Разработка иммуноферментного метода на основе антигенных компонентов слизи Pseudomonas aeruginosa для диагностики синегнойной инфекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Дубейковская, Зинаида Андреевна

• Дубейковская, Зинаида Андреевна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дубейковская, Зинаида Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ. I

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА ШТАММОВ СИНЕГНОЙНОЙ

ПАЛОЧКИ.

1.1. Антигены клетки синегнойной палочки • •

1.2. Внеклеточные продукты синегнойной палочки, обладающие антигенными свойствами •

1.2 Л. Экзотоксин А

1.2.2. Внеклеточная слизь

Глава 2. ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ, ФОРМИРУЮЩИЙСЯ ПРИ СИНЕГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИИ.

Глава 3. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Часть II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Тест-штаммы синегнойной палочки

4.2. Серотипирование клинических штаммов синегнойной палочки.

4.3. Объемная реакция бактериальной агглютинации

4.4. Бактериологическая диагностика острых и хронических нагноительных заболеваний легких.

4.5. Питательная среда и метод культивирования штаммов сшегнойной палочки.

4.6. Получение частично очищенных препаратов слизи синегнойной палочки.

4.7. Выделение очищенных антигенных компонентов слизи.

4.8. Получение иммунных кроличьих сывороток к частично очищенным препаратам слизи сине-гнойной палочки

4.9. Адсорбция антислизевой сыворотки группо-специфическим антигеном.

4.10. Адсорбция кроличьих антислизевых сывороток бактериальными клетками синегнойной палочки.

4.11. Постановка реакции преципитации и проведение иммуно электрофорез а.

4.12. Исследуемые сыворотки людей.

4.13. Приготовление коньюгатов пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов кролика и человека.

4.13.1. Очистка пероксидазы хрена.

4.13.2. Получение чистых антител к igG н + ъ) кролика.

4.13.3. Связывание антител с ферментом.

4.14. Методика выполнения иммуноферментного анализа

4.15. Методы химического анализа.

4.16. Статистическая обработка полученных результатов

Глава 5. СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ КОМПОНЕНТОВ

СЛИЗИ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ

5.1. Агглютинация штаммов синегнойной палочки антислизевыми сыворотками.

5.2. Использование тмунодиффуз ионных методов для изучения антигенных компонентов слизи синегнойной палочки.

Глава 6. ВЫБОР ОПТИМАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ИМШОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА НА ОСНОВЕ КОМПОНЕНТОВ СЛИЗИ С ЦЕЛЫ) ШРВДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ.

6.1. Выбор оптимальной концентрации препарата слизи и условий его сорбции на твердофазном носителе.

6.2. Подбор времени инкубации антисыворотки, полученной к антигену слизи, с гомологичным антигеном и антислизевой сыворотки с конъ-югатом анти-igG кролика.

6.3. Подбор оптимального разведения конъюгата анти-igG кролика меченого пероксидазой хрена.

Глава 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К P.AERUGINOSA В СЫВОРОТКАХ ЖИВОТНЫХ С СИНЕГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ.

Глава 8. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ (ШЕЦИФШЕСКИХ АНТИТЕЛ К СЛИЗИ СИНЕГНОШОЙ ПАЛОЧКИ У БОЛЬНЫХ С ОСТРЫМИ И ХРОНИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ЛЕГКИХ.№

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка иммуноферментного метода на основе антигенных компонентов слизи Pseudomonas aeruginosa для диагностики синегнойной инфекции»

В последнее десятилетие возросла роль синегнойной палочки в инфекционной патологии человека (И.И.Колкер с соавтор., 1976; М.И.Кузин с соавтор., 1982). В ряде случаев этот микроорганизм является не только главным этиологическим фактором инфекционного процесса, но нередко осложняет также и заболевания стафилококковой этиологии (О.И.Котова с соавтор., 1983).

Эффективность лечения больных с гнойно-септическими заболеваниями обусловленными синегнойной палочкой, во многом зависит от своевременной диагностики возбудителя инфекционного процесса. До сих пор бактериологический метод выделения возбудителя является овновой лабораторной диагностики инфекционных заболеваний, вызываемых синегнойной палочкой. Бактериологическая диагностика синегнойной инфекции связана с определенными трудностями, поскольку выделение чистых культур синегнойной палочки и их последующая идентификация осуществляются в несколько этапов и, как правило, синегнойная палочка выделяется в ассоциации с другими микроорганизмами (стафилококк, протей, стрептококк, клебсиелла и т.д.), что безусловно затрудняет установление этиологического фактора. Использование селективной среды для выделения синегнойной палочки возможно только при условии достаточно большого количества бактериальных клеток. Установлено, что при длительной антибиотикотера-пии наблюдается возникновение Л-форм этого микроорганизма с последующей реверсией их в атипичные (беспигментные) формы, в связи с чем бактериологическая диагностика синегнойной инфекции может быть затруднена (З.Н.Кочемасова, 1976; White et al. 1978). Кроме того, утрата пигмента у штаммов синегнойной палочки может наблюдаться при ее росте в некоторых ассоциациях, особенно в ассоциации с протеем, что нередко является причиной диагностических ошибок (А.А.Арутчева, 1983).

Все изложенное выше свидетельствует о необходимости использования помимо традиционных бактериологических способов выделения возбудителя и других методов его специфической диагностики. Применение точных и чувствительных серологических методов может способствовать не только уточнению роли данного микроорганизма в инфекционном процессе, но и установлению этиологии инфекционного осложнения в случаях, когда возбудитель не удается выделить.

Появление и развитие высокочувствительных методов серологической диагностики (радиоиммунологический метод, иммунофер-ментный метод) значительно расширило возможности исследователей в плане диагностики инфекционных заболеваний. Однако возможность применения любого из методов серодиагностики во многом определяется серологическими свойствами используемого антигена, что зависит от степени изученности антигенной структуры возбудителя. Синегнойная палочка, как известно, характеризуется сложным антигенным строением. Слизь синегнойной палочки (капсулоподобное вещество) является одним из наиболее характерных признаков этого вида микроорганизмов ( Haynes, 1951; К.И.Савицкая, 1979). В препаратах слизи содержится несколько антигенных компонентов (Н.А.Палкина, с соавтор., 1978; Pier et ai. , 1978). Остается, тем не менее неизвестным, в какой мере различия в антигенном составе компонентов слизи коррелируют с отличиями шташов синегнойной палочки по их О-антигенам. Мы встретили в литературе лишь несколько сообщений о наличии как групповых, так и штаммоспецифических антигенов слизи p.aeruginosa , серологическая специфичность которых не совпадает с серологической специфичностью 0-анти-гена ( "Radaud et al. , 1977; Maresz-Babczyzyn,

Sokalska . 1977; И.Г.Зайднер с соавтор., 1981). До настоящего времени не описано ни одной схемы серологического группирования штаммов синегнойной палочки по антигенам слизи и поэтому не представляется возможным оценить насколько приемлемы компоненты слизи этого микроорганизма при использовании их в серологических реакциях, предназначенных для диагностики синегнойной инфекции.

В связи с этим целью представленной работы являлась разработка иммуноферментного метода на основе антигенных компонентов слизи синегнойной палочки в диагностике инфекций, обусловленных P.aeruginosa.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1). Провести сравнительное изучение состава антигенных компонентов слизи из штаммов синегнойной палочки разных 0-се-рогрупп с целью поиска как общих, так и групповых антигенов.

2). Выявить наличие возможных серологических перекрестов между препаратами слизи синегнойной палочки и антигенами гете-рологичных микроорганизмов.

3). Осуществить выбор оптимальных параметров для выполнения непрямого варианта иммуноферментного метода на основе антигенных компонентов слизи, предназначенного для выявления антител с синегнойной палочке.

4). Апробировать разработанный метод серодиагностики синегнойной инфекции на сыворотках больных с заболеваниями, обусловленными синегнойной палочкой и другими микроорганизмами.

В результате проведенных исследований установлено, что препараты слизи штаммов синегнойной палочки содержат до четырех антигенных компонентов, один из которых является серологически общим антигеном слизи для штаммов P.aeruginosa разных О-серогрупп. Установленный факт позволяет рассматривать препараты слизи синегнойной палочки в качестве возможного антигена для использования их при диагностике синегнойной инфекции без учета 0-серотипов P.aeruginosa , число которых в настоящее время насчитывается около двадцати. Кроме того, для штаммов синегнойной палочки выявлены группоспецифические антигенные компоненты слизи, серологическая специфичность которых не коррелировала с принадлежностью штаммов к 0-серогруп-пам. С помощью ряда последовательных этапов очистки (осаждением этиловым спиртом, фракционированием на колонке с анионо-обменником) получены очищенные препараты общего и группоспе-цифического антигенов слизи, предпринято изучение их серологических свойств и химической природы. Установлена довольно высокая серологическая видоспецифичность препарата слизи синегнойной палочки и на его основе впервые разработан нммуноферментный метод определения специфических антител к слизи p.aeruginosa . Разработка иммуноферментного метода на основе антигенных компонентов слизи включала получение высокоактивных и стабильных при хранении конъюгатов пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов человека и кролика, а также выбор оптимальных условий постановки реакции (подбор соотношений компонентов, условий сорбции на твердой'фазе и т.д.). Разработанный метод серодиагностики позволил выявлять наличие синегнойной инфекции у больных с нагноительными заболеваниями легких даже при отсутствии данных бактериологического анализа и может быть рекомендован в практику лабораторных исследований в клиническом стационаре.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Дубейковская, Зинаида Андреевна

ВЫВОДЫ

1. Внеклеточная слизь синегнойной палочки содержит группоспе-цифические антигенные компоненты, серологическая специфичность которых не совпадает с серологической специфичностью О-антигена. Один из группоспецифических антигенов выделен в очищенном виде и продемонстрировано его участие в агглютинации культур синегнойной палочки антисыворотками, полученными к слизи этого микроорганизма.

2. Препараты слизи, полученные из штаммов синегнойной палочки разных О-серогрупп, содержат серологически общий антигенный компонент, представляющий полимер уроновых кислот. Это дает основание использовать препараты слизи в качестве антигена при серодиагностике синегнойной инфекции без учета циркулирующих се-ротипов синегнойной палочки.

3. На основе препарата слизи впервые разработан непрямой вариант иммуноферментного метода, предназначенный для выявления антител к синегнойной палочке разных О-серогрупп. При анализе используются иммобилизованные препаратом слизи полистироловые пластины отечественного производства, которые сохраняют серологическую активность не менее месяца. Приготовленные конъюгаты пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов кролика и человека стабильны в течение двух лет.

4. Установлено, что при синегнойной инфекции имеет место стимулирование выраженного гуморального иммунного ответа, обусловленного компонентами слизи синегнойной палочки. В эксперименте на ожоговой модели синегнойной инфекции, выполненной на кроликах, показано, что использование иммуноферментного метода позволяет достоверно выявлять нарастание титров антител к слизи синегнойной палочки на 8-9 сутки. о. Установлено, что использование иммуноферментного метода позволяет выявлять наличие синегнойной инфекции у 76,6% больных с нагноительными заболеваниями легких, обусловленных синегнойной палочкой. В 20% случаев с помощью разработанного метода установлена синегнойная этиология инфекционного процесса за 5-6 дней до её бактериологического подтверждения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дубейковская, Зинаида Андреевна, 1984 год

1. Акатова Н.С., Смирнова Н.Е. Принцип получения специфических сывороток для серотипирования Pseudomonas aeruginosa . МЭИ, 1976, 2, 51-53.

2. Акатова Н.С., Смирнова Н.Е. Сравнительное изучение различных схем серотипирования Pseudomonas aeruginosa МЭИ, 1977, 10, I0I-I04.

3. Александров А.Д.Анциферова Н.Г., Уварова Р.Н., Мороз А.с

4. Выделение цротективного антигена Pseudomonas aeruginosc и изучение его свойств. В кн.: Семинар молодых ученых по медицинской микробиологии и инфекционной иммунологии. Тезисы докладов (20-23 октября 1981 года), М. ,1981, 8-10. ■ * ' '

5. АрутчеЁа А.А. 'Синегнойная раневая инфекция в траЕматолого-ортопедическом стационаре. Автореф.дисс.канд., М., 1983.

6. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы вмикробиологических исследованиях. Л., Медгиз, 1962, I-I80.

7. Баллад Й.Е., Лейкина Е.С., Егоров A.M., Гаврилош Е.М.,

8. Зорихина В.И. Эффективность различных модификаций шмуноферментного метода с очищенными антигенами альЕеококка в диагностике альЕеококкоза человека. Мед.паразитология и паразитарн.болезни, 1982, 51, I, 66-70.

9. Берёзин И.В'., Егоров A.M., ГаврилоЕа Е.М. и др.

10. Антитела диагностические против IgG кролика, меченые пероксидазой. Лабораторный регламент № 19, МЗ СССР,1978.

11. Выгодчиков Г.В. Стафилококковые инфекции. М., 1963,190.195. " '

12. Гаврилова Е.М., Дзантиев Б.Б., Егоров A.M. Получениеи свойства иммунопероксидазных комплексов. Биохимия,1979, 44, 9, I614-1622.

13. Гуркова Э.А.,"Анциферова Н.Г., Чуркин Е.Г. и др. Сине-гнойная инфекция ожоговых ран. 2-я Всесоюз.конф. по проблеме "Глубокие и обширные ожоги" (Тез.докл. 2930 ноября 1979 г.), М., 1979.

14. Ермолин Г.А. История создания, области и перспективы применения количественного ферментного иммуноанализа (КФИА). В кн.: Иммунодиагностика тропических и паразитарных болезней. Тр. Центр.ин-та усоЕершенст.врачей, 1980, 234, . 3-12.

15. Журавлёва Н.В. Антителообразование и ингибиция активности антител при 1фОЕОпусканиях. М.,1979, 104.

16. Зайднер И.Г., Станиславский Е.С., Колкёр'И.И.'и др. Иммунологическое изучение клеточных компонентов синегнойной палочки. Сообщение У. Антигенный анализ слизи и её фракций. МЭИ, 1979, 9, 41-45.

17. Зайднер И.Г., Палкина Ы.А., Станиславский Е.С., Ландсман Н.М,

18. Иммунохимический анализ протектиЕНых антигенов и протек-тиЕНые свойства компонентов слизи Pseudomonas aeruginosa с разной молекулярной массой. ШЭИ, 1981, 4, 92-95.

19. КоЕаленко Э.А., Касянчук Н.В., Захарова "И.Я. Изучение липополисахаридов клеточных оболочек бактерий рода Pseudomonas . У. Некоторые серологические характеристики. Мик-робиол.журнал, 1979, 41, 6, 603-606.

20. Котова О.И., КрючкоЕа Г.С., Мельникова Е.В. 'и др. Особенности синегнойной пнеЕмонии у детей и Езрослых. Сов. медицина, 1983, 6, 77-79. . .

21. Кочемасона З.Н., 'Шульцев ГЛ1., Кассирская Н.Г. и др. Изучение некоторых сеойсте Л-форм, Еыделенных из мочи больных хроническим пиелонефритом. Вестн.АМН СССР, 1976, 5, 49-52.

22. Кузин.М.И., Сологуб В.К., Юденич В.В. ОжогоЕая болезнь.1. М.,1982, 160 с.

23. Хренникова С.С., Хабахпашена Н.А., Мальцева Н.Н., Ефремова

24. Е.Б. ~ Получение и сравнительная оценка пероксидазных IgG конъшгатоЕ на основе.чистых антител и Fab- фрагментов IgG ,.МЭИ, 1982, 9, 99-103.

25. Олейник И.И., Родйоноеэ. С.Н., Бычков В.А., Сахарова А.Е.

26. Применение реакции пассивной гемагглютинации для ЕыяЕле-ния антител к синегнойной палочке у больных острой гнойной деструктивной пневмонией. МЭИ, 1978, 9, 99-103.

27. Савицкая К.И., Левина Е.Н., Синицына Г.Г. 0 патогенностиклинических штаммов Pseudomonas aeruginosa . ЕМЭИ, 1979, 6, 84-89.

28. Савельева В.Ф., Ермолин Г .А., Польнер А.А. и др. Иммуноферментный метод оцределения антител к пенициллину. Иммунология, 1982, 4, 82-85.

29. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарногоколичества нуклеиновых кислот. Ж.биохимия,1958,23,5,656-66

30. Станиславский' Е.С., Колкер И.И., Гришина И.А.,*Жванецкая И.А.

31. Иммунологическое изучение клеточных компонентов синегнойной палочки. Сообщение I. МЭИ, 1976, 2, 45-50.

32. Чаплинский В.Я., Акатова Н.С., Троцан Л.К., Крылова В.П.

33. Опыт типироЕания Pseudomonas aeruginosa с помощью агглютинирующих сывороток промышленного изготовления. Лаб.дело, 1982, 8, 480-481.

34. Чекан Л.В., Миньовйч Ф.Л., КутимоЕа Л.Р., Едеабная Л.С., Станиславский Е.С. Естественные, антитела против Pseudomonas aeruginosa в црепаратах -глобулина человека. МЭИ, 1981, 6, 85-89.

35. Черномордйк А.Б. Серологические типы синегнойной палочки.

36. Автореферат МЭИ, I960, 5, 100-101.

37. ШабалоЕа Л.А., Румянцев В.Г., Михеёва Г.А. и др. Синегнойная инфекция цри муковисцидозе. Педиатрия, 1982,1,28-31.

38. Abe С., Shinoya Н., Hirao Y. et al. Common protectiveantigen (OEP) of Pseudomonas aeruginosa. Jap.J.Exp. Med., 1975, 45, 5, 355-359.

39. АЪе С., Tanamoto К., Homma J.Y. Infection protective property of the common antigen (OEP) of Pseudomonas aeruginosa and its chemical composition. Japan.J.Exp.Med., 1977, 47, 5, 393-402.

40. Adam M.M., Kontrohr Т., Horvath E. Serological studies on

41. Pseudomonas aeruginosa 0 group lipopolysaccharides. Acta microbiol.Acad.Sci.Hung., 1971, 18, 307-317.

42. Alexander J»W. Studies on the isolation of an infectionprotective antigen from P.aeruginosa. Surg.Gynec.Obstet. 1966, 123, 965-977.

43. Alms Т.Н., Bass J.A. Immunisation against Pseudomonasaeruginosa.I. Induction of protection by an alcohol-precipitated fraction from the slime layer. J.Infect. Dis., 1967a, 117, 3, 249-256.

44. Alms Т.Н., Bass J.A. Immunisation against Pseudomonasaeruginosa.II.Purification and characterization of the protective factor from the alcohol-precipitated fraction. J.Infect.Dis., 1967b, 117, 3, 257-264.

45. Atic M., Liu P.V., Hanson B.A. et al. « Pseudomonas exotoxinshock; A preliminary report of studies in dogs.J.A.M.A., 1968, 205, 134-140.

46. Avrameas S., Ternynck Т., Guesdon J.L. Couping og enzymesto antibodies and antigens. Scand.J.Immunol., 1978, 8, suppl.7, 7-23.

47. Bartell P.P., Orr Т.Е., Ghudio B. Purification and chemical composition of the protective slime antigen of Pseudomonas aeruginosa. Infect.Immun., 1970,2,543-548.

48. Bartell P.P., Krikszens A. Influence of anti-slime glycolipoprotein serum on the interaction between Pseudomonas aeruginosa and macrophages. Infect.Immun., 1980,27, 777-783.

49. Bass A., McCoy J.C2 Passive immunization against experimental Pseudomonas infection: correlation of protection to Verder and Evans "0" serotypes. Infect.Iromun., 1971, 3, 51-58.

50. Bergan Т., Hirfiby N. Epidemiological markers for Pseudomonas aeruginosa. 6. Relationship between concominant nonmucoid and mucoid strains from respiratory tract in cystic fibrosis. Acta path.microbiol.Scand. Sect.B, 1975, 83, 553-560.

51. Bitter Т., Muir II.M. A modified uronic acid carbazolereaction. Anal.Biochem.,1962,4,4,330-334.

52. Bjorn M.J., Iglewski B.H., Ives S.K. et al. Effect ofiron on yelds of exotoxin A in cultures of Pseudomonas aeruginosa PA-ЮЗ. Infect.Immun., 1978,19,3,785-791.

53. Bjorn M.J., Vasil M., Sadoff Y.C., Iglewski B.H. Incidence of exotoxin production by Pseudomonas sp. Infect.Immun., 1977,16,1,362-366.

54. Bonde G.J;, Carlsen F.E., Jensen С .P. Production .ofhyaluronic acid by Pseudomonas aeruginosa. Acta Pharmacol .Toxicol., 1957, 13, 205-212.

55. Boorsma D.M., Kalsbeek G.L. A comparative study of horseradish peroxidase conjugates prepared with a one-step and a two-step method. J.Histohem.Cytochem.,1974, 23, 200.

56. Boorsma D.M., Streefkerk I.G. Peroxidase conjugate chromatography. Isolation of conjugates prepared with glu-taraldegyde or periodate using polyacrylamide, agarose gel. J.Histohem.Cytochem., 1976,24,481-486.

57. Bradley D.E., Pitt T.L. An immunological study of thepili of Pseudomonas aeruginosa. J.Hyg.,1975,74,3,419-430

58. Bulletin of the World Health Organization, 1976, 54, 2,129.139.

59. Bullock S.L., Walls W. Evaluation of some the parametres of the enzyme-linked immunospecific assay. J.Inf, Dis., 1977, 136, suppi., 279-285.

60. Bulter J., McGivern P., Swanson P. Amplification of ELISAin the detection of class specific antibodies. J.Immun. Methods, 1978, 20, complete, 365-384.

61. Callahan L.T.III Purification and characterization of

62. Pseudomonas aeruginosa exotoxin. Infect.Immun., 1974, 9, 113-118.

63. Callahan L.T.III Pseudomonas aeruginosa exotoxin: purification by preparative polyacrylamide gel electrophoresis and the development of highly specific antitoxin serum. Infect.Immun., 1976, 14, 1, 55-61.

64. Carlson D.M., Matthews L.W. Polyuronic acids produced by

65. Pseudomonas aeruginosa. Biochem., 1966,5,2817-2822.

66. Carlsson H.E., Lindberg A.A., Hammarstrom S. Titration ofantibodies to Salmonella 0 antigens by Enzyme-linked immunosorbent assay. Infect.Immun., 1972,6,5,703-708.

67. Cetin E.T., Toreci К., Anh 6. Encapsulated Pseudomonasaeruginosa (Pseudomonas aeruginosa mucosus) strains. J.Bact•, 1965, 89,5,1432-1433.

68. Cha S.C., Bass J.A., Shetla M.R. Composition of the protective antigen from the slime layer of Pseudomonas aeruginosa. Tex.Rep.Biol.Med., 1971, 3, 265-272.

69. Chester J.R., Meadow P.M. y Pitt T.L. The relationshipbetween the O-antigenic lipopolysaccharides and serological specificity in strains of Pseudomonas aeruginosa of different O-serotypes. J.Gen.Microbiol.,1973, 78, 305-318.

70. Collier R.J. Diphteria toxin: mode of action and structure. Bacterid .Rev., 1975, 39, 54, 85-91.

71. Crowder J.Gi, Delvin H.B., Fisher M.W., White A. Heatstable opsonins in seraof patients with Pseudomonas infection. J.Lab.Clin.Med., 1974, 83, 6, 853-859.

72. Cukor G., Blacklow U.R., Howak IT .A. et al. Comparativeanalysis of serum antibody response to Pseudomonas aeruginosa exotoxin A by cystic fibrosis and intensive care units patients. J.Clin.Microbiol.,1983,18,3,457-462.

73. Diaz F., Mosovich L.L., Neter E. Serogroups of Pseudomonas aeruginosa and immune response by patients with cystic fibrosis. J.Inf.Dis., 1970, 121, 269-274.

74. Dimitracopoulus G., Sensakovic J.W., Bartell P.F. Slimeof Pseudomonas aeruginosa; in vivo production. Infect. Immun., 1974, 10, 1, 152-156.

75. Dmitriev B.A., Kocharova N.A., Krirel Y.A. et al. Thesomatic antigens of Pseudomonas aeruginosa. The structure of the polysaccharide chain of Ps.aeruginosa 0:6 (Lanyi) lipopolysaccharide. Fur.J.Biochem., 1982, 125, 1, 152-156.

76. Doggett R.G. Incidence of mucoid Pseudomonas aeruginosa from clinical sources. Appl.microbiol.,1969,18,936-937.

77. Doggett R.G., Harrison G.M. Pseudomonas aeruginosa: immuneststus in patients with cystic fibrosis. Infect.Immun., 1972, 6, 628-635.

78. Doggett R.G. Pseudomonas aeruginosa: clinical manifestations of infections and current therapy. London,1979,

79. Doi Т., Yoskioka M., Hakjima T-. Pseudomonas aeruginosaantibodies in human plasma. Japan.J.Exp.Med., 1976, 46, 3, 149-154.

80. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K. et al. Colorimetric method for the determination of sugars and related substances. Anal.Chem., 1956, 28, 350-356.

81. Dugiud J'.P. The demonstration of bacterial capsules andslime. J.Pathol .Bacterid., 1951, 63, 673-685.

82. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA: III. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labelled antiimmunoglobulin in antigen-coated tubes. J.Immunol., 1971,109,1, 129-135.

83. Evans L.R., Linker A. Production and characterization ofthe slime polysaccharide of Pseudomonas aeruginosa. J.Bact., 1973,116, 915-924.

84. Fernandes P.В., Kim C., Cundy K.R., Huang IT .IT. Antibodies to cell envelope proteins of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis patients. Infect.Immun., 1981, 33, 2, 527-532.

85. Gaines S., Landy M. Prevalence of antibody to Pseudomonasin normal human sera. J.Васteriol.,1955,69,6,628-633.

86. Govan J.R. Mucoid strain of Pseudomonas aeruginosa: theinfuence of culture medium on the stability, of mucus production. J.Med.Microbiol.,1975,8,513-522.

87. Govan J.R.W., Fyfe J.A.M. Mucoid Pseudomonas aeruginosaand cystic fibrosis resistance of the mucoid form to carbenicillin, fluoroxantin and tobramicin and isolation of mucoid variants in vitro. J.Antimicrob.Chemother., 1978, 4, 3, 233-240.

88. Graber C.D., Cummings G., Vogel E.H., Tumbusch W.T.

89. Measurment of the protective effect of antibody in ' burned and unburned patients' sera for Pseudomonas aeruginosa infected mice. Tex.Rep.Biol.,1961t19,268-276.

90. Granfors К. Measurment of immunoglobulin M (IgM), IgGand IgA antibodies against Yersinia enterocolitica by enzyme-linked immunosorbent assay: persistence of serum antibodies during disease. J.Clin.Microbiol.,1979,9,3, 336-341.

91. Granfors K, Viljanen M.K., Toivanen A. Measurment of immunoglobulin A antibodies against Yersinia enterocolitica by enzyme-linked immunosorbent assay: Comparison of lipopolysaccharide and whole bacterium as antigen. J.Clin.Microbiol.,1981,14,1,6-14:

92. Habs J. Untersuchungen uber die O-Antigene von P.aeruginosa. Z;Hyg.Infekt.Kr., 1957, 144, 218-228.

93. Harding S.A., Scheld W.M., McGovan M.D., Sande M.A.

94. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Streptococcus pneumoniae antigen. J.Clin.Microbiol., 1979, 10, 3, 339-342.

95. Hill H.R., Master J.M; Enzyme-linked immunosorbent assayand radioimmunoassay in the serologic diagnosis of infections diseases. J.Infect.Dis.,1983,147,2,258-263.

96. Hirao Y., Homma J.Y. Antigenic relationship between thecommon antigen of Pseudompnas aeruginosa and Vibrio cholerae. Infect.Immun.,1978,19,2,373-377.

97. Holder J.A., V/heller R., Montie T.C. Flagellar preparations from Pseudomonas aeruginosa: animal protection studies. Infect.Immun.,1982, 35, 1, 276-280.

98. Homma J.Y. Serological typing of P.aeruginosa and severalpoints to be considered. Jap.J.Exp.Med.,1974,44,1-12.

99. Homma J.Y., Ito M., Yabuuchi E. Cross protective immunityin mice injected with heat-killed cells of Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens. Jap.J.Exp.Med.,1972, 42, 1-22.

100. Homma J.Y., Abe C., Hirao J. Common protective antigen of Pseudomonas aeruginosa. J.Jap.Ass.Infect.Dis.,1973,47, 169-172.

101. Homma J.Y., Abe С., Okada К. et al. The biological properties of the protein moiety of endotoxin of Pseudomonas aeruginosa. Animal, Plant an Microbial Toxins, 1976, 1, 499-508.

102. Horton D., Rodemeyer G. Analytical characterization oflipopolysaccharide antigens from seven strains of Pseudomonas aeruginosa. Carbohydrate Res.,1977,55,18, 35-47.

103. Hftfiby IT. Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. Relationship between strains of Pseudomonas aeruginosa and humoral immune response. Acta.path.microb. Scand., 1974a, Sect.B, 82, 351-558.

104. Hgfiby N. Epidemiological investigations of the respiratory tract bacteriology in patients with cystic fibrosis. Acta path.microb.scand.,1974, 82 a, 541-550.

105. Hf&Lby N. Cross-reactions between Pseudomonas aeruginosaand thirty-six other six bacterial species. Scand.J. Immunol.,1975, 4a,Suppl.2, 197-202.

106. Hgfiby N. Humorally occurring precipitating antibodiesagaiiri; Pseudomonas aeruginosa. Scand.J.Immunol., 1975, 4b, Suppl.2, 187-196.

107. H^iby N., Hertz J.B. Precipitating antibodies against

108. Escherichia coli, Bacteroides fragilis, ss.Thetaiotao-micron and Pseudomonas aeruginosa in serum from normal persons and cystic fibrosis patients, determined by means of crossed immunoelectrophoresis. Acta Paediatr. Scand., 1979, 68, 495-500.

109. Jones R.J., Lowbury E.J.L. Antiserum and antibiotics inthe prophylaxis against Pseudomonas aeruginosa. In: Research in burns (Eds. A.B.Wallace, A.W.Wilkinson), Livingstone, Edinburgh and London,1966, 474-485.

110. Iglewski B.H'., Liu P.V., Kabat D. Mechanism of action of

111. Pseudomonas aeruginosa exotoxin A: adenosin diphosphate rybozylation of mammalian elongation factor 2 in vitro and in vivo. Infect.Immun., 1977,15,1,138-144.

112. Ishikawa E., Kato K. Ultrasensitive enzyme immunoassay.

113. Scand.J.Immunol., 1978,8,Suppl.7,43-55.

114. Keleti G., Ledever W.H. Handbook of micromethods for thebiological sciences. New York, 1974, 74-75.

115. Keren D.D. Enzyme immunosorbent assay for immunoglobulin

116. Kohler R.V., White A. Detection of IgG antibodies totype-specific Pseudomonas aeruginosa lijhopolysacchari-des by solid-phase radioimmunoassay. J.Infect .Dis., 1977, 136, 1, 112-116.

117. Kostiala A.A., Kostiala J. Enzyme-linked Immunosorbentassay (ELISA) for IgM," IgG and IgA class antibodies against Candida albicans antigens: development and ctom-parison with other methods. Sabourandva,1981,19,2,123-134.

118. Lanyi Б. Serological properties of P.aeruginosa: I.

119. Group specific somatic antigens. Acta microbiol.Acad. Sci.Hung., 1966/1967, 13, 295-318.

120. Lanyi B. Serological properties of Pseudomonas aeruginosa. II. Type-specific thermolabil (flagella) antigens. Acta Microbiol.Acad.Sci.^ung.,1970,17,35-38.

121. Lanyi В., Bergan T. Serological characterization of Pseudomonas aeruginosa. Methods microbiol.,1978,10,93-168.

122. Leppla S.H. Large-scale purification and characterizationof the exotoxin of Pseudomonas aeruginosa. Infect.Immun., 1976, 14, 4, 1077-1086.

123. Levy H.B., Sober H.A. A simple chromatographic meted forpreparation gamma-globulin. Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1960, 103, 2, 250-252.

124. Linker A., Jones R.S. A polysaccharide resembling alginicacid from Pseudomonas microorganism. Nature,1964,204, 187-188.

125. Liu P.V. The role various fractions of Pseudomonas aeruginosa in its pathogenicity. III. Identity of lethal toxins produced in vitro and in vivo. J.Infect.Dis., 1966, 166, 481-489.

126. Liu P.V. Exotoxins of Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.

127. Dis., 1973, 128, 3, 506-513.

128. Liu P.V. Extracellular toxins of Pseudomonas aeruginosa.

129. J.Infect.Dis., 1974, 130 Suppl., S95-S99.

130. Liu P.V., Abe Y., Bates J.L. The role various fractionsof Pseudomonas aeruginosa in its pathogenesis. J.Infect. Dis., 1961, 108, 2, 218-228.

131. Liu P.V., Hsieh H. Inhibition of various bacteria by ammonium salts, its effect on toxin production and virulence. J.Bacteriol., 1969, 99, 406-414.

132. Liu P;V;, Hsieh H. Exotoxins of Pseudomonas aeruginosa.

133. I. Characteristics of antitoxin A. J.Infect.Dis., 1973, 128, 520-526.

134. Liu P.V., Yoshi S., Hsieh H. Exotoxins of Pseudomonasaeruginosa. II. Concentration, purification and characterization of exotoxin A. J.Infect.Dis.,1973,128,506-513.140. boury O.H. у Resenbrough N.J., Farr A.L., Rendall R.

135. Protein measurment with the Folin phenol reagent.J.Biol. Chem., 1959, 193, 265-275.

136. Iynn M., Sensakovic J.V/., Bartell P.F. In vivo distribution of Pseudomonas aeruginosa slime glycolipoprotein: association with leucocytes. Infect.Iramun.,1977,15;1, 109-114.

137. Maresz-Babczyszyn J., Sokalska M. Humoral response inrabbit after immunization with slime extraction from Pseudomonas aeruginosa. In.: Pseudomonas species, Poznan. 1977, 105-109.

138. Mates A., Zand P. Specifity of the protective responseinduced by the slime layer of Pseudomonas aeruginosa. J.Hyg.Camb., 1974, 73, 1, 75-84.

139. Mertsola J., Ruuskanen 0., Kuronen Т., Viljanen M.K.

140. Serologic diagnosis of Pertussis. Comparison of Enzyme-linked immunosorbent assay and bacterial agglutination. J.Infect.Dis., 1983, 147, 2, 252-257.

141. Michaels G.B., Eagon R.G. The effect of ethylendiaminetetra acetate and of lysozyme on isolated lipopolysaccha-ride from Pseudomonas aeruginosa. Broc.Soc.Exp.Biol.Med., 1966, 22, 866-868.

142. Michaels G.B., Eagon R.G. Chemical characterization ofendotoxic lipopolysaccharide from three strains of Pseudomonas aeruginosa. Broc.Soc.Exp.Biol.Med., 1969, 131, 1346-1349.

143. Middlebrook J.L., Dorland R.B. Differential chemical protection of mammalian cells from the exotoxins of Cory-nebacterium diphteriae and Pseudomonas aeruginosa. IN-fect.Immun., 1977, 16,232-239.

144. Molin S.O., Nygren H., Dolonius L., Hansson H.-A. A kinetic study of the reaction between glutaraidegyde and horseradish peroxidase. J.Histochem.Cytochem., 1978, 26, Ю53-Ю56.

145. Montie T.C., Craven R.C., Holder J.A. Flagellar preparations from Pseudomonas aeruginosa: isolation and characterization. Infect.Immun.,*1982,35,1,281-288.

146. Murakawa Т. Slime production by Pseudomonas aeruginosa.

147. I. Purification of slime and its physicochemical properties. Japan.J.Microbiol., 1973, 17, 4, 275-281.

148. Wadaud M., Lapchine L., Ageuda L. Biological activitiesof purified extract of Pseudomonas aeruginosa. In.: Pseudomonas species, Poznan, 1977, 38.

149. Wakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody.

150. A new method of conjugation. J.Histochem.Cytochem., 1974, 22, 1084-1089.

151. Nygren H., Hansson H.-A., Lange S. Studies on the cohjugation of horseradish peroxidase to immunoglobulin G via glutaraldegyde. bfed.Biol., 1979, 57, 3, 187-191.

152. Pavlovskis O.R. Pseudomonas aeruginosa exotoxin: effecton cellular and mitochondrial respiration. J.Infect. Dis., 1972, 126, 48-53.

153. Pavlovskis O.R., Gordon F.B. Pseudomonas aeruginosa exotoxin: effect on cell culture. J.infect.Dis., 1972, 125, 631-636.

154. Pavlovskis O.R., Voleker P.A., Shackelford A.H'. Pseudomonas aeruginosa exotoxin in mice: histopathology and serum enzyme changes. J.Infect.Dis.,1976,253-259•

155. Pavlovskis O.R., Shackelford A.H. Pseudomonas aeruginosaexotoxin in mice: localization and effect on protein synthesis. Infect.Immun., 1974, 9, 3, 540-546.

156. Pavlovskis O.R., Iglevski B.H., Pollack M. Mechanism ofaction of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A in experimental mouse infections: adenosine diphosphate ribosyl-etion of elongation factor 2. Infect.Immun.,1978, 19, 1, 29-33.

157. Pier G.B., Sidberry H.F., Zolyomi S., Sadoff J.C. Isolation and characterization of a High-Molecular-Weight Polysaccharide from the slime of Pseudomonas aeruginosa. Infect.Immun., 1978, 22, 3, 908-918.

158. Pier G.B., Mattews W.J., Bradley J.D.D. Immunochemicalcharacterization of the mucoid exopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa, 1983» 137, 3, 494-503.

159. Pitt T.L., Bradley D.E. The antibody response to theflagella of Pseudomonas aeruginosa. J.Med.Microbiol., 1974, 8, 97-106.

160. Pollack M., Callahan L.T.III, Taylor N.S. Neutralisingantibody to Pseudomonas aeruginosa exotoxin in human sera: evidence for for in vivo toxin production during infection. Infect.Immun.,1976,14,4,942-947 .

161. Pollack M., Taylor U.S. Serum antibody to Pseudomonasaeruginosa exotoxin neasured by a passive hemagglutination assay. J.Clin.Microbiol.,1977,6,1,58-61 .

162. Pollack M,, Taylor U.S., Callahan III L.T. Exotoxin production by clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Infect.Immun., 1977, 15, 3, 776-780.

163. Pollack M., Young L.S. Protective activity of antibodiesto exotoxin A and lipopolysaccharide at the onset of Pseudomonas aeruginosa septicemia in man. J.Clin. Invest., 1979, 63, 2, 276-286.

164. Portsmarm Т., Portsmann B. Reinigung von Peroxidase-markeirtem IgG clurch Affinitat shromatographie Verglich von Glutaraldehudund Perjodat kopplung. Acta Biol.Med. Ger., 1979, 38, 7, 1039-1054.

165. Sanai Y., Takeshi K., Homma J.Y., Kamata H. Productionof exotoxin, protease and elastase of Pseudompnas aeruginosa strains isolated from patients an environmental specimens. Japan.J.Exp.Med., 1978, 48, 6, 553-556.

166. Sasaku M., Ito M., Homma J.Y. Immunological studies onthe original endotoxin protein (OEP) of Pseudompnas aeruginosa: Adjivant effect of OEP in vivo. Jap.J.Exp. Med., 1975, 45, 335-343.

167. Schultz W.W., Phipps Т.Н., Pollack M. Enzyme-linked immunosorbent assay for Pseudomonas exotoxin. J.Clin. Microbiol., 1979, 9, 6, 705-708.

168. Schwarzmann S., Boring J.R.III. Antiphagocytic effectof slime from a mucoid strain of Pseudomonas aeruginosa Amer.Soc.Microbiol.,1971,3,6,762-767.

169. Sensakovic J.W., Bartell P.F. The slime of Pseudomonasaeruginosa: biological characterization and possible role in experimental jnfection. J.Infect.Dis.,19747 129, 2, 101-109.

170. Sensakovic J.W., Bartell P.F. Biological activity offragments derived from the extracellular glyc©lipoprotein of Pseudomonas aeruginosa. Infect.Immun., 1975, 12, 4, 808-812.

171. Sensakovic J.W., Bartell P.F. Glycolipoprotein from

172. Pseudomonas aeruginosa as a protective antigen against Pseudomonas aeruginosa infection in mice. Infect.Immun., 1977, 18, 2, 304-309.

173. Soenson S., Larsen K.-A. Enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA) for the determination of diphtheria toxin antibodies. J.Immun.Methods, 1977, 17, 3/4, 249-256.

174. Sompolinsky D., Hertz J.B., H^iby U., Jensen K. et al.

175. An antigen common to a wide range of bacteria. I. Isolation of a common antigen Pseudomonas aeruginosa. Acta path.microbiol.scand.,1980,sect .B, 88, 143-149.

176. Smalley D.L., Ourth D.D. Bactericidal antibody responseto Pseudomonas aeruginosa by adults with urinary tract infections. J.Clin.Microbiol.,1979,10,2,251-252.

177. Smith R.A., Urlich J.Y. Enzyme-linked immunosorbentassay for quantitative detection of Bacillus thurin-giensis Crystal protein. Appl.Environ.^licrobiol., 1983, 45, 2, 586-590.

178. Snell K., Holder I.A., Leppla S.A., Saellinger C.B.

179. Role of exotoxin and protease as possible virulence factors in experimental infections with Pseudomonas aeruginosa. Infect.Immun.,1978,19,839-845.

180. Stevens W.A., Tsiantos I. The use of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of Coryne-bacterium michiganense in tomatoes. Microbios Letters, 1979, Ю, 37, 29-32.

181. Stieritz D.D., Holder I.A. Experimental studies of thepathogenesis of Pseudomonas aeruginosa infection: evidence for the in vivo production of a lethal toxin. J.Med.Microbiol., 1978, 11, 101-105.

182. Shibl A.M., Al-Sowaygh I.A. Inhibition of Pseudomonasaeruginosa slime production by Staphylococcal extracellular product. J.Clin.Microb., 1980, 11, 2,123-126.

183. Shigeta S., Yasunada Y., Ogata M. Type-specific indirecthemagglutinating antibody in patients with Pseudomonas aeruginosa infections. J.Clin.Microbiol.,1978,8,5, 489-495.

184. Tanamoto K., Abe C., Homma J.Y. et al. A compaund possessing antitumor and interferoninducing activities derived from the common antigen (OEP) of Pseudomonas aeruginosa. J.Biochem.,1978,83,3,711-718.

185. Taylor U.S., Pollack M. Purification of Pseudomonas aeruginosa exotoxin by affinity chromatography. Infect. Immun., 1978, 19, 1, 66-70.

186. Ueda Y., Sanai Y., Homma J.Y. Enzyme-linked immunosorbentassay for detection of antibody to Pseudomonas aeruginosa and measurement of antibody titre in horse serum. Amer.J.Veter.Res., 1982, 43, 1, 55-60.

187. Vasil M.L., Kabat D., Iglewski B.H. Structure activityrelationship of an exotoxin of Pseudomonas aeruginosa. Infect.Immun.,1977,16,1,353-361.

188. Verder е., Evans J. A proposed antigenic scheme forthe identification of strains of Pseudompnas aeruginosa J.Infect.Dis., 1961, Ю9, 183-187.

189. Weiss R.J., Ray H.D. The structure and isolation ofpili (fimbriae) of Pseudomonas aeruginosa. Aust.J. Exp.Biol.Med.Sci., 1972, 50, 559.

190. Wokatch R. Serologische Untereuchungen au P.aeruginosa

191. Bact.pyocyaneum) aus Verschidenen Tiererten. Zbl. Bakt.J.Abt.Orig., 1964, 192, 468-476.

192. Widerman G., Flamm H. Antigengemeinschaft zuischen

193. Pseudomonas und Escherichia. Zbl .Bakt .J.Abt .Orig., 1961, 182, 1-2, 67-70.

194. Wilkinson S.G., Galbrath L. Studies of lipopolysaccharides from Pseudomonas aeruginosa. Eur.J.Biochem., 1975, 52, 2, 331-343.

195. Wisdom G.B. Enzyme-immunoassay. Clin.Chem.?1976,22,8,1243-1255.

196. White C.J.В., Horsman U.R., Rowe P.S., Howells K.F. Cellwall characteristics of Pseudomonas aeruginosa and its carbenicillin-induced L-form. Acta biol.Acad.Sci. Hung., 1978,29,1,67-74.

197. Young I.S., Armstrong D. Human immunity to Pseudomonas.

198. In vitro interaction of bacteria, polymorphonuclear leucocytes and serum factors. J.Infect.Dis.,1972,126, 3, 257-276.

199. Young L.S. Role of antibody in infections due to Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis.,1974,130 Suppl., S111-S118.

200. Young H., Low A.C. Serological diagnosis of gonorrhoea:detection of antibodies to gonococcal pili by enzyme-linked immunosorbent assay. Med.lab.Sci., 1980, 38, 1, 41-47.