Разработка и усовершенствование технологий получения микробиологических питательных основ и сред тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, доктор биологических наук Султанов, Заман Зубаирович

• Султанов, Заман Зубаирович
• доктор биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации доктор биологических наук Султанов, Заман Зубаирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ

К СЫРЬЮ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД;

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ

ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД; СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ

РАЗВИТИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД В РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ (Обзор литературы).

1.1. Основные требования, предъявляемые к сырью для производства питательных сред.

1.2. Технологические аспекты получения питательных основ и сред.

1.3. Состояние и перспективы развития питательных основ и питательных сред в Российской Федерации.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ ОСНОВ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ БЕЛКОВОГО СЫРЬЯ.

3.1 .Экспериментальное обоснование получение питательных основ из различных видов рыбного сырья.

3.2. Разработка технологии получения сухого пептона из рыбного сырья.

3.3. Разработка технологии получения электролит-дефицитной питательной основы из рыбного сырья.

3.4. Разработка технологии получения сухой питательной основы из отходов производства мяса криля.

3.5. Разработка технологии получения сухого гидролизата сои.

3.6. Усовершенствование технологии получения экстракта кормовых дрожжей.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЕ ЖЕЛТОЧНОЙ ЭМУЛЬСИИ

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕЦИТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

МИКРООРГАНИЗМОВ.96.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА СУХИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА ЭЛЕКТРОЛИТ

ДЕФИЦИТНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ ОСНОВЕ.

5.1. Разработка сухого электролит-дефицитного питательного агара для выделения, дифференциации и количественного определения микроорганизмов в моче.

5.2. Разработка сухой электролит-дефицитной питательной среды для выделения и предварительной идентификации высокопатогенного штамма Е. coli 0157:Н7.

5.3. Разработка сухого электролит-дефицитного агара с эозин-метиленовым синим для выделения и дифференциации энтеробактерий.

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ

УРОИНФЕКЦИЙ.

6.1. Разработка сухой селективной среды для бактериологического анализа мочи.

6.2. Разработка сухой питательной среды для определения антибактериальных субстанций в моче.

ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ,

ВЫДЕЛЕНИЯ И СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГЕМОКУЛЬТУР.

7.1. Разработка сухой среды для накопления и выделения гемокультур сальмонелл.

7.2. Разработка питательной среды для накопления и выделения основных возбудителей бактериемии и сепсиса.

7.3. Разработка питательной среды для субкультивирования гемокультур

ГЛАВА 8. РАЗРАБОТКА СУХОЙ СЕЛЕКТИВНОЙ СРЕДЫ

ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ Я CEREUS.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и усовершенствование технологий получения микробиологических питательных основ и сред»

Актуальность проблемы

Задачи, стоящие перед отечественным здравоохранением по снижению уровня инфекционных болезней, тесно связаны с их бактериологической диагностикой, которая в значительной степени зависит от качества и ассортимента питательных сред.

Однако научные и практические учреждения нашей страны все еще недостаточно обеспечены стандартными питательными средами и поэтому вынуждены использовать среды лабораторного приготовления, которые получают с применением низкокачественных компонентов. При этом их не всегда проверяют с эталонными тест-штаммам и, т.е их применение происходит без необходимого контроля. Нестандартность питательных сред, приготовляемых в условиях лабораторий, отрицательно влияет на результаты лабораторной диагностики инфекционных болезней.

За рубежом при микробиологических исследованиях используют только коммерческие питательные среды, имеющие соответствующие сертификаты качества, и включенные в особый список (А.Г.Бойцов, О.Н.Ластова, А.А.Порин, 2000; National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1990)

Одним из факторов, определяющих качество питательных сред, является наличие в их составе стандартных питательных основ.

Питательными основами большинства сред служат белковые гидролизаты, которые являются богатыми источниками аминокислот, пептидов, витаминов, органических кислот, что позволяет использовать их для культивирования широкого спектра микроорганизмов (Л.П.Блинкова, И.Г.Ахапкина, И.В.Яковлева, В.В.Свиридов, 1995; Л.П.Блинкова, Л.Г.Бутова, З.И.Ершова, И.Г.Ахапкина 1993; И.Г.Ермишина, Т.Ф.Власова, 1995;

Л.С.Лабинская, Л.П.Блинкова, А.С.Ещина, 2004; М.М.Меджидов, 2003; С.П.Рогожин, Л.Я.Телишевская, И.Г.Шептун,1986; Л.Я.Телишевская, 2000).

При этом в качестве белкового сырья используют чаще всего мясо, рыбу, рыбную муку и казеин (В.И. Артюхин, А.П. Шепелин, Н.В. Киселева, 1990). Из перечисленных видов сырья наиболее оптимальным, по нашему мнению, является рыба, которая по содержанию белка мало, чем отличается от мяса животных. Белок рыб по аминокислотному составу близок белку животных и не уступает ему по питательности, что позволяет рассматривать рыбу как полнопенный заменитель мяса в производстве питательных сред (И.М.Скурихин, М.Н.Волгарев, 1987).

В настоящее время основным белковым сырьем в промышленном производстве питательных сред является каспийская килька (М.М.Меджидов, 2003; М.М.Меджидов, Н.И.Гриднева,1999). Однако из-за экологических проблем Каспия улов кильки значительно снизился, и стал ощущаться дефицит этого сырья. Поэтому необходимы резервные источники белкового сырья, позволяющие оперативно осуществить замену кильки на другие источники сырья без изменения конечных характеристик получаемых препаратов и условий на всех стадиях технологического процесса.

Производители питательных сред за рубежом выпускают около 14 наименований питательных основ определенного целевого назначения (The Oxoid Manual, 1982; Product Catalog for Microbiology, Difco, 1996/97). Это позволяет им осуществлять коммерческий выпуск питательных сред практически для всех групп микроорганизмов.

В РФ промышленный выпуск питательных основ до недавнего времени ограничивался только 4-мя препаратами (панкреатические гидролизаты рыбы, рыбной муки, казеина и солянокислый гидролизат казеина), что сдерживало научные исследования по разработке новых питательных сред.

Одним из наиболее используемых компонентов питательных сред является ферментативный пептон (Л.Я. Телишевская, 2000; Microbiology

Manual Merck, 1990; The Oxoid Manual, 1982). Промышленный выпуск сухого ферментативного пептона в РФ был прекращен на длительный срок и в незначительных объемах начинает возрождаться. Пептоны производства Семипалатинского и Винницкого мясокомбинатов не отличаются стабильностью, как по физико-химическим, так и по биологическим показателям, что вызывает необходимость закупки дорогостоящих пептонов фирм «Difco», «Oxoid», «Merck», использующих в качестве сырья мясо высшей категории (В.И. Артюхин, А.П. Шепелин, Н.В. Киселева, 1990). В этой связи разработка технологии получения отечественного пептона, не уступающего по качеству зарубежным аналогам с использованием более дешевого сырья, является актуальной задачей.

Известно, что гидролизаты сои широко используются за рубежом в составе коммерческих питательных сред для культивирования и выделения широкого спектра микроорганизмов (Culture Media Manual, «bioMerieux», 1994; Microbiology Manual «Merck», 1990; USP National Formulary Rockille Maryland, 1995).

Бобы сои и продукты ее переработки характеризуются высоким содержанием белка (35-52%) с широким набором заменимых и незаменимых аминокислот. Аминокислотный состав белков сои близок к сырью животного происхождения. Биологическая ценность сои и продуктов ее переработки, как сырья для производства питательных сред, не ограничивается лишь высоким содержанием белка, они содержат значительное количество углеводов, а также комплекс витаминов группы «В» (И.М.Скурихин, М.Н.Волгарева, 1987; Л.Я.Телишевская, 2000; В.Б.Толстогузов, 1987). Необходимо отметить и коммерческую значимость сои и продуктов ее переработки, связанную с относительной дешевизной по сравнению с мясным и рыбным сырьем.

В нашей стране до недавнего времени питательные среды на основе сои не выпускались что, прежде всего, связано с отсутствием разработок отечественных технологий получения соевых гидролизатов.

В приготовлении питательных сред в качестве стимулятора роста микроорганизмов широко используют экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) (А.К.Баранова, 1978; Л.Б.Бендас, Б.М.Раскин, А.К.Баранова,1974, Б.М.Раскин, 1982).

Однако существующие технологии получения ЭКД не всегда обеспечивают высокую прозрачность растворов препарата (Н.А.Ковчик, И.И.Литвиненко, 1980). Данный показатель является очень важным, особенно при использовании экстрактов в составе жидких сред, т.к. о наличии роста судят по помутнению среды.

Кроме того, водные растворы ЭКД представляют собой полидисперсную коллоидную систему с размером частиц от нескольких микрон до одного и выше миллиметров. Коллоидные частицы быстро забивают поры фильтрующего материала, в результате чего скорость фильтрации резко падает. Учитывая, что ЭКД является богатой средой, не исключено его обсеменение микроорганизмами, приводящее к помутнению. Это делает его непригодным для дальнейшего использования. Отсюда вытекает необходимость совершенствования технологии получения экстракта кормовых дрожжей на этапе фильтрации и повышения степени прозрачности растворов препарата.

Определение лецитиназной активности является одним из дифференцирующих признаков при выделении родов Bacillus, Staphylococcus, Clostridium, Listeria. Продукции фермента лецитиназы исследуется на средах с добовлением желточной эмульсии (А.С.Лабинская, Л.П.Блинкова, А.С. Ещина,2004; З.М.Андреева, М.В.Лебедева, В.М.Имшенецкая,1986; Ф.Герхардт,1984; С.м.0марова,2007;

И.С.Тартаковский,2002). Зарубежные фирмы Oxoid, Difco, Merck для определения лецитиназной активности микроорганизмов выпускают желточную эмульсию в виде коммерческого препарата - Egg - Yolk Emulsion sterile.

Отечественная промышленность указанный препарат не выпускает, что вынуждает клинические лабаратории страны использовать желточную эмульсию, изготовляемую непосредственно в лабараторных условиях. При этом она не контролируется на микробиологическую чистоту. Срок хранения препарата обычно не превышает нескольких дней. Кроме того, приготовление желточной эмульсии непосредственно перед проведением бактериологических исследований удлиняет время подготовки к анализу. Поэтому разработка технологии получения стерильной желточной эмульсии в готовом к употреблению виде с длительным сроком хранения является актуальной задачей.

Известно, что выделение чистых культур микроорганизмов значительно осложняется, если в микробной ассоциации присутствует протей, способный к роению (В.И.Покровский, 1985). Для подавления роения протеев обычно используют различные химические вещества (S.T.Cowan, K.J.Steel, 1974). Однако данные вещества, препятствуя роению протеев, могут ингибировать и рост искомых микроорганизмов. Вместе с тем, роение протеев может быть устранено на средах, содержащих питательную основу с минимальным содержанием минеральных веществ (электролит-дефицитную) (J.H.Sandus,1960).

На электролит-дефицитной основе ряд зарубежных фирм выпускают цистин-лактоза-электролит-дефицитный агар (CLED-arap), рекомендованный для выделения и количественного учета микроорганизмов в моче.

Преимуществом среды является ее способность подавлять роение протеев и одновременно поддерживать рост основных возбудителей уроинфекций (Culture Media Manual, bio Merieux, 1994; Microbiology Manual Merck, 1990; Manual of BBL. Sixth Edition).

Электролит-дефицитная питательная основа может быть использована и в составе других сред, например, в средах для выделения энтеробактерий, где одним из основных требований к их качеству является способность сред подавлять роение протеев.

В мировой практике при бактериологическом анализе мочи, помимо CLED-arapa, используют также селективную среду и среду для определения антибактериальных субстанций в моче (Arbeitsanleitungen Klinische Chemie. Keimzahl, 1992; Culture Media Manual bio Merieux, 1994). Данный комплекс питательных сред позволяет осуществить быструю идентификацию возбудителей уроинфекций и оценить эффективность результатов антимикробной терапии. Аналогичные препараты отечественные производители питательных сред не выпускают, что сказывается на качестве бактериологических исследований мочи.

В последние годы в ряде стран отмечают вспышки эшерихиоза, вызванного высокопатогенным для человека штаммом Е. coli 0157:117, продуцирующим веротоксин или шига-подобный токсин и способным вызывать у людей геморрагический колит с последующим тяжелым осложнением в виде гемолитического уремического синдрома или тромботической тромбоцитопенической пурпуры (Ю.А.Ратипер, В.М.Бондаренко, A.Siitonen, 1998; Н.А.Шабанова, В.М.Бондаренко, 2001; Griffin P.M., Cielak P.R., 1994; Hammermuller J.D., Gyles C.L., 1994).

Количество заболеваний и смертей, вызываемых данным штаммом, ежегодно увеличивается (Tuttle J., Comer Т., Doyle М., Wells J.G., 1999, Michel P., Wilson J.B., Martin S.W., 1999).

В связи с высокой патогенностью и глобальным распространением данной инфекции задача совершенствования способов индикации Е. coli 0157:117 весьма актуальна. При этом особое внимание следует уделить исследованиям, направленным на разработку селективных сред, способствующих выделению штамма в чистой культуре.

Как известно, среди лабораторных исследований при инфекционных болезнях обнаружение возбудителей брюшного тифа и паратифов занимает значительное место, т.к. имеет не только диагностическое, но и эпидемиологическое значение (Ю.И.Литинский, Г.И.Герок, И.С.Молочаева, 1990). Выявление бактерий в крови всегда является показателем острого заболевания. При этом положительный результат исследований на гемокультуру, как правило, зависит от качества питательных сред.

Согласно регламентирующим документам (Приказ Минздрава СССР от 22.04.85 г. №535) для выделения гемокультур сальмонелл рекомендовано использование желчного бульона или среды Рапопорта. Указанные среды -лабораторного приготовления и, следовательно, нестандартны. Это не позволяет стандартизировать метод исследования гемокультур сальмонелл и получать сопоставимые результаты в различных лабораториях, что важно для проведения эффективных профилактических мероприятий.

Одним из способов стандартизации метода выделения гемокультур сальмонелл является использование для диагностики сухих питательных сред.

Кроме сальмонелл в крови могут находиться и другие микроорганизмы, вызывающие бактериемию и сепсис (В.М. Бондаренко, В.Г.Марченко, О.В.Лопушанская и др., 1986; Е.Б.Брусина, 2001; Л.А.Генчиков, Н.И.Володина, Т.М.Обухова, 1986; П.В.Кулагин, Р.П.Савченко, В.С.Иванова и др., 2001; Д.Д.Меньшиков, Р.Ф.Астафьева, Б.Л.Курилин и др., 2003; В.С.Савельев, Б.Р.Гельфанд, 2006; К.И. Савицкая, Н.А. Семина, В.В.Галкин, Ю.Б. Абаш, 2001; В.А. Руднов, 2000; В.В.Федоров, М.А. Куликова, 1995; Unal S., Masterton R., Goossens H., 2004).

В виду неуклонного роста численности больных и высокой летальности бактериемия сепсис являются актуальными проблемами современной медицины (В.Б.Белобородов, 1998; В.С.Савельев, Б.Р.

Гельфанд, 2006). Смертность от сепсиса находится на 11-ом месте среди других причин летальности. В США ежегодно диагностируют более 700 тыс. случаев тяжелого сепсиса. Септический шок развивается в 58% случаев тяжелого сепсиса (Б.Р.Гельфанд, В.А.Руднова, Д.Н.Проценко, Е.Б.Гельфанд, 2004).

На основании эпидемических исследований в 2003 г. в Европе (EPISEPSIS) и Австралии (ANZICS) эксперты пришли к заключению, что частота сепсиса в индустриальных странах составляет 50-100 случаев на 100 тыс. населения (Б.Р.Гельфанд, В.А.Руднов, Д.Н.Проценко, Е.Б.Гельфанд, 2004). К сожалению, аналогичных исследований в России не приводили. Однако представляется, что при различиях в уровне жизни, причинах смертности и системах оказания медицинской помощи этот показатель, несомненно, выше.

Ряд исследователей отмечают низкий процент высеваемости гемокультур при использовании сред лабораторного приготовления (В.Д.Бадиков, Л.Е.Журавлева, В.Н.Болехан, 1998; Н.А.Гиоргобиани, В.Г.Бочоришвили, 1987; П.В.Кулагин, Р.П.Савченко, В.С.Иванова и др., 2001; И.А.Лягина, Т.К.Корнева, 1995).

По всей вероятности это связано с тем, что используемые среды не обеспечивают полностью питательные потребности основных возбудителей бактериемии и сепсиса. Кроме того, они не содержат антикоагулянтов крови, в результате чего, образовавшийся сгусток фибрина ограничивает доступ питательных веществ к микробной клетке (И.А.Лягина, Т.К. Корнеева, 1995), а учитывая, что у больных с положительной гемокультурой концентрация возбудителей в крови не превышает 10 микробных клеток мл (м.к./мл) (В.Д.Бадиков, Л.Е.Журавлева, В.Н.Болехан, 1998), обеспечение условий доступа питательных веществ к микробной клетке является, необходимым условием для активного размножения гемокультур в среде.

В связи с этим используемые в настоящее время питательные среды для выделения гемокультур нуждаются в совершенствовании.

В последние десятилетия в патологии человека значительно увеличился удельный вес болезней, вызываемых условно патогенными микроорганизмами. Одним из таких микроорганизмов, роль которого в патогенезе пищевых отравлений считается установленной, является В. cereus (С.П.Аскалопов, А.И.Ильчинко, 1962; Дернард Диксон, 1983; А.П.Крупина, 1965; Ю.П.Пивоваров, 1970; О.И.Салтыкова, Л.Л.Остер, 1976).

В. cereus — почвенный микроорганизм чрезвычайно широко распространенный во внешней среде - воде, воздухе и пыли помещений, на оборудовании и аппаратуре предприятий пищевой промышленности и общественного питания. Благодаря широкому распространению В. cereus часто обнаруживается и на продуктах питания, в которых при благоприятных условиях активно размножается и может вызывать пищевые отравления. Критерием диагностики заболеваний, вызываемых В. cereus, является обнаружение В.cereus в анализируемом продукте в количестве 105 в г и

2 3 наличие В.cereus в кале и рвотных массах в количестве 10-10 в 1 кг (Р.С.Джалилова, 1987; Ю.П.Пивоваров, 1975; Granum Р.Е., 2001; Kramer J.M., Gibert R.J., 1989; Schijeni J.L., Wong A.C., 1999; Gaur Aditya II., Patrick Christian, 2001).

На долю отравлений, вызываемых данным микроорганизмом, приходится до 5% от общего числа всех пищевых отравлений (Ю.П.Пивоваров, 1970). Этот микроорганизм может вызывать и такие заболевания как сепсис, пневмония, эндокардиты, менингиты, а также легочные и раневые инфекции (Ф.С.Флуер, 2007; Beecher D.J., Pulido J.S., 1997; Bektmeyer W.B., Zimmerman G.A., 1985).

При выделении В. cereus из клинического материала и нестерильных продуктов возникают трудности, связанные с наличием в них ассоциаций разнообразной микрофлоры (Р.С.Джалилова, 1987). Поэтому для выделения

B.cereus из материалов, содержащих смешанную микрофлору, требуются высокоселективные среды.

Приведенные данные свидетельствуют о необходимости разработки новых питательных основ и питательных сред, и в первую очередь, таких, как ферментативный пептон, электролит-дефицитная питательная основа, соевый гидролизат, среды для диагностики уроинфекций, энтеробактерий, бацилл, для накопления и выделения гемокультур.

Цель исследования - Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования технологий получения микробиологических питательных основ и сред.

Задачи исследования:

1. В результате исследований выявить альтернативные источники белкового сырья для производства питательных сред.

2. Экспериментально обосновать и разработать промышленную технологию получения ферментативного пептона из рыбного сырья, изучить физико-химические и биологические свойства препарата.

3. Создать промышленную технологию получения электролит-дефицитной питательной основы, с использованием которой сконструировать питательные среды: для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче; для выделения и дифференциации Е. coli 0157:Н7; для выделения и дифференциации энтеробактерий, а также изучить их физико-химические и биологические свойства.

4. Разработать технологию получения ферментативного гидролизата сои, изучить физико-химические и биологические свойства препарата.

5. Изыскать новые технологические решения получения желточной эмульсии, готовой к употреблению, с длительным сроком хранения и экстракта кормовых дрожжей с высокой степенью прозрачности.

6. Экспериментально обосновать состав и разработать сухую селективную среду для бактериологического анализа мочи, а также питательную среду для определения антибактериальных субстанций в моче. Изучить физико-химические и биологические показатели созданных сред.

7. Разработать комплекс питательных сред для накопления, выделения и субкультивирования гемокультур, изучить физико-химические и биологические характеристики сконструированных сред.

8. Разработать новую селективную питательную среду для выделения В. cereus, изучить физико-химические и биологические свойства препарата.

Научная новизна. В экспериментальных исследованиях выявлены альтернативные источники белкового сырья для получения питательных сред, позволяющие полноценно заменить каспийскую кильку на другие источники белкового сырья без изменения конечных характеристик получаемых основ и стадий технологического процесса.

Впервые экспериментально обоснована и разработана технология получения сухого ферментативного пептона из рыбного сырья, который по физико-химическим и биологическим показателям не уступает аналогичным препаратам ведущих зарубежных фирм, но превосходит пептоп производства Семипалатинского мясокомбината и фирмы I liMedia.

Разработана технология получения электролит-дефицитной питательной основы из рыбного сырья. Показана способность данной основы подавлять роение протеев и одновременно способствовать росту других патогенных и условно патогенных микроорганизмов.

Разработана технология получения сухой питательной основы из отходов производства мяса криля. Питательный агар, приготовленный на данной основе, полностью соответствовал требованиям Фармакопейной статьи предприятия на питательный агар - ФСП № 42-0504-5807-04.

Изучены закономерности и определены оптимальные технологические параметры процессов получения гидролизата сои. Среды на основе этого гидролизата обладали высокой чувствительностью, способны выявить рост микроорганизмов при минимальной посевной дозе, что указывает на его высокие ростовые свойства.

Усовершенствована технология получения ЭКД, обладающего ростстимулирующей активностью в отношении тест-штаммов ауксотрофных по витаминам группы В, а также полной прозрачностью и высокой фильтруемостью.

Разработана технология получения желточной эмульсии для определения лсцитиназной активности микроорганизмов в готовом к употреблению виде с длительным сроком хранения.

Научно обосновано новое направление в разработке отечественных сред на электролит-дефицитной питательной основе. На этом субстрате разработаны новые питательные среды: электролит-дефицитный питательный агар для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче, питательная среда для выделения и дифференциации Е. coli 0157:Н7 и электролит-дефицитный агар с эозин-метиленовым синим для выделения и дифференциации энтеробактерий. Экспериментально показаны преимущества электролит-дефицитных сред, которые заключались в способности подавлять роение протеев и одновременно поддерживать рост выделяемых микроорганизмов.

Разработана сухая селективная среда для выделения и предварительной идентификации микроорганизмов в моче. В экспериментах установлено, что созданная среда совместно с неселективной средой при посеве мочи позволяет ускорить идентификацию микроорганизмов.

Разработана новая питательная среда для определения антибактериальных субстанций в моче, обладающая высокой чувствительностью и способностью выявлять в моче низкие концентрации антибактериальных препаратов.

Разработан комплекс питательных сред для накопления, выделения и субкультивирования гемокультур. Показано преимущество разработанных сред по чувствительности и эффективности накопления основных возбудителей гемоинфекций, что способствует выделению гемокультуры при низкой напряженности бактериемии.

Разработана селективная среда для выделения В. cereiis в чистой культуре из клинического материала и пищевых продуктов.

Основные положения научной новизны исследований подтверждены 15 патентами и авторскими свидетельствами.

Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику. Предложены альтернативные источники рыбного сырья, позволяющие расширить сырьевую базу для производства питательных сред.

В промышленное производство внедрены новые технологии получения белковых основ и питательных сред, повышающие эффективность производства и расширяющие номенклатуру питательных сред.

Новые питательные среды, позволяют улучшить бактериологическую диагностику инфекционных заболеваний.

По результатам выполненных исследований утверждены НД:

ФСП 42-0504-3426-04, ПР №58944705-03-06. Питательная среда для выделения и дифференциации E.coli 0157.Н7 и других энтеробактерий по признаку ферментации сорбита, сухая (ЭДКС-агар);

ФСП 42-0504-3162-04, ПР №58944705-02-06. Питательная среда для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче электролит-дефицитная сухая (ЭДПА);

ФСП 42-504-3427-04, ПР №58944705-01-06. Питательная среда для выделения и дифференциации энтеробактерий селективная, сухая (типа Макконки агара);

Промышленный регламент на производство питательного бульона для культивирования микроорганизмов (СПБ) №1681-05;

Регламент производства №148-88 - Питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой;

Регламент производства №1937-00, ФСП 42-3441-97, изменение 1. Экстракт кормовых дрожжей для микробиологических питательных сред, сухой.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выявлены альтернативные источники белкового сырья для производства питательных сред, позволяющие осуществить замену одних видов сырья другими без изменений конечных характеристик препаратов и условий проведения стадий технологического процесса.

2. Экспериментально обоснована и разработана технология получения сухого ферментативного пептона из рыбного сырья.

3. Разработана сухая электролит-дефицитная питательная основа и научно обоснована целесообразность ее использования в составе сред для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче, для выделения и дифференциации различных видов энтеробактерий, включая энтерогеморрагические E.coli 0157:Н7.

4. Сконструированы сухие питательные среды . для бактериологического анализа мочи - селективная среда для выделения и дифференциации энтеробактерий и среда для определения антибактериальных субстанций в моче.

5. Экспериментально обоснованы и разработаны питательные среды для накопления и выделения гемокультур.

6. Создана селективная среда для выделения B.cereus.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты проведенных исследований доложены на:

VII съезде - Всесоюзном совещании «Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты». Владивосток. - 1992 г; Всероссийском обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., - 1997 г; Международной научной конференции «Разработка и производство диагностических питательных сред и микротест-систем», Махачкала, — 1998г; VI-Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». М., -1999 г; 3-й Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем; Махачкала, — 2001 г; VIII Съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., - 2002 г; 4-й Международной научно-практической конференции «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем, Махачкала, - 2003 г; Научно-практической конференции «Новые технологии в медицине», Махачкала, - 2003 г; Всероссийской научной конференции посвященной 105-летию Пермского НПО «Биомед», Пермь, - 2003 г; Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы», институт им. Л. Пастера Санкт

Петербург, - 2003 г; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применение иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, - 2004 г; III Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова. М., — 2005 г; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология». М., — 2006г; I Всероссийской конференции: «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты», Пущино, - 2007 г. Диссертация апробирована 05.10.07 г. на конференции в НПО «Питательные среды».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 47 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 271 странице и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 205

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Султанов, Заман Зубаирович

1. Выявлены альтернативные источники белкового сырья для получения питательных основ, позволяющие осуществить замену одних видов сырья другими без изменения конечных характеристик препаратов и условий их производства на всех стадиях технологического процесса.2. Экспериментально обоснована и впервые разработана технология получения сухого ферментативного пептона из рыбного сырья, который по физико-химическим и биологическим свойствам не уступает аналогичным препаратам ведущих зарубежных фирм.3. Разработана технология получения сухого ферментативного гидролизата сои, содержащего комплекс питательных веществ в виде аминокислот, пептонов, углеводов, позволяющих выявлять рост различных микроорганизмов при минимальной посевной дозе.4. Предложены новые технологические решения получения компонентов питательных сред: желточной эмульсии, готовой к употреблению, с длительным сроком хранения и экстракта кормовых дрожжей с высокой степенью прозрачности.5. Создана сухая электролит-дефицитная питательная основа из рыбного сырья и научно обоснована целесообразность ее использования в составе сред для подавления роения протея.6. Па электролит-дефицитной питательной основе разработаны новые сухие питательные среды: электролит-дефицитный питательный агар для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче; электролит-дефицитный кристаллвиолет сорбитол агар для выделения и дифференциации Е. coli 0157:117 и других энтеробактерий по признаку ферментации сорбита; электролит-дефицитный агар с эозин-метиленовым синим для выделения и дифференциации энтеробактерий.7. Сконструирована сухая селективная среда для выделения и дифференциации энтеробактерий, применение которой совместно с электролитдефицитным питательным агаром при бактериологическом анализе позволяет ускорить идентификацию микроорганизмов в моче.8. Разработана новая сухая питательная среда для определения антибактериальных субстанций в моче, обладающая высокой чувствительностью и способная регистрировать низкие концентрации антибактериальных препаратов в моче.9. Экспериментально обоснованы и разработаны новые питательны среды для накопления и выделения гемокультур, обладающие высокой чувствительностью и значительным накопительным эффектом в отношении основных возбудителей бактериемии и сепсиса, что позволяет выделить гемокультуру при минимальном содержании возбудителя в крови.10. Создана новая селективная питательная среда для выделения B.cereus.Среда полностью ингибирует рост микробов-ассоциантов, что способствует выделению В. cereus в чистой культуре.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Султанов, Заман Зубаирович, 2008 год

1. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф.Герхарда. М.: Мир. 1983.-536 с. 76. А.Ю.Миронов, К.И.Савицкая, А.А.Воробьев. Условно патогенные микроорганизмы при гнойно-воспалительных заболеваниях лор-органов и менингитах //Ж: Микробиология, эпидемиология и иммунология. 2001. №2.С. 21-25.

2. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов. Методические указания. МУК 41.4.588-98-128с. 78. А.Г.Мухленов, Ю.А.Бойков, П.Резвая. Способ получения гидролизатов из рыбного сырья. Патент РФ №1755417, 1996. 79. А.Г.Мухленов, А.В.Тимофеев, Ю.А.Бойков, П.Резвая. Способ получения гидролизатов. Патент РФ №1559466, 1996.

3. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. (Методические указания МУК 4.2.1890-04.78.

4. Определитель бактерий Берджи) /Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Смита, 9 изд. М.: 1997. 800 с. 87. Ю.П.Пивоваров. К вопросу о роли B.cereus в пищевых отравлениях у человека //Ж: Гигиена и санитария. 1969. №8. 91. 88. Ю.П.Пивоваров, Г.И.Сидоренко. Проблема пищевых отравлений вызываемых B.cereus /В сб. Актуальные вопросы гигиены. М., 1970. 8192.

5. Славю Нейчев. Клиническая микробиология. София. 1977. 317 с.

6. Справочник Лабораторные исследования в ветеринарии /Под ред. Б.И.Антонова. М.: Агропромиздат, 1986. 352 с.

7. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования /Под ред. М.О.Биргера. М.: Медицина, 1982. 464 с. 121. В.Н.Стадников, В.Д.Попов, В.М.Лысянский. Процессы и аппараты пищевых производств. М.: 1983. 663 с.

8. Среды бактериоселективные сухие «Гем», М.: 1997. 64 с. 123. Э.Д.Степанова. Экспериментально-производственные разработки сред. новой технологии изготовления диагностических сухих питательных Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1979. 20 с.

9. Angus D.C., Linde- Zwirde W.T., Lidicker J. Epidemiology of severe sepsis in the United States:analysis of incidence, outcome, and associted costs of care Crit Care Med.-2001 .-29.-P. 1303-1310.

10. Amodio-Cocchieri Renata, Cirillo Teresa, Villani Francesco. The occurrence of B.cereus fast foods. Int. J Food Sci and Nutr. 1998. 49, №4. P. 303-308.

11. Arbeitsanleitungen Klinische Chemie Keimzahl. Eintauchnahrboden mit Brolacin-Agar and Mac-Conkey-Agar. Diagnostica Merck. 1992. P. 120-122.

12. Arbeitsanleitungen Klinische Chemie. Diagnostica Merck. HemmstoffTest in Harn. 1992. P. 123-125.

13. Beecher D.J., Pulido J.S., Barney N.P. Extracellular Virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis methods and implication of involment of hemolisin BL// Infect. Immun. 1995. 63. P. 632-639.

14. Bektmeyer W.B., Zimmerman G.A. Liferthreatening complications associated with B.cereus pneumonia//Am.Rev.Respir.Dis. -1985. -131 (3). P.466469.

15. Benner E.J. Limple disposable method for guatitative cultures of urine. //Applied Microbiol. 1980. vol.19. P.409-412.

16. Bolton F.J., Aird A. Verocytotoxin-producind E.coli 0157:H7 //Public health and microbiological significance //Brit J. Biomed. Sci. -1998. -55. -№2. P.127-135.

17. Bridson E.Y., Brecker A.B. //Methods in Microbiology. Design and Formulation of Microbiol Culture Media. 1970. -v3a. P.229-295.

18. Brun-Buisson C, Doyon E, Corlet J. Incidence, risk factors, and ontcome of severe sepsis and septic shock in adults. A multicenter prospective study in intensive care units. French ICU Group for Severe Sehsis JAMA.-1995-274.-P. 968-974

19. Cantoni C. Chromocult coliform agar enterohemolisin agar per la ricerca di E.coli 0157:H7 negli alimenti /And. alim. 1998. -37. -№368. P.354-356.

20. Carretto Edoardo, Barbarani Daniela, Marzani Federico Capra. B.cereus fatal bacteremia and apparent association with nosocomial transmossion in an intensie care unit. //J. Infec. Diseases. 2000. -32. №1. P.98-100.

21. Cavallo J.D., Carrabe E. Outils du diagnostic biologiyne des infections urinaires nosocomiales: Analyse eritiyne //Meat, et malad. Infec. 2003. -33. №9. P.447-456.

22. Chart H. Clinical significance of verocytotoxin-producing E.coli 0157.-H7. //World J. Microbiol, and Biotechnol. 2000. 16. №8-9. P.719-724.

23. Cowan S.T., Steel K.J. Manual for the identification of medical bacteria. 2 d ed, Combridge: University Press. 1974. P.238.

24. Gross R., Belk K., Smith G., Bellinger G. Micro-testing and beef safety. //Meat and Poultry. 2003. 49. №8. 69-70 p.

25. Culture Media Manual bio Merieux. 1994. P. 100.

26. Dellinger R.P. Cardiovasular management of septic shock. //Crit. Care Med. 2003. 31. P. 946-955.

27. Donovan K.O. A selective medium for Bacillus cereus in milk //J.appl. Bact. 1958.-21.-P.100-103.

28. Ehling-Schulz M.E., Fricker M., Scherer S. Identification of emetic toxin producing B.cereus strains by a novel molecular assay //FEMC Microbiol. Lett. 2004.-232.-P.189-195.

29. Ellner P.D., Stoessel C.J., Drakeford E. A new culture medium for medical bacteriology //Amer. J. Clin. Path. 1966. vol 45. №4. P. 502-504.

30. European Pharmacopoeia II, Charter VIII. 10. 1980.

31. Extermann M., Regamey C Humair L., Initial treatment of sepsis in nonneutropenic patients: ceftazidime alone versus «beet guess combined antibiotic therapy Chemotherapy.-1995.-P.306-315. 32. FrenchX. Pharmacopoeia,— 1986.

33. Fine biochemicals. Separation technology. «Serva» 1988/89. 711 p.

34. Friedman G., Silva E. Has motality of septic shock changed with time //Crit Care Med. 1990. 26. P.2078-2086.

35. Fnjisawa Tomohico, Sata Shin, Acikawa Katsuhiro, Takahashi Takanori //Modification of sorbitol Mac Conkey medium containig cefixime and telluture for isolation of E.coli 0157:H7 from radish sprouts //Appll. and Eviron Microbiol. 2000. 66. №7. P. 3117-3118.

36. Gaur Aditya H., Patrick Christian G., Mc. Cullers Jon A. B.cereus bacterimia and meningitis in immunocompronised children //Clin Infec. Discases.2001.-32. №10. P.1456-1462.

37. Granum P.E. B.cereus, In: M.P.Doyle et al (ed) //Food microbiology fundamentals and frontiers. Washington D.C., ASM Press. -2001. P.373-381.

38. Granum P.E., Sillivan K., Lund T. The sequense of the non-hemolytic enterotoxin operon from Bacillus cereus. FEMC Microbiol. Lett. 1999. 177. P.225-229.

39. Greenberg A.E. Standard Methods for Examination of Water and Wasterwater 18th Ed., Washington, D.C. 1992. P.26-36.

40. Griffin P.M., Bell B.P., Cieslak P.R. Recent adwances in verocytotoxinprod E.coli infections //Elsevier Sci. B.V. 1994. P. 7-12.

41. Hammermuller J.D., Gules C.L. Recent advances in verocytotoxin-prod E.coli infections //Elsevier Sci. B.V. 1994. P.l 13-116.

42. Hancock D.D., Besser Т.Е., Kinsel M.L., Tarr P. The prevalence of E.coli 0157:H7 in dairy and beef cattle in Washington State //Enidemol. and infec1995. 113. №2. P.1999-2007.

43. Kleer J., Barthoma A., Leventzow R. Lebensmittel-infectionen and Intoxikationen in Einrichtungen zur Gemeinschaftverfeugung Lebensmittelhyg. 2001. 52. P.73-112.

44. Kramer J.M., Gilbert R.J. B.cereus and other Bacillus species //Food bacterial pathogens. New York, Marcel Dekker Ins. 1989. P.21-70.

45. Kundrat W. Methoden zur Bestimmung von Antibiotika-Ruckstanden in tierischen Produkten //Z. anal. Chem. 1968. №243. P.624-630.

46. Kundrat W. 45-Minuten-schnellmethode zum microbiologischen 1985-2000 //Archiv Nachweis von Hemmstoffen in tierischen Produkten. Fleischwirtsch. 1972. №52. P.485-487.

47. Liener I.E. Sagnificance for humans of biologically active factors in soybeans and other food legymes //J. Am. Oil Chem. Sos. 1979. v56. P. 121-129.

48. Liener I.E. Factors, Affecting the Nutritional Quality of soya products //J. Am. Oil Chem. Sos. 1981. v58. №3. P.406-409. 180. MacCormick P.A. Greenslade L., Kibber C.C. A prospective randomized trial of ceftazidime versus netilmicin plus mezlocillin in the empirial the of presumed sepsis in cirrhotic patients //Hepatology.-l997-25.-H/883-886/

49. Manual BBL. Products and Laboratory Procedures. Sixth Edition. 389 P.

50. Martin G.S., Mannino D.M., Eaton S., Moss M. The Epidemiology of Sepsis in the United States from 1979 through 2000.//N. Engl. J. Med.-2009.-348.P.1546-1554.

51. Michel P., Wilson J.В., Martin S.W. Temporal and geographical distrubitions of reported cases of E.coli 0157:H7 infection Ontario. //Epidemiol, and infec. 1999. 122. №2. P.193-200.

52. Microbiological and Diagnostic Reagents «Oxoid». 1990. 36 p.

53. Microbiol Manual «Merck». 1990. 325 p.

54. Mossel D.A., Koopman M.J., Jongerius E. Enumeration of Bacillus cereus in foods //Appl. Microbiol. 1967. №15. P.650-653.

55. Naber K.G., Weidnerb W. Cronic prostatitisan infections //J.Antimicrob. Chemother. 1991. №28. P.86-87.

56. National Committee for Clinica Laboraty Stadards. Quality Assurance for Commercially Prepared Microbiological Culture Media. Appoved Standard M22-A. National Commitee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, 1990.-253p.

57. Nygren B. Phospholipase C-producig bacteria and food poisoning. An experimental study of Clostridium perfringens and Bacillus cereus //Acta path. Microbiol. Scand. 1962. №56. P. 1-160.

58. Rackis J.J. Biolodical and physiological Factors in soybeans //J. Am. Oil. Chem.-1974.-v51.-P.161-174.

59. Riley L.W., Remis R.C., Halgerson S.D. Hemorrhagis colitis associated with a rare E.coli serotype //N.Engl. J.Med. 1983. v.308. P.681-685.

60. Sandys G.H. A new method of preventing swarming of Proteus spp. with a description of new medium suitable for use routine laboratory practice //J.Med. Lab. Technol. 1960. 17. P.224-233.

61. Schjoeni J.L., Wong A.C.L. Heterogeneity observed in the components hemolisin BL, an enterotoxin produced by B.cereus Int //J. Food Microbiol. 1999. 53.P.159-167. diasease

62. Synge Barti A. Veterinary significance of verocytotoxin-producing //World J.Microbiol, and Biotechnol. 2000. 16. 8-9. P. 725-732.

63. Smith B.A., Baird-Parker A.C, The use of sulphamethazine for inhibiting Proteus spp. on Baird-Parkers isolation medium for Staphylococcus aureus III. Appl.Bact. 1964. 27. P.78-82.

64. Talan D.A., Morgan G.J., Newdow M. Etiology of bloody diarrhoea among patients presenting to United States emergency departments: Prevalence of E.coli 0157:H7 and other enteropathogenes //Clin. Infect. Diseases. 2001. 32. №4. P.573-580. 197. The «Oxoid» Manual. 1982. 352 p.

65. Unal S.Masterton R., Goossens H. Bacteriemia in Europe antimicrobial susceptibility data from the mystic surveillance programe //International Journal of antimicrobial agents. 2004. №23. P. 155-163. 199. USP XXIII.-1990. 200. USP, National Formulary 16th ed., Washington, D.C. 1985.

66. Vanderpitte J., Engback K., Piot P., Heuck C.C. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology. //World Heart Organization. Geneva. 1991. 132p. 202. Van Netten P., Perales J., Van Moosdijk, Curtic G.D. Liquid and solid selective differential media for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes //Int. J. Food Microbiol. 1989. 8. P.299-316.

67. Vernozy-Rozand C Ray-Gueniot S. E.coli 0157:117 Etude clinique, pathogeque, epidemiologique et prevention des accidents alimentaires //Rev. med. vet (Fr). 1997. 148. №2. P. 89-98.

68. Wood R., Donaghy M., Dudas S. Monitoring patients in the community with suspected E.coli 0157;H7 infection during a large outbreak in Scotland in 1996. //Epidemiol, and infec. 2001. 127. №3. P.413-420.