Разработка и усовершенствование промышленных технологий получения препаратов на основе хитозана для лечения и профилактики болезней животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Шинкарев, Сергей Михайлович

• Шинкарев, Сергей Михайлович
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шинкарев, Сергей Михайлович

1. Введение.

2. Обзор литературных источников.

2.1. Значение лечения и профилактики желудочно - кишечных заболеваний молодняка в системе ветеринарных мероприятий.

2.2. Химическая структура и строение хитозана.

2.3. Способы получения хитозана.

2.4. Получения водорастворимых форм хитозана.

2.4.1. Получение солевых форм и производных хитозана.

2.4.2. Получение низкомолекулярного хитозана.

2.5. Свойства хитозана, его солей и производных, их применение в медицине и ветеринарии.;.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и усовершенствование промышленных технологий получения препаратов на основе хитозана для лечения и профилактики болезней животных»

Актуальность проблемы. Проблема ведения животноводства и получения экологически чистых продуктов питания животного происхождения имеет особое значение во всех фундаментальных и приоритетно - прикладных исследованиях (Эрнст Л.К., 1999; Смирнов, A.M., 1999; Бударков В.А., 1999; Ильязов Р.Т., 2000 и другие). Для повышения резистентности и профилактики болезней животных используются различные препараты. Появились работы в этом направлении с использованием препаратов из хитозана (Гущина Э.В., 1991, Насибов С.М., Большаков И.Н., 1999 и др.)

Полисахариды - хитин и хитозан - перспективные материалы для создания новых продуктов и направлений в биотехнологии. Природное происхождение и большие возможности химической модификации делают их весьма интересными объектами для исследования. Наличие аминогрупп придает хитозану многие ценные свойства - растворимость в кислых водных средах, способность к комплексообразованию, ионному обмену и т. д. Хитин по своей воспроизводимости в животном мире сравним с целлюлозой в растительном мире, однако и до настоящего времени хитин не изучен так полно, как целлюлоза. Основными сырьевыми источниками для производства хитина являются панцири ракообразных, развитие промысла которых и масштабное разведение креветок в некоторых странах Азии, достигшее 1 млн т в год, привело к значительному возрастанию интереса в последние годы к проблеме эффективной утилизации панциря ракообразных и получению производных хитина. (В.П. Быков, 1999). По мнению американских экспертов, называющих хитозан "полимером XXI века", мировой рынок продукции на основе хитозана в следующем столетии будет носить глобальный характер.

Рыбная отрасль России располагает значительной базой панцирьсодер-жащего сырья, позволяющей организовать промышленное производство хитина и его производных. Россия обладает значительными ресурсами ракообразных для производства хитозана - основного производного хитина, имеющего широкое практическое применение. При этом наиболее перспективными областями использования хитина и его производных являются здравоохранение, пищевая промышленность, сельское хозяйство, биотехнология, очистка газовоздушных и жидких сред (43,35,67,140) В последние годы заметно увеличилось число производителей хитина и хитозана, расширился круг научных коллективов, проводящих исследования по созданию эффективных технологий получения и переработки этих полисахаридов.

По своей природе хитин и хитозан - жесткоцепные неплавкие и нерастворимые в большинстве доступных растворителях полимеры. Поэтому основным вопросом их переработки является создание новых экономичных и экологически чистых способов получения различных форм этих полисахаридов. Модификация полимеров в гетерогенной среде без использования токсичных органических соединений — перспективный экологически чистый метод получения различных производных хитозана. С экономической точки зрения немаловажным является и то, что выход модифицированного хитозана в 1,5-2 раза превышает затраты исходного полимера. Одним из способов получения высокоочищенного водорастворимого хитозана может быть гидролиз полимера с целью получения низкомолекулярных звеньев и олигомеров, обладающих более высокой биологической активностью и способностью проникать в организм.

Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является разработка и усовершенствование промышленных технологий получения препаратов на основе хитозана для лечения и профилактики болезней животных. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- разработать промышленную технологию получения К- замещенных производных хитозана без использования токсичных растворителей и исследовать их физико-химические свойства;

- усовершенствовать промышленную технологию получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана;

- разработать лекарственные формы препаратов в виде порошков, стерильных гелей и жидкостей с пролонгированным действием;

- изучить биологические свойства препаратов на основе хитозана;

- изучить возможность использования разработанных препаратов на основе хитозана для лечения и профилактики болезней животных.

Научная новизна. В результате проведенной работы:

- разработана, апробирована и внедрена в промышленное производство научно обоснованная технология получения сукцината хитозана без использования органических токсичных соединений (Патент №2144040 от 07 апреля 1998г);

- усовершенствованы промышленные технологии получения низкомолекулярного хитозана и хитоолигосахаридов в результате обработки ферментом и перекисью водорода, определена зависимость молекулярной массы полимера от условий гидролиза;

- получены и испытаны на животных лекарственные формы препаратов на основе хитозана в виде порошков, стерильных гелей и растворов для лечения и профилактики болезней;

- на основании биохимических, гематологических и производственных показателей обоснована целесообразность их применения в качестве радиопротектора, иммуномодулятора, бактериостатического и антитоксического препарата.

Практическая значимость работы. Разработанные промышленные технологии получения препаратов хитозана, натриевой соли сукцината хитозана и низкомолекулярного полимера апробированы и внедрены в промышленное производство на оборудовании и мощностях ВНИТИБП- ЗАО «Биопрогресс». Решены вопросы масштабирования технологических процессов, изучены физико - химические и биологические свойства этих продуктов. Полученные полисахариды и их производные применены для лечения и профилактики болезней животных.

На защиту выносятся. Результаты исследований по разработке промышленных технологий производства препаратов на основе хитозана, изучение их свойств, а также результаты их применения для лечения и профилактики болезней животных.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены:

- на заседаниях ученого Совета ВНИТИБП в 1998 - 2001 гг.

- на I Российской научно - практической конференции «Актуальные проблемы медицинской экологии» (Орел, 1998г);

- на Всероссийской научно - практической конференции, посвященной 70-летию со дня рождения профессора В.А. Першина «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 1997);

- на Всероссийской научно - практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения Н.Ф. Чуклова «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 1998);

------- на V, VI Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство»

Москва, 1998,1999гг);

- на V конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Москва, 1999);

- на научной конференции, посвященной 80-летию Трескунова К.А. «Место фитотерапии в современной медицине» (Черноголовка, 1999г);

- на научной конференции «Фитотерапия, лазеротерария, биологически активные вещества естественного происхождения (БАВЕП) в XXI веке» (Черноголовка, 2000г);

- на Всероссийской научно - практической конференции, посвященной 309 летию ВНИТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000);

- на Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2001);

- на Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (Москва, 2001 г).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, получен Патент РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 125" страницах печатного текста и состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и приложений. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 11 рисунками. Библиографический указатель включает 177 источников литературы, в т.ч. 111 зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Шинкарев, Сергей Михайлович

5. Выводы

1. Разработана промышленная технология получения Ы-замещенных производных хитозана, включающая основные этапы: получение активированного хитозана; ацилирование аминогрупп без присутствия токсичных органических соединений; распылительное или лиофильное высушивание.

2. Усовершенствована промышленная технология производства низкомолекулярного водорастворимого хитозана, позволяющая повысить качество и значительно расширить области применения препарата.

3. Определены технологические параметры регулирования молекулярной массы и степени замещения различных форм и производных хитозана с целью получения биополимеров различного назначения с требуемыми свойствами.

4. На основе полученных модификаций хитозана и его производных разработаны различные лекарственные формы препаратов для внутреннего и наружного применения в виде порошков, стерильных гелей и жидкостей с пролонгированным действием.

5. Установлено лечебное и профилактическое действие разработанных на основе хитозана препаратов при испытании их на молодняке сельскохозяйственных животных с признаками желудочно - кишечных расстройств неинфекционной природы. ------------

6. Достоверно выявлено повышение иммунного статуса животных, получавших хитозансодержащие препараты. Сохранность в опытных группах поросят была выше на 56+ 2%, а привесы - на 10-16% по сравнению с контролем.

7. В опытах на лабораторных животных установлено, что водорастворимая форма хитозана с молекулярной массой менее 10 кДа обладает выраженным радиопротекторным действием, что указывает на новый аспект применения этого природного полисахарида.

104

5. Практические предложения.

На основании полученных данных разработана следующая НТД:

1. «Сукцинат хитозана» ТУ 9289-003-11734126-98. Утверждены директором ВНИТИБП 13 июля 1998г.

2. «Хитозан низкомолекулярный пищевой» ТУ 9289-002-1141823499, утверждены директором центра «Биоинженерия» 1 апреля 2000г.

3. «Хитозан низкомолекулярный пищевой» технологическая инструкция утверждены директором центра «Биоинженерия» 14 октября 1999г.

4. «Хитозан» ТУ 9289-008-11734126-01 (на утверждении ВГНКИ)

5. Временное наставление по применению хитозана гелевого для профилактики и лечения желудочно - кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных (на утверждении).

6. Временное наставление по применению хитозана водорастворимого для профилактики и лечения желудочно - кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных (на утверждении).

7. Гигиеническое заключение № 77.01.12.928.П.35174.11.0 от 30/11.2000г. на сукцинат хитозана

Гигиеническое заключение № 77.99.9.916.П.9308.3.00 от 02/03.2000г. на хитозан низкомолекулярный пищевой. ----------

2.6. Заключение.

Обзор литературных данных не оставляет сомнений в том, что область применения хитозана и его модификаций чрезвычайно обширна. В результате исследований, проводимых во многих странах, и благодаря уникальным свойствам этого полимера, область применения будет еще более расширена.

35

Основной задачей в производстве хитозана является получение полимера и его модификации стандартного качества, с воспроизводимыми характеристиками. Диапазон колебаний этих характеристик может быть велик, так как ясно, что для разных областей применения требуются полимеры с различными свойствами. В связи с этим важно иметь возможность контролировать и регулировать свойства хитозана и препаратов на его основе уже в процессе их получения.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что существующие технологии позволяют получать хитозан и его производные, пригодные для использования в пищевой, косметической, деревообрабатывающей промыш-ленностях, для очистки сточных вод и промышленных сбросов.

Исследования многих авторов направлены на поиск эффективных форм и модификаций хитозана для использования в медицине и ветеринарии. Наиболее перспективно создание препаратов на основе низкомолекулярного хитозана. Однако стоит отметить, что большинство предложенных способов трудоемки, проводятся на лабораторном оборудовании и позволяют получать препарат в малых количествах. Поэтому разработка промышленной технологии получения препаратов на основе хитозана с высокой биологической активностью приобретает особое значение.

3. Материалы и методы

Работа выполнена в период 1997-2001 гг. во Всероссийском научно -исследовательском и технологическом институте биологической промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук в отделе получения биологически активных веществ.

Для проведения экспериментальных работ использовали хитин и хито-зан производства фирм «Восток - Бор» и «Сонат». Ферментный комплекс хи-тиназ 81хер1:отюе8 кигеапоуп получали в центре «Биоинженерия» РАН. Отбор проб и лабораторных образцов для исследований проводили в соответствии с требованиями ГОСТ 8756.0-70 "Отбор проб и подготовка их к испытанию".

Производственные испытания препаратов на основе хитозана проводили в хозяйствах Брянской, Курской, Московской и Тульской областей на 288 телятах и 96 поросятах.

Определение степени деацетилирования хитозана. Модифицированный метод Ван-Слайка. Способ определения концентрации ]ЧН2-групп по Ван-Слайку основан на разложении алифатических аминов азотистой кислотой НЖ>2, сопровождающимся выделением азота:

И-]ЧН2 + Н1Ч02 и он + н2о + ]Ч2Т

Подобная реакция происходит при обработке азотистой кислотой хитозана, что позволяет определить количество в нем аминогрупп, т.е. степень деацетилирования.

Азотистую кислоту получают непосредственно перед определением следующей реакцией: т]Ч02 + СНзСООН Н]Ч02 + СНзСОО^ Для этого в небольшой стаканчик на 50 мл вносят 4 мл 14% раст

-л вора №Ж)2 и 15 мл ледяной уксусной кислоты. Смесь выдерживают 5 мин по секундомеру (29). Навеску хитозана 20 мг взвешивают с точностью до 0,0001 г., растворяют в 10 мл 2% уксусной кислоты. В реакционную камеру вносят 1 мл раствора.

После того, как в реакционную камеру внесено исследуемое вещество, заливают предварительно приготовленную азотистую кислоту и проводят реакцию при постоянном встряхивании реакционной камеры в течение 4 минут по секундомеру. Затем реакцию останавливают, внося в реакционную камеру 2 мл 40% раствора КОН и встряхивают реактор в течение 1 минуты по секундомеру. В реакторе при этом образуется пузырек газа, состоящий из смеси азота, образовавшегося в результате реакции азотистой кислоты с аминогруппами хитозана, и окислов азота, образующихся при распаде неустойчивой азотистой кислоты.

Для очистки азота от окислов азота в реактор вводят 10 мл щелочного раствора перманганата калия, реактор встряхивают 3 минуты по секундомеру для поглощения перманганатом калия окислов азота. Оставшийся после поглощения окислов азота пузырек газа представляет собой азот, объем которого измеряется на градуированном участке аппарата. Определение СДА обычно проводят 3 раза. Расчет СДА проводят по следующей формуле:

Ур - Ух) 273 0,00125 (В - Р) Ур-ра

С=------------------------------------ (1) ц 2 (273 + 0 760 или

0,02245 (Ур - Ух) Ур-ра (В - Р)

С = ---------------------------------- (2) я (273 + г) где 0,02245 - коэффициент, объединяющий константы;

Vp - объем азота при рабочем измерении (мл); Vx - объем азота при холостом измерении (мл); Vp-pa - степень разбавления хитозана в уксусной кислоте; В - атмосферное давление в момент измерения (мм рт.ст.); Р - парциальное давление водяных паров над поверхностью, поправка на температуру в момент измерения (мм рт.ст.); t - температура воздуха в момент измерения (°С); q - навеска вещества (г).

Кондуктометрическое титрование. Данный метод основан на измерении электропроводности раствора полимера, величина которой изменяется в зависимости от происходящих химических взаимодействий определяемого вещества с титрантом (71). В случае титрования раствора хитозана раствором NaOH наблюдается нелинейный характер изменения электропроводности раствора, что выражается в образовании характерной двоякоизломан-ной кривой титрования. Подобный характер изменения электропроводности связан с изменением равновесной концентрации ионов определяемого вещества, еще не вступавшего в реакцию, или с обратимостью реакции.(65).

Определение степени деацетилирования (СДА) хитозана проводили титрованием на кондуктометре PRL Т №5721 фирмы MEGA EtWRO (Польша) при 25 ± 0,1 °С.

Полученные данные обрабатывали графическим построением зависимости удельной электропроводности (mS) от объема добавленного титранта с концентрацией в г-экв/л. На рис.1 приведена кривая кондуктометрического титрования образца хитозана.

1,2 шБ

О, 8 0,6-0,4 0,2-0 а --—-—- Ь -:-:- с ---;-:

V 0,5Ы ЫаОН, мл

Рис.2. Кривая кондуктометрического титрования образца хитозана. а - участок кривой, соответствующий процессу нейтрализации избыточного количества кислоты;

Ь - "плато" - участок кривой, соответствующий процессу нейтрализации ионов СГ , присоединившихся к аминогруппам хитозана; с - участок возрастания электропроводности вследствие избытка щелочи.

На основе значения Ь , полученного при построении кривой титрования, определяли степень деацетилирования (СДА) по формуле:

Мхт V N

СДА = ---------------------- 100%

Р + (Мхт - Мхтз) V N

3) где Мхт - молекулярная масса звена хитина; Мхтз - молекулярная масса звена хитозана; Р - навеска хитозана (мг);

N - нормальность титранта - раствора щелочи (г-экв/л);

4 ' шЛ? У

• .г Г 40

V - объем "плато" (участок Ь) в мл.

Определение степени замещения хитозана

Определение степени замещения водорастворимого хитозана проводится методом кондуктометрического титрования.

Навеску образца в количестве 200 мг помещают в стакан емкостью Ю0-150 мл и растворяют при перемешивании в ЗО мл дистиллированной воды. В полученный раствор погружают датчик кондуктометра и добавляют при перемешивании 10 мл 0,1 N раствора соляной кислоты. Полученный раствор титруют 0,1 N водным раствором едкого натрия до первоначального показателя проводимости.

На кривой зависимости проводимости раствора хитозана водорастворимого от объема титранта присутствуют три перегиба. Первый перегиб соответствует количеству свободной (избыточной) соляной кислоты, второй -общему количеству кватернизованных соляной кислотой аминогрупп хитозана водорастворимого и одной из карбоксильных групп свободной янтарной кислоты, третий перегиб обусловлен титрованием карбоксильных групп сук-цинамидных звеньев хитозана водорастворимого и второй карбоксильной группы свободной янтарной кислоты.

Степень замещения (СЗ) рассчитывают по формуле:

СЗ = ((К + 1 )/2 - К* А/2В ) х 100%, (4) где А - объем щелочи, пошедшей на титрование общего количества кватернизованных соляной кислотой аминогрупп хитозана водорастворимого и одной из карбоксильных групп свободной янтарной кислоты;

В - объем щелочи, пошедшей на титрование карбоксильных групп сукцинамидных звеньев хитозана водорастворимого и второй карбоксильной группы свободной янтарной кислоты;

К = М1 / М2, где лвяяствш

41

М1 - количество реагента (в молях), используемого для получения водорастворимого хитозана М2 - количество хитозана (в молях), используемого в реакции.

Определение содержания токсичных элементов меди, кадмия, ртути, мышьяка, олова, свинца, цинка, железа проводят по СТ СЭВ 5340 и по ГОСТ 26931, ГОСТ 26933, ГОСТ 26927, ГОСТ 26930, ГОСТ 26935, ГОСТ 26932, ГОСТ 26934, ГОСТ 26928.

Определение микробиологической чистоты проводили методом Коха - определяли наиболее вероятную численность колониеобразующих единиц (КОЕ) мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов в 1 г препарата.

Определение молекулярной массы хитозана. Капиллярную вискозиметрию используют для измерения характеристической вязкости [г| ], определяющей основной прирост вязкости растворителя при введении в него полимера (95).

В настоящей работе для измерения [ г| ] растворов хитозанов использовали модифицированный (64) капиллярный вискозиметр иЬеПоёе с диаметром капилляра 0,71 мм. Вязкость растворов хитозанов измеряли при 25 ± 0,05 °С в диапазоне концентраций 0,025-0,1 г/Дл. Ранее было показано, что в этом диапазоне вязкость растворов хитозана практически не зависит от скорости сдвига (65).

Образцы хитозана для измерений [ г| ] готовили растворением навески в 0,2 М ацетатном буфере в течение не менее 2 часов. Такая длительность времени необходима для растворения высокомолекулярных образцов. Раствор хитозана с концентрацией 0,1 г/Дл помещали в приемную емкость вискозиметра и термостатировали при 25 ± 0,05 °С 30 минут, затем производили измерение вязкости до получения не менее двух сходящихся результатов. Поеле этого проводили разбавление пробы термостатированным растворителем до концентрации 0,07 г/Дл и снова проводили измерение. Таким же образом проводили последовательное разведение раствора до 0,05 г/Дл и 0,025 г/Дл с измерением его вязкости (64).

Среднее воспроизводимое значение времени истечения раствора служит для расчета удельной вязкости по формуле: tp-pa ~ tp-рителя

Луд=--------------------------------------(5) tp-рителя где Тр.ра - среднее воспроизводимое значение истечения раствора хитозана; Тррителя - среднее воспроизводимое значение времени истечения растворителя. Далее определяли приведенную вязкость раствора:

Луд

ЛпР= ----------(6) с где г|уд - удельная вязкость раствора; с - концентрация раствора (г/Дл). Строили график зависимости Т)уд от с, который представляет собой прямую, интерполируя которую на ось ординат, получали значение характеристической вязкости [ Г| ]. Среднюю молекулярную массу хитозана определяли, как lg [ Л ] +3,8601

Mv = antilg----------------------------------(7)

0,850 где г| - характеристическая вязкость раствора (Дл/г).

Определение динамической вязкости растворов хитозанов.

Измерения динамической вязкости растворов хитозана и его производных проводили на ротационном вискозиметре "Reotest-2" в системе коаксиальных цилиндров N/N и S/S при скоростях сдвига от 3 до 1400 с"1 в соответствии с инструкцией, прилагаемой к прибору.

Приготовление препаратов на основе хитозанэ

Приготовление гелей на основе натриевой соли сукцината хитозана Для получения геля использовали деминерализованную, дистиллированную или кипяченую воду, 2%-ный гель получали путем растворения 1 кг препарата НССХ в 49 л воды. Стерилизацию готовых форм проводили в парогенераторе при давлении 0,15Мпа в течение 1 часа

Препараты на основе хитозана с регулируемой молекулярной массой получали в виде солевой формы (с янтарной, соляной или уксусной кислотами) путем растворения низкомолекулярного полимера в 0,5-2%-ных растворах кислот. Фильтровали полученные гели на нутч-фильтре через капроновое сито с размером ячейки 50 мкм. Стерилизовали путем фильтрации через каскад фильтров.

Фасовку осуществляли во флаконы ФО - 10 или ФО - 500 по

ТУ 64-2-10-87, которые укупоривали резиновыми пробками по ТУ 38.106618 - 95 и обжимали алюминиевыми колпачками по ОСТ 64-009-89.

Оборудование и материалы. Для растворения и сукцинилирования хитозана использовали реакторы из нержавеющей стали объемом 0,15, 0,63 и л

1 м . Гидролиз хитозана проводили в эмалированном реакторе объемом 0,15м3.

Для стерилизации готовых форм использовали фильтры УСФ 293-7 на пластинах фирм «Millipore» или «Scitz» с размером пор 0,8 мкм, 0,45 мкм и 0,22 мкм, либо автоклавировали в парогенераторе ГПД 560 Для сублимационной сушки препарата использовали установку TG 50.5 фирмы HVD GmBH, а для распылительной - установки «MINOR» фирмы "NIRO ATOMIZER" и отечественную РСЦ - 10.

Определение параметров острой токсичности хитозана было проведено на 36 мышах-самцах массой 18.20 г., разделенных на 6 групп по 6 голов в каждой. Препарат вводили однократно в дозах 1,6 - 51,2 г/кг живой массы животного подкожно в виде гелевого раствора. Наблюдение за общим состоянием, поведением и летальностью мышей продолжали в течение 14 дней. Обработку результатов проводили методом пробит-анализа по L.C. Miller, M.L.Taitner.

Изучение хронического действия препарата хитозан проводили на самцах мышей с исходной массой 25.30 г. Препарат вводили внутрижелудочно в дозе 70 мг/кг (1/200 ЛД50) живой массы 5 дней подряд с интервалом 5 дней на протяжении 6 месяцев. По окончании опыта провели определение количества эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина в периферической крови, а также гисто-морфологическое изучение печени и почек.

Влияния препарата хитозан на гематологические показатели крови изучено в эксперименте на 10 белых мышах. Животные были разделены на 2 группы по 5 гол. в каждой (опытная и контрольная). Опытной группе животных в течение 6-ти месяцев внутрижелудочно вводили препарат по вышеописанной схеме, в контрольной группе животные не подвергались обработке препаратом.

Влияние хитозана на резистентность животных изучали на 78 поросятах крупной белой породы. Препарат скармливали в два этапа по 5 дней через 14 дней вместе с подкормкой по 3 мл/кг живой массы 2%-ного гелевого раствора хитозана. В ходе эксперимента учитывали выживаемость поросят, привесы в группах, определили гематологические показатели периферической крови.

Динамику проникновения хитозана в различные ткани и его выведение изучали на 40 мышах линии С 57/ВС массой 25-26г, которым вводили Н-хитозан в дозе 4 мг/кг живого веса (что соответствует 100 мкг вещества или 100 цКи метки на 1 животное) в виде 0,02%-ного раствора. Животных убивали через 1, 3, 5, 15, 30 мин, 1, 2, 4, 8 и 20часов, отбирали образцы крови, печени, почек, селезенки, тимуса и помещали их в жидкий азот. У каждого животного брали по две навески каждой ткани, заливали растворяющим составом, инкубировали в термостате, обесцвечивали и помещали во флаконы со сцинтиллятором на основе толуола и метилцеллозольва. Радиоактивность измеряли на счетчике 8Ь-60 (Митрохин Ю.И., Гутникова М.Н. и др).

Действие хитозана в качестве радиопротектора изучали на 30 мышах массой 20-22 г, которым внутрибрюшинно вводили хитозан в дозе 200 мг\кг живой массы в виде 2%-ного геля. Облучали мышей у-лучами на установке " Гамма-панорама" в дозе 7 Р/мин в течение 57,5 мин общей дозой 400 Р (Ы)5о/зо). Эффективность применения препарата оценивали по выживаемости мышей и их клиническому состоянию.

Гематологические показатели (эритроциты, лейкоциты, гемоглобин, лейкоформула) определяли по стандартным методикам (Краснов И.П., Ми-тюшин В.В.)

Опыты на телятах и поросятах проводили в период массовых отелов и опоросов. Хитозан выпаивался телятам и давался поросятам с прикормом за 30 минут до основного кормления 2-3 раза в Сутки. Контролем служили группы животных, которым вводили антибиотики или не назначали лечения.

Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере с использованием прикладных программ.

4. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Получение 1Ч-замещенных производных хитозана. 4.1.1. Получение активированного хитозана.

Химическая модификация хитозана является наиболее доступным способом получения водорастворимых форм с заданными свойствами. Многочисленные исследования по применению модифицированного хитозана в области медицины, ветеринарии и биологии способствовали проведению интенсивной работы по созданию современных технологий получения производных хитозана. Основные требования, предъявляемые к качеству препарата - водорастворимость, биосовместимость, нетоксичность, деградируемость в организме человека и животных. Предложенные технологии получения производных хитозана (39,47 и др), во многом, соответствуют этим критериям, но требовали применения токсичных органических растворителей, что неприемлемо в таких отраслях как медицина и ветеринария. Полярные органические вещества могут прочно адсорбироваться на хитозане и его производных ( 5,87 ), причём выявлен полиэкстремальный характер зависимости величины адсорбции от потенциала ионизации органической молекулы. Избирательная адсорбция на этих биополимерах обусловлена образованием более прочных связей между группами -ОН, -КНг и -ИНСОСНз макромолекул хитозана и органическими молекулами, чем их водородные связи с молекулами воды (3,36,41). Полное удаление полярных органических молекул из полимеров или олигомеров возможно лишь из их тонких плёнок в высоком вакууме и при повышенных температурах (82,89,96). Поэтому удаление органических молекул из макрообъёмов хитозана и его производных в вакууме и, тем более, при сушке на воздухе практически невозможно. Вследствие этого в натриевой соли сукцината хитозана, получаемого по методике (39) или (47), когда все стадии проводят в органической среде, обнаруживается при анализе этих продуктов наличие органических растворителей.

Были проведены исследования по разработке промышленной технологии получения N - замещенных производных хитозана, лишенного этого недостатка.

Схема получения активированного хитозана (рисунок 3) не отличалась от других способов ( 39 ), так как применения токсичной органики при этом не требовалось. Основной задачей на данном этапе исследований являлось получение активированного хитозана с рН, близким к нейтральному, оптимальной консистенцией осадка и минимальным содержанием примесей.

При получении гелевых растворов хитозана с различной молекулярной массой и последующей фильтрации было отмечено, что высокомолекулярный хитозан (ММ>500кДа) при концентрации геля 3% не фильтровался при обычных условиях (15 - 20 °С, 0,1 - 0,15 МПа) через сито с размером ячейки 50 мкм, а при использовании сита с размером ячейки 200 мкм получали опа-лесцирующий раствор, что свидетельствует о наличии нерастворимых примесей.

Проведенные исследования вязкостей растворов хитозана с молекулярной массой от 26 до 500 кДа и концентрацией от 2 до 8 % ( таблица 1 ) показали, что оптимальное значение для получения прозрачных растворов находится в пределах 25 - ЗОсПз. При повышении этого показателя время фильтрации увеличивается, требуются повышенная температура и давление, при понижении - возрастает объем фильтрата, снижается эффективность использования оборудования и рабочего времени, повышаются затраты на концентрацию и сушку.

При переосаждении хитозана из гелевых растворов многие исследователи (/$9) предлагают доводить рН суспензии до И - 13 с последующей отмывкой до рН 7,5 - 8,0. Это необходимо для осаждения низкомолекулярных фракций при широком ММР.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шинкарев, Сергей Михайлович, 2001 год

1. Албулов А.И., Комаров Б А., Самуйленко А.Я, Фоменко А.С., Шинкарев С.М. Разработка технологии получения натриевой соли сукцината хитозана.// Материалы Пятой конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М. ВНИРО, 1999.-С.7-9.

2. Араки Я., Ито Е. Метаболический путь образования хитозана. Ферментативное деацетилирование хитина // Biochemical and Biophisical Research Communications, 1974.-том 56.- c.669-675.

3. Арнетт Э.М. Количественное сравнение слабых органических оснований. Современные проблемы физической органической химии. Сборник обзоров. М: изд. "Мир" 1967 С. 195

4. Балицкий К.П., Векслер И.Г. Применение некоторых стимуляторов полисахаридной природы в комплексной терапии злокачественных новообразований. // Неспецифичные стимуляторы полисахаридной природы и их применение в онкологии. Рига: Занатне, 1977. С. 88-99.

5. Богданов В Д. Эмульсионные системы, содержащие хитозан // Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования. М.: ВНИРО, 1992.-С. 76-83.

6. Бржески М.М. Получение хитина/хитозана из панцирей антарктического криля (Euphausia superba Dana) в промышленном масштабе.// Материалы Международной конференции по хитину и хитозану. Саппоро, Япония, 1982. Перевод КЕ-57232 Киев, 1983.

7. Буянов А.А., Семенов В.В., Нифантов В.Д. и др. Влияние введения хитозана на эндокринные органы поросят сосунов //

8. Научная конференция профессорско преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов ЛВИ «Актуальные проблемы ветеринарии». Тезисы докладов. Л.,1991. с.13-14.

9. Быков В.П., Быкова В.М., Сафронова Т.М., Кривошеина Л.И., Немцев C.B., Недосекова Т.М., Новиков A.B., Ермишева О.Э., Кадыров З.К., Сныткин И.И. Способ переработки мелких ракообразных с получением хитозана. Патент РФ N 2000066, 1992.

10. Быков В.П. Состояние и перспективы развития производства хитина, хитозана и продуктов на их основе из панциря ракообразных.// Материалы Пятой конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М. ВНИРО, 1999.-С.12-15.

11. Ванлербеш Г., Себаг Э. Способ получения производных хитозана. Патент № 508212, кл. С 08 В 37/08. Бюл. № 11. 04.05.76

12. Варламов В.П., Стояченко И.А., Буданов М.В. Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана. Патент № 2073016 кл. С 08 В 37/08. Бюл. № 4. 10.02.97.

13. Взнуздаева O.A., Зверева Г.А., Молодцов Н.В. Влияние хитозана на Jg M и Jg G антителообразующей клетки у мышей // Иммунология. 1984., №1., с. 53-55.

14. Воронин Е.С., Девришов Д.А., Петров Р.В., Шишков В.Г., Белов А.Д. Концепция этиологии и профилактики диарей и респираторных болезней новорожденных телят.// Тезисы докладов

15. Всероссийской научной конференции «Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных». М.-1996. С. 8-10.

16. Галактионов В.Г., Мищенко Б.А., Самойленко A.C. и др. Усиление с помощью хитозана реакции контактного взаимодействия макрофага с тимоцитами in vitro // Иммунология. -1983. N3. - С. 6669.

17. Галактионов ВТ., Мищенко Б.А, Хромых JI.B,, Молодцов Н.В. Изучение действия хитозана на контактное взаимодействие макрофагов с лимфоцитами in vitro // Иммунология 1984. - N2. -С.35-38.

18. Гамзазаде А.И., Ажигирова И.А., Рогожин C.B. Авторское свидетельство СССР N 592678. Способ получения хитозана., 1977.

19. Гамзазаде А.И., Скляр A.M., Рогожин C.B. Некоторые особенности получения хитозана. // Высокомолекулярные соединения, 1985.- т.А.- XXVII.- N 6.- с. 1325-1331.

20. Гарсия-Алонсо И., Овьеда-Вега Д., Хенрикес Р.Д. Влияние ионов кальция в хитине омара на его характеристики. // Биоорганическая химия, 1984.-t.10.- N 9.- с. 1248-1252.

21. Гущина Э.В. Показатели неспецифической защиты поросят при введении иммуномодуляторов полисахаридной и пептидо -полисахаридной природы. Автореферат диссертации на соис. Уч. Степ, к.в.н. JI.-1991. 23 с.

22. Дрозд H.H., Шер АИ., Макаров В.А и др. Связь физико-химической структуры и антикоагулянтных эффектов упроизводных полисульфатнрованного хитозана // Эксперим. и клин, фармакология. 1994. -T.57,N4.-C .42-45.

23. Дубинская AM., Доброворский А.Е. Применение хитина и его производных в фармации: Обзор // Хим. фармац. журн. -1989. Т.23, N5.-С. 623-628.

24. Жоголев КД., Никитин В.Ю. Экспериментально-лабораторное изучение иммуномодулирующих свойств препаратов хитина и хнтозана // Иммунология -1998. N6. - С. 53-54.

25. Жоголев КД, Никитин В.Ю., Буланьков Ю.И„ Десятова AB. Влияние хитозана на миграцию, пролиферацию и дифференцировку стволовых кроветворных клеток // Материалы 1 съезда иммунологов России. Новосибирск, 1992. - С. 164-165.

26. Жоголев КД., Щедрина Н.А, Никитин В.Ю., Ващенко В.И. Иммунокорригирующее действие препарата хитозан при бактериальной и гриппозной инфекции // Иммунокоррекцня при инфекционной патологии. Д., 1988. - С.32.

27. Жоголев К.Д., Никитин В.Ю., Цыган В.Н., Егоров В.Н. Хитозан в медицине и рациональном питании.- С-Пб,2000г.- 24 стр.

28. Йиргенсон Б. Природные органические макромолекулы.- М.: Мир, 1965.- с.203-206.

29. Коваль Ю.Ф., Жоголев КД., Никитин В.Ю., Бельгесов Н.В. Шейбак В.В. и др. АС. № 1681858 "Способ повышения резистентности поросят к инфекционным заболеваниям" // Бюл-О.И., 1991. - N37. МКИ А 61 К 35/56.

30. Коваль Ю.Ф., Жогодев КД., Никитан В.Ю., Буланьков Ю.И„ Деоггова A.B. Изучение биологической активности препаратов хитина и хнтозана // Материалы 1 съезда иммунологов России (23-25 июня 1992). Новосибирск, 1992. - С. 219.

31. Кленкова Н.И. Структура и реакционная способность целлюлозы.- JL: Наука. Ленинградское отделение, 1976.- с. 152-191. 34. Климов В.А. Основные микрометоды анализа органических соединений. М.: Химия, 1975.-с. 164.

32. Корнилаева Г В. Т.В.Макарова ТВ. А.И.Гамзазаде АИ. и соавт. Сульфатированные производные хитозана как ингибиторы ВИЧ-инфекции // Иммунология. -1995. N1. -С. 13-14.

33. Мищенко Б.А., Самойленко АС., Хромых Л.М. Анализ контактного взаимодействия макрофагов с сингенными лимфоцитами различного органного происхождения под влиянием хитозана // Теоретическая и прикладная иммунология. М., 1982. С.34-35.

34. Мима С., Ивамото Р., Йосикава С. Высокодеацетилированный хитин и его свойства. Материалы Международной конференции похитину и хитозану 2., Саппоро, Япония, 1982., Перевод КЕ-57233.-Киев, 1984.

35. Молодцов Н.В. Способ получения водорастворимого хитозана. Авторское свидетельство № 508212, кл. С 08 В37/08. Бюл.№11. 25.03.76г

36. Мрачковская Т.А., Гамзазаде А.И., Рогожин C.B. Способ получения карбоксилсодержащих производных хитозана. Авторское свидетельство № 802290, кл. С 08 В 37/08. Бюл. № 5. 07.02.81

37. Мэнсон Дж., Сперлинг JI. Полимерные смеси и композиты. М: изд. "Мир". 1979.

38. Насибов С.М, Большаков И.Н., Кулаев JI.B. Антибактериальная активности сорбентов на основе хита-зана // Совершенствование производства хитина н хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования. М.: ВНИРО, 1992. - С.63-74.

39. Немцев C.B. Способы получения хитина и хитозана.// Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих от-ходов криля и пути их использования. Материалы третьей всесоюзной конференции.- М.: ВНИРО, 1992.-с.7-15.

40. Никитин В.Ю. Жоголев КД, Шейбак В.В., Нудьга Л.А Иммуноадъювантные свойства хитозана и его производных Intern, oonf. Natural substence for health and beauty. Рига, 1997.- С.76-77.

41. Нудьга JI.A Биоматериалы наосиове хитина и хитозана // Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования. М., 1992. - С. 40-44.

42. Нудьга Л.М., Плиско Е.А., Данилов С.Н. Получение хитозана и изучение его фракционного состава. // Журнал органической химии, 1971.--t.XLL- с 111.

43. Петров В.А, Тарасенко Г. А Медико-биологические аспекты использования хитозана из панциря ракообразных в пищевых целях // Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования. • М., 1992. С. 51-56.

44. Петров Р В. Хаитов Р.М Синтетические полиэлектролиты и регуляция отдельных этапов иммуногенеза / Иммунология. Т.7. Регуляторные клетки иммунной системы. М., 1978. - С. 223-244.

45. Петров РВ., Хаитов Р М., Манько В.М. Контроль и регуляция иммунного ответа. М.: Медицина, 1981-312с.

46. Пенистон К.П., Джонсон Э.Л. Способ получения хитозана. Пат.США N4195175, 1980, Перевод КЕ-49121.- Киев, 1984.

47. Пенистон К.П., Джонсон ЭЛ. Способ восстановления химических веществ из панциря ракообразных. Пат. США N 4199496, 1980, Перевод КЕ-49589. Киев, 1984.

48. Пениче-Ковас К., Нието Х.М., Гарсия-Алонсо И., Фернандес-Белтран Х.Р. Влияние некоторых параметров приготовления хитозана на его характеристики. // Биоорганическая химия, 1984.-т.Ю.-N 9.-С.1248-1252.

49. Плиско Е.А., Данилов С.Н. Свойства хитина и его модификаций.// Материалы 3 Всесоюзной конференции по проблемам химии и обмена углеводов. М., 1963.- с. 141-145.

50. Плиско Е.А., Нудьга Л.А., Данилов С.Н. Хитин и его химические превращения. // Успехи химии, 1977.- t.XLVI.- вып.8.- с. 1470-1487.

51. Роговина С.З., Вихорева, Г.А., Горбачева И.Н., Зеленецкий С.Н., Акопова Т. А. Способ получения карбоксилсодержащих производных хитозана. Патент РФ №2100373, кл. С 08 В 37/08. Бюл. №36.27.l2.97r ■

52. Роговина С.З., Акопова Т.А., Зеленецкий С.Н. Изучение экструзионного размола хитозана. Производство и применение хитина и хитозана. Тезисы докладов 4-ой Всероссийской конференции. М: изд. ВНИРО 25.04.1995 С. 27.

53. Рогожин C.B., Лозинский В.И., Вайнерман Е.С., Кулакова В .К., Гамзазаде А.И., Быкова В.М., Немцев C.B., Лобова Е.И. Способ получения хитозана. Авторское свидетельство СССР N 1363831, 1986.

54. Салем Омер А. Разработка технологии получения хитина и хитозана из сепиона каракатицы. Автореферат диссертации на соиск. учен.степ. канд. техн. наук.-М., 1995.

55. Сенюк О.Ф., Горовой Л.Ф., Трутнева И.А. Использование хитинового препарата «Микотон» в качестве радиопротектора. Материалы Пятой конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М. ВНИРО, 1999.- С. 193-197.

56. Сидоров М.А. Научные основы профилактики болезней молодняка животных.// Тезисы докладов Всероссийской научной конференции «Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных». М.-1996. С. 1-3.

57. Сироткин А.Н., Ильязов Р.Г. Радиоэкологиясельскохозяйственных животных. Казань, 2000г. 382 стр.■ ■/

58. Скворцов В.Ю. Мастернак Т В, Кириллина Е А, Молодцов Н.В. Влияние хитозана на индукцию иммунного ответа на эритроцитыбарана в сиюенной и аллогенной системах переноса "иммунных" макрофагов//Иммунология.-1985.-N5.-С 79-81

59. Скляр A.M. Исследование гидродинамических и реологических свойств растворов полимергомологов хитозана и его хлористоводород-ной соли. Автореф. диссертации на соискание уч.степени к.х.н. 12111-173 ДСП, от 18.06.81. М.: ИНЭОС АН СССР, 1981.

60. Тарасенко Г .А. Радиопротекторные и антитоксические свойства хитозана из панциря краба по отношению к Cs и Hg.// Материалы Пятой конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М. ВНИРО, 1999.- С. 197-198.

61. Усманов Т.И., Рашидова С.Ш., Ашуров Н.Ш., Султанов А.Ж. Исследование микроструктуры цепи хитозанов методом ЯМР-спектроскопии// Материалы Пятой конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М. ВНИРО, 1999.-С.263-265. ,

62. Феофилова Е.П. Биологические функции и практическое использование хитина.// Прикладная биохимия и микробиолия. -1984 -Т.20, N2. -С. 147-160.

63. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Менорская А.С. Хитин мицелиальных грибов: методы выделения, идентификации и физико-химические свойства. // Микробиология, 1995.- том 64.- N 1.-С.26-30.

64. Худякова Т.А., Крешков А.П. Кондуктометрический метод анализа. М.: Высшая школа, 1975.- с.23-30.

65. Эрнст JI.K. Проблемы устойчивости сельскохозяйственных животных к болезням и пути их решения.//Материалы научной сессии Россельхозакадемии/ Том I: Пленарное заседание I-III- М.: Россельхозакадемия, 1999.- С. 25-36.

66. Ando Т., Kataoka S. Pat. Japan N 110267, 1979. Опубликов. в С.А., 1980.- v.92.- р.164-252.

67. Ando Y., Tsuzuki' *. The role of surface charge in ionic germination of Clostridium perfringens spores.//J. Gen. Microbiol. 1984.-V. 130 .-P 267-273.

68. Asao, Y.; Tanzawa, T. Manufacture of low-molecular-weight water-soluble chitosan. JP 63 63,701, 1988. -----------

69. Babak V.G., Rinaudo M, Desbrinres J, Vikhoreva G.A., Michalski MC. The effect of alkyl chains length of a polysoap on the surface activity of its complexes with cationic surfactants. Mendeleev Commun. 1997.1. P. 149-151.

70. Bross. G. Colloid chemistry in microencapsulation technology. Sverdlovsk: Oural Univesity Press, 1991 .-171 p.

71. Belamie E., Giraud-Guille M., Domard A. Microscopic studies of chitosan in condensed phases. 1st International conference of the european chitin society. Abstracts book. Brest-France. September 11-13 1995. P. 11. . . . -. . .

72. Bertone F.F., Adickes E.D. Chitosan: effects on wound healing in urogenital tissue: preliminary report // J. Urology. 1988. - Vol. 140. - P. 1134-1137.

73. Brien R.W., Ralph B J. // Ann. Botany. New series. 1966.-30.1. N».120.-P. 831-846.

74. Chandy T, Sharma C.P. Chitosan — as a biomaterial // Biomater. Artif. Cells Artif. Organs. 1990. - Vol. 18, N l.-P. 1-24.

75. Darmon S.E., Rudall K. Disc. Far. Soc., 1950, № 9, P 251.

76. Denuzime A; Taverna M; Ferner D; DomardA. Capillary electrophoresis of glycosaminoglycan-derived disaccharides: application to stability studies of glycosaminoglycan chitosan complexes.// Electrophoresis, 1997.-Y. 18.-№5.-P. 745-750.

77. Diamantstein J, Klos M., Osawa H Chitin: An immunological adjuvant a polyclonal B-lymphocyte activator.// Int. Archs. Allergy Appl. Immun. -1982. Vol.68, N4. - P. 377-381

78. Domard, A.; Rinaudo, M.; Terrasin, C. Manufacture of kwaternization chitosan PF 33.02.402,1986.

79. Etsuko G. Manufacture of a chitosan.//JP №.-536891.-1993.

80. Fihser I.S., Trans. Br. Mycol. Soc.-1975. 64.-P. 175-193.

81. Fujita H. Pat. Japan N 53-125770, 1975.

82. Gamzazade A.I., Shlimak V.M., Sklar A.M., Shtikova E.V., Pavlova S.A.,Rogojin S.V. // Acta Polymerien 1985. V. 36. № 8. P. 420.

83. Gilbert R.D., Patton P.A. Liquid crystal formation in cellulose and cellulos derivatives. Progress in Polymer Sciense. 1983. V. 9. P. 115 -131

84. Gorovoj L, Kosyakov V. Advances in Chitin Science.// Proc. 7 Int. Conf. on Chitin/Chitisan. Lyon, France.-1997.-V. 2.-P. 858-863.

85. GorovojL., Burdyukova L., Zemskov V., Prilutsky A. Advances in

86. Chitin Science. V. 2. Proc. 7 Int.Conf. on Chitin/Chitisan. Lyon, France. 1997.-P. 648-655. 18.

87. Hirano S., Hirochi K., Hayashi K., Mikami T., Tachibana H. Chitin and chitosan for use in pharmaceutics and cosmetics1. JP 42,158,205, 1988

88. Hoppe-Seyler F. Veber. Chitin and Zellulosa // Ber. Deutshem Chemischem Gesellschaft. 1894. - B.27. - H2. -P.3329-3331.

89. Iida J. Ishihara C., Nishimura K. Stimulation of nonspecific host resistance against Sendai virus and Escher-ichia Coli infections by chitin derivatives in mice / Vaccine 1987 - Vol.5. N4 - P. 270-274.

90. Inoue, K., Baba, Y. Yoshizuka Ml Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993.-66.-N10.-P. 2915-2921.

91. Jameela S R. LAtha P G. Subramoniam A. et al. Antitumour activity of mitoxantrone-loaded chitosan micro-spheres against Ehrhch ascites carcinoma / J.Pharm. Pharmacol. -19%. Vol.48. N7. - P. 685688.

92. Kameyama, H.; Sekiguchi, T. Manufacture of water-soluble chitosan. JP 02 22, 301, 1990.

93. Kim Y., Min D.S. Wound covering materials from polyelectrolyte complexes of chitosan with sulfonated chitosan // Trans. Soc. Biomat. -1988. -Nil.-P. 5S8-S62.

94. Kosyakov V.N., Yakoviev N.G., Gorovoj L.F. Biotechnology for waste management and site restoration.//KluverAcad.Publ. Netherlands, 1997. P. 119-131

95. Kurita, K. Chitin Nat. Teenol.// Proc. *". Int. Conf. "Chitin and Chitosan" 1985. Plenum Abstr. NewYork, 1986. P. 287-293.

96. Kurita. K.//Prog. Bioteenot, (Ind. Polysaccharides). 1987. 3. P. -337-346.

97. Kunitz J.W., Kiessling L.L. Solution conformation of Lewis a—derived selectin ligands is unaffected by anionic substituents at the 3'- and 6'-positions.// Glycobiology, 1997.-V. 7.-N» 3.-P. 337-347.

98. Ledderhes, S. Chitosan., NewYork, 1894.

99. Marcmkiewicz J., Polewska A. Knapczyk J. Immunoadjuvant properties of chitosan' Arch. Immunol. Ther Exp. Warsz 1991 - Vol 39, N 1-2.- P. 127-132

100. Masri M.S., Randall V.G. Pat. US N 4125708, 1978. Ony6jiHKOB. C.A., 1979.- v.90.- p.89092.

101. Mima S., Yoshikawa S., Miya M. Pat. Japan N 53-130870, 1975. Ony6nHKOB. C.A., 1976.- v.84.- p.75239.

102. Mitsubishi Rayon Co Ltd. Pat. Japan N 56-38103, 1981. Ony6nHKOB. C.A., 1982.- v.95.- p.121169.

103. Miyazaki M., Nishimura S., Yoshida A., Okuba N. // Chem. Pharm.Bull., 1979.-v.27.-N 2.-p.232.

104. Mori X. Okumura M. Matsuura M. et al. Effects of chitin and its derivatives on the proliferation and cytokine production offibroblasts in vitro / Biomaterials. 1997. - Vol 18. N13. - P. 947-951.

105. Murata J., Saiki 1., Nishimura S. Inhibitory effect of chitin heparinoids on the lung metastasis of B16 BL6 melanoma // Jpn. J. Cancer Res. - 1989. - Vol. 80, N 9.-P. 866-872.

106. Murata J., Saiki I. Matsuno K. Inhibition of tumor cell arrest in lungs by antimetastatic chitin heparinoid Jpn. J. Cancer Res. 1990. -Vol. 81, N5.- P 506-513.

107. Murata J. Saiki I. Macabe T. Inhibition of tumor-induced angiogenesis by sulfated chitin derivatives' Cancer Res -1991 .-Vol. 51.N1.-P. 22-26.

108. Muzzarelli Fi.A.A. Chitosan-glucan complex. Pat. Ger. 2923802. -1979

109. Muzzarelli R.A.A., Raith G., Tubertini O. Separation of trace elements from sea-water, brine and sodium and magnesium salt solutions by chromatography on chitosan. // J.Chromatogr., 1970.- v.47.-N3.-p.414.

110. Muzzarelli R.A.A. Selective collection of trace metal ions by precipitation of chitosan and new derivatives of chitosan. // Anal.Chim.Acta., 1971.-v.54.-N 1.-p. 133.

111. Muzzarelli R.A.A., Rocchetti R., Marangio G. Separation of zirconium, niobium, cesium and ruthenium for the determination of cesium in nuclear fuel solutions. // J.Radioanal.Chem., 1972.- v. 10.- N 1.-p.17.

112. Muzzarelli R.A.A. Ghitin. Oxford, N.Y., Toronto, Sydney, Paris, Frankfurt, 1977. Pergamon Press. — 309 pp.

113. Muzzarelli. R.A.A. Natural Chelatin Polymers.//Oxford: Pergamon Press, 1973.-P.55, 83.

114. Muzzarelli, R.A.A., Tanfani, F., Scarpini, G., Tucci, E. J.//Appl. Biochem. 1980a.-2.- P. 54-59.

115. Muzzarelli R.A-A., Jeuniaux C. Oooday G.W. Chitin in nature and technology. Plenum Press, New York, 1986 -420p

116. Nagasawa K., Tohira Y., Inoue Y., Tanoura N., Reactions between carbohydrates and sulfuric acid. Depolymerization and sulfonation of polysaccharides by sulfuric acid. // Carbohydr. Res., 1971.-V.18.-N l.-p.95.

117. Nikitin V.Yu., Zhogolev K.D. Bulankov Yu.I., Nudga L.A. Immunological activity of chitosan and its derivatives // International Journal immunorehabilitation. -1994. N 1. - P. 254-255.

118. Nishimura K., Nishimura S , Seo H Macrophage activation with multi-porous beads prepared from partially deacetylated chitin ji J. Biomed. Mater. Res. 1986. - Vol.20. N9 - P 1359 -1372.

119. Nishioka Y., Kyotani S. Okamura M. Release characteristics of cisplatin chitosan micrqspheres and effect of containing chitin / Chem Pharm. Bull (Tokyo). -1990 Vol.38. N10. - P. 2871-2873.

120. Odier A. Memoire sur la composition des parties cornees des insects Memoires Societe Histoire Naturalle (Pans). 1823 - Vol.1 - P 29-42.

121. Okmi P., Hiroshi M., Watanabe J. et at. Manufacture of a chitosan with Mucoraceae.//EP №.-531991 .-1993.

122. Ormrod D.J; Holmes C.C; Miller *.*. Dietary chitosan inhibits hypercholesterolaemia and atheroge-nesis in the apolipoprotein E-deficient mouse model of atherosclerosis.//Atherosclerosis, 1998.-V. 138.-N2.-P. 329-334.

123. Peluso G., Petillo 0., Ranieri M. et al. Chitosan-mediated stimulation of macrophage function ' Biomaterials. -1994.-Vol.15, N 15.-P. 1215-1220.

124. Poncelet D., Babak V.G., Neufeld R.J., Goosen M.F.A., Burgarski B. Theory of electrostatic dispersion of polymer solutions in the production of microget beads containing biocatalyst. Advances in Colloid and Interface Science. 199$, 79.-P.213-228.

125. Poncelet D., Babak V., Dulieu C., Picot A. Production of alginate beads by emutsification-internat ionotropic gelation, 2-d World Cong, on Emulsion. Bordeaux, France, 1997.-,247.

126. Pumpel, R., Schinner, F. PEMS Microbiology reviews. 1993.-11.-P. 159-164.

127. Roberts G.A.F. Chitin chemistry.// THE MACMILAN PRESS LTD, printed in Hong Kong. 1992.-350 p.

128. Sabnis S., Lawrence H. Improved infrared spectroscopic method for the analysis of degree of N-deacetylation of chitosan.//Polymer Bulletin , 7/1997.Vol. 39(1) P. 67-71,

129. Sagar A., Hamlyn P., Walas D. Nonwoven fabric. Pat. GB N 2165865,1986.

130. Sagar A. Hamlyn P., Wales D. Manufacture of wound dressings from microfungal fibers. Pat.EP N460774,1991.

131. Sail K.N., Kreter J.K., Keates R.H. The effect of chitosan on corneal wound healing // Ann. Jphthalmol. 1987. - Vol. 19, N l.-P. 31-33.

132. Sannan T., Kurita K., Iwakura Y. Studies of Chitin. Effect of deacetilation on solubility. // Die Makromolekular Chemie, 1976.- N 177.- pp.3589-3600.

133. Sato M., Onishi H., Takahara J., et al. In vivo drug release and antitumor characteristics of water-soluble conjugates ofmrtomycin C with glycol-chitosan and N-succinyl-chitosan Biol. Pharm. Bull. 1996. -Vol.19, N9.

134. Schulz M. S. Rodriguez L. F., Del Blanco M.Emulsification properties of chitosan.//Colloid & Polymer Science, 12/1998. Vol 276 (12). P.l 159-1165.

135. Shepherd R. Reader S. Falshaw A. Chitosan functional properties Givcoconj J. 1997 - Vol.14. N4 - P 535-542.

136. Shibata Y. Foster L.A. Met7ger W.J. et al. Alveolar macrophage priming by intravenous administration of chilm particles, polymers ofN-acctyl-D-glucosamine. jn mice' Infect. Immun. 1997. - Vol.65. N5. - P. 1734-1741.

137. Siegel S. M., Galun M., Siegel B. Z. Water, Air, and Soil Pollution.//1990.-53.-P. 335-344.

138. Sosa M., Fazely F., Koch J.A et al. N-carboxymethylchitosan-N.O-sulfate as an anti-HIV-1 agent / Bio-chem. biophys. Res. Commun.1991. -Vol.174. N2.-P. 489-4%. '

139. Suzuki K., Okawa Y. Hashimoto K. Protecting efTect ofchilin and chitosan on expirementally induced murine candidiasis Microhiol. and Immunol. 1984. - Vol.28, N8. - P. 903-912.

140. Suzuki K. Tokoro A. Okawa Y. Enhancing effects ofN-acetyl.chitooligosaccharides on the active oxygen-generating and microbicidal activities of peritoneal exudate cells in mice.// Chem. Phami. Bull. 1985. - Vol.33. N2. - P. 886-888.

141. Suzuki K., Okawa. Y., Hashimoto K. Immunoadjuvant effect of chitin and chitosan. Ed. Hirano S., Tokura S. Chitin and chitosan. The Japanese Society of chitin and dutosan. Tottori Univ., Tottori, 1982. P. 210-212.

142. Takeda M., Tamida T. Thin layer chromatography of saccha-rides obtained by degradation of chitin. Separation of chitin-oligosaccharides. // Suisan Daigakku Kenkyu Hokoku, 1969.- p. 143.

143. Takeuchi H., Yamamoto H., Niwa *., Hino *., Kawashima Y.

144. Enteral absorption of insulin In rats from mucoadhesivechitosan-coated liposomes.//Pharm. Res, 1996.-V. 13.-N» 6.-P. 896-901

145. Tan T. K., Loon E. Infection of Spathoglottis plicata (Orchidaceae) seeds by mycorrhizal fungus.// Plant Cell Reports, 11/1998. Vol. 18 (1/2) P. 14-19,

146. Tanigawa T.; Tanaka Y.; Sashiwa H.; Saimoto H.; Shigemasa Y. Effect of chitosan oligomer on wound healing// J.Japan Veter.Med.Assn, 1995; Vol.48,N6. P. 419-422

147. Tanzawa, Tomoya; Asao, Yoshiichi; Akikubo, Akira. Manufacture of water-soluble low-molecular-weight chitosan with narrow molecular weight distribution. JP 62,184,002, 1988

148. Taravel M.N.; Domard A. Relation between the physicochemical characteristics of collagen and its interactions with chitosan: 1.// Biomaterialsv1993.-V. 14.-N® 12.-P. 930-938.

149. Tsezos, M., B. Voiesky. Biotechnology and Bioengineering. 1982.24.-P. 385-401.

150. Tsezos M., B. Voiesky. Biotechnology and Bioengineering. 1981.-23.-P. 583-604.

151. Tsezos, M. //Biotechnology and Bioengineering. 1983.-25.-P. 20252040. '

152. Usami Y., Okamoto Y., Minami S. et al. Chitin and chitosan induce migration of bovine polimorphonuclear cells J. Vet. Med. Sci. - 1994. - Vol.56, N4.-P 761-762

153. Wakatsuki,£., lba, M. and Imahara, H. J. Ferment. Technol. 1988,-66.-P. 257-265. v

154. Wang M., Ganquan H. A novel preconcentration technique using crosslinked chitosan for the determination of mercury by CVAAS.//124

155. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 7/1997. Vol. 358(7/8). P. 856-858,

156. Watanabe K. Saiki I., Uraki Y. Tokura S. 6.0-carboxymethylchltin (CM-chitin) as drug carrier / Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1990. -Vol.38. N2. - P. 506-509.

157. Weltrowski M., Patry J., Bourget M. Reactive filter for textile dyes adsorption. 1st International conference of the european chitin society. Abstracts book. Brest- France. September 11-13 1995. P. 39.

158. Volesky, *. Cambridge: Elsevier Publication,-1987. 5.-P. 96-101.

159. Yamaguchi Y., Kishimoto S. Wound healing effect of chitin «uigical dressing // Trans. Soc. Biomat. 1988. -Nil.-P. 216-222.

160. Yanqiao S., Guanwen C.Blend of chitosan acetate salt with poly(N-vinyl-2-pyrrolidone) //Polymer Bulletin, 11/1998. Vol 41 (5). P.553-559,-v.

161. Yasuhiro Nishiyama. Regioselective introduction of galactoside branches into chitosan and chitin.//Polymer Bulletin , 11/1997.V.39(5) P.543-549,

162. Zimmermann A. Verfahren zuf Herstellung von Chitinxanthogenat. Pat. FRGN 856146, 1952.125