Разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики иерсиниоза крупного рогатого скота тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Астахова, Татьяна Станиславовна

• Астахова, Татьяна Станиславовна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Астахова, Татьяна Станиславовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Используемые реактивы и материалы.

Определение активности конъюгатов в ИФА.

Постановка непрямого метода ИФА для дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза.

Полиакриламидный гельэлектрофорез (ПААГЭ) с додецил сульфатом натрия (ДСН).

Иммуноблот-анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Изучение антигенов клеток Yersinia enterocolitica 03, 08, и Brucella abortus.

1.1 Анализ белковых профилей ДСН-лизатов клеток после разделения в 15% ПААГ.

1.2 Характеристика антигенов в методе иммуноблоттинга.

2. Подбор оптимальных условий постановки ИФА для диагностики иерсиниоза.

2.1. Проверка различных сероваров иерсиний в качестве специфического антигена.

2.2 Подбор оптимальной концентрации антигенов для сенсибилизации плашек.

2.3. Определение оптимального времени сенсибилизации иммунологических плашек антигенами.

2.4. Подбор оптимального значения рН буферной системы для сорбции антигенов и антител.

2.5. Подбор оптимального режима инкубации сывороток и конъюгатов.

2.6. Влияние сроков хранения плашек, сенсибилизированных антигенами, на результаты ИФА.

2.7. Проверка чувствительности и специфичности разработанной ИФА тест-системы.

2.7.1. Исследование гетерологичных сывороток в предлагаемой ИФА тест-системе.

2.7.2. Исследование гипериммунных сывороток.

2.7.3 Сравнение специфичности и чувствительности различных ИФА тест-систем для диагностики иерсиниоза.

2.7.4 Исследование сывороток крови животных, полученных из хозяйств благополучных и неблагополучных по бруцеллезу.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики иерсиниоза крупного рогатого скота»

Успешное развитие животноводства в современных условиях во многом определяется эпизоотическим состоянием отдельных хозяйств и районов по инфекционным болезням животных, предупреждением заболеваемости и гибели от них поголовья.

Острые кишечные инфекции остаются одной из актуальных проблем ветеринарии и медицины во многих странах мира. К таким инфекциям относится и кишечный иерсиниоз, являющийся зооантропонозом и вызываемый У. еп!егосо1Шса.

Кишечный иерсиниоз особенно интенсивно начали изучать за последние 25-30 лет. Изучение распространения иерсиниоза животных в РФ затруднено, т.к. эта болезнь не подлежит обязательному учету как самостоятельная нозологическая единица и до сих пор не разработана система мероприятий по диагностике, профилактике и лечению больных животных.

Иерсиниоз принадлежит к числу труднодиагносцируемых, но широко распространенных инфекций, и хотя клинико-эпизоотическое значение У.егйегосоШса для сельскохозяйственных животных изучено еще недостаточно, практические работники диагностических лабораторий, несомненно, встречаются с этим возбудителем и должны уметь идентифицировать его. Диагностика иерсиниоза представляет определенные трудности, что обусловлено полиморфизмом клинической картины, несовершенством серологических методов, сложностью, низкой результативностью и длительностью бактериальной диагностики возбудителя, недостаточной осведомленностью врачей об этом заболевании. До сих пор лабораторный диагноз иерсиниоза в основном базируется на традиционных приемах: обнаружении возбудителя бактериологическим методом и выявлении специфических антител в реакции агглютинации (РА). Учитывая то, что лабораторная диагностика длительна и малоинформативна, в последние годы возросла роль экспрессных методов лабораторной диагностики данной инфекции. В диагностике иерсиниоза наиболее серьезную проблему представляют перекрестные серологические взаимодействия между Y.enterocolitica 09 сероварианта и микроорганизмами рода Brucella, что не исключает возможность появления ложноположительных результатов с единым бруцеллезным антигеном при проведении плановых диагностических исследований сывороток животных из благополучных по бруцеллезу хозяйств. В отечественной науке вопрос о роли бактерий вида Y.enterocolitica в патологии животных и их значение в возникновении перекрестных реакций при исследовании сывороток на бруцеллез изучено крайне недостаточно. Учитывая вышеизложенное, важное научное и практическое значение приобретают исследования, направленные на разработку высокочувствительных и эффективных методов дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза.

В связи с вышеуказанными проблемами целью наших исследований явилась разработка тест-системы иммуноферментного анализа (ИФА) для дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза крупного рогатого скота (КРС).

На разрешение были поставлены следующие задачи:

- Охарактеризовать антигенную структуру иерсиний различных сероваров и антигенные связи возбудителей иерсиниоза и бруцеллеза методами иммуноферментного, электрофоретического и иммуноблотного анализа.

- Разработать метод иммуноферментного анализа для диагностики иерсиниоза, для чего предусматривалось:

- отработка оптимальных условий постановки иммуноферментного метода определения антител к иерсиниям.

- испытание разработанной тест-системы ИФА при исследовании гипериммунных анти-иерсиниозных и полевых сывороток крови животных.

Научная новизна.

- Методами электрофореза и иммуноблоттинга охарактеризован белковый состав клеток Yersinia enterocolitica различных сероваров и Brucella abortus и подтверждено, что Brucella abortus и Yersinia enterocolitica 09 имеют несколько перекрестно реагирующих антигенных детерминант, выявляемых методом иммуноблоттинга. Установлено, что единственным дифференцирующим белком является белок бруцелл с молекулярной массой 18 кД.

- Разработана тест-система ИФА для диагностики иерсиниоза и дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза.

- Получены патент на изобретение "Способ диагностики иерсиниоза"

2152037) и патент на изобретение "Способ диагностики бруцеллеза" (№2152035).

Практическая значимость.

Материалы работы использованы при составлении нормативной документации:

- ТУ 9388-020-00494189-01 на "Набор для выявления антител к иерсиниям и бруцеллам в сыворотках крови крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа".

- временное наставление по применению набора для выявления антител к иерсиниям и бруцеллам в сыворотках крови крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (в порядке широкого производственного испытания 2001-2003 гг.) (Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ № 13-5-02/0064 от 04.05.01г).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Иерсиниоз - острая бактериальная инфекция из группы зоонозов, характеризующаяся общей интоксикацией организма, частым развитием гастроэнтероколитов, полиморфизмом клинических проявлений, тенденцией к генерализации процесса с развитием поражений различных органов и систем, рецидивирующим и затяжным характером.

ВОЗБУДИТЕЛЬ ИЕРСИНИОЗ А И ЕГО ХАРАКТЕРИСТИКА

Возбудителем кишечного иерсиниоза является Yersinia enterocolitica, который в соответствии с Bergey's Manual of Systematic Bacteriology относится к семейству Enterobacteriaceae. Данный микроорганизм был впервые выделен и описан в 1939 году Schleifstein и Coleman, и как самостоятельный вид Yersinia enterocolitica классифицирован в 1964 году после крупных вспышек эпизоотий в хозяйствах по разведению шиншилл в Европе и обнаружения этих бактерий у людей при клинических проявлениях аппендицита, гепатита, сепсиса (18, 32, 42, 89).

Морфологические и кулътуралъные свойства

Рядом исследователей установлено, что Y.enterocolitica представляет собой грамотрицательные палочки с закругленными концами, не образующие спор и капсул, обладающие перитрихиальными жгутиками. Культуральные свойства Y.enterocolitica довольно хорошо изучены и подробно освещены в отечественной и зарубежной литературе. Y.enterocolitica относится к факультативным анаэробам, хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, агар Хоттингера, МПБ) при рН 6.0-9.0 и температуре - 4-3 8°С. Отмечено, что клетки Y.enterocolitica при температуре 20-22°С подвижны, при более высокой температуре культивирования (37°С) неподвижны. При температуре 22-28°С на плотных питательных средах бактерии формируют гладкие колонии S-формы (круглые, умеренно выпуклые, прозрачные, с ровными волнистыми краями), в бульоне дают равномерное помутнение. Характерной особенностью У.еМегосоНиса является полиморфизм колоний по размеру, форме и цвету при культивировании в определенных условиях. При культивировании в режиме 37°С изменяется характер роста в жидких и плотных питательных средах. Наряду с вышеописанными гладкими колониями на агаре можно наблюдать образование бугристых колоний Я-формы (непрозрачные, имеют неровный фестончатый край, поверхность может быть исчерчена), в бульоне выпадает осадок. При пересеве (5-7 пассажей) Я-форма реверсирует в форму. Как правило, при выделении из организма больного или из объекта внешней среды иерсинии находятся в Б-форме (18, 42, 51, 67, 79).

Эпизоотологическая характеристика

Представители вида У.егЛегосо1Шса широко распространены в природе в связи с хорошей приспособляемостью к сапрофитному образу жизни, что является одной из характерных особенностей этого возбудителя.

Из сообщений различных отечественных и зарубежных авторов, изучающих клинику, этиологию и патогенез иерсиниоза, следует, что инфекция встречается у многих видов диких и домашних животных: рогатый скот, лошади, олени, кролики, зайцы, свиньи, птицы, морские свинки, кошки, собаки и др. (17, 19, 33, 34, 51, 89, 91, 133, 135). От животных выделяют У.еп1егосо1Шса сероваров 03, 05.27, 06.30, 07, 08, 09. По данным зарубежных авторов, основными носителями патогенных для человека сероваров У.еп1егосо1Шса являются свиньи (85, 91, 98, 130, 137). Большую роль в распространении иерсиниоза играют синантропные грызуны, особенно серые крысы. Многие исследователи сообщают о широком распространении иерсиний в окружающей среде. У.еп1егосо1Шса выделяют от здоровых носителей среди теплокровных и холоднокровных животных, а также из различных резервуаров внешней среды: вода, озера, овощи, а также продуктов животноводства. Однако большая часть штаммов, изолируемых из этих источников - апатогенны.

Немаловажное значение имеет также социальный аспект иерсиниоза, поскольку больные животные являются одной из основных причин и источниками заражения людей. При иерсиниозе имеет место главным образом аэрогенно-оральный механизм распространения возбудителя, который реализуется различными путями: воздушным, пищевым, водным. Способность иерсиний длительное время сохраняться в продуктах животного и растительного происхождения, размножаться при низких температурах, а также неприхотливость к условиям обитания способствуют накоплению их в пищевых продуктах. Пищевой путь передачи иерсиниозной инфекции человеку является, очевидно, ведущим. В этом случае заражение происходит в результате употребления в пищу сырых или недостаточно термически обработанных продуктов (мясо, молоко, фрукты, овощи) (19, 51, 135).

Антигенная структура иерсиний

Известны данные о широком спектре антигенов в клеточной стенке иерсиний, которые имеют полисахаридную или полипептидную природу. Y.enterocolitica имеет жгутиковый Н-антиген, соматический О-антиген и общий со всеми бактериями p. Enterobactereae К-антиген (42, 51, 123, 138).

У Yersinia enterocolitica обнаружено 20 Н-антигенов. Они термолабильны и разрушаются при кипячении. Н-антигены имеют диагностическое значение и активны в РА, если их получать при температуре культивирования иерсиний не выше 26-28°С. При температуре культивирования выше 30°С синтез белков жгутикового антигена прекращается, что сопровождается снижением подвижности бактерий (42, 51,57, 67, 74).

По результатам исследования Н-антигена методом иммуноблота его белки имеют молекулярную массу 47-50 кД. Н-антиген Yersinia enterocolitica состоит из 18 аминокислот, из которых чаще всего представлены аланин, глицин, глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота (74).

Соматический О-антиген сложен по своему составу, в его основе лежит липополисахарид (ЛПС), который является эндотоксином клетки. Липополисахарид состоит из основной части (кора) и присоединенных к нему длинных О-специфических боковых полисахаридных цепей (58, 67, 140). Этот антиген устойчив к нагреванию и действию этанола. Различие в строении О-антигенов позволило выделить более 60 серовариантов Yersinia enterocolitica, хотя некоторые О-серогруппы дополнительно делятся по Н-антигену (67, 103).

О- и Н-антигены серологически неоднородны, поскольку в их составе содержатся специфические и перекрестнореагирующие доминанты, определяющие внутриродовые и общие для энтеробактерий антигенные связи, которые выявляются в РА в титрах 1:100 и выше (67).

Известно, что клетки Y.enterocolitica имеют антигены, общие с антигенами различных микроорганизмов. Так Y.enterocolitica содержит общий энтеробактериальный антиген, который обусловливает перекрестные серологические реакции, как внутриродовые (род Yersinia), так и с рядом энтеробактерий других родов, например, с сальмонеллами, эшерихиями, протеем, шигеллами, холерным вибрионом. (72, 89, 110, 115). Степень антигенного родства иерсиний с различными представителями кишечных бактерий различна. Более ярко она выражена с сальмонеллами и протеями, причем различные сероварианты иерсиний имеют различно выраженные антигенные связи (72). Связь с сальмонеллами более выражена у иерсиний сероваров 03, 08, 016, 018. Внутриродовые антигенные связи между иерсиниями слабее и менее выражены, чем связи с микроорганизмами других родов (58).

Особый интерес для ветеринарии представляет антигенное родство между Y.enterocolitica серовара 09 и бруцеллами.

Поскольку общий энтеробактериальный антиген у Brucella abortus не обнаружен, то антигенные связи между Y.enterocolitica и В.abortus обусловлены наличием других антигенов. Hurvell et al. (1973) в своих работах отмечали, что антигенные детерминанты, общие для иерсиний и бруцелл, локализованы в полисахаридной части фенол-растворимых липополисахаридо-пептидных соматических антигенных комплексов.

Структура ЛПС Y.enterocolitica описана Caroff М. (1984) и является типичной структурой для микроорганизмов из семейства Enterobacteriaceae. Она включает в себя липид А, олигосахариды кора и О-специфическую цепь. Предполагается, что О-цепь ЛПС иерсиний отвечает за перекрестные реакции, возникающие с липополисахаридным антигеном бруцелл и по своей структуре идентична О-цепи бруцелл (27, 62, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 113, 129). Получены данные, что общей антигенной детерминантой, ответственной за перекрестные серологические реакции между Y.enterocolitica 09 и Brucella spp. является - 4-амино-4,6-дезокси-4-формамидо-Ь-Э-маннопиранозил, входящий в состав О - антигенной цепи липополисахаридов этих бактерий. (81)

Факторы патогенности иерсиний

Как упоминалось выше, вид Y.enterocolitica представлен значительным количеством (около 60) серо - и биоваров, как патогенных, так и непатогенных для человека и животных. Ряд сероваров Y.enterocolitica (03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 010) обладает генотипом типичных возбудителей иерсиниоза, представленным в виде хромосомных и плазмидных детерминант, кодирующих образование адгезинов, инвазинов, токсинов и др. факторов патогенности. Экспрессия таких детерминант обуславливает специфические особенности патогенеза иерсиниоза, как самостоятельной нозологической единицы (2, 59, 122).

В настоящее время интенсивно изучается вирулентность иерсиний. Ряд исследователей пришли к выводу, что у этих микроорганизмов она определяется содержащейся в клетках специфической плазмидой с М.м=40-46 МД (pYV). С присутствием этой плазмиды связана способность бактерий к температурно-зависимому синтезу дополнительных белков наружной мембраны (БНМ), синтезу V и W-антигенов, зависимость роста от ионов Са2+ при 37°С (7, 14, 15, 60, 66, 73, 92, 109, 112, 125, 126, 128). Признак кальций-зависимости характерен для всех трех видов патогенных иерсиний (Y. enterocolitica, У. pseudotuberculosis, У. pestis) и заключается в ограничении роста при дефиците ионов Са2+ в среде при 37°С (14, 59, 75, 80). Гены плазмиды кодируют синтез по крайней мере 16 белков наружной мембраны. Эти белки образуют фибриллы, принимающие участие в адгезии иерсиний к эпителиоцитам слизистых оболочек хозяина, обеспечивают устойчивость микроба к бактерицидному действию нормальной сыворотки крови, наделяют бактерии способностью к аутоагглютинации in vitro (12, 77, 95, 96, 99, 106, 107, 114). Часть из этих белков, как считают, может быть использована для дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза (58; 69, 84, 112, 113, 116). Однако практических диагностических тест-систем на уровне таких антигенов пока не создано.

Для образования этих белков важен состав культуральной среды и температура выращивания штаммов. Оптимальные условия для такого синтеза отмечены при культивировании в бульоне и температуре 37°С. При 25 С БНМ не обнаруживаются. Синтез этих белков зависит также от концентрации ионов Са в среде. Выделение БНМ значительно увеличивается, если культивирование проводят в среде, сильно истощенной ионами Са2+ (126, 128, 132).

V и W-антигены вирулентности расположены в наружной мембране и синтезируются при культивировании иерсиний при температуре 37°С (80, 124, 141). Для антигена W было показано, что он является липопротеином с молекулярной массой 145 кД; антиген V представляет собой пептид с молекулярной массой 37 кД. Роль данных компонентов недостаточно изучена, но предполагается, что они ответственны за внутриклеточную устойчивость и размножение иерсиний в фагоцитирующих клетках. При изучении экспрессии V и W-антигенов in vitro оказалось, что оптимальными условиями для их синтеза являются температура 37°С и питательная среда, лишенная ионов Са (14, 80, 128).

Вирулентные свойства бактерий кодируются также хромосомными генами. Для вирулентных иерсиний характерны хромосомные локусы inv и ail, которые сообщают бактериям способность к инвазии (128). Хромосомные факторы, в частности определяющие синтез О-антигена, по-видимому, принимают участие и в формировании адгезивности иерсиний (18). У вирулентных иерсиний недавно установлено наличие кодируемых хромосомными генами связывающих железо низкомолекулярных соединений - сидерофоров, выделяемых микроорганизмами в условиях дефицита ионов железа. У высоковирулентных штаммов иерсиний выявлены контролируемые хромосомными генами характерные полипептиды, синтез которых подавляется избытком железа и не зависит от температуры (59).

Среди штаммов Y.enterocolitica существуют различия в проявлении их вирулентных свойств. Как правило, проявление полного патогенного потенциала при иерсиниозе возможно лишь при совмещении в клетке хромосомных детерминант патогенности и характерной плазмиды, которая встречается только у тех вариантов Y.enterocolitica, которые известны как наиболее частые возбудители иерсиниоза — 03, 05.27, 07, 08, 09,010 (19, 32,51,59, 67, 76, 78, 119).

Клиника

Несмотря на то, что иерсиниозная инфекция зарегистрирована у большого числа животных, ее патогенез и клинические признаки изучены недостаточно. Это, вероятно, объясняется тем, что при диареях сельскохозяйственных животных исследования не проводятся. Кроме того, инфекционный агент может присутствовать у клинически здоровых животных без проявления признаков заболевания, что существенно затрудняет его обнаружение.

Иерсиниоз сельскохозяйственных животных может тем не менее протекать как клинически выраженное заболевание, сопровождающееся диареей. У коров наблюдаются маститы и энтериты. У коз при иерсиниозе летальный исход наступает внезапно без каких-либо предшествующих симптомов, но с выраженными дегенеративными изменениями внутренних органов. Установлено, что особенно восприимчивы к иерсиниозу поросята отъемного возраста. При остром воспалении кишечника у них наблюдаются септические и токсические реакции, в печени образуются гранулемы и отмечается дегенерация клеток.

По мнению ряда исследователей, такие клинические признаки, как повышение температуры тела, диарея, артриты, дерматиты, аборты являются ориентировочными при диагностике иерсиниоза свиней. Течение иерсиниоза зависит от вирулентных свойств возбудителя, его концентрации в организме, возраста и упитанности животного (18, 30, 32, 51, 53, 106, 135).

Диагностика иерсиниоза

Большинство исследователей считают, что диагностику иерсиниоза животных нельзя основывать только на клиническом проявлении болезни, т.к. инфекционный процесс при иерсиниозе может протекать у одних животных латентно, в форме скрытого носительства, а у других клинические признаки не являются характерными только для данной болезни (2, И, 18, 35, 37). Поэтому при диагностике иерсиниоза рекомендуют использовать бактериологический и серологические методы лабораторных исследований. Безусловно, лабораторную серодиагностику иерсиниоза осложняет общность антигенной структуры иерсиний с другими микроорганизмами, например, обнаружение перекрестных реакций между ЛПС Y.enterocolitica 09 и В.abortus (16, 25, 31, 105, 113, 117, 120, 121, 129). Антитела в высоких титрах к возбудителю иерсиниоза обнаруживаются как у животных, экспериментально и естественно зараженных бруцеллезом, так и у людей, больных бруцеллезом, вызванным бруцеллами разных видов (22, 42, 43, 121). Перекрестные реакции усложняют серологическую диагностику бруцеллеза и иерсиниоза, тем более, что в диагностике бруцеллеза серологические тесты (РА, РСК) являются крайне важным критерием (56).

Перекрестные реакции между Y.enterocolitica 09 и В. abortus устанавливаются во всех используемых серологических реакциях: РА, РИГА, РСК, РБП, иммунодиффузии и иммуноэлектрофорезе. Выявляемый по указанным реакциям титр антител в сыворотках животных больных бруцеллезом часто бывает выше к штаммам иерсиний, чем к бруцеллам. (21; 70, 97, 102, 119). В связи с необходимостью проведения дифференциального диагноза бруцеллеза и иерсиниоза у животных и людей, во многих странах мира уделяется большое внимание изысканию специфических тестов для дифференциации этих заболеваний.

В настоящее время диагноз на иерсиниоз устанавливается на основании комплекса эпизоотологических данных, клинических признаков, патанатомических исследований и результатов лабораторных анализов (18, 44, 46, 63, 70).

Выделение возбудителя из патматериала служит наиболее надежным критерием в лабораторной диагностике иерсиниоза. Преимущество бактериологического исследования заключается в том, что этот метод позволяет провести изучение выделенной культуры, дифференциацию вида и биотипа. Но бактериологический анализ трудоемок и длителен, не всегда успешен и экономически не приемлем в больших масштабах. Поэтому, важное значение в диагностике иерсиниозов приобретают серологические тесты.

Серологическая диагностика включает иммунологические методы, основанные на принципе взаимодействия антител с антигеном. Полиморфизм клинических проявлений иерсиниоза, низкая результативность и длительность (14-21 день) бактериальной диагностики повышают значение серологических методов. Для серологической диагностики иерсиниоза в настоящее время по прежнему стандартным методом является реакция агглютинации (РА) (47). Этот метод и его модификации изучали многие исследователи (3, 5, 6, 26, 29, 55, 61, 101). В начале заболевания результат РА, как правило, бывает отрицательным или титры антител очень низкими. По мере развития инфекционного процесса показатели реакции быстро нарастают и уже к 3-7 дню болезни достигают диагностических титров, которые могут сохраняться до нескольких месяцев, а иногда и лет. Однако эффективность использования данной реакции в ряде случаев снижается за счет перекрестных реакций возбудителя иерсиниоза с сыворотками к некоторым микроорганизмам, что обуславливает неспецифичность показаний РА. За диагностический титр принято считать разведение сыворотки 1:200.

Для дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза предлагается использовать РА с корпускулярным бруцеллезным антигеном, обработанным ЭДТА (26) или проведение РА параллельно с двумя антигенами (иерсиниозным и бруцеллезным) (6).

Малая специфичность РА побудили исследователей к разработке метода РИГА (10, 21, 38, 49, 54, 116). В основу РИГА положена адсорбция антигенов на поверхности эритроцитов и последующая их агглютинация гомологичной этому антигену сывороткой. При наличии коммерческих компонентов РИГА методически проста, выявляет антитела в более ранние сроки, отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, чем РА. В ней используются стандартные (коммерческие) эритроцитарные диагностикумы, выпускаемые микробиологической промышленностью, результаты РИГА легко учитываются. М.В. Дулатова с соавт. (21) разработали и внедрили в практику эритроцитарные антигенные препараты (ЭД) для серодиагностики иерсиниоза у людей. Перекрестные реакции обнаруживались в 4 % случаев. Поскольку диагностикум для РИГА представляет собой формалинизированные бараньи эритроциты, сенсибилизированные полисахаридными антигенами иерсиний, целесообразна параллельная постановка РА, выявляющая АТ к корпускулярному антигену (67).

В работе других авторов (116) указывается на невозможность дифференциации бруцеллезной и иерсиниозной инфекций с помощью РЫТА, используя О-антиген иерсиний. Все антибруцеллезные сыворотки реагировали с полисахаридным антигеном иерсиний в довольно высоких титрах. Авторы предлагают использовать в качестве антигена - эритроциты, сенсибилизированные общим энтеробактериальным антигеном иерсиний. Результаты показали, что использование РИГА в такой модификации позволяет избежать перекрестных реакций с бруцеллами.

Несмотря на простоту постановки и удобство учета результатов РНГА, эритроцитарные диагностикумы имеют и некоторые недостатки, такие как собственная антигенность эритроцитов и их не всегда достаточная стабильность (64). В связи с этим для диагностики иерсиниоза некоторыми авторами предложено использовать реакцию коагглютинации (РКоА), которая основана на способности штаммов золотистого стафилококка адсорбировать на своей поверхности специфичные иммуноглобулины из сыворотки (8, 9, 13, 24, 28, 47). Полученные таким способом сенсибилизированные клетки стафилококков (диагностикум) агглютинируют при наличии в испытуемом материале специфичного антигена. Актуальность использования РКоА с диагностическими целями в последние годы возрастает, расширяется спектр ее применения. Это обусловлено экспрессностью метода, возможностью ранней лабораторной диагностики в отличие от других иммунологических методов и реакций, а также способностью выявлять антигены возбудителя инфекции. РКоА наиболее эффективна в начальный период (1-5 дней) острого заболевания, а при других формах - в сроки максимально выраженных клинических симптомов. Чувствительность данного метода -10-100 нг/мл ЛПС АГ, что соответствует 104-105 микробных кл/мл. РКоА позволяет определить возбудителя заболевания у 64% больных при отрицательном бактериологическом исследовании (47, 67).

Данные, полученные Королюком A.M., позволяют сделать вывод, что РКоА является перспективным методом серологической идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза. Совпадение результатов РКоА с микробиологическим методом наблюдалось в 98% случаев. По сообщениям Ю.А. Белой (9); Г.Я. Ценевой (67); О.Ф. Белой (8) и др. эта реакция одинаково эффективна при расшифровке острых и хронических инфекционных процессов, обусловленных Y. enterocolitica у людей.

Учитывая то, что РКоА применяют для определения иерсиниозной инфекции у людей, в ветеринарии данный метод предложил использовать Хапцев З.Ю. (68). Испытанные коагглютинирующие диагностикумы оказались специфичными, выявляли иерсиниоз соответствующих сероваров и не взаимодействовали с гетерогенными микроорганизмами: сальмонеллами, эшерихиями, протеем, синегнойной палочкой.

Для иммунологической диагностики иерсиниозов с успехом применяют и реакции, основанные на использовании меченых антител -реакция иммунофлюоресценции, иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ, иммуноблоттинг. Перечисленные методы обладают достаточно высокой специфичностью и чувствительностью.

Многие авторы указывают на перспективность применения метода иммуноблоттинга (ИБ) в дифференциальной диагностике бруцеллезной и иерсиниозной инфекций (40, 93, 96, 104, 131, 134). Этот метод представляет собой подход к анализу белков, сочетающий в себе преимущества трех независимо разработанных физико-химических методов исследования. На первом этапе проводят электрофоретическое разделение сложной смеси биологических макромолекул с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Затем осуществляют электрофоретический перенос (электроблоттинг) разделенных белков из геля на твердую подложку. На последнем этапе перенесенные белки выявляют на полученной таким образом реплике (блоте) с помощью прямого или непрямого иммуноферментного анализа. При этом, как правило, удается получить результаты, отличающиеся высоким качеством с точки зрения разрешающей способности и чувствительности. Метод чаще всего применяется для определения состава и молекулярных размеров антигенов, но кроме того, он эффективен для определения специфических антител и поиска антигенно родственных молекул в однотипных или различных антигенных препаратах (4, 48, 136).

Применительно к анализу антигенной структуры иерсиний методом иммуноблоттинга имеются указания лишь на несколько работ, причем полученные данные не поддаются однозначной трактовке. Поэтому каждое новое исследование на данном объекте пополняет наши знания в этом вопросе.

С. Schoerner et al. (131) с целью диагностики иерсиниоза у людей исследовали возможность использования в качестве иерсиниозного антигена для проведения иммуноблоттинга суспензию клеток Y.enterocolitica или белки наружной мембраны (БНМ), выделенные из клеточной оболочки иерсиний. Результаты показали, что идентификация антител против БНМ Y.enterocolitica 09 (26, 36, 47 кД) в ИБ позволяет дифференцировать иерсиниозную инфекцию от бруцеллезной. При использовании в качестве антигена целых клеток наблюдались перекрестные реакции с антителами к Brucella abortus в антибруцеллезных сыворотках крови, что коррелировало с результатами, полученными в РА. Однако этот метод не позволяет обнаружить инфекции, имевшие место в прошлом, так как титры агглютинации антител часто ниже порога 1:80 и такие сыворотки не берутся в опыты по дифферециальной диагностике. Также предложенный метод не может идентифицировать двойной инфекции Y.enterocolitica и Brucella spp. и такая инфекция будет ошибочно считаться иерсиниозной. Но, как считают авторы, это незначительный недостаток, т.к. смешанные инфекции встречаются крайне редко. К сожалению, дальнейшие исследования С. Schoerner в этой области не проводятся.

Удачное использование ИБ для обнаружения антительного ответа к БНМ с ММ 26, 37, 47 кД, выделенным из Y.enterocolitica серовара 08, было показано в работе Kittelberger et al. (104) при обнаружении иерсиниозной инфекции у экспериментально и естественно инфицированных жвачных. В результате также было отмечено затруднение дифференциального серологического тестирования при смешанной инфекции.

На возможность дифференциации иерсиниозной и бруцеллезной инфекций с помощью иммуноблоттинга с использованием в качестве антигена БНМ указывают и другие авторы, однако до практического применения дело не дошло и на сегодня вопрос дифференциальной диагностики указанных инфекций находится в стадии оценки. В сравнении с реакцией агглютинации иммуноблоттинг показал более высокую чувствительность. Поскольку БНМ различных сероваров иерсиний кросс-реактивны, то в исследуемых сыворотках выявляются антитела именно к БНМ, независимо от того, каким сероваром иерсиний вызвана инфекция. (96, 127).

Перспективным методом для диагностики иерсиниоза является метод иммуноферментного анализа.

Впервые антительный вариант метода ИФА для диагностики иерсиниоза был предложен Carlsson et al. (82). Авторы показали, что ИФА в 10-100 раз чувствительнее, чем пробирочная РА. Отметили то, что метод ИФА кроме увеличения чувствительности также увеличивает возможность дифференциальной диагностики инфекций, обусловленных Brucella и Yersinia enterocolitica 09, т.к. в их опытах титры гомологичных сывороток превышали титры гетерологичных сывороток в 100 раз и более. В качестве антигенов при постановке реакции предлагалось использовать липополисахариды клеточных оболочек В. abortus 544 и Y. enterocolitica 19.

Weynants et al. (139) использовали метод непрямой ИФА с БНМ Yersinia enterocolitica 03 в качестве антигена для дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза у экспериментально зараженных и естественно инфицированных животных. Антитела против БНМ были обнаружены в сыворотках животных, экспериментально зараженных иерсиниозом, и не обнаружены в сыворотках животных, зараженных В.abortus. В полевых исследованиях в 66,7% сывороток, давших положительный результат в бруцеллезном тесте, и в 10% сывороток, давших негативный ответ в бруцеллезном тесте, обнаружены антитела к БНМ Yersinia enterocolitica.

В сходных исследованиях С. Schoerner et al. (131) смогли дифференцировать инфекции Y.enterocolitica 09 и Brucella spp. у людей. В работе этих авторов была показана возможность использования в качестве антигена БНМ Y.enterocolitica 09. Как показали результаты исследований, перекрестных реакций с антителами к Brucella abortus в этом случае не возникало. Было проведено сравнение полученных результатов с данными РА, общепринятой для диагностики иерсиниоза с использованием в качестве антигена суспензий клеток. Однако в данном случае были установлены перекрестные реакции, возникающие между Y.enterocolitica 09 и В. abortus, которые наблюдались в РА в титрах 1:80 и выше.

Maki-Ikola et al. (Ill) предложили использовать для обнаружения иерсиниозной инфекции ИФА с комбинированным антигеном, состоящим из БНМ Y.enterocolitica 08 и ЛПС Y.enterocolitica 03. Имея в виду тот факт, что БНМ различных штаммов иерсиний высоко кросс-реактивны, они могут служить в качестве антигенов для серологической диагностики любой иерсиниозной инфекции. По данным авторов, БНМ 08 серотипа недостаточно эффективны для обнаружения антител против Y.enterocolitica 03. Поскольку Y.enterocolitica 03 наиболее частый серотип, обуславливающий инфекцию в Европе, то обнаружение антител против него особенно важно. Поэтому авторы предлагают скомбинировать БНМ

Y.enterocolitica 08 с ЛПС Y.enterocolitica 03. 93% сывороток от пациентов, инфицированных различными серотипами иерсиний, были положительными в исследовании с помощью предложенной тест-системы. Но данный тест выявляет инфекции, вызванные и другими видами иерсиний (Y. pseudotuberculosis, Y. pestis).

В течение последних лет метод ИФА стал чаще использоваться для серологической диагностики иерсиниозной инфекции, потому что имеет преимущества над классическим методом РА, результаты которого часто зависят от присутствия Ig М (111). Метод ИФА был признан более чувствительным, чем обычно используемые методы (РА, РСК).

Из представленных литературных данных следует, что ни один из известных в настоящее время методов серологической диагностики иерсиниозов не отвечает всем требованиям по чувствительности, специфичности, точности и по доступности для практики. В настоящее время в медицинской практике имеется много методической литературы по диагностике иерсиниоза. В отечественной ветеринарной микробиологической науке вопросы диагностики иерсиниоза менее изучены. Также остается актуальным вопрос дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных, т.к. выраженные перекрестные серологические реакции могут явиться серьезным источником ошибок при диагностике бруцеллеза. Следует отметить, что, несмотря на широкий спектр работ, посвященных изучению перекрестных реакций, требуется дополнительное изучение этой проблемы и разработка специфических методов для проведения дифференциальной диагностики. Наиболее перспективным серологическим методом является иммуноферментный анализ, однако, для его внедрения необходимы готовые тест- системы. В зарубежной практике предложено несколько коммерческих иммуноферментных тест-систем для диагностики иерсиниоза. В России на данный момент подобных аналогов ИФА тест-систем не существует и поэтому вполне оправдано дать также краткую характеристику метода.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

Иммуноферментный анализ (ИФА) - одно из направлений исследований в области химической энзимологии как в нашей стране, так и за рубежом. В ИФА сочетаются специфичность иммунохимического анализа и высокая чувствительность детекции ферментативной метки. Явные преимущества этого метода, к которым относится простота выполнения, доступность и высокая стабильность реагентов, легкость методов визуальной и приборной регистрации, экспрессность и возможность автоматизации для проведения массовых анализов, обеспечили его прочное положение в клинической биохимии, при диагностике заболеваний растений, животных и человека, а также в научных исследованиях.

Развитие ИФА связано с поиском более простого и высокочувствительного способа улавливания минимальных количеств антигенов различного происхождения и антител к ним (1-5 нг). С точки зрения выполнения все методы ИФА можно разделить на 2 группы: гетерогенные и гомогенные, т.е. с участием твердой фазы или же только в растворе.

Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов - положило начало методам твердофазного (гетерогенного) ИФА.

Эти методы наиболее распространены и используются для определения широкого круга низко- и высокомолекулярных соединений антител, пептидов, стероидных гормонов, фармакологических препаратов, вирусных и бактериальных антигенов и т.д.

В 1972 г. Рубенштейн с сотр. разработали новый подход, заключающийся в проведении всего анализа без использования твердой фазы. Метод получил название "гомогенного" ИФА или "ЕМ1Т-анализа", и был основан на учете различий каталитических свойств ферментативной метки в свободном виде и в составе иммунохимического комплекса. В дальнейшем термин "гомогенный иммуноанализ" стал применим к любой системе иммуноферментного анализа, в котором специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляется в гомогенном растворе. На основании этого метода разрабатываются диагностические иммуноферментные тест-системы экспресс-определения биологически-активных соединений, нашедшие широкое применение в химической токсикологии, фармакологии, эндокринологии (48).

К ограничениям применения гомогенных методов следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (1 мкг/мл), возможность определения только низкомолекулярных антигенов; нестабильность маркеров, т.к. присутствие в образцах эндогенных примесей (свободных ферментов, ингибиторов и т.п.) сильно влияет на ход реакции (23).

На протяжении последних 2-х десятилетий ИФА интенсивно развивается как в теоретическом, так и в практическом плане и к настоящему времени сформировался в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение.

Одной из наиболее важных задач ИФА является ранняя диагностика инфекционных заболеваний, проведение массового обследования с целью выявления больных животных и тем самым успешного проведения профилактических мероприятий.

Типы гетерогенного ИФА

Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе и включает обязательную стадию разделения свободного и сорбированного на плашке комплекса меченого соединения, которые находятся в разных фазах.

Методы иммунологического анализа, применение которых сопряжено с необходимостью разделения связавшихся и не связавшихся антигенов, были разработаны для целого ряда разнообразных гаптенов и антител. Среди этих методов можно выделить 2 типа - конкурентный и неконкурентный ИФА.

Если на первой стадии в системе присутствует только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания, то метод является неконкурентным.

Если на первой стадии анализа в системе одновременно присутствуют анализируемое соединение и его аналог, конкурирующие за имеющиеся в относительном недостатке центры специфического связывания, то метод называется конкурентным.

Наиболее широкое применение на практике находит вариант последовательного (неконкурентного) гетерогенного анализа, называемый "фермент-связанным иммуносорбентным анализом" (ELISA).

Многообразие методов гетерогенного анализа обусловлено возможностью введения ферментативной метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антител. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является то, какой из реагентов - антитело или антиген, находится в иммобилизованном виде для разделения иммунохимических комплексов от несвязавшихся компонентов.

Все методы можно разделить на 2 группы: ■ гетерогенные методы ИФА, основанные на определении образовавшихся в ходе реакции специфических иммунных комплексов; гетерогенные методы ИФА, основанные на определении оставшихся свободными центров специфического связывания.

Гетерогенные методы ИФА антигена, основанные на определении специфических иммунных комплексов

Все методы, относящиеся к этой группе, являются неконкурентными. Одним из них является "сэндвич"-метод с использованием иммобилизованных (первичных) и меченых ферментом (вторичных) антител.

Суть метода заключается в использовании «подложки», т.е. слоя неспецифически сорбированных иммуноглобулинов, с которыми затем взаимодействует специфический антиген. При этом на твердой фазе образуется специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от не связавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела (конъюгаты). После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата определяют ферментативную активность вторичных антител, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается "зажатым" между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения в литературе названия "сэндвич"-метод .

Данная схема проведения анализа требует больших затрат времени, т.к. состоит из нескольких последовательных операций. Одним из достоинств является высокая чувствительность, особенно при использовании в качестве первичных антител специфических моноклональных антител к определенной детерминанте искомого антигена.

Сэндвич"-метод пригоден для количественного определения веществ, содержащих много антигенных детерминант, например для антител, ревматоидных факторов, полипептидных гормонов, белков.

Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении специфических иммунных комплексов

Все методы этой группы являются неконкурентными. Один из них -метод с использованием иммобилизованного антигена и антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой (непрямой метод).

К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку и после инкубации и удаления несвязавшихся компонентов выявляют специфические иммунокомплексы с помощью меченых ферментом антивидовых антител.

Данная схема является одной из наиболее распространенных в иммуноферментном анализе антител, т.к. отличается универсальностью меченого реагента, что дает возможность выявлять антитела к разным антигенам, а также можно устанавливать общий уровень антител и определять их принадлежность к классам иммуноглобулинов.

Данный подход позволяет решать проблемы серодиагностики заболеваний человека и сельскохозяйственных животных, используя ограниченный набор антивидовых конъюгатов, что значительно облегчает задачу производства реагентов для ИФА. Непрямой метод ИФА используют также для определения иммуногенности профилактирующих антигенов и оценки уровня иммунитета у животных.

Для оптимизации любого из вышеупомянутых методов необходимо учитывать ряд одинаково важных для каждого из них факторов, таких, как природа и способ подготовки носителя, способ его сенсибилизации, тип и содержание конъюгированного фермента, последовательность реакций, время инкубации на каждом этапе.

Одним из важнейших достоинств метода ELISA является его высокая чувствительность, которая достигается, как правило, за счет: 1) очистки конъюгата, 2) оптимизации времени инкубации путем изменения температуры, особенно на стадии собственно ферментативной реакции, 3) использования первичных и вторичных моноклональных антител, 4) использования быстродействующих субстратов со стабильной окраской.

Увеличение времени инкубации далеко не всегда приводит к повышению чувствительности определения. В каждом случае необходимо проверять, влияет ли длительность инкубации на развитие окраски, особенно при проведении реакции при повышенной температуре.

На чувствительность анализа влияет последовательность добавления реагентов. Чувствительность повышается также, если уменьшить объем реагента, используемого для остановки реакции, или увеличить добавляемое количество конъюгата.

Получение иммобилизованных антигенов и антител

Задача разделения свободного меченого компонента от образующегося комплекса со связывающим агентом эффективно решается при использовании антител (или антигенов), иммобилизованных на нерастворимом носителе. Получение антител или антигенов, связанных с носителем, является одной из существенных процедур при разработке твердофазного ИФА, т.к. от степени сохранения стабильности и активности иммобилизованных препаратов зависят количественные характеристики метода и возможности его практического применения.

Носители, применяемые в ИФА

Первоначально в гетерогенных методах ИФА применялись такие носители как целлюлоза, сефароза, сефадекс, биогель, пористое стекло. Одним из немногих (но существенных) недостатков гранулированных носителей является сложность их точного дозирования и трудность промывок без потерь микроколичеств иммуносорбента, используемого в анализе.

С начала 70-х годов в практику ИФА вошли методы, основанные на иммобилизации антигенов и антител непосредственно на стенках посуды, в которой проводится анализ. В основном, для такого анализа используют пробирки и планшеты из непористых полимерных материалов -полистирола, поливинилхлорида и т. д. Многие вещества (белки, полисахариды, пептидные гормоны, липополисахариды и т.д.) могут быть адсорбционно связаны с поверхностью таких полимеров, что значительно упрощает процедуру иммобилизации. В настоящее время этот подход является одним из основных в практике твердофазного ИФА.

Иммобилизация антигенов

Антигены могут быть ковалентно связаны с носителем либо адсорбированы на нем. Выбор метода связывания антигена с носителем зависит от его структуры и молекулярной массы соединения.

Адсорбционная иммобилизация антигенов

Многие макромолекулярные антигены - пептидные гормоны, белки, ферменты, ЛПС и т.д., а также целые вирусные частицы и целые клетки микроорганизмов - могут быть связаны с поверхностью полимерных и неорганических носителей путем адсорбции. В случае пассивной адсорбции носитель в течение нескольких часов обрабатывают раствором соответствующих антител, при этом связывание с поверхностью носителя обеспечивается за счет гидрофобных взаимодействий. Различия чаще всего относятся к оптимальным значениям рН, которые могут изменяться от нейтральных до щелочных (рН 6.8-9.6) в зависимости от заряда сорбируемой молекулы. Длительность процесса адсорбции и максимальное количество связанного с поверхностью антигена являются характеристиками, индивидуальными для каждого процесса и зависящими от гидрофобности, заряда и молекулярной массы молекулы и должны быть детально отработаны при создании ИФА тест-систем.

Ковалентное связывание

Ковалентное связывание осуществляют при помощи бифункциональных реагентов, связывающих носитель с активным веществом. Наиболее простой метод заключается в предварительной обработке планшетов водным раствором глутарового альдегида.

Добавляемые затем антитела ковалентно связываются с активированным носителем. Другими доступными реагентами для активации полистирола являются толуол - 2,4 - диизоцианат, поли - Ь - лизин, бромциан, азид и т. п. Выбор сшивающего агента и метода связывания необходимо проводить с учетом доступных функциональных групп, модификация которых не снижает способность инфекционного агента эффективно взаимодействовать с антителами.

Связывание белков с полистирольным носителем непосредственно зависит от времени и температуры обработки. Так, при 37°С связывание белка примерно вдвое больше, чем при 4°С.

Ферменты. используемые в ИФА в качестве меток

Принципиальная возможность применения ферментов в качестве меток в ИФА обусловлена чрезвычайно высокой чувствительностью методов регистрации их активности. Ферменты, используемые в ИФА в качестве маркеров, должны отвечать ряду требований: высокая специфичность, позволяющая обнаружить ферментную метку в низких концентрациях; доступность фермента, возможность получения препаратов высокой степени чистоты, сохраняющих высокую ферментативную активность после химической модификации при получении конъюгата с антителами или антигеном; высокая активность и стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом; простота и чувствительность метода определения активности фермента.

Наибольшее распространение в гетерогенном анализе среди ферментов получили пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и галактозидаза. Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Наиболее доступной является пероксидаза. Она содержит легко окисляемые перийодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента с АТ или АГ. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим методом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. Основным достоинством фермента является полное отсутствие его в плазме крови, что дает возможность использовать фермент в гомогенном ИФА. Молекулярная масса пероксидазы=40000, рН0Пхимум-5-7, пригодность каждого образца фермента для конъюгации определяют по величине соотношения Е4оз/Е275> которая характеризует степень чистоты фермента (ЯетЬеНгИа!) и должен быть не менее 3.0.

Среди хромогенных субстратов наибольшее распространение получили ОФД, 5-амино салициловая кислота.

Для измерения каталитической активности пероксидазы могут быть использованы следующие методы: фотометрический, флуориметрический, хемилюминесцентный, электрохимический.

Определение каталитической активности пероксидазы с использованием в качестве субстрата ОФД.

Метод основан на фотометрической регистрации продукта окисления ОФД, имеющего максимум поглощения при 435 нм. Так как ИФА обычно проводят с большим количеством образцов, то часто для остановки ферментативной реакции используют так называемый стоп-реагент, например, концентрированную серную кислоту. При добавлении в реакционную смесь равного объема 0.1М Н2804 максимум спектра поглощения сдвигается на 50 нм в длинноволновую область, поэтому в этом варианте регистрацию оптической плотности следует проводить при 490 нм. рН-оптимум каталитической активности пероксидазы при использовании в качестве субстрата ОФД равен 5. В анализе следует использовать свежеприготовленный раствор субстрата и избегать воздействия на него сильного света.

Обнаружение специфических антител в физиологических жидкостях играет важную роль в клинической диагностике широкого круга заболеваний как инфекционного, так и аутоиммунного характера. Для этих целей был разработан целый ряд разнообразных методик, в том числе основанных на фиксации комплемента, пассивной гемагглютинации, ингибирования вирусной гемагглютинации, иммунофлуоресценции. Применение этих методик для количественного определения антител требует титрования сывороток в сериях разведений. Недостатками подобных методик является трудоемкость, невысокая точность и значительный элемент субъективизма при оценке слабой положительной реакции и отрицательной. Благодаря развитию ИФА, в частности, методов типа ELISA, появилась возможность проводить количественные измерения в широком диапазоне концентраций с использованием единичного разведения сыворотки или плазмы. Эти методы также позволяют легко различать по активности антитела, принадлежащие к разным классам иммуноглобулинов. Объективность количественных оценок обеспечивается инструментальным фотометрированием, при этом интенсивность регистрируемых сигналов непосредственно коррелирует с уровнем тестируемых антител (23).

Необходимость более полного выявления больных животных на всех стадиях инфекционного процесса привела к разработке новых иммунологических методов, способных выявлять минимальные количества AT, достигающих нанограмм.

Разрабатываемые в последние годы иммуноферментные методы позволяют выявлять в биологических жидкостях как антитела, так и антигены, не требуют дорогостоящего оборудования и позволяют проводить визуальную оценку реакции. Как указывалось в литературном обзоре, перед практической ветеринарией стоит задача дифференциации кишечного иерсиниоза и бруцеллеза у сельскохозяйственных животных. Имеющиеся на

33 вооружении ветеринаров методы серодиагностики этих инфекций (РА, РСК) не позволяют с достаточной точностью решить эту задачу.

В связи с необходимостью разработки эффективных средств диагностики иерсиниоза, которые позволили бы дифференцировать эту инфекцию от бруцеллеза, необходимо выявление наиболее специфических антигенов этого возбудителя и изучение их иммунологических свойств.

Настоящее исследование посвящено изучению антигенной структуры белков, входящих в состав клеток иерсиний и бруцелл, с помощью методов иммуноблоттинга и ИФА с целью создания диагностической системы для дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза у КРС.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:

Используемые реактивы и материалы:

1. Антигены: коммерческий корпускулярный "Единый бруцеллезный антиген для РА, РСК, РДСК", из вакцинного штамма Brucella abortus 19, производства Щелковского биокомбината (ТУ 10.19.009-88); в качестве исходного иерсиниозного антигена использовали суспензии микробных клеток Yersinia enterocolitica (сероварианты 03, 08 и 09), полученные из 2-х суточных агаровых культур, выращенных на агаре Хоттингера при +20-22 С и инактивированных при +56°С в течение 18 часов, дважды отмытых от среды забуференным физиологическим раствором (ЗФР) с последующим центрифугированием (6000 об/мин., 15 мин.).

Суспензии антигенов для ИФА готовили в ЗФР (рН 7,3) путем доведения оптической плотности (ОП) до требуемых значений на фотоэлектроколориметре (КФК-2-УХЛ-4,2) при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм. протеиновый антиген. Суточную культуру иерсиний с агара Хоттингера пересевают в бульон Хоттингера, содержащий 20 мМ/л хлорида магния и 20 мМ/л оксалата натрия для оптимальной экспрессии БНМ. Через 12-16 часов инкубации при 4°С в среду добавляют ЮмМ ЭДТА и продолжают инкубировать еще 90 мин при 37°С. Затем в культуральном фильтрате проводят осаждение продуцируемого в среду протеинового антигена. Для этого в супернатант добавляют сульфат аммония (40 г/мл). Через 8-12 ч. инкубации осадок собирают центрифугированием и диализуют против водопроводной воды 2-е суток и против дистиллированной воды-1 сутки.

Иерсиниозные антигены и культуральная жидкость для получения протеинового антигена были получены в отделе препаратов против хронических болезней животных н.с. В.Б. Кузьминой.

2. Сыворотки: специфические анти-иерсиниозные (к сероварам ОЗ; 08; 09) гипериммунные кроличьи сыворотки, полученные в ВГНКИ в отделе препаратов против хронических болезней животных н.с. В.Б. Кузьминой; национальный бруцеллезный стандарт (стандартный биологический образец антибруцеллезной сыворотки КРС, производства ВГНКИ). сыворотки крови КРС из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств; сыворотки крови КРС из благополучных по бруцеллезу хозяйств, дающие положительный результат в РА с "Единым бруцеллезным антигеном". гетерологичные позитивные сыворотки крови животных (сальмонеллезные, эшерихиозные, кампилобактериозные, микобактериальные, пастереллезные), полученные из профильных г лабораторий ВГНКИ; нормальные сыворотки крови кролика и КРС.

3. Буферные смеси и другие реактивы: забуференный физиологический раствор (ЗФР), рН 7.3: 72 мл 0,2 М Ма2НР04 х 12 Н20, 28 мл 0,2 М ЫаН2Р04 х 2 Н20 и 9г ИаС1 доводили дистиллированной водой до 1 л в мерной колбе; забуференный физиологический раствор с добавлением 0,05% Твина-20 (ЗФРТ); фосфатный буфер, 0.1М:

- рН 6.2: 18,5 мл 0,2М Ыа2НР04 и 81,5 мл 0,2М ЫаН2Р04 доводят дистиллированной водой до 200 мл, при необходимости доводят рН до нужной величины Н3Р04 или №ОН; рН 8.0: 94,7 мл 0,2М Na2HP04 и 5,3 мл 0,2М NaH2P04 доводят дистиллированной водой до 200 мл, при необходимости доводят рН до нужной величины Н3Р04 или NaOH; карбонат-бикарбонатный буфер, 0.2М, рН9.8: 22 мл 0,2М Na2CC>3 и 50 мл 0,2М NaHC03 разбавляют водой до 200 мл; цитратно-фосфатный буфер (ЦФБ) 0.05М, рН 5.0: 9.7 мл 0.1М лимонной кислоты хН20 + 10.3 мл 0,2М Na2HP04x2H20 разбавляют водой до 1000 мл;

10х буфер для переноса = 10х Трис-глициновый буфер: 0.25 М Трис, 1.92 М глицин, рН 8.3, фирмы "Serva".

Из него готовят " Товбин буфер " (0.025 М Трис, 0.192 М глицин, 20% метанол) 10-кратным разбавлением с добавлением 20% метанола (100 мл 10х буфер для переноса + 200 мл метанола + 700 мл Н20). 10х буфер для электрофореза = 10х ДСН-Трис-глициновый буфер: 0.25 М Трис, 1.92 М глицин, 1% ДСН, рН 8.3, фирмы "Merck".

Из него готовят буфер для электрофореза (0.025 М Трис, 0.192 М глицин, 0.1%ДСН) 10-кратным разведением: 50 мл 10х ДСН-Трис-глицин буфер довести до 500 мл дистиллированной водой. Раствор мономеров (АА/Бис) (хранится при +4°С,в темноте) (30% Т, 2,7% С): 146 г акрил амида (АА) + 4 г бисакриламида (Бис)—> до 500 мл Н2Одист.,

4х буфер разделяющего геля (+4°С): 1,5 М Трис-HCl, рН 8.8:

Трис-основной.36,3 г

Н20.100 мл

НС1.до рН 8,8

Н20.до 200 мл

4х буфер концентрирующего геля (+4° С): 0,5М Трис-HCl, рН6.8:

Трис-основной.6 г

Н20.50 мл

НС1.до рН 6.8

Н20.до 100 мл

Лизирующий буфер: 2х буфер для образцов (0,125М Трис, 4% ДСН, 10%

ДТТ, 20% глицерин, 0.001% бромфенолового синего, рН 6.8):

0,5М Трис-НС1, рН6,8.2,5мл

10%ДСН.4 мл

Дитиотрейтол (ДТТ).1 г

Глицерин.2 мл

Н20.до 10 мл

Буфер для иммуноблота (ЗОмМ Трис-НС1, 150мМ ЫаС1, 0.05% Твин-20,

0.5мг/мл овальбумин, рН 8.0):

С1.1.76г

ЗМТрис-НС1.2 мл

Твин-20.100 мкл

Овальбумин.100 мг

Н20.до 200 мл хромогенный субстрат ортофенилендиамин (ОФД): 10 мг ОФД растворяют в 25 мл ЦФБ с рН 5,0 и добавляют 50 мкл 3% Н202, готовится непосредственно перед использованием; хромогенный субстрат диаминобензидин (ДАБ): 10 мг диаминобензидина растворяют в 10 мл Трис ЗмМ, рН 8.0 и добавляют 50 мкл 3% Н202;

0.5М раствор серной кислоты; 3% перекись водорода; 10% додецилсульфат натрия (ДСН); 10% персульфат аммония (ПСА); Краситель для гелей:

0.1-0.3% Кумасси 11250 в смеси Н20 : спирт : ледяная уксусная кислота в соотношении 5:3:1. Кумасси растворяют в спирте на мешалке в течение 15 минут. Затем добавляют воду и уксусную кислоту. Фильтруют. 0,1% раствор амидочерного в смеси изопропанол - уксусная к-та (25%-10%); коммерческая тест-система для количественного определения IgG- и IgA-антител к Y.enterocolitica в сыворотках крови (Y.enterocolitica 03 ELISA, DAKO, Дания); антитела диагностические против иммуноглобулинов кролика, меченные пероксидазой хрена, изготовленные НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи (ФС 423618-98); антитела диагностические против иммуноглобулинов КРС, меченные пероксидазой хрена, изготовленные НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи (ФС 423618-98).

Определение активности конъюгатов в ИФА

Для определения рабочего разведения антивидовых пероксидазных конъюгатов поверхность лунок иммунологических плашек сенсибилизировали нормальной сывороткой кролика или КРС в разведении 1:1000 в ЗФР. После инкубации в течение 30 минут при 37°С и отмывки ЗФРТ в лунках раститровывали конъюгаты, начиная с разведения 1:50 в ЗФРТ с двойным шагом разведения. Реакцию учитывали по ОП окрашенного продукта реакции, возникающего в результате взаимодействия фермента с хромогенным субстратом (ОФД), измеренной при длине волны 490 нм, через 5-10 минут после инкубации.

За рабочее разведение конъюгата принимали такое разведение, при котором ОП490 конечного продукта реакции была не ниже 0.1 ед.

Постановка непрямого метода ИФА для дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза

Для отработки условий постановки ИФА опыты проводили по следующей схеме:

- в качестве твердофазного носителя использовали 96-луночные полистироловые плашки (Dynatech, США). Для сенсибилизации иммунологических плашек в лунки вносили суспензии клеток Yersinia enterocolitica различных сероваров (03; 08; 09) или "Единого бруцеллезного антигена", разведенных до рабочей концентрации, в объеме 0,1 мл. Условия адсорбции антигенов были подобраны в опытах. Несвязавшийся с поверхностью полистирола антиген отмывали 3-х кратно ЗФРТ. После термической обработки в течение 15 минут при 65°С (для фиксации антигена) планшеты можно хранить не менее 6 месяцев (срок наблюдения) при 4°С. - для количественного определения антител в испытуемых сыворотках каждую из них титровали методом двукратных разведений в ЗФРТ на иерсиниозном и бруцеллезном антигенах, либо вносили на оба антигена в одном разведении в тройной повторности и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Стандартно отмывали, добавляли по 0,1 мл антивидовых пероксидазных конъюгатов в рабочем разведении в ЗФРТ и инкубировали 1 час при комнатной температуре. после стандартной отмывки в лунки добавляли по 0,1 мл субстратной смеси. Реакцию останавливали после 5-10 минутной инкубации при комнатной температуре добавлением 0,02 мл 0,5М H2S04. Регистрацию цветной реакции, возникающей в результате взаимодействия фермента с субстратом, проводили инструментально на вертикальном фотометре Micro ELISA Auto Reader MR580 (Dynatech, США) при длине волны 490 нм.

Результаты реакции выражали в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА). Данный показатель рассчитывали по формуле, предложенной в документах ВОЗ (41):

ЕД ИФА= ffix х10()9 где ОПх - средняя оптическая плотность лунок с исследуемым образцом; ОП0 - средняя оптическая плотность лунок с отрицательной контрольной сывороткой.

При анализе сывороток крови больных за положительные принимали значения ЕД ИФА не менее 200 плюс удвоенное среднее квадратическое отклонение (т.е. ИФА+2а). В нашем случае этот показатель равняется 244.

В дальнейших опытах по исследованию сывороток из хозяйств применяли ИФА с подобранными ранее условиями.

Результаты обрабатывали статистически в соответствии с общепринятой методикой (50).

Полиакриламидный гельэлектрофорез (ПААГЭ) с додецил сульфатом натрия (ДСН):

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем ОД % ДСН, проводили по методу Laemmli U.K. (108). Суспензии клеток доводили до оптической плотности, равной 1, при длине волны 540 нм. Полученные культуры в объеме 5 мл центрифугировали при 6000 об/мин 10 мин и осадок растворяли в 250 мкл дистиллированной воды. К суспензии клеток добавляли лизирующий буфер в равном объеме. Пробы нагревали в течение 7-10 мин. при 95°С, центрифугировали при 14000 об/мин 5 мин и по 10 мкл наносили на ДСН-ПААГ. ПААГ состоял из 2-х частей: 4% концентрирующий и 15% разделяющий:

15%разделяющий гель 4% концентрирующий гель

Н20 1.87 мл 2 мл

АА/Бис (30/2.7) 4 мл 0,44 мл

1,5 М Трис-HCl, pH 8,8 2 мл

0,5М Трис-HCl, рН6,8 - 0,8 мл

10% ДСН 80 мкл 40 мкл

10% ПСА 60 мкл 30 мкл

ТЕМЭД 5 мкл 3 мкл

ПААГЭ проводили в вертикальной камере SE400 фирмы "Hoefer Scientific Instruments" (США). Концентрирование полос проводили при силе i U '

С".т"Н ¡4 A

UI.D» v. тока 45 мА /2 стекла. При переходе на разделяющий гель силу тока повышали до 60 мА /2 стекла. Длительность электрофореза составила 50-60 мин.

Полученные электрофореграммы фиксировали 20 мин в 20% ТХУ при комнатной температуре на шейкере, затем окрашивали раствором Кумасси R-250 в течение ночи при комнатной температуре.

Молекулярную массу белков определяли путем сравнения со смесью молекулярных маркеров, подвергнутых гидролизу как и опытные образцы, фирмы "Merck" (мол. массы от 12 до 78 кД). Для определения молекулярных масс белковых полос были определены коэффициенты относительной подвижности Rf:

Длина пробега образца, мм

Rf =-

Длина геля после фиксации, мм

По значению коэффициента относительной подвижности для стандартных образцов был построен калибровочный график зависимости величины Rf от значений десятичного логарифма молекулярной массы. Исходя из значений коэффициентов относительной подвижности для исследуемых белков, их молекулярные массы были определены по калибровочным графикам.

Иммуноблот-анализ:

Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану после разделения в геле проводили на аппарате "Semi-phor ТЕ-70" в "Товбин буфере" при постоянном токе 100 мА в течение часа. После переноса мембраны промывали в буфере для блота и оставляли в нем на забивку на 20 минут. Затем мембраны погружали в раствор сыворотки в рабочем разведении в том же буфере. Инкубировали с сыворотками ночь при комнатной

42 температуре на мешалке. Отмывали 2-3 раза в блокирующем буфере и погружали в раствор конъюгата в рабочем разведении. Инкубацию с конъюгатом проводили 1,5 ч при комнатной температуре. Стандартно отмывали и погружали мембрану на 10-15 мин. в раствор субстрата (диаминобензидина). Результат реакции учитывали по появлению полос коричневого цвета, соответствующих местоположению разделенных белков. Реакцию останавливали, промывая мембрану дистиллированной водой.

Молекулярные массы окрашенных полос определяли по калибровочным графикам, исходя из значений коэффициентов относительной подвижности, как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Астахова, Татьяна Станиславовна

ВЫВОДЫ

1. Brucella abortus и Yersinia enterocolitica 09 имеют несколько перекрестно реагирующих антигенных детерминант, выявляемых методом иммуноблоттинга. Единственным дифференцирующим белком является белок бруцелл с молекулярной массой 18 кД.

2. Отработаны условия постановки непрямого ИФА в целях дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза у КРС:

- в качестве видоспецифического антигена предлагается инактивированная прогреванием суспензия клеток Yersinia enterocolitica 03 при оптимальной дозе 0.1 ед.ОП54о для сенсибилизации плашек;

- оптимальное значение рН буфера для адсорбции антигена и антител равно 7.3;

- оптимальный режим для проведения ИФА: инкубация с антигеном 15 минут при 37°С, с сыворотками и конъюгатом 1 час при температуре 22-24°С, с субстратом 5-10 минут.

3. Проведенными исследованиями установлена активность и специфичность разработанной тест-системы.

Система прошла комиссионную апробацию, запатентована в РФ и имеет утвержденную нормативную документацию.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Астахова, Татьяна Станиславовна, 2002 год

1. А. с. G 01 N 33/535. Способ иммуноферментной диагностики иерсиниозов / Малов И.В., Рубцов И.В., Ющенко Г.В., Леоненко В.В. № 4859426/14; Заявлено 13.08. 90; Опубл. 07.10.92, Бюлл. №37. - 3 с.

2. Авилов В.М., Сочнев В.В., Тебекин А.Б. Спектр патогенности при иерсиниозной инфекции. // Вет. и биол. наука с\х произ.-ву: по мат.-ам Всерос. н-пр. конф. Н.Новгород.-1997.- С. 66-68.

3. Аленушкина Т.В. Клинико-экспериментальное изучение особенностей иммунитета и усовершенствование терапии иерсиниоза: Автореф. дисс.канд. мед. наук-М., 1993,- 23 с.

4. Антитела. Методы. Пер. с англ. В 1 т. // Под ред. Д.Кэтти.- М.: Мир, 1991 .-287с.

5. Аядова Е., Лазничкова К., Соботкина Я. Результаты применения некоторых лабораторных методик при кишечных инфекциях. // Острые кишечные инфекции.- Л.-1982.-вып. 6.- С. 137-143.

6. Бабкин А.Ф., Соболев Н.М., Орлова В.А. и др. Серологическая и бактериальная индикация иерсиниоза у животных. // Ветеринария. Респуб. межвед. тематич. сб., Киев: Урожай,- 1988.- С.56-57.

7. Барков A.B., Ленченко Е.М. Патогенные и вирулентные свойства иерсиний. // Ветеринария.- 1997.-№6.- С. 20-23.

8. Белая О.Ф. Клинико-патологические, иммунологические и диагностические аспекты циркуляции в организме антигенов и токсинов энтеробактерий как факторов патогенности возбудителей при острых кишечных заболеваниях: Дисс. д-ра мед.наук.- 1994.- 426 с.

9. Белая Ю.А. Реакция коагглютинации чувствительный экспресс метод индикации антигенов и токсинов возбудителей кишечных и других заболеваний. // Новое в практике лаб. иссл. - Горький.- 1987.-С. 66-70.

10. Ю.Беседнова H.H., Кудрина Н.В. Иммунные комплексы и R-белки при иерсиниозах // ЖМЭИ.- 1997.- №5,- С. 45-49.

11. Бродянский Ю.М., Чайко H.A. Улучшение методов бактериальных и серологических исследований при кишечных инфекциях. // Острые кишечные инфекции.-Л.- 1982.-вып. 6.- С. 124-132.

12. Водопьянов С.О., Радионова A.B., Мишанькин Б.Н., Кирдеев В.К. Феномен пилеобразования у Y.enterocolitica // ЖМЭИ.- 1984.- №7.- С. 2931.

13. Вяльба Е.В. Циркулирующие иммунные комплексы при иерсиниозах: Автореф. дисс.канд. мед. наук / ММСИ.- М., 1989.-17 с.

14. Гинзбург A.JI. Плазмиды и мобильные генетические элементы патогенных бактерий рода Yersinia // Генетика.- 1987.- т. XXIII.- №4.- С. 581-594.

15. Горчакова Н.Г. Нетрадиционные методы идентификации и дифференциации бруцелл: Автореф. дисс.канд. мед. наук С.-П., 1993.21 с.

16. Григорьева Г.И., Сочнев В.В., Бацанов Н.П., Филиппов Н.В. Бруцеллы и бруцеллез.- Н.Новгород, 1991.- 348 с.

17. Джентимирова K.M., Куликовский A.B. Иерсиниоз актуальная проблема ветеринарной медицины // Ветеринария.- 1993.- №11-12.- С.28-35.

18. Джентимирова K.M., Куликовский A.B., Штукарева М.Ю. Иерсиниоз сельскохозяйственных животных // Сельскохозяйственная биология,-1995.-№6.-С. 15-24.

19. Джентимирова K.M. Экология Yersinia enterocolitica во внешней среде: Автореф. дисс.канд. вет. наук-М., 1990.- 21 с.

20. Драновская Е.А., Желудков М.М., Толмачева Т.А. и др. Иммунолобиологическая активность и физико-химические свойства компонентов клеточной стенки бруцелл и Y.enterocolitica 09 // Ветеринария.- 1995.- №11.- С.34-37.

21. Дулатова М.В., Головачева С.Н., Шпилюк Г.Ф. и др. Проблемы и перспективы иммунологической диагностики иерсиниозов // Материалы всесоюзной научной конференции,- С-П.- 1990.- С.48.

22. Дунаев В.И., Амиркулов И.А. Антигенное родство Y.enterocolitica с родом Brucella. // Актуальные вопросы инфекционной патологии. Саратов: Из.-во Сарат. Унив.-та.- 1981.- С. 37-38.

23. Егоров В.Т., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.: Мир, 1991. 456 с.

24. Елезов М.П. Иерсиниоз крупного рогатого скота в условиях северного экономического района: Автореф. дисс.канд. вет. наук , 1994.- 20 с.

25. Ефремов B.C. Перекрестные серологические реакции к бруцеллезному антигену у животных, экспериментально зараженных иерсиния энтероколитика 09 // Бюллетень ВИЭВ.- 1989.- вып.69.- С. 29-34.

26. Ефремов B.C. Дифференциация перекрестных серологических реакций, обусловленных Y.enterocolitica 09 при диагностике бруцеллеза животных: Автореф. дис.канд. вет. наук: ВНИИЭВ.-М., 1995,- 22 с.

27. Желудков М.М., Драновская Е.А., Залкинд Г.И. Характеристика антигенных комплексов, обусловленных перекрестными реакциями между бруцеллами и Y. enterocolitica 09 // ЖМЭИ.- 1983.- №9.- С. 38-39.

28. Зыкин Л.Ф., Хапцев З.Ю. Усовершенствование лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза // Ветеринария.- 2001.- №5.-С. 22-24.

29. Ивановская Я.Б. Применение реакции агглютинации для выявления иерсиниозной инфекции // Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии.- 1990.- С. 46.

30. ЗОЛвановска Я. Роль ¡ерсиний у виникновенш аборт1в у сшьскогосподарьских тварин // Вет. медицина Украши.- 1999. №5.- С.

31. Кальмель Д., Валет Л., Деметр Ф. Иммуноэнзиматический тест ЭЛИЗА, применяемый при поисках и титровании антител бруцеллы аборту с // Материалы симпозиума по бруцеллезу. М.- 1984.- 16 с.

32. Кирьянов Е.А., Савчук И.И. Роль Y.enterocolitica в патологии сельскохозяйственных животных // Тез. Всес.науч.-практ. конф.

33. Иерсиниозы (микробиология, эпидемиология клиника, патогенез, лабораторная диагностика)". Владивосток,- 1989.- С. 89-90.

34. Кирьянов Е.А. Иерсиниозы животных. Лекция.- Уссурийск, 1991.- 19 с.

35. Колос E.H., Гнутов И.Н., Ющенко Г.В. и др. Сельскохозяйственные животные, как источник иерсиниоза // ЖМЭИ.- 1985.- №4.- С.29-31.

36. Кононенко А.Б., Бритова C.B., Светличкин О.В., Белоусов A.B. Проблема иерсиниоза и пути совершенствования диагностики // Тезисы Всеросс. Науч.-практ. Конф. "Науч. осн. произ-ва вет. биол. преп.".- Щелково: ВНИиТИБП, 2000,- С. 386.

37. Королюк A.M. Применение реакции коагглютинации для обнаружения и быстрой идентификации возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза// Лабораторное дело.- 1984.- №4.- С. 37-38.

38. Кубенский E.H. Клинико-лабораторная диагностика иерсиниоза // Тез. докл. науч.-практ. конф.- М.-1992.- С. 56-58.

39. Кудрина Н.В. Система комплемента, R-белки и циркулирующие иммунные комплексы при иерсиниозах: Автореф. дисс.канд. мед. наук / НИИЭиМ СО РАМН.-Владивосток, 1993.- 21 с.

40. Кулаков Ю.К., Коллаган Д.О., Рамю М., Лютар Ж-П., Скавронская А.Г. Генетические и молекулярно-биологическое изучение факторов патогенности бруцелл // ЖМЭИ.- 1996.- №3.-С. 34-36.

41. Кэрстак Э. Успехи в разработке иммуноферментных методов: получение реагентов, планирование эксперимента и интерпретация результатов // Бюллетень ВОЗ.- 1985,- №4.- С. 125-126.

42. Ленченко Е.М. Иерсиниоз: этиология, эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактика.- М., 1998.- 52 с.

43. Маматова З.Б. Иммуноферментный метод диагностики бруцеллеза: Дисс.канд. вет. наук М., 1986.- 387 с.

44. Методические рекомендации: дифференциальная диагностика бруцеллеза и иерсиниоза и меры по их профилактике.- М.: Росагропромиздат.-1991.-21 с.

45. Михайлов JI.M., Титенко A.M., Рудник М.П., Захлебная О. Д. Использование моноклональных антител для выявления общих антигенных детерминант Brucella spp. и Yersinia enterocolitica 0:9 // ЖМЭИ. 2000. - №3. - С.63-66.

46. Наставления по диагностике бруцеллеза животных. Рекомендации по дифференциальной диагностике бруцеллеза и иерсиниоза и меры по их профилактике.- М.: ФГНУ Росинформагротех, 2000. 46 с.

47. Николаева Л.Г., Белая Ю.А., Быстрова С.М. и др. // Обнаружение бактериальных антигенов с помощью реакции коагглютинации у больных острыми кишечными инфекциями, Кишечные инфекции, респ. межвед. Сб., Киев, 1991.-С. 65-66.

48. Нго Т.Т., Ленхофф Г. М. Иммуноферментный анализ антител // Иммуноферментный анализ.- М.: Мир, 1989.- С. 172-190.

49. Образцова Е.М. Антигенные эритроцитарные препараты для обнаружения антител Y.enterocolitica серотипов 0:5, 0:7,8, 0:6,30 // ЖМЭИ. 1993. -№6.- С. 91-92.

50. Путилина Н.Г., Кулагин П.П., Буркин B.C., Ибрагимов Ф.Х. Иммунохимическая характеристика поверхностных водорастворимых антигенов Y.enterocolitica//ЖМЭИ.- 1982. -№1.- С. 83-84.

51. Родионова В.Б., Муравьев в.Н., Малофеева H.A. Роль иерсиний в патологии репродукции у свиней // Проб л. инф. и инваз. бол. в жив-ве на совр. этапе.- М., 1999. С. 35-36.

52. Романова С.Ю. Прогностическое значение показателей иммунитета при иерсиниозе: Автореф. дисс.канд. мед. наук/ ЛМИ.- Л, 1989. 15 с.

53. Сабурин В.А. Иерсиниоз животных в Правом и Среднем Поволжье: Автореф. дис.канд. вет. наук/ Н.Новгород, 1995. 22 с.

54. Светличкин О.В. Разработка тест-системы обнаружения Y.enterocolitica с использованием ПЦР и ДНК-зондов // Тезисы докладов Всеросс. Науч.-практ. Конф. "Научн. осн. произ-ва вет. биол. преп.".- Щелково: ВНИТИБП.- 2000. С. 388.

55. Скрыпник В.Г. Кишечные иерсиниозы животных // Б-ка вет. мед.- 1999.-№4.-36 с.

56. Скрыпник В.Г., Митрофанов A.B. Роль Y.enterocolitica в патологии КРС // Пробл. инф. патологии с/х животных.- Владимир.- 1997.- С. 210-215.

57. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Фенотип возбудителя иерсиниоза и его значение для диагностики // ЖМЭИ.- 1992.- №1. С. 60-64.

58. Смирнов И.В., Ценева Г.Я., Митрикова Л.А. Выявление маркеров вирулентности у клинических штаммов иерсиний // Мол. генетика, микроб, и вирус.- 1991.- №3. С. 32-34.

59. Собакин A.C., Зыкин Л.Ф., Хапцев З.Ю., Оркин В.Ф. Выявление кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза у животных // Ветеринария.-1998.-№8.-С. 15-17.

60. Соколова Е.Е., Яговкин Э.А., Гурлева Г.Г. Использование фенольной фракции из бруцелл для получения специфической сыворотки против Y.enterocolitica 09 // ЖМЭИ. 1985. - №5. - С. 49-51.

61. Сочнев В.В. Старунова Н.П., Тебекин А.Б., Горчакова Н.Г., Елезов М.П. Комплекс мероприятий по диагностике и профилактике иерсиниоза крупного рогатого скота // Труды Свердл. н-и. вет. станции.- 1995. -вып. 10. С. 135-137.

62. Тихонов В.К. Иерсиниоз животных в Центральном Правобережном агрорайоне Нижегородской области: Дисс.канд. вет. наук. Н.Новгород, 1999. - 336 с.

63. Хапцев З.Ю. Усовершенствование лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных: Автореф. дис.канд. вет. наук/ СГАУ. Саратов, 2000. - 23 с.

64. Ценева Г.Я. Ющук Н.Д., Аленушкина Т.В. Показатели иммунитета при экспериментальной инфекции, вызванной Yersinia enterocolitica 03 и 09 // ЖМЭИ. 1995. - №2. - С. 73-77.

65. Ценева Г.Я. Лабораторная диагностика псевдотуберкулеза и иерсиниоза / Пособие для врачей.- С-П.: С-ПНИИЭиМ, 1997. 64с.

66. Чибисова В.А., Селютина Д.Ф., Горелов В.Н., Драновская Е.А., Скавронская А.Г. Выделение и очистка антигенов бруцелл, синтезированных клетками Escherichia coli К12 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- 1992. №3-4. - С. 12-17.

67. Шлегель Г. Общая микробиология.- М., 1987. 435 с.

68. Шумилов К.В., Мельниченко Л.П., Селиверстов В.В. // Современные данные об иерсиниозе животных // Ветеринария.- 1998.- №4.- С. 7-13.

69. Ющенко Г.В., Дунаев В.И. Об антигенном родстве Y.enterocolitica с представителями рода Brucella // ЖМЭИ.- 1980.- №3.- С. 42-44.

70. Ющенко Г.В. Род Yersinia // Энтеробактерии.- М.: Медицина, 1985.- С. 220-239.

71. Ющук Н.Д., Аленушкина Т.В., Смирнов И.В., Воскресенская Е.А. Патогенные свойства возбудителя и иммунологические показатели при экспериментальной иерсиниозной инфекции // ЖМЭИ. прил. авг./сент. -1994.-С. 122-126.

72. Aleksic S., Burwitz К., Bockemuhl J., Aleksic V. Immune response to flagellar antigens in human infections with Yersinia enterocolitica // Contr. Microbiol. Immunol. 1991.-vol.12.-P. 110-116.

73. Berche P., Carter P. Calcium requirement and virulence of Y. enterocolitica // J. Med. Microbiol.- 1982.- vol. 15.- No.3.- P. 277-285.

74. Bissett M.L., Powers C., Abbott S.L., Janda J. M. Epidemiologic investigations of Yersinia enterocolitica and related species: sources, frequency, and serogroup distribution // J. of Clin. Microbiol.- 1990.- vol.28.- No.5.- P. 910912.

75. Bolin I., Portnoy D.A., Wolf-Watz H. Expression of the temperuture-induccible outer membran proteins of yersiniae // Infect. Iimmun.- 1985.- vol.46.- P. 123128.

76. Botton E.J. The Genus Yersinia // A handbook of the biology of bacteria ecophysiology, isolation, identification, applications.- 1992.- vol.III.- P. 28632887.

77. Botton E.J. Yersinia enterocolitica: The charisma continues // Clin. Microbiol. Rev.- 1997.- vol.10.- No.2.- P. 257-262.

78. Brubaker R.R. The Vwa+ virulence factor of yersiniae: molecular basis of the attendant nutritional requirement for Ca // Rev. Infect. Dis.- 1983.- vol.5.- P. 748-752.

79. Bundle D.R., Caroff M. The LPS of Brucella abortus and Brucella melitensis // Ann. Inst. Pasteurs Microbiol.- 1987.- vol. 138.- P. 92-98.

80. Carlsson .E., Hurvell B., Lindberg A.A. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for titration of antibodies against Brucella abortus and Yersinia enterocolitica // Acta path, microbiol. scand.- 1976.-vol.84.- P. 168-176.

81. Caroff M., Bundle D.R., Perry M.B. Structure of the O-chein of the phenolphase soluble cellular lipopolisaccaride of Yersinia enterocolitica serotype 09 // Eur. J. Biochem.- 1984.- vol.139.- P. 195-200.

82. Caroff M., Bundle D.R., Perry M.B. et al. Antigenic S-type lipopolysaccharide of Brucella abortus 1119-3 // Infect. Immun.- 1984.- vol.46.- p.384-388.

83. Christensen S.G. Yersinia enterocolitica in Danish pigs // J. Appl. Bacteriol.-1980.- vol.48.- p. 377-382.

84. Cloeckaert A Characterization of O-polysaccharide specific monoclonal antibodies derived from mice infected with the routh Br. melitensis strain B115 //J. Gen. Microbiol.- 1993.- vol. 139,- P.1551-1556.

85. Corbel M.J., Stuart F.A., Brever R.A. Observations on serological cross-reaction between smooth Brucella species and organisms of other genera // Dev. Biol. Stand.- 1984.-vol.56.- P. 873-878.

86. Corbel M.J. Recent advances in the study of Brucella antigens and their serological cross-reactions // Yet. Bull.- 1985.- vol.55.- P.927-942.

87. Cover T.L., Aber R.C. Yersinia enterocolitica // The New England Journal of Medicin.- 1989.- No.6.- P. 16-24.

88. Feeley J.C. Isolaition techniques for Yersinia enterocolitica // Bottone: CRC press, Boca Raton.- 1981.- P. 9-15.

89. Fukushima H., Nakamura R., Ito Y., Saito K. Ecological studies of Yersinia enterocolitica. 1. Dissemination of Yersinia enterocolitica in pigs // J. Med. Microbiol.- 1983.-vol.8.- P. 469-483.

90. Gemski P., Lazere J. R., Casey T. Plasmid associated with patogenicity and calcium deficiency of Yersinia enterocolitica // Infect. Immun.- 1980.-vol.27.-P.682-685.

91. Granfors K., Ogasawara M., Hill JL., Lahesmaa- Rantala R., Toivanen A. Analysis of IgA Antibodies to lipopolysaccharide in Yersinia-triggered reactive arthritis // J. Infect Dis.- 1989.- vol.159.- P. 1142-1147.

92. Granfors K., Viljanen M.K., Toivanen A. Measurement of IgM, IgG, and IgA antibodies against Yersinia enterocolitica by ELISA: Comparison of LPS and whole bacterium as antigen // J. Clinical Microbiology.- 1981.- vol.14.- No.l.-P. 6-14.

93. Heesemann J., Gross U., Schmidt N., Laufs R. Immunochemical analisis of plasmid encoded proteins released by enteropatogenic Yersinia sp. grown in calcium - deficient media // Infect. Immun.- 1986.-vol.54.- No.2.- P.561-567.

94. Heesemann J., Eggers C., Schroder J. Serological diagnosis of Yersiniosis by immunoblot technique using virulence associated of enteropathogenic Yersiniae // Contr. Microbiol. Immunol.- 1987.- vol.9- P. 285-289.

95. Hunter D., Hughes S. Isolaition of Yersinia enterocolitica from pigs in the United Kingdom // Veter. Records.- 1983.- vol.112.- P. 322-323.

96. Hurtland E.L., Bordun A., Robins-Brown R.M. Contribution of Yop B to virulence of Yersinia enterocolitica // Infect. Immun.- 1996.- vol. 64.- P. 982987.

97. Hurvell B., Lindberg A.A. Immunochemical studies on the cross-reactions between Brucella species and Yersinia enterocolitica type 9 // Contr. Microbiol. Immunol.- 1973.-voL2.-P. 159-168.

98. Hurvell B. Zoonotic Yersinia enterocolitica infection: host range, clinical manifistations between animals and man // Bottone.- CRC Press, 1981.- P. 145159.

99. Kapperud G. Yersinia enterocolitica infection // A Handbook of zoonoses.-1994,-Sect.A.-P. 337-353.

100. Kwaga J. Plasmids and outer membrane proteins of Yersinia enterocolitica and related species of swine origin // Vet. Microbiol.- 1993.-vol.36.- No. 3/4.-P. 205-214.

101. Laird W.J., Cavanaugh D.C. Correlation of autoagglutination and virulence in Yersiniae // J. Clin. Microbiol.- 1980.- vol. 11.- P. 430-432.

102. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature.- 1970,- vol.277.- P. 680-685.

103. Lewin A. Comparison of plasmids of strain Yersinia enterocolitica biovar 1A with the virulence plasmid of a pathogenic Yersinia enterocolitica strain // Zentralb. fur Bacteriology.- 1996.- vol.285.-No.l.- P. 62-63.

104. Maeland J.A., Digranes A. Common enterobacterial antigen in Yersinia enterocolitica//Acta Path. Microbiol. Scand.- 1975.- vol. 83.- P.

105. Maki-Ikola O., Heesemann J., Lahesmaa R. et al. Combined use of released proteins and lipopolysaccharide in ELISA for serologic screening of yersinia infections // J. Inf. Dis.- 1991.- vol.163.- P. 409-412.

106. Mazigh D., Quilici M., Mollaret H. Immunogenicity of Yersiniae // Contr. Microbiol. Immunol.- 1987.-vol.9.-P.304-311.

107. Marx A., Sandulache R., Pop A., Cerbu A. Serological cross-reaction between Brucella abortus and Yersinia enterocolitica // J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol.- 1974.- vol.18.- P. 429-431.

108. Michiels T., Wattiau P., Brasseur R., Ruysschaert J-M., Cornelis G. Secretion of Yop proteins by Yersiniae // Infect. Immun.- 1990.- vol.58.- No.9.-P. 2840-2849.

109. Minor L. Common enterobacterial antigen and ONPG test in the taxonomy of the genus Yersinia // Contr. Microbiol. Immunol.- 1979.- vol.5.- P. 1-7.

110. Mittal K.R., Tizard I.R. Serological cross-reactions between Brucella abortus and Yersinia enterocolitica serotype 09 // Vet. Bull.- 1981.- vol.51.-No.7.- P. 501-504.

111. Mosimabale F., Gyles C.L. The pathogenicity of Yersinia enterocolitica strains isolated from various sources in four test systems // Can. J. Comp. Med.-1982.-vol.46.-P. 70-75.

112. Nattermann V.N., Horsch F., Zimmermann H. Yersinia enterocolitica -Infectionen in Schweinebestanden ihre differentoaldiagnostische Bedeutung. // Mh. Vet.-Med.- 1980.- vol.35.- P. 225-227.

113. Nielsen K. H. The serological response of cattle immunized with Yersinia enterocolitica 0:9 or 0:16 to Yersinia and Brucella abortus antigen in enzyme immunoassays // Vet. Immunol. Immunopath.- 1990.vol.24.- P. 373-382.

114. Nielsen K. H., Kelly L., Gall D., Nicoletti P., Kelly W. Improved competitive enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis // Vet. Immunol. And Immunopath.- 1995.-vol.46- P. 285-291.

115. Noble M.A., Barteluk R., Freeman H. et. al. Clinical significance of virulence-related assay of Yersinia spp. // J. Clin. Microb.- 1987.- vol.5.- P. 802-807.

116. Ogata S., Kanamori M., Miyashita K. Antigenity of protein and lipopolisacharide from Yersinia enterocolitica // Contr. Microbiol. Immunol.-1979.-vol.5.-P. 64-72.

117. Perry R.D., Brubaker R.R. Vwa+phenotype Yersinia enterocolitica // Infect. Immun.- 1983.-vol.40.- P.166-171.

118. Portnoy D.A., Martinez R.J. Role of plasmid in pathogenisity of Yersinia species//Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 1985.-vol.118.- P.29-51.

119. Portnoy D.A., Wolf-Watz I., Bolin H., Beeder A.B., Falkow Characterization of common virulence plasmids in Yersinia species and theirrole in the expression of out membrane proteins // Infect. Immun.- 1984.-vol.43.-P.108-114.

120. Robins-Brown R.M., Bordun A.M., Slee K.J. Serological response of sheep to plasmid encoded proteins of Yersinia sp. following natural infection with Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis // J. Med. Microbiol.- 1993.-vol.39.- P. 268-272.

121. Salyers A.A., Whitt D.D. Yersinia Infections // Bacterial pathogenesis.-Washington: ASM Press, 1994.- P.213-227.

122. Schiemann D.A., Fleming C.A. Yersinia enterocolitica isolated from throats of swine in eastern and western Canada // Can. J. Microbiol.- 1981.- vol.27.- P. 1326-1333.

123. Skurnik M. Expression of antigens encoded by the virulence plasmid of Yersinia enterocolitica under different growth conditions // Infect. Immun.-1985.-vol.47.-No.l.-P. 183-190.

124. Slee K.J. and Button C. Enteritis in sheep and goats due to Yersinia enterocolitica infection // Austr. Vet. J.- 1990.- vol.67.- No.l 1.- P. 396-398.

125. Stahlberg T.H., Granfors K., Pekkola-Heino K. et al. Immunoblotting analysis of human IgG, IgM and IgA response to chromosomally coded antigens of Y. enterocolitica 03 // Acta path, microbiol. immunol. scand.-Sect.C.- 1987.-vol.95.-P.71-79.

126. Swaminathan B., Harmon M.C., Mehlman J.J. Yersinia enterocolitica // J. paper No.8714.- 1981.-P. 150-183.91

127. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from poliacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1979.- vol.76.- No.9.- P. 4350-4354.

128. Wauters G. Cariage of Yersinia enterocolitica serotype 3 by pigs as a source of human infection // Contrib. Microbiol. Immunol.- 1979.- vol.5.- P. 249-252.

129. Wauters G., Aleksic S., Charlier J., Schulze G. Somatic and flagellar antigens of Yersinia enterocolitica and related species // Contr. Microbiol. Immunol.- 1991,- vol.12.- P. 239-243.

130. Weynants V., Tibor A., Denoel P. A. et al. Infection of cattle with Yersinia enterocolitica 09 a cause false positive serological reactions in bovine brucellosis diagnostic test // Vet. Microbiology.- 1996.- vol.48.- P.101-112.

131. Winblad S. Studies on O-antigen factors of Yersinia enterocolitica // Int. Sympos. on pseudotuberculosis.- Ser. Immunobiol. Standart.- Paris: Basel.-1968.- vol.2.- P. 337-342.

132. Une T., Brubaker R.R. Roles of V-antigen in promotoring virulence and immunity in Yersiniae // J. of Immunology.- 1984.- vol.133.- No.4.- P. 22262230.госетжжмшш