным антигеном реагировало 167 (44,8%) сывороток крови, тогда как в РСК аналогичный показатель был несколько ниже и составил 103 (27,1%) пробы, что ниже в 1,7 раза. Титры специфических антител в ИФА соответственно были значительно выше, чем в РСК, что связано с разной чувствительностью двух тестов.

Таким образом, высокая чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов ИФА с предложенным «Набором препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» позволили рекомендовать его для проведения производственных испытаний.

Для этого нами были разработаны и утверждены нормативно-технические документы:

- Инструкция по применению «Набора препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа ИФА)» [Приложение Г1];

- Технические условия «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа ИФА)» (ТУ-9388-009-00492374-2010) [Приложение Г2].

Производственное испытание «Набора препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА».

Производственные испытания проводились на базе ФГУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория».

В течение 2010 - 2011 годов с применением экспериментальных серий «Наборов препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» было исследовано 1008 проб сывороток крови КРС из 4 не благополучных по хламидиозу животноводческих хозяйств РТ и других регионов РФ. Параллельно все сыворотки крови были исследованы в РСК. Результаты этих исследований обобщены в таблице №17.

Таблица №17 - Результаты сравнительного исследования сывороток крови крупного рогатого скота в РСК и ИФА (Р<0,05)

№ п/п Наименование хозяйств Исследовано сывороток Положительно реагировало в

РСК ИФА

1 Алькеевский р-он РТ, ОП «Камкино» 907 71 130

2 Алькеевский р-он РТ, ЖК «Челны» 41 3 5

3 Зеленодольский р-он РТ, ООО «Завольжье» 28 - -

4 Верхнеуслонский р-он РТ, ООО «Плем дело Привольжье», ОП «Вахитово» 32 6 9

Итого: 1008 80 (7,9%) 144 (12,2%)

В ходе проведенных производственных испытаний установлено, что из 1008 проб в РСК реагировало положительно 80 проб (7,9%), а в ИФА 144 (14,2%). Таким образом, в ИФА было выявлено в 1,8 раза больше положительных результатов, чем в РСК.

Таким образом, в производственных условиях установлено, что предлагаемый «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом ИФА» показал хорошие результаты при диагностике хламидиоза. Высокая активность и специфичность компонентов набора позволяли выявлять хламидийные антитела в сыворотках крови больных

животных. При этом была установлена его более высокая активность по сравнению с РСК.

4.1.3.3 Разработка «Набора препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА».

После того, как нами была установлена принципиальная возможность диагностики хламидиоза свиней с предлагаемым нами антигеном в иммуноферментном анализе, мы приступили к разработке «Набора препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА», которая велась параллельно с разработкой тест-системы для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота.

Актуальность разработки такой системы для диагностики хламидиоза у свиней, наряду с вышеприведёнными причинами, обусловлена тем, что у свиней на хламидии вырабатываются так называемые «неполные» антитела, выявление которых в РСК невозможно и требует постановки непрямого метода связывания комплемента, что очень затруднительно в производственных условиях.

Подбор компонентов тест-системы и отработка режимов постановки ИФА.

С целью комплектования диагностической тест-системы для свиней были использованы аналогичные реактивы и материалы, что и для набора препаратов для диагностики хламидиоза КРС в ИФА, с учетом разницы в специфических компонентах, а именно контрольных специфической и отрицательной к хламидийному антигену сывороток крови свиней и антивидового специфического конъюгата к иммуноглобулину (^О) свиньи.

Вместе с этим для комплектования набора были использованы следующие компоненты: твердая фаза для адсорбции антигена; специфический хламидийный антиген; субстрат для выявления меченных АТ; стоп-реагент и растворы для разведения компонентов и промывания твердой фазы на разных этапах анализа.

Антиген адсорбировали на твердую основу, в качестве которой использовали аналогичные полистироловые 96-луночные планшеты. Концентрация белка в антигене была установлена экспериментально и составила также 3,8 мкл/мл при экспозиции 18 ч (+4°С).

В качестве меченных антител использовали антивидовой комерческий конъюгат (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) который, разводили, фасовали по ампулам и лиофильно высушивали аналогичным способом.

Получение специфической и отрицательной контрольных сывороток крови.

В качестве положительного контроля были использованы сыворотки крови свиней предварительно иммунизированных антигеном изготовленных из штаммов хламидий выделенных от свиней «J1C-88» и «РС-85».

Штаммы хламидий «JIC-88» и «РС-85» выделенные при хламидиозной пневмонии и репродуктивном синдроме свиней соответственно являются производственными, они депонированны в коллекции штаммов «ВГНКИ» и ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и используются согласно СТ000492374-004-2008 «Штаммы хламидий от крупного рогатого скота овец и свиней».

Иммунизацию животных проводили в условиях вивария двукратно с интервалом 15 дней. Предварительно животных исследовали в РСК, используя специфический и контрольный антигены.

Кровь от привитых свиней через месяц после второй иммунизации исследовали в РСК и параллельно в ИФА и при обнаружении высокого уровня специфических антител (титр в РСК 1:80 и выше) животных тотально обескровливали, получали сыворотку крови.

Полученную специфическую сыворотку крови свиней обрабатывали иммуносорбентом, приготовленным на основе оболочек желточных мешков развивающихся эмбрионов кур с целью устранения неспецифических антител [199].

После этого обработанную сыворотку крови свиней повторно исследовали в РСК со специфическим и контрольным антигенами.

Сыворотки считали специфичными, если при отсутствии реакции с контрольным антигеном титр специфических антител с хламидийным антигеном был 1:40 и выше.

Отрицательную контрольную сыворотку крови получали от серонегативных клинически здоровых свиней, которых исследовали сначала в РСК, а затем в ИФА. При получении двукратного отрицательного результата животных обескровливали.

л

Сыворотки были разлиты по ампулам в объеме 0,5 см , затем заморожены при -60°С и лиофилизированы.

Все остальные растворы и компоненты набора для диагностики хламидиоза в ИФА у свиней были расфасованы также как и в наборе, использованном для диагностики хламидиоза КРС в ИФА.

Учет результатов реакции проводили аналогичным способом на спектрофотометре модели Bio-Rad Model 680, при длине волны 490.

Таким образов, в состав «Набора препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА» вошли компоненты, представленные в таблице №18.

Таблица №18 - Состав «Набора препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА»

Наименование компонентов Способ фасовки Объем Кол-во

1. 2. 3. 4.

Паншеты с хламидийным антигеном полиэтилен 2

Контрольная положительная сыворотка крови свиней (К+) Ампулы 0,5 см3 1

Контрольная отрицательная сыворотка крови свиней (К-) Ампулы 0,5 см3 1

1. 2. 3. 4.

Концентрат фосфатно-буферного раствора с Твин-20 (ФБР-Т) Флаконы 50,0 см3 2

Буфер для разведения конъюгата (БРК) Флаконы 1,0 см3 1

Антитела к иммуноглобулину О (^О) свиньи меченные пероксидазой хрена (конъюгат) Ампулы 0,2 см3 1

Фосфатно-цитратный буфер (ФЦБ) Флаконы 10,0 см3 2

Ортофенилдиамин (хромоген), (ОФД) Флаконы 4,0 мг 2

Перекись водорода (Н2О2) 3% раствор Флаконы 2,0 см3 1

Серной кислоты 1М раствор (стоп-реагент) Флаконы 10,0 см3 2

На производство, контроль и применение опытных серий «Наборов препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА» были разработаны и утверждены соответствующие нормативно-технические документы: инструкция по изготовлению наборов, технические условия и инструкция по применению.

Испытание специфичности и активности «Набора препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА».

Испытание специфичности и активности компонентов разработанного набора для диагностики хламидиоза свиней в ИФА проводили комиссионно в отделе биобезопасности ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Для испытаний был представлен образец «Набора препаратов для серологической диагностики хламидиоза свиней методом иммуноферментного анализа (ИФА)» производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», серия №1, дата изготовления: 03. 2013 г.

Испытание компонентов набора проведено по следующим показателям:

- внешний вид компонентов набора;

- определение растворимости компонентов набора;

- определение активности хламидийного антигена, контрольной положительной сыворотки крови и пероксидазного антивидового конъюгата;

- определение специфичности хламидийного антигена, контрольных отрицательной и положительной сывороток крови.

В результате визуального осмотра компонентов набора было установлено их соответствие заявленным нормам: планшеты для ИФА с сенсибилизированным хламидийным антигеном закрыты крышками и обернуты в полиэтиленовую пленку, сыворотки и конъюгат представляют собой гомогенную аморфную массу, сыворотки светло-коричневого цвета, конъюгат - белого, ортофенилдиамин представляет собой мелкокристаллический порошок светло-жёлтого цвета. Растворы (БРК, ФЦБ, Н202, стоп-реагент) - прозрачные бесцветные жидкости. Наличие посторонних примесей, хлопьев, плесени, трещин ампул и флаконов не обнаружено.

При определении растворимости контрольных положительной и отрицательной сывороток, а также конъюгата установлено, что они растворяются в течение 1-2 минут.

Для определения активности компонентов набора и их специфичности были использованы различные сыворотки крови свиней, содержащие гомологичные и гетерологичные антитела к хламидийному антигену:

- Пробы сывороток крови свиней принадлежащих ООО «Нур Баяна» Актанышского района РТ;

- Пробы сывороток крови свиней принадлежащих ООО «Химикам-Агро» С. Городище Нижнекамского района РТ;

- Пробы сывороток крови свиней принадлежащих ООО «Нефтехим Arpo Пром» С. Соболевко Нижнекамского района РТ;

Всего из трех хозяйств было происследовано 111 сывороток крови свиней различных половозрастных групп.

Так же в опыте были использованы гетерологичные и контрольные сыворотки крови свиней:

- Сыворотка позитивная к пастереллезу свиней;

- Сыворотка позитивная к болезни Ауески свиней;

- Контрольная положительная сыворотка крови из набора;

- Контрольная отрицательная сыворотка крови из набора.

Все сыворотки крови были раститрованы путем двукратных последовательных разведений, начиная с разведения 1:200 до 1:1600 против специфического хламидийного антигена, сенсибилизированного в рабочем разведении 1:256 (3,8 мкг/мл) на планшетах, входящих в состав набора.

Для сравнения все пробы сывороток крови параллельно подвергались исследованию в РСК. Для постановки РСК использовали «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (№ РОСС БШ.ФВ01.В18712). Результаты проведенных испытаний обобщены в таблице №19.

Таблица №19 - Результаты ИФА и РСК с гомологичными и гетерологичными

к хламидийному антигену сыворотками крови.

№ Наименование хозяйств Группы животных Результат (гитр)

РСК ИФА

1. 2. 3. 4. 5.

1 Актанышский район Лактирующие - -

2 ООО «Нур Баяна» свиноматки - -

3 - 1:400

4 - 1:400

5 1:20 1:400

6 - -

7 1:20 1:800

8 1:20 -

9 - 1:200

10 1:20 1:400

11 - -

12 - -

13 1:20 -

14 - 1:800

15 - -

1. 2. 3. 4. 5.

16 Хряки- - 1:400

17 призводители - 1:800

18 - -

19 - 1:200

20 - 1:800

1 ООО «Химикам-Arpo» откорм - 1:400

2 С. Городище - 1:400

3 - -

4 - -

5 - 1:100

6 - 1:200

7 - -

8 - 1:100

9 - -

.10 - -

11 - -

12 - -

13 - -